NO319990B1 - Cellulaere preparater, forloper-celler for monocyttmakrofager, farmasoytisk preparat og deres fremstilling. - Google Patents
Cellulaere preparater, forloper-celler for monocyttmakrofager, farmasoytisk preparat og deres fremstilling. Download PDFInfo
- Publication number
- NO319990B1 NO319990B1 NO19960743A NO960743A NO319990B1 NO 319990 B1 NO319990 B1 NO 319990B1 NO 19960743 A NO19960743 A NO 19960743A NO 960743 A NO960743 A NO 960743A NO 319990 B1 NO319990 B1 NO 319990B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cells
- gene
- macrophages
- preparation according
- pharmaceutical preparation
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 131
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 title claims description 78
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 title claims description 52
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims description 24
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 22
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 76
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 22
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 9
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 8
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims description 6
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 230000001173 tumoral effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 5
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 4
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 2
- 108700041567 MDR Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 claims description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 abstract 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 14
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 13
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 13
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 4
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 4
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000003003 monocyte-macrophage precursor cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 210000004206 promonocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N (+)-catechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 2
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 2
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N catechin Natural products OC1Cc2cc(O)cc(O)c2OC1c3ccc(O)c(O)c3 ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000005487 catechin Nutrition 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 210000002791 cfu-m Anatomy 0.000 description 2
- 229950001002 cianidanol Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002476 tumorcidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 102000011767 Acute-Phase Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010062271 Acute-Phase Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100035248 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101001022185 Homo sapiens Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000026633 IL6 Human genes 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004020 intracellular membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000002864 mononuclear phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår cellulære preparater, deres fremstilling, farmasøytiske preparater inneholdende de cellulære preparater.
Mer spesielt angår oppfinnelsen isolering, dyrking og aktivering av celler fra det mononukleære, fagocytære system.
Cellene fra det mononukleære, fagocytære system, omfatter monocytter fra det perifere blod, deres forløpere fra ryggmarg eller blod, og vevmakrofager. Monocyttene dannes i ryggmargen som de forlater etter modning ved å gå gjennom det perifere blod mot vevet. De humane monocytter som sirkulerer i blodet har en halveringstid på ca. 3 dager. Når vevet nåes, kalles monocytten makrofag. Dette totale antall vevmakrofager over-skrider stort antallet sirkulerende monocytter med en faktor på ca. 400. Makrofagene finnes over alt i legemet, men er særlig tallrike i leveren (Kupffer-celler), i de lymfatis-ke ganglier, i bukhinnen og i huden (Langerhans-celler). Den nøyaktige halveringstid for vevmakrofagene er ikke kjent, men synes å telles i måneder mer enn i dager. Til slutt er monocyttenes passasje fra den generelle sirkulering til vevet, irreversibel.
Monocyttene og makrofagene er kjent for å ha tallrike og viktige funksjoner inkludert induksjon av immunresponser i akutte faser (anonym, "Lancet" ii (1985) 536-537), he-matopoiese-reguleringen (CA. Sieff i "J. Clin. Invest.", 79 (1987) 1549-1557), immun-systemaktiveringen (E.R. Unanue i "Annu. Rev. Immunol.", 2 (1984) 395-428) koagule-ringen (H. Prydz og A.C. Allison i "Thromb. Haemost.", 39 (1978) 582-591), desime-ring av organismer og tumorceller (S.D. Sharma og J.S. Remington i "Lymphokines", 3
(1981) 181-212 samt E.A. Carswell et al., i "Proe. Nati. Acad. Sei." USA, 72 (1975) 3666-3670) samt vevreparasjon og sårheling (J.H. Korn et al. i "J. Clin. Invest.", 65
(1980) 543-54).
I det nedenfor følgende defineres en linje av monocytter-makrofager som en linje av mononukleært system omfattende perifere blodmonocytter, deres forløpere fra ryggmarg eller blod, og vevmakrofager. De omfatter likeledes de monocytter som oppnås ved dyrking av forløperceller samt makrofagene som oppnås etter dyrking av monocytære celler under de betingelser som detaljert er angitt i eksemplene (se i tillegg R. Andressen et al. i "Cancer Res.", 50:7450; J. Bartholeyns et al. i "Anticancer Res.", 11
(1991) 1201-1204; M. Lopez et al. i "Journal of Immunological Methods", 159 (1993) 29-38). Monocytt-makrofagforløpeme omfatter særlig pluripotente cellerstammer, mye-loide cellestammer (CFU-GEMM), myelomonocytiske cellestammer (CFU-GM), CFU-M'ene, monoblastene og promonocyttene. I dag brukes monocyttene-makrofagene ved adaptiv immunoterapi for behandling av visse typer kreft hos mennesker. Disse celler renses idet man går ut fra sirkulasjonsblod fra pasientene, dyrking ex vivo og aktivering med y-interferon for å indusere deres differensiering og øke deres tumoricidkraft, hvoretter blodet reinjiseres til pasientene. Imidlertid er behandlingen tung for den syke fordi monocyttene-makrofagene må hentes ut hyppig og regelmessig, ex vivo-aktiveringen nødvendiggjør vesentlig tidsforbruk og i tillegg er y-interferon meget kostbart. Av denne grunn er det viktig å ha til disposisjon mer effektive behandlingsmåter som er mindre belastende for sykdommen og som er rimeligere. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fordelaktig løsning på dette prob-lem. Foreliggende oppfinnere har vist at det, ved hjelp av egnede vektorer, er mulig å overføre gener ex vivo i monocytt-makrofagceller, noe som tillater å gi dem overlegne egenskaper, både hva angår cytotoksisitet som stimulering av immunsystemet.
En første gjenstand for oppfinnelsen ligger således i et cellulært preparat omfattende celler fra den differensierte monocyttmakrofaglinje, kjennetegnet ved at den inneholder en rekombinant nukleinsyre, båret av en adenoviral vektor som under kontroll av reguleringselementer som tillater dens ekspresjon, omfatter ett eller flere terapeutiske gener.
Foreliggende oppfinnelse tillater også på enkel og effektiv måte å oppnå sunne og aktive monocytter-makrofager som kan benyttes ved adoptiv immunoterapi for behandling av visse patologier som kreft. Oppfinnelsen tillater likeledes å gi monocyttene-makrofagene terapeutiske egenskaper som er nye eller som er forbedret i forhold til or-ganismens monocytter-makrofager, særlig på området for forsvar mot infeksiøse midler, mot tumorceller eller ved aktivering av immunsystemet. Slike celler benyttes fordelaktig for kurativ eller preventiv behandling av infeksiøse (særlig virale) eller autoimmune sykdommer, immunitære mangler eller for vaksineformål.
Innenfor oppfinnelsen kontekst angir uttrykket "terapeutisk gen" et hvilket som helst gen hvis transkripsjon og eventuelt traduksjon i cellen gir et produkt med en terapeutisk effekt. Det kan særlig dreie seg om hele eller en del av et terapeutisk protein (interleu-kin, interferon, tumomekrosefaktor, kolonistimulerende faktorer, osv.), et antigenisk peptid for realisering av en vaksine eller stimulering av immunsystemet, eller videre et anti-retnings-RNA som er i stand til å regulere ekspresjonen av et spesifikt protein, for eksempel et protein av viral opprinnelse, eller likeledes interferere med infeksjons-syklusen og/eller replikasjonen til et virus.
Fortrinnsvis koder genet for hele eller en del av et protein som er i stand til å gi cellene i linjen anti-infeksjons-, anti-cancer- eller nye eller forbedrede immunostimulerende egenskaper.
Aller helst velges genet blant gener som koder for interferonene (særlig y-interferon),
tumornekrosefaktorene (særlig oc-faktor), interleukinene (ILI-12), de kolonistimulerende faktorer (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, osv.), MDR-genet (multi drug resistance), eller et gen som koder for et antigen for en infeksiøs partikkel eller er spesifikk for en tumor (for eksempel et overflateprotein av en virus: særlig HIV-virusproteinet gpl60, eller Mc-1-antigenet som er karakteristisk for epiteliale tumorer).
Foreliggende oppfinnelse har til formål å tilveiebringe cellulære preparater som definert ovenfor der den rekombinante nukleinsyre bæres av en vektor, fortrinnsvis en viral vektor. Anvendelsen av en vektor ifølge oppfinnelsen tillater særlig å forbedre administreringen av nukleinsyren til cellene og likeledes å øke dens stabilitet i disse celler, noe som tillater å oppnå en lengre-varende effekt. Videre er det mulig å innføre flere gener i en og samme vektor, noe som likeledes øker behandlingens effektivitet.
Den benyttede vektor er fortrinnsvis av viral opprinnelse og kan særlig velges blant adenoviruser, adeno-assosierte vimser (AAV), herpes-virus, vaksinevirus, cytomegalo-virus (CMV), osv.
Fortrinnsvis er den benyttede vims et defekt vims. Uttrykket "defekt vims" angir et vi-ms som ikke er i stand til replikering i målcellen. Generelt er således genomet til det benyttede, defekte vims innenfor oppfinnelsens ramme, berøvet i det minste de sekvenser som er nødvendige for replikering av vimset i den infekterte celle. Disse områder kan enten være eliminert (helt eller delvis), eller gjort ildce-funksjonelle, eller substituert med andre sekvenser og særlig med rekombinant nukleinsyre. Fortrinnsvis bevarer det defekte vims ikke desto mindre de sekvenser i genomet som er nødvendig for enkapsi-dering av de virale partikler.
En vektor som er særlig fordelaktig for fremstilling av de cellulære preparater ifølge oppfinnelsen er en adenovirale vektor. Foreliggende oppfinnere har kunnet vise at adenovirusene på meget effektiv måte er i stand til å infektere cellene fra monocytt-makrofag-linjen, å holde seg stabile der og å uttrykke et terapeutisk gen, enten nu dette dreier seg om et intracellulært produkt, et membranprodukt eller et sekretert produkt. Det foreligger forskjellige adenovirusserotyper, hvis struktur og egenskaper varierer noe, men som ikke er patogener for mennesker og særlig ikke irnmunodeprimerte sub-jekter. Imidlertid integreres denne virus ikke i genomet i cellene de infekterer og de kan inkorporere vesentlige fragmenter eksogent DNA. Blant de forskjellige serotyper fore-trekker man innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse å benytte adenovirusene av type 2 eller 5 (Ad 2 eller Ad 5). Når det gjelder adenovirus Ad 5, er de sekvenser som er nødvendige for replikering, områdene EIA og E1B.
De defekte, rekombinante vimser som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen kan fremstilles ved homolog rekombinering mellom et defekt vims og et plasmid som blant annet bærer nukleinsyresekvensen som definert nedenfor (Levero et al., "Gene", 101
(1991) 195; Graham, "EMBO J.", 3(12) (1984) 2917). Den homologe rekombinering skjer etter ko-transfeksjon av nevnte vims og plasmid i en egnet cellelinje. Den benyttede cellelinje må fortrinnsvis (i) være transformerbar av elementene, og (ii) bære sekvensene som er i stand til å komplementere genomdelen av det defekte vims, for-trinnsvis under integrert form å unngå rekombineirngsrisiki. Som et eksempel på linje som kan benyttes for fremstilling av defekte, rekombinante adenovimser kan nevnes human embryonyrelinje 293 (Graham et al. i "J. Gen. Virol.", 36 (1977) 59) som særlig, integrert i sitt genom, inneholder den venstre del av genomet av en Ad 5-adenovirus (12%).
Til slutt blir de multipliserte vimser gjenvunnet og renset i henhold til klassiske teknikker innenfor den molekylære biologi.
Teknikkene for konstruksjon av vektorer avledet fra adenovirus, HSV, CMV eller AAV, og inneholdende de heterologe nukleinsyresekvenser, er beskrevet i litteraturen og kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen [Akli et al. i "Nature Genetics", 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., "Human Gene Therapy" 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero et al., "Gene", 101 (1991) 195; Le Gal la Salle et al., "Science", 259 (1993) 988; Roemer og Friedmann i "Eur. J. Biochem.", 2 (1990) 739; Miyanohara et al. i "New Biol.", 4 (1992) 238; WO91/18088, WO90/09441, WO88/10311].
Infeksjonen av cellene i monocytt-makrofaglinjen kan gjennomføres i henhold til forskjellige protokoller med en infeksjonsmultiplisitet som er tilpasset som funksjon av den benyttede vektor, det angjeldende gen, og så videre, som beskrevet i de etterfølgen-de eksempler.
Ikke-virale vektorer, enten kjemiske av typen liposom eller polyamid, eller fysiske som
en sprøyte eller elektroporering, kan også benyttes.
En særlig metode for gjennomføring av oppfinnelsen ligger i et cellulærpreparat omfattende forløperceller for monocyttene-makrofagene inneholdende et defekt, rekombinant adenovirus som, under kontroll av reguleringselementer som tillater dets ekspresjon, omfatter et eller flere terapeutiske gener. Mer spesielt velges forløpercellene blant opphavscellene og progenitorcellene for det hematopoietiske system, og omfatter særlig de pluripotente opphavsceller, de myeloi'de opphavsceller (CFU-GEMM), de myelomonocytiske opphavsceller (CFU-GM), CFU-M'ene, monoblastene og promonocyttene.
Som antydet ovenfor anbringes det terapeutiske gen under kontroll av reguleringselementer som tillater dets ekspresjon. Disse reguleringselementene består generelt av transkripsjonspromotersekvenser. Det kan dreie seg om sekvenser som naturlig er ansvarlige for ekspresjon av det angjeldende terapeutiske gen når sekvensene er i stand til å funksjonere i monocyttene-makrofagene. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av annen opprinnelse (ansvarlige for ekspresjon av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotersekvenser for eukaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotersekvenser som stammer fra genomet til cellen man ønsker å infektere. Likeledes kan det dreie seg om promotersekvenser som stammer fra genomet av en virus, her innbefattet det adenovirus som benyttes som vektor. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promoteren for genene EIA, MLP, CMV, RSV, osv. Videre kan disse ekspresjonssekvenser modifiseres ved tilsetning av aktiverings- eller reguleringssekvenser. I visse tilfeller (for eksempel når det terapeutiske gen er det til y-INF eller a-TNF), er det særlig fordelaktig som reguleringselement å benytte konstitutive promotere som tillater en kontinuerlig og høy ekspresjon av det terapeutiske gen. I andre tilfeller kan det være mer fordelaktig å benytte en regulert pro-moter, hvis aktivitet kan kontrolleres. Når imidlertid det innførte gen ikke omfatter ekspresjonssekvenser, kan det innskytes i genomet til det defekte virus nedstrøms en slik sekvens.
Cellepreparatene ifølge oppfinnelsen omfatter generelt en cellepopulasjon som er anriket på monocytter, makrofager eller deres forløpere. Det kan dreie seg om monocytter, makrofager, deres forløpere eller en blanding av de forskjellige celletyper. Fortrinnsvis har preparatene ifølge oppfinnelsen mer enn 80% monocytter, makrofager eller for-løpere, aller helst mer enn 90%.
Monocyttene-makrofagene som ifølge oppfinnelsen er transformert ex vivo, særlig under anvendelse av en rekombinant, adenoviral vektor, foreligger således som et valgfritt verktøy for fremstilling av et farmasøytisk preparat, særlig anti-tumoralt, anti-infeksiøst eller ment for å forsterke det hematopoietiske system hos en pasient, særlig immunsystemet.
Foreliggende oppfinnelse angår således også et farmasøytisk preparat som, som aktiv bestanddel, inneholder celler fra monocytt-makrofaglinjen som beskrevet ovenfor.
De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan administreres systemisk, ved intratumoral injeksjon, osv., som funksjon av den valgte applikasjonsmåte. Likeledes kan de benyttes alene eller i forbindelse med andre farmasøytiske preparater.
I det ovenfor sagte implikerer uttrykket "i forbindelse med" ikke at monocyttene-makrofagene og de andre medikamenter nødvendigvis administreres i blanding eller samtidig. Uttrykket omfatter likeledes enhver anvendelse eller presentasjon som implikerer deres administrering i tidsintervaller som ikke er null, men tilstrekkelig korte til å autorisere en addisjon eller en synergi hva angår produktenes virkninger.
I en særlig utførelsesform omfatter oppfinnelsen et farmasøytisk preparat omfattende celler fra monocytt-makrofaglinjen inneholdende en rekombinant nukleinsyre som koder for hele eller en del av dette protein som gir makrofagen egenskapen i helt eller delvis å kunne eliminere tumorale celler fra en organisme.
Som antydet ovenfor må de mononukleære fagocytter eller monocytter nødvendig differensieres i makrofager, deretter aktiveres, i det vesentlige med y-interferon (_-INF), for å bli til aktiverte makrofager som oppviser en cytotoksisitet vis-å-vis tumorale celler. Til i dag har podning av monocytt til makrofag og aktivering med y-interferon vært gjennomført in vitro fra monocytære celler som er hentet fra human-cytafereser og deretter reinjisert etter aktivering. Imidlertid har de eksperimentelle forsøk ikke gitt til-fredsstillende resultater på grunn av effektivitetsproblemer ved aktiveringen, det høye antall nødvendige injeksjoner (minst en injeksjon pr. uke og derfor også en cytaferese pr. uke), noe som viser seg å være svært og sågar for tungt for pasienten.
Foreliggende oppfinnelse muliggjør at det in vivo dannes, ut fra sirkulerende monocytter-makrofager eller deres forløpere, cellulære populasjoner som er anriket på anti-tumorale makrofager ved transformering med en rekombinant DNA som for eksempel uttrykket y-INF.
En foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen ligger således i et farmasøytisk preparat som, som aktiv bestanddel inneholder celler av monocytter-makrofager som definert ovenfor inneholdende et defekt, rekombinant adenovirus som bærer genet for y-interferon. Slike celler har de anti-canceriøse egenskaper som kreves ved adoptiv immunoterapi på grunn av en konstant og varig stimulering av makrofagene med y-interferon. Oppfinnelsen tillater således fremstilling av homogene populasjoner av tumoricide humanmakrofager MAK (macrophages activated killers).
Blant fordelene ved preparatene ifølge oppfinnelsen i forhold til kjent behandling kan man nevne reproduserbarhet, behandlingsøkonomi og komfort for den syke som derved unngår regulære cytafereser.
Blant mediatorene for den anti-tumorale aktivitet for makrofager spiller videre a-TNF (tumor-nekrosefaktor) likeledes en avgjørende rolle (Feinman et al. i "J. Immunol.", 138
(1987) 635-640). a-TNF (eller katektin) er et cytokin som i det vesentlige er saltet ut fra makrofager som respons på en tissulær destruksjon, et bakterielt endotoksin, en viral infeksjon eller andre cytokiner (B. Quantin et al. i "Human Gene Transfer", 219 (1991) 271-272). Det er, innenfor oppfinnelsens ramme, likeledes mulig ex vivo å fremstille makrofager som inneholder et rekombinant gen som uttrykker en slik mediator for å generere meget aktive cellepopulasjoner.
En annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen ligger således i et farmasøytisk preparat som, som aktiv bestanddel, inneholder monocytt-makrofagceller som definert ovenfor inneholdende et defekt, rekombinant adenovirus som bærer et gen som koder for a-TNF. Ennu mer foretrukket omfatter cellene ifølge oppfinnelsen et gen som koder for en membran form av a-TNF. Denne membranære ekspresjon av a-TNF gir de trans-formerte celler forbedrede anti-canceriøse egenskaper når de benyttes ved adoptiv immunoterapi. Denne utførelsesform tillater videre å unngå en utsalting av TNF i det ekst-racellulære medium, idet en slik utsalting kan medføre ekstremt ugunstige inflammato-riske effekter.
Fortrinnsvis koder den rekombinante nukleinsyre for et a-TNF som er deletert for aminosyrer fra det N-terminale området idet den nevnte delesjon omfatter minimum 3 aminosyrer og høyst 20 aminosyrer, fortrinnsvis på de 12 N-terminale aminosyrer.
I en ytterligere utførelsesform omfatter oppfinnelsen et farmasøytisk preparat som omfatter celler fra monocytt-makrofaglinjen inneholdende en rekombinant nukleinsyre som koder for hele eller en del av dette protein som gir makrofagen egenskapen å kunne inhibere eller behandle manifestasjoner på en infeksjon med et infiserende middel som et virus, et retrovirus, en parasitt eller en bakterie, ved induksjon eller regulering av immunresponsen.
Denne anvendelse trekker fordel av makrofagens egenskap i å kunne presentere antigener på overflaten der denne antigeniske presentasjon stimulerer immunresponsen for de immunokompetente celler, særlig B-lymfocyttene og T-lymfocyttene. Antigenene som er til stede i organismen blir fanget opp av makrofagene som behandler dem og deretter uttrykker dem på overflaten, i forbindelse med de komplekse histo-kompatibilitetsmolekyler fra klasse II. Foreliggende oppfinnelse tillater på fordelaktig måte å utvikle denne egenskap hos makrofagene for en generell eller spesifikk stimulering av immunsystemet.
For den generelle stimulering av immunsystemet, kan det terapeutisk gen være et rekombinant gen som uttrykker en forbindelse som er i stand til å stimulere produksjon av MHC-molekyler av klasse II, som tillater å generere celler ifølge oppfinnelsen med egenskapen til forbedret antigenisk presentasjon; og/eller et rekombinant gen som uttrykker et viralt, noe som tillater å generere celler ifølge oppfinnelsen som induserer et forsterket immunforsvar mot denne type infeksjon. Som eksempel på slike antigener kan særlig nevnes glykoproteinet av hundegalskapsvirusen.
For en spesifikk stimulering av immunsystemet, kan makrofagene benyttes for en definert presentasjon av antigener, for vaksineformål.
Den rekombinante nukleinsyre bæres fortrinnsvis av en defekt adenoviral vektor under de termer som er definert ovenfor.
Foreliggende oppfinnelse angår likeledes en fremgangsmåte for fremstilling av monocytter-makrofager som definert ovenfor og som omfatter følgende trinn: 1. Tilveiebringelse og isolering av monocytter-makrofager eller deres forløpere fra blod eller ryggmarg,
2. dyrking av cellene,
3. transformering av cellene ved hjelp av rekombinant nukleinsyre som definert ovenfor, og eventuelt
4. kondisjonering og/eller lagring av de således oppnådde celler.
Tilveiebringelsen og isoleringen av monocytt-makrofagcellene eller deres forløpere kan gjennomføres ved en hvilken som helst for fagmannen kjent teknikk. De forskjellige teknikker kan implikere fysikalske separeringstrinn som sentrifugering, tri-cellulær (FACS), osv.), seleksjon med immunogene forbindelser (antistoffer som er spesifikke for cellulære markører: US 4 965 204; EP 17 381, EP 30 450, osv) eller biokjemiske forbindelser (membranære reseptorligander: EP 405 972), osv.
Når det gjelder monocytter-makrofager kan disse oppnås fra blod ved forskjellige teknikker og særlig ved cytaferese (Lopez et al., "J. Immunol. Methods.", 159 (1992) 29) eller ved anvendelse av antistoffer som er rettet mot spesifikke markører i monocytt-makrofagcellene som CD 14, CD64 eller Maxi. De kan likeledes oppnås ex vivo fra forløperceller ved dyrking under egnede betingelser som tillater deres differensiering.
Når det gjelder forløperceller, kan disse likeledes isoleres ved hjelp av et antistoff som erkjenner spesifikke markører som: Opphavsceller: CD33, CD34; celler GFU-GM og CFU-M: CD13, CD14, CD15, CD33, HLA DR; monoblaster og promonocytter: CD13, CD 14, CD 15, CD33. Teknikkene som anvendes innenfor rammen av oppfinnelsen er kjent for fagmannen, se for eksempel EP 451 611, WO93/02181.
De således oppnådde celler kan deretter dyrkes under alle sterile betingelser som tillater deres bevaring, proliferering og/eller differensiering (når det dreier seg om forløper-celler. Dyrkingen kan således gjennomføres ganske enkelt ved å holde cellene under transformeringen. Det er således mulig å transformere cellene på forløperstadiet eller monocyttstadiet, som så differensieres og/eller aktiveres in vivo etter deres readministrering til pasienten. På samme måte kan differensieringen/aktiveringen gjen-nomføres ex vivo etter transformeringen. Dyrkingen kan likeledes gjennomføres for å tillate en cellulær proliferering og/eller differensiering før man gjennomfører transformeringen på de mature celler (monocytter, makrofager, MAK). Således kan proli-fereringen av forløperne og deres differensiering i monocytære celler gjennomføres ex vivo i nærvær av vekst og differensieirngsfaktorer som GM-CSF, M-CSF, interleukinene H3, IL4, IL6 og ILI 1 eller også SCF.
Dyrkingen av de isolerte celler kan gjennomføres i forskjellige medier som er kjente for fagmannen (for eksempel RPMI, IMDM), supplementert blant annet med serum og aminosyrer. Dyrkingen gjennomføres under sterile betingelser, fortrinnsvis ved 37°C, som vist i eksemplene. De kan gjennomføres på kulturplaquer eller også fortrinnsvis i teflonposer.
Dyrkingsbetingelsene kan tilpasses av fagmannen som en funksjon av den isolerte cellepopulasjon, den tilsiktede anvendelse, og så videre.
På samme måte blir transformering av cellene ved hjelp av rekombinant nukleinsyre gjennomført i sterilt medium under betingelser tilpasset av fagmannen på området som en funksjon av nukleinsyren, den isolerte cellepopulasjon, og så videre.
Når nukleinsyre bæres av en viral vektor som et adenovirus, kan infeksjonen av cellene fra monocytt-makrofag-linjen realiseres i henhold til forskjellige protokoller for en mul-tiplisitet av infeksjoner som tilpasses som en funksjon av den benyttede vektor og det angjeldende gen som beskrevet i eksemplene. Fortrinnsvis inkuberes monocyttene-makrofagene i nærvær av 50 til 250 pfu pr. renset viruscelle og fortrinnsvis 80 til 100 pfu/celle. I henhold til transformeringsbetingelsene kan prosentandelene celler som modifiseres ved innføring av rekombinant nukleinsyre variere fra 30 til 95%.
De således oppnådde modifiserte celler kan deretter kondisjoneres med henblikk på umiddelbar anvendelse og/eller lagres med henblikk på senere bruk.
For en umiddelbar readministrering blir cellene generelt bragt i suspensjon i en fosfatbuffer eller fysiologisk serum i en konsentrasjon som varierer fra 10^ til 10^ celler pr. dose.
For bevaring kan cellene fryses, fortrinnsvis i nærvær av konserveirngsmidler som gly-cerol, DMSO, og så videre.
Oppfinnelsen muliggjør også realisering av en metode for behandling omfattende administrering av celler som angitt ovenfor. Det kan dreie seg om celler som stammer fra pasienten (autologe) eller fra en donor (allogene).
Administreringen kan skje på forskjellige måter. Fortrinnsvis blir cellene administrert ved injeksjon, helst intravenøst eller intratumoralt. Videre kan systemisk injeksjon gjen-nomføres ved perfusjon.
En særlig behandlingsmetode er:
1. Tilveiebringelse og isolering av monocyttene-makrofagene eller deres forløpere fra blod eller ryggmarg,
2. dyrking av cellene,
3. transformering av cellene med en rekombinant nukleinsyre som angitt ovenfor, og eventuelt
4. kondisjonering og/eller lagring av de således oppnådde celler, og
5. deres administrering til pasienten.
Behandlingen gir tallrike fordeler i forholdet til andre behandlinger ved adoptiv immunoterapi med LKA, de forskjellige TIL, eller forskjellige NK (natural kitlers) som for eksempel fraværet av toksiske mediatorer som er satt fri celler, fravær av proliferering av aktiverte makrofager, det faktum at deres effektorforhold på målcellene for cytotoksisiteten er lavere enn ved andre behandlinger, og det faktum at det ikke er nødvendig med samtidig injeksjon av cytokin som IL2 hvis sekundærvirkninger er svært ugunstige. Videre muliggjør oppfinnelsen at det ikke infekteres mer enn en definert og kontrollert cellepopulasjon, oppfinnelsen muliggjør å velge multiplisiteten ved infeksjonen (antallet virale partikler pr. celle), den muliggjør på irreversibel måte å treffe vevet fra sirkula-sjonsblodet, og den muliggjør å trekke fordel av makrofagenes sentrale rolle i organismen både via den anti-tumorale eller anti-infeksiøse aktivitet og ved virkningen på stimulering eller regulering av immunsystemet som forklart ovenfor. Tatt i betraktning den betydelige levetid for makrofagene, kan en repetisjon av de for pasienten belastende behandlinger unngås.
Foreliggende oppfinnelse gir således nye muligheter for en behandling som er mer effektive, mindre belastende for den syke, rimeligere og mer reproduserbar.
Foreliggende oppfinnelse omfatter et cellulært preparat omfattende celler fra den differensierte monocyttmakrofaglinje, kjennetegnet ved at den inneholder en rekombinant nukleinsyre, båret av en adenoviral vektor som under kontroll av reguleringselementer som tillater dens ekspresjon, omfatter ett eller flere terapeutiske gener.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også forløpercelle for monocyttmakrofager, kjenn-tegnet ved at den inneholder et defekt, rekombinant adenovirus som under kontroll av reguleringselementer som tillater dens ekspresjon, inneholder ett eller flere terapeutiske gener.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse et farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det som aktiv bestanddel inneholder ett eller flere cellulære preparater ifølge ett av kravene 1 til 6.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av monocytter-makrofager ifølge et av kravene 1 til 6, kjennetegnet ved at man gjennomfører følgende trinn: tilveiebringing og isolering av monocytter-makrofager eller deres forløpere fra
isolert blod eller ryggmarg,
dyrking av cellen,
transformering av cellene med en rekombinant nukleinsyre som definert ovenfor, og eventuelt
kondisjonering og/eller lagring av de således oppnådde celler.
Foreliggende oppfinnelse beskrives nærmere under henvisning til den nedenfor følgende beskrivelse for mulighetene for transformering av celler fra monocytt/makrofaglinjen og ekspresjon av terapeutisk gen både når det gjelder celler i kultur og celler som er reinjisert in vivo i tumorer.
Eksemplene skal illustrere oppfinnelsen ved gjennomførbarheten av metoden og beva-ringen av effektiviteten for genet og proteinet som uttrykkes av genet som er transferert i makrofagen både in vitro, ex vivo og in vivo.
Oppfinnelsen illustreres også under henvisning til de ledsagende figurer, der:
figur 1 viser snitt av makrofager som stammer fra monocytter, infektert med et defekt,
rekombinant adenovirus som bærer genet Lac-Z av E. coli (Ad.RSV.Øgal), 48 timer etter infeksjon (figur la), 4 dager etter infeksjon (figur lb) og 16 dager etter infeksjon (figur lc). Figur ld: ikke infekterte sammenligningsceller; og figur 2 viser detekteringen av J3-galaktosidase-aktiviteten, uttrykt i monocyttene-makrofagene som er transformert med adenovirus Ad.RSV.J3gal, etter intratumoral injeksjon i nakne mus.
Musene oppviser tumorer som er indusert ved subkutan injeksjon av tumorale celler av human mesoteliom og behandles ved intratumoral injeksjon av humane monocytter-makrofager, infektert med Ad.RVS.Bgal. Tre dager etter behandlingen blir tumorene ekstrahert, fiksert og nærværet av B-galaktosidase-aktivitet bestemt.
Generelle, molekvlbiologiske teknikker.
De klassiske metoder som benyttes i molekylbiologien, for eksempel preparativ ekstrahering av plasmidisk DNA, plasmidisk sentrifugering av DNA i cesiumkloridgradient, elektroforese på agarose- eller akrylamidgel, rensing av DNA-fragmenter ved elektro-eluering, ekstrahering av proteiner med fenol eller fenol-kloroform, presipitering av DNA i saltmedium med etanol eller isopropanol, transformering i Escherichia coli, osv., er velkjente for fagmannen og rikelig beskrevet i litteraturen [T. Maniatis et al. i "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982; F.M. Ausubel et al. (red.) i "Current Protocols in Molecular Biol-ogy", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Plasmidene av typen pBR322, pUC og fagene fra serie Ml3 er av kommersiell opprinnelse (Bethesda Research Laboratories).
For ligaturene kan DNA-fragmentene separeres i henhold til størrelse, ved hjelp av elektroforese på agarose- eller akrylamidgel, ekstrahering med fenol eller med fenol:kloroform, presipiteres med etanol og inkuberes i nærvær av DNA-ligase av fagen T4 (Biolabs) i henhold til leverandørens anbefalinger.
Erstatninger av de proeminente 5'-ender kan gjennomføres med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I fra E. coli (Biolabs) i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Destrueringen av de proeminente 3'-ender gjennomføres i nærvær av DNA-polymerase av fagen T4 (Biolabs), benyttet i henhold til leverandørens anbefalinger. Destrueringen av de proeminente 5'-ender gjennomføres ved en behandling med Sl-nuklease.
Den styrte mutagenese in vitro med syntetiske oligodeoksynukleotider kan gjennomfø-res i henhold til den metode som er beskrevet av Taylor et al. ["Nucleic Acids Res.", 13
(1985) 8749-8764] under anvendelse av det fra Amersham tilgjengelig kit.
Den enzymatiske forsterkning av DNA-fragmentene ved den teknikk som kalles PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, R.K. Saiki et al. i "Science", 230 (1985) 1350-1353; K.B. Mullis og F.A. Faloona i "Meth. Enzym.", 155 (1987) 335-350] kan gjen-nomføres under anvendelse av en "DNA thermal cycler" (Perkin Eimer Cetus) i henhold til fabrikantens spesifikasjoner.
Verifiseringen av nukleotidsekvensene kan gjennomføres ved den metode som er utvik-let av Sanger et al. ["Proe. Nati. Acad. Sei." USA, 74, (1977) 5463-5467] under anven-
deise av de fra Amersham tilgjengelige kit.
For fremstillingen av adenoviruset benyttes human embryonyrelinjen 293 (Graham et al., i "J. Gen. Virol.", 36 (1977) 59). Denne linje inneholder særlig, integrert i genomet, den venstre del av genomet av humant adenovirus Ad5 (12%).
Eksempler
Eksempel 1: Fremstillin<g> av monocytter og makrofa<g>er.
Den fremstillingsteknikk for makrofager som benyttes er allerede beskrevet i litteraturen (Lopez et al., 1993, supra). Kort sagt blir mononukleuscellene (MNC) separert fra eryt-rocyttene og granulocyttene over en Ficoll-Hypaque-gradient (d=l,077) under anvendelse av en Cobe 2991-ploprosessor og deretter vaskes det 3 ganger med en fosfatbuffer. En del av dette MNC ble benyttet for å fremstille monocyttene ved elutriasjon under de betingelser som er beskrevet nedenfor. Den andre del av MNC bringes i kultur (5»1()6 pr. ml) i et IMDM-medium (Gibco, Frankrike) inneholdende 3»10~<5> M 2-merkaptoetanol, 1% ikke-essensiell aminosyre, 2 mM L-glutamin, 2 mM natriumpyru-vat, 100 Ul pr. ml penicillin, 100 ug pr. ml streptomycin og 2% AB-serum, i teflonposer på 600 ml, og deretter inkubert ved 37°C i en fuktig atmosfære med 5% CO2 i 7 dager.
Cellene gjenvinnes deretter og monocyttene-makrofagene renses til 95% ved elutriasjon under anvendelse av en Beckman J6ME-sentrifuge, utstyrt med en J5,0-rotor og et elutriasjonskammer på 40 ml.
Eksempel 2: Infeksjon av monocyttene og makrofagene med en adenoviral vektor som uttrykker genet av B- galaktosidase ( Ad. RSV. BgaD.
2.1. Fremstilling av vektoren: Den adenovirale vektor som benyttes i dette eksempel er vektoren Ad.RSV.Bgal. Denne vektor er berøvet de sekvenser som er nødvendig for replikeringen, men omfatter ikke desto mindre de sekvenser som er nødvendig for å penetrere inn i de infekterbare celler samt helheten av de essensielle sekvenser som er nødvendig for enkapsideringen av denne adenovirus. Den bærer likeledes, under kontroll av RSV-promoteren, genet av B-galaktosidasen av E. coli. Konstruksjonen av den defekte, rekombinante adenovirus Ad.RSV.Bgal er beskrevet i litteraturen (Stratford-Perricaudet et al., "J. Clin. Invest.", 90 (1992) 626). Kort sagt er adenovirusen Ad.RSV.Bgal et defekt, rekombinant adenovirus (der regionene El og E3 er deletert), oppnådd ved homolog rekombinering in vivo mellom adenovirus mutanten Ad-dl324 (Thimmappaya et al., "Cell", 31 (1982) 543) og plasmidet pAd.RSV.Bgal (Akli et al., 1993).
Plasmidet pAd.RSV.6gal inneholder, i retning 5'_3',
fragmentet PvuII som tilsvarer den venstre ekstremitet av adenovirusen Ad5 omfattende: ITR-sekvensen, replikeringsopprinnelsen, enkapsideringssignalene og for-sterkeren EIA;
genet som koder for B-galaktosidase under kontroll av RSV-promoteren (Rous-sarkomvirus),
et andre fragment av genomet av adenovirusen Ad5 som tillater homogen rekombinering mellom plasmidet pAd.RSV.Bgal og adenovirus dl324.
Etter linearisering med enzym Clal blir plasmidet pAd.RSV.Bgal og adenoviruset dl 324 kotransfektert inn i linje 293 i nærvær av kalsiumfosfat for å tillate homogen rekombinering. De således dannede, rekombinante adenoviruser seleksjoneres ved rensing på plaque. Etter isolering blir DNA av det rekombinante adenovirus forsterket i cellelinje 293, noe som fører til en kultursupernatant inneholdende ikke-renset, rekombinant, defekt adenovirus med en titer på ca. 10<*0> pfu/ml.
De virale partikler renses generelt ved sentrimgering over en cesiumkloirdgradient i henhold til kjente teknikker (se særlig Graham et al. i "Virology", 52 (1973) 456).
Dette adenovirus benyttes for å vise muligheten for å transformere monocytter-makrofager og for å vise transfæreffektiviteten for genet i disse celler.
2.2. Infeksjon av monocytter og makrofager: Friske monocytter eller makrofager inkuberes natten over i nærvær av 80 til 100 PFU (Plaque forming unit) med renset cellevi-rus (Ad.RSV.Bgal) i et komplett RPMI-medium (IMO<**> celler pr. ml). Cellene vaskes for å fjerne frie virale partikler og reinkuberes så i et friskt komplett RPMI-medium i teflonposer eller i dyrkingsplater på 12 brønner. Til forskjellige tidsrom blir cellealiquoter tatt ut, fiksert og testet med henblikk på nærvær rav fi-galaktosidase-aktivitet.
B-galaktosidase-aktiviteten prøves i cellene etter infeksjon med rekombinant adenovirus under anvendelse av histokjemiske metoder som beskrevet av Stratford-Perricaudet et al. i "Hum. Gene Ther.", 1 (1990) 241. Kort sagt blir cellene inkubert i nærvær av X-gal for å frigi B-gal-aktivitet som så visualiseres ved tilsynekomst av en blåfarve i cellekjer-nene inneholdende genet B-gal, og motfarves med hemotoksylin og eosin.
Eksempel 3: Påvisning av genoverføring i humanmonocvtter eller makrofager avledet fra humanmonocvtter transformert med den rekombinante. adenovirale vektor som bærer fi- galaktosidasegenet.
3.1. Ekspresjon av iJ-galaktosidase-aktiviteten i monocyttene-makrofagene i celle-kutur.
Effektiviteten ved genoverføringen med adenovirale vektorer prøves i de rensede monocytter og i makrofagene som stammer fra de samme monocytære celler. De mononukleære blodceller som oppnås ved cytaferese separeres på en Ficoll-gradient som beskrevet i eksempel 1. En del av suspensjonen av MNC underkastes elutriasjon og de således oppnådde monocytter benyttes i infeksjonsprøvene (eksempel 2). En andre del av MNC-suspensjonen dyrkes i 6 til 7 dager, noe som tillater differensiering av monocyttene i makrofagene som beskrevet i eksempel 1. Etter denne dyrkingsperiode blir makrofagene også renset ved elutriasjon. De således rensede makrofager er to ganger så store som monocyttene og uttrykker på sin overflate det differensieringsspesifikke antigen Maxi. Ekspresjonen av CD 14 av HLA-DR og av CD64 økes likeledes på signifi-kant måte hvis man sammenligner med utgangsmonocyttene. En del av de makrofager som oppnås fra monocyttene i kultur aktiveres deretter ved tilsetning av 250 Ul/ml rekombinant y-interferon ca. 18 timer før dyrkingsslutt i henhold til den protokoll som er beskrevet av Lopez et al. i "J. Immunotherapy", 11 (1992) 209-217). Denne aktivering tillater å oppnå aktiverte makrofager som kan være aktive ved anti-infeksiøs immunoterapi.
De rensede monocytter eller rensede makrofager, enten etter 6 dagers kultur (det vil si før aktivering med y-interferon) eller etter 7 dagers dyrking (etter aktivering med y-interferon) infekteres med 80 til 100 pfu pr. rekombinant adenoviruscelle pAd.RSV.figal.
Etter infeksjon over natten blir mediet trukket av, cellene vasket og reinkubert i et friskt, komplett medium, enten i teflonposer eller i en-dusin-brønners plater. Cellene blir deretter fiksert og prøvet på B-galaktosidase-aktivitet ved forskjellige tidsrom etter infeksjon. Ekspresjonen av 6—galaktosidase i cellekjernen indikerer overføringseffektivitet for
genet og dets ekspresjon.
De oppnådde resultater er vist i figur 1. De viser detektering av B-galaktosidase-aktiviteten på forskjellige tidsrom etter infeksjon av makrofagene avledet fra monocytter som er behandlet med interferon. Tilsvarende resultater oppnås med celler som ikke er aktivert med y-interferon. Alt etter fremstilling uttrykker 40 til 80% av makrofagene B-galaktosidase-aktivitet i kjernen mellom 2 og 4 dager etter infeksjon. Ekspresjonen av B-galaktosidase fortsetter inntil 3 uker etter infeksjon (figur lc). Det er klart at man ved å øke infeksjonsmultiplisiteten, kan øke prosentandelen celler som uttrykker det rekombinante gen. Det er også mulig å oppnå cellulære preparater der 95% eller mer av cellene er transformert.
3.2. Ekspresjon av B-galaktosidase etter intratumoral injeksjon av monocytter makrofager med rekombinant adenovirus i nakne mus.
I apparaturen for å prøve om de infekterte monocytter-makrofager kan uttrykke et eksogent gen i in vivo-tumorer blir monocytter-makrofager som er infektert med rekombinant adenovirus injisert i tumorer indusert i nakne mus.
De nakne mus blir deretter underkastet en subkutan injeksjon av 2*10^ tumorale celler av human mesoteliom (HIB-celler). Tumorene (med en diameter på ca. 4 mm) som in-duseres ved denne injeksjon behandles deretter med intratumoral injeksjon av humane monocytter-makrofager som er infektert med pAd.RSV.Bgal, oppnådd ifølge eksempel 3.1. For injeksjon blir de infekterte human-monocytter-makrofager bragt i suspensjon i en fosfatbuffer. De injiserte doser er 2*10^ celler pr. mus. 3 dager etter behandling blir tumorene ekstrahert, fiksert og nærværet av B-galaktosidase-aktivitet blir bedømt.
De oppnådde resultater er vist i figur 2. De viser klart at B-galaktosidase-aktiviteten finnes i tumoren 3 dager etter behandling og at de administrerte monocytter-makrofager således er i stand til på vesentlig måte å kolonisere tumoren og der uttrykke et rekombinant gen.
Eksempel 4: Overføring av et mutert TN F-gen i makrofa<g>er oppnådd fra human-blodmonocytter.
aTNF eller katetin er et cytokin som i det vesentlige er saltet ut fra makrofager som respons på en tissulær destruksjon, et bakterielt endotoksin, en viral affeksjon eller andre cytokiner. TNF produseres i form av et prohormon på 233 aminosyrer (26 kDa). Det mature protein omfatter 157 aminosyrer (17 kDa) og er resultatet av en eliminering av en N-terminal sekvens på 76 aminosyrer. De aktiverte monocytter-makrofager syntetise-rer membranær aTNF og har en cytotoksisk virkning på deres mål ved kontakt celle-
celle (virkningen av membranære aTNF på 26 kDa), samt ved lokal frigjøring av opp-løselig aTNF (17 kDa). Dette er forskjellig fra det som skjer ved et septisk sjokk, der sjokket partielt resulterer i en akutt eller kronisk aktivering av monocytter som medfører frigjøring i sekretert form av TNF (Perez et al. i "Cell", 63 (1990) 251). Da aTNF er klonet og eksprimert i £. coli (Pennica et al., 1984) står store mengder til disposisjon for kliniske prøver. Imidlertid er den terapeutiske anvendelse av aTNF på mennesker be-grenset på grunn av den vesentlige toksisitet og på grunn av de forekommende bivirk-ninger (kakeksi, feber, hodepine, tretthet, hypertensjon). Ved kolorektal cancer har en nylig klinisk prøve vist at det opptrer en vesentlig toksisitet ved doser som er util-strekkelige til å oppnå en anti-tumoral-aktivitet (Kemeny et al., 1990).
Foreliggende oppfinnelse muliggjør å øke den anti-tumorale kraft for makrofager uten å gj toksisitet forbundet med oppløselig aTNF. Oppfinnelsen tillater således å tilveiebringe transfekterte makrofager via membranær form av aTNF. Videre oppviser makrofagene ifølge oppfinnelsen, oppnådd på denne måte, en ytterligere vesentlig fordel: Mens således oppløselig aTNF (sekretert) har en plasmatisk kort halveringstid på ca. 20 minutter, kan makrofagene ifølge oppfinnelsen forbli i periferien av tumoren i mange dager, noe som gir håp om en meget varighet anti-tumoralaktivitet som et resultat av kontakten med makrofager som bærer den tumorale TNF-celle.
De således aktiverte makrofager oppnås ved infeksjon av makrofager oppnådd fra monocytter eller monocytter ved rekombinante adenoviruser som beskrevet i eksempel 2, men der det terapeutiske gen er det til et mutert aTNF.
Mer spesielt oppnås det muterte gen på følgende måte. Den membranære form av aTNF har to spaltingsseter, det ene befinner seg mellom aminosyrene -1 og +1 (posisjonen +1 representerer begynnelsen av det mature protein), det andre befinner seg i området +13 (Perez et al., 1990, supra). Delesjon av aminosyrene 1 til 12 forhindrer spalting i 26 kDa-form mens man opprettholder cytotoksisiteten til sonene for kontakt celle-celle. Mutasjonene av human-aTNF realiseres ved rettet mutagenese, de tilsvarer mutantene A+l, Al-12, beskrevet av C. Perez et al., 1990, supra. Effektiviteten for konstruksjonen av mutert TNF bedømmes ved transitorisk ekspresjon i eukaryotiske celler (cos) idet man søker membranære, intracellulære og sekreterte former av TNF under anvendelse av anti-TNF-antistoffer og måler deres biologiske aktivitet. En rekombinant adenovirus omfattende det muterte gen som fremstilt som ovenfor konstrueres deretter og den biologiske aktivitet for syntetisert TNF kontrolleres: (a) vis-å-vis linje L 929 ved teknikken med cytolysesoner i agar, en teknikk som viser lysering under kontakt celler-celler, og (b) ved inhibering av innarbeiding av tritiert thymidin i cellene i U 937-kultur (histocytære celler av et human lymfom), K 562 (celler som stammer fra en kronisk, myeologenisk leukemi) og LS 174 T (kolisk adenokar-sinom), samt vis-å-vis blastiske celler som er hentet fra leukemiske pasienter. Den anti-tumorale-aktivitet in vivo prøves deretter på en dyremodell og består i å implantere human-tumorer i nakne mus og deretter å behandle disse mus med systemiske injeksjoner av makrofager som er transfektert med det modifiserte aTNF-gen som antydet ovenfor i eksempel 3. Den anti-tumorale-effekt bedømmes i forhold til sammenligningsmus som er behandlet med et placebo eller med ikke-transfekterte makrofager.
Eksempel 5: Makrofager fra monocytter eller monocytter som er transformert med rekombinant adenovirus inneholdende — interferon- genet og som gir makrofagene en forbedret, anti- tumoral- aktivitet.
y-interferongenet innføres i den ovenfor beskrevne, adenovirale vektor og det rekombinante adenovirus benyttes for åtransformere cellene av monocytter eller makrofager som stammer fra monocyttene.
Makrofagene som oppnås etter differensiering i RPMI-medium som beskrevet ovenfor i eksempel 1, uttrykker y-interferon på konstitutiv måte, det er således ikke lenger nød-vendig å behandle makrofagene i 18 til 24 timer for å oppnå den ønskede cytotoksiske og anti-tumorale effekt. Makrofagene som på konstitutiv måte uttrykker y-interferon kan så benyttes i adoptiv anti-canceriøs immunoterapi, enten ved systemisk injeksjon eller ved injeksjon direkte i tumorene.
Claims (20)
1.
Cellulært preparat omfattende celler fra den differensierte monocyttmakrofaglinje, karakterisert ved at den inneholder en rekombinant nukleinsyre, båret av en adenoviral vektor som under kontroll av reguleringselementer som tillater dens ekspresjon, omfatter ett eller flere terapeutiske gener.
2.
Cellulært preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at det eller de terapeutiske gener koder for hele eller en del av et protein som er i stand til å gi cellene nye eller forbedrede anti-infeksiøse, anti-canceriøse eller immunostimulerende egenskaper.
3.
Cellulært preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert v e d at genet er valgt blant gener som koder interferoner, tumomekrosefaktorer, interleukiner, faktorer for kolonistimulering, for eksempel G-CSF, M-CSF, GM-CSF osv., MDR-genet, og et gen som koder for et antigen for en infeksiøs partikkel eller som er spesifikk for en tumor.
4.
Cellulært preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at den adenovirale vektor er et defetivt, rekombinant adenovirus.
5.
Forløpercelle for monocyttmakrofager, karakterisert v e d at den inneholder et defekt, rekombinant adenovirus som under kontroll av reguleringselementer som tillater dens ekspresjon, inneholder ett eller flere terapeutiske gener.
6.
Forløpercelle ifølge krav 5, karakterisert ved at den er valgt blant opphavs- og avkom-celler i det hematopoietiske system.
7.
Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel inneholder ett eller flere cellulære preparater ifølge ett av kravene 1 til 6.
8.
Farmasøytisk preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter celler fra monocyttmakrofaglinjen inneholdende en rekombinant nukleinsyre som koder for hele eller en del av et protein som gir makrofagen evnen til å eliminere hele eller deler av tumorale celler i en organisme.
9.
Farmasøytisk preparat ifølge krav 8, karakterisert ved at genet er valgt blant genet for interferon-y og genet av tumornekrosefaktor-a.
10.
Farmasøytisk preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter celler av monocyttmakrofaglinjen inneholdende et defekt, rekombinant adenovirus som bærer genet for INF-y.
11.
Farmasøytisk preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter celler av monocyttmakrofaglinjen inneholdende et defekt, rekombinant adenovirus som bærer genet TNF-a.
12.
Farmasøytisk preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det defekte, rekombinante adenovirus bærer et gen som koder for en membranær form av TNF-a.
13.
Farmasøytisk preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter celler av monocytt-makrofaglinjen inneholdende en rekombinant nukleinsyre som koder for hele eller en del av et protein som gir makrofagen egenskapen til prevensjon eller behandling av manifestasjoner av en infeksjon fra et infeksiøst middel som et virus, et retrovirus, en parasitt eller en bakterie.
14.
Farmasøytisk preparat ifølge krav 13, karakterisert ved at den rekombinante nukleinsyre koder for et viralt eller bakterielt overflateantigen.
15.
Farmasøytisk preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter celler av monocytt-makrofaglinjen inneholdende et defekt, rekombinant adenovirus som uttrykker et overflateantigen fra HIV-virus, for eksempel hele eller en del av proteinet GP 160.
16.
Farmasøytisk preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 15, karakterisert ved at det foreligger i injiserbar form.
17.
Farmasøytisk preparat ifølge krav 16, karakterisert v e d at det er forberedt for intravenøs eller intratumoral injeksjon.
18.
Farmasøytisk preparat ifølge krav 16, formulert med henblikk på en per fusjon.
19.
Farmasøytisk preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 18, karakterisert ved at det omfatter IO5 til IO9 celler pr. dose.
20.
Fremgangsmåte for fremstilling av monocytter-makrofager ifølge et av kravene 1 til 6, karakterisert ved at man gjennomfører følgende trinn: tilveiebringing og isolering av monocytter-makrofager eller deres forløpere fra iso
lert blod eller ryggmarg, dyrking av cellen, transformering av cellene med en rekombinant nukleinsyre som definert ovenfor,
og eventuelt kondisjonering og/eller lagring av de således oppnådde celler.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9310222A FR2709309B1 (fr) | 1993-08-25 | 1993-08-25 | Compositions cellulaires, préparation et utilisations thérapeutiques. |
| PCT/FR1994/001019 WO1995006120A1 (fr) | 1993-08-25 | 1994-08-22 | Cellules recombinantes de la lignee monocyte-macrophage pour la therapie genique |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO960743D0 NO960743D0 (no) | 1996-02-23 |
| NO960743L NO960743L (no) | 1996-03-25 |
| NO319990B1 true NO319990B1 (no) | 2005-10-10 |
Family
ID=9450378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19960743A NO319990B1 (no) | 1993-08-25 | 1996-02-23 | Cellulaere preparater, forloper-celler for monocyttmakrofager, farmasoytisk preparat og deres fremstilling. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6210963B1 (no) |
| EP (1) | EP0719332B1 (no) |
| JP (1) | JP3731035B2 (no) |
| KR (1) | KR100392984B1 (no) |
| AT (1) | ATE272117T1 (no) |
| AU (1) | AU698043B2 (no) |
| CA (1) | CA2170159A1 (no) |
| DE (1) | DE69433921T2 (no) |
| FI (1) | FI960855A (no) |
| FR (1) | FR2709309B1 (no) |
| IL (1) | IL110754A (no) |
| NO (1) | NO319990B1 (no) |
| WO (1) | WO1995006120A1 (no) |
| ZA (1) | ZA946264B (no) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69734974D1 (de) * | 1996-02-08 | 2006-02-02 | Us Gov Health & Human Serv | Verfahren zur transformation dendritischer zellen und aktivierung von t zellen |
| US6734014B1 (en) | 1996-02-08 | 2004-05-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for transforming dendritic cells and activating T cells |
| FR2746109B1 (fr) | 1996-03-12 | 1998-04-17 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Milieu pour la conservation de materiel biologique |
| CA2268417A1 (en) * | 1996-10-09 | 1998-04-16 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Mononuclear phagocytes in therapeutic drug delivery |
| US20020068048A1 (en) * | 1997-09-05 | 2002-06-06 | Patrick A. Dreyfus | Method for the treatment or diagnosis of human pathologies with disseminated or difficult to access cells or tissues |
| NZ503318A (en) * | 1997-09-23 | 2001-11-30 | Oxford Biomedica Ltd | Modified haemopoietic stem cell comprised of a spliced upstream with a nucleotide sequence of interest to be used as in gene therapy |
| WO2000060054A1 (en) * | 1999-04-06 | 2000-10-12 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Pharmaceutical compositions comprising circulating blood cells, preferably monocytes and uses thereof |
| AU2001261737A1 (en) * | 2000-05-18 | 2001-11-26 | Genetix Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for promoting angiogenesis using monocytes |
| US6579522B1 (en) | 2000-06-27 | 2003-06-17 | Genvec, Inc. | Replication deficient adenoviral TNF vector |
| CN1388248A (zh) * | 2001-05-25 | 2003-01-01 | 钱其军 | 高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒及其构建方法 |
| WO2003024312A2 (en) * | 2001-09-17 | 2003-03-27 | Valeocyte Therapies Llc | Cell therapy system |
| US20030086903A1 (en) | 2001-11-02 | 2003-05-08 | Genvec, Inc. | Therapeutic regimen for treating cancer |
| AU2003203527A1 (en) * | 2002-04-12 | 2003-10-30 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | Control of the ratio of lap to lip |
| WO2004050683A2 (en) * | 2002-12-02 | 2004-06-17 | Abgenix, Inc. | Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof |
| WO2004073624A2 (en) | 2003-02-14 | 2004-09-02 | The Curators Of The University Of Missouri | Contraceptive methods and compositions related to proteasomal interference |
| WO2005097988A1 (ja) * | 2004-03-23 | 2005-10-20 | Dnavec Research Inc. | 組織の維持および／または修復に関連する骨髄関連細胞 |
| US7838503B2 (en) * | 2005-06-15 | 2010-11-23 | Children's Medical Center Corporation | Methods for extending the replicative lifespan of cells |
| BRPI0720342A2 (pt) * | 2006-10-04 | 2018-09-18 | Janssen Pharmaceutica N.V. | preparado de células apresentadoras de antígenos artificiais e seu uso em terapias celulares. |
| MX2009007457A (es) | 2007-01-12 | 2009-08-12 | Univ Illinois | Celulas que no son de mono para el desarrollo del virus del sindrome porcino reproductor y respiratorio (prrs). |
| JP5546107B2 (ja) * | 2008-04-17 | 2014-07-09 | 国立大学法人宇都宮大学 | ＲＮＡウイルスＢｍＭＬＶ陰性カイコ培養細胞株 |
| EP2248903A1 (en) * | 2009-04-29 | 2010-11-10 | Universitat Autònoma De Barcelona | Methods and reagents for efficient and targeted gene transfer to monocytes and macrophages |
| WO2011119920A2 (en) | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| HUE037408T2 (hu) | 2011-06-10 | 2018-08-28 | Univ Oregon Health & Science | CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok |
| US20130189754A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-07-25 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| EP2586461A1 (en) | 2011-10-27 | 2013-05-01 | Christopher L. Parks | Viral particles derived from an enveloped virus |
| ES2631608T3 (es) | 2012-06-27 | 2017-09-01 | International Aids Vaccine Initiative | Variante de la glicoproteína Env del VIH-1 |
| AU2014255733B2 (en) | 2013-04-18 | 2019-05-16 | Tilt Biotherapeutics Oy | Enhanced adoptive cell therapy |
| EP2848937A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel HIV-1 immunogens |
| US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| US20170151281A1 (en) | 2015-02-19 | 2017-06-01 | Batu Biologics, Inc. | Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer |
| US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| US9931394B2 (en) | 2015-03-23 | 2018-04-03 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| CN110709508A (zh) * | 2017-03-28 | 2020-01-17 | 朱正仑 | 治疗新生性疾病的方法 |
| WO2020097193A1 (en) | 2018-11-06 | 2020-05-14 | The Regents Of The University Of California | Chimeric antigen receptors for phagocytosis |
| US11026973B2 (en) | 2019-04-30 | 2021-06-08 | Myeloid Therapeutics, Inc. | Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof |
| GB2628935A (en) | 2019-09-03 | 2024-10-09 | Myeloid Therapeutics Inc | Methods and compositions for genomic integration |
| US10980836B1 (en) | 2019-12-11 | 2021-04-20 | Myeloid Therapeutics, Inc. | Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof |
| JP2023549140A (ja) | 2020-11-04 | 2023-11-22 | マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド | 操作されたキメラ融合タンパク質組成物およびその使用方法 |
| WO2022197949A2 (en) | 2021-03-17 | 2022-09-22 | Myeloid Therapeutics, Inc. | Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof |
| CN114657143B (zh) * | 2022-03-11 | 2022-10-25 | 西安电子科技大学 | 一种肿瘤微环境调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989005349A1 (en) * | 1987-12-09 | 1989-06-15 | The Australian National University | Method of combating viral infections |
| US5399493A (en) * | 1989-06-15 | 1995-03-21 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures |
| CA1340565C (en) * | 1989-06-29 | 1999-05-25 | Thomas B. Okarma | Device and process for cell capture and recovery |
| US5246921A (en) * | 1990-06-26 | 1993-09-21 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Method for treating leukemias |
| FR2683725B1 (fr) * | 1991-11-15 | 1995-07-07 | Pasteur Institut | Composition cellulaire pour le traitement des organismes humains ou animaux. |
| CA2121370C (en) * | 1991-11-22 | 2003-03-18 | David H. Sachs | Specific tolerance in transplantation |
| US5338165A (en) * | 1991-11-25 | 1994-08-16 | Ford Motor Company | Automotive fuel pump with modular pump housing |
| GB9125623D0 (en) * | 1991-12-02 | 1992-01-29 | Dynal As | Cell modification |
| US5436151A (en) * | 1992-04-03 | 1995-07-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for culturing human hematopoietic stem cells in vitro |
| DE4219626A1 (de) * | 1992-06-16 | 1993-12-23 | Wehling Peter Priv Doz Dr Med | Methode zur Einschleusung therapeutisch relevanter Gene in Körperzellen |
| CA2158455C (en) * | 1993-03-17 | 2003-05-27 | Nicholas P. Restifo | Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide and their uses in vaccines and disease treatments |
| US5543328A (en) * | 1993-08-13 | 1996-08-06 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviruses having modified fiber proteins |
| AU5297496A (en) * | 1995-02-17 | 1996-09-04 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Methods of preparation and use of recombinant adenoviral vectors |
-
1993
- 1993-08-25 FR FR9310222A patent/FR2709309B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-08-18 ZA ZA946264A patent/ZA946264B/xx unknown
- 1994-08-22 EP EP94925523A patent/EP0719332B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-22 JP JP50738795A patent/JP3731035B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-22 KR KR1019960700928A patent/KR100392984B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-08-22 AT AT94925523T patent/ATE272117T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-08-22 WO PCT/FR1994/001019 patent/WO1995006120A1/fr active IP Right Grant
- 1994-08-22 AU AU75398/94A patent/AU698043B2/en not_active Ceased
- 1994-08-22 US US08/601,006 patent/US6210963B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-22 DE DE69433921T patent/DE69433921T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-22 CA CA002170159A patent/CA2170159A1/fr not_active Abandoned
- 1994-08-23 IL IL11075494A patent/IL110754A/en not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-02-23 FI FI960855A patent/FI960855A/fi not_active Application Discontinuation
- 1996-02-23 NO NO19960743A patent/NO319990B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE272117T1 (de) | 2004-08-15 |
| FR2709309B1 (fr) | 1995-11-10 |
| AU7539894A (en) | 1995-03-21 |
| IL110754A0 (en) | 1994-11-11 |
| FR2709309A1 (fr) | 1995-03-03 |
| AU698043B2 (en) | 1998-10-22 |
| JPH09501837A (ja) | 1997-02-25 |
| NO960743L (no) | 1996-03-25 |
| FI960855A0 (fi) | 1996-02-23 |
| FI960855A (fi) | 1996-04-23 |
| DE69433921D1 (de) | 2004-09-02 |
| ZA946264B (en) | 1995-03-20 |
| IL110754A (en) | 2001-04-30 |
| EP0719332B1 (fr) | 2004-07-28 |
| EP0719332A1 (fr) | 1996-07-03 |
| DE69433921T2 (de) | 2006-10-05 |
| US6210963B1 (en) | 2001-04-03 |
| KR100392984B1 (ko) | 2004-10-20 |
| WO1995006120A1 (fr) | 1995-03-02 |
| CA2170159A1 (fr) | 1995-03-02 |
| NO960743D0 (no) | 1996-02-23 |
| JP3731035B2 (ja) | 2006-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO319990B1 (no) | Cellulaere preparater, forloper-celler for monocyttmakrofager, farmasoytisk preparat og deres fremstilling. | |
| JP4094053B2 (ja) | 免疫または炎症応答の調節による抗がん遺伝子療法 | |
| EP0707071B1 (en) | Recombinant vectors derived from adenovirus for use in gene therapy | |
| RU2703438C2 (ru) | Расширенная адоптивная клеточная терапия | |
| JP4842128B2 (ja) | 新規多機能性サイトカイン | |
| JP4880060B2 (ja) | 新規多機能性サイトカイン | |
| JPH06508039A (ja) | 抗腫瘍治療のためのサイトカインを発現する組換え型欠損アデノウイルス | |
| JP3952201B2 (ja) | Ｈｓｐを発現するオンコリティック微生物およびその使用 | |
| US20160250326A1 (en) | Conjugates of GM-CSF and IL-7, and Compositions Thereof | |
| JP2021526842A (ja) | Ｉ型インターフェロン及びｃｄ４０−配位子を用いる腫瘍溶解性ウイルス又は抗原提示細胞媒介性癌治療 | |
| JP7543419B2 (ja) | 組換えウイルスベクター、それを含む免疫組成物及び用途 | |
| WO2017117890A1 (zh) | Il-12/cd107a融合蛋白及其制法和用途 | |
| AU717974B2 (en) | Transduced human hematopoietic stem cells | |
| CN115605586B (zh) | 工程化溶瘤腺病毒 | |
| CA2584639A1 (en) | Adenovirus fiber shaft composition and methods of use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |