CN114657143B

CN114657143B - 一种肿瘤微环境调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114657143B
Application number: CN202210237581.5A
Authority: CN
Inventors: 宁蓬勃; 王忠良; 杜付玉; 龚春梅; 张伟洁
Original assignee: Xidian University
Current assignee: Xidian University
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2042-03-11
Also published as: CN114657143A; WO2023169092A1

Abstract

本发明公开了一种肿瘤微环境调控型CAR‑单核/巨噬细胞及其制备方法和应用，属于免疫学和肿瘤治疗学技术领域。所述CAR‑单核/巨噬细胞形成嵌合抗原受体复合结构的同时，可胞内表达GM‑CSF并自分泌至胞外，促进CAR‑单核/巨噬细胞形成M1型巨噬细胞分化，保持自身抗肿瘤微环境M2型逆转的同时，可进一步调控肿瘤微环境，进而增敏CAR‑单核/巨噬细胞的抗肿瘤效应。本发明基于GM‑CSF构建了肿瘤微环境调控型的CAR巨噬细胞技术平台，能够维持CAR‑M自身的M1型特性，又能产生TME逆转效应，进而实现CAR‑单核/巨噬细胞的高效抗肿瘤效应。

Description

一种肿瘤微环境调控型CAR-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫学和肿瘤治疗学技术领域，特别是涉及一种肿瘤微环境调控型CAR-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，肿瘤细胞免疫疗法功能被广泛应用于各种恶性肿瘤的实验研究和临床治疗，尤其是CAR-T细胞免疫疗法在血液系统肿瘤领域取得很好的疗效。但在实体肿瘤中，抑制性肿瘤微环境(Tumor Microenvironment，TME)通常会通过多种因素对过继细胞免疫治疗形成免疫壁垒，其致密的细胞和基质屏障首先对工程淋巴细胞浸润实体肿瘤形成物理屏障。即便是进入实体肿瘤，TME形成的免疫抑制微环境，如缺氧和酸性环境、免疫检查点配体的表达、特别是大量的免疫抑制细胞，如肿瘤相关巨噬细胞 (tumor-associatedmacrophage，TAM)、髓系来源的抑制细胞和调节性T细胞，形成的免疫抑制屏障是当前实体肿瘤免疫治疗的主要难点之一。

TME形成的免疫抑制机制十分复杂，这其中重要的因素，即为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)形成的免疫抑制机制。肿瘤通过各种可溶性和机械因素将循环中的单核细胞和组织驻留的巨噬细胞招募到TME，并将它们极化成M2 表型，从而产生TAM。TAM相对于生理条件下的巨噬细胞，对肿瘤细胞的免疫识别和吞噬能力发生显著性改变，失去了对异常细胞识别并免疫清除的基本免疫功能。同时， TAM还通过上调免疫抑制表面蛋白，分泌活性氧，产生抑制T细胞功能的细胞因子，以及分泌招募Treg细胞的趋化因子，在抑制内源性抗肿瘤免疫中发挥关键作用。此外， TAM通过分泌VEGF和基质金属蛋白酶等因子来促进肿瘤血管生成和转移，这些因子可以重塑TME，增加血管形成，促进肿瘤细胞迁移。由于巨噬细胞极化是一个渐进变化过程，随着肿瘤微环境抑癌信号的增加，TME可能将更多趋化至实体瘤内部的巨噬细胞从M1表型转变为M2样TAM表型。随着肿瘤恶性程度的增加，实体瘤内TAM 会达到50％，并且继续增多。

针对TAM的免疫抑制特性，当前一部分临床免疫治疗，采取抑制巨噬细胞向实体肿瘤趋化、杀灭巨噬细胞数量、诱导M2型巨噬细胞向M1型复极化或者促进TAM重编程为M1型等不同策略。有研究通过阻断CSF1(也称为MCSF)/CSF1R轴，这是巨噬细胞分化和存活的重要配体-受体对，从而阻断单核细胞分化来减少TAM的数量，同时也降低了现有TAM的存活率。此外，有研究使用CSF1R的小分子抑制剂阻断诱导 TAM从M2向M1表型的复极化，使TAM具有抗肿瘤作用。这些策略仍着眼于对TAM 的数量改变的治疗水平。

针对实体肿瘤的免疫治疗难点，嵌合抗原受体巨噬细胞免疫治疗(CAR-Macrophage， CAR-M)是作为近年来发展的新颖的过继细胞免疫治疗技术，采用单核/巨噬细胞进行 CAR构建，为攻克实体肿瘤提供了一种可能的解决方案。CAR-M细胞可特异地向实体瘤集聚，并穿透肿瘤周围致密的间质组织。此外，CAR-M将直接杀瘤手段与通过抗原提呈增强内源性免疫的能力结合在一起，使其成为抗肿瘤细胞治疗发展的独特途径。研究发现，CAR-M能够在不添加可溶性调理因子的情况下驱动对靶肿瘤细胞的吞噬和杀伤。Morrissey等发现，利用抗CD19和抗CD22 CAR构建小鼠巨噬细胞系和小鼠骨髓来源的巨噬细胞，介导了对抗原珠和肿瘤细胞的吞噬作用，证实了CAR诱导吞噬途径的能力。Zhang等利用诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)表达 CAR，并将CAR-iPSCs诱导为CAR-iMac。在没有抗原刺激的情况下，CAR-iMac偏向 M2样表型。在抗原刺激后，CAR介导的信号促进CAR-iMac的吞噬作用。

虽然新颖的CAR-M技术在解决实体瘤方面优势明显，但是作为巨噬细胞体系的过继免疫治疗，实体瘤内部的抑制性TME通常会通过多种因素阻碍CAR-M细胞的治疗效果，并且CAR-M在进入实体瘤内部之后，也存在极化成为M2型巨噬细胞的风险。如何避免回输的巨噬细胞发展并产生TAM的促癌特性，是CAR-M技术发展中要解决的重要问题。对此，理想的设计应既能维持CAR-M自身的M1型特性，又能产生TME 逆转效应。而CAR-M信号转导功能的特异性元件的设计，为提高CAR-M的抗癌潜能提供了可能性。

发明内容

本发明的目的是提供一种肿瘤微环境调控型CAR-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用，以解决上述现有技术在CAR-M领域发展中的瓶颈问题，基于GM-CSF基序设计构建的肿瘤微环境调控型TMER CAR(单核)巨噬细胞，CAR-M scFV靶向杀伤肿瘤细胞后，不但能够维持自身肿瘤微环境中维持M1表型，并能够对TME中的TAM 实现再教育，逆转肿瘤微环境，实现更优抗肿瘤效应。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种肿瘤微环境调控型CAR-单核/巨噬细胞，其为包括嵌合抗原受体的复合结构，可产生GM-CSF胞内表达并分泌至胞外，促进CAR-单核/巨噬细胞形成 M1型巨噬细胞分化的同时，进一步调控肿瘤微环境；其中所述GM-CSF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种嵌合抗原受体，包括GM-CSF、HER2 scFv、α1β1整合素的跨膜区域、α1β1整合素胞内以及FcγRI跨膜信号传导域胞内。

优选的是，所述GM-CSF、HER2 scFv、α1β1整合素的跨膜区域、α1β1整合素胞内以及FcγRI跨膜信号传导域胞内的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-5所示。

本发明还提供一种重组载体，包括所述的嵌合抗原受体。

本发明还提供根据所述的肿瘤微环境调控型CAR-单核/巨噬细胞的制备方法，包括构建所述的重组载体，并将所述重组载体转染所述CAR-单核/巨噬细胞的步骤。

优选的是，所述重组载体的构建方法包括：

(1)构建嵌合抗原受体：将HER2 scFv、α1β1整合素的跨膜区域、α1β1整合素胞内、FcγRI跨膜信号传导域胞内使用linker进行连接后，再用P2A连接GM-CSF，合成嵌合抗原受体；

(2)将所述嵌合抗原受体与慢病毒载体重组，构建所述重组载体。

本发明还提供一种药物组合物，包括所述的CAR-单核/巨噬细胞或所述的嵌合抗原受体或所述的重组载体，连同药学上可接受的辅料或载体。

本发明还提供所述的CAR-单核/巨噬细胞在制备促进M1型巨噬细胞分化的药物中的应用。

本发明还提供所述的CAR-单核/巨噬细胞在制备治疗实体瘤药物中的应用；所述实体瘤可选择HER2高表达的实体肿瘤，但不限于此。

本发明公开了以下技术效果：

本发明基于GM-CSF基序设计构建了肿瘤微环境调控型TMER CAR(单核)巨噬细胞(Tumor Microenvironment Regulated CAR-M，TMER CAR-M)，基于本技术平台 GM-CSF基序与嵌合抗原受体形成复合结构，其构建的CAR-M能够自分泌GM-CSF 并至胞外，并导致产生更高水平的炎性抗癌细胞因子；恰能够使CAR-M scFV靶向杀伤肿瘤细胞的同时，维持自身保持巨噬细胞M1表型，免遭肿瘤微环境逆转，同时， GM-CSF会进入TME中，恰能够使其起到调控肿瘤微环境的作用，增强抗肿瘤效应。

本发明基于GM-CSF基序，设计适用于巨噬细胞功能的极化元件，设计并实施了一种肿瘤微环境调控型TMER CAR-M(TMER CAR-M)细胞技术平台，该技术平台显著提高CAR-M抗肿瘤特性，起到了维持M1表型以及调控肿瘤微环境的作用，适用于今后各类型CAR-M治疗实体肿瘤的应用及延伸设计。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明巨噬细胞特异活化型TMER CAR-M的构建及其表征：A：共聚焦显微镜观察TMER CAR的跨膜表达；B：qPCR检测TMER CAR的表达；C：共聚焦检测TMER CAR-M的HER2蛋白结合能力，标尺大小为30μm；

图2为本发明TMER CAR-M的活力检测；A：CCK-8检测TMER CAR-M的增殖情况；B：qPCR检测p53的表达情况；C：qPCR检测CCND-1的表达情况；D：qPCR检测Ki67的表达情况；*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01， *为P<0.05；

图3为本发明TMER CAR-M体外M1表型极化检测；A.qPCR检测CD80的表达情况；B.qPCR检测IFN-γ的表达情况；C.qPCR检测iNOS的表达情况；D.qPCR检测 CD206的表达情况；E.qPCR检测Arg-1的表达情况；F.qPCR检测IL-10的表达情况； *表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，*为P<0.05；

图4为本发明TMER CAR-M体外抗M2复极化检测；A.qPCR检测CD80的表达情况；B.qPCR检测IFN-γ的表达情况；C.qPCR检测iNOS的表达情况；D.qPCR检测CD206的表达情况；E.qPCR检测Arg-1的表达情况；F.qPCR检测IL-10的表达情况；*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，*为P<0.05；

图5为本发明TMER CAR-M体外调控M2型巨噬细胞逆转情况分析；A.qPCR检测CD206的表达情况；B.qPCR检测Arg-1的表达情况；C.qPCR检测IL-10的表达情况；D.qPCR检测CD80的表达情况；E.qPCR检测IFN-γ的表达情况；F.qPCR检测iNOS的表达情况；*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，*为 P<0.05；

图6为本发明小鼠HER2+-4T1肿瘤模型验证TMER CAR-M的抗肿瘤结果；A. TMERCAR-M治疗小鼠HER2+-4T1肿瘤模式图；B.TMER CAR-M治疗小鼠肿瘤生长曲线；C.TMER CAR-M治疗小鼠肿瘤生存曲线；D.TMER CAR-M治疗小鼠体重；*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，*为P<0.05。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1一种肿瘤微环境调控型CAR(单核)巨噬细胞的制备方法及功能验证

1、肿瘤微环境调控型TMER CAR-M的构建及表征

本研究前期参考CAR-T的体胞外结合理念，受益于包膜病毒的侵染出芽表达机制，采用慢病毒载体构建巨噬细胞的特异性CAR以及肿瘤微环境调控型TMER CAR-M，以HER2为模式分子成功建立肿瘤微环境调控型TMER CAR-M平台，于细胞膜表面表达跨膜HER2 scFv胞外段，筛选获得具有高亲和HER2结合活性的TMER CAR-M 稳转细胞系。

1.1慢病毒的构建和包装

基于慢病毒载体，通过将HER2 scFv、α1β1整合素的跨膜区域、α1β1整合素胞内、FcγRI跨膜信号传导域胞内和GFP使用linker进行连接，随后使用P2A连接GM-CSF 基序，合成嵌合抗原受体HER2 scFv-GM-CSF(由生工生物工程(上海)股份有限公司进行的序列合成)，将其转染巨噬细胞，构建巨噬细胞特异性CAR，通过将合成的HER2 scFv-GM-CSF-CAR慢病毒质粒与Rev、Gag、VSV三种辅助质粒进行共转染，使其包装成为完整的HER2 scFv-GM-CSF-CAR慢病毒。

具体步骤如下：

(1)将4×10⁵个处于对数生长期的HEK293T细胞均匀接种于6孔板中，在37℃、 5％CO₂细胞培养箱中静置培养至细胞汇合度达到60％-70％，按3:1:1:1比例分别取质粒pCDH-HER2 scFv-GM-CSF、Rev、Gag和VSV加入到装有Opti-MEM的离心管中混匀室温孵育，再加入TurboFect Transfection Reagent转染试剂，枪头轻柔吹打混匀，室温孵育；

(2)将上述孵育好的混合液缓慢滴加到接种了293T细胞的6孔板中，边滴加边轻轻摇动培养板，置于37℃、5％CO₂培养16-24h后，弃掉6孔板各孔中的转染混合液，添加2-3mL包含10％胎牛血清(FBS)的Advanced DMEM完全培养基，将细胞培养板重置于37℃、5％CO₂培养48h，待合成为HER2 scFv-GM-CSF-CAR慢病毒；

(3)为去除细胞碎片，将含有慢病毒的培养基于4℃、4000g下离心10min。用 0.22μm的过滤器过滤上清液并收集，离心机4℃、15000g离心2h。弃上清，利用病毒保存液重悬病毒颗粒，再10000g离心5min后取上清于-80℃中保存备用；

(4)随后，检测包装出来的慢病毒滴度，向9个无菌的1.5mL离心管中加入90μLDMEM完全培养基，再将10μL已获得的重组慢病毒颗粒HER2 scFv-GM-CSF-CAR加入第一个离心管中吹打均匀，吸出10μL混合液加入到第二个离心管中，如此连续直至最后一管，每组设置三个重复。将5×10⁴个HEK293T细胞均匀接种于96孔板中，细胞汇合度达到60％-70％时依次加入上述稀释好的各梯度慢病毒稀释液，同时设置不加入病毒稀释液的293T细胞作为阴性对照；培养24h后，更换新鲜的DMEM完全培养基，48h后于倒置荧光显微镜下观察各孔荧光情况。慢病毒滴度计算公式为：病毒滴度 (TU/mL)＝平均发绿色荧光细胞数×病毒稀释倍数/接种病毒液的体积(mL)，单位为 TU/mL。

上述构建嵌合抗原受体的各元件序列如下：

GM-CSF序列(SEQ ID NO:1)：

atgtggctgcagaacctgctgttcctgggcatcgtggtgtacagcctgagcgcccccacaaggtctccaatcacagtgaccag accctggaagcacgtggaggccatcaaggaggccctgaatctgctggacgacatgcccgtgaccctgaacgaagaggtggaggt ggtgtccaacgagttcagcttcaagaagctgacctgtgtgcagaccaggctgaagatcttcgagcagggcctgaggggcaacttcac caagctgaagggagccctgaatatgaccgccagctactaccagacctactgcccccccacccctgagacagattgcgagacccag gtgaccacctacgccgacttcatcgatagcctcaagacctttctgacagacatccccttcgagtgtaagaagccaggccagaag。

HER2 scFv序列(SEQ ID NO:2)：

atgaatttacaaccaattttctggattggactgatcagttcagtttgctgtgtgtttgctctagcttctcaggtacaactgcagcagtc tggacctgaactgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcctctgggtatcctttcacaaactatggaatgaactgg gtgaagcaggctccaggacagggtttaaagtggatgggctggattaacacctccactggagagtcaacatttgctgatgacttcaagg gacggtttgacttctctttggaaacctctgccaacactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaagtgaagacatggctacatatttctgt gcaagatgggaggtttaccacggctacgttccttactggggccaagggaccacggtcaccgtttcctctggcggtggcggttctggtggcggtggctccggcggtggcggttctgacatccagctgacccagtctcacaaattcctgtccacttcagtaggagacagggtcagcat cacctgcaaggccagtcaggatgtgtataatgctgttgcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaacttctgatttactcggc atcctcccggtacactggagtcccttctcgcttcactggcagtggctctgggccggatttcactttcaccatcagcagtgtgcaggctga agacctggcagtttatttctgtcagcaacattttcgtactccattcacg。

α1β1整合素的跨膜区域序列(SEQ ID NO:3)：

ttatgggtcatcctgctgagtgcttttgccggattgttgctgttaatgctgctcattttagcactgtgg。

α1β1整合素胞内序列(SEQ ID NO:4)：

aagatcggattcttcaagagacctctgaagaagaagatggagaag。

FcγR I跨膜信号传导域胞内序列(SEQ ID NO:5)：

aagatccatagactgcagagagagaagaagtacaacctggaggtgcctctggtgagcgagcagggcaagaaggccaaca gcttccagcaggtgaggagcgacggcgtgtacgaggaggtgaccgccaccgccagccagaccacccctaaggaggcccctgac ggccctaggagcagcgtgggcgactgtggccctgagcagcctgagcctctgcctcctagcgacagcaccggcgcccagaccagc cagagc。

GFP序列(SEQ ID NO:6)：

gtgagtaagggcgaggagctgtttaccggcgtggtgcccatcctggtggagctggacggcgacgtgaacggccacaagttc agcgtgagcggcgagggggagggcgacgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatttgcacaaccggcaagctgcccgtg ccatggcctaccctggtgaccaccctgacatacggcgtccagtgttttagcaggtatcccgaccacatgaagcagcacgacttctttaa gagcgccatgcccgagggctacgtgcaggagaggaccatcttcttcaaggacgacggtaactacaagaccagagccgaggtgaa gttcgagggcgacaccctggtgaaccggatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggtaacatcctgggccacaagctg gagtataactataatagccacaacgtgtacatcatggccgacaagcagaagaacggcattaaggtgaacttcaagatcagacataac atcgaggacggatctgtgcagctggccgaccactaccagcagaacacccctatcggagatggaccagtgctgctgcctgataatca ctatctgagcacacagtctgccctgagcaaagatcctaatgaaaagagagatcacatggtgctgctggagtttgtgacagctgctgga ataacactgggcatggatgagctgtataagtaa。

Linker序列(SEQ ID NO:7)：

ggcggtggttccggcggtggatctggtggaggaactggaggaggttcaggaggtggt。

P2A序列(SEQ ID NO:8)：

ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct。

1.2制备TMER CAR-M细胞系

在包装为完整的慢病毒并检测了其滴度后，使用HER2 scFv-GM-CSF-CAR慢病毒感染巨噬细胞，获得TMER CAR-M稳转细胞系，取巨噬细胞接种于6孔板内，待其生长到细胞汇合度至60-70％时，以每9：1的比例向巨噬细胞的培养基中加入HER2 scFv- GM-CSF-CAR慢病毒病毒颗粒，24h前后更换新鲜DMEM完全培养基，48h后即完成巨噬细胞的慢病毒感染；观察细胞生长情况及形态变化，传代至新的培养瓶或培养皿中进行扩增或者冻存。

1.3qPCR检测

提取上述稳转细胞株的总RNA，利用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒检测上述的稳转细胞株中融合蛋白的表达情况，按照试剂盒说明书进行实验，qPCR实验步骤如下：

(1)正常溶解2×SuperReal Premix Plus、50×ROX Reference Dye、模板、引物和RNase-free ddH₂O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀；

(2)在冰上将反转得到的cDNA模板以一定体系与正向引物、反向引物、Mix、 ROX、ddH₂O混合，利用移液枪将混合液添加入八连管中，20μL体系包括：10μL 2×SuperRealPremix Plus、0.6μL正向引物(10μM)、0.6μL反向引物(10μM)、0.1-2μL cDNA模板、0.4μL 50×ROX Reference Dye，使用RNase-free ddH₂O补充至总体积20μL；

(3)盖上管盖，吹打混匀，用微量离心机离心5-10s，确保所有组分均在管底；

(4)将反应体系放置于RT-qPCR仪ABI 7300中，设置仪器参数，95℃预变性 15min、95℃变性10s、60℃±1℃退火20s，72℃延伸31s，40个循环，运行程序，待程序结束后导出Ct值，并利用2^-ΔΔCt(Livak)法计算最终结果。

qPCR结果显示：TMER CAR-M融合蛋白的成功表达；共聚焦显微镜结果成功验证了HER2 scFv的HER2结合活性，如图1所示。这为后期研究提供细胞治疗模型。

2、TMER CAR-M的活力检测

(1)CCK细胞增殖试验

①于96孔板中每孔加入100μL的不同组的巨噬细胞悬液，分别为J774A.1(UTD-M)、Empty-pCDH J774A.1(Empty)、HER2 scFv J774A.1(CAR-like)、HER2 scFv CARJ774A.1(First generation CAR-M)、HER2 scFv-GM-CSF CAR J774A.1(TMER CAR-M) 密度为1×10⁴个细胞/mL，置于37℃、5％CO₂的培养箱中静置培养；

②细胞培养24-48h之后，吸去96孔板中的培养基，用PBS清洗细胞2-3次，再向96孔板中加入10μL的CCK8检测溶液，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养3-4h；

③用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度，靶细胞细胞活性大小＝(效靶比作用组吸光度－效应细胞对照组吸光度)/(靶细胞阳性对照组吸光度－空白孔吸光度)。

(2)同时，分别提取各组细胞总RNA，采用qPCR检测TMER CAR-M活性，检测方法同上述的qPCR的检测方法。

结果如图2所示，TMER CAR-M组细胞增殖显著增强于CAR-Like组和Firstgeneration CAR-M组(图2A)。qPCR检测结果显示，TMER CAR-M组细胞的增殖因子CCND1和Ki67的mRNA表达水平均显著强于CAR-Like组和First generation CAR- M组，且p53表达水平低于CAR-Like组和First generation CAR-M组，见图2B-D。研究结果提示，TMER CAR-M的基础活力显著增强，这意味着GM-CSF的表达增强了 TMER CAR-M的活力。

3、TMER CAR-M的体外M1表型极化检测

将上述构建的TMER CAR-M，分别基于2×10⁵个细胞/mL的密度，分别于6孔板中进行培养并检测，具体操作为：

于6孔板中分别接种4×10⁵个UTD-M、Empty、CAR-like、First generation CAR-M、TMER CAR-M，以10％FBS的DMEM高糖培养基于37℃、5％CO₂培养箱中静置培养48h，随后分别提取各组细胞总RNA，采用qPCR检测TMER CAR-M极化，检测方法同上述的qPCR的检测方法。

结果如图3所示，与CAR-like组和和First generation CAR-M相比，TMER CAR- M组M1型因子CD80、IFN-γ和iNOS表达水平均显著上升，但其M2型因子CD206、 Arg-1和IL-10表达水平均显著下降，说明TMER CAR-M组相对于CAR-like组和First generation CAR-M组均呈现显著性的M1型抗肿瘤巨噬细胞特性，这意味着GM-CSF 在TMER CAR-M的极化方面发挥了作用，提示TMER CAR-M可能抗M2复极化。

4、TMER CAR-M体外抗M2复极化验证

采用肿瘤细胞培养上清液体外模拟肿瘤抑制性微环境体系，分别作用TMER CAR-M、CAR-Like及对照组普通巨噬细胞，将构建成功的TMER CAR-M细胞与CAR-Like 和Firstgeneration CAR-M组进行对照分析，肿瘤培养上清对TMER CAR-M诱导5d，提取其提取细胞总RNA，qPCR检测进一步验证TMER CAR-M抗极化能力。具体步骤包括：

(1)于6孔板中每孔加入2×10⁵个的UTD-M、CAR-like、First generation CAR-M和TMER CAR-M细胞，置于37℃、5％CO₂的培养箱中静置培养；

(2)待UTD-M、CAR-like、First generation CAR-M和TMER CAR-M组细胞贴壁后，吸去孔板中的培养基，用PBS清洗细胞2-3次，分别向6孔板中每组加入肿瘤细胞培养上清，每组实验设置3个平行孔。

(3)细胞诱导5d后，吸去6孔板中的培养基，用PBS清洗细胞2-3次，再向6 孔板中每孔加入1mL的Trizol，提取RNA，利用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green) 试剂盒，并按照试剂盒说明书进行实验。

(4)正常溶解2×SuperReal Premix Plus、50×ROX Reference Dye、模板、引物和RNase-free ddH₂O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀；

(5)在冰上将反转得到的cDNA模板以一定体系与正向引物、反向引物、Mix、 ROX、ddH₂O混合，利用移液枪将混合液添加入八连管中，20μL体系包括：10μL 2×SuperRealPremix Plus、0.6μL正向引物(10μM)、0.6μL反向引物(10μM)、0.1-2μL cDNA模板、0.4μL 50×ROX Reference Dye，使用RNase-free ddH₂O补充至总体积20μL；

(6)盖上管盖，吹打混匀，用微量离心机离心5-10s，确保所有组分均在管底；

(7)将反应体系放置于RT-qPCR仪ABI 7300中，设置仪器参数，95℃预变性 15min、95℃变性10s、60±1℃退火20s，72℃延伸31s，40个循环，运行程序，待程序结束后导出Ct值，并利用2-^ΔΔCt(Livak)法计算最终结果。

结果如图4所示，在肿瘤上清液的作用下，与TMER CAR-M组相比，CAR-like 组、First generation CAR-M组及普通巨噬细胞组M2型因子CD206、Arg-1和IL-10表达水平均显著上升(如图4D -F)，提示CAR-like组、和First generation CAR-M组及普通巨噬细胞组在肿瘤微环境诱导性出现M2型极化，而TMER CAR-M组仍然保持显著性的M1型巨噬细胞特征。

5、TMER CAR-M体外调控M2型巨噬细胞逆转为M1型

采用肿瘤细胞培养上清液体外模拟肿瘤抑制性微环境体系，分别作用TMER CAR-M、CAR-Like及对照组普通巨噬细胞，将构建成功的TMER CAR-M细胞与CAR-Like 和Firstgeneration CAR-M组进行对照分析，肿瘤培养上清对普通巨噬细胞诱导，随后使用TMERCAR-M上清进行诱导，提取其提取细胞总RNA，qPCR检测进一步验证 TMER CAR-M抗极化能力。具体步骤包括：

(1)于6孔板中每孔加入2×10⁵个普通巨噬细胞，使用肿瘤细胞培养上清诱导5d，置于37℃、5％CO₂的培养箱中静置培养，每组实验设置3个平行孔；

(2)细胞诱导5d后，吸去6孔板中的培养基，用PBS清洗细胞2-3次，使用UTD- M、CAR-like、First generation CAR-M和TMER CAR-M细胞培养液上清进行诱导；

(3)细胞诱导5d后，吸去6孔板中的培养基，用PBS清洗细胞2-3次，再向6 孔板中每孔加入1mL的Trizol，提取RNA，检测方法同上述的qPCR的检测方法。

结果如图5A-C所示，与CAR-like组、First generation CAR-M组及普通巨噬细胞组相比，在TMER CAR-M组上清液的作用下，CAR-like组、First generation CAR-M组及普通巨噬细胞组M2型因子CD206、Arg-1和IL-10表达水平均显著上升，提示CAR- like组、Firstgeneration CAR-M组及普通巨噬细胞组在肿瘤微环境中不能诱导M2型巨噬细胞重编程为M1表型，而TMER CAR-M组上清诱导的巨噬细胞显示出显著性的 M1型巨噬细胞特征，说明TMER CAR-M上清能够调控M2型巨噬细胞逆转为M1型，初步评价其体外肿瘤微环境调控能力。

6、TMER CAR-M体内治疗肿瘤效果验证

本研究前期初探TMER CAR-M在体内靶向肿瘤能力的验证，使用小鼠HER2⁺-4T1 肿瘤模型验证TMER CAR-M的抗肿瘤效果，HER2⁺-4T1肿瘤模型的建立包括如下步骤：

(1)小鼠乳腺癌细胞系HER2⁺-4T1利用1640培养基(hyclone)于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

(2)4-6周龄的雌性BALB/c小白鼠购买后需于恒温无菌通风小鼠饲养间饲养一周以上后再进行小鼠实验；

(3)将HER2⁺-4T1细胞扩大培养，待小鼠饲养约一周后，消化HER2⁺-4T1细胞，用PBS清洗2-3次，并利用PBS重悬，稀释密度为10⁷个细胞/mL，将100μL细胞重悬液以皮下注射的方式注射到小鼠右肢上方皮下；

(4)将UTD-M、Empty、CAR-like、First generation CAR-M和TMER CAR-M细胞均利用DMEM高糖培养基于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

(5)待HER2⁺-4T1细胞成瘤后，每组设置4只小鼠的平行实验，分别将100μL PBS或细胞重悬液通过尾静脉方式进行注射，UTD-M、Empty、CAR-like、First generation CAR-M和TMER CAR-M组分别注射3×10⁶个细胞，在注射第一次后的第5d，进行第二次注射，每组注射量为3×10⁶个细胞，总共注射了两次。

(6)用电子游标卡尺对小鼠肿瘤的长和宽分别进行测量，利用电子天平对小鼠体重进行测量，小鼠肿瘤体积＝(长*宽²)/2，每两天测量一次，最后计算小鼠生存曲线。

结果见图6，相对于CAR-like组和First generation CAR-M组，TMER CAR-M组肿瘤得到了明显抑制，生存期延长，取得了显著的治疗效果。另外，相对于CAR-like 组和Firstgeneration CAR-M组，TMER CAR-M组体重无明显变化，提示其具有较好安全性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 西安电子科技大学

<120> 一种肿瘤微环境调控型CAR-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtggctgc agaacctgct gttcctgggc atcgtggtgt acagcctgag cgcccccaca 60

aggtctccaa tcacagtgac cagaccctgg aagcacgtgg aggccatcaa ggaggccctg 120

aatctgctgg acgacatgcc cgtgaccctg aacgaagagg tggaggtggt gtccaacgag 180

ttcagcttca agaagctgac ctgtgtgcag accaggctga agatcttcga gcagggcctg 240

aggggcaact tcaccaagct gaagggagcc ctgaatatga ccgccagcta ctaccagacc 300

tactgccccc ccacccctga gacagattgc gagacccagg tgaccaccta cgccgacttc 360

atcgatagcc tcaagacctt tctgacagac atccccttcg agtgtaagaa gccaggccag 420

aag 423

<210> 2

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaatttac aaccaatttt ctggattgga ctgatcagtt cagtttgctg tgtgtttgct 60

ctagcttctc aggtacaact gcagcagtct ggacctgaac tgaagaagcc tggagagaca 120

gtcaagatct cctgcaaggc ctctgggtat cctttcacaa actatggaat gaactgggtg 180

aagcaggctc caggacaggg tttaaagtgg atgggctgga ttaacacctc cactggagag 240

tcaacatttg ctgatgactt caagggacgg tttgacttct ctttggaaac ctctgccaac 300

actgcctatt tgcagatcaa caacctcaaa agtgaagaca tggctacata tttctgtgca 360

agatgggagg tttaccacgg ctacgttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtt 420

tcctctggcg gtggcggttc tggtggcggt ggctccggcg gtggcggttc tgacatccag 480

ctgacccagt ctcacaaatt cctgtccact tcagtaggag acagggtcag catcacctgc 540

aaggccagtc aggatgtgta taatgctgtt gcctggtatc aacagaaacc aggacaatct 600

cctaaacttc tgatttactc ggcatcctcc cggtacactg gagtcccttc tcgcttcact 660

ggcagtggct ctgggccgga tttcactttc accatcagca gtgtgcaggc tgaagacctg 720

gcagtttatt tctgtcagca acattttcgt actccattca cg 762

<210> 3

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttatgggtca tcctgctgag tgcttttgcc ggattgttgc tgttaatgct gctcatttta 60

gcactgtgg 69

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagatcggat tcttcaagag acctctgaag aagaagatgg agaag 45

<210> 5

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagatccata gactgcagag agagaagaag tacaacctgg aggtgcctct ggtgagcgag 60

cagggcaaga aggccaacag cttccagcag gtgaggagcg acggcgtgta cgaggaggtg 120

accgccaccg ccagccagac cacccctaag gaggcccctg acggccctag gagcagcgtg 180

ggcgactgtg gccctgagca gcctgagcct ctgcctccta gcgacagcac cggcgcccag 240

accagccaga gc 252

<210> 6

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgagtaagg gcgaggagct gtttaccggc gtggtgccca tcctggtgga gctggacggc 60

gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgagc ggcgaggggg agggcgacgc cacctacggc 120

aagctgaccc tgaagttcat ttgcacaacc ggcaagctgc ccgtgccatg gcctaccctg 180

gtgaccaccc tgacatacgg cgtccagtgt tttagcaggt atcccgacca catgaagcag 240

cacgacttct ttaagagcgc catgcccgag ggctacgtgc aggagaggac catcttcttc 300

aaggacgacg gtaactacaa gaccagagcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

aaccggatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gtaacatcct gggccacaag 420

ctggagtata actataatag ccacaacgtg tacatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480

attaaggtga acttcaagat cagacataac atcgaggacg gatctgtgca gctggccgac 540

cactaccagc agaacacccc tatcggagat ggaccagtgc tgctgcctga taatcactat 600

ctgagcacac agtctgccct gagcaaagat cctaatgaaa agagagatca catggtgctg 660

ctggagtttg tgacagctgc tggaataaca ctgggcatgg atgagctgta taagtaa 717

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcggtggtt ccggcggtgg atctggtgga ggaactggag gaggttcagg aggtggt 57

<210> 8

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

Claims

1.一种肿瘤微环境调控型CAR-单核/巨噬细胞在制备治疗实体瘤药物中的应用，其特征在于，其为包括嵌合抗原受体的复合结构，产生GM-CSF胞内表达并分泌至胞外，促进CAR-单核/巨噬细胞形成M1型巨噬细胞分化的同时，进一步调控肿瘤微环境；

所述嵌合抗原受体由GM-CSF、HER2 scFv、α1β1整合素的跨膜区域、α1β1整合素胞内以及FcγRI跨膜信号传导域胞内组成；所述GM-CSF、HER2 scFv、α1β1整合素的跨膜区域、α1β1整合素胞内以及FcγRI跨膜信号传导域胞内的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-5所示。

2.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由GM-CSF、HER2 scFv、α1β1整合素的跨膜区域、α1β1整合素胞内以及FcγRI跨膜信号传导域胞内组成；

所述GM-CSF、HER2 scFv、α1β1整合素的跨膜区域、α1β1整合素胞内以及FcγRI跨膜信号传导域胞内的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-5所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求2所述的嵌合抗原受体。

4.根据权利要求1中所述的肿瘤微环境调控型CAR-单核/巨噬细胞的制备方法，其特征在于，包括构建权利要求3所述的重组载体，并将所述重组载体转染所述CAR-单核/巨噬细胞的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述重组载体的构建方法包括：

（1）构建嵌合抗原受体：将HER2 scFv、α1β1整合素的跨膜区域、α1β1整合素胞内、FcγRI跨膜信号传导域胞内使用linker进行连接后，再用P2A连接GM-CSF，合成嵌合抗原受体；

（2）将所述嵌合抗原受体与慢病毒载体重组，构建所述重组载体。

6.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1中所述的CAR-单核/巨噬细胞或权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的重组载体，连同药学上可接受的辅料或载体。