CN108546679B - 在体外大量扩增人类成熟高活性树突状细胞的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种制备成熟高活性树突状细胞的方法，包括：1)从外周血或脐带血收集单个核细胞；2)诱导所述单个核细胞分化为树突状细胞；3)让所述树突状细胞与来自非致病性的非人类灵长类动物T淋巴细胞病毒蛋白接触；以及4)筛选和鉴定获得的成熟高活性树突状细胞。本发明还提供了通过该方法制备的成熟高活性树突状细胞及其使用方法。本发明所制备的树突状细胞增殖能力强、活性高且易于进行基因修饰改造，优于现有技术中所使用的树突状细胞。这些细胞和使用方法在肿瘤或病毒的免疫治疗方面有广阔的应用前景。

Description

在体外大量扩增人类成熟高活性树突状细胞的方法及其应用
技术领域
本发明涉及制备树突状细胞的方法，尤其是在体外制备成熟高活性树突状细胞的方法。本发明还涉及由该方法制备的成熟高活性树突状细胞及其相关应用。
背景技术
免疫系统是人体识别和清除外来病原微生物(病毒)以及体内变异细胞(肿瘤)的最重要的系统。在免疫系统中发挥作用的功能单元是各类型的免疫细胞，包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)以及树突状细胞等。其中，B淋巴细胞通过产生抗体来抵抗外来抗原的入侵，主要参与体液免疫；T淋巴细胞、NK细胞等主要介导细胞免疫。树突状细胞作为抗原递呈细胞，在T细胞及NK细胞介导的细胞免疫方面起到非常关键的作用。
近两年，肿瘤免疫治疗成为全球关注的焦点。以PD1/PDL1抗体和CAR-T细胞为首的抗肿瘤免疫治疗药物取得突破性进展，先后被FDA批准上市。但是，不能忽视的是，无论是PD1/PDL1抗体还是CAR-T细胞技术，都还存在着一些缺陷亟待改善。首先是安全性问题。以PD1/PDL1抗体为例，因其缺乏良好的靶向性，用药后容易引起自身免疫性疾病，临床上已经证实该药物可引起严重的心肌炎并致死。同样，CAR-T 细胞引发的强烈的细胞因子风暴也会危及性命。其次是有效性问题。PD1/PDL1等抗体虽然在黑色素瘤、肾癌等多种癌症中都表现出较好的效果，但整体有效率在20％左右。CAR-T细胞目前只能治疗血液性肿瘤中的少部分B细胞淋巴瘤，而对实体瘤疗效不明显，适用范围非常窄。因此，通过免疫细胞抗击癌症的目标依旧任重而道远。
树突状细胞(dendritic cell，DC)作为人体天然免疫系统中最核心的成员，功能最强大的抗原递呈细胞，其潜在的应用价值受到极大的关注。DC细胞主要分为两个亚群，分别是骨髓来源的DC细胞(mDCs)和浆细胞型DC细胞(pDCs)。mDC细胞中的 CD11c+亚型相对丰富，而占少数的CD141+mDC细胞展现出一种强大的将MHC-I上的胞外抗原递呈到CD8T细胞上、并促进其分化成细胞毒性T细胞(CTL)的能力。在正常生理条件下，DC细胞处于未成熟及未活化状态，但在炎症因子、微生物等刺激下，pDC细胞通过分泌大量干扰素α(IFNα)介导抗炎反应；而mDC细胞通过将抗原呈递给幼稚T细胞，使其成熟活化为特异性杀伤的效应毒性T细胞，后者在抗肿瘤及抗病毒方面具有强大的作用。由此可知，树突状细胞通过活化特异性T细胞可以抵御肿瘤或病毒感染，理论上是一个非常好的临床应用对象。
但是，在癌症治疗方面，至今为止，仅有Sipuleucel-T这一个DC疫苗被FDA批准用于无症状或轻微症状的去势抵抗性前列腺癌。该疫苗是通将外周血单核细胞经 GM-CSF及IL4等细胞因子及肿瘤抗原肽刺激后产生的一种单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)，在临床治疗中表现出一定的疗效，但总的临床受益情况却相当有限。此种方法是目前临床上常用的方法，存在以下缺陷：第一，体外形成的MoDCs生长潜能有限并且很难培养较长时间，因此，多轮疫苗接种需要重复制备MoDC细胞才能完成，对患者身体损伤较大；第二，体外成熟活化的MoDCs并非真正意义上的CD141+DCs 细胞，其功能发挥上不能媲美原代DC细胞。而人体血液中，原代DC细胞仅占单个核细胞(mononuclear cell)数量的1％，难以达到治疗所需数量要求。
比较理想的能够取代MoDCs疫苗的应当是一类培养流程简单，细胞增殖能力强，能够突破细胞数量限制的DC样永生化细胞株。MUTZ-3作为一株髓性白血病细胞株，能在体外成熟并分化成DC样细胞。MUTZ-3细胞在培养中能够稳定地维持在前DC样细胞状态，可提供大量诱导性DC样细胞供癌症疫苗研发使用。但其作为异源细胞，很可能被患者机体排斥掉或引起严重副作用，其临床效果还有待检验。为此，研究新的产生树突状细胞的方法十分必要。
在抗病毒感染方面，树突状细胞的潜能还未被开发出来。据报道，目前在世界范围内，约2.4亿人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，中国有9000万人受感染；全球约1.3～1.5亿人感染丙型肝炎病毒((hepatitis C virus，HCV)，中国感染人数为 1000万人。但是，针对肝炎病毒感染，目前仅有预防性乙肝疫苗上市，该疫苗对于已经感染者不起任何作用，也即无法终止乙肝病毒继续诱发肝组织癌变的步伐。人乳头状瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)已经被证实是宫颈癌、头颈癌的诱发因素，但目前也仅有预防性疫苗可用，治疗性细胞产品和疫苗的研发仍未成功。针对艾滋病病毒(Human ImmunodeficiencyVirus,HIV)、流感病毒等变异性大的病毒，预防性疫苗收效甚微，治疗难关依然存在。因此，探讨以树突状细胞为基础的抗病毒研究显得十分重要，且如何使树突状细胞在数量上满足要求，在功能发挥方面实现最大化，是研究中需要重点考虑的。
灵长类T淋巴细胞病毒(Primate T-cell lymphotropic viruses，PTLVs)包含猿猴类病毒(STLVs)以及人类病毒(HTLVs)。人类HTLVs病毒中，HTLV1和HTLV2较为常见，前者感染人群后约有5％的被感染者患病，其中包含人T细胞白血病/淋巴瘤和热带痉挛性瘫痪，HTLV2病毒感染与疾病关联性不大。HTLV3及HTLV4病毒感染与疾病的关系还未可知。猿猴类STLVs病毒目前仅在少数猴子和大猩猩体内发现，其中STLV1 病毒会导致猿类白血病。在研究人T细胞白血病/淋巴瘤的过程中有研究者认为， HTLVs病毒蛋白Tax可能在体外研究中使T细胞及树突状细胞成熟高活性。但迄今为止，未见非人类灵长类动物T淋巴细胞病毒Tax蛋白在体外能诱导树突状细胞成熟并维持高活性的报道。
发明内容
在一方面，本发明提供了一种制备成熟高活性树突状细胞的方法，其包括：
1)从外周血或脐带血收集单个核细胞；
2)诱导所述单个核细胞分化为树突状细胞；
3)让所述树突状细胞与来自非人类灵长类动物T淋巴细胞病毒的Tax蛋白接触；以及
4)筛选和鉴定获得的成熟高活性树突状细胞。
在一些实施方案中，所述Tax蛋白能够激活NF-κB、AP1和/或STAT信号通路。
在一些实施方案中，所述Tax蛋白具有如SEQ ID NO：1-4所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，步骤2)包括让所述单个核细胞依次接触PHA和IL-2或者让所述单个核细胞接触GM-CSF和IL-4。
在一些实施方案中，步骤3)包括将包含所述Tax蛋白的编码核酸的慢病毒载体引入所述树突状细胞。
在一个具体实施方案中，所述Tax蛋白的编码核酸具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，该方法还包括将肿瘤抗原或病毒抗原表达载体引入所述成熟高活性树突状细胞的步骤。
在另一方面，本发明提供了通过上述方法制备的成熟高活性树突状细胞。
在另一方面，本发明提供了一种制备细胞毒性T淋巴细胞的方法，包括让负载了肿瘤抗原或病毒抗原的所述成熟高活性树突状细胞与来自外周血或脐带血的单个核细胞混合培养，并回收CD3+T细胞。
在另一方面，本发明提供了一种制备自然杀伤细胞的方法，包括让所述成熟高活性树突状细胞与来自外周血或脐带血的单个核细胞混合培养，并回收CD3-CD56+细胞。
在另一方面，本发明提供了一种制备Tγδ细胞的方法，包括让负载了肿瘤抗原或病毒抗原的所述成熟高活性树突状细胞与来自外周血或脐带血的单个核细胞混合培养，并回收CD3+TCRγδ+T细胞。在另一方面，本发明提供了所述成熟高活性树突状细胞在制备抗肿瘤或抗病毒的细胞产品中的应用。
本发明采用来自STLV病毒的Tax蛋白成熟高活性树突状细胞，有利于大量生产基础研究以及临床应用所需的树突状细胞。本发明所制备的树突状细胞增殖能力强、活性高且易于进行基因修饰改造，优于现有技术中所使用的树突状细胞。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
本发明人通过对HTLVs和STLVs病毒中Tax蛋白氨基酸序列的对比分析，发现 Tax在PTLVs病毒中的同源性很高，达74％以上。其中，HTLV1和STLV1Tax同源性高达95％以上，HTLV3和STLV3Tax蛋白同源性也高达90％以上。这些信息提示， STLVs病毒中Tax蛋白的功能可能与HTLV Tax蛋白的功能类似，可能通过STLVs病毒的Tax蛋白产生成熟高活性树突状细胞。
STLV1、STLV2、STLV3、和STLV4病毒Tax蛋白的氨基酸序列分别参见SEQ ID NO：1-4。本发明人从外周血或脐带血分离单个核细胞，在细胞因子存在下对其进行培养，诱导其分化为树突状细胞，接着借由慢病毒载体(也可以通过转染、电转、腺病毒、逆转录病毒等方式)将Tax蛋白编码核苷酸整合进该树突状细胞基因组，最终获得了成熟高活性树突状细胞。所得到的成熟高活性树突状细胞可以直接诱导自然杀伤细胞的生成，或者在通过慢病毒载体而负载了肿瘤抗原或病毒抗原后，诱导细胞毒性 T淋巴细胞、NK细胞或Tγ/δ细胞的生成。
慢病毒载体构建及慢病毒生产
A.Tax慢病毒载体构建及慢病毒生产
1)此处以STLV3病毒Tax基因为例，其氨基酸序列是唯一的，详见SEQ ID NO3，编码核苷酸序列参见SEQ ID NO：5，需说明的是，任何修改核苷酸而不改变氨基酸的序列仍属于本发明范围内。将该序列委托北京金维智生物科技有限公司进行密码子优化及全基因合成，然后插入慢病毒载体EcoRI-BamHI位点，转化到 E.coli，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒；
2)将获得的Tax慢病毒载体与混合包装质粒(包括VSV-G、Gag-Pol和Rev的表达质粒)通过转染试剂(例如，磷酸钙转染试剂、脂质体转染试剂、高分子聚合物转染试剂等)共转染293细胞(或293T细胞或293FT细胞)；
3)浓缩。方法1：收集病毒上清液。25,000rpm转速，4℃，离心2小时。方法2：病毒上清液中加入PEG8000及适当浓度的NaCl溶液，常温或4℃条件下，1600g或 3000rpm，离心30～60min；
4)弃上清，病毒沉淀用RPMI1640培养基重悬后冻存于-80℃冰箱。
B.含肿瘤或病毒蛋白的载体构建及慢病毒生产
1)筛选来自肿瘤相关的或特异性抗原。其中，肿瘤相关抗原表现为在肿瘤细胞中异常高表达，而在正常组织细胞中表达量较低。肿瘤特异性抗原，是指在肿瘤细胞中因基因突变进而致氨基酸发生变异的蛋白，如：hRAS，kRAS等。另有一类癌症-睾丸蛋白如MAGE家族蛋白、NY-ESO-1、gp100、GPC3、AFP蛋白等。
2)筛选来自病毒的抗原。例如HBV抗原HbsAg、HbcAg、HbxAg等；HCV抗原 NS1、NS2、NS3、NS4、NS5等；HPV抗原如E6、E7等；EBV抗原如EBNA1、LAMP2 等；HTLV病毒抗原如Tax、Hbz等；HIV病毒抗原如Gag等；还包括SARS、Ebola、流感病毒等核心保守抗原等。
3)将肿瘤或病毒的抗原基因克隆到合适的慢病毒载体上，并生产相应的慢病毒，方法同上文Tax慢病毒生产。
通过外周血原代树突状细胞建立成熟高活性树突状细胞株
例如可以包括以下步骤：
1)无菌环境下抽取患者或健康人静脉血10mL；
2)将抗凝管内10mL血液转移到装有10mL PBS缓冲液的50mL离心管内，轻轻混合；
3)取15mL Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)溶液加入到另一支无菌50mL离心管内；
4)将20mL稀释后的血液沿离心管壁轻轻加到Ficoll液面上；
5)室温条件下，400g离心30min；
6)用移液管尽可能多地吸弃最上层血浆，外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)的细胞层位于稀释后的血浆/Ficoll交界面；
7)小心收集白膜层，加入适量的PBS缓冲液保证总体积为40mL，200g常温离心10min；
8)弃上清，用20mL PBS重悬细胞，200g常温离心10min；
9)弃上清，含血清RPMI1640培养基重悬细胞，计数；
10)转移2×106个新鲜的PBMCs细胞至6孔板的一个孔内，加入5μg/mL PHA(浓度例如可以在1-30μg/mL的范围)刺激并培养细胞；
11)经PHA处理约24小时之后，收集细胞，离心弃上清，用2ml RPMI1640培养基重悬洗涤细胞，离心；
12)弃上清，加入2ml含血清PRMI1640重悬细胞并转移至新的6孔板内，加入100 单位/mL IL-2继续培养细胞4-5天；
13)将细胞悬液转移至15ml离心管内，1500rpm离心5min；
14)弃上清，RPMI1640培养基重悬细胞，计数；
15)接种2×106个细胞于6孔板内，向孔内加入MOI为10-50的Tax慢病毒和6-10 μg/ml聚凝胺，共培养16-24小时；
16)收集细胞，离心，弃上清；
17)RPMI培养基重悬洗涤细胞，离心，弃上清；用含血清RPMI1640培养基重悬细胞，加入100单位/ml IL2后继续培养细胞；
18)细胞在含有100单位/ml IL2的培养基内继续培养；
19)在慢病毒转导2-3个星期后，1×107个被转导的细胞与100μL抗CD3的磁珠(Invitrogen)在4℃环境中孵育30min；
20)转移在磁力作用下未连接到磁珠上的细胞，放入6孔板内，在含有100单位/mLIL-2和RPMI1640培养基中继续培养；
21)在培养1-2周后，CD3阴性筛选出的细胞经FACS确定细胞的纯度；若回收到的细胞不纯，可以再进行几轮抗CD3抗体的阴性筛选；
22)在经历CD3阴性筛选后，在含有IL2的培养基中继续培养约两个月，CD3阴性细胞群经FACS检测分析CD83、CD80、CD86、CD70、CCR7、4-1BBL和HLA-DR等分子的表达，证实获得了成熟的树突状细胞株。
通过脐带血树突状细胞建立成熟高活性树突状细胞株
例如可以包括以下步骤：
1)获取产妇脐带血10ml；
2)将抗凝管内10mL血液转移到装有10mL PBS缓冲液的50mL离心管内，轻轻混合；
3)取15mL Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)溶液加入到另一支无菌50mL离心管内；
4)将20mL稀释后的血液沿离心管壁轻轻加到Ficoll液面上；
5)室温条件下，400g离心30min；
6)移液管尽可能多地吸弃最上层血浆，脐带血单个核细胞层处于稀释后的血浆 /Ficoll交界面；
7)小心收集白膜层，加入适量的PBS缓冲液保证总体积为40mL，200g常温离心10min；
8)弃上清，20mL PBS重悬细胞，200g常温离心10min；
9)弃上清，含10％FBS RPMI1640培养基重悬细胞，计数；
10)转移4×106个新鲜的脐带血单个核细胞至6孔板的一个孔内，加入1-5μg/mLPHA(浓度范围例如为约1-30μg/mL)刺激并培养细胞；
11)经PHA处理约24小时之后，收集细胞，离心弃上清，2ml RPMI1640培养基重悬洗涤细胞，离心；
12)弃上清，加入2ml含血清PRMI1640重悬细胞并转移至新的6孔板内，加入50-200单位/mL IL-2继续培养细胞3-5天。
13)将细胞悬液转移至15ml离心管内，1500rpm离心5min；
14)弃上清，RPMI1640培养基重悬细胞，计数；
15)接种2×106个细胞于6孔板内，向孔内加入MOI为10-50的Tax慢病毒和5-10 μg/ml聚凝胺，共培养16-24小时；
16)收集细胞，离心，弃上清；
17)RPMI培养基重悬洗涤细胞，离心，弃上清；含血清RPMI1640培养基重悬细胞，加入100units/ml IL2后继续培养细胞；
18)细胞在含有100单位/ml IL2的培养基内继续培养；
19)在慢病毒转导2-3个星期后，1×107个被转导的细胞与100μL抗CD3的磁珠(Invitrogen)在4℃环境中孵育30min；
20)转移在磁力作用下未连接到磁珠上的细胞，放入6孔板内，在含有100单位/mLIL-2和RPMI1640培养基中继续培养；
21)在培养1-2周后，CD3阴性筛选出的细胞经FACS确定细胞的纯度；若回收到的细胞不纯，可以再进行几轮抗CD3抗体的阴性筛选；
22)在经历CD3阴性筛选后，在含有IL2的培养基中继续培养约两个月，CD3阴性细胞群经FACS检测分析CD83、CD80、CD86、CD70、CCR7、4-1BBL和HLA-DR等分子的表达，证实获得了成熟的树突状细胞株。
通过单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)建立成熟高活性树突状细胞株
例如可以包括以下步骤：
1)获取外周血或产妇脐带血10ml；
2)将抗凝管内10mL血液转移到装有10mL PBS缓冲液的50mL离心管内，轻轻混合；
3)取15mL Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)溶液加入到另一支无菌50mL离心管内；
4)将20mL稀释后的血液沿离心管壁轻轻加到Ficoll液面上；
5)室温条件下，400g离心30min；
6)移液管尽可能多地吸弃最上层血浆，单个核细胞层处于稀释后的血浆/Ficoll交界面；
7)小心收集白膜层，加入适量的PBS缓冲液保证总体积为40mL，200g常温离心10min；
8)弃上清，20mL PBS重悬细胞，200g常温离心10min；
9)弃上清，含血清RPMI1640培养基重悬细胞转入培养瓶内，置于37℃培养箱内培养2-3小时；
10)移液管吸弃未贴壁细胞，加入新的RPMI培养基，清洗两次，剩余的贴壁细胞加入新的含血清培养基培养；
11)加入含GM-CSF以及IL-4共培养7天；
12)将细胞悬液转移至15ml离心管内，1500rpm离心5min；
13)弃上清，RPMI1640培养基重悬细胞，计数；
14)接种4×106个细胞于6孔板内，向孔内加入MOI为10-50的Tax慢病毒和5-10ug/ml聚凝胺，共培养16小时；
15)收集细胞，离心，弃上清；
16)RPMI培养基重悬洗涤细胞，离心，弃上清；含血清RPMI1640培养基重悬细胞，加入100单位/ml IL2后继续培养细胞；
17)细胞在含有100单位/ml IL2的培养基内继续培养；
18)在慢病毒转导2-3个星期后，1×107个被转导的细胞与100μL抗CD3的磁珠(Invitrogen)在4℃环境中孵育30min；
19)转移在磁力作用下未连接到磁珠上的细胞，放入6孔板内，在含有50-200单位/mL IL-2和RPMI1640培养基中继续培养；
20)在培养1-2周后，CD3阴性筛选出的细胞经FACS确定细胞的纯度；若回收到的细胞不纯，可以再进行几轮抗CD3抗体的阴性筛选；
21)在经历CD3阴性筛选后，在含有IL2的培养基中继续培养约两个月，CD3阴性细胞群经FACS检测分析CD83、CD80、CD86、CD70、CCR7、4-1BBL和HLA-DR等分子的表达，证实获得了成熟的树突状细胞株。
产生负载特异性肿瘤或病毒抗原的树突状细胞株的方法
例如可以包括以下步骤：
1)将上文建立的各种树突状细胞株按照2×106/孔分别接种于6孔板内；
2)将上文生产的负载肿瘤或病毒抗原的慢病毒按照MOI为5-50的量加入细胞株中，同时加入5-10μg/ml聚凝胺(polybrene)，置于32-37℃，CO2培养箱内培养过夜(16-24h)；
3)收集细胞，离心，弃上清；
4)含血清RPMI培养基重悬细胞，转移至新的孔内继续培养24-48小时；
5)向孔内加入1-5μg/ml嘌呤霉素(puromycin)继续培养48小时；
6)收集细胞，离心，弃上清；5ml无血清RPMI1640培养基重悬洗涤细胞，离心；
7)弃上清，用2-4ml含血清培养基重悬细胞，转移至干净的孔内，继续培养；
8)扩大培养3-5天后，取少量细胞经Western印记或RT-PCR检测特异性肿瘤抗原或病毒抗原的表达情况，得到负责相应肿瘤或病毒抗原的成熟高活性树突状细胞。
产生特异性抗肿瘤或抗病毒的细胞毒性T淋巴细胞的方法(主要为Tαβ细胞)
例如可以包括以下步骤：
1)获取外周血或脐带血10ml；
2)按照前文单个核细胞分离办法获得外周血或脐带血单个核细胞；
3)将负载肿瘤或病毒抗原的外周血或脐带血来源的原代树突状细胞或者由单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)与外周血或脐带血来源的单个核细胞按照适当的比例如 1:10～1:500混合，共培养2-3天；
4)加入100-200单位/L IL2，继续培养细胞2-3周；
5)所得细胞经流式检测为CD3+T细胞。
产生自然杀伤细胞(NK)的方法
例如可以包括以下步骤：
1)获取外周血或脐带血10ml；
2)按照上文单个核细胞分离办法获得外周血或脐带血单个核细胞；
3)将外周血或脐带血来源的原代树突状细胞或者由单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)与外周血或脐带血来源的单个核细胞按照适当的比例如1:10～1:500混合，共培养2-3天；
4)加入100-200单位/L IL2，继续培养细胞2-3周；
5)所得细胞经流式检测为CD3-CD56+细胞。
产生特异性抗肿瘤或抗病毒的Tγδ细胞的方法
例如可以包括以下步骤：
1)获取外周血或脐带血10ml；
2)按照单个核细胞分离办法获得外周血或脐带血单个核细胞；
3)负载肿瘤抗原或病毒抗原的外周血或脐带血来源的原代树突状细胞或者由单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)与单个核细胞按照适当的比例如1:10～1:500混合，共培养2-3天；
4)加入100-200单位/L IL2，继续培养细胞2-3周；
5)所得细胞经流式检测为CD3+TCRγδ+细胞。
细胞毒性T淋巴细胞或NK细胞或Tγδ细胞或几种细胞混合物的体外活性鉴定
例如可以包括以下步骤：
1)将靶细胞(表达肿瘤或病毒抗原的细胞)按4000个/孔接种于6孔板内培养过夜；
2)将经负载特异性抗原的树突状细胞株诱导刺激的细胞毒性T淋巴细胞或NK细胞或Tγδ细胞或几种细胞混合物按照效应细胞：靶细胞为0:1、1:1、5:1、10:1、20:1的比例加入到靶细胞孔内，继续培养24小时；
3)吸弃培养基上清，2ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤孔内细胞一次，弃PBS；
4)重复步骤3)；
5)通过显微镜观察杀伤活性并拍照。
细胞毒性T淋巴细胞或NK细胞或Tγδ细胞或几种细胞混合物的体内活性鉴定
在NOD-SCID小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)皮下注射2×106的肿瘤细胞(可以是乳腺癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌等)，10天后经尾静脉分别注射特异性细胞毒性T淋巴细胞及NK及Tγδ细胞混合物1×107个，并设置对照组(注射生理盐水)，测定移植瘤的生长状况。结果表明，相对于对照组，经抗原负载的树突状细胞株激活的细胞毒性T细胞、NK细胞及Tγδ细胞对相关肿瘤的抑制作用与对照组有显著差异，说明本发明的细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、Tγδ细胞、或它们的混合物具有良好的体内抗肿瘤作用。
使用细胞毒性T淋巴细胞或NK细胞或Tγδ细胞或几种细胞混合物的治疗方法
治疗癌症：将本发明的细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、Tγδ细胞、或它们的混合物，按照1×108到1×1010个的数量注射到受试者(例如肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌等癌症患者)体内。这些细胞或细胞混合物的注射周期为1周～1年。
本发明的细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、Tγδ细胞、或它们的混合物还可以与一种或多种其它的已知疗法联合起来应用。这些已知疗法例如包括放射、手术、化疗或给予其它抗癌制剂，也可将这些方法联合应用。例如，本发明中的治疗方法可与一种化疗制剂联合使用。
治疗病毒感染：将本发明的细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、Tγδ细胞、或它们的混合物，按照1×108到1×1010个的数量注射到受试者体内，受试者是病毒感染者(流感病毒、HBV、HCV、HPV、EBV、HIV、Ebola、SARS等)。细胞或细胞混合物的注射周期为1周至1年。
树突状细胞疫苗和使用方法
本文还提供本发明的成熟高活性树突状细胞及其制备方法在制备疫苗方面的应用。
制备疫苗所采用的树突状细胞可以是受试者自体细胞或异体细胞，还可以是负载了来自受试者的癌细胞或病毒抗原的树突状细胞。
治疗癌症：将本发明的树突状细胞按照1×108到1×1010个的数量注射到受试者(例如肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌等癌症患者)体内。这些细胞或细胞混合物的注射周期为1周至1年。
本发明提供的树突状细胞可与一种或多种其它的已知疗法联合起来应用。这些已知疗法例如包括放射、手术、化疗或给予其它抗癌制剂，也可将这些方法联合应用。例如，本发明中的治疗方法可与一种化疗制剂联合使用。
治疗病毒感染：将本发明的树突状细胞按照1×108到1×1010个的数量注射到受试者体内，受试者是病毒感染者(流感病毒、HBV、HCV、HPV、EBV、HIV、Ebola、 SARS等)。细胞或细胞混合物的注射周期为1周至1年。
与HTLV病毒Tax蛋白相比，本发明采用来自STLV病毒的Tax蛋白转化树突状细胞的优势在于：
一、安全性更高：
(1)STLVs病毒属于非人源的病毒，未见在人体内发现STLVs病毒的报道；
(2)STLVs的致病性不强，除STLV1引起非人类灵长类动物白血病外，STLV2、STLV3、STLV4病毒感染非人类灵长类动物后并未致病；
(3)研究中并非使用完整的病毒颗粒，而是采用其中一个关键的病毒蛋白基因来诱导产生新的树突状细胞株。
二、有效性更高：
动物源性的病毒或蛋白进入人体内，其免疫原性高于人体自身蛋白，更能引起强烈的免疫反应。
本申请首次公开了采用STLVs病毒Tax蛋白建立成熟高活性树突状细胞的方法，通过该成熟高活性树突状细胞制备细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞等效应细胞的方法、以及包括这些细胞的相关疫苗，这些方法和疫苗在肿瘤或病毒的免疫治疗方面有广阔的应用前景。
本文中提及的相关氨基酸和核苷酸序列如下：
SEQ ID NO1:猴嗜T淋巴细胞病毒1型(Simian T-lymphotropic virus type 1)Tax氨基酸序列
MAHFPGFGQSLLFGYPVYVFGDCVQGDWCPITGGLCSARLHRHALLATCPEHQITW DPIDGRVIGSALQFLIPRLPSFPTQRTSKTLKVLTPPTTPKTPNIPPSFLQAMRKYSPFRN GYMEPTLGQHLPTLSFPDPGLRPQNLYTLWGGSVVCMYLYQLSPPITWPLLPHVIFCH PGQLGAFLTNVPYKRIEELLYKISLTTGALIILPEDCLPTTLFQPARAPVTLTAWQNGL LPFHSTLTTSGLIWTFTDGTPMISGPCPKDGQPSLVLQSSSFIFHKFQTKAYHPSFLLSH GLIQYSSFHNLHLLFEEYANVPISLLFNEKEANDTDHEPQISPGGLEPPSEKHFRETEV
SEQ ID NO2:猴嗜T淋巴细胞病毒2型(Simian T-lymphotropic virus type 2)Tax氨基酸序列
MAHFPGFGQSLLYGYPVYVFGDCVQADWCPVSGGLCSTRLHRNALLATCPEHQLT WDPIDGRVVGSRLQYLIPRLPSFPTQRTSKTLKVLTPPTTPVSPKIPPPSSQSMRRLSPY RNGCLHPTLGDQLPSLSFPDPGVRPQNIYTTWGRTVVCLYLYQLSPPMTWPLIPHVIF CHPKQLGTFLTNVPLKRLEELLYKIFLHTGAIIVLPEDRVGTTLFQPVRAPCVQTAWD TGLLPYHSLITTPGLIWTFNDGSPMISGPCPKTGQPSFLVQSSLLIFEKFQTKAFHPSFLLSHQLIQYSSFQYSSFHNLHPSFEEYTNIPVSYFFNEKQADDSDSDPGPSSLGAPRASHQ LKGHAVSHKQSREQALTFPPADHLRNQEPVSRKITSPLPTSPCLEKQRL
SEQ ID NO3:猴嗜T淋巴细胞病毒3型(Simian T-lymphotropic virus type 3)Tax氨基酸序列
MAHFPGFGQSLLYGYPVYVFGDCVQADWCPISGGLCSARLHRHALLATCPEHQITW DPIDGRVVSSALQYLIPRLPSFPTQRTTRTLKVLTPPTTATTPKVPPSFFHAVRKHTPFR NNCLELTLGEQLPAMSFPDPGLRPQNVYTMWGSSVVCLYLYQLSPPMTWPLIPHVIF CHPEQLGAFLTRVPTKRLEELLYKIFLSTGAILILPENCFPTTLFQPTRAPAIQAPWHTG LLPCQKEITTPGLVWTFTDGSPMISGPCPKEGQPSLVVQSSTFIFQQFQTKANHPAFLLSHKLIHYSSFHSLHLLFEEYTTVPFSLLFNEKGANVNDDEPQDEPQPPTRGQIAESSV
SEQ ID NO4:猴嗜T淋巴细胞病毒4型(Simian T-lymphotropic virus type 4)Tax氨基酸序列
MAHFPGFGQSLLFGYPVYVFGDCVQGDWCPISGGLRSARLHRHALLATCPEHQITW DPVDGRVIGSALQFLIPRLPSFPAQRTSKTLKVLTPPTTHTTPNIPPSFLQAMRKYSPFR NGYMEPTLGRHLPTLSFPDPGLLPQNLHTLWGGSVVCMYLYQLSPPITWPLLPHVIFC HPGQLGAFLTNVPYKRMEELLYKISLTTGALIILPEDCLPTTLFQPARAPVTLTAWQN GLLPFHSTLTTQGLIWTFTDGTPMISGPCPKDGQPSLVLQSSSFIFHKFQTKAYHPSFLLSHGLIQYSSFHNLHLLFEEYTNIPISLLFNEKEANDHDHEPQISPEGLEPSSEKHFRETE V
SEQ ID NO5:猴嗜T淋巴细胞病毒3型(Simian T-lymphotropic virus type 3)Tax核酸序列
ATGGCCCACTTTCCAGGTTTCGGGCAGAGCCTGCTCTACGGGTACCCTGTCTACGT TTTCGGCGATTGTGTGCAGGCCGATTGGTGCCCCATTTCCGGGGGGCTTTGTTCCG CCCGGCTACATCGGCACGCCTTACTGGCCACCTGTCCTGAACACCAGATCACCTG GGACCCCATCGATGGACGCGTTGTCAGCTCGCCTCTACAATACCTTATCCCTCGCC TCCCCTCCTTCCCCACCCAAAGAACTTCCCGCACCCTCAAGGTCCTCACCCCGCCG CCCACTGCTACAACCCCCAAAGTTCCTCCCTCCTTCTTCCATGCAGTCAGGAAACA CACCCCTTTCCGAAACAACTGCCTCGAGCTCACCTTGGGAGAGCAACTACCCGCC ATGTCTTTCCCCGACCCCGGCCTCCGACCCCAAAATGTCTATACCATGTGGGGAA GCACCATCGTGTGCTTATACCTCTACCAACTCACACCTCCAATGACCTGGCCGTTA ATCCCACATGTCATTTTTTGCCATCCGGACCAACTAGGGGCCTTCCTAACAAAAA TCCCTACCAAACGCTTGGAAGAACTCTTATACAAACTATTCTTAAGTACAGGGGC CATACTTATCCTACCTGAAAATTGCTTCCCAACTACCCTGTTTCAGCCCACCCGCG CACCAGTAATTCAAGCCCCCTGGCACTCAGGCCTACTCCCATACCTAAAGGAAAT TGTCACCCCCGGGCTGATTTGGGTGTTTACTGACGGTAGTTCTATGATTTCCGGAC CCTGCCCCAAGGAAGGGCAGCCATCTTTGGTGGTCCAATCATCTACATTCATTTTC CAAAAATTTCAAACCAAAGCCTATCACCCAGCCTTCCTCCTGTCCCATAAATTAATCCAATACTCCTCGTTCCATTCCCTCCATCTACTTTTTGAAGAATACACCACTGTC CCCTTTTCTTTATTGTTTAACGAAAAAGAGGCAAATGACAGTGACAGCAAGCCCC AAGGCGAGCCACAACTACTAGCCAAAGGGCATACAGTTGAATCATCTGTC。
序列表
<110> 北京翊博普惠生物科技发展有限公司
<120> 在体外大量扩增人类成熟高活性树突状细胞的方法及其应用
<130> 18302ci
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 353
<212> PRT
<213> Simian T-cell lymphotropic virus type 1
<400> 1
Met Ala His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Phe Gly Tyr Pro
1 5 10 15
Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Gly Asp Trp Cys Pro Ile Thr
20 25 30
Gly Gly Leu Cys Ser Ala Arg Leu His Arg His Ala Leu Leu Ala Thr
35 40 45
Cys Pro Glu His Gln Ile Thr Trp Asp Pro Ile Asp Gly Arg Val Ile
50 55 60
Gly Ser Ala Leu Gln Phe Leu Ile Pro Arg Leu Pro Ser Phe Pro Thr
65 70 75 80
Gln Arg Thr Ser Lys Thr Leu Lys Val Leu Thr Pro Pro Thr Thr Pro
85 90 95
Lys Thr Pro Asn Ile Pro Pro Ser Phe Leu Gln Ala Met Arg Lys Tyr
100 105 110
Ser Pro Phe Arg Asn Gly Tyr Met Glu Pro Thr Leu Gly Gln His Leu
115 120 125
Pro Thr Leu Ser Phe Pro Asp Pro Gly Leu Arg Pro Gln Asn Leu Tyr
130 135 140
Thr Leu Trp Gly Gly Ser Val Val Cys Met Tyr Leu Tyr Gln Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Ile Thr Trp Pro Leu Leu Pro His Val Ile Phe Cys His Pro
165 170 175
Gly Gln Leu Gly Ala Phe Leu Thr Asn Val Pro Tyr Lys Arg Ile Glu
180 185 190
Glu Leu Leu Tyr Lys Ile Ser Leu Thr Thr Gly Ala Leu Ile Ile Leu
195 200 205
Pro Glu Asp Cys Leu Pro Thr Thr Leu Phe Gln Pro Ala Arg Ala Pro
210 215 220
Val Thr Leu Thr Ala Trp Gln Asn Gly Leu Leu Pro Phe His Ser Thr
225 230 235 240
Leu Thr Thr Ser Gly Leu Ile Trp Thr Phe Thr Asp Gly Thr Pro Met
245 250 255
Ile Ser Gly Pro Cys Pro Lys Asp Gly Gln Pro Ser Leu Val Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Ser Phe Ile Phe His Lys Phe Gln Thr Lys Ala Tyr His Pro
275 280 285
Ser Phe Leu Leu Ser His Gly Leu Ile Gln Tyr Ser Ser Phe His Asn
290 295 300
Leu His Leu Leu Phe Glu Glu Tyr Ala Asn Val Pro Ile Ser Leu Leu
305 310 315 320
Phe Asn Glu Lys Glu Ala Asn Asp Thr Asp His Glu Pro Gln Ile Ser
325 330 335
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Val
<210> 2
<211> 400
<212> PRT
<213> Simian T-cell lymphotropic virus type 2
<400> 2
Met Ala His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Tyr Gly Tyr Pro
1 5 10 15
Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Ala Asp Trp Cys Pro Val Ser
20 25 30
Gly Gly Leu Cys Ser Thr Arg Leu His Arg Asn Ala Leu Leu Ala Thr
35 40 45
Cys Pro Glu His Gln Leu Thr Trp Asp Pro Ile Asp Gly Arg Val Val
50 55 60
Gly Ser Arg Leu Gln Tyr Leu Ile Pro Arg Leu Pro Ser Phe Pro Thr
65 70 75 80
Gln Arg Thr Ser Lys Thr Leu Lys Val Leu Thr Pro Pro Thr Thr Pro
85 90 95
Val Ser Pro Lys Ile Pro Pro Pro Ser Ser Gln Ser Met Arg Arg Leu
100 105 110
Ser Pro Tyr Arg Asn Gly Cys Leu His Pro Thr Leu Gly Asp Gln Leu
115 120 125
Pro Ser Leu Ser Phe Pro Asp Pro Gly Val Arg Pro Gln Asn Ile Tyr
130 135 140
Thr Thr Trp Gly Arg Thr Val Val Cys Leu Tyr Leu Tyr Gln Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Met Thr Trp Pro Leu Ile Pro His Val Ile Phe Cys His Pro
165 170 175
Lys Gln Leu Gly Thr Phe Leu Thr Asn Val Pro Leu Lys Arg Leu Glu
180 185 190
Glu Leu Leu Tyr Lys Ile Phe Leu His Thr Gly Ala Ile Ile Val Leu
195 200 205
Pro Glu Asp Arg Val Gly Thr Thr Leu Phe Gln Pro Val Arg Ala Pro
210 215 220
Cys Val Gln Thr Ala Trp Asp Thr Gly Leu Leu Pro Tyr His Ser Leu
225 230 235 240
Ile Thr Thr Pro Gly Leu Ile Trp Thr Phe Asn Asp Gly Ser Pro Met
245 250 255
Ile Ser Gly Pro Cys Pro Lys Thr Gly Gln Pro Ser Phe Leu Val Gln
260 265 270
Ser Ser Leu Leu Ile Phe Glu Lys Phe Gln Thr Lys Ala Phe His Pro
275 280 285
Ser Phe Leu Leu Ser His Gln Leu Ile Gln Tyr Ser Ser Phe Gln Tyr
290 295 300
Ser Ser Phe His Asn Leu His Pro Ser Phe Glu Glu Tyr Thr Asn Ile
305 310 315 320
Pro Val Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Lys Gln Ala Asp Asp Ser Asp Ser
325 330 335
Asp Pro Gly Pro Ser Ser Leu Gly Ala Pro Arg Ala Ser His Gln Leu
340 345 350
Lys Gly His Ala Val Ser His Lys Gln Ser Arg Glu Gln Ala Leu Thr
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Phe Pro Pro Ala Asp His Leu Arg Asn Gln Glu Pro Val Ser Arg Lys
370 375 380
Ile Thr Ser Pro Leu Pro Thr Ser Pro Cys Leu Glu Lys Gln Arg Leu
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<210> 3
<211> 350
<212> PRT
<213> Simian T-lymphotropic virus type 3
<400> 3
Met Ala His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Tyr Gly Tyr Pro
1 5 10 15
Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Ala Asp Trp Cys Pro Ile Ser
20 25 30
Gly Gly Leu Cys Ser Ala Arg Leu His Arg His Ala Leu Leu Ala Thr
35 40 45
Cys Pro Glu His Gln Ile Thr Trp Asp Pro Ile Asp Gly Arg Val Val
50 55 60
Ser Ser Ala Leu Gln Tyr Leu Ile Pro Arg Leu Pro Ser Phe Pro Thr
65 70 75 80
Gln Arg Thr Thr Arg Thr Leu Lys Val Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala
85 90 95
Thr Thr Pro Lys Val Pro Pro Ser Phe Phe His Ala Val Arg Lys His
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Thr Pro Phe Arg Asn Asn Cys Leu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Gln Leu
115 120 125
Pro Ala Met Ser Phe Pro Asp Pro Gly Leu Arg Pro Gln Asn Val Tyr
130 135 140
Thr Met Trp Gly Ser Ser Val Val Cys Leu Tyr Leu Tyr Gln Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Met Thr Trp Pro Leu Ile Pro His Val Ile Phe Cys His Pro
165 170 175
Glu Gln Leu Gly Ala Phe Leu Thr Arg Val Pro Thr Lys Arg Leu Glu
180 185 190
Glu Leu Leu Tyr Lys Ile Phe Leu Ser Thr Gly Ala Ile Leu Ile Leu
195 200 205
Pro Glu Asn Cys Phe Pro Thr Thr Leu Phe Gln Pro Thr Arg Ala Pro
210 215 220
Ala Ile Gln Ala Pro Trp His Thr Gly Leu Leu Pro Cys Gln Lys Glu
225 230 235 240
Ile Thr Thr Pro Gly Leu Val Trp Thr Phe Thr Asp Gly Ser Pro Met
245 250 255
Ile Ser Gly Pro Cys Pro Lys Glu Gly Gln Pro Ser Leu Val Val Gln
260 265 270
Ser Ser Thr Phe Ile Phe Gln Gln Phe Gln Thr Lys Ala Asn His Pro
275 280 285
Ala Phe Leu Leu Ser His Lys Leu Ile His Tyr Ser Ser Phe His Ser
290 295 300
Leu His Leu Leu Phe Glu Glu Tyr Thr Thr Val Pro Phe Ser Leu Leu
305 310 315 320
Phe Asn Glu Lys Gly Ala Asn Val Asn Asp Asp Glu Pro Gln Asp Glu
325 330 335
Pro Gln Pro Pro Thr Arg Gly Gln Ile Ala Glu Ser Ser Val
340 345 350
<210> 4
<211> 353
<212> PRT
<213> Simian T-lymphotropic virus type 4
<400> 4
Met Ala His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Phe Gly Tyr Pro
1 5 10 15
Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Gly Asp Trp Cys Pro Ile Ser
20 25 30
Gly Gly Leu Arg Ser Ala Arg Leu His Arg His Ala Leu Leu Ala Thr
35 40 45
Cys Pro Glu His Gln Ile Thr Trp Asp Pro Val Asp Gly Arg Val Ile
50 55 60
Gly Ser Ala Leu Gln Phe Leu Ile Pro Arg Leu Pro Ser Phe Pro Ala
65 70 75 80
Gln Arg Thr Ser Lys Thr Leu Lys Val Leu Thr Pro Pro Thr Thr His
85 90 95
Thr Thr Pro Asn Ile Pro Pro Ser Phe Leu Gln Ala Met Arg Lys Tyr
100 105 110
Ser Pro Phe Arg Asn Gly Tyr Met Glu Pro Thr Leu Gly Arg His Leu
115 120 125
Pro Thr Leu Ser Phe Pro Asp Pro Gly Leu Leu Pro Gln Asn Leu His
130 135 140
Thr Leu Trp Gly Gly Ser Val Val Cys Met Tyr Leu Tyr Gln Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Ile Thr Trp Pro Leu Leu Pro His Val Ile Phe Cys His Pro
165 170 175
Gly Gln Leu Gly Ala Phe Leu Thr Asn Val Pro Tyr Lys Arg Met Glu
180 185 190
Glu Leu Leu Tyr Lys Ile Ser Leu Thr Thr Gly Ala Leu Ile Ile Leu
195 200 205
Pro Glu Asp Cys Leu Pro Thr Thr Leu Phe Gln Pro Ala Arg Ala Pro
210 215 220
Val Thr Leu Thr Ala Trp Gln Asn Gly Leu Leu Pro Phe His Ser Thr
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gln Gly Leu Ile Trp Thr Phe Thr Asp Gly Thr Pro Met
245 250 255
Ile Ser Gly Pro Cys Pro Lys Asp Gly Gln Pro Ser Leu Val Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Ser Phe Ile Phe His Lys Phe Gln Thr Lys Ala Tyr His Pro
275 280 285
Ser Phe Leu Leu Ser His Gly Leu Ile Gln Tyr Ser Ser Phe His Asn
290 295 300
Leu His Leu Leu Phe Glu Glu Tyr Thr Asn Ile Pro Ile Ser Leu Leu
305 310 315 320
Phe Asn Glu Lys Glu Ala Asn Asp His Asp His Glu Pro Gln Ile Ser
325 330 335
Pro Glu Gly Leu Glu Pro Ser Ser Glu Lys His Phe Arg Glu Thr Glu
340 345 350
Val
<210> 5
<211> 1050
<212> DNA
<213> Simian T-lymphotropic virus type 3
<400> 5
atggcccact ttccaggttt cgggcagagc ctgctctacg ggtaccctgt ctacgttttc 60
ggcgattgtg tgcaggccga ttggtgcccc atttccgggg ggctttgttc cgcccggcta 120
catcggcacg ccttactggc cacctgtcct gaacaccaga tcacctggga ccccatcgat 180
ggacgcgttg tcagctcgcc tctacaatac cttatccctc gcctcccctc cttccccacc 240
caaagaactt cccgcaccct caaggtcctc accccgccgc ccactgctac aacccccaaa 300
gttcctccct ccttcttcca tgcagtcagg aaacacaccc ctttccgaaa caactgcctc 360
gagctcacct tgggagagca actacccgcc atgtctttcc ccgaccccgg cctccgaccc 420
caaaatgtct ataccatgtg gggaagcacc atcgtgtgct tatacctcta ccaactcaca 480
cctccaatga cctggccgtt aatcccacat gtcatttttt gccatccgga ccaactaggg 540
gccttcctaa caaaaatccc taccaaacgc ttggaagaac tcttatacaa actattctta 600
agtacagggg ccatacttat cctacctgaa aattgcttcc caactaccct gtttcagccc 660
acccgcgcac cagtaattca agccccctgg cactcaggcc tactcccata cctaaaggaa 720
attgtcaccc ccgggctgat ttgggtgttt actgacggta gttctatgat ttccggaccc 780
tgccccaagg aagggcagcc atctttggtg gtccaatcat ctacattcat tttccaaaaa 840
tttcaaacca aagcctatca cccagccttc ctcctgtccc ataaattaat ccaatactcc 900
tcgttccatt ccctccatct actttttgaa gaatacacca ctgtcccctt ttctttattg 960
tttaacgaaa aagaggcaaa tgacagtgac agcaagcccc aaggcgagcc acaactacta 1020
gccaaagggc atacagttga atcatctgtc 1050

Claims (11)

1.一种制备成熟高活性树突状细胞的方法，包括：
1)从外周血或脐带血收集单个核细胞；
2)诱导所述单个核细胞分化为树突状细胞；
3)让所述树突状细胞与来自STLV3病毒的Tax蛋白接触；以及
4)筛选和鉴定获得的成熟高活性树突状细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述Tax蛋白能够激活NF-κB、AP1和/或STAT信号通路。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述Tax蛋白具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)包括让所述外周血或脐带血单个核细胞依次接触PHA和IL-2或者让所述外周血或脐带血单个核细胞接触GM-CSF和IL-4。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤3)包括将包含所述Tax蛋白的编码核酸的慢病毒载体引入所述树突状细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其中还包括将肿瘤抗原或病毒抗原表达载体引入所述成熟高活性树突状细胞的步骤。
7.通过权利要求1至6中任一项的方法获得的成熟高活性树突状细胞。
8.一种制备细胞毒性T淋巴细胞的方法，包括让权利要求6的方法制备的成熟高活性树突状细胞与来自外周血或脐带血的单个核细胞混合培养，并回收CD3+T细胞。
9.一种制备自然杀伤细胞的方法，包括让权利要求1至5中任一项的方法制备的成熟高活性树突状细胞与来自外周血或脐带血的单个核细胞混合培养，并回收CD3-CD56+NK细胞。
10.一种制备Tγδ细胞的方法，包括让权利要求6的方法制备的成熟高活性树突状细胞与来自外周血或脐带血的单个核细胞混合培养，并回收CD3+TCRγδ+T细胞。
11.权利要求7的成熟高活性树突状细胞在制备抗肿瘤或抗病毒的细胞产品中的应用。
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Correct: BEIJING YIBO PUHUI BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co.,Ltd.|100192 Room 203, 2nd floor, building 5, Tiandi Linfeng, No.1, yongtaizhuang North Road, Haidian District, Beijing

False: Shangqiu Zhongyu Lianyun Biotechnology Development Co.,Ltd.|476200 Room 1001, Building 8, Building 7, Huajing International Hotel and Paradise Business Street, west of Beiguan Street, Chengguan Town, Zhecheng County, Shangqiu City, Henan Province

Number: 52-02

Volume: 38

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