CN115851599A - 一种用于治疗aml恶性肿瘤的cd38-car-t及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗AML恶性肿瘤的CD38‑CAR‑T的核苷酸序列，载体，宿主细胞及其在制备制备抗肿瘤药物中的应用。本发明通过对多种结构的设计与筛选，克服了技术偏见，制备出的CAR‑T细胞对肿瘤细胞具有较好的特异性识别功能和有效的体外杀伤能力，并延长了CAR‑T细胞的扩增时间及疗效的方式。

Description

一种用于治疗AML恶性肿瘤的CD38-CAR-T及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种CD38-CAR-T及其应用。

背景技术

急性髓细胞性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是髓系造血干/祖细胞恶性疾病，是一个具有高度异质性的疾病群，它可以由正常髓系细胞分化发育过程中不同阶段的造血祖细胞恶性变转化，包括所有非淋巴细胞来源的急性白血病。以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征，临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例病情急重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。

目前主要的治疗方案就是化疗、造血干细胞移植。化疗目前疗效较差，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前被认为能够治愈AML的治疗方法，然而，大多数患者在allo-HSCT后会出现复发，一旦复发后，治疗的选择极其有限，预后较差，一年的总生存率不到20％。目前对于复发、难治AML尚无有效、统一治疗方案，特异性、靶向性的免疫治疗技术(CART技术)给这些疑难疾病带来了新的治疗机遇。

CAR-T技术在难治复发性急性B淋巴细胞白血病(r/r B-ALL)治疗中已经取得显著地临床疗效，但是在难治复发性急性髓系白血病(r/r AML)治疗中疗效较差。尽管人们已经尝试CD33、CD123等靶点，但是由于这些抗原标记在正常的造血细胞也有表达，存在“off-tumor，on-target”的风险。

CD38被证实广泛表达于多种恶性血液瘤，是一个定位于膜上的糖蛋白，催化环腺苷二磷酸核糖(cADPR,cyclic ADP-ribose)的合成和降解。cADPR是核苷酸的代谢产物，通过作用于ryanodine受体(RyRs)参与细胞内钙库的钙动员。许多研究发现CD38/cADPR介导的Ca2+信号传递和通过RyRs通道的Ca2+释放在Ca2+内平衡的调控中发挥了重要的作用。CD38/cADPR/RyRs介导的Ca2+信号传递也参与了许多病理和生理过程。同时CD38在免疫抑制细胞上也有较强的表达，可以作为免疫抑制细胞的特异性靶点。

目前已有2款CD38单克隆治疗抗体(Daratumumab,Isatuximab)获批上市，在临床上显示出了一定的治疗效果，但是其批准的适应症均为多发性骨髓瘤，对于AML无公布的治疗结果，对于AML的治疗效果仍不清楚。据统计，90％的多发性骨髓瘤(MM)患者表达高水平CD38，并且CD38的表达与病人的生存期密切相关。除MM外，CD38也在急性髓性白血病(AML)，急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)等多种恶性血液癌症中高表达，CD38和血液肿瘤是多种恶性血液肿瘤的潜在治疗靶点，清除免疫抑制细胞存在运用方向。

CD38在T细胞上也有表达，在培养过程中会出现抑制自溶效应，导致培养的失败。CAR-T在AML治疗中的效果较差，也与AML肿瘤微环境有关，构建的CAR-T要满足临床治疗的要求，能够克服AML肿瘤微环境的抑制因素，再接触抗原后得到足够的激活。

发明内容

本发明的目的在于，鉴于现有技术的上述缺陷，本发明从多种结构组合中筛选出来几种，更为强力，可以满足临床扩增及治疗的需要，同时CAR结构可以抑制CD38蛋白表达，达到较好的培养与治疗目的。

A-DU-BB28与A-DU-BB40作为CAR-T药品，特别是在在表达CAR的情况下，功能更强的情况下，抑制CD38抗原表达的基础上制备CAR-T药物。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一目的，提供了一种CD38-CAR-T的氨基酸序列，选自以下序列中的至少一种：SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24。

本发明还提供了编码CD38-CAR-T的核苷酸序列，选自以下序列中的至少一种：SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。

本发明的第二目的在于，提供一种CAR-T药物，其包含所述CD38-CAR-T和药学上可接受的载体。

本发明的第三目的在于，提供一种所述CD38-CAR-T在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步的，所述肿瘤是恶性血液肿瘤。优选急性髓性白血病。

本发明还提供了一种载体，其包含所述编码CD38-CAR-T的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述载体为重组慢病毒载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，其包含所述编码CD38-CAR-T的核苷酸序列或者所述载体。如本文所用，术语“宿主细胞”应从广义上来理解，可以是原核细胞或真核细胞；可以是本领域已知的任何适宜宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。

本发明的优点在于：

1.本发明研究发现，以往本领域普通技术人员认为CART-38的需要使用基因敲除或者基因表达干扰抑制的方式来防止CAR-T的自溶，或者需要在制备的过程中添加抗体或者蛋白来抑制这种现象。因此，本发明通过对多种结构的设计与筛选，筛选出无需以上方法，可以制备CAR-T细胞，延长其扩增时间及疗效的方式。本发明克服了上述技术偏见,采用了人们由于技术偏见而舍弃的技术手段，从而解决了技术问题。

2.本发明通过实验研究了通过常规CAR-T生产工艺获得可特异性识别CD38的CAR基因修饰T细胞的制备可行性，以及CD38表达阴性的CART-38治疗CD38+AML的可行性。结果显示，CART-38对CD38+肿瘤细胞具有特异性识别功能和有效的体外杀伤能力。因此，验证了制造靶向CD38的临床级CAR-T细胞的可行性，可将应用CD38制备的CAR-T药物应用于恶性肿瘤药物制备当中。

附图说明

图1是CD38-CAR的结构示意图及各个分组的名称与leader、scfv与共刺激域的结构示意图。

图2：图2A是使用CD38蛋白通过流式细胞仪检测各组CD38-CAR的CAR-T细胞阳性率(n＝3)；图2B是通过细胞计数的方法，测定各组CD38-CAR在5天培养的周期中扩增数与细胞起始的比值，即扩增倍数。

图3：图3A是使用LDH的方法进行检测其特异性裂解CD38 CART的CD38+靶细胞示意图(n＝3)，图3B与3C是使用流式细胞仪使用CBA的方法检测T细胞在杀伤靶细胞时细胞因子分泌的情况，分别为IFN-γ与TNF(n＝3)。

图4：图4A是在第12天使用台盼蓝染色后，检测其细胞活率。图4B是在第10天检测CD38-CAR-T上CD38的表达，用过抗CD38的抗体使用流式细胞仪进行检测。图4C，对于A-DU-BB28及A-DU-BB40进行大批量的扩增，分别在14天的周期使用CD38蛋白通过流式细胞仪检测其CD38蛋白表达的变化趋势。

具体实施方式

为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。

实施例1：

第一步，本实施例中，CAR蛋白是由信号肽leader引导的，包含靶向肿瘤抗原CD38的scfv单链抗体及由CD8衍生的链接和跨膜结构域，胞内信号域由共刺激域及CD3-zeta信号域一同组成，如图1所示。我们依据CAR的基本结构构建了不同的结构组合，两种不同的信号肽，分别为来自CD8A衍生的引导肽及来源于FMC63-CD828Z的引导肽(GenBank:MN702884.1)，两种靶向CD38治疗性抗体DU与IS来源的VL与VH区域，及三种胞内共刺激信号的组合，构建了12种不同的CAR蛋白，通过用编码CAR的慢病毒载体转导，生成识别CD38的CAR修饰T细胞(CART-38)。12种CAR蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列如表1所示。

表1

如图2A所示，采用流式细胞术对转导后的T细胞表面的CAR表达量进行验证，各组CAR基因的转导效率相对平均，这也表明12种CAR结构均能成功包装慢病毒，且可以表达在CAR-T细胞表面，其中A-IS-BB40组的转导效率最高，但综合来看，所有的CAR-T的阳性率均超过40％，说明制备CAR-T成功，且无明显差异。如图2B所示，在5天的培养周期中，各组的扩增倍数均在10倍左右，无显著差异。

如图3A所示，构建稳定表达CD38抗原的K562靶细胞，在经丝裂霉素处理后将靶细胞与CART-38细胞共培养，CD38-的K562细胞系作为对照组参考。将CART-38分别与K562-CD38细胞和K562细胞共孵育。A-DU-BB28与A-IS-BB28均有较高的杀伤作用，杀伤效率均可到达60％，说明两种特异性抗体来源的scfv均能靶向相应抗原，同时均能激活CAR-T的杀伤功能。不同的结构杀伤效率不同，表示其杀伤的能力与结构相关，共刺激域为BB28体现出更强的杀伤效率，这更有利于对AML的治疗。图3B与3C，为接受靶细胞刺激后CAR-T细胞释放细胞因子的能力，可以看出与杀伤结果基本对应，A-DU-BB28与A-IS-BB28均有较高的细胞因子释放能力。

如图4A所示，培养至第10天，观察到细胞的生长状态各组间有明显差异，检测细胞活率可以看出，scfv为IS组细胞状态更差。为了探索其原因，由于T细胞在天然状态表达CD38。如图4B所示，在D10天检测CD38-CAR-T上CD38蛋白表达的情况，令人惊奇的是，DU组的CD38表达均低于IS组，体现出了意想不到的CD38表达抑制作用，可能DU scfv更容易在胞内与CD38蛋白结合，产生了联合抑制的作用，同时也可以看出信号肽A的作用优于信号肽B的作用，这更有利于细胞的扩增与生产，同时CD38的降低会提高CD38-CAR-T在体内的存续时间，提高对AML的治疗效果。如图C所示，我们选取了A-DU-BB28及A-DU-BB40进行大规模的培养测试，其CD38的蛋白的随扩增的时间的延长，蛋白的表达量降低，特别在第三天后，这与CAR蛋白的表达周期相一致。

本实施例的研究思路为，A-DU-BB28与A-DU-BB40的组合可以使CD38-CAR-T的CD38蛋白的表达抑制，从而提高CD38 CAR-T的生长与维持，防止CD38 CAR-T的自溶现象，更有利于CD38 CAR-T治疗AML的效果，更适合与AML肿瘤治疗。同时A-DU-BB28与A-DU-BB40作为三代CAR-T治疗产品，其CD38表达抑制功能不会影响CAR-T的表达，保持较强的抗肿瘤作用。

实施例2 CAR质粒的构建及慢病毒的包装

慢病毒骨架质粒载体为pWPXL，来自优卡迪；pPac-R、pPac-GP和pEnv-G均来自优卡迪；DMEM培养基来自Gibco，293T细胞来自ATCC。

将实施例1获得的12组CAR结构构建于质粒载体为pWPXL上。

具体步骤包括：将慢病毒骨架pWPXL与EcoR I、BamH I两种限制性核酸内切酶混合进行酶切；进行凝胶电泳(120V，20min)后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收7000bp大小的线性质粒；设计相应引物通过聚合酶链式反应(PCR)合成目的基因，即为anti-CD38-CAR质粒基因，包含依次串联的leader膜受体信号肽、scfv、CD8α嵌合受体铰链区Hinge和CD8α嵌合受体跨膜区TM、共刺激结构域，以及CD3ζ胞内信号肽；PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳(120V，20min)回收并通过纯化试剂盒进行纯化，获得的载体线性质粒和目的基因片段按照无缝克隆试剂盒同源重组，获得嵌入目的基因的目的质粒。

取适量目的基因质粒对293T细胞进行转染，步骤如下：在15mL离心管中加入2500ul CaCl2、3种包装质粒(80ug pPac-R、100g pPac-GP、60g pEnv-G)和220ug目的质粒CAR，随即补加细菌内毒素检查用水至5000ul，加入5000ul HBS，添加完毕后持续震荡20s左右。取293T细胞，加入混合的转染试剂1mL，轻轻摇晃混合均匀，放置培养箱中。转染6h后弃去培养上清，加入10mL 4％DMEM完全培养基。转染24h后继续补加10mL 4％DMEM完全培养基。在培养的24小时、48小时以及72小时收集病毒上清于4℃进行保存，待病毒上清收集完毕，使用0.45um滤器对病毒上清进行过滤，滤去细胞的残渣之后加入聚乙二醇8000(PEG8000)对病毒进行浓缩，4℃孵育12小时，之后离心3000rpm，15分钟，离心后弃去上清，并加入适量的无菌PBS溶解病毒沉淀，将溶解的病毒进行分装并保存于-80℃冰箱，得到重组慢病毒载体。该重组慢病毒载体含有抗CD38 CAR基因。Anti-CD38-CAR质粒基因的结构如图1。

实施例3 anti-CD38-CART的制备

将实施例2所得的慢病毒载体分别转导原代T细胞，制备CAR-T细胞，流式细胞仪检测CAR阳性率；CAR阳性率定义为能够与CD38抗原结合的细胞百分比。流式检测一抗为HumanCD38 Protein,His Tag，二抗为抗His荧光。具体步骤包括：用单个核细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)；CD4分离磁珠和CD8分离磁珠分选淋巴T细胞；CD3和CD28抗体激活T细胞；加入慢病毒分别转导T细胞，放入37℃，5％CO2培养箱中转导48h；转导48h后换培养基，并每隔1～2天计数补液；转导后5天左右用流式细胞术检测CAR阳性率，一抗为Human CD38Protein,His Tag，二抗为抗His荧光。CAR阳性率如图2A所示。

每天将CART细胞从二氧化碳培养箱中取出置于生物安全柜中，使用一次性移液管轻轻吹打混匀瓶中的细胞后，吸取100μL左右的细胞悬液于1.5mLEP管中，并使用台盼蓝染色法进行细胞计数，并计算细胞数与细胞活率。

实施例4 anti-CD38-CART的体外功能验证

CD4/CD8磁珠，CD3抗体，CD28抗体均来自美天旎；IL-2来自Peprotech；A-IMV培养基来自Gibco。LDH杀伤试剂盒来源：CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay，Promega，货号REF：G1782；A-IMV培养基来自Gibco；K562(CD38阴性)来自上海中国科学院细胞库；过表达CD38的髓系白血病细胞株K562-CD38(来自上海优卡迪)。

分别培养效应细胞12组细胞；分别培养靶细胞K562、CD38-K562；将效应细胞和靶细胞分组共孵育进行细胞毒性实验，实验效靶比设置分别为5:1；孵育过夜后采用乳酸脱氢酶(LDH)法测杀伤效率，同时效应细胞与靶细胞共孵育后取上清检测细胞因子水平。

具体实验步骤如下：1)收集靶细胞的悬液：贴壁细胞弃去培养上清每皿使用10ml生理盐水浸润皿底后弃去生理盐水，每皿细胞加入1ml胰酶消化细胞，视细胞系特性决定消化时间，显微镜下观察细胞不贴壁，悬浮且形态变圆，加入3mL完全培养基终止消化。1500rpm离心5min，弃去上清，分别加入5mL PBS重悬，1500rpm离心5min，弃上清。2)靶细胞铺板：用1mL AIM-V杀伤培养基(AIM-V+4％FBS)分别重悬靶细胞。使用血球计数板法计数。96孔板每孔加入靶细胞1x104孔，根据所需细胞量，使用杀伤培养基配制靶细胞悬液，配好后将靶细胞铺于96孔细胞培养板中，250g，离心5分钟，放入37℃二氧化碳培养箱培养2h，促进靶细胞贴壁。3)收集效应细胞悬液，将T细胞混合均匀，使用血球计数板法计数。根据杀伤所需效应细胞用量，取效应细胞，1500rpm离心5min，用1mL AIM-V杀伤培养基(AIM-V+4％FBS)分别重悬效应细胞，台盼蓝染色计数。4)96孔板每孔已经加入靶细胞1x104，设置E:T(效应细胞：靶细胞)为2.5:1时，效应细胞每孔加入2.5x104；E:T＝5：1时，效应细胞5x104/孔；E:T＝10：1时，效应细胞1x105/孔，体积均为50ul/孔。按照体系计算配制E:T＝10：1时，效应细胞1x105/孔，准备1倍体积的细胞量，使用杀伤培养基进行2倍梯度稀释，配制E:T＝5：1和E:T＝2.5：1的效应细胞悬液。5)铺板结束后，用封口膜封住96孔板放离心机中，250g，升3降1离心5min，撕去封口膜放入37℃恒温培养箱中孵育24h。6)按照试剂盒说明书步骤进行检测，最后使用酶标仪在490nm处检测吸光度。7)杀伤效率计算公式：细胞毒性％＝实验组杀伤/最大杀伤x100％。

检测细胞因子步骤：效应T细胞与靶细胞共孵育后，收集上清于1.5mL EP管中进行细胞因子检测。a样本处理：细胞悬液1500rpm离心3min后收集上清于新的1.5mL EP管中。b标准品准备：加入2mL标准品稀释液稀释标准品冻干粉，室温静置15min。接着2倍梯度稀释标准品(最高浓度至空白稀释液共10个梯度)。c在新的EP管中加入50μL标准品或者样本，接着加入50μL磁珠以及50μL检测抗体，涡旋仪混合均匀，室温孵育3h。d加入Wash Buffer洗涤两遍后弃去上清加入200μL Wash Buffer重悬上机检测细胞因子IFNγ/TNFα。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种CD38-CAR-T，其特征在于，其氨基酸序列选自以下序列中的至少一种：SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24。

2.如权利要求1所述的CD38-CAR-T，其特征在于，所述氨基酸序列由以下核苷酸序列中的至少一种编码：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。

3.一种CAR-T药物，其特征在于，包含权利要求1所述CD38-CAR-T和药学上可接受的载体。

4.一种载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核苷酸序列。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求4所述的载体。

6.权利要求1所述CD38-CAR-T在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.权利要求1所述CD38-CAR-T在制备治疗免疫抑制淋巴细胞疾病药物中的应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是恶性血液肿瘤。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述疾病是急性髓性白血病。

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