CN111704675B - 一种治疗hiv感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法及其应用 - Google Patents

一种治疗hiv感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体重组基因的构建方法及其应用，所述双特异性嵌合抗原受体包括抗CD32a单链抗体以及抗HIV gp120单链抗体，所述抗CD32a单链抗体的编码核苷酸序列以及抗HIV gp120单链抗体的编码核苷酸序列在双特异性嵌合抗原受体编码基因中以串联形式连接。本发明的双特异性嵌合抗原以HIV复制增殖的标志物融合蛋白gp120和潜伏期的标志物胞膜蛋白CD32a为靶点，设计双靶点CAR‑T细胞，能够彻底清除HIV感染的靶细胞，具有巨大的临床推广价值。

Description

一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法 及其应用
技术领域
本发明涉及医药生物领域，具体是指一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体、其编码基因、构建方法及其应用。
背景技术
艾滋病(AIDS)是一种危害性极大的传染病，由感染艾滋病病毒(HIV病毒)引起。HIV主要攻击目标是CD4+T淋巴细胞，大量破坏该细胞，导致免疫功能缺陷，易发感染、恶性肿瘤，病死率较高。尽管抗HIV新型药物和其他疗技术大大提高了AIDS患者的生存率，并延长了生存时间。但HIV的高突率、抗病毒药物无法清除的潜伏病毒库和免疫重建不全，仍是三大科学挑战。
高效抗逆转录病毒治疗(HAART)是HIV/AIDS治疗史上的第一次革命，其极大的降低了HIV/AIDS的发病率和病死率，显著延长了患者寿命，甚至降低了HIV的传播。但也面临着很多挑战：1)患者必须终生服药，需付出昂贵的经济代价；2)严重的毒副作用；3)耐药毒株的出现；4)更为重要的是cART不能彻底清除病毒，主要是因为药物仅对复制中的病毒有效，而对HIV在感染早期建立的潜伏性病毒“储藏库”(reservoir)是无效的。一旦抗逆转录病毒治疗中断，病毒储藏库中的整合前病毒再度激活，几乎所有患者体内病毒血症会迅速反弹。对淋巴瘤的治疗主要是化疗的方法，副作用大且容易复发，无可供使用的疗法。但HIV合并恶性肿瘤患者一般病情严重，患者免疫系统遭受严重损伤，病情进展较快，患者病死率较高，对此，如何选择有效的治疗方案已迫在眉睫。
艾滋病治疗的根本目标是清除体内所有HIV病毒，以及HIV感染的细胞，包括激活状态的和潜伏状态的。由于gpl20和gp41在潜伏细胞中不表达或者非常低表达，从而导致CAR-T无法有效清除。CD32a表达在潜伏状态下的CD4+T细胞的表面标志物。Gp120和CD32a可能是针对HIV-1病毒活化复制和HIV-1病毒潜伏的较好的靶点。
本发明拟进一步针对HIV复制增殖的标志物融合蛋白gp120和潜伏期的标志物胞膜蛋白CD32a为靶点，设计双靶点CAR-T细胞，彻底清除体内HIV活化复制和HIV潜伏细胞。所述的双特异性单链抗体嵌合抗原受体由CD8信号肽、HIV gp120及CD32a抗原特异性的两个单链抗体串联依次连接，再和CD28跨膜区以及CD28、CD3ζ胞内信号传导结构域依次串联组成。
本发明针对HIV复制增殖的标志物融合蛋白gp120和潜伏期的标志物胞膜蛋白CD32a为靶点，设计双靶点CAR-T细胞，以期能彻底清除HIV感染的靶细胞，具有巨大的临床推广价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明第一目的是提供一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体，所述双特异性嵌合抗原受体中包含抗HIV gp120单链抗体和抗CD32a单链抗体。
进一步地，所述双特异性嵌合型抗原受体从N端到C端顺次包括信号肽、抗HIVgp120单链抗体、Strep tagⅡ、连接肽、抗CD32a单链抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、4-1BB、以及胞内信号刺激域CD3ζ。
本发明的第二目的是提供双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸。
进一步地，所述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。
本发明第三目的是提供一种重组慢病毒载体，所述慢病毒载体以PTK881-EF1α载体为骨架，含有前述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸。
本发明第四目的是提供一种免疫细胞，所述免疫细胞转染有前述的重组慢病毒载体。
进一步地，所述免疫细胞为T细胞，更优选地，所述T细胞为γδT细胞。
本发明第四目的是提供一种双特异性嵌合抗原受体编码核苷酸的构建方法。
进一步地，所述构建方法包括以下步骤：
1)基因合成如SEQ ID NO：1所示的信号肽-抗HIV gp120单链抗体编码核苷酸SP1-N6、以及如SEQ ID NO：2所示的抗CD32a单链抗体编码核苷酸MDE-8，将合成的上述编码核苷酸分别克隆至pUC57载体；
2)以人cDNA文库为模板，设计引物分别扩增片段CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB、CD3ζ、以引物互补方式得到Strep tagII、G4S1短片段；
3)采用Overlap PCR技术将SP1-N6、Strep tag II、G4S1、MDE-8、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB、CD3ζ顺次扩增连接，获得嵌合抗原受体的编码基因N6-MDE-8-CAR，其结构示意图如图1所示；
优选地，单链抗体scFv-N6的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；scFv-N6的重链可变区VH和轻链可变区VL之间用G4S3连接，G4S3的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示。单链抗体scFv-MDE-8的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；单链抗体ScFv-N6、ScFv-MDE-8的氨基酸序列分别如SEQID NO.7、SEQ ID NO.8；单链抗体scFv-MDE-8的重链可变区VH与轻链可变区VL之间用G4S3连接，G4S3的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示。
更优选地，信号肽SP1的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10所示；Strep tagⅡ的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；G4S-Linker的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示；CD8铰链区的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示；CD28跨膜结构域的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示；4-1BB的核苷酸序、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示；CD3ζ的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示；
本发明第五目的是提供双特异性嵌合抗原受体、及其编码核苷酸、重组慢病毒载体、免疫细胞在制备治疗HIV感染的药物或制剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
CD32a表达是潜伏状态下的HIV感染的CD4+T细胞的标记，针对CD32a设计CAR是免疫细胞治疗艾滋病清除潜伏期的HIV的有效方法。本发明针对HIV复制增殖的标志物融合蛋白gp120和潜伏期的标志物胞膜蛋白CD32a为靶点，以免疫源性很低的gamma-delta细胞制备CAR-T，用于AIDS治疗，将达到“通用型”CAR-T生产和免疫重建双重功能，并有可能改变CAR-T药品产业化途径，具有巨大的临床推广价值，为AIDS的彻底治愈提供了一种潜在的治疗途径。
附图说明
图1为N6-MDE-8-CAR结构示意图；
图2为PTK881-EF1α-N6-MDE-8-01质粒图谱；
图3为N6-MDE-8CAR-γδT细胞转导效率检测结果；
图4为N6-MDE-8-CAR-CD8+T细胞转导效率检测结果；
图5为N6-MDE-8CAR-γδT细胞体外杀瘤效率检测结果；
图6为N6-MDE-8-CAR-CD8+T细胞体外杀瘤效率检测结果；
图7为γδT细胞体外杀瘤效率检测结果；
图8为CD8+T细胞体外杀瘤效率检测结果。
图9单靶点(gp120或CD32a)与双靶点(N6-MDE-8-CAR)的CAR-T细胞体外杀伤实验结果
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：PTK881-EF1α-N6-MDE-8-01质粒的构建
1、序列SP1-N6(核苷酸序列SEQ ID NO.1)、MDE-8(核苷酸序列SEQ ID NO.2)由苏州金唯智生物科技公司进行基因合成，合成的序列克隆到pUC57载体上。
2、以人的cDNA文库为模板，设计引物分别扩增片段CD8 hinge、CD28跨膜区、4-1BB、CD3ζ，以引物互补方式得到Strep tagⅡ、G4S1短片段。采用Overlap PCR技术将SP1-scFv-N6、Strep tagⅡ、G4S1、MDE-8、CD8 hinge、CD28跨膜区、4-1BB、CD3ζ顺次扩增连接成带有酶切位点EcoR I和BamH I的N6-MDE-8-CAR，结构示意图如图1所示。
其中，N6-MDE-8-CAR为能够识别被HIV病毒感染的血液肿瘤细胞表面的具有信号肽的单链抗体ScFv-N6、ScFv-MDE-8。单链抗体scFv-N6的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；scFv-N6的重链可变区VH和轻链可变区VL之间用G4S3连接。单链抗体scFv-MDE-8的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；单链抗体ScFv-N6、MDE-8的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8；单链抗体scFv-MDE-8的重链可变区Vh与轻链可变区VL之间用G4S3连接，G4S3的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.24所示。
信号肽SP1的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；Strep tagⅡ的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；G4S1-Linker的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示；CD8铰链区的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示；CD28跨膜结构域的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示；4-1BB的核苷酸序、氨基酸序列分别如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示；CD3ζ的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20所示；
3、将质粒PTK881-Kan使用EcoR I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，产物经过0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并割胶回收置于Eppendorf管内，用Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，并测定产物的纯度和浓度。
4、将上述载体回收片段分别与N6-MDE-8-CAR以1:2摩尔比加入Eppendorf管加入ExnaseⅡ连接酶(Vazyme)与同源重组酶5×CEⅡbuffer，37℃反应0.5小时；将连接液取出10μL加入100μL DH5α感受态细胞冰浴30min后42℃热激90s，完成后加入500μL soc培养基37℃、220rpm培养2小时；2小时后将Eppendorf管4000g离心1min移除400μL多余液体。将剩余液体涂布在含卡那霉素的LB平板37℃培养12小时；分别在平板上挑取单菌落，接种到5mLLB液体培养基中37℃、220rpm培养12小时。
5、用Axygen小提试剂盒提取质粒，获得质粒PTK881-EF1α-N6-MDE-8-1，送生工生物工程(上海)股份有限公司科技公司一代测序验证无误后，进行含质粒PTK881-EF1α-N6-MDE-8-1的DH5α菌株保种。PTK881-EF1α-N6-MDE-8-1的完整图谱示意图如图2所示。
实施例2：质粒的制备及测序
1、质粒的制备
将含质粒PTK881-EF1α-N6-MDE-8-1的DH5α菌种分别接种至250mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃、220rpm培养过夜。培养液在4℃于6000g离心20min，弃上清。
取出EndoFree plasmid mega kit(Qiagen)中的Buffers P1，向离心得到的大肠杆菌沉淀中加120mL提前预冷的Buffers P1，盖上离心瓶盖，剧烈振荡离心瓶使大肠杆菌沉淀在Buffers P1中完全分散。
向离心瓶中加120mLBuffers P2，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至50rpm，彻底混匀后室温放置5min。
向离心瓶中加120mLBuffers P3，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至滚轴混匀仪最大转速70rpm，彻底混匀直至呈白色不粘稠蓬松的混合液。在4℃于9000g离心15min。
向QIAfilter Cartridge倒入50mLBufferFW，将离心所得上清液倒入QIAfilterCartridge中，轻轻地搅拌混匀。将混合液抽滤入已标记好对应的玻璃瓶中。
向每个玻璃瓶中加入20mL Buffer ER，上下颠倒混匀6次，在-20℃孵育30min。
将标记好的mega柱放入对应的架子上，向每个mega柱内加入35mL Buffers QBT平衡，重力作用使之流尽。
将玻璃瓶中的液体分批全部倒入对应标记的mega柱中，待柱中液体流尽后，向每个mega柱分批加入200mLBuffer QC进行清洗。待柱中液体流尽后，将废液收集盘中的废液倒入50mL洁净离心管内。
再向每个mega柱内加入40mL Buffer QN，使用50mL洁净离心管收集流出液，上下颠倒6次混匀，分装20mL至另一洁净已标记的50mL离心管内。
向每个50mL离心管加入14mL异丙醇(常温)，上下颠倒6次混匀。在4℃于15000g离心50min。
超净工作台内吸尽上清，每管加入3.5mL Endotoxin-free water漂洗，不要将底部沉淀冲散。在4℃于15000g离心30min。将EndoFree plasmid mega kit中的BufferTE放入烘箱内预热。
在超净工作台内吸尽离心后的上清，于超净工作台内吹干(挥发残留的无水乙醇，时间在10min左右)。
在烘箱内拿出BufferTE，在超净工作台内向每管加入1mL BufferTE，用枪吹打10次后放入65℃烘箱，期间不间断地敲击管壁促使沉淀完全溶解。在4℃于4000g离心1min将管壁上的液体甩到管底后吹打混匀。
在超净工作台内将液体全部转移至无内毒素无热源无核酸酶对应标记的EP管中。吸出2μL，用微量分光光度计测质粒浓度，并标记在对应的EP管上，获得质粒PTK881-EF1α-N6-MDE-8-1。
2、目的基因测序
分别取20μL(500ng)质粒DNA，外送测序，根据原始种子序列，检查质粒生产所得产品的目的基因有无发生改变，稳定的工艺下，工作种子在进行发酵培养放大过程中，目的基因不会发生改变，可用于下一环节的生产和正确表达蛋白。
实施例3、Lenti3-N6-MDE-8-CAR慢病毒载体的制备与活滴检测
1、慢病毒载体的制备
在多层细胞培养瓶(Hyperflask)接入130.0～140.0×106数目的293T细胞(Takara)，共560mL DMEM完全培养基(50mL胎牛血清、5mL Antibiotic-Antimycotic(100×))，在37℃含5％CO2培养箱中培养24小时。分别将混有320μg质粒(PTK881-EF1α-N6-MDE-8-1：BZ1质粒：BZ2质粒：BZ3质粒＝12：10：5：6)、混有320μg质粒(PTK881-EF1α-C11-1：BZ1质粒：BZ2质粒：BZ3质粒＝12：10：5：6)的DMEM基础培养基加入960μg PEI管中，漩涡震荡,室温平衡10min。将上述35mL PEI与质粒的混合液与525mL DMEM完全培养基混匀，换入上述多层细胞培养瓶中。将多层细胞培养瓶置于37℃含5％CO2培养箱培养3天后，收集细胞培养上清液。
分别将上清液4000rpm(或3000g)离心30min后，向离心后上清中加入cryonase酶(Takara)置于4℃。6个小时后，使用0.22μm的滤膜对慢病毒上清液进行抽滤，4℃于30000g离心2.5h。去除上清，加入1mL T细胞培养基重悬沉淀。重悬后，留20μL做病毒活性滴度检测，剩余慢病毒浓缩液分装，分别标记为Lenti3-N6-MDE-8-CAR并置于-80℃保存备用。按上述方法制备慢病毒Lenti3-gp120、Lenti3-CD32a作为对照。
2、慢病毒载体活性滴度检测
原理：anti-Strep tagⅡ抗体上标记有荧光素，而anti-Strep tagⅡ抗体能与CAR中Strep tagⅡ特异性结合，通过流式细胞仪检测到的荧光信号间接反应了CAR在293T细胞中的表达情况。
方法：在6孔板中接入5.0×105个/孔293T细胞，慢病毒浓缩液每孔分别加入0.1μL、0.5μL、1μL，并设1个阴性对照。置于37℃含5％CO2培养箱内培养。三日后，用Versene溶液(Gibco)收集293T细胞送流式细胞学检测CAR阳性293T细胞比例，并换算得到Lenti3-N6-MDE-8-CAR慢病毒浓缩液活性滴度。
目前的慢病毒浓缩液活性滴度在1×108～10×108(TU/mL)范围内，检测分析结果见表1。
表1 Lenti3-N6-MDE-8-CAR慢病毒活性滴度检测分析结果
样品名称 活性滴度(TU/mL)
Lenti3-N6-MDE-8-CAR 2.3×10<sup>8</sup>
Lenti3-gp120 2.5×10<sup>8</sup>
Lenti3-CD32a 2.1×10<sup>8</sup>
实施例4、CAR-γδT、CAR-CD8+T细胞的制备
1、CAR-γδT细胞制剂制备：
采集健康供者外周血200mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞。计数后，使用适量TCRγδ+T Cell Isolation Kit,human(美天旎)分选TCRγδ+T细胞，并以1.0～2.0×106个/mL密度在γδT细胞激活培养液(OpTmizerTMCTSTM T-Cell Expansion BasalMedium，OpTmizerTM CTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500～1000IU/mL的IL-2(双鹭药业)，IL-75～20ng/mL，唑唻膦酸5μM)中培养，活化γδT细胞。
24小时后，按MOI为5分别加入Lenti3-N6-MDE-8-CAR慢病毒载体进行转导，混匀后置于CO2培养箱孵育，4小时后补加适量的γδT细胞激活培养液进行培养。
慢病毒转导24小时后将转导后的N6-MDE-8CAR-γδT细胞换入γδT细胞激活培养液，并调整活细胞密度为1.0-2.0×106/mL，继续培养扩增3天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0-2.0×106/mL。第4天开始，每天补加γδT细胞扩增培养液(OpTmizerTMCTSTMT-Cell Expansion Basal Medium，OpTmizerTM CTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500～1000IU/mL的IL-2(双鹭药业)，IL-75～20ng/mL)，并调整活细胞密度为1.0-2.0×106/mL，扩增培养至14天。
根据预计细胞用量收集N6-MDE-8CAR-γδT细胞，重悬于含2％人血白蛋白的100mL生理盐水中，转入细胞回输袋中，热封后制成N6-MDE-8CAR-γδT细胞制剂成品。同时制备gp120 CAR-γδT和CD32a CAR-γδT作为对照。
2、CAR-CD8+T细胞制剂制备
采集健康供者外周血100mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞。计数后，使用适量CD8+T Cell Isolation Kit human(美天旎)分选CD8阳性细胞，并以1.0～2.0×106个/mL密度在T细胞完全培养液(OpTmizerTM CTSTM T-Cell ExpansionBasal Medium，OpTmizerTM CTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500～1000IU/mL的IL-2(双鹭药业))中培养，同时按每106个细胞加入25μl Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)活化T细胞。
24小时后，按MOI为3分别加入Lenti3-N6-MDE-8-CAR慢病毒载体进行转导，混匀后置于CO2培养箱孵育，4小时后补加适量的T细胞完全培养基进行培养。
慢病毒转导24小时后将转导后N6-MDE-8CAR-CD8+T细胞换入新鲜T细胞完全培养液，并调整活细胞密度为1.0-2.0×106/mL，继续培养扩增10～20天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0-2.0×106/mL。
根据预计细胞用量收集N6-MDE-8CAR-CD8+T细胞，重悬于含2％人血白蛋白的100mL生理盐水中，转入细胞回输袋中，热封后制成N6-MDE-8CAR-CD8+T细胞制剂成品。同时制备gp120 CAR-CD8+T和CD32a CAR-CD8+T作为对照。
3、CAR-γδT、CAR-CD8+T细胞转导效率检测
取1.0×106个CAR-γδT、CAR-CD8+T细胞，分别与FITC-strepII室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，反映了CAR阳性细胞在总细胞中的比率。N6-MDE-8CAR-γδT、N6-MDE-8CAR-CD8+T细胞转导效率检测结果分别如图3、图4所示。图3、图4表明成功制备了N6-MDE-8CAR-γδT细胞、gp120 CAR-γδT细胞、CD32a CAR-γδT细胞、N6-MDE-8CAR-CD8+T细胞、gp120 CAR-CD8+T细胞、CD32aCAR-CD8+T细胞。
实施例5、CAR-γδT、CAR-CD8+T细胞的体外功能检测
1.体外杀伤检测：
采用钙黄绿素检测法分别对CD8+T、γδT、CAR-γδT、CAR-CD8+T细胞进行体外杀伤功能检测。选取构建稳转细胞293T-gp120+，293T-CD32a+，293T-gp120+-CD32a+细胞作为阳性靶细胞，以293T细胞作为阴性靶细胞。
取适量的上述293T-gp120+，293T-CD32a+，293T-gp120+-CD32a+、293T靶细胞，在1×106/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×105/mL，向96孔板中分别加阴性靶细胞和阳性靶细胞，阳性靶细胞分三组，第一组：每孔加入5000个293T-gp120+；第二组：每孔加入5000个293T-CD32a+细胞；第三组每孔加入5000个293T-gp120+-CD32a+细胞。按25:1,5:1,1:1的效靶比分别加入T、γδTN6-MDE-8CAR-γδT、N6-MDE-8CAR-CD8+T细胞，37℃孵育2～3小时。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞裂解百分数。靶细胞裂解百分数结果如图5-8所示，结果显示，N6-MDE-8CAR-γδT、N6-MDE-8CAR-CD8+T细胞能明显促进gp120、CD32a阳性靶细胞(293T-gp120+、293T-CD32a+，293T-gp120+-CD32a+)裂解，N6-MDE-8CAR-γδT对阴性靶细胞(293T)也有一定的杀伤作用；γδT细胞对阳性靶细胞和阴性靶细胞都有一定的促进裂解作用。图9结果显示单靶点的gp120 CAR-γδT、CD32a CAR-γδT细胞对阳性靶细胞293T-gp120+-CD32a+的裂解效果比双靶点的N6-MDE-8CAR-γδT细胞差。同样的，单靶点的gp120 CAR-CD8+T、CD32a CAR-CD8+T细胞对阳性靶细胞293T-gp120+-CD32a+的裂解效果比双靶点的N6-MDE-8CAR-CD8+T细胞差。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 申请人 武汉波睿达生物科技有限公司
<120> 一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法及其应用
<130> CP19455
<141> 2020-07-08
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60
atcccccgag cgcacctggt acaatcaggg actgcgatga agaaaccggg ggcctcagta 120
agagtctcct gccagacctc tggatacacc tttaccgccc acatattatt ttggttccga 180
caggcccccg ggcgaggact tgagtgggtg gggtggatca agccacaata tggggccgtg 240
aattttggtg gtggttttcg ggacagggtc acattgactc gagacgtata tagagagatt 300
gcgtacatgg acatcagagg ccttaaacct gacgacacgg ccgtctatta ctgtgcgaga 360
gaccgttcct atggcgactc ctcttgggcc ttagatgcct ggggacaggg aacgacggtc 420
gtcgtctccg cgggcggagg gggttcaggt ggaggaggct ctggcggtgg cggaagctac 480
atccacgtga cccagtctcc gtcctccctg tctgtgtcta ttggagacag agtcaccatc 540
aattgccaga cgagtcaggg tgttggcagt gacctacatt ggtatcaaca caaaccgggg 600
agagccccta aactcttgat ccaccatacc tcttctgtgg aagacggtgt cccctcaaga 660
ttcagcggct ctggatttca cacatctttt aatctgacca tcagcgacct acaggctgac 720
gacattgcca catattactg tcaagtttta caatttttcg gccgagggag tcgactccat 780
attaaa 786
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa ttactactat 180
acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatctg 300
ggggcagcag cttctgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggcgga 360
gggggttcag gtggaggagg ctctggcggt ggcggaagcg ccatccagtt gacccagtct 420
ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcaagtcag 480
ggcattaaca gtgctttagc ctggtatcag cagaaaccag ggaaagctcc taagctcctg 540
atctatgatg cctccagttt ggaaagtggg gtcccatcaa ggttcagcgg cagtggatct 600
gggacagatt tcactctcac catcagcagc ctgcagcctg aagattttgc aacttattac 660
tgtcaacagt ttaatagtta ccctcatact tttggccagg ggaccaagct ggagatcaaa 720
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
20 25 30
Ile Leu Phe Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Val Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala
115 120
<210> 4
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His His Thr Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Ala
65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Leu His Ile Lys
100
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Tyr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Gly Ala Ala Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
20 25 30
Ile Leu Phe Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Val Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Ile His Val Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys
145 150 155 160
Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp Leu His Trp Tyr Gln His Lys
165 170 175
Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile His His Thr Ser Ser Val Glu
180 185 190
Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe His Thr Ser Phe
195 200 205
Asn Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg Gly Ser Arg Leu His Ile Lys
225 230 235 240
<210> 8
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Tyr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Gly Ala Ala Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
130 135 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Gly Ile Asn Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
165 170 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro
180 185 190
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe
210 215 220
Asn Ser Tyr Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60
atcccc 66
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aactggagcc acccccagtt cgagaag 27
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 13
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 14
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 15
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 16
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 17
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 18
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 19
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggcggagggg gttca 15
<210> 22
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggcggagggg gttcaggtgg aggaggctct ggcggtggcg gaagc 45
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60
atcccccgag cgcacctggt acaatcaggg actgcgatga agaaaccggg ggcctcagta 120
agagtctcct gccagacctc tggatacacc tttaccgccc acatattatt ttggttccga 180
caggcccccg ggcgaggact tgagtgggtg gggtggatca agccacaata tggggccgtg 240
aattttggtg gtggttttcg ggacagggtc acattgactc gagacgtata tagagagatt 300
gcgtacatgg acatcagagg ccttaaacct gacgacacgg ccgtctatta ctgtgcgaga 360
gaccgttcct atggcgactc ctcttgggcc ttagatgcct ggggacaggg aacgacggtc 420
gtcgtctccg cgggcggagg gggttcaggt ggaggaggct ctggcggtgg cggaagctac 480
atccacgtga cccagtctcc gtcctccctg tctgtgtcta ttggagacag agtcaccatc 540
aattgccaga cgagtcaggg tgttggcagt gacctacatt ggtatcaaca caaaccgggg 600
agagccccta aactcttgat ccaccatacc tcttctgtgg aagacggtgt cccctcaaga 660
ttcagcggct ctggatttca cacatctttt aatctgacca tcagcgacct acaggctgac 720
gacattgcca catattactg tcaagtttta caatttttcg gccgagggag tcgactccat 780
attaaaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggcggag ggggttcaca ggtgcacctg 840
gtggagtctg ggggaggcgt ggtccagcct gggaggtccc tgagactctc ctgtgcagcg 900
tctggattca ccttcagtag ctatggcatg cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg 960
ctggagtggg tggcagttat atggtatgat ggaagtaatt actactatac agactccgtg 1020
aagggccgat tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac 1080
agcctgagag ccgaggacac ggctgtgtat tactgtgcga gagatctggg ggcagcagct 1140
tctgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct caggcggagg gggttcaggt 1200
ggaggaggct ctggcggtgg cggaagcgcc atccagttga cccagtctcc atcctccctg 1260
tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcaggg cattaacagt 1320
gctttagcct ggtatcagca gaaaccaggg aaagctccta agctcctgat ctatgatgcc 1380
tccagtttgg aaagtggggt cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg gacagatttc 1440
actctcacca tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg tcaacagttt 1500
aatagttacc ctcatacttt tggccagggg accaagctgg agatcaaaaa ctggagccac 1560
ccccagttcg agaagggcgg tggcggaagc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 1620
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 1680
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatttttg ggtgctggtg 1740
gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 1800
tgggtgaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1860
gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1920
ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1980
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 2040
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 2100
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 2160
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 2220
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 2268

Claims (4)

1.一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述双特异性嵌合型抗原受体从N端到C端顺次拼接信号肽、抗HIV gp120单链抗体、Strep tagⅡ、抗CD32a单链抗体、CD8 hinge、CD28TM、4-1BB、CD3ζ，且所述双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列如SEQID NO：25所示。
2.一种重组慢病毒载体，其特征在于：以PTK881-EF1α载体为骨架，含有权利要求1中所述的编码核苷酸。
3.一种免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞转染有权利要求2所述的重组慢病毒载体，且所述免疫细胞为T细胞。
4.权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体、权利要求2所述的重组慢病毒载体、权利要求3所述的免疫细胞在用于制备治疗HIV感染的药物或制剂中的应用。
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