CN112175092B - 同时靶向lmp1和gp350的双靶标嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

同时靶向lmp1和gp350的双靶标嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同时靶向LMP1和GP350的双靶标嵌合抗原受体，其包括：依次连接的抗GP350单链抗体的轻链、抗GP350的单链抗体的重链、抗LMP1单链抗体的轻链、抗LMP1单链抗体的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、4‑1BB胞内区以及CD3ζ胞内区。本发明的双靶标嵌合抗原受体有更高的特异性和安全性，对EBV感染引起的恶性肿瘤以及处于潜伏期的EBV具有特异性杀伤作用。

Description

同时靶向LMP1和GP350的双靶标嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，提供了治疗人肿瘤的方法和组合物。本发明通过基因工程技术获得同时靶向LMP1和GP350的双靶标嵌合抗原受体编码基因，将该融合基因插入表达载体中，并转导入人T淋巴细胞中，使T细胞表达该融合基因。本发明还涉及前述融合基因表达的多肽、载体，以及用于免疫治疗的在其表面表达所述CAR的免疫细胞。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是人类发现的第一个致瘤病毒，其在人群中感染率高达90％，并与多种淋巴源性肿瘤的发生发展密切相关(Plummer M,de Martel C,Vignat J,et al.Global burden of cancers attributable to infections in 2012:asynthetic analysis[J].Lancet Glob Health,2016,4(9))，Burkitt淋巴瘤(Pannone G,Zamparese R,Pace M,et al.The role of EBV in the pathogenesis of Burkitt'sLymphoma:an Italian hospital based survey[J].Infect Agent Cancer,2014,9(1))，霍奇金淋巴瘤Gandhi MK,Tellam JT,Khanna R.Epstein-Barr virus-associatedHodgkin's lymphoma[J].Br J Haematol,2004,125(3):267-281等均与EBV感染密切相关。全球每年新增约200000例EBV相关的肿瘤病例(COHEN JI，FAUCI AS，VARMUS H，etal.Epstein-Barr virus:an important vaccine target for cancer prevention[J].Science Translational Medicine，2011，3(107))。EBV主要传播途径是唾液，病毒穿过黏膜上皮屏障，感染下层淋巴组织。在原发性感染发生后，EBV以潜伏感染形式存在于记忆B淋巴细胞中，以逃避宿主免疫系统并防止受感染的细胞凋亡。宿主免疫力低下或环境发生改变时，EBV被激活从而大量复制,产生新的病毒个体，进而感染上皮细胞、淋巴细胞与自然杀伤细胞。根据EBV的潜伏类型，可以分为Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型，85％的淋巴瘤和Ⅱ，Ⅲ型潜伏相关，共同表达LMPs。1型潜伏膜蛋白(Latent membrane protein，LMP1)作为EBV编码的跨膜潜伏蛋白，是EBV重要的致瘤基因，参与多种EBV相关肿瘤的发生、发展、转移等过程(Bollard CM,Rooney CM,Heslop HE.T-cell therapy in the treatment of post-transplantlymphoproliferative disease[J].Nat Rev Clin Oncol,2012,9(9))，LMP-1能够转化体外永生化人及动物细胞，其与细胞粘附性，细胞外基质的降解，肿瘤血管的生成等密切相关(Zhang X,Sanmun D,Hu L,et al.Epstein-Barr virus-encoded LMP1 promotescisplatin-induced caspase activation through JNK and NF-kappaB signalingpathways[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,360(1))，LMP1是潜伏感染的重要标志物。EBV可以逃避免疫系统的识别，由于缺乏有效的治疗措施针对潜伏期的EBV，EBV相关淋巴瘤的复发和治疗是临床亟待解决的难题。
EBV借助GP350/220与B淋巴细胞膜上表达丰富的CR2结合,从而侵入B淋巴细胞。EBV基因BLLF1编码的GP350/220是一种高度糖基化的单跨膜蛋白,对CR2具有高度亲和力,GP350/220有三个区域,分别是多肽11382、11389和11 416序列,参与EBV对B淋巴细胞的侵入。(Urquiza M,Lopez R,Patino H,et al.Identification of three gp350/220regionsinvolved in Epstein-Barr virus invasion of host cells[J].J Biol Chem,2005,280(42))。因此，GP350对于游离的EBV颗粒感染B细胞具有重要作用。
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T，CAR-T)是近来兴起的治疗复发难治淋巴瘤的有效治疗手段。与抗体药物相比，CAR-T细胞疗法更具活性优势，其特点在于将抗体的靶向特异性与T细胞的归巢、组织穿透和靶向杀伤效应进行了有机的结合。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，尽管CAR-T细胞治疗取得了快速发展，但CAR-T治疗淋巴瘤也面临一系列挑战，如脱靶效应和细胞因子风暴等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，如何同时清除潜伏期的EBV及游离的EBV病毒颗粒。
本发明的发明目的之一在于提供一种针对现有技术的不足，提供特异性更好、安全性更高、疗效更加显著的双靶标联合嵌合抗原受体及其应用。
本发明的发明目的之二在于提供编码该双靶标嵌合抗原受体的核酸及其应用。
本发明的发明目的之三在于提供含有该双靶标嵌合抗原受体的细胞及其应用。
本发明的目的之四在于提高双靶标嵌合抗原受体对T细胞的转导效率。
实现本发明上述目的的具体技术方案详述如下：
一种同时靶向LMP1和GP350的双嵌合抗原受体，其包括：依次连接的抗GP350单链抗体的轻链、抗GP350的单链抗体的重链、抗LMP1单链抗体的轻链、抗LMP1单链抗体的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、4-1BB胞内区以及CD3ζ胞内区。
本发明所述的抗GP350抗体的轻链核苷酸编码序列如SEQ ID NO.11所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，抗GP350的抗体重链的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.13所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示
本发明的双靶标嵌合抗原受体的信号肽核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。抗LMP1及GP350抗体的轻重链间的连接序列的核苷酸编码序列优选如SEQ ID NO.5所示，其氨基酸序列优选如SEQ ID NO.6所示。抗LMP1抗体的轻链核苷酸编码序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，抗LMP1单链抗体的重链编码序列如SEQ ID NO.7所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。抗LMP1单链抗体的轻重链间的链接序列的核苷酸编码序列优选如SEQ ID NO.5所示，其氨基酸序列优先如SEQ ID NO.6所示。CD8α铰链区核苷酸编码序列如SEQ ID NO.15所示，其氨基酸序列如SEQID NO.16所示；CD28跨膜区和胞内区核苷酸编码序列如SEQ ID NO.17所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；4-1BB胞内区核苷酸编码序列如SEQ ID NO.19所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；CD3ζ胞内区核苷酸编码序列如SEQ ID NO.21所示，其氨基酸序列如SEQID NO.22所示。
本发明还提供一种带有所述双嵌合抗原受体的重组表达载体。
本发明还提供一种带有所述双嵌合抗原受体的免疫细胞。
本发明还提供所述双嵌合抗原受体或带有所述双嵌合抗原受体的免疫细胞在肿瘤免疫治疗中的应用。
本发明还提供制备所述双嵌合抗原受体的重组表达载体的方法。
本发明还提供一种带有所述双嵌合抗原受体的免疫细胞。
发明的有益效果：(1)本发明涉及的双靶标嵌合抗原受体体外肿瘤细胞杀伤能力强，抗肿瘤活性效果理想，能够同时清除潜伏期EBV及EBV病毒颗粒；(2)本发明涉及的双靶标嵌合抗原受体受到抗原刺激时，分泌细胞因子水平极低，使得临床应用安全性更高，有效降低现有技术中CAR-T技术炎性细胞因子风暴；(3)本发明涉及的双靶标嵌合抗原受体较单靶标抗原受体的转化率大为提高。
附图说明
图1表示PTK-hGP350 CAR-T细胞、PTK-hLMP1 CAR-T细胞、PTK-hGP350-hLMP1 CAR-T细胞与P3HR1细胞共孵育24小时，上清中分泌的IL-2。
图2表示PTK-hGP350 CAR-T细胞、PTK-hLMP1 CAR-T细胞、PTK-hGP350-hLMP1 CAR-T细胞与P3HR1细胞共孵育24小时，上清中分泌的TNF-α。
图3表示PTK-hGP350 CAR-T细胞、PTK-hLMP1 CAR-T细胞、PTK-hGP350-hLMP1 CAR-T细胞与P3HR1细胞共孵育后，实时定量PCR检测的EBV-DNA拷贝数。
具体实施方式
本发明提供了一种双靶标嵌合抗原受体、免疫效应细胞及其在临床中的应用，下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。
实施例1双靶点CART质粒构建
质粒构建
依次合成基因序列片段并连接：抗GP350单链抗体的轻链、抗GP350单链抗体的重链、抗LMP1单链抗体的轻链、抗LMP1单链抗体的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、4-1BB胞内区、以及CD3ζ胞内区。片段由金唯智公司合成。将得到的基因序列片段连接至带有酶切位点Age I和Afe I的通用慢病毒表达载体PTK881，得到能同时表达LMP1和GP350双靶点CAR的质粒PTK-hGP350-hLMP1。连接步骤由金唯智生物公司完成。
构建的质粒中还包括位于抗GP350单链抗体的轻链前的信号肽序列，序列如SEQID NO.1所示，抗LMP1单链抗体的轻重链间的连接序列如SEQ ID NO.5所示，单链抗体间的连接序列如SEQ ID NO.9所示，抗GP350单链抗体的轻重链间的连接序列如SEQ ID NO.5所示。
采用同样的方法，构建了PTK-hGP350，PTK-hLMP1。
将合成的PTK-hGP350-hLMP1、PTK-hGP350、PTK-hLMP1重组质粒的穿刺菌接种至250mL含100μg/mL氨苄霉素的LB培养液中，37℃、200rpm培养过夜。
质粒提取
将过夜培养的菌液平均加入50ml离心管中，13,000rpm(～16,200×g)离心1分钟收集细菌，尽量吸弃全部上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入600μl Buffer P1(事先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀；向离心管中加入600μl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀8-10次，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠；向离心管中加入600μl Buffer E3，立即上下颠倒混匀8-10次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟。13,000rpm离心5分钟，吸取上清，将上清加入过滤柱(Endo-Remover FM)中(已装入收集管)，13,000rpm离心1分钟过滤，将收集管中的滤液转移到离心管中。向滤液中加入600μl异丙醇，上下颠倒混匀。柱平衡：向已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DL)中加入200μl Buffer PS，13,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱(已装入收集管)中。13,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
向吸附柱中加入750μl Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，13,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱重新放回收集管中，13,000rpm离心1分钟。将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附膜的中间部位加150μl Endo-Free Buffer EB，室温放置2-5分钟，13,000rpm离心2分钟。-20℃保存质粒。
实施例2 CAR-T细胞的构建
慢病毒包装：在直径10cm的培养皿中接入一定数目的293T细胞，加入10mL DMEM完全培养基，在37℃含5％CO2的培养箱中培养数皿。当293T细胞长满培养皿大约90％左右面积后，将混有16μg三质粒包装系统100μl DMEM低糖培养基加入含48μl PEI转染试剂的DMEM低糖培养基的管中，漩涡震荡，充分混匀，37℃孵育30min。将前述得到的混合液滴入10cm的培养皿中，并置于37℃含5％CO2培养箱培养，6-8小时后换液，去掉10cm培养皿中全部的培养基，加入新的10mlDMEM完全培养基。3天后，收集细胞培养上清液，通过0.45μm滤膜过滤，得到病毒初始液。本实施例中三质粒包装系统为PTK-hGP350-hLMP1质粒与GAG质粒和VSVG质粒的混合物，其中三者的质量比为PTK-hGP340-hLMP1:GAG:VSVG＝8:6:2。PTK-hGP350，PTK-hLMP1同。
病毒液浓缩、滴度测定
1)配制5×PEG 8000NaCl：称取NaCl 8.766g；PEG8000 50g溶解在200mL Milli-Q纯水中；121℃，湿热灭菌30min；保存在4℃。
2)每30mL过滤后的病毒初始液，加入5×PEG-8000NaCl母液7.5mL。
3)每20～30min混合一次，共进行3-5次。
4)4℃放置过夜。
5)4℃，4000g，离心20min。
6)吸弃上清，静置离心管1～2min，吸走残余液体。
7)每30mL过滤后的病毒初始液，加入500μL PBS溶解慢病毒沉淀，得到病毒浓缩液。
在制备得到病毒浓缩液后，对病毒滴度进行测定，具体如下：
1)取生长状态良好的293T细胞，加入1ml胰酶消化细胞，直至细胞刚有脱落，消化后计数，按5×105细胞/孔将细胞均匀铺至24孔细胞培养板，37℃含5％CO2培养箱培养6～10h至细胞贴壁。
2)向24孔板中细胞培养上清中分别加入0.1μl、0.5μl、1μl浓度的病毒浓缩液，并设置1个阴性对照，轻轻拍打24孔板边缘，使病毒液与培养液混合均匀，于培养箱中37℃含5％CO2培养箱感染48h。
3)感染48h后，加入1ml胰酶消化细胞消化，直至细胞刚有脱落，收集细胞，标准流式细胞术检测阳性细胞百分比，并根据以下公式计算病毒滴度，单位为TΜ/mL：T＝(铺板时细胞数×阳性细胞百分比×1000)/加入的病毒液体积(μl)。结果如表1所示：
Figure BDA0002672355940000061
表1
上表显示，慢病毒浓缩液活性滴度在1～10E+08范围左右，符合实验要求。
制备T细胞
1)收集健康人的外周新鲜血液10mL。
2)稀释：室温下加入等体积的PBS缓冲液，轻轻吹打混匀。
3)加样：取50mL离心管，吸取10mL淋巴细胞分离液于离心管中，淋巴细胞分离液用量与稀释前血液的体积比为1:1，离心管倾斜45°，将稀释后的血液在淋巴细胞分离液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至其上面。
4)离心：18-20℃，1800rpm，20min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分离液层、单个核细胞层、血浆层。
5)回收：首先吸去上层的血浆，然后用移液枪轻轻吸出单个核细胞层，放入新的离心管中。
6)洗涤：加入PBS缓冲液至50ml，1800rpm，10min，弃上清，洗涤两次。
7)细胞计数：弃上清，加1ml RPMI-1640培养基，其中含10％胎牛血清，吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液，采用血细胞计数板计数。
8)利用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基调整细胞密度至1×106细胞/mL，加入细胞因子及抗体复合物，置于37℃含5％CO2培养箱培养24h。本实施例中所用的细胞因子为100Μ/mL的IL-2，抗体复合物为终浓度100ng/m L Anti-CD3(OKT3)和250ng/mL Anti-CD28。
慢病毒感染T细胞
向制备好的T细胞中按照感染时病毒总pfu和细胞总数的比值MOI为2的比例加入病毒浓缩液，混匀后置于含5％的CO2的培养箱中孵育，4小时后补加T细胞完全培养基，调整细胞密度至1.0×106/mL进行培养转导，得到CAR-T细胞。
慢病毒转导24小时后将细胞换入新鲜T细胞完全培养液，并调整活细胞密度为1.0×106/mL，继续培养扩增10～20天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0×106/mL。
实施例3转导效率检测
在转导得到CAR-T细胞后，可对PTK-hGP350-hLMP1 CAR-T细胞的转导效率检测，具体如下：
取1.0×106个转导后T细胞，与Goat anti-Hμman IgG Antibody，FITC conjμgate室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，表2反映了转导效率。
转导类型 转导效率
PTK-hGP350-hLMP1 CAR-T细胞 29.8％
PTK-hGP350CAR-T细胞 32.5％
PTK-hLMP1 CAR-T细胞 33.1％
表2
实施例4细胞因子检测
将表达LMP1和GP350的人EBV阳性淋巴瘤细胞P3HR1细胞以每孔1x 105种于96孔板中，将2x 105个效应细胞PTK-hGP350-hLMP1 CAR-T与靶细胞混合，以总体积200μl的培养液(RPMI 1640培养基+10％FBS)在37℃5％CO2培养箱中共培养24个小时，每组3个复孔。之后离心取上清10μl用PerkinElmer的AlphaLISA assay系列试剂盒(AL208、AL216、AL217、AL221)分别检测TNF-α、以及IL-2的细胞因子浓度水平。
实施例5颗粒酶和穿孔素的检测
将人EBV阳性的淋巴瘤细胞P3HR1细胞以每孔1x 105种于96孔板中，将2x 105个效应细胞PTK-hGP350-hLMP1 CAR-T、PTK-hGP350 CAR-T、PTK-hLMP1 CAR-T、T细胞分别与靶细胞混合，以总体积200μl的培养液(RPMI 1640培养基+10％FBS)在37℃5％CO2培养箱中共培养24个小时。每组3个复孔。用ELISA双抗夹心法测OD值，再根据标准品的浓度计算各组细胞上清液颗粒酶、穿孔素的浓度，表3为实验数据。
Figure BDA0002672355940000071
Figure BDA0002672355940000081
表3
实施例6 CAR-T细胞对EB病毒感染的淋巴癌细胞的体外杀伤作用
采用钙黄绿素检测法对PTK-hGP350-hLMP1 CAR-T细胞进行体外杀瘤功能检测。
取适量表达LMP1和GP350的人EBV阳性淋巴瘤细胞P3HR1细胞作为靶细胞，在1×106/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温下，洗两遍后，将细胞重悬至1.5×105/mL。按不同效靶比加入PTK-hGP350-hLMP1 CAR-T细胞，200g离心30秒，37℃孵育2～3小时。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞裂解百分数。结果如下表4所示：
Figure BDA0002672355940000082
表4
上表结果显示，PTK-hGP350-hLMP1 CART细胞对EBV阳性淋巴瘤细胞具有特异杀伤活性。
实施例7实时定量PCR检测EBV-DNA拷贝数
提取基因组DNA:取1×106左右个P3HR1细胞置于干燥离心管,应用TIANGEN公司的DNA提取纯化试剂盒从P3HR1淋巴癌细胞中提取基因组DNA,将提取的基因组DNA进行EBV-DNA检测。
上游引物:AATTTTTTCTGCTAAGCCCAACA下游引物:ACGGGTGGGTGTGTGTAGTGT；探针:FCCACCA-CACCCAGGCP。采用Taqman技术,利用实时荧光定量PCR方法对EBV-DNA浓度进行检测,总反应体系为15μl,其中包括模板DNA 2μl,反应混合液13μl(含ABI Universal masterMixⅡ、检测引物及特异位点探针、H2O。PCR反应条件分别为:50℃2min,95℃10min；95℃30s,55℃45s,共50个循环。PCR扩增结果用自动分析软件Sequence Detection Systemsoftware(Version 2.0)进行自动分析(美国ABI公司)。结果如图3所示。
实施例8相关技术方案对比
本实施例中的实验步骤同实施例6。
本发明中的双靶标嵌合抗原受体与单靶标嵌合抗原受体相比，显示出更高的杀伤效率。表5显示PTK-hGP350-hLMP1 CAR-T、PTK-hGP350 CAR-T、PTK-hLMP1 CAR-T不同效靶比下对肿瘤细胞的杀伤效率。
Figure BDA0002672355940000091
表5
与中国发明专利CN201910419725.7中的双靶标嵌合抗原受体相比，PTK-hCD30-hLMP1 CAR-T的构建根据中国发明专利CN201910419725.7记载的内容。本发明提供的双靶标嵌合抗原受体，技术效果更佳。表6显示了PTK-hGP350-hLMP1 CAR-T与CN201910419725.7中的PTK-hCD30-hLMP1 CAR-T比较实验数据。
Figure BDA0002672355940000101
表6
Figure BDA0002672355940000111
Figure BDA0002672355940000121
Figure BDA0002672355940000131
Figure BDA0002672355940000141
Figure BDA0002672355940000151
Figure BDA0002672355940000161
Figure BDA0002672355940000171
Figure BDA0002672355940000181
Figure BDA0002672355940000191
Figure BDA0002672355940000201
<110> 徐州医科大学附属医院
<120> 同时靶向LMP1和GP350的双嵌合抗原受体及其应用
<130> 2020.09.04
<170> PatentIn version 3.3
<210> 信号肽编码序列
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 信号肽氨基酸序列
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<160> 抗LMP1单链抗体的轻链编码序列
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gaactgcaga tgacacaaag cccctcctcc ctctccgcca gcgtgggaga cagagtcgct 60
atcacatgta gagctagcca gtccatctcc tcccatctga actggtatca gcagaaaccc 120
ggcaaggccc ccaaactgct gatttatgcc gccagcagcc tccaatccgg cgtgcctagc 180
agattcagcg gctccggcag cggaacagac tttacactca ccatcagctc tctgcagccc 240
gaagacttcg ccacctacta ctgtcagcag tcctactcca caccttacac attcggccaa 300
<210> 抗LMP1单链抗体的轻链氨基酸序列
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser His
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln
100
<210> 抗LMP1单链抗体的轻重链连接序列的编码序列
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ggtggcggtg gctctggtgg cggtggctcc ggtggcggtg gctca 45
<210> 抗LMP1单链抗体的轻重链连接序列
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 抗LMP1单链抗体的重链编码序列
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gaagtccaac tggtcgagag cggaggagga ctcgtccaac ccggcggctc tctgaggctg 60
agctgcgctg cttccggctt cacattctcc tcctactgga tgagctgggt gagacaagct 120
cccggcaagg gactcgaatg ggtggccaat atcaagcaag acggcagcga gaagtactac 180
gtggactccg tgaagggaag attcacaatc tccagagaca acgccaagaa ctctctgtat 240
ctgagaatga actctctgag agccgaagac acagccgtgt attactgcgc tagggcttgg 300
ggctactcca gctactactt cgattactgg ggacaaggca ccctcgtcac agtcagcccc 360
<210> 抗LMP1单链抗体的重链氨基酸序列
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Trp Gly Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro
115 120
<210> 单链抗体间连接序列的编码序列
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcgggtgg aggcggttca 60
ggcggaggtg gctct 75
<210> 单链抗体间连接序列
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 抗GP350单链抗体轻链编码序列
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
caggctgtgc tgacccagga gagcgccctg accacatcac ccggcgagac cgtgaccctg 60
acctgcagat cctccaccac aggcgccgtg accacaagca actacgccaa ctgggtgcag 120
gagaagcccg accacctgtt caccggcctg atcggcggca ccaacaacag agtgcccggc 180
gtgcccgcca gattcagcgg atccctgatc ggcgacaaag ccgccctgac cattaccggc 240
gcccagaccg aagacgaggc catctacttc tgcgtgctgt ggcacagcaa tcactgggtg 300
ggcggaggca ccaaactgac cgtgctg 327
<210> 抗GP350单链抗体轻链氨基酸序列
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 12
Gln Ala Val Leu Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Thr Gly Ala Val Thr Thr
20 25 30
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr
35 40 45
Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Val Pro Gly Val Pro Ala Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly
65 70 75 80
Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp His Ser
85 90 95
Asn His Trp Val Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 抗GP350单链抗体重链编码序列
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ttcgagctgg tgaagttcgg cacctccatg aagatcagct gcaaggccag tggaagtagc 60
tttacagact acaccatgaa ctggatgaag cagagccacg gaagaaatct ggagtggatt 120
gggctgatta acccctacaa cggcggcacc aggtacaacc agaaatttaa gggacgggcc 180
accctgaccc tggacaaaag cagcagcacc gcctacatgg aggtgctgag cctgacctcc 240
gaagacagcg ccgtgtacta ctgcggcgga ctgagaagag tgaactggtt tgcctactgg 300
tggggccagg gaaccctggt gagcgtgagt gccgccaaga ccaccccccc cagcgtgtac 360
cccctggctc ctggaagcgc cgctcagacc aacagcatgg tgactctggg a 411
<210> 抗GP350单链抗体重链氨基酸序列
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 14
Phe Glu Leu Val Lys Phe Gly Thr Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ser Ser Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Met Lys Gln Ser
20 25 30
His Gly Arg Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly
35 40 45
Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Leu
50 55 60
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Val Leu Ser Leu Thr Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gly Leu Arg Arg Val Asn Trp
85 90 95
Phe Ala Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ala Ala
100 105 110
Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala
115 120 125
Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130 135
<210> CD8α铰链区编码序列
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
ttttgggtcc tcgtggtggt gggaggagtg ctggcttgct attctctgct cgtgaccgtc 60
gcctttatca tcttttgggt gaggtccaaa aggagcagag gcggacacag cgattatatg 120
aacatgacac ctagaagacc cggacctacc agaaaacact accaacccta tgctcctcct 180
agagactttg ccgcctacag atcc 204
<210> CD8α铰链区氨氨基酸序列
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 16
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> CD28跨膜区和胞内区编码序列
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
agatccaaga gatctagact gctgcattcc gactacatga atatgacccc cagaaggccc 60
ggccctacaa ggaagcacta ccagccttac gcccctccta gggatttcgc cgcttataga 120
agc 123
<210> CD28跨膜区和胞内区氨基酸序列
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 18
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 41BB胞内区编码序列
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
aagagaggaa gaaagaaact gctctacatt ttcaagcagc cctttatgag acccgtccaa 60
accacacaag aggaggatgg ctgcagctgt agatttcccg aggaagaaga gggaggctgc 120
gagctg 126
<210> 41BB胞内区氨基酸序列
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 20
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> CD3ζ胞内区编码序列
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
agagtgaagt tttctagatc cgccgacgct cccgcctatc aacaaggcca gaatcagctg 60
tacaacgagc tgaacctcgg aagaagggag gagtacgatg tgctggacaa aagaaggggc 120
agagaccccg agatgggcgg aaaacccaga aggaaaaacc cccaagaggg cctctataac 180
gagctccaga aggataagat ggccgaggcc tattccgaaa tcggcatgaa aggagagagg 240
agaaggggca aaggccacga tggactctac caaggactga gcaccgctac caaggacacc 300
tatgacgctc tgcatatgca agctctcccc cccagatga 339
<210> CD3ζ胞内区氨基酸序列
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 22
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110

Claims (4)

1.一种双靶标嵌合抗原受体，其特征在于包括依次连接的抗GP350单链抗体的轻链、抗GP350的单链抗体的重链、抗LMP1单链抗体的轻链、抗LMP1单链抗体的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、4-1BB胞内区以及CD3ζ胞内区，以及信号肽序列和连接序列，所述抗GP350单链抗体的轻链的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.11所示，抗GP350的单链抗体的重链的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.13所示，抗LMP1单链抗体的轻链的核苷酸编码序列如SEQID NO.3所示，抗LMP1单链抗体的重链的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.7所示，CD8α铰链区的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.15所示，CD28跨膜区和胞内区的核苷酸编码序列如SEQ IDNO.17所示，4-1BB胞内区的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.19所示，CD3ζ胞内区的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.21所示，所述信号肽序列如SEQ ID NO.1所示，所述连接序列分别为，抗LMP1单链抗体的轻重链及抗GP350单链抗体的轻重链间连接序列均如SEQ ID NO.6所示，抗LMP1单链抗体及抗GP350单链抗体间的连接序列如SEQ ID NO.10所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的双靶标嵌合抗原受体的核苷酸编码序列。
3.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞包含权利要求1所述的双靶标嵌合抗原受体，所述免疫细胞选自T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞。
4.权利要求3所述的免疫细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为EBV阳性的骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
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