CN110144325A

CN110144325A - 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110144325A
Application number: CN201810147083.5A
Authority: CN
Inventors: 张宏玲; 钟春颖
Original assignee: Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2019-08-20

Abstract

本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR‑DR5和/或靶向c‑Met的嵌合抗原受体CAR‑c‑Met，CAR‑DR5可以专一性的靶向DR5，CAR‑c‑Met可以专一性的靶向c‑Met，从而促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，并且能够有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，更好的维持细胞的活力和杀伤力。本发明还提供了该靶向性T淋巴细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内排位第五位的最常见的恶性肿瘤。在我国，每年由于肝癌死亡的人数超过十万。目前，HCC的治疗方法包括非特异性免疫治疗、主动免疫治疗、过继性细胞免疫治疗等。其中，过继性细胞免疫治疗被认为是现有科技中有可能彻底清除癌细胞的方法。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)作为当前最新的免疫细胞技术之一，因其能够表达特异性受体靶向识别特异性的细胞如肿瘤细胞，受到广泛的关注和研究。CAR-T的肿瘤识别蛋白为人工设计的跨膜信号蛋白，CAR-T免疫细胞是应用基因修饰病人自体的T细胞，利用抗原抗体结合的机制，可以不依赖于主要组织相容性复合体的方式活化淋巴细胞，从而杀伤肿瘤。CAR-T免疫细胞因抗肿瘤的特异性和靶向性增强，同时杀伤活性和持久性也增强，因此具有非常广阔的应用前景。

肝脏是机体的免疫器官，拥有独特的免疫系统，具备免疫监视功能，能将偶然出现的肿瘤细胞作为异物加以清除。但HCC通过抗原的表达异常，代谢产物与细胞因子的异常分泌和肝癌细胞所处的免疫微环境发生改变等途径来逃避机体免疫系统的识别和攻击，发生肿瘤免疫逃逸。因此，亟需一种制备工艺简单、特异性强且能够减少肿瘤免疫逃逸发生的方法用于HCC治疗过程中。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5和/或靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met，CAR-DR5可以专一性的靶向DR5，CAR-c-Met可以专一性的靶向c-Met，从而促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，并且能够有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，更好的维持细胞的活力和杀伤力。本发明还提供了该靶向性T淋巴细胞的制备方法和应用。

第一方面，本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5和/或靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met，其中，所述CAR-DR5包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-c-Met包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向c-Met的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向DR5的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，所述靶向c-Met的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明中，死亡受体5(death receptor 5；DR5)属于肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF10B)，其胞质区含死亡结构域。DR5在肝癌等多种实体瘤细胞中广泛表达，而在普通细胞中表达很微弱的细胞表面抗原。当它与相关配体结合时，能选择性地杀伤多种肿瘤细胞而对正常细胞没有毒性，是肿瘤治疗过程中重要的靶点。受体酪氨酸激酶c-Met又称为肝细胞生长因子(hypatocyte growth factor，HGF)受体，是受体酪氨酸激酶家族中一类独特的亚族。c-Met的高表达常见于人肝脏等多种实体肿瘤，c-Met与HGF结合产生信号通路，过度激活将会引起下游信号通路的活化，从而诱导癌症的发生。因此，c-Met是肿瘤特别是肝癌治疗过程中的重要靶点。

其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向DR5的单链抗体的氨基酸序列(或所述靶向c-Met的单链抗体的氨基酸序列)的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。

可选的，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述靶向c-Met的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述靶向DR5的单链抗体保留有对DR5抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有DR5抗原的肿瘤细胞。所述靶向c-Met的单链抗体同样保留有对c-Met抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有c-Met抗原的肿瘤细胞。

在本发明中，所述CAR-DR5中的所述胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列与所述CAR-c-Met中的所述胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区对应的氨基酸序列可以相同，也可以不同。

在本发明中，所述CAR-DR5中的胞外铰链区用于促进所述靶向DR5的单链抗体与肿瘤上的DR5结合；所述CAR-c-Met中的胞外铰链用于促进所述靶向c-Met的单链抗体与肿瘤上的c-Met结合。

可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。

进一步可选的，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。

可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:10或如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO：11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:9。

在本发明中，所述CAR-DR5中的跨膜区用于固定所述靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5；所述CAR-c-Met中的跨膜区用于固定所述靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met。

可选的，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。

进一步可选的，所述跨膜区为CD8跨膜区。

可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。

可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:13或如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO：14具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:12。

在本发明中，所述CAR-DR5中的胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路；所述CAR-c-Met中的胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。

可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。

可选的，所述胞内信号区为4-1BB信号区和CD3ζ信号区。

可选的，所述4-1BB信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。

可选的，所述4-1BB信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。

可选的，所述4-1BB信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。

可选的，所述4-1BB信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:16或如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO：17具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:15。

可选的，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。

可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:19或如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO：20具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:18。

可选的，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

可选的，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列。

可选的，所述CAR-DR5的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:21具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:5。

可选的，所述CAR-c-Met的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

可选的，所述CAR-c-Met的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:22具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:6。

在本发明中，优选的，所述靶向性T淋巴细胞可以为带CAR-DR5和CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞(即，靶向DR5和c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞)，也可以为带CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞和带CAR-c-Met的嵌合抗原受体T细胞的混合或为带CAR-DR5和CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞和带CAR-c-Met的嵌合抗原受体T细胞三者的混合。此时，所述靶向性T淋巴细胞，既可以识别表面表达有DR5抗原蛋白的肿瘤细胞，也可以识别表面表达有c-Met抗原蛋白的肿瘤细胞，当然对同时有DR5抗原蛋白和c-Met抗原蛋白的肿瘤细胞的识别性也较好，能够有效避免肿瘤细胞出现DR5免疫逃逸的发生。

其中，当所述靶向性T淋巴细胞为带CAR-DR5和CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞时，所述CAR-DR5和所述CAR-c-Met的位置分布不作限定。可选的，所述CAR-DR5和所述CAR-c-Met交替分布。所述CAR-DR5的单链抗体和所述CAR-c-Met的单链抗体之间没有化学键相连，以确保更好的识别能力。

本发明第一方面提供的靶向性T淋巴细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5和/或靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met，CAR-DR5能够与DR5蛋白发生特异性结合，专一性的靶向DR5，CAR-c-Met能够与c-Met蛋白发生特异性结合，专一性的靶向c-Met，从而激活T细胞内的信号区，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，尤其是表达DR5和/或c-Met的肿瘤细胞，并且能够有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，对肿瘤细胞特别是表达DR5和c-Met的肝癌细胞具有较强的亲和活性和杀伤力。

本发明所述靶向性T淋巴细胞可以高效识别并杀伤包括肝癌、乳腺癌、纤维肉瘤、胶质细胞瘤等表达有DR5和/或c-Met的癌细胞，尤其适用于肝癌细胞。

第二方面，本发明提供了一种重组病毒载体，包括如第一方面所述的靶向性T淋巴细胞中所述CAR-DR5和/或CAR-c-Met的编码基因。

可选的，所述CAR-c-Met的编码基因包括如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列。

可选的，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。进一步可选的，所述病毒载体为慢病毒载体。

在本发明中，所述重组病毒载体包括了所述CAR-DR5和/或CAR-c-Met的编码基因，即重组病毒载体包括了仅含有CAR-DR5的编码基因的第一重组病毒载体、仅含有CAR-c-Met的编码基因的第二重组病毒载体或含有CAR-DR5和CAR-c-Met的编码基因的第三重组病毒载体中的至少一种。优选的，所述重组病毒载体包括第三重组病毒载体，或第一重组病毒载体和第二重组病毒载体的混合，或第一重组病毒载体、第二重组病毒载体和第三重组病毒载体的混合。本发明提供的重组病毒载体的包装效率更好，且更加感染性，所得靶向性T淋巴细胞能较充分地表达CAR-DR5和/或CAR-c-Met。

可选的，当所述重组病毒载体含有CAR-DR5的编码基因和CAR-c-Met的编码基因时，在所述重组病毒载体上所述CAR-DR5的编码基因和所述CAR-c-Met的编码基因之间，还包括一特殊序列，该特殊序列用于使所述CAR-DR5编码基因和所述CAR-c-Met的编码基因在转录翻译后可以得到两个独立的蛋白CAR-D R5和CAR-c-Met。在采用这样的重组病毒载体转染CD3阳性T淋巴细胞后，所得的靶向性T淋巴细胞为带CAR-DR5和CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞。进一步可选地，所述特殊序列可以是RBS序列、IRES序列、T2A序列或其他蛋白酶序列等。

本发明第二方面提供的所述重组病毒载体可以用于靶向DR5和c-Met的嵌合抗原受体T细胞的制备，有利于促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞。

第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第二方面所述的重组病毒载体。

可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞等，但不限于此。进一步可选的，所述宿主细胞为HEK293T细胞。

本发明第三方面提供的所述宿主细胞用于组装如第二方面所述的重组病毒载体，使其具有感染性。

第四方面，本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括：

(1)分别提供靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的编码基因和靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met的编码基因；

所述CAR-DR5的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向DR5的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-c-Met的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向c-Met的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；

其中，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向c-Met的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；

(2)将所述CAR-DR5的编码基因和所述CAR-c-Met的编码基因分别插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-DR5重组质粒和pWPXLD-CAR-c-Met重组质粒；

(3)分别对所述pWPXLD-CAR-DR5重组质粒和所述pWPXLD-CAR-c-Met重组质粒进行共同包装，得到带CAR-DR5编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-c-Met编码基因的第二重组慢病毒；

(4)将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性T淋巴细胞。

上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向DR5的单链抗体的编码基因(或所述靶向c-Met的单链抗体的编码基因)的5’端相连，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因(或所述靶向c-Met的单链抗体的编码基因)的3’端与所述胞外铰链区的编码基因的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述胞内信号区的编码基因的5’端相连。

在本发明中，所述CAR-DR5中的信号肽用于指导所述CAR-DR5表达到细胞表面，所述CAR-c-Met中的信号肽用于指导所述CAR-c-Met表达到细胞表面，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。所述CAR-DR5中的信号肽的氨基酸序列与所述CAR-c-Met中的信号肽的氨基酸序列可以相同，也可以不同。

可选的，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。

可选的，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。

可选的，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列。

可选的，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:24或如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:23。

所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列如本发明第一方面部分所述，这里不再赘述。

可选的，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。

可选的，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列。

可选的，所述CAR-DR5的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:26具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:7。

可选的，所述CAR-c-Met的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。

可选的，所述CAR-c-Met的编码基因包括如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列。

可选的，所述CAR-c-Met的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:27具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:8。

所述CAR-DR5的编码基因插入到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-DR5的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-DR5的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。

所述CAR-c-Met的编码基因插入到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-c-Met的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-c-Met的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。

可选的，所述分别对所述pWPXLD-CAR-DR5重组质粒和所述pWPXLD-CAR-c-Met重组质粒进行共同包装，得到带CAR-DR5编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-c-Met编码基因的第二重组慢病毒，包括：

将所述pWPXLD-CAR-DR5与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到带CAR-DR5编码基因的第一重组慢病毒；以及将所述pWPXLD-CAR-c-Met与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到带CAR-c-Met编码基因的第二重组慢病毒。

在本发明中，所述pWPXLD-CAR-DR5重组质粒和所述pWPXLD-CAR-c-Met重组质粒经过密码子优化，病毒包装效率高，制备得到的第一重组慢病毒和第二重组慢病毒滴度高。相应地，采用该第一重组慢病毒和第二重组慢病毒联合转染CD3阳性T淋巴细胞时，该两种重组慢病毒的滴度较高，可降低制备成本。

可选的，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。

所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。

本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。

重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。

重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。

为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。

可选的，所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞时，所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒的滴度比为1：(0.5-2)。

可选的，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。进一步可选的，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。更进一步可选的，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

具体的，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。

其中，将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，包括：

先将所述第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞后，再将所述第二重组慢病毒进行转染；或先将所述第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞后，再将所述第一重组慢病毒进行转染；或将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞。

在本发明中，制备得到的靶向性T淋巴细胞包括带所述CAR-DR5和所述CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-c-Met的嵌合抗原受体T细胞中的至少一种。可选的，所述靶向性T淋巴细胞包括带所述CAR-DR5和所述CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者包括带所述CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-c-Met的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者包括带所述CAR-DR5和所述CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-c-Met的嵌合抗原受体T细胞的混合。

当所述靶向性T淋巴细胞为带所述CAR-DR5和所述CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞时，此时靶向性T淋巴细胞的表面具有两个独立的、未键合的嵌合抗原受体(也即是有两个独立的单链抗体)，不影响它们对各自靶标的识别、结合，能同时、高效地识别肿瘤细胞上的DR5和c-Met，对表达DR5和c-Met中一种或两种的肿瘤细胞均可以进行识别和杀伤，避免出现肿瘤细胞逃逸的发生，提高了靶向识别的广度和宽度，以及杀伤广谱性，在复杂的肿瘤微环境下也具有较强的肿瘤杀伤能力。

本发明第四方面提供的靶向性T淋巴细胞的制备方法中，采用带CAR-DR5编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-c-Met编码基因的第二重组慢病毒分别或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，可使得制得的靶向性T淋巴细胞上嵌合抗原受体CAR-DR5和/或CAR-c-Met的表达效率更高，以具有较好的肿瘤识别、杀伤能力。

第五方面，本发明提供了如第一方面所述的靶向性T淋巴细胞、如第二方面所述的重组病毒载体、如第三方面所述的宿主细胞或如第四方面所述的制备方法制得的靶向性T淋巴细胞在制备诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

特别的，适用于表达DR5和/或c-Met的肝癌药物中的应用。

可选的，所述靶向性T淋巴细胞在制备诊断和治疗肝癌的药物中的应用。

所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的靶向性T淋巴细胞、如第二方面所述的重组病毒载体、如第三方面所述的宿主细胞中的一种或多种。

本发明的有益效果：

本发明提供的靶向性T淋巴细胞可以与DR5蛋白和c-Met蛋白发生特异性结合，专一性的靶向DR5和c-Met，激活T细胞内的信号区，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，对表达DR5和c-Met中一种或两种的肿瘤细胞均可以进行识别和杀伤，有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，提高了靶向识别的广度和宽度，以及杀伤广谱性，在复杂的肿瘤微环境下也具有较强的肿瘤杀伤能力。

附图说明

图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-DR5重组质粒的质粒图谱。

图2为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-c-Met重组质粒的质粒图谱。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

实施例一一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括：

(1)制备靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的基因序列

分别制备信号肽、靶向DR5的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO：24所示，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：3所示，所述CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：10所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：13所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQ ID NO：16所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：19所示。

通过PCR的方法将上述信号肽、靶向DR5的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的编码基因，所述CAR-DR5的编码基因如SEQ ID NO：26所示。

(2)制备靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met的基因序列

分别制备信号肽、靶向c-Met的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO：25所示，所述靶向c-Met的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：4所示，所述CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：11所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：14所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQ IDNO：17所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：20所示。

通过PCR的方法将上述信号肽、靶向c-Met的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met的编码基因，所述CAR-c-Met的编码基因如SEQ ID NO：27所示。

(3)构建pWPXLd-CAR-DR5重组质粒和pWPXLd-CAR-c-Met重组质粒

将CAR-DR5的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-DR5的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-DR5的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-DR5重组质粒，如图1所示为pWPXLd-CAR-DR5重组质粒。

将CAR-c-Met的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-c-Met的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-c-Met的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-c-Met重组质粒，如图2所示为pWPXLd-CAR-c-Met重组质粒。

(4)重组慢病毒构建

将pWPXLd-CAR-DR5重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，将病毒按照100μL、2×10⁸TU/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-DR5的第一重组慢病毒。

将pWPXLd-CAR-c-Met重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，将病毒按照100μL、2×10⁸TU/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-c-Met的第二重组慢病毒。

(5)靶向性T淋巴细胞的制备

a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离

PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。

b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞

取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。

c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞

取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述带CAR-DR5的第一重组慢病毒和所述带CAR-c-Met的第二重组慢病毒进行共同培养，其中带CAR-DR5的第一重组慢病毒和所述带CAR-c-Met的第二重组慢病毒的滴度比为1:1。

培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×10⁶个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向性T淋巴细胞，包括了带CAR-DR5和CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞，带CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞和带CAR-c-Met的嵌合抗原受体T细胞，将其保存在回输专用的细胞冻存液中。

实施例二一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括：

按照实施例一中的方法制备得到带CAR-DR5的第一重组慢病毒和带CAR-c-Met的第二重组慢病毒，将带CAR-DR5的第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，按照实施例一种相同的培养条件和时间进行培养，经过收集得到靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞。再将带CAR-c-Met的第二重组慢病毒转染所述靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向性T淋巴细胞，包括了带所述CAR-DR5和所述CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞，带所述CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-c-Met的嵌合抗原受体T细胞，将其保存在回输专用的细胞冻存液中。

实施例三一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括：

按照实施例一中的方法制备得到带CAR-DR5的第一重组慢病毒和带CAR-c-Met的第二重组慢病毒。先将带CAR-c-Met的第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，按照实施例一种相同的培养条件和时间进行培养，经过收集得到靶向c-Met的嵌合抗原受体T细胞；再将带CAR-DR5的第一重组慢病毒转染所述靶向c-Met的嵌合抗原受体T细胞，培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向性T淋巴细胞，包括了带所述CAR-DR5和所述CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞，带所述CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-c-Met的嵌合抗原受体T细胞，将其保存在回输专用的细胞冻存液中。

效果实施例

为了评估本发明所描述的上述方法制备的靶向性T淋巴细胞效果，进行如下效果实施例。

其中，以实施例一制备得到的靶向性T淋巴细胞作为实验组，以带CAR-DR5的第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞制得的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞作为对照组1，以带CAR-c-Met的第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞制得的靶向c-Met的嵌合抗原受体T细胞作为对照组2，以未经制备的T淋巴细胞作为阴性对照组。

效果实施例一：评估靶向性T淋巴细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况

在体外将实验组、对照组1、对照组2和阴性对照组与肝癌靶细胞(L929细胞)数量比为1:10、1:3、1:1、3:1和10:1比例，在37℃，5％CO₂下进行共培养，在培养后的第15-18小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况，发现经过本发明所述的方法制备的靶向性T淋巴细胞肿瘤杀伤力远远高于对照组1、对照组2和阴性对照组，因此经本发明方法制备的靶向性T淋巴细胞具有强的肿瘤杀伤能力。

效果实施例二：评估靶向性T淋巴细胞的小鼠体内肿瘤细胞杀伤情况

将实验组、对照组1、对照组2和阴性对照组在肝癌小鼠模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×10⁶个细胞(n＝9)，得到小鼠的生存曲线，发现实验组小鼠的存活率大大高于对照组1、对照组2和阴性对照组。因此，经过本方法制备的靶向性T淋巴细胞能够较好的保护小鼠因肝癌导致的死亡。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳宾德生物技术有限公司

<120> 一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Cys

145 150 155 160

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

165 170 175

Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Arg Ile Asn Tyr Met Pro Ser Leu

180 185 190

Lys Glu Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

195 200 205

Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Ser Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 2

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr

20 25 30

Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

145 150 155 160

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

165 170 175

Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr

180 185 190

Arg Phe Asn Pro Asn Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr

195 200 205

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

210 215 220

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu

225 230 235 240

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacattgtga tgacacaatc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccggaagaa ctacttggct 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 300

ccgttcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 360

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaagtg aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg 420

cagcctggag gttccctgaa actctcctgt gcagcctcag gattcgattt tagtacatgc 480

tggatgaatt gggtccggca ggctccaggg aaaggactag aatggattgg agaaattaat 540

ccagatagta gtaggataaa ttatatgcca tctctaaagg aaaaattcat catctccaga 600

gacaacgcca aaaatacact gtacctgcaa atgagcaaag tgagatctga agacacagcc 660

ctttattact gtgcaagggg aggaactttc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 720

tcagtcaccg tctcctca 738

<210> 4

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgca agagcagcca gagcctgctg tacaccagca gccagaagaa ctacctggcc 120

tggtaccagc agaagcccgg caaggccccc aagctcctga tctactgggc cagcacaagg 180

gagagcggcg tgcctagcag atttagcggc agcggcagcg gcaccgattt caccctgacc 240

atcagctccc tgcagcccga ggacttcgcc acctactact gccagcagta ctacgcctac 300

ccctggacct tcggccaggg caccaaggtg gagatcaaga ggggaggcgg aggatctggc 360

ggcggaggaa gtggcggagg gggatctggg ggaggcggaa gcgaggtgca gctggtggag 420

agcggcggag gactggtgca gcctggagga agcctgagac tgagctgcgc cgcctccggc 480

tacaccttca ccagctactg gctgcactgg gtgagacagg cccccggaaa gggactggag 540

tgggtgggca tgatcgaccc ctccaacagc gacaccaggt tcaaccccaa cttcaaggac 600

aggttcacca tcagcgccga caccagcaag aacaccgcct acctgcagat gaacagcctg 660

agggccgagg acacagccgt gtactactgc gccacctaca ggagctacgt gacccctctg 720

gactactggg gccagggcac cctggtgaca gtgagcagc 759

<210> 5

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Cys

145 150 155 160

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

165 170 175

Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Arg Ile Asn Tyr Met Pro Ser Leu

180 185 190

Lys Glu Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

195 200 205

Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

245 250 255

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

260 265 270

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

275 280 285

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

290 295 300

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

305 310 315 320

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

325 330 335

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

340 345 350

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

355 360 365

Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

370 375 380

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

385 390 395 400

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

405 410 415

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

420 425 430

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

435 440 445

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

450 455 460

Ala Leu Pro Pro Arg

465

<210> 6

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr

20 25 30

Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

145 150 155 160

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

165 170 175

Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr

180 185 190

Arg Phe Asn Pro Asn Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr

195 200 205

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

210 215 220

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu

225 230 235 240

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr

245 250 255

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

260 265 270

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

275 280 285

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

290 295 300

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

305 310 315 320

Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

325 330 335

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

340 345 350

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

355 360 365

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu

370 375 380

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

385 390 395 400

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

405 410 415

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

420 425 430

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

435 440 445

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

450 455 460

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470 475

<210> 7

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

145 150 155 160

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp

165 170 175

Phe Ser Thr Cys Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

180 185 190

Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Arg Ile Asn Tyr

195 200 205

Met Pro Ser Leu Lys Glu Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

210 215 220

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala

225 230 235 240

Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro

260 265 270

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

275 280 285

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

290 295 300

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

305 310 315 320

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys

325 330 335

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

340 345 350

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

355 360 365

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 8

<211> 496

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Tyr Thr Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

165 170 175

Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Leu His Trp Val Arg

180 185 190

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Met Ile Asp Pro Ser

195 200 205

Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile

210 215 220

Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

225 230 235 240

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr

245 250 255

Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

260 265 270

Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile

275 280 285

Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala

290 295 300

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

305 310 315 320

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

325 330 335

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

340 345 350

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

355 360 365

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

370 375 380

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

385 390 395 400

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

405 410 415

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

420 425 430

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

435 440 445

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

450 455 460

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

465 470 475 480

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490 495

<210> 9

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 10

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60

tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120

gacttcgcct gcgat 135

<210> 11

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 12

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 13

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60

actctttact gt 72

<210> 14

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 15

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 16

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60

actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120

gaactg 126

<210> 17

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 19

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60

tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120

cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180

gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240

agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300

tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336

<210> 20

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 21

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gacattgtga tgacacaatc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccggaagaa ctacttggct 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 300

ccgttcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 360

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaagtg aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg 420

cagcctggag gttccctgaa actctcctgt gcagcctcag gattcgattt tagtacatgc 480

tggatgaatt gggtccggca ggctccaggg aaaggactag aatggattgg agaaattaat 540

ccagatagta gtaggataaa ttatatgcca tctctaaagg aaaaattcat catctccaga 600

gacaacgcca aaaatacact gtacctgcaa atgagcaaag tgagatctga agacacagcc 660

ctttattact gtgcaagggg aggaactttc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 720

tcagtcaccg tctcctcaac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc 780

atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 840

gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 900

acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 960

aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1020

gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1080

ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1140

ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1200

gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1260

aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1320

aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1380

cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1407

<210> 22

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgca agagcagcca gagcctgctg tacaccagca gccagaagaa ctacctggcc 120

tggtaccagc agaagcccgg caaggccccc aagctcctga tctactgggc cagcacaagg 180

gagagcggcg tgcctagcag atttagcggc agcggcagcg gcaccgattt caccctgacc 240

atcagctccc tgcagcccga ggacttcgcc acctactact gccagcagta ctacgcctac 300

ccctggacct tcggccaggg caccaaggtg gagatcaaga ggggaggcgg aggatctggc 360

ggcggaggaa gtggcggagg gggatctggg ggaggcggaa gcgaggtgca gctggtggag 420

agcggcggag gactggtgca gcctggagga agcctgagac tgagctgcgc cgcctccggc 480

tacaccttca ccagctactg gctgcactgg gtgagacagg cccccggaaa gggactggag 540

tgggtgggca tgatcgaccc ctccaacagc gacaccaggt tcaaccccaa cttcaaggac 600

aggttcacca tcagcgccga caccagcaag aacaccgcct acctgcagat gaacagcctg 660

agggccgagg acacagccgt gtactactgc gccacctaca ggagctacgt gacccctctg 720

gactactggg gccagggcac cctggtgaca gtgagcagca ccacgacgcc agcgccgcga 780

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 840

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 900

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 960

tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1020

gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1080

ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc 1140

cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1200

aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1260

ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1320

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1380

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 1428

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Ala Arg Pro

20

<210> 24

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gccctccctg tcaccgccct gctgcttccg ctggctcttc tgctccacgc cgctcggccc 60

<210> 25

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

<210> 26

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gccctccctg tcaccgccct gctgcttccg ctggctcttc tgctccacgc cgctcggccc 60

gacattgtga tgacacaatc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120

atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccggaagaa ctacttggct 180

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 240

gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 360

ccgttcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaagtg aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg 480

cagcctggag gttccctgaa actctcctgt gcagcctcag gattcgattt tagtacatgc 540

tggatgaatt gggtccggca ggctccaggg aaaggactag aatggattgg agaaattaat 600

ccagatagta gtaggataaa ttatatgcca tctctaaagg aaaaattcat catctccaga 660

gacaacgcca aaaatacact gtacctgcaa atgagcaaag tgagatctga agacacagcc 720

ctttattact gtgcaagggg aggaactttc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 780

tcagtcaccg tctcctcaac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc 840

atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 900

gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 960

acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 1020

aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1080

gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1140

ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1200

ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1260

gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1320

aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1380

aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1440

cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1467

<210> 27

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 120

atcacctgca agagcagcca gagcctgctg tacaccagca gccagaagaa ctacctggcc 180

tggtaccagc agaagcccgg caaggccccc aagctcctga tctactgggc cagcacaagg 240

gagagcggcg tgcctagcag atttagcggc agcggcagcg gcaccgattt caccctgacc 300

atcagctccc tgcagcccga ggacttcgcc acctactact gccagcagta ctacgcctac 360

ccctggacct tcggccaggg caccaaggtg gagatcaaga ggggaggcgg aggatctggc 420

ggcggaggaa gtggcggagg gggatctggg ggaggcggaa gcgaggtgca gctggtggag 480

agcggcggag gactggtgca gcctggagga agcctgagac tgagctgcgc cgcctccggc 540

tacaccttca ccagctactg gctgcactgg gtgagacagg cccccggaaa gggactggag 600

tgggtgggca tgatcgaccc ctccaacagc gacaccaggt tcaaccccaa cttcaaggac 660

aggttcacca tcagcgccga caccagcaag aacaccgcct acctgcagat gaacagcctg 720

agggccgagg acacagccgt gtactactgc gccacctaca ggagctacgt gacccctctg 780

gactactggg gccagggcac cctggtgaca gtgagcagca ccacgacgcc agcgccgcga 840

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020

tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1080

gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1140

ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc 1200

cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1260

aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1320

ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1380

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1440

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 1488

Claims

1.一种靶向性T淋巴细胞，其特征在于，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5和/或靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met，其中，所述CAR-DR5包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-c-Met包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向c-Met的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；

其中，所述靶向DR5的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向c-Met的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的靶向性T淋巴细胞，其特征在于，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述靶向c-Met的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的靶向性T淋巴细胞，其特征在于，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-c-Met的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

4.一种重组病毒载体，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向性T淋巴细胞中所述CAR-DR5和/或CAR-c-Met的编码基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求4所述的重组病毒载体。

6.一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括：

7.如权利要求6所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列，所述CAR-c-Met的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。

8.如权利要求6所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞时，所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒的滴度比为1：(0.5-2)。

9.如权利要求6所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向性T淋巴细胞包括带所述CAR-DR5和所述CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者包括带所述CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-c-Met的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者包括带所述CAR-DR5和所述CAR-c-Met的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-c-Met的嵌合抗原受体T细胞的混合。

10.如权利要求1-3任一项所述的靶向性T淋巴细胞、如权利要求4所述的重组病毒载体、如权利要求5所述的宿主细胞或如权利要求6-9所述的制备方法制得的靶向性T淋巴细胞在制备诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。