CN110157674A - 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体CAR‑EGFRvⅢ和/或靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体CAR‑IL13Rα2，CAR‑EGFRvⅢ可以专一性的靶向EGFRvⅢ，CAR‑IL13Rα2可以专一性的靶向IL13Rα2，从而激活T细胞内的信号区，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，并且能够有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，更好的维持细胞的活力和杀伤力。本发明还提供了该靶向性T淋巴细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用。
背景技术
胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，起源于神经胶质细胞。胶质瘤约占所有原发性神经系统肿瘤的60％，具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低的“三高一低”的特点。目前，采用的外科手术、化疗等传统疗法并未明显的改善胶质瘤患者的预后。
近年来，过继性细胞免疫治疗被认为是现有科技中有可能彻底清除癌细胞的方法。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)作为当前最新的免疫细胞技术之一，因其能够表达特异性受体靶向识别特异性的细胞如肿瘤细胞，受到广泛的关注和研究，也是肿瘤免疫治疗的研究中最为活跃的方向。CAR-T的肿瘤识别蛋白为人工设计的跨膜信号蛋白，CAR-T免疫细胞是应用基因修饰病人自体的T细胞，利用抗原抗体结合的机制，可以不依赖于主要组织相容性复合体的方式活化淋巴细胞，从而杀伤肿瘤。CAR-T免疫细胞因抗肿瘤的特异性和靶向性增强，同时杀伤活性和持久性也增强，因此具有非常广阔的应用前景。因此，亟需一种可以用于胶质瘤治疗的嵌合抗原受体T细胞。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体CAR-EGFRvⅢ和/或靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体CAR-IL13Rα2，CAR-EGFRvⅢ可以专一性的靶向EGFRvⅢ，CAR-IL13Rα2可以专一性的靶向IL13Rα2，从而促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，尤其是表达EGFRvⅢ和/或IL13Rα2的胶质瘤细胞，有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，更好的维持细胞的活力和杀伤力。本发明还提供了该靶向性T淋巴细胞的制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体CAR-EGFRvⅢ和/或靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体CAR-IL13Rα2，其中，所述CAR-EGFRvⅢ包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向EGFRvⅢ的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-IL13Rα2包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向IL13Rα2的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向IL13Rα2的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在本发明中，表皮生长因子受体III型突变体(Epidermal Growth FactorReceptor variant III，EGFRvIII)是表皮生长因子受体(EGFR)的最常见突变体，是EGFR的胞外区的框内缺失突变。EGFRvIII广泛存在于胶质瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌等恶性肿瘤中，并且EGFRvIII仅表达在恶性肿瘤细胞，在正常的组织细胞中不表达，因而成为肿瘤治疗，特别是胶质瘤治疗的理想靶点。
白细胞介素13受体α2(IL13Rα2)在肿瘤细胞，尤其是在胶质瘤细胞中高表达，并且胶质瘤的病理级别越高，其表达越强，而在正常的胶质细胞中不表达IL13Rα2。因此，IL13Rα2可以作为是胶质瘤治疗过程中的重要靶点。
其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体的氨基酸序列(或所述靶向IL13Rα2的单链抗体的氨基酸序列)的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
可选的，所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述靶向IL13Rα2的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体保留有对EGFRvⅢ抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有EGFRvⅢ抗原的肿瘤细胞。所述靶向IL13Rα2的单链抗体同样保留有对IL13Rα2抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有IL13Rα2抗原的肿瘤细胞。
在本发明中，所述CAR-EGFRvⅢ中的所述胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列与所述CAR-IL13Rα2中的所述胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区对应的氨基酸序列可以相同，也可以不同。
在本发明中，所述CAR-EGFRvⅢ中的胞外铰链区用于促进所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体与肿瘤上的EGFRvⅢ结合；所述CAR-IL13Rα2中的胞外铰链用于促进所述靶向IL13Rα2的单链抗体与肿瘤上的IL13Rα2结合。
可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。
进一步可选的，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。
可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:10或如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO：11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:9。
在本发明中，所述CAR-EGFRvⅢ中的跨膜区用于固定所述靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体CAR-EGFRvⅢ；所述CAR-IL13Rα2中的跨膜区用于固定所述靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体CAR-IL13Rα2。
可选的，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。
进一步可选的，所述跨膜区为CD8跨膜区。
可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:13或如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO：14具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:12。
在本发明中，所述CAR-EGFRvⅢ中的胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路；所述CAR-IL13Rα2中的胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。
可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。
可选的，所述胞内信号区为4-1BB信号区和CD3ζ信号区。
可选的，所述4-1BB信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
可选的，所述4-1BB信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。
可选的，所述4-1BB信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
可选的，所述4-1BB信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:16或如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO：17具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:15。
可选的，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:19或如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO：20具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:18。
可选的，所述CAR-EGFRvⅢ的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
可选的，所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因包括如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:21具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:5。
可选的，所述CAR-IL13Rα2的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
可选的，所述CAR-IL13Rα2的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:22具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:6。
在本发明中，优选的，所述靶向性T淋巴细胞可以为带CAR-EGFRvⅢ和CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞(即，靶向EGFRvⅢ和IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞)，也可以为带CAR-EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞和带CAR-IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞的混合或为带CAR-EGFRvⅢ和CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带CAR-EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞和带CAR-IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞三者的混合。此时，所述靶向性T淋巴细胞，既可以识别表面表达有EGFRvⅢ抗原蛋白的肿瘤细胞，也可以识别表面表达有IL13Rα2抗原蛋白的肿瘤细胞，当然对同时有EGFRvⅢ抗原蛋白和IL13Rα2抗原蛋白的肿瘤细胞的识别性也较好，能够有效避免肿瘤细胞出现EGFRvⅢ免疫逃逸的发生。
其中，当所述靶向性T淋巴细胞为带CAR-EGFRvⅢ和CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞时，所述CAR-EGFRvⅢ和所述CAR-IL13Rα2的位置分布不作限定。可选的，所述CAR-EGFRvⅢ和所述CAR-IL13Rα2交替分布。所述CAR-EGFRvⅢ的单链抗体和所述CAR-IL13Rα2的单链抗体之间没有化学键相连，以确保更好的识别能力。
本发明第一方面提供的靶向性T淋巴细胞，包括靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体CAR-EGFRvⅢ和/或靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体CAR-IL13Rα2，CAR-EGFRvⅢ能够与EGFRvⅢ蛋白发生特异性结合，专一性的靶向EGFRvⅢ，CAR-IL13Rα2能够与IL13Rα2蛋白发生特异性结合，专一性的靶向IL13Rα2，从而激活T细胞内的信号区，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，尤其是表达EGFRvⅢ和/或IL13Rα2的肿瘤细胞，并且能够有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，对肿瘤细胞特别是表达EGFRvⅢ和IL13Rα2的胶质瘤细胞具有较强的亲和活性和杀伤力，同时对正常细胞不造成损伤。
本发明所述靶向性T淋巴细胞可以高效识别并杀伤胶质瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌等表达有EGFRvⅢ和/或IL13Rα2的癌细胞，尤其适用于胶质瘤细胞。
第二方面，本发明提供了一种重组病毒载体，包括如第一方面所述的靶向性T淋巴细胞中所述CAR-EGFRvⅢ和/或CAR-IL13Rα2的编码基因。
可选的，所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因包括如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-IL13Rα2的编码基因包括如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列。
可选的，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。进一步可选的，所述病毒载体为慢病毒载体。
在本发明中，所述重组病毒载体包括了所述CAR-EGFRvⅢ和/或CAR-IL13Rα2的编码基因，即重组病毒载体包括了仅含有CAR-EGFRvⅢ的编码基因的第一重组病毒载体、仅含有CAR-IL13Rα2的编码基因的第二重组病毒载体或含有CAR-EGFRvⅢ和CAR-IL13Rα2的编码基因的第三重组病毒载体中的至少一种。优选的，所述重组病毒载体包括第三重组病毒载体或第一重组病毒载体和第二重组病毒载体的混合，或第一重组病毒载体、第二重组病毒载体和第三重组病毒载体的混合。本发明提供的重组病毒载体的包装效率更好，且更加感染性，所得靶向性T淋巴细胞能较充分地表达CAR-EGFRvⅢ和/或CAR-IL13Rα2。
可选的，当所述重组病毒载体含有CAR-EGFRvⅢ的编码基因和CAR-IL13Rα2的编码基因时，在所述重组病毒载体上所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因和所述CAR-IL13Rα2的编码基因之间，还包括一特殊序列，该特殊序列用于使所述CAR-EGFRvⅢ编码基因和所述CAR-IL13Rα2的编码基因在转录翻译后可以得到两个独立的蛋白CAR-EGFRvⅢ和CAR-IL13Rα2。在采用这样的重组病毒载体转染CD3阳性T淋巴细胞后，所得的靶向性T淋巴细胞为带CAR-EGFRvⅢ和CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞。进一步可选地，所述特殊序列可以是RBS序列、IRES序列、T2A序列或其他蛋白酶序列等。
本发明第二方面提供的所述重组病毒载体可以用于靶向EGFRvⅢ和IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞的制备，有利于促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞。
第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第二方面所述的重组病毒载体。
可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞等，但不限于此。进一步可选的，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
本发明第三方面提供的所述宿主细胞用于组装如第二方面所述的重组病毒载体，使其具有感染性。
第四方面，本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括：
(1)分别提供靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体CAR-EGFRvⅢ的编码基因和靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体CAR-IL13Rα2的编码基因；
所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向EGFRvⅢ的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-IL13Rα2的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向IL13Rα2的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；
其中，所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向IL13Rα2的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因和所述CAR-IL13Rα2的编码基因分别插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-EGFRvⅢ重组质粒和pWPXLD-CAR-IL13Rα2重组质粒；
(3)分别对所述pWPXLD-CAR-EGFRvⅢ重组质粒和所述pWPXLD-CAR-IL13Rα2重组质粒进行共同包装，得到带CAR-EGFRvⅢ编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-IL13Rα2编码基因的第二重组慢病毒；
(4)将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性T淋巴细胞。
上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体的编码基因(或所述靶向IL13Rα2的单链抗体的编码基因)的5’端相连，所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体的编码基因(或所述靶向IL13Rα2的单链抗体的编码基因)的3’端与所述胞外铰链区的编码基因的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述胞内信号区的编码基因的5’端相连。
在本发明中，所述CAR-EGFRvⅢ中的信号肽用于指导所述CAR-EGFRvⅢ表达到细胞表面，所述CAR-IL13Rα2中的信号肽用于指导所述CAR-IL13Rα2表达到细胞表面，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。所述CAR-EGFRvⅢ中的信号肽的氨基酸序列与所述CAR-IL13Rα2中的信号肽的氨基酸序列可以相同，也可以不同。
可选的，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:24或如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:23。
所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列如本发明第一方面部分所述，这里不再赘述。
可选的，所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因包括如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:26具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:7。
可选的，所述CAR-IL13Rα2的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-IL13Rα2的编码基因包括如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-IL13Rα2的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:27具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:8。
所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因插入到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。
所述CAR-IL13Rα2的编码基因插入到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-IL13Rα2的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-IL13Rα2的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。
可选的，所述分别对所述pWPXLD-CAR-EGFRvⅢ重组质粒和所述pWPXLD-CAR-IL13Rα2重组质粒进行共同包装，得到带CAR-EGFRvⅢ编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-IL13Rα2编码基因的第二重组慢病毒，包括：
将所述pWPXLD-CAR-EGFRvⅢ与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到带CAR-EGFRvⅢ编码基因的第一重组慢病毒；以及将所述pWPXLD-CAR-IL13Rα2与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到带CAR-IL13Rα2编码基因的第二重组慢病毒。
在本发明中，所述pWPXLD-CAR-EGFRvⅢ重组质粒和所述pWPXLD-CAR-IL13Rα2重组质粒经过密码子优化，病毒包装效率高，制备得到的第一重组慢病毒和第二重组慢病毒滴度高。相应地，采用该第一重组慢病毒和第二重组慢病毒联合转染CD3阳性T淋巴细胞时，该两种重组慢病毒的滴度较高，可降低制备成本。
可选的，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。
可选的，所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞时，所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒的滴度比为1：(0.5-2)。
可选的，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。进一步可选的，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。更进一步可选的，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体的，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
其中，将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，包括：
先将所述第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞后，再将所述第二重组慢病毒进行转染；或先将所述第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞后，再将所述第一重组慢病毒进行转染；或将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞。
在本发明中，制备得到的靶向性T淋巴细胞包括带所述CAR-EGFRvⅢ和所述CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞中的至少一种。可选的，所述靶向性T淋巴细胞包括带所述CAR-EGFRvⅢ和所述CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者包括带所述CAR-EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者包括带所述CAR-EGFRvⅢ和所述CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞的混合。
当所述靶向性T淋巴细胞为带所述CAR-EGFRvⅢ和所述CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞时，此时靶向性T淋巴细胞的表面具有两个独立的、未键合的嵌合抗原受体(也即是有两个独立的单链抗体)，不影响它们对各自靶标的识别、结合，能同时、高效地识别肿瘤细胞上的EGFRvⅢ和IL13Rα2，对表达EGFRvⅢ和IL13Rα2中一种或两种的肿瘤细胞均可以进行识别和杀伤，避免出现肿瘤细胞逃逸的发生，提高了靶向识别的广度和宽度，以及杀伤广谱性，在复杂的肿瘤微环境下也具有较强的肿瘤杀伤能力。
本发明第四方面提供的靶向性T淋巴细胞的制备方法中，采用带CAR-EGFRvⅢ编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-IL13Rα2编码基因的第二重组慢病毒分别或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，可使得制得的靶向性T淋巴细胞上嵌合抗原受体CAR-EGFRvⅢ和/或CAR-IL13Rα2的表达效率更高，以具有较好的肿瘤识别、杀伤能力。
第五方面，本发明提供了如第一方面所述的靶向性T淋巴细胞、如第二方面所述的重组病毒载体、如第三方面所述的宿主细胞或如第四方面所述的制备方法制得的靶向性T淋巴细胞在制备诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
特别的，适用于诊断和治疗表达EGFRvⅢ和/或IL13Rα2的胶质瘤药物中的应用。
可选的，所述靶向性T淋巴细胞在制备诊断和治疗胶质瘤的药物中的应用。
所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的靶向性T淋巴细胞、如第二方面所述的重组病毒载体、如第三方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
本发明的有益效果：
本发明提供的靶向性T淋巴细胞可以与EGFRvⅢ蛋白和IL13Rα2蛋白发生特异性结合，专一性的靶向EGFRvⅢ和IL13Rα2，激活T细胞内的信号区，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，尤其是胶质瘤细胞，对表达EGFRvⅢ和IL13Rα2中一种或两种的肿瘤细胞均可以进行识别和杀伤，有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，提高了靶向识别的广度和宽度，以及杀伤广谱性，在复杂的肿瘤微环境下也具有较强的肿瘤杀伤能力，同时对正常的细胞不造成损伤。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-EGFRvⅢ重组质粒的质粒图谱。
图2为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-IL13Rα2重组质粒的质粒图谱。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括：
(1)制备靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体CAR-EGFRvⅢ的基因序列
分别制备信号肽、靶向EGFRvⅢ的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO：24所示，所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：3所示，所述CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：10所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：13所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQID NO：16所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：19所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向EGFRvⅢ的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体CAR-EGFRvⅢ的编码基因，所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因如SEQ ID NO：26所示。
(2)制备靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体CAR-IL13Rα2的基因序列
分别制备信号肽、靶向IL13Rα2的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO：25所示，所述靶向IL13Rα2的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：4所示，所述CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：11所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：14所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQID NO：17所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：20所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向IL13Rα2的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体CAR-IL13Rα2的编码基因，所述CAR-IL13Rα2的编码基因如SEQ ID NO：27所示。
(3)构建pWPXLd-CAR-EGFRvⅢ重组质粒和pWPXLd-CAR-IL13Rα2重组质粒
将CAR-EGFRvⅢ的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-EGFRvⅢ重组质粒，如图1所示为pWPXLd-CAR-EGFRvⅢ重组质粒。
将CAR-IL13Rα2的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-IL13Rα2的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-IL13Rα2的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-IL13Rα2重组质粒，如图2所示为pWPXLd-CAR-IL13Rα2重组质粒。
(4)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-EGFRvⅢ重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，将病毒按照100μL、2×108TU/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-EGFRvⅢ的第一重组慢病毒。
将pWPXLd-CAR-IL13Rα2重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，将病毒按照100μL、2×108TU/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-IL13Rα2的第二重组慢病毒。
(5)靶向性T淋巴细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述带CAR-EGFRvⅢ的第一重组慢病毒和所述带CAR-IL13Rα2的第二重组慢病毒进行共同培养，其中带CAR-EGFRvⅢ的第一重组慢病毒和所述带CAR-IL13Rα2的第二重组慢病毒的滴度比为1:1。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向性T淋巴细胞，包括了带所述CAR-EGFRvⅢ和所述CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞，带所述CAR-EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞，将其保存在回输专用的细胞冻存液中。
实施例二一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括：
按照实施例一中相同的方法制备得到带CAR-EGFRvⅢ的第一重组慢病毒和带CAR-IL13Rα2的第二重组慢病毒，将带CAR-EGFRvⅢ的第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞。再将带CAR-IL13Rα2的第二重组慢病毒转染所述靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞，培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向性T淋巴细胞，包括了带所述CAR-EGFRvⅢ和所述CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞，带所述CAR-EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞，将其保存在回输专用的细胞冻存液中。
实施例三一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括：
按照实施例一中相同的方法制备得到带CAR-EGFRvⅢ的第一重组慢病毒和带CAR-IL13Rα2的第二重组慢病毒。先将带CAR-IL13Rα2的第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞；再将带CAR-EGFRvⅢ的第一重组慢病毒转染所述靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞，培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向性T淋巴细胞，包括了带所述CAR-EGFRvⅢ和所述CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞，带所述CAR-EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞，将其保存在回输专用的细胞冻存液中。
效果实施例
为了评估本发明所描述的上述方法制备的靶向性T淋巴细胞效果，进行如下效果实施例。
其中，以实施例一制备得到的靶向性T淋巴细胞作为实验组，以带CAR-EGFRvⅢ的第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞制得的靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞作为对照组1，以带CAR-IL13Rα2的第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞制得的靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞作为对照组2，以未经制备的T淋巴细胞作为阴性对照组。
效果实施例一：评估靶向性T淋巴细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况
在体外将实验组、对照组1、对照组2和阴性对照组与胶质瘤靶细胞(U87细胞)数量比为1:10、1:3、1:1、3:1和10:1比例，在37℃，5％CO2下进行共培养，在培养后的第15-18小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况，发现经过本发明所述的方法制备的靶向性T淋巴细胞肿瘤杀伤力远远高于对照组1、对照组2和阴性对照组，因此经本发明方法制备的靶向性T淋巴细胞具有强的肿瘤杀伤能力。
效果实施例二：评估靶向性T淋巴细胞的小鼠体内肿瘤细胞杀伤情况
将实验组、对照组1、对照组2和阴性对照组在胶质瘤小鼠模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×106个细胞(n＝9)，得到小鼠的生存曲线，发现实验组小鼠的存活率大大高于对照组1、对照组2和和阴性对照组。因此，经过本方法制备的靶向性T淋巴细胞能够较好的保护小鼠因胶质瘤导致的死亡。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳宾德生物技术有限公司
<120> 一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 2
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu
20 25 30
Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Arg Pro Leu Cys
35 40 45
Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys
50 55 60
Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu
65 70 75 80
Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala
85 90 95
Gly Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln
100 105 110
Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly
115 120 125
Arg Phe Asn
130
<210> 3
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagattcagc tcgtgcaatc gggagcggaa gtcaagaagc caggagagtc cttgcggatc 60
tcatgcaagg gtagcggctt taacatcgag gattactaca tccactgggt gaggcagatg 120
ccggggaagg gactcgaatg gatgggacgg atcgacccag aaaacgacga aactaagtac 180
ggtccgatct tccaaggcca tgtgactatt agcgccgata cttcaatcaa taccgtgtat 240
ctgcaatggt cctcattgaa agcctcagat accgcgatgt actactgtgc tttcagagga 300
ggggtctact ggggacaggg aactaccgtg actgtctcgt ccggcggagg cgggtcagga 360
ggtggcggca gcggaggagg agggtccggc ggaggtgggt ccgacgtcgt gatgacccag 420
agccctgaca gcctggcagt gagcctgggc gaaagagcta ccattaactg caaatcgtcg 480
cagagcctgc tggactcgga cggaaaaacg tacctcaatt ggctgcagca aaagcctggc 540
cagccaccga agcgccttat ctcactggtg tcgaagctgg attcgggagt gcccgatcgc 600
ttctccggct cgggatcggg tactgacttc accctcacta tctcctcgct tcaagcagag 660
gacgtggccg tctactactg ctggcaggga acccactttc cgggaacctt cggcggaggg 720
acgaaagtgg agatcaag 738
<210> 4
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggcgcttt tgttgaccac ggtcattgct ctcacttgcc ttggcggctt tgcctcccca 60
ggccctgtgc ctccctctac agccctcagg tacctcattg aggagctggt caacatcacc 120
cagaaccaga agcgtccgct ctgcaatggc agcatggtat ggagcatcaa cctgacagct 180
ggcatgtact gtgcagccct ggaatccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatcgag 240
aagacccaga ggatgctgag cggattctgc ccgcacaagg tctcagctgg gttttccagc 300
ttgcatgtcc gagacaccaa aatcgaggtg gcccagtttg taaaggacct gctcttacat 360
ttaaagaaac tttttcgcga gggacggttc aac 393
<210> 5
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
245 250 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
260 265 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
275 280 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
290 295 300
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
305 310 315 320
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
325 330 335
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
340 345 350
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
355 360 365
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
370 375 380
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
385 390 395 400
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
420 425 430
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
435 440 445
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
450 455 460
Ala Leu Pro Pro Arg
465
<210> 6
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu
20 25 30
Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Arg Pro Leu Cys
35 40 45
Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys
50 55 60
Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu
65 70 75 80
Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala
85 90 95
Gly Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln
100 105 110
Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly
115 120 125
Arg Phe Asn Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
130 135 140
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
145 150 155 160
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
165 170 175
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
180 185 190
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
195 200 205
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
210 215 220
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
225 230 235 240
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
245 250 255
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
260 265 270
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
275 280 285
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
290 295 300
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
305 310 315 320
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
325 330 335
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
340 345 350
Pro Arg
<210> 7
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn
35 40 45
Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr
65 70 75 80
Gly Pro Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile
85 90 95
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
100 105 110
Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn
165 170 175
Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu
180 185 190
Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser
195 200 205
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu
225 230 235 240
Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr
245 250 255
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 8
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr
20 25 30
Cys Leu Gly Gly Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala
35 40 45
Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys
50 55 60
Arg Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala
65 70 75 80
Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys
85 90 95
Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His
100 105 110
Lys Val Ser Ala Gly Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile
115 120 125
Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu
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Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
145 150 155 160
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
165 170 175
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
180 185 190
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
195 200 205
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
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Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
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Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
245 250 255
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
260 265 270
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
275 280 285
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
290 295 300
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
325 330 335
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
340 345 350
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
355 360 365
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370
<210> 9
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 10
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120
gacttcgcct gcgat 135
<210> 11
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 13
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60
actctttact gt 72
<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 15
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 16
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 17
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 19
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
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<210> 20
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
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tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 21
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gagattcagc tcgtgcaatc gggagcggaa gtcaagaagc caggagagtc cttgcggatc 60
tcatgcaagg gtagcggctt taacatcgag gattactaca tccactgggt gaggcagatg 120
ccggggaagg gactcgaatg gatgggacgg atcgacccag aaaacgacga aactaagtac 180
ggtccgatct tccaaggcca tgtgactatt agcgccgata cttcaatcaa taccgtgtat 240
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ggggtctact ggggacaggg aactaccgtg actgtctcgt ccggcggagg cgggtcagga 360
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atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 840
gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 900
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 960
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1020
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1080
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1140
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1200
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1260
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1320
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1380
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1407
<210> 22
<211> 1062
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atggcgcttt tgttgaccac ggtcattgct ctcacttgcc ttggcggctt tgcctcccca 60
ggccctgtgc ctccctctac agccctcagg tacctcattg aggagctggt caacatcacc 120
cagaaccaga agcgtccgct ctgcaatggc agcatggtat ggagcatcaa cctgacagct 180
ggcatgtact gtgcagccct ggaatccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatcgag 240
aagacccaga ggatgctgag cggattctgc ccgcacaagg tctcagctgg gttttccagc 300
ttgcatgtcc gagacaccaa aatcgaggtg gcccagtttg taaaggacct gctcttacat 360
ttaaagaaac tttttcgcga gggacggttc aacaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 420
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 480
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 540
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 600
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 660
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 720
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac 780
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 840
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 900
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 960
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1020
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1062
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gccctccctg tcaccgccct gctgcttccg ctggctcttc tgctccacgc cgctcggccc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60
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<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccctccctg tcaccgccct gctgcttccg ctggctcttc tgctccacgc cgctcggccc 60
gagattcagc tcgtgcaatc gggagcggaa gtcaagaagc caggagagtc cttgcggatc 120
tcatgcaagg gtagcggctt taacatcgag gattactaca tccactgggt gaggcagatg 180
ccggggaagg gactcgaatg gatgggacgg atcgacccag aaaacgacga aactaagtac 240
ggtccgatct tccaaggcca tgtgactatt agcgccgata cttcaatcaa taccgtgtat 300
ctgcaatggt cctcattgaa agcctcagat accgcgatgt actactgtgc tttcagagga 360
ggggtctact ggggacaggg aactaccgtg actgtctcgt ccggcggagg cgggtcagga 420
ggtggcggca gcggaggagg agggtccggc ggaggtgggt ccgacgtcgt gatgacccag 480
agccctgaca gcctggcagt gagcctgggc gaaagagcta ccattaactg caaatcgtcg 540
cagagcctgc tggactcgga cggaaaaacg tacctcaatt ggctgcagca aaagcctggc 600
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gacgtggccg tctactactg ctggcaggga acccactttc cgggaacctt cggcggaggg 780
acgaaagtgg agatcaagac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc 840
atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 900
gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 960
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 1020
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1080
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1140
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1200
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1260
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1320
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1380
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1440
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1467
<210> 27
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60
atggcgcttt tgttgaccac ggtcattgct ctcacttgcc ttggcggctt tgcctcccca 120
ggccctgtgc ctccctctac agccctcagg tacctcattg aggagctggt caacatcacc 180
cagaaccaga agcgtccgct ctgcaatggc agcatggtat ggagcatcaa cctgacagct 240
ggcatgtact gtgcagccct ggaatccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatcgag 300
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ttgcatgtcc gagacaccaa aatcgaggtg gcccagtttg taaaggacct gctcttacat 420
ttaaagaaac tttttcgcga gggacggttc aacaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 480
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 540
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 600
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 660
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 720
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 780
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac 840
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 900
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tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1020
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1080
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1122

Claims (10)

1.一种靶向性T淋巴细胞，其特征在于，包括靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体CAR-EGFRvⅢ和/或靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体CAR-IL13Rα2，其中，所述CAR-EGFRvⅢ包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向EGFRvⅢ的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-IL13Rα2包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向IL13Rα2的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向IL13Rα2的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQID NO：2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向性T淋巴细胞，其特征在于，所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述靶向IL13Rα2的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的靶向性T淋巴细胞，其特征在于，所述CAR-EGFRvⅢ的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-IL13Rα2的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
4.一种重组病毒载体，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向性T淋巴细胞中所述CAR-EGFRvⅢ和/或CAR-IL13Rα2的编码基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求4所述的重组病毒载体。
6.一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)分别提供靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体CAR-EGFRvⅢ的编码基因和靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体CAR-IL13Rα2的编码基因；
所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向EGFRvⅢ的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-IL13Rα2的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向IL13Rα2的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；
其中，所述靶向EGFRvⅢ的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向IL13Rα2的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因和所述CAR-IL13Rα2的编码基因分别插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-EGFRvⅢ重组质粒和pWPXLD-CAR-IL13Rα2重组质粒；
(3)分别对所述pWPXLD-CAR-EGFRvⅢ重组质粒和所述pWPXLD-CAR-IL13Rα2重组质粒进行共同包装，得到带CAR-EGFRvⅢ编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-IL13Rα2编码基因的第二重组慢病毒；
(4)将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性T淋巴细胞。
7.如权利要求6所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR-EGFRvⅢ的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列，所述CAR-IL13Rα2的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
8.如权利要求6所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞时，所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒的滴度比为1：(0.5-2)。
9.如权利要求6所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向性T淋巴细胞包括带所述CAR-EGFRvⅢ和所述CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者包括带所述CAR-EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者包括带所述CAR-EGFRvⅢ和所述CAR-IL13Rα2的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-EGFRvⅢ的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-IL13Rα2的嵌合抗原受体T细胞的混合。
10.如权利要求1-3任一项所述的靶向性T淋巴细胞、如权利要求4所述的重组病毒载体、如权利要求5所述的宿主细胞或如权利要求6-9所述的制备方法制得的靶向性T淋巴细胞在制备诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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