CN110144328A - 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞，包括靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体CAR‑EGFRvIII和/或靶向HER2的嵌合抗原受体CAR‑HER2，其中，所述CAR‑EGFRvIII包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向EGFRvIII的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR‑HER2包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向HER2的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列。该靶向性抗肿瘤T细胞可以精准高效地杀伤表面EGFRvIII和/或HER2阳性抗原的肿瘤细胞，有效克服肿瘤细胞的免疫逃逸。本发明还提供了该靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
神经胶质瘤简称胶质瘤，是中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)最常见的恶性肿瘤，起源于神经胶质细胞。胶质瘤是一种侵袭性强、复发率高的肿瘤，由于其浸润性生长，手术治疗很难全部切除肿瘤细胞，即使辅于放疗、化疗等，仍然难免复发。
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)技术是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，其治疗肿瘤具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势弥补了传统疗法的弊端，在国内外已经用于临床治疗恶性肿瘤，并在白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等血液系统肿瘤中取得了卓越的临床疗效。但是，CAR-T技术目前的应用还局限于血液瘤，在胶质瘤等肿瘤细胞的应用还未有相关研究；同时，CAR-T技术应用过程中时常出现肿瘤细胞上靶位肿瘤抗原的丢失、细胞内吞、变异，导致CAR-T细胞无法识别和激活。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用，本发明提供的靶向性抗肿瘤T细胞，既可以有效识别表面表达有EGFRvIII(表皮生长因子受体III型突变体)抗原蛋白的肿瘤细胞又可以有效识别表面表达有HER2(人上皮生长因子受体2)抗原蛋白的肿瘤细胞，并激活T细胞的免疫作用对EGFRvIII和HER2阳性肿瘤细胞进行杀伤，具有持久细胞活力和杀伤力，有效克服所靶向的肿瘤细胞表面EGFRvIII抗原蛋白或HER2抗原蛋白出现丢失、细胞内吞、变异等所引起的免疫逃逸；此外，所述靶向性抗肿瘤T细胞对正常细胞不会造成损伤。
第一方面，本发明提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞，包括靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII和/或靶向HER2的嵌合抗原受体CAR-HER2，其中，所述CAR-EGFRvIII包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向EGFRvIII的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-HER2包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向HER2的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明所述靶向性抗肿瘤T细胞的特异性靶点包括表皮生长因子受体III型突变体(epidermal growth factor receptor variant III，EGFRvIII)和人上皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)。其中，所述EGFRvIII是表皮生长因子受体(EGFR)的最常见突变体，在脑胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中表达率很高，很多研究表明，EGFRvIII一般在肿瘤细胞中出现，在正常人细胞中几乎不表达。HER2同样是在胶质瘤、乳腺癌等多种肿瘤细胞中高表达，且对肿瘤的发生和转移发挥着重要作用的表皮生长因子受体家族分子；研究表明，HER2在正常人的中枢神经系统中不表达，但是在脑胶质瘤中，胶质瘤细胞表面的HER2过表达与其恶性表型密切相关，因此，它可以成为人胶质瘤治疗的特异性靶点。
其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向CAR-EGFRvIII的单链抗体或所述靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
可选地，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述靶向HER2的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。本发明所述靶向EGFRvIII的单链抗体保留有对EGFRvIII抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有EGFRvIII抗原的肿瘤细胞。所述靶向HER2的单链抗体同样保留有对HER2抗原的亲和活性，能够高效识别表面具有HER2阳性抗原的肿瘤细胞。
可选地，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:3具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。所述靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。
在本发明中，所述CAR-EGFRvIII中的所述胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列与所述CAR-HER2中的所述胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区对应的氨基酸序列可以相同，也可以部分不同。
本发明中，所述胞外铰链区用于促进所述靶向EGFRvIII或HER2的单链抗体与肿瘤上的EGFRvIII或HER2结合。
可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。
进一步可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区。
可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
可选地，CD8α铰链区的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或如SEQ IDNO:11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:9。
本发明中，所述跨膜区用于固定所述嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII或CAR-HER2。
可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。
进一步可选地，所述跨膜区包括CD8跨膜区。
可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列或如SEQ IDNO:14所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:12。
本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。
可选地，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD27信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。
可选地，所述胞内信号区包括4-1BB信号区和CD3ζ信号区。
在本发明一实施方式中，所述胞内信号区为从氨基端到羧基端顺次连接的4-1BB信号区和CD3ζ信号区。相应地，所述胞内信号区的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的4-1BB信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因。
可选地，所述4-1BB信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
可选地，所述4-1BB信号区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。
可选地，所述4-1BB信号区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
可选地，所述4-1BB信号区的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQID NO:15所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列或如SEQID NO:17所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:15。
可选地，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQID NO:18所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列或如SEQID NO:20所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:18。
在本发明一实施方式中，所述CAR-EGFRvIII的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-HER2的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
可选地，所述CAR-EGFRvIII的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列，所述CAR-HER2的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-EGFRvIII的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQID NO:5所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:21具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:5。所述CAR-HER2的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。
本发明第一方面提供的所述靶向性抗肿瘤T细胞，同时靶向两个肿瘤靶点(EGFRvIII和HER2)，增强了对肿瘤细胞的识别，在CAR-EGFRvIII或CAR-HER2与相应的抗原蛋白结合后，所述T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎不会造成损伤，扩大了免疫细胞的杀伤谱；同时，可以有效避免肿瘤细胞上靶位肿瘤抗原(EGFRvIII或HER2)的丢失、细胞内吞、变异，导致所述靶向性抗肿瘤T细胞无法识别和激活。此外，基于所述EGFRvIII和HER2的单链抗体为人源化单链抗体，这使得该T细胞避免引起人机体的免疫反应，持久地维持细胞的活力和杀伤力。
本发明所述靶向性抗肿瘤T细胞可以高效识别并杀伤包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌等表达有HER2和/或EGFRvIII阳性抗原的肿瘤细胞，尤其适用于神经胶质瘤细胞。
第二方面，本发明提供了一种重组病毒载体，包括本发明第一方面所述的靶向性抗肿瘤T细胞中所述CAR-EGFRvIII和/或所述CAR-HER2的编码基因。
可选地，所述CAR-EGFRvIII的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列，所述CAR-HER2的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-EGFRvIII的编码基因包括如SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列。所述CAR-HER2的编码基因包括如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-EGFRvIII的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQID NO:7所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:23具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:7。所述CAR-HER2的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。
本发明中，以CAR-EGFRvIII为例，SEQ ID NO：23与SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列相比，多了下文所述的连接肽的编码基因，但在嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII表达到T细胞表面时，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。CAR-HER2的情况与之类似。
本发明中，以CAR-EGFRvIII为例，SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列相比，多了下文所述的连接肽的氨基酸序列，但在嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII表达到T细胞表面时，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。CAR-HER2的情况与之类似。
可选地，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。进一步可选地，所述病毒载体为慢病毒载体。
其中，所述重组病毒载体可以分别含有所述CAR-EGFRvIII或所述CAR-HER2的编码基因，也可以同时含有所述CAR-EGFRvIII和所述CAR-HER2的编码基因。当所述重组病毒载体同时含有所述CAR-EGFRvIII和所述CAR-HER2的编码基因时，所述CAR-EGFRvIII和所述CAR-HER2的编码基因之间还可以增设一段特殊序列用于使所述CAR-EGFRvIII编码基因和所述CAR-HER2的编码基因在转录翻译后可以得到CAR-EGFRvIII和CAR-HER2的两个独立蛋白，其中，所述可以特殊序列可以是核糖体结合位点(ribosomebinding site，RBS)序列、IRES序列、T2A序列或其他蛋白酶序列等。
本发明第二方面提供的所述重组病毒载体可以用于靶向EGFRvIII和HER2的靶向性抗肿瘤T细胞的制备，有利于促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞。
第三方面，本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面所述的重组病毒载体。
可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞等，但不限于此。进一步可选地，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
本发明第三方面提供的所述宿主细胞用于提供将如第二方面所述的重组病毒载体的组装并制备生成相应病毒的场所，由宿主细胞制备的病毒携带有所述CAR-EGFRvIII和所述CAR-HER2的遗传信息，具有强侵染性。
第四方面，本发明提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，包括：
(1)分别提供靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII的编码基因和靶向HER2的嵌合抗原受体CAR-HER2的编码基因；
所述CAR-EGFRvIII的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向EGFRvIII的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-HER2的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向HER2的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；
其中，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向HER2的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-EGFRvIII的编码基因和所述CAR-HER2的编码基因分别插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-EGFRvIII重组质粒和pWPXLD-CAR-HER2重组质粒；
(3)分别对所述pWPXLD-CAR-EGFRvIII重组质粒和所述pWPXLD-CAR-HER2重组质粒进行包装，得到带CAR-EGFRvIII编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-HER2编码基因的第二重组慢病毒；
(4)将所述第一重组慢病毒与所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性抗肿瘤T细胞。
可选地，所述CAR-EGFRvIII的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向EGFRvIII的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-HER2的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向HER2的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因。
其中，所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列如本发明第一方面部分所述，这里不再赘述。
本发明中，所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII或所述嵌合抗原受体CAR-HER2表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。
可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。
可选地，所述信号肽的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列。
可选地，所述信号肽的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列。
可选地，所述信号肽的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列或如SEQ IDNO:27所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:25。
可选地，所述制备方法中，所述CAR-EGFRvIII的编码基因包括如SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列，所述CAR-HER2的编码基因包括如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。
可选地，所述步骤(3)中，所述分别对所述pWPXLD-CAR-EGFRvIII重组质粒和所述pWPXLD-CAR-HER2重组质粒进行包装，得到带CAR-EGFRvIII编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-HER2编码基因的第二重组慢病毒，包括：
将所述pWPXLD-CAR-EGFRvIII重组质粒与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞，得到所述第一重组慢病毒；
将所述pWPXLD-CAR-HER2重组质粒与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞，得到所述第二重组慢病毒。
所述CAR-EGFRvIII的编码基因插入到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-EGFRvIII的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-EGFRvIII的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。
所述CAR-HER2的编码基因插入到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-HER2的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-HER2的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。
可选地，所述分别对所述pWPXLD-CAR-EGFRvIII重组质粒和所述pWPXLD-CAR-HER2重组质粒进行共同包装，得到带CAR-EGFRvIII编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-HER2编码基因的第二重组慢病毒，包括：
将所述pWPXLD-CAR-EGFRvIII与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到带CAR-EGFRvIII编码基因的第一重组慢病毒；以及将所述pWPXLD-CAR-HER2与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到带CAR-HER2编码基因的第二重组慢病毒。
可选地，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2。
所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞。
进一步可选地，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
本发明所述第一重组慢病毒或第二重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。
可选地，所述步骤(4)中，所采用的第一重组慢病毒与第一重组慢病毒的病毒滴度之比是1：(0.5-2)。
本发明分别构建pWPXLD-CAR-EGFRvIII重组质粒和pWPXLD-CAR-HER2重组质粒，并包装制备第一重组慢病毒和第二重组慢病毒，所述pWPXLD-CAR-EGFRvIII重组质粒和pWPXLD-CAR-HER2重组质粒经过密码子优化，病毒包装效率高，同时通过宿主细胞制备的病毒浓度高。相应地，采用第一重组慢病毒和第二重组慢病毒来联合转染CD3阳性T淋巴细胞时，这两种重组慢病毒的浓度较高，可降低实验成本。
由本发明所述方法制备的靶向性抗肿瘤T细胞的表面具有两个分别独立的单链抗体可以同时识别在一个或多个肿瘤细胞上HER2和EGFRvIII靶点，提升了肿瘤杀伤能力，高效多样化的识别癌症细胞，对于复杂的肿瘤微环境有着更加精准的肿瘤杀伤能力。此外，本发明所述靶向性抗肿瘤T细胞的两个嵌合抗原受体各自的单链抗体之间并没有相连，存在相对独立的空间，因此可以实现互不干扰。例如彼此间空间位阻对蛋白折叠或构型会产生影响或改变，导致所述嵌合抗原受体识别相应抗原的准确性下降，甚至引起自身免疫反应。
可选地，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。
可选地，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。
进一步可选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体的，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
可选地，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带所述CAR-EGFRvIII和所述CAR-HER2的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-EGFRvIII的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-HER2的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-EGFRvIII和所述CAR-HER2的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-EGFRvIII的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-HER2的嵌合抗原受体T细胞的混合。
第五方面，本发明提供了一种如本发明第一方面所述的靶向性抗肿瘤T细胞、如本发明第二方面所述的重组病毒载体、如本发明第三方面所述的宿主细胞或如本发明第四方面所述的制备方法制得的靶向性抗肿瘤T细胞在制备、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。具体地，所述应用包括检测试剂盒所述应用。
特别地，适用于表面含有EGFRvIII和/或HER2抗原的恶性肿瘤中。更特别地，更适用于神经胶质瘤、乳腺癌或其他同时具有EGFRvIII和HER2抗原的肿瘤细胞的诊断和治疗。
所述应用可以具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的靶向性抗肿瘤T细胞或采用如第二方面所述的重组病毒载体转染得到的靶向性抗肿瘤T细胞或采用如第四方面所述的制备方法所制得的靶向性抗肿瘤T细胞，如本发明第二方面所述的重组病毒载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
图1为本发明实施提供的pWPXLd-CAR-EGFRvIII重组载体的质粒图谱。
图2为本发明实施提供的pWPXLd-CAR-HER2重组载体的质粒图谱。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。若无特别说明，本发明实施例所采用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。
下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，
实施例一
一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII的基因序列
分别制备信号肽、靶向EGFRvIII的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述CAR-EGFRvIII中，信号肽的编码基因如SEQ ID NO：26所示，靶向EGFRvIII的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：3所示，CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：10所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：13所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQ ID NO：16所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：19所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向EGFRvIII的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到CAR-EGFRvIII的编码基因，该CAR-EGFRvIII的编码基因如SEQ ID NO：23所示。
(2)制备靶向HER2的嵌合抗原受体CAR-HER2的基因序列
分别制备信号肽、靶向HER2的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述CAR-HER2所用的信号肽的编码基因如SEQ ID NO：27所示，靶向HER2的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：4所示，CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：11所示，CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：14所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQID NO：17所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：20所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向HER2的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到CAR-HER2的编码基因，该CAR-HER2的编码基因如SEQ ID NO：24所示。
(3)构建pWPXLd-CAR-EGFRvIII重组质粒和pWPXLd-CAR-HER2重组质粒
将CAR-EGFRvIII的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-EGFRvIII的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-EGFRvIII的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图1所示的pWPXLd-CAR-EGFRvIII重组质粒。
将CAR-HER2的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。其中当所述CAR-HER2的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-HER2的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图2所示的pWPXLd-CAR-HER2重组质粒。
(4)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-HER2重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×108TU/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-EGFRvIII的第一重组慢病毒。
将pWPXLd-CAR-HER2重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μL、2×108TU/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-HER2的第二重组慢病毒。
(5)靶向性抗肿瘤T细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，同时加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的带CAR-EGFRvIII的第一重组慢病毒和带CAR-HER2的第二重组慢病毒进行共同培养，所述第一重组慢病毒与第二重组慢病毒的用量(滴度)为1:1。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×1·06个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向性抗肿瘤T细胞，包含：CAR-EGFRvIII单阳性T淋巴细胞和CAR-HER2单阳性T淋巴细胞或CAR-EGFRvIII/CAR-HER2双阳性T淋巴细胞细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中。
效果实施例
效果实施例一：评估本发明靶向性抗肿瘤T细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况
将经过本发明实施例一制得的靶向性抗肿瘤T细胞(实验组)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)、具有单独的CAR–EGFRvIII的T细胞(EGFRvIII CAR–T单独组)以及具有单独的CAR–HER2的T细胞(HER2CAR–T单独组)进行比较，在体外将上述四组效应细胞与靶细胞(MCF-7乳腺癌细胞)按数量比为1:10、1:3、1:1、3:1和10:1的比例，在37℃、5％CO2下进行共培养，在培养后的第15-18小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况，结果显示实验组(靶向性抗肿瘤T细胞)的肿瘤细胞死亡数目最多，肿瘤杀伤力效果远远高于其他组，EGFRvIII CAR–T单独组和HER2CAR–T单独组中有一定数目的肿瘤细胞死亡，阴性对照组几乎无死伤肿瘤细胞。
效果实施例二，评估本发明靶向性抗肿瘤T细胞的对小鼠体内肿瘤细胞杀伤情况
将本发明实施例一制备的靶向性抗肿瘤T细胞(实验组)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)、具有单独的CAR–EGFRvIII的T细胞(EGFRvIII CAR–T单独组)以及具有单独的CAR–HER2的T细胞(HER2CAR–T单独组)，在小鼠乳腺癌模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×106个细胞(n＝9)，得到小鼠的生存曲线，结果显示实验组的小鼠存活率最高，远远超过阴性对照组和空白对照组。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳宾德生物技术有限公司
<120> 一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 2
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Tyr Asn Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Phe Arg Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser
115 120 125
Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys
130 135 140
Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr
165 170 175
Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser
180 185 190
Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys
195 200 205
Ser Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr His
210 215 220
Gly Tyr Val Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
<210> 3
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagattcagc tcgtgcaatc gggagcggaa gtcaagaagc caggagagtc cttgcggatc 60
tcatgcaagg gtagcggctt taacatcgag gattactaca tccactgggt gaggcagatg 120
ccggggaagg gactcgaatg gatgggacgg atcgacccag aaaacgacga aactaagtac 180
ggtccgatct tccaaggcca tgtgactatt agcgccgata cttcaatcaa taccgtgtat 240
ctgcaatggt cctcattgaa agcctcagat accgcgatgt actactgtgc tttcagagga 300
ggggtctact ggggacaggg aactaccgtg actgtctcgt ccggcggagg cgggtcagga 360
ggtggcggca gcggaggagg agggtccggc ggaggtgggt ccgacgtcgt gatgacccag 420
agccctgaca gcctggcagt gagcctgggc gaaagagcta ccattaactg caaatcgtcg 480
cagagcctgc tggactcgga cggaaaaacg tacctcaatt ggctgcagca aaagcctggc 540
cagccaccga agcgccttat ctcactggtg tcgaagctgg attcgggagt gcccgatcgc 600
ttctccggct cgggatcggg tactgacttc accctcacta tctcctcgct tcaagcagag 660
gacgtggccg tctactactg ctggcaggga acccactttc cgggaacctt cggcggaggg 720
acgaaagtgg agatcaag 738
<210> 4
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacatccagc tgacccagtc tcacaaattc ctgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgtat aatgctgttg cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaacttct gatttactcg gcatcctccc ggtacactgg agtcccttct 180
cgcttcactg gcagtggctc tgggccggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcaa cattttcgta ctccattcac gttcggctcg 300
gggacaaaat tggagatcgg cggtggcggt tctggtggcg gtggctccgg cggtggcggt 360
tctcaggtac aactgcagca gtctggacct gaactgaaga agcctggaga gacagtcaag 420
atctcctgca aggcctctgg gtatcctttc acaaactatg gaatgaactg ggtgaagcag 480
gctccaggac agggtttaaa gtggatgggc tggattaaca cttccactgg agagtcaaca 540
tttgctgatg acttcaaggg acggtttgac ttctctttgg aaacctctgc caacactgcc 600
tatttgcaga tcaacaacct caaaagtgaa gacatggcta catatttctg tgcaagatgg 660
gaggtttacc acggctacgt tccttactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtttcctct 720
<210> 5
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
245 250 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
260 265 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
275 280 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
290 295 300
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
305 310 315 320
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
325 330 335
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
340 345 350
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
355 360 365
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
370 375 380
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
385 390 395 400
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
420 425 430
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
435 440 445
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
450 455 460
Ala Leu Pro Pro Arg
465
<210> 6
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Tyr Asn Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Phe Arg Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser
115 120 125
Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys
130 135 140
Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr
165 170 175
Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser
180 185 190
Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys
195 200 205
Ser Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr His
210 215 220
Gly Tyr Val Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
245 250 255
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
260 265 270
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
275 280 285
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
290 295 300
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
305 310 315 320
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
325 330 335
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
340 345 350
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln
355 360 365
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
370 375 380
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
385 390 395 400
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
405 410 415
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
420 425 430
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
435 440 445
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 7
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn
35 40 45
Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr
65 70 75 80
Gly Pro Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile
85 90 95
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
100 105 110
Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn
165 170 175
Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu
180 185 190
Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser
195 200 205
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu
225 230 235 240
Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr
245 250 255
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 8
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser
20 25 30
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Phe
100 105 110
Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
130 135 140
Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys
145 150 155 160
Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
165 170 175
Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile
180 185 190
Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg
195 200 205
Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Ile
210 215 220
Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp
225 230 235 240
Glu Val Tyr His Gly Tyr Val Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
260 265 270
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
275 280 285
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
290 295 300
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
305 310 315 320
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
325 330 335
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
340 345 350
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
355 360 365
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
370 375 380
Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
385 390 395 400
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
405 410 415
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
420 425 430
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
435 440 445
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
450 455 460
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
465 470 475 480
Pro Pro Arg
<210> 9
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 10
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120
gacttcgcct gcgat 135
<210> 11
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 13
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60
actctttact gt 72
<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 15
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 16
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 17
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 19
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336
<210> 20
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 21
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gagattcagc tcgtgcaatc gggagcggaa gtcaagaagc caggagagtc cttgcggatc 60
tcatgcaagg gtagcggctt taacatcgag gattactaca tccactgggt gaggcagatg 120
ccggggaagg gactcgaatg gatgggacgg atcgacccag aaaacgacga aactaagtac 180
ggtccgatct tccaaggcca tgtgactatt agcgccgata cttcaatcaa taccgtgtat 240
ctgcaatggt cctcattgaa agcctcagat accgcgatgt actactgtgc tttcagagga 300
ggggtctact ggggacaggg aactaccgtg actgtctcgt ccggcggagg cgggtcagga 360
ggtggcggca gcggaggagg agggtccggc ggaggtgggt ccgacgtcgt gatgacccag 420
agccctgaca gcctggcagt gagcctgggc gaaagagcta ccattaactg caaatcgtcg 480
cagagcctgc tggactcgga cggaaaaacg tacctcaatt ggctgcagca aaagcctggc 540
cagccaccga agcgccttat ctcactggtg tcgaagctgg attcgggagt gcccgatcgc 600
ttctccggct cgggatcggg tactgacttc accctcacta tctcctcgct tcaagcagag 660
gacgtggccg tctactactg ctggcaggga acccactttc cgggaacctt cggcggaggg 720
acgaaagtgg agatcaagac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc 780
atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 840
gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 900
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 960
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1020
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1080
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1140
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1200
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1260
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1320
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1380
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1407
<210> 22
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gacatccagc tgacccagtc tcacaaattc ctgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgtat aatgctgttg cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaacttct gatttactcg gcatcctccc ggtacactgg agtcccttct 180
cgcttcactg gcagtggctc tgggccggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcaa cattttcgta ctccattcac gttcggctcg 300
gggacaaaat tggagatcgg cggtggcggt tctggtggcg gtggctccgg cggtggcggt 360
tctcaggtac aactgcagca gtctggacct gaactgaaga agcctggaga gacagtcaag 420
atctcctgca aggcctctgg gtatcctttc acaaactatg gaatgaactg ggtgaagcag 480
gctccaggac agggtttaaa gtggatgggc tggattaaca cttccactgg agagtcaaca 540
tttgctgatg acttcaaggg acggtttgac ttctctttgg aaacctctgc caacactgcc 600
tatttgcaga tcaacaacct caaaagtgaa gacatggcta catatttctg tgcaagatgg 660
gaggtttacc acggctacgt tccttactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtttcctct 720
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 780
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 840
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 900
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 960
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1020
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1080
gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1140
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1200
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1260
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1320
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1380
ccccctcgc 1389
<210> 23
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gccctccctg tcaccgccct gctgcttccg ctggctcttc tgctccacgc cgctcggccc 60
gagattcagc tcgtgcaatc gggagcggaa gtcaagaagc caggagagtc cttgcggatc 120
tcatgcaagg gtagcggctt taacatcgag gattactaca tccactgggt gaggcagatg 180
ccggggaagg gactcgaatg gatgggacgg atcgacccag aaaacgacga aactaagtac 240
ggtccgatct tccaaggcca tgtgactatt agcgccgata cttcaatcaa taccgtgtat 300
ctgcaatggt cctcattgaa agcctcagat accgcgatgt actactgtgc tttcagagga 360
ggggtctact ggggacaggg aactaccgtg actgtctcgt ccggcggagg cgggtcagga 420
ggtggcggca gcggaggagg agggtccggc ggaggtgggt ccgacgtcgt gatgacccag 480
agccctgaca gcctggcagt gagcctgggc gaaagagcta ccattaactg caaatcgtcg 540
cagagcctgc tggactcgga cggaaaaacg tacctcaatt ggctgcagca aaagcctggc 600
cagccaccga agcgccttat ctcactggtg tcgaagctgg attcgggagt gcccgatcgc 660
ttctccggct cgggatcggg tactgacttc accctcacta tctcctcgct tcaagcagag 720
gacgtggccg tctactactg ctggcaggga acccactttc cgggaacctt cggcggaggg 780
acgaaagtgg agatcaagac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc 840
atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 900
gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 960
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 1020
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1080
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1140
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1200
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1260
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1320
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1380
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1440
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1467
<210> 24
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60
gacatccagc tgacccagtc tcacaaattc ctgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 120
atcacctgca aggccagtca ggatgtgtat aatgctgttg cctggtatca acagaaacca 180
ggacaatctc ctaaacttct gatttactcg gcatcctccc ggtacactgg agtcccttct 240
cgcttcactg gcagtggctc tgggccggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 300
gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcaa cattttcgta ctccattcac gttcggctcg 360
gggacaaaat tggagatcgg cggtggcggt tctggtggcg gtggctccgg cggtggcggt 420
tctcaggtac aactgcagca gtctggacct gaactgaaga agcctggaga gacagtcaag 480
atctcctgca aggcctctgg gtatcctttc acaaactatg gaatgaactg ggtgaagcag 540
gctccaggac agggtttaaa gtggatgggc tggattaaca cttccactgg agagtcaaca 600
tttgctgatg acttcaaggg acggtttgac ttctctttgg aaacctctgc caacactgcc 660
tatttgcaga tcaacaacct caaaagtgaa gacatggcta catatttctg tgcaagatgg 720
gaggtttacc acggctacgt tccttactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtttcctct 780
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 840
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 900
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 960
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 1020
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1080
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1140
gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1200
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1260
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1320
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1380
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1440
ccccctcgc 1449
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gccctccctg tcaccgccct gctgcttccg ctggctcttc tgctccacgc cgctcggccc 60
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60

Claims (10)

1.一种靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，包括靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII和/或靶向HER2的嵌合抗原受体CAR-HER2，其中，所述CAR-EGFRvIII包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向EGFRvIII的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-HER2包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向HER2的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQID NO：2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述靶向HER2的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述CAR-EGFRvIII的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-HER2的氨基酸序列包括如SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列。
4.一种重组病毒载体，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向性抗肿瘤T细胞中所述CAR-EGFRvIII和/或CAR-HER2的编码基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求4所述的重组病毒载体。
6.一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)分别提供靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII的编码基因和靶向HER2的嵌合抗原受体CAR-HER2的编码基因；
所述CAR-EGFRvIII的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向EGFRvIII的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-HER2的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向HER2的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；
其中，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向HER2的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-EGFRvIII的编码基因和所述CAR-HER2的编码基因分别插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-EGFRvIII重组质粒和pWPXLD-CAR-HER2重组质粒；
(3)分别对所述pWPXLD-CAR-EGFRvIII重组质粒和所述pWPXLD-CAR-HER2重组质粒进行包装，得到带CAR-EGFRvIII编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-HER2编码基因的第二重组慢病毒；
(4)将所述第一重组慢病毒与所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性抗肿瘤T细胞。
7.如权利要求6所述的靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR-EGFRvIII的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列，所述CAR-HER2的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
8.如权利要求6所述的靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所采用的第一重组慢病毒与第一重组慢病毒的病毒滴度之比是1：(0.5-2)。
9.如权利要求6所述的靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带所述CAR-EGFRvIII和所述CAR-HER2的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-EGFRvIII的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-HER2的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-EGFRvIII和所述CAR-HER2的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-EGFRvIII的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-HER2的嵌合抗原受体T细胞的混合。
10.如权利要求1-3任一项所述的靶向性抗肿瘤T细胞、如权利要求4所述的重组病毒载体、如权利要求5所述的宿主细胞或如权利要求6-9所述的制备方法制得的靶向性抗肿瘤T细胞在制备、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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