CN115109754A - 抗EGFR和cMet双特异性嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

抗EGFR和cMet双特异性嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗EGFR和cMet双特异性嵌合抗原受体及其应用，具体地，本发明提供了表达第一CAR和第二CAR的免疫细胞，所述第一CAR靶向第一肿瘤细胞标志物，所述第二CAR靶向第二肿瘤细胞标志物。本发明的第一CAR和第二CAR同时识别相应肿瘤细胞标志物，免疫细胞可被充分激活，增强靶向特异性，发挥抗肿瘤功效，并且降低在靶/脱肿瘤毒性，提高细胞治疗的安全性。

Description

抗EGFR和cMet双特异性嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及抗EGFR和cMet双特异性嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
经过基因工程改造表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞已经被证明对某些B细胞白血病或者淋巴瘤亚型的患者具有治疗作用，并且对多发性骨髓瘤患者也显示了潜在的疗效。目前已有3个CAR T药物获批，分别为Yescarta用于治疗大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤，Tecartus用于治疗套细胞淋巴瘤，以及Kymriah用于治疗大B细胞淋巴瘤和针对小儿和年轻人的急性淋巴细胞白血病。CAR分子包括3个主要的结构成分，分别是细胞外抗原结合功能结构域；跨膜结构域，用以传递抗原识别信号；以及细胞内信号传导结构域。第一代的CAR仅包含CD3ζ激活信号，由于缺乏共刺激信号功能结构域，无法使CAR T细胞充分激活，显示出有限的细胞毒性，不能在体内有效扩增或持续存在。第二代CAR同时引入了CD28或4-1BB的共刺激功能结构域，增强了CAR T的细胞毒性，并提高了其持久性。目前CAR T细胞产品的上市药物均采用了二代的设计。通过添加另一个共刺激结构域，例如OX40、ICOS、CD27等，第三代CAR在二代的基础上进一步扩展，尽管报道其具有更强的持久性，但有可能会诱发细胞因子过量释放，目前在临床上的疗效并没有得到验证。为了扩展CAR T的疗效并将其应用到更广泛的恶性肿瘤，尤其是实体瘤，需要对CAR T进行创新性的工程化构建。
在CAR T细胞治疗过程中会出现多种不良反应，如细胞因子释放综合征(CRS)，神经系统毒性，在靶/脱肿瘤的靶点毒性(on-target off-tumor toxicity)以及肿瘤溶解综合征。其中CRS是系统性的，可累及全身各个器官，最频发以及症状最突出的急性不良反应，在临床上需要有效地对CRS进行管理和干预。由于肿瘤相关抗原在肿瘤细胞中高表达以外，也会在正常组织或细胞中有非特异性的低水平表达，例如CD19、Her2、ROR1、Muc1等。靶点毒性即CAR T细胞因识别正常组织表达的抗原而被激活，并造成对正常组织的损伤。CAR T治疗CD19阳性的恶性淋巴瘤，由于骨髓中具有表达CD19的B细胞祖细胞，其同肿瘤细胞一并被清楚，从而导致B细胞发育不良以及血红蛋白降低，临床上通过输注免疫球蛋白来代替B细胞产生的抗体功能。在一项以碳酸酐酶IX为靶点，治疗肾癌的CAR T细胞临床试验中，多名患者出现了肝酶异常，这些不良反应归因于CAR T细胞渗入并且作用于表达碳酸酐酶的胆管上皮。一名结直肠癌患者，在接受靶向Her2的CAR T细胞输注后，由于肺上皮细胞也表达低水平的Her2，患者则出现了致命的肺损伤。另外，在靶向EGFRvIII的CART治疗神经胶质瘤的临床试验中，也发生了类似的肺水肿毒性。由于单一靶向CAR T细胞有可能造成靶点毒性，并且目前很难通过IHC或者组织芯片等体外筛选的方法进行准确判断。
因此本领域迫切需要开发一种新型的嵌合抗原受体T细胞，既可同时识别多个抗原，增强靶向特异性，发挥抗肿瘤功效，并且能够降低在靶/脱肿瘤毒性，提高细胞治疗的安全性。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的嵌合抗原受体T细胞，既可同时识别多个抗原，又可增强靶向特异性，发挥抗肿瘤功效，并且降低在靶/脱肿瘤(ontarget/off tumor)毒性，提高细胞治疗的安全性。
本发明的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达第一CAR和第二CAR，所述第一CAR靶向第一肿瘤细胞标志物，所述第二CAR靶向第二肿瘤细胞标志物，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47、或其组合；所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合。
在另一优选例中，所述免疫细胞含有第一CAR和第二CAR。
在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞、巨噬细胞或T细胞，较佳地为T细胞。
在另一优选例中，所述第一CAR、第二CAR定位于所述免疫细胞的细胞膜。
在另一优选例中，所述第一CAR、第二CAR含有靶向肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域。
在另一优选例中，所述抗原结合结构域为抗体或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗原结合片段是Fab或scFv或单结构域抗体sdFv。
在另一优选例中，所述第一CAR的结构如式I所示：
L1-S1-H1-TM1-C1-CD3ζ (I)
式中，所述“-”为连接肽或肽键；
L1为无或第一信号肽序列；
S1为靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47、或其组合；
H1为无或第一铰链区；
TM1为第一跨膜结构域；
C1为无或第一共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域包括靶向肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列。
在另一优选例中，所述的靶向第一肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列的结构如式A1或A2所示：
VH1-VL1 (A1)；或
VL1-VH1 (A2)；
其中，VL1为抗第一肿瘤细胞标志物抗体的轻链可变区；VH1为抗第一肿瘤细胞标志物抗体的重链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。
在另一优选例中，所述的VL1和VH1通过柔性接头相连。
在另一优选例中，所述的柔性接头为1-5个(较佳地，2-4个)连续的GGGGS所示的序列。
在另一优选例中，所述柔性接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第120-134位所示。
在另一优选例中，VL1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1中第135－247位所示，且VH1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第1－119位所示。
在另一优选例中，所述的靶向第一肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列如SEQID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述第一CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2－4中任一所示。
在另一优选例中，所述第二CAR的结构如式II所示：
L2-S2-H2-TM2-C2-Z2 (II)
式中，所述“-”为连接肽或肽键；
L2为无或第二信号肽序列；
S2为靶向第二肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合；
H2为无或第二铰链区；
TM2为第二跨膜结构域；
C2为第二共刺激信号分子；
Z2为无或源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述靶向第二肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域包括靶向肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列。
在另一优选例中，所述的靶向第二肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列的结构如式A3或A4所示：
VH2-VL2 (A3)；或
VL2-VH2 (A4)；
其中，VL2为抗第二肿瘤细胞标志物抗体的轻链可变区；VH2为抗第二肿瘤细胞标志物抗体的重链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。
在另一优选例中，所述的VL2和VH2通过柔性接头相连。
在另一优选例中，所述的柔性接头为1-5个(较佳地，2-4个)连续的GGGGS所示的序列。
在另一优选例中，所述柔性接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5中第120-134位所示。
在另一优选例中，所述柔性接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6中第120-134位所示。
在另一优选例中，VL2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5中第135－241位所示，且VH2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5的第1－119位所示。
在另一优选例中，VL2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6中第135－241位所示，且VH2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6的第1－119位所示。
在另一优选例中，所述的靶向第二肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列如SEQID NO.:5或6所示。
在另一优选例中，所述第二CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7－14中任一所示。
在另一优选例中，所述的靶向第一或第二肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列为鼠源、人源、人源和鼠源嵌合、或者全人源化的单链抗体可变区片段。
在另一优选例中，所述L1、L2各自独立地为选自下组的蛋白的信号肽：CD8a、CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述L1为CD8a来源的信号肽。
在另一优选例中，所述L2为CD8a来源的信号肽。
在另一优选例中，所述L1、L2的氨基酸序列各自独立地如SEQ ID NO.:15所示。
在另一优选例中，所述H1、H2各自独立地为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、Ig(免疫球蛋白)铰链、或其组合。
在另一优选例中，所述H1、H2各自独立地为CD8来源的铰链区。
在另一优选例中，所述H1、H2的氨基酸序列各自独立地如SEQ ID NO.:16所示。
在另一优选例中，所述TM1、TM2各自独立地为选自下组的蛋白的跨膜区：CD8、CD28、CD8a、CD33、CD37、CD8α、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4、CD3ε、或其组合。
在另一优选例中，所述TM1、TM2为CD8来源的跨膜区。
在另一优选例中，所述TM2为CD28来源的跨膜区。
在另一优选例中，所述TM1、TM2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:17所示。
在另一优选例中，所述TM2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:18所示。
在另一优选例中，所述C1、C2各自独立地为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：CD28、4-1BB(CD137)、CD30、CD40、CD70、CD134、LIGHT、DAP10、CDS、ICAM-1、OX40、或其组合。
在另一优选例中，所述C1为无；或CD28和/或4-1BB来源的共刺激信号分子。
在另一优选例中，所述C2为CD28和/或4-1BB来源的共刺激信号分子。
在另一优选例中，所述C1、C2的氨基酸序列各自独立地如SEQ ID NO.:19所示。
在另一优选例中，所述C1、C2的氨基酸序列各自独立地如SEQ ID NO.:20所示。
在另一优选例中，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.:21所示。
本发明第二方面提供了一种制备本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的方法，包括以下步骤：
(A)提供一待改造的免疫细胞；和
(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达第一CAR和第二CAR，所述第一CAR靶向第一肿瘤细胞标志物，所述第二CAR靶向第二肿瘤细胞标志物，从而获得本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞。
在另一优选例中，在步骤(A)中，还包括分离和/或激活待改造的免疫细胞。
在另一优选例中，在步骤(B)中，包括(B1)将表达靶向所述第一肿瘤细胞标志物的第一CAR的第一表达盒导入所述免疫细胞；和(B2)将表达靶向第二肿瘤细胞标志物的第二CAR的第二表达盒导入所述免疫细胞；其中所述的步骤(B1)可在步骤(B2)之前、之后、同时、或交替进行。
在另一优选例中，在步骤(B)中，将所述第一表达盒和/或第二表达盒导入所述免疫细胞的细胞核中。
在另一优选例中，当步骤(A)中的待改造的免疫细胞已经表达所述第一CAR和第二CAR时，则步骤(B)可以省略。
在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞、巨噬细胞或T细胞。
在另一优选例中，所述的第一表达盒含有编码所述的第一CAR的核酸序列。
在另一优选例中，所述的第二表达盒含有编码所述第二CAR的核酸序列。
在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于相同或不同的载体上。
在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于同一载体。
在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于不同载体。
在另一优选例中，所述的载体为病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。
在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
本发明第三方面提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂。
在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。
在另一优选例中，所述制剂还含有治疗癌症或肿瘤的其他药物(如新兴的抗体药物、其他CAR-T药物或化疗药物)。
本发明第四方面提供了一种如本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的用途，用于制备选择性杀伤肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达肿瘤细胞标志物(比如EGFR、cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47、EpCAM)的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括同时表达肿瘤细胞标志物(比如EGFR、cMet、Her2、HER3)的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括同时表达EGFR和cMet的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合，优选地，所述肿瘤为实体瘤。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤,膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌、鼻咽癌、胸腺癌、或其组合。
本发明第五方面提供了一种用于选择性杀伤肿瘤的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：
(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达靶向第一肿瘤细胞标志物的第一CAR的第一表达盒，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47、或其组合；和
(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有靶向第二肿瘤细胞标志物的第二CAR的第二表达盒，所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列为独立的或相连的。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的容器内。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的载体上。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于同一载体。
本发明第六方面提供了一种选择性杀伤肿瘤的方法，包括：
给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、或本发明第三方面所述的制剂。
在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。
在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。
本发明第七方面提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、或本发明第三方面所述的制剂。
在另一优选例中，所述方法还包括给需要治疗的对象施用治疗癌症或肿瘤的其他药物。
在另一优选例中，所述其他药物包括CAR-T药物。
在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达肿瘤细胞标志物(比如EGFR、cMet、HER2、HER3、MUC1、ROR1、PD-L1、CD47)的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括同时表达肿瘤细胞标志物(比如EGFR、cMet、EpCAM、HER2、HER3)的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括同时表达EGFR和cMet的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合，优选地，所述肿瘤为实体瘤。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤,膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌、鼻咽癌、胸腺癌、或其组合。
本发明第八方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含靶向第一肿瘤细胞标志物的第一CAR和靶向第二肿瘤细胞标志物的第二CAR，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47、或其组合；所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合。
在另一优选例中，所述第一CAR和第二CAR通过连接肽连接。
在另一优选例中，所述连接肽包括自剪切蛋白。
在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：T2A、P2A、E2A、F2A、或其组合。
在另一优选例中，所述自剪切蛋白包括T2A。
在另一优选例中，所述融合蛋白的结构如下式III所示：
L1-S1-H1-TM1-C1-CD3ζ-Z3-L2-S2-H2-TM2-C2-Z2 (III)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L1为无或第一信号肽序列；
L2为无或第二信号肽序列；
S1为靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47、或其组合；
S2为靶向第二肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合；
H1为无或第一铰链区；
H2为无或第二绞链区；
TM1为第一跨膜结构域；
TM2为第二跨膜结构域；
C1为无或第一共刺激信号分子；
C2为第二共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
Z2为无或源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
Z3为连接肽。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:22－25中任一所示。
本发明第九方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第八方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:22－25任一所示融合蛋白的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:26－29任一所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与(b)所示序列的同源性≥75％(较佳地≥80％)的多核苷酸；
(d)如(b)所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:26－29任一所示。
本发明第十方面提供了一种载体，所述载体包括本发明第九方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括DNA、RNA。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。
在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
在另一优选例中，所述载体为含有或插入有本发明第九方面所述的多核苷酸的载体。
在另一优选例中，所述载体用于表达本发明第八方面所述的融合蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了靶向EGFR和cMet双特异性“和”逻辑CAR(And logic BiCAR)的组成，包括2个独立的CAR分子，为抗cMet的scFv串联CD3ζ激活信号结构域的CAR组合抗EGFR的scFv串联4-1BB或者CD28共刺激信号结构域的CAR；图1B示出“和”逻辑BiCAR表达的分子构建连接示意图；图1C示出了靶向cMet的第二代全功能CAR的组成，scFv串联4-1BB或者CD28以及CD3ζ；图1D示出了靶向EGFR的二代全功能CAR的组成，scFv串联4-1BB或者CD28以及CD3ζ。
图2显示了Mock T(2A),E-28(2B)、E-28z(2C)、M-z(2D)、M-28z(2E)CAR及“And”logic BiCAR T(2F)细胞的染色流式细胞术分析。
图3显示了Mock T,E-28、M-z,、M-28z CAR以及BiCAR T细胞与293T(3A)，分别稳定表达抗原EGFR(3B)、cMet的293T(3C)，及共表达EGFR/cMet的293T细胞株(3D)共孵育24h后，体外细胞溶解毒性。CAR-T效应细胞与靶细胞细胞数目的比例分别为1:10、1:3、1:1和3:1。
图4显示了Mock T,E-28、M-z、M-28z CAR以及BiCAR T细胞与293T，以及分别稳定表达EGFR、cMet、EGFR/cMet共表达的293T细胞株在不同效靶比1:10(4A)、1:3(4B)、1:1(4C)、3:1(4D)条件下共孵育24h，体外分泌细胞因子IFN-r的细胞毒性。
图5显示了Mock T,M-z、M-28z、E-28z CAR及BiCAR T对于EGFR过表达、cMet低表达的正常人表皮角质形成细胞的体外细胞溶解毒性，效靶比分别为1:10(5A)、1:3(5B)、1:1(5C)、3：1(5D)。
图6显示了由不同健康donor#1(6A)和#2(6B)的外周血单核细胞(PBMC)所制备的Mock T、E-28、M-z、M-28z CAR及BiCAR T细胞，体外分别与EGFR和cMet共表达的SNU-5人胃癌细胞株共孵育24h，于不同的效靶比条件下，对靶细胞的裂解毒性。
图7显示了Mock T,E-28、M-z、M-28z CAR及BiCAR T细胞与EGFR/cMet过表达的H1993人肺腺癌细胞株体外共培养24h，于不同的效靶比1:10、1：3、1：1、3：1的条件下，对靶细胞裂解毒性。
图8显示了由PBMC所制备的Mock T、E-28、M-z、M-28z CAR及BiCAR T细胞，体外分别与EGFR和cMet共表达的H1975人肺腺癌细胞株共孵育24h，于不同的效靶比1:10、1：3、1：1、3：1条件下，对靶细胞的裂解毒性。
图9显示了由PBMC所制备的Mock T、E-28、M-z、M-28z CAR及BiCAR T细胞，体外分别与EGFR/cMet共表达的H820人肺腺癌细胞株共孵育24h，于不同的效靶比1:10、1：3、1：1、3：1条件下，对靶细胞的裂解毒性。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现含有靶向第一肿瘤细胞标志物(比如cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47)的第一CAR和靶向第二肿瘤细胞标志物(比如，EGFR、EpCAM、Her2、Her3)的第二CAR的免疫细胞可被充分激活，增强靶向特异性，发挥抗肿瘤功效，并且降低在靶/脱肿瘤毒性，提高细胞治疗的安全性。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。
如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种CAR及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。
EGFR
表皮因子生长受体(EGFR)属于酪氨酸激酶家族，家族包括其它三个成员ERBB2/HER2,ERBB3/HER3以及ERBB4/HER4。其锚定在细胞质膜中，包括胞外配体结合功能结构域，疏水跨膜区及胞内酪氨酸激酶结构域。EGFR的配体(例如EGF,TGF-a等)与其结合后，会形成同源二聚体或与其它家族成员形成异源二聚体，导致酪氨酸残基的自磷酸化，从而激活多个下游信号传导途径，调节细胞的增殖，存活和凋亡。EGFR信号网络在上皮组织的维持和生长中起着重要的作用，其异常激活、活跃与多种癌症的发生、进展和不良预后有关。
EGFR在多种肿瘤中过表达，包括25-77％的结直肠癌，80-100％的头颈癌，40-80％的非小细胞肺癌(NSCLC)，50-90％的肾癌，30-50％的胰腺癌，14-91％的乳腺癌，40-63％的胶质母细胞瘤，35-70％的卵巢癌等。EGFR的基因突变和过度表达均异常激活下游通路，与致癌和癌症进展密切相关。目前针对EGFR靶点的药物，包括酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(例如厄洛替尼，吉非替尼，奥西替尼等)和单克隆抗体(西妥昔单抗及帕尼单抗)，已批准分别用于非小细胞肺癌，结直肠癌和头颈癌的治疗。EGFR也广泛地表达于人的正常器官和组织中，包括皮肤、肺、肝、肾脏等。获批的单抗药物在真实世界中的不良反应以及针对EGFR开发的CAR T细胞治疗药物临床上的在靶点毒性均主要表现为皮肤毒性。EGFR原癌基因驱动突变是NSCLC致癌、疾病进展的重要因素，在50-60％的亚洲患者中被检测到，临床上作为预后和疾病预测的生物标志物。EGFR-TKI药物(吉非替尼、厄洛替尼等)对于EGFR敏感突变的晚期NSCLC患者有很好的疗效，然而经过中位时间6-12个月的治疗后，大部分患者对EGFR-TKI产生耐药。耐药机制主要包括EGFR的获得性突变，约50％的耐药病人出现T790M突变，而三代TKI药物如奥西替尼的耐药是由于C797S突变；以及旁路途径cMet、Her2信号通路的激活。接受奥西替尼治疗的病人，约30％会出现获得性cMet基因扩增，从而避开靶点EGFR，导致TKI耐药。NSCLC是典型的多驱动基因突变，基因组不稳定性、肿瘤异质性以及疾病进展过程中产生的原发或获得性耐药对于晚期NSCLC的靶向治疗的应用产生了瓶颈，因此多靶点的靶向治疗将有机会取得更好的临床疗效。
cMet
间质表皮转化因子(cMet)是受体酪氨酸激酶的一种，与配体肝细胞因子(HGF)结合后，导致受体的二聚及磷酸化，激活多种不同的细胞信号通路，参与细胞的增殖、运动、迁移、侵袭和血管生成。cMet正常表达于人的多种组织和器官中，包括肝、食管、胃、结直肠、皮肤、卵巢及子宫内膜。cMet对于正常生理条件下控制细胞稳态非常重要，而当cMet被过度激活，则会启动正常细胞向肿瘤细胞转化，出现上皮-间质化。cMet的基因突变、基因扩增或过表达可导致其信号通路异常激活，促进肿瘤进展。
cMet在多种癌症中过表达，包括肺癌，乳腺癌，卵巢癌，肾癌，结直肠癌，甲状腺癌，肝癌和胃癌。cMet的过度表达与较差的存活期直接相关，在一些癌症如肺癌、结直肠、卵巢癌等，cMet和/或其配体HGF作为临床预后指标。cMet基因异常的癌症中，典型的是胃癌和结直肠癌，其中胃癌约10-20％cMet基因拷贝数扩增，约25％cMet基因突变；结直肠癌病人中cMet突变率为约15％。cMet过表达于25％-75％的NSCLC。EGFR-TKI耐药的NSCLC中，15％-30％出现cMet基因获得性扩增，cMet也作为EGFR突变的NSCLC病人中TKI耐药的检测标志物。
针对cMet的靶向药物都是抑制HGF/cMet信号通路，处于临床上试验的主要包括受体酶抑制剂(例如Tivantinib、Capmatinib等)，单克隆抗体(例如Onartuzumab)，以及抗体药物偶联物(例如Telisotuzumab vedotin)。由于许多类型的癌症中cMet突变导致其过表达，NSCLC中EGFR-TKI耐药引发的获得性基因扩增以及cMet抑制剂开发中的耐药性等,针对特定适应症及病人群体的多靶点开发或者联合治疗将有机会提高临床疗效。
抗原结合结构域
在本发明中，嵌合抗原受体CAR的抗原结合结构域特异性结合于肿瘤细胞标志物，比如EGFR、cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、或PD-L1等。CAR的抗原结合结构域是由单克隆抗体的重链和轻链通过不同长度的柔性接头连接形成的单链可变片段(scFv)。svFv序列通常衍生来自于小鼠、人源化或者全人源单克隆抗体。另外，抗原结合结构域也包括由于缺少轻链、较小的，来自于羊驼的重链纳米抗体(VH/nanobody)。scFv或VH对靶点抗原的亲和力对于调节CAR T细胞功能至关重要，但过高的亲和力有可能致使CAR T细胞过度激活而导致细胞死亡。除了亲和力之外，靶抗原的密度和表位也是影响抗原识别以及功效的重要因素。另外，抗原非依赖性的scFv的以及CAR分子在细胞膜上的高表达会诱导CAR分子的聚集，产生抗原非依赖性信号转导(tonic signalling)和脱靶激活，最终可能导致CAR T细胞的早期耗竭。
铰链区和跨膜区
对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。优选地，本发明的CAR中的铰链区为CD8的铰链区，本发明的跨膜区为CD8或CD28的跨膜区。
胞内结构域
本发明的CAR的胞内结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语“细胞内信号传导结构域”通常指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的胞浆序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。
在优选的实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以本身包括CD3ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的胞浆结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。优选地，包括4-1BB(CD137)、CD28等。
本发明的CAR的胞浆信号传导部分内的胞浆信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1BB、和/或CD28的信号传导结构域(共刺激分子)以及CD3ζ的信号传导结构域。
嵌合抗原受体(CAR)
嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好的临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。
CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非MHC限制方式识别。
CAR-免疫细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各国引发了临床研究的热潮。
具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和/或ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和/或ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域和/或CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达肿瘤细胞标志物(比如PSMA、GPC3、GD2、HER2、Mesothelin(MSLN)、CEA、EGFR/EGFRvIII、Claudin18.2、Mucin 1(MUC1)、NKG2D配体、CD19、CD20、BCMA、CD22、CD30、IL3RA、CD38、CD138)的抗体，较佳地为单链抗体。
在一优选实施方式中，本发明CAR的抗原结合部分靶向第一肿瘤细胞标志物和第二肿瘤细胞标志物。在一优选实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部分是靶向cMet的第一scFV和靶向EGFR的第二scFv。
在一优选实施方式中，所述的第一scFv的结构如式A1或A2所示：
VH1-VL1 (A1)；或
VL1-VH1 (A2)；
其中，VL1为抗第一肿瘤细胞标志物抗体的轻链可变区；VH1为抗第一肿瘤细胞标志物抗体的重链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。
在一优选实施方式中，VL1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1中第135－247位所示，且VH1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第1－119位所示。
在一优选实施方式中，所述的第二scFv的结构如式A3或A4所示：
VH2-VL2 (A3)；或
VL2-VH2 (A4)；
其中，VL2为抗第二肿瘤细胞标志物抗体的轻链可变区；VH2为抗第二肿瘤细胞标志物抗体的重链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。
在一优选实施方式中，VL2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5中第135－241位所示，且VH2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5的第1－119位所示。
在一优选实施方式中，第一scFV、第二scFv包含变体形式，所述变体与其野生型的第一scFV、第二scFV序列分别具有≥80％、≥85％、≥90％、≥95％、≥98％或≥99％的同源性。
在本发明中，本发明的第一scFV、第二scFV还包括其保守性变异体，指分别与本发明的第一scFV、第二scFV的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
在本发明中，本发明的第一CAR中的胞内结构域包括CD8的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域。
在本发明中，本发明的第二CAR中的胞内结构域包括CD8或CD28的跨膜区、4-1BB或CD28的共刺激因子。
在本发明的一优选实施方式中，所述第一CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2－4中任一所示。
在本发明的一优选实施方式中，所述第二CAR的氨基酸序列SEQ ID NO.:7－14中任一所示。
在本发明的一优选实施方式中，所述含有第一CAR和第二CAR的融合蛋白(即logicBiCAR)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:22－25中任一所示。
其中，在SEQ ID NO.:22中第1－21位为第一信号肽；第22－268位为靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域(比如靶向cMet的抗体单链可变区序列)；第269－313位为铰链区；第314－337位为跨膜区(如CD8的跨膜区)；第338－449位为CD3ζ，第453－470位是连接肽(如自剪切蛋白)，第471－491位为第二信号肽，第492－732位为靶向第二肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域(比如靶向EGFR的抗体单链可变区序列)；第732－777位为铰链区；第778－804位为跨膜区(如CD28的跨膜区)；第805－845位为共刺激元件(如CD28)。
其中，在SEQ ID NO.:23中第1－21位为第一信号肽；第22－268位为靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域(比如靶向cMet的抗体单链可变区序列)；第269－313位为铰链区；第314－337位为跨膜区(如CD8的跨膜区)；第338－449位为CD3ζ，第453－470位是连接肽(如自剪切蛋白)，第471－491位为第二信号肽，第492－732位为靶向第二肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域(比如靶向EGFR的抗体单链可变区序列)；第733－777位为铰链区；第778－804位为跨膜区(如CD28的跨膜区)；第805－845位为共刺激元件(如CD28)。
其中，在SEQ ID NO.:24中第1－21位为第一信号肽；第22－268位为靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域(比如靶向cMet的抗体单链可变区序列)；第269－313位为铰链区；第314－337位为跨膜区(如CD8的跨膜区)；第338－449位为CD3ζ，第453－470位是连接肽(如自剪切蛋白)，第471－491位为第二信号肽，第495－732位为靶向第二肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域(比如靶向EGFR的抗体单链可变区序列)；第733－777位为铰链区；第778－801位为跨膜区(如CD8的跨膜区)；第802－843位为共刺激元件(如4-1BB)。
其中，在SEQ ID NO.:25中第1－21位为第一信号肽；第22－268位为靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域(比如靶向cMet的抗体单链可变区序列)；第269－313位为铰链区；第314－337位为跨膜区(如CD8的跨膜区)；第338－449位为CD3ζ，第453－470位是连接肽(如自剪切蛋白)，第471－491位为第二信号肽，第495－732位为靶向第二肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域(比如靶向EGFR的抗体单链可变区序列)；第733－777位为铰链区；第778－801位为跨膜区(如CD8的跨膜区)；第802－843位为共刺激元件(如4-1BB)。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)
如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明所述的CAR-T细胞，本发明CAR-T细胞可靶向肿瘤表面抗原(如PSMA)，用来治疗PSMA高表达或阳性的肿瘤，尤其是实体瘤。
CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。
在本发明中，本发明的含有第一CAR和第二CAR的融合蛋白(即logicBiCAR)包含(i)胞外结构域，其包含靶向第一肿瘤细胞表面抗原的抗原；(ii)第一绞链区；(iii)第一跨膜域；(iv)任选的第一共刺激因子；和(iv)CD3ζ的信号传导结构域；以及；(v)连接肽(如自剪切蛋白)；(vi)胞外结构域，其包含靶向第二肿瘤细胞表面抗原的抗原；(ii)第二绞链区；(iii)第二跨膜域；和(iv)第二共刺激因子。
嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M细胞)
如本文所用，术语“CAR-M细胞”、“CAR-M”、“本发明CAR-M细胞”均指本发明所述的CAR-M细胞，本发明CAR-M细胞可靶向肿瘤表面抗原(如cMet和EGFR)，用来治疗肿瘤抗原(比如cMet和EGFR)高表达或阳性的肿瘤，尤其是实体瘤。
巨噬细胞是先天免疫系统的主要效应器和调节者，具有吞噬能力，能够分泌促炎因子，将抗原呈递给T细胞激活免疫系统。
CAR-M相比于CART，其本身就可以体外直接杀死抗原特异性肿瘤细胞，体内抑制肿瘤生长，重塑肿瘤微环境，具有良好的抗肿瘤活性，此外，CAR-M还具有抗原呈递能力，将肿瘤细胞抗原呈递并激活内源T细胞。
嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)
如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可靶向肿瘤表面抗原(如cMet和EGFR)，用于治疗cMet和EGFR高表达或阳性的肿瘤，尤其是实体瘤。
自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。
与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。
外源T细胞抗原受体
如本文所用，外源T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)为通过基因转移技术从肿瘤反应性T细胞中克隆出TCR的α链和β链，通过基因工程的手段，以慢病毒或逆转录病毒为载体，外源性转入到T细胞内的TCR。
外源TCR修饰的T细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞，并通过优化TCR与肿瘤性特异性抗原的亲和力，可以提高T细胞与肿瘤的亲和力，提高抗肿瘤效果。
载体
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以启动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
制剂
本发明提供了一种本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞、以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/Kg体重，更优地1×104-1×107个细胞/Kg体重。
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
治疗性应用
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物(比如cMet、EGFR)蛋白，协同激活T细胞，引起细胞免疫应答，从而选择性杀伤肿瘤细胞，比如cMet和EGFR高表达的肿瘤细胞。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，肿瘤细胞的标志物(比如cMet、EGFR)的CAR-T细胞引起抗表达肿瘤细胞的标志物(比如cMet、EGFR)的细胞的特异性免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括靶向第一肿瘤细胞表面抗原的抗原结合域、铰链和跨膜区、和CD3ζ信号传导结构域、T2A、靶向第二肿瘤细胞表面抗原的抗原结合域、铰链和跨膜区、和4－1BB/CD28的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成每一部分中的任意数量的变化。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括前列腺癌、肝癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、卵巢癌。
本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的T细胞(如，本发明的CAR-T细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
融合蛋白
如本文所用，术语“融合蛋白”、“本发明融合蛋白”、和“本发明的多肽”、“logicBiCAR”具有相同的含义，均具有本发明第八方面所述的结构。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:22－25中任一所示。
如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO.:22－25中任一所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:22－25中任一所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:22－25中任一所示。
编码序列
本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:22－25中任一所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:22－25中任一所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。
本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明融合蛋白的功能。
编码本发明的融合蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:26－29中任一所示。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术在所述NK细胞上表达本发明融合蛋白的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的NK细胞。一般来说包括步骤：将本发明所述的第一表达盒和/或第二表达盒转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择NK细胞为宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的主要优点包括：
1.本发明首次发现含有靶向第一肿瘤细胞标志物(比如cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47)的第一CAR和靶向第二肿瘤细胞标志物(比如，EGFR、EpCAM、Her2、Her3)的第二CAR的工程化免疫细胞可被充分激活，增强靶向特异性，发挥抗肿瘤功效，并且降低在靶/脱肿瘤(on target/off tumor)毒性，提高细胞治疗的安全性。
2.本发明首次发现，本发明的免疫细胞能同时识别EGFR和cMet这2个不同的抗原，增强CAR T细胞靶向肿瘤的特异性和选择性，以及在肿瘤中的归巢。另外，可同时抑制两个致病信号通路，从而抑制疾病进展，提高生存期。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
通用方法
慢病毒颗粒制备
将处于对数生长期的293T细胞以7E6/dish的密度接种至10cm培养皿中，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜后用于转染，培养基为含有10％FBS的DMEM培养基。次日，于转染前更换为新鲜的DMEM培养基。转染步骤如下：将目的基因质粒例如pWPXLd-cMET-EGFP、pWPXLd-EGFR-BFP或pWPXLd-CAR，分别与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G，融入Opti-MEM培养基中混匀；再加入DNA转染试剂混匀；逐滴加入培养皿中，培养6hr；更换含有10％FBS的DMEM培养基；72hr后收集上清，离心、过滤、分装；冻存于-80℃，以待滴度测定或细胞感染。
CAR T细胞制备
由健康人外周血通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞。PBMC的T细胞于加入CD3单抗和重组人IL-2的淋巴细胞培养基中刺激活化；活化后，添加重组慢病毒及Polybrene进行转导；在37℃、5％CO2培养箱中孵育后进行离心换液，进行细胞计数及传代培养。
通过流式检测CAR表达
在CAR T细胞培养至第7天时，取1E6细胞，清洗细胞2次；分别或者共同添加1ugMET-His、1ug EGFR-Fc抗原于4℃孵育30m；洗涤2次，随后分别添加Anti-His-PE和Allophycocyanin AffiniPure Goat Anti-Human IgG于4℃孵育30m；然后洗涤细胞2次后使用流式细胞术检测各不同CAR表达。
抗原稳转293T细胞的制备与单克隆筛选
将293T细胞按照合适的密度接种于6孔板中，加入未浓缩的含有目的抗原基因的慢病毒颗粒进行感染，感染24hr后更换培养基，之后进行传代培养。将感染后的293T细胞通过流式细胞仪分选法分选出表达目的基因的克隆池(pool)或通过有限稀释法进行单克隆筛选，之后将分选出的pool或单克隆细胞进行目的基因的表达鉴定。步骤如下：取1E6细胞，洗涤2次后，加入PE Mouse Anti-Human EGF Receptor clone EGFR.1和Alexa
Figure BDA0002989465800000341
647Mouse Anti-Human c-Met Clone 3D6在4℃孵育30m后，洗涤细胞2次后使用流式细胞仪进行检测。
CCK8法测定细胞毒性
使用CCK8试剂盒对CAR-T细胞进行毒性测定。收集处于对数生长期的靶细胞及采用培养至第7天的CAR T细胞制备不同细胞密度的细胞悬液；靶细胞按照5000cells/well进行铺板(3复孔)，然后以不同设置的效靶比添加CAR T细胞悬液，并孵育24hr；然后每孔添加CCK8，反应4h；用酶标仪测定其在450nm波长下的吸光度。
分泌型的带有HiBiT标签蛋白检测法(HiBiT Extracellular Detection System，Promega)测定细胞毒性
收集处于对数生长期的携带HaloTag-HiBiT标签的靶细胞(包括293T-HaloTag-HiBiT、293T-HaloTag-HiBiT-EGFR、293T-HaloTag-HiBiT-cMet、293T-HaloTag-HiBiT-EGFR-cMet&EGFR、H1975-Halotag-HiBiT、H1975-HaloTag-HiBiT)及培养至第7天的CAR T细胞制备不同细胞密度的细胞悬液；靶细胞按照5000cells/well进行铺板(3复孔)，然后以不同设置的效靶比添加CAR T细胞悬液，孵育24h；使用酶标仪检测luminescence。最大释放的阳性对照组中加入一定终浓度的digitonin孵育30m后，将孔板从培养箱中取出，晾至常温后，加入等体积的预先配制好的检测Buffer(含有1：100倍稀释的LgBiT Protein和1：50倍稀释的
Figure BDA0002989465800000351
HiBiT Extracellular Substrate)，在摇床上混匀后，使用酶标仪检测luminescence。
Cytation 5全自动细胞成像多功能酶标仪系统测定细胞毒性
取处于对数生长期的NHEK细胞，重悬于预热好的指定的NHEK细胞培养基中；加入染料CellTrackerTM Deep Red dye，孵育30m；离心弃上清，制备一定细胞密度的NHEK细胞悬液，接种于黑色透明底的96孔板中孵育过夜；将孔板置于Cytation 5中进行活细胞数量的监测；1hr后不同设置的效靶比添加CAR T细胞悬液，进行靶细胞活细胞数量的实时、动态监测。
实施例1
病毒制备：将慢病毒目的基因质粒pWPXLd-CAR与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G加入X-tremeGENE 9DNA Transfection Reagent(Roche)中混匀，加入培养293T细胞的培养皿中，轻轻混匀，72h后收集上清，1000g低速离心、0.45um滤膜过滤后，直接分装或使用超滤管浓缩后分装，冻存于-80℃，以待细胞感染。
CAR T细胞制备：由健康人外周血通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获取外周血单个核细胞，并将其接种至含有CD3单抗(Miltenyi Biotec)和IL-2(GE Healthcare)的淋巴细胞培养基(Gibco)中刺激活化。然后，添加重组慢病毒以及polybrene(Sigma)转导细胞，并置于37℃、饱和湿度的5％CO2培养箱中进行传代培养。结果如图1所示，结果表明，图1A示出了靶向EGFR和cMet“和”逻辑BiCAR的组成，包括2个独立的CAR分子，为抗cMet的scFv串联CD3ζ激活信号结构域的CAR(SEQ ID NO.:2所示，其中SEQ ID NO.:3－4为抗cMet的全功能2G单CAR)组合抗EGFR的scFv串联4-1BB或者CD28共刺激信号结构域的CAR(如SEQ IDNO.:7－10中任一所示，其中SEQ ID NO.:11-14为抗EGFR的全功能2G单CAR)；图1B示出“和”逻辑BiCAR表达的分子构建连接示意图(如SEQ ID NO.:22－25中任一所示)；图1C示出了靶向cMet的第二代全功能CAR的组成，scFv串联4-1BB或CD28以及CD3ζ(如SEQ ID NO.:3-4中任一所示)；图1D示出了靶向EGFR的第二代全功能CAR的组成，scFv串联4-1BB或CD28以及CD3ζ(如SEQ ID NO.:11-14中任一所示)。
实施例2
流式检测CAR分子的表达：在CAR T细胞培养至第7天时候，取1E6的细胞，使用洗涤缓冲液将细胞洗涤2次后，添加1ug cMet-His(Acrobiosystem)和或1ug EGFR-Fc抗原(Acrobiosystem)在4℃孵育30m后，使用洗涤缓冲液洗涤2次，随后添加Anti-His-PE(BD)和Allophycocyanin(APC)AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγfragment specific(Jackson ImmunoResearch)在4℃孵育30m。将细胞洗涤2次后使用流式细胞术(CytoFLEXLX,Beckman Coulter)检测CAR的表达。
结果如图2所示，通过流式检测CAR T细胞中CAR分子的表达。图2A示出由于Mock T细胞并没有进行任何CAR分子的转导，因此不存在第一CAR(anti-cMet-scFv-CD3ζ/M-z)或第二CAR分子(anti-EGFR-scFv-CD28/E-28)。图2B显示了只表达第二CAR分子E-28CAR T具有24％的细胞转导率；图2C示出了针对EGFR靶点的全功能二代CAR T(anti-EGFR-scFv-CD28-CD3ζ/E-28z)具有27％的细胞转导率；图2D显示了表达第一CAR分子M-z的CAR T具有28％的细胞转导率；图2E示出了针对cMet靶点的全功能二代CAR T(anti-cMet-scFv-CD28-CD3ζ/M-28z)具有26％的转导率；图2F示出了“和”逻辑BiCAR T细胞中，第一CAR分子M-z和第二CAR分子E-28共表达的转导率为35％。
实施例3
EGFR和或cMet稳转细胞株293T的制备与单克隆筛选：将培养的293T细胞中加入含有目的基因EGFR和或cMet的慢病毒颗粒进行感染，24h后更换培养基并进行传代培养。然后将感染后的293T细胞通过流式细胞仪分选出表达目的基因的池克隆(pool)或通过有限稀释法进行单克隆筛选。之后将分选出的pool或单克隆细胞通过流式细胞仪进行目的基因表达鉴定。
Figure BDA0002989465800000361
HiBiT Extracellular Detection System(Promega)方法检测细胞毒性：分别收集处于对数生长期的携带HaloTag-HiBiT标签的靶细胞293T-Halotag-HiBiT、293T-Halotag-HiBiT-EGFR、293T-Halotag-HiBiT-cMet、293T-Halotag-HiBiT-Met&EGFR及培养至第7天的CAR T细胞以制备不同细胞密度的细胞悬液。取相应靶细胞进行铺板(3复孔)，然后以3:1、1:1、1:3和1:10的效靶比添加CAR T细胞悬液，孵育24h后，加入等体积预先配制好的
Figure BDA0002989465800000371
HiBiT Extracellular Buffer(含有1:100倍稀释的LgBiT Protein和1:50倍稀释的
Figure BDA0002989465800000372
HiBiT Extracel lular Substrate)，在摇床上混匀，使用酶标仪(Thermo Varioskan LUX)检测化学发光(luminescence)。
结果如图3所示，结果表明由于不存在CD3ζ信号激活功能结构域，MockT及E-28CART对于任何检测的靶向细胞及效靶比都没有特异性的裂解毒性(图3A-3D)；M-z、M-28z和BiCAR T对于cMet单一靶点或者EGFR和cMet共表达的稳转细胞株呈现了剂量依赖的、特异的体外杀伤功能(图3C,3D)；并且BiCAR较于一代M-z或二代M-28z CAR T具有增强的细胞裂解毒性(图3C,3D)。
实施例4
IFN-r细胞因子检测(Human IFN-r Quantikine ELISA Kit,R&D Systems)：分别收集处于对数生长期的携带HaloTag-HiBiT标签的靶细胞293T-Halotag-HiBiT、293T-Halotag-HiBiT-EGFR、293T-Halotag-HiBiT-cMet、293T-Halotag-HiBiT-Met&EGFR及培养至第7天的CAR T细胞以制备不同细胞密度的细胞悬液。相应靶细胞进行铺板(3复孔)，然后以3:1、1:1、1:3和1:10的效靶比添加CAR T细胞悬液，孵育24h后,取上清加入酶标液孵育2h，然后加入显色液室温避光显色30m，再加入终止液终止反应，再用酶标仪测定在450nm波长下的吸光度。
结果如图4A-4D所示，结果表明，与仅表达cMet单一抗原的靶细胞相比，BiCAR T对共表达EGFR和cMet抗原靶细胞的IFN-r分泌增强，并且优于全功能的二代M-28z CAR T；然而对于一代M-z CAR T，由于不存在共刺激信号结构域，相较于BiCAR或M-28z CAR T，其产生非常有限的IFN-r的分泌；Mock T及E-28CAR T针对靶细胞没有杀伤活性，也不特异地分泌IFN-r。简单概括，“和”逻辑BiCAR对于EGFR和cMet这2个靶点同时存在的靶细胞，起到协同增强的细胞毒性效应功能，意味着其具有高度选择性的抗肿瘤功效。
实施例5
使用细胞成像多功能酶标仪Cytation 5(Biotek)对CAR-T细胞进行毒性测定：取对数生长期的NHEK重悬于NHEK细胞培养基(含有Keratinocyte Growth Kit的Dermal CellBasal Medium，ATCC)中，并添加CellTrackerTM Deep Red dye(Invitrogen)，孵育30m后，离心、弃上清，制备一定细胞密度的NHEK细胞悬液，接种于黑色透明底的96孔板中置于培养箱中孵育过夜。然后将孔板置于细胞成像多功能酶标仪上进行活细胞数量的监测，1h后按照3:1、1:1、1:3和1:10的效靶比添加CAR T细胞，继续进行靶细胞活细胞数量的监测。
结果如图5A-5D所示，结果表明，与二代E-28z、M-28z CAR T，或者是一代M-z CART相比，BiCAR T都最大限度地降低了对NHEK细胞的裂解毒性。“和”逻辑的BiCAR可以有效地降低或者避免对于人正常组织的靶点毒性，例如对人的皮肤毒性，具有潜在的更好的安全性。
实施例6
CCK8方法(同仁化学研究所)检测细胞毒性：收集处于对数生长期的人胃癌细胞SUN5及培养至第7天的CAR T细胞。靶细胞进行铺板(3复孔)后，以10：1、3:1、1：1、1：3和1：10的效靶比添加CAR T细胞悬液，于培养箱中共孵育24h后，添加CCK8，反应4h后，用酶标仪测定在450nm波长下的吸光度。
结果如图6A-6B所示，结果表明，BiCAR T产生对于SNU5细胞特异的、剂量依赖的裂解功能，并且强于M-28z和M-z CAR T；然而，Mock T及E-28CAR T并没有对靶细胞产生特异的效应功能。
实施例7
CCK8方法检测细胞毒性：收集处于对数生长期的人肺腺癌细胞H1993及培养至第7天的CAR T细胞。靶细胞进行铺板(3复孔)后，以3:1、1：1、1：3和1：10的效靶比添加CAR T细胞悬液，于培养箱中共孵育24h后，添加CCK8，反应4h后，用酶标仪测定在450nm波长下的吸光度。
结果如图7所示，结果表明，BiCAR呈现对H1993剂量依赖的特异性杀伤，并且体外功效优于M-28z和M-z；然而，Mock T及E-28CAR T对靶细胞没有裂解活性。
实施例8
Figure BDA0002989465800000391
HiBiT Extracellular Detection System(Promega)方法检测细胞毒性：收集处于对数生长期的携带HaloTag-HiBiT标签的肺腺癌细胞株H1975及培养至第7天的CAR T细胞制备不同细胞密度的细胞悬液。取相应靶细胞进行铺板(3复孔)，然后以3:1、1:1、1:3和1:10的效靶比添加CAR T细胞悬液，孵育24h后，加入等体积的预先配制好的
Figure BDA0002989465800000392
HiBiT Extracellular Buffer，在摇床上混匀，使用酶标仪检测luminescence。。
结果如图8所示，结果表明，BiCAR T细胞对于H1975肿瘤细胞具有剂量依赖性的、特异的裂解活性，其细胞毒性与M-28z CAR相当，并且都强于一代M-z CAR T细胞。
实施例9
CCK8方法检测细胞毒性：收集处于对数生长期的人肺腺癌细胞H820及培养至第7天的CAR T细胞。靶细胞进行铺板(3复孔)后，以3:1、1：1、1：3和1：10的效靶比添加CAR T细胞悬液，于培养箱中共孵育24h后，添加CCK8，反应4h后，用酶标仪测定在450nm波长下的吸光度。
结果如图9所示，结果表明BiCAR T细胞对于H820肿瘤细胞具有剂量依赖的、特异的体外杀伤功能，其作用优于M-28z或者M-z CAR T；然而，Mock T、E-28CAR T并没有呈现对靶细胞特异性的杀伤功效。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 复星凯特生物科技有限公司
<120> 抗EGFR和cMet双特异性嵌合抗原受体及其应用
<130> P2020-2816
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
180 185 190
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln
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<210> 2
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Phe Asn Pro Asn Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
165 170 175
Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Ser Ser Gln Lys Asn
180 185 190
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
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Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Tyr Pro
245 250 255
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro
260 265 270
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275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val
305 310 315 320
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
325 330 335
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
340 345 350
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355 360 365
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Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
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Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
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450 455 460
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
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Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
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275 280 285
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Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
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Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
385 390 395 400
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
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Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
420 425 430
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
435 440 445
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
450 455 460
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305 310 315 320
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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245 250 255
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325 330 335
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
405 410 415
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420 425 430
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<210> 12
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
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100 105 110
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130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
195 200 205
Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
210 215 220
Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
290 295 300
Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
305 310 315 320
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg
325 330 335
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
340 345 350
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355 360 365
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405 410 415
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
420 425 430
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
435 440 445
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
450 455 460
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
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50 55 60
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65 70 75 80
Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys
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100 105 110
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275 280 285
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325 330 335
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
340 345 350
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450 455 460
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<211> 845
<212> PRT
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<400> 23
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Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
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Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
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Cys Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
340 345 350
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
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Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
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Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser
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Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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<212> PRT
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
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165 170 175
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
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245 250 255
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
385 390 395 400
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
405 410 415
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
420 425 430
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
435 440 445
Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile
530 535 540
Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu
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Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
565 570 575
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Arg
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Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
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Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro
725 730 735
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740 745 750
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
755 760 765
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
770 775 780
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
785 790 795 800
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
805 810 815
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
820 825 830
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
835 840
<210> 25
<211> 843
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg
65 70 75 80
Phe Asn Pro Asn Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
165 170 175
Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Ser Ser Gln Lys Asn
180 185 190
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Tyr Pro
245 250 255
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
340 345 350
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
355 360 365
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
370 375 380
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
385 390 395 400
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
405 410 415
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
420 425 430
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
435 440 445
Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
450 455 460
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu
465 470 475 480
Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Lys
485 490 495
Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr
500 505 510
Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val
515 520 525
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser
530 535 540
Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile
545 550 555 560
Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu
565 570 575
Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr
580 585 590
Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
595 600 605
Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
610 615 620
Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro
625 630 635 640
Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr
645 650 655
Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu
660 665 670
Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser
675 680 685
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu
690 695 700
Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro
705 710 715 720
Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Thr Thr Thr Pro
725 730 735
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
740 745 750
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
755 760 765
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
770 775 780
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
785 790 795 800
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
805 810 815
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
820 825 830
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
835 840
<210> 26
<211> 2538
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctggtgga gtccggcgga ggactggtgc aacctggcgg aagcctcagg 120
ctcagctgtg ccgctagcgg atacacattc acctcctact ggctccactg ggtgagacag 180
gcccctggca agggactgga gtgggtcgga atgatcgacc cttccaatag cgacaccagg 240
ttcaacccca acttcaagga taggttcaca atctccgccg acaccagcaa gaataccgct 300
tacctgcaga tgaattccct gagggctgag gacaccgccg tgtactactg cgccacatac 360
agaagctacg tgacccctct ggactactgg ggccagggca cactggtgac agtgtccagc 420
ggaggaggag gaagcggagg aggaggcagc ggaggaggag gatccgacat ccagatgaca 480
cagagccctt cctccctgag cgctagcgtg ggagacaggg tgaccatcac ctgtaagagc 540
tcccagtccc tgctgtacac ctccagccag aagaattacc tggcctggta ccagcagaag 600
cccggaaaag cccccaagct gctgatctac tgggctagca caagagagtc cggcgtgccc 660
agcagattta gcggcagcgg atccggcacc gactttaccc tgacaatcag cagcctccag 720
cctgaagact tcgccaccta ctactgccag cagtactacg cctatccttg gaccttcggc 780
caaggcacaa aggtggagat caagaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg cagagtgaag 1020
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1080
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1140
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1200
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1260
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1320
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgcggc ggcggcgagg gcagaggaag tctgctaaca 1380
tgcggtgacg tcgaggagaa tcctggccca atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg 1440
ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg ccgcaagtgc aactgcaaga gtccggaccc 1500
ggactggtga agcccagcga gacactgtct ctgacatgta cagtgtccgg aggatccgtg 1560
tcctccggcg actattactg gacatggatc agacagtccc ccggcaaggg actggagtgg 1620
atcggacaca tctactattc cggcaacacc aactacaacc cctctctgaa gagcagactg 1680
accatcagca tcgacacctc caagacccag ttttctctga agctgagctc cgtgaccgct 1740
gccgacacag ccatctacta ctgcgtgagg gatagagtga ccggcgcctt tgacatttgg 1800
ggacaaggca ccatggtgac cgtcagcagc ggaggaggag gaagcggcgg aggaggcagc 1860
ggaggcggag gaagcgacat ccagatgacc cagagcccta gctctctgag cgctagcgtg 1920
ggcgacagag tgaccatcac atgccaagcc tcccaagaca tttccaacta tctgaactgg 1980
taccagcaga aacccggcaa ggcccccaag ctgctgattt acgacgccag caatctggag 2040
accggcgtgc cttctagatt tagcggcagc ggatccggca ccgacttcac attcaccatc 2100
tcctctctgc aacccgagga catcgccacc tacttctgcc aacactttga ccatctgcct 2160
ctggcctttg gcggaggcac caaggtggag atcaagacca cgacgccagc gccgcgacca 2220
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 2280
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tttttgggtg 2340
ctggtggtgg ttgggggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt 2400
attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact 2460
ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc 2520
gcagcctatc gctcctga 2538
<210> 27
<211> 2538
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctggtgga gtccggcgga ggactggtgc aacctggcgg aagcctcagg 120
ctcagctgtg ccgctagcgg atacacattc acctcctact ggctccactg ggtgagacag 180
gcccctggca agggactgga gtgggtcgga atgatcgacc cttccaatag cgacaccagg 240
ttcaacccca acttcaagga taggttcaca atctccgccg acaccagcaa gaataccgct 300
tacctgcaga tgaattccct gagggctgag gacaccgccg tgtactactg cgccacatac 360
agaagctacg tgacccctct ggactactgg ggccagggca cactggtgac agtgtccagc 420
ggaggaggag gaagcggagg aggaggcagc ggaggaggag gatccgacat ccagatgaca 480
cagagccctt cctccctgag cgctagcgtg ggagacaggg tgaccatcac ctgtaagagc 540
tcccagtccc tgctgtacac ctccagccag aagaattacc tggcctggta ccagcagaag 600
cccggaaaag cccccaagct gctgatctac tgggctagca caagagagtc cggcgtgccc 660
agcagattta gcggcagcgg atccggcacc gactttaccc tgacaatcag cagcctccag 720
cctgaagact tcgccaccta ctactgccag cagtactacg cctatccttg gaccttcggc 780
caaggcacaa aggtggagat caagaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
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ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1140
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tgcggtgacg tcgaggagaa tcctggccca atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg 1440
ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg ccgcaagtgc aacttaaaca atcaggacct 1500
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gcagcctatc gctcctga 2538
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<211> 2532
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
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<210> 29
<211> 2532
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
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tcccagtccc tgctgtacac ctccagccag aagaattacc tggcctggta ccagcagaag 600
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caaggcacaa aggtggagat caagaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
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gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg cagagtgaag 1020
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1080
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tgtgaactgt ga 2532

Claims (10)

1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞表达第一CAR和第二CAR，所述第一CAR靶向第一肿瘤细胞标志物，所述第二CAR靶向第二肿瘤细胞标志物，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47、或其组合；所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合。
2.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述第一CAR的结构如式I所示：
L1-S1-H1-TM1-C1-CD3ζ (I)
式中，所述“-”为连接肽或肽键；
L1为无或第一信号肽序列；
S1为靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47、或其组合；
H1为无或第一铰链区；
TM1为第一跨膜结构域；
C1为无或第一共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
3.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述第二CAR的结构如式II所示：
L2-S2-H2-TM2-C2-Z2 (II)
式中，所述“-”为连接肽或肽键；
L2为无或第二信号肽序列；
S2为靶向第二肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合；
H2为无或第二铰链区；
TM2为第二跨膜结构域；
C2为第二共刺激信号分子；
Z2为无或源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
4.一种制备权利要求1所述的工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)提供一待改造的免疫细胞；和
(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达第一CAR和第二CAR，所述第一CAR靶向第一肿瘤细胞标志物，所述第二CAR靶向第二肿瘤细胞标志物，从而获得权利要求1所述的工程化的免疫细胞。
5.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
6.一种如权利要求1所述的工程化的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备选择性杀伤肿瘤的药物或制剂。
7.一种用于选择性杀伤肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：
(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达靶向第一肿瘤细胞标志物的第一CAR的第一表达盒，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47、或其组合；和
(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有靶向第二肿瘤细胞标志物的第二CAR的第二表达盒，所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合。
8.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含靶向第一肿瘤细胞标志物的第一CAR和靶向第二肿瘤细胞标志物的第二CAR，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47、或其组合；所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合。
9.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求8所述的融合蛋白。
10.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求9所述的多核苷酸。
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