CN112778427B - 双特异性cs1-bcma car-t细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种双特异性CS1‑BCMA CAR‑T细胞及其应用。具体地，本发明提供了一种双特异性CAR，其包含CS1scFv和BCMA scFv，以及4‑1BB共刺激域和CD3激活域。本发明的双特异性CAR‑T细胞对CS1阳性靶细胞和BCMA阳性靶细胞有显著的杀伤作用，能够针对靶细胞分泌IFN‑γ，并在体内实验中，显著抑制RPMI8226异种移植肿瘤的生长。本发明还提供了上述双特异性CAR‑T细胞的制备方法和应用。

Description

双特异性CS1-BCMA CAR-T细胞及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种双特异性CS1-BCMA CAR-T细胞及其应用。
背景技术
免疫疗法正在成为一种非常有前景的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞是免疫系统的有效武器，能够持续性地从正常细胞中搜寻外来抗原或非正常细胞(如癌细胞或被感染细胞)。用CAR(嵌合抗原受体)构建物对T细胞进行遗传修饰是设计肿瘤特异性T细胞的最常见方法。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞输入患者(称为过继细胞转移或ACT)，代表了一种有效的免疫治疗方法。与化学疗法或抗体相比，CAR-T技术的优势在于重新编程的工程化T细胞可以在患者中增殖并持续存在(“活的药物”)。
通常，CAR包括位于N端的单克隆抗体衍生的单链可变片段(scFv)，铰链区，跨膜结构域，若干个胞内共刺激结构域((i)CD28，(ii)CD137(4-1BB)，CD27或其他共刺激域)，以及串联的CD3-zeta激活结构域(图1)。CAR从第一代(没有共刺激域)发展到第二代(有一个共同刺激域)再到第三代CAR(有多个共刺激域)。具有多个共刺激域的CAR(即所谓的第三代CAR)可以使CAR-T细胞的细胞毒性增强，并显著改善CAR-T细胞的持续性，表现出增强的抗肿瘤活性。
目前，CAR-T疗法对于实体肿瘤的治疗还存在诸多挑战，包括：缺乏理想的治疗靶点、归巢障碍、以及免疫抑制微环境导致的CAR-T细胞持久性表现不良等。因此，本领域还需要开发新的用于实体瘤的CAR-T细胞和治疗方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双特异性CS1-BCMA CAR-T细胞及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种双特异性嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体的结构如下式I所示：
L-scFv1-I-scFv2-H-TM-C-CD3ζ (I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为任选的信号肽序列；
I为柔性接头；
H为任选的铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
scFv1和scFv2两者中一个为靶向CS1的抗原结合结构域，另一个为靶向BCMA的抗原结合结构域。
在另一优选例中，所述scFv1为靶向CS1的抗原结合结构域，所述scFv2为靶向BCMA的抗原结合结构域。
在另一优选例中，所述靶向CS1的抗原结合结构域的结构如下式A或式B所示：
VH1-VL1 (A)；VL1-VH1 (B)
式中，VH1为抗CS1抗体重链可变区；VL1为抗CS1抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述靶向CS1的抗原结合结构域的结构如式A所示。
在另一优选例中，所述的VH1和VL1通过柔性接头(或连接肽)相连，所述的柔性接头(或连接肽)为1-4个连续的SEQ ID NO:6(GGGGS)所示的序列，较佳地2-4个，更佳地3-4个。
在另一优选例中，所述抗CS1抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗CS1抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中，所述靶向BCMA的抗原结合结构域的结构如下式C或式D所示：
VL2-VH2 (C)；VH2-VL2 (D)
式中，VL2为抗BCMA抗体轻链可变区；VH2为抗BCMA抗体重链可变区；“-”为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述靶向BCMA的抗原结合结构域的结构如式C所示。
在另一优选例中，所述的VL2和VH2通过柔性接头(或连接肽)相连，所述的柔性接头(或连接肽)为1-4个连续的SEQ ID NO:6(GGGGS)所示的序列，较佳地2-4个，更佳地3-4个。
在另一优选例中，所述抗BCMA抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示，所述抗BCMA抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中，所述的scFv1和/或scFv2为鼠源、人源、人源和鼠源嵌合、或者全人源化的单链抗体可变区片段。
在另一优选例中，所述柔性接头I的序列包含2-6个，较佳地为3-4个连续的SEQ IDNO:6(GGGGS)所示的序列。
在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述的L为CD8来源的信号肽。
在另一优选例中，L的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述的H为CD8来源的铰链区。
在另一优选例中，H的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsi lon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、GD2、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。
在另一优选例中，所述的TM为CD28来源的跨膜区。
在另一优选例中，TM的序列如SEQ ID NO:9所示。
在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。
在另一优选例中，所述的C为4-1BB来源的共刺激信号分子。
在另一优选例中，所述的4-1BB来源的共刺激信号分子的氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示。
在另一优选例中，CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(CAR)。
在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。
在另一优选例中，所述核酸分子的5’端还包含启动子序列，较佳地为MNDU3启动子。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。
在另一优选例中，所述载体为病毒颗粒的形式。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述慢病毒载体中包含启动子，较佳地，所述启动子选自下组：MNDU3启动子、EF-1alpha、CMV启动子、或其组合。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子或表达本发明第一方面所述的CAR。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括大肠杆菌。
在本发明的第五方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述的免疫细胞表达有本发明第一方面所述的CAR。
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在另一优选例中，所述细胞包括T细胞、NK细胞。
在另一优选例中，所述细胞为CAR-T细胞或CAR-NK细胞，较佳地为CAR-T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞中CAR与细胞自杀元件共表达。
在本发明的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第五方面所述的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。
在另一优选例中，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包含抗肿瘤的第二活性成分，较佳地包括第二抗体、或化疗剂。
在另一优选例中，所述的化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。
在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第五方面所述的免疫细胞、或本发明第六方面所述的制剂的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤为CS1和/或BCMA阳性肿瘤。
在另一优选例中，所述的CS1和/或BCMA阳性肿瘤包括多发性骨肉瘤。
在本发明的第八方面，提供了一种用于制备本发明第四方面所述的宿主细胞或第五方面所述工程化的免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第二方面所述的核酸分子、或本发明第三方面所述的载体。
在本发明的第九方面，提供了一种制备工程化的免疫细胞的方法，所述的免疫细胞表达本发明第一方面所述的CAR，所述方法包括以下步骤：
(a)提供待改造的免疫细胞；和
(b)将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入所述免疫细胞内，从而获得所述工程化的免疫细胞。
在另一优选例中，所述工程化的免疫细胞为CAR-T细胞或CAR-NK细胞。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第三方面所述的载体、本发明第五方面所述的免疫细胞、或本发明第六方面所述的制剂。
在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了CAR的结构。其中，图的左边是第一代CAR(没有共刺激域)，中间是第二代CAR(一个共刺激结构域CD28或者4-BB)，右边是第三代CAR(两个或多个共刺激结构域)。
图2显示了CS1和BCMA抗原的序列。
图3显示了双特异性CS1-BCMA CAR构建物的结构。其中，使用第二代CAR结构和4-1BB共刺激结构域。
图4显示了CAR阳性细胞的百分比。其中，利用小鼠FAB抗体和生物素-PE标记的BCMA重组蛋白通过FACS检测CAR+细胞，FAB抗体检测到>95％的CAR+细胞，BCMA蛋白检测到>80％的BCMA+ScFv细胞。
图5显示了CS1-BCMA-CAR-T细胞的表达和杀伤情况。图5A显示CHO-BCMA，CHO-CS1和Hela-CS1细胞稳定表达BCMA和CS1抗原。其中，在CHO-BCMA细胞上用同种型和BCMA抗体进行FACS检测，在CHO-CS1细胞和Hela-CS1细胞上用CS1抗体进行FACS检测，同种型Ab标记为蓝色；CS1和BCMA Ab标记为红色。图5B显示CS1-BCMA-CAR-T细胞特异性杀伤CHO-CS1细胞。细胞毒性试验显示，CS1-BCMA-CAR-T细胞杀伤CHO-CS1细胞。其中，BCMA-CAR-T细胞和MockCAR-T细胞用作阴性对照。
图6显示CS1-BCMA-CAR-T细胞杀伤Hela-CS1细胞。其中，Mock CAR-T细胞和BCMA-CAR-T细胞用作阴性对照。
图7显示CS1-BCMA-CAR-T细胞杀伤CHO-BCMA细胞。细胞毒性试验显示，CS1-BCMA-CAR-T细胞杀伤CHO-BCMA靶细胞。其中，BCMA-CAR-T细胞用作阳性对照，Mock CAR-T细胞用作阴性对照。
图8显示CS1-BCMA-CAR-T细胞对Hela-BCMA细胞的杀伤作用明显强于对Hela细胞的杀伤作用。细胞毒性试验显示，CS1-BCMA-CAR-T细胞杀伤Hela-BCMA靶细胞。BCMA-CAR-T细胞用作阳性对照，Mock CAR-T细胞用作阴性对照。
图9显示CS1-BCMA-CAR-T细胞针对CHO-CS1和CHO-BCMA靶细胞分泌高水平的IFN-γ，针对CHO细胞不分泌IFN-γ。*p<0.05，根据Student’s t检验，CS1-BCMA-CAR-T细胞与Mock CAR-T细胞相比。
图10显示CS1-BCMA-CAR-T细胞针对Hela-CS1细胞和Hela-BCMA细胞分泌IFN-γ。*p<0.05，根据Student’s t检验，CS1-BCMA-CAR-T细胞与Mock CAR-T细胞相比。
图11显示了用小鼠FAB和生物素化的重组BCMA蛋白进行FACS检测的三种不同供体来源的CAR+细胞的检测结果。其中，图11A显示了供体#57的FACS检测结图11B显示了供体#890的FACS检测结果；图11C显示了供体#999的FACS检测结果。
图12显示了3个供体来源的CS1-BCMA-CAR-T细胞的RTCA分析结果。其中，图12A显示了供体#57的RTCA分析结果；图12B显示了供体#890的RTCA分析结果；图12C显示了供体#999的RTCA分析结果。
图13显示了3个供体来源的CS1-BCMA CAR-T细胞的IFN-γ分泌情况。其中，图13A显示了供体#57(A)的IFN-γ分泌情况；图13B显示了供体#890的IFN-γ分泌情况；图13C显示了供体#999的IFN-γ分泌情况。
图14显示了CS1-BCMA-CAR-T细胞(PMC743)显著抑制RPMI8226肿瘤细胞的生长。PMC743处理与对照PBS处理的小鼠相比，p＜0.05。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种靶向CS1和BCMA双特异性CAR，所述的双特异性CAR包含CS1scFv和BCMA scFv，以及4-1BB共刺激域和CD3激活域。实验表明，本发明的双特异性CAR-T细胞对CS1阳性靶细胞和BCMA阳性靶细胞有显著的杀伤作用，能够针对靶细胞分泌IFN-γ，并在体内实验中，显著抑制RPMI8226异种移植肿瘤的生长。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、I 1e(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
CS1和BCMA抗原
CS1(SLAM家族成员7，CD319)和BCMA(肿瘤坏死因子受体超家族成员17)蛋白通常在多发性骨髓瘤中过表达。
基于其在多发性骨髓瘤中表达的高百分比，两个靶标均用于CAR-T细胞治疗。
图2显示了CS1抗原的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)和BCMA抗原的氨基酸序列(SEQID NO:13)，其中用下划线标记了BCMA的胞外结构域(1-54aa)和CS1的胞外结构域(23-226aa)。
嵌合抗原受体(CAR)
如本文所用，术语“CS1-BCMA-CAR”、“双特异性CAR”、“CS1-BCMA双特异性CAR”具有相同含义，均指本发明第一方面提供的靶向CS1和BCMA的CAR。具体地，本发明的CS1-BCMA双特异性CAR由两个scFv，4-1BB共刺激域和CD3激活域组成(图3)。对于双特异性CAR中包含的BCMA scFv，使用来源克隆4C8BCMA的scFv(R.Berahovich等.基于新型BCMA单克隆抗体的CAR-T细胞阻断多发性骨髓瘤细胞生长.Cancers(Basel)10(2018).)，氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。对于双特异性CAR中包含的CS1scFv，使用来源Promab的CS1抗体7A8D5，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。实验表明，该CS1scFv以单特异性CAR的形式也能很好地针对CS1阳性靶细胞起作用。
CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。
本发明的嵌合抗原受体(CAR)为二代CAR，包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向CS1和BCMA的抗原结合结构域(CS1-BCMA scFv)。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variablefragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
具体地，在本发明的优选实施方式中，为了提高CAR-T细胞在肿瘤微环境中的生存能力，用4-1BB为共刺激结构域，构建了一种靶向CS1和BCMA的二代CAR载体，依次包括人源化的CS1抗体的单链抗体序列,人源化的BCMA抗体的单链抗体序列胞内区序列，人4-1BB胞内区序列，及人CD3ζ序列。
进一步地，将CS1-BCMA-CAR序列置于具有卡那霉素抗性基因的第二代慢病毒构建体的MNDU3启动子下，构建表达CS1-BCMA-CAR的慢病毒载体。利用293T细胞生产慢病毒，转导T细胞，从而制备CS1-BCMA-CAR-T细胞，具体方法参见通用方法部分。
载体
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBSLetters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
制剂
本发明提供了一种含有本发明的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，更优地1×104-1×107个细胞/ml。
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
治疗性应用
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物CS1和BCMA，协同激活T细胞，引起T细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗CS1和BCMA的CAR-T细胞引起针对CS1和/或BCMA阳性的细胞的特异性免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括MNDU3启动子、CS1-BCMA scFv、4-1BB胞内区和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
在优选的实施方式中，可治疗的癌症为CS1和/或BCMA阳性肿瘤，如多发性骨肉瘤等。
本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的T细胞(CAR-T细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的双特异性CAR-T细胞对CS1阳性靶细胞和BCMA阳性靶细胞有显著的杀伤作用。
(b)本发明的双特异性CAR-T细胞针对CS1阳性靶细胞和BCMA阳性靶细胞分泌IFN-γ。
(c)本发明的双特异性CAR-T细胞能够在体内实验中显著抑制RPMI8226异种移植肿瘤的生长。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用材料和方法：
1.从全血中分离外周血单核细胞(PBMC)
将从单个或多个供体(取决于所需的血液量)收集的全血(斯坦福医院血液中心，加利福尼亚州斯坦福)加入10mL肝素真空容器(购自Becton Dickinson)中。在50ml锥形离心管(PBS，pH 7.4，不含Ca2+/Mg2+)中，将约10ml的抗凝全血与无菌磷酸盐缓冲液(PBS)混合，总体积为20ml。小心地吸取稀释血浆/Ficoll界面上的含有外周血单核细胞(PBMC)的细胞层，避免吸入任何Ficoll，用PBS洗涤两次，并在室温下以200xg离心10分钟。用血细胞计数器计数细胞。将PBMC用CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(美国生命技术公司)洗涤一次，CAR-T培养基中含有5％AB血清和1.25ug/mL两性霉素B(Gemini Bioproducts，Woodland，CA)，100U/mL青霉素，和100ug/mL链霉素)。将细胞直接用于后续实验或在-80℃下冷冻保存。
2.T细胞活化
在不添加人白介素2(huIL-2)(Invitrogen)的情况下，将分离的细胞(用1xPBS(pH7.4)洗涤，无Ca2+/Mg2+)用CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(美国生命技术公司)洗涤一次，CAR-T培养基中含有5％AB血清和1.25ug/mL两性霉素B(Gemini Bioproducts，Woodland，CA)，100U/mL青霉素，和100ug/mL链霉素)，细胞浓度为5x105细胞/毫升将细胞重悬于含有300U/mL huIL2的CAR-T培养基中，终浓度为5x105细胞/mL。以1：1的CD3-CD28磁珠细胞比激活PBMC。
3.T细胞转导和扩增
PBMC激活后，将细胞在37℃，5％CO2中孵育24小时。每孔含1x106个细胞，加入5x106个慢病毒和2μL/mL的Transplus培养基(Alstem，里士满，加利福尼亚)(最终稀释度为1：500)。在重复添加病毒之前，将细胞再孵育24小时。在含有300U/mL IL-2的新鲜培养基的持续存在下，将细胞培养12-14天(总孵育时间取决于所需的CAR-T细胞的最终数量)。每2-3天分析一次细胞浓度，同时添加培养基以将细胞悬液稀释至1x106细胞/mL。
3.FACS检测CAR阳性细胞
洗涤细胞并将其悬浮在FACS缓冲液(含有0.1％叠氮化钠和0.4％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS))中。将细胞分成等分试样(1x106个)。Fc受体在冰上用标准山羊IgG(美国生命技术公司)封闭10分钟。使用生物素标记的多克隆山羊抗小鼠F(ab)2抗体(生命技术)来检测CS1。BCMA-生物素标记的重组蛋白用于检测BCMA+CAR细胞。生物素标记的正常多克隆山羊IgG抗体(美国生命技术公司)用作同种型对照。(1：200稀释，反应体积为100μl)。将细胞在4℃下孵育25分钟，并用FACS缓冲液洗涤一次，然后悬浮在FACS缓冲液中。每管中添加100μl1：1000稀释的标准小鼠IgG(Invitrogen)进行封闭，并在冰上孵育10分钟。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤并重悬于100μl FACS缓冲液中。然后将细胞用藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素(BD Pharmingen，San Diego，CA)和别藻蓝蛋白(APC)标记的CD3(eBiocience，SanDiego，CA)染色。
4.细胞毒性测定(实时细胞毒性测定)
使用ACEA，根据制造商的操作指南进行细胞毒性测定。
5.ELISA
使用ELISA试剂盒检测到IFN-γ细胞因子，根据制造商的操作指南进行实验。
实施例1CS1-BCMA-CAR-T细胞表达CS1ScFv和BCMA scFv
将双特异性CS1-BCMA scFv片段，41BB共刺激域和CD3zeta激活域插入CAR内，将CAR慢病毒转导到T细胞中。结果显示，CS1-BCMA-CAR细胞在体外有效扩增。
采用相同方法构建不包含scFv和TF标签的CAR，将其命名为Mock CAR，在细胞毒性和细胞因子测定中用作阴性对照。
利用小鼠FAB抗体和生物素标记的BCMA重组蛋白，通过FACS检测CS1-BCMA-CAR阳性细胞。
结果如图4所示，利用MNDU3启动子进行表达CAR的慢病毒构建，细胞转导产物中有高百分比的CAR阳性细胞。
将本实施例获得的CAR阳性细胞命名为PMC743并用于后续实验。
实施例2 CS1-BCMA-CAR-T细胞杀伤CHO-CS1细胞和Hela-CS1细胞
将CS1-BCMA CAR-T细胞(PMC743)分别与CHO-CS1细胞、Hela-CS1细胞(CS1阳性，CS1抗原的稳转染细胞)，以及CHO细胞(CS1阴性)共同孵育。BCMA-41BB-CD3-CAR-T细胞(PMC744)和Mock CAR-T细胞用作对照。经冻存保存的效应细胞与靶细胞的比例(E:T)为20：1和40：1。孵育时间为24小时。
用BCMA和CS1抗体进行的CHO-BCMA和CHO-CS1染色如图5A所示。
共孵育24小时后，使用XCelligence系统，对CS1-BCMA-CAR-T细胞和靶细胞系进行实时细胞毒性测定。
结果显示，CS1-BCMA-41BB-CD3CAR-T细胞(PMC743)可以杀伤CHO-CS1细胞，而BCMA-41BB-CD3-CAR-T细胞(PMC744)和Mock CAR-T细胞(图5B)不能杀伤CHO-CS1细胞。
用Hela-CS1进行相同测定，结果显示，PMC743可以杀伤Hela-CS1细胞，而单特异性BCMA CAR-T细胞不能杀伤Hela-CS1细胞(图6)。
实施例3 CS1-BCMA-CAR-T细胞特异性杀伤CHO-BCMA细胞和Hela-BCMA细胞
采用与实施例2类似的方法，用稳定表达BCMA的CHO和Hela细胞系进行相同的测定。
结果显示，与BCMA-CAR-T细胞类似，CS1-BCMA-CAR-T细胞特异性杀伤BCMA阳性靶细胞(图7)。
用Hela-BCMA靶细胞(稳定转导BCMA抗原)进行检测，结果显示，CS1-BCMA-CAR-T细胞对其有高杀伤活性(图8)。
实施例4 CS1-BCMA-CAR-T细胞针对CS1阳性细胞分泌高水平的IFN-γ。
将CS1-BCMA-CAR-T细胞与靶细胞共孵育，收集上清液，根据操作规程使用Fisher的试剂盒进行ELISA分析。
结果显示，将CS1-BCMA CAR-T细胞与CHO-CS1和CHO-BCMA(图9)以及Hela-CS1和Hela-BCMA细胞(图10)共孵育后，检测到高水平的IFN-γ分泌。上述结果表明，CS1-BCMA-CAR-T细胞可以特异性靶向CS1和BCMA阳性靶细胞，且具有高度的特异性。
实施例5使用来自供体的PBMC制备CS1-BCMA-CAR-T细胞
使用来自3个供体的PBMC进行了PMC743CAR的转导，3个供体分别编号：#57，#890和#999。使用单特异性的BCMA-CAR-T细胞和CS1-CAR-T细胞作为对照。
对来自3个供体的CAR-T细胞进行扩增，获得高表达水平的CAR阳性细胞(图11)。
使用小鼠F(ab)2抗体进行检测，供体#57的PMC743CAR+细胞比例>70％，使用生物素化的BCMA重组蛋白进行检测，该比例为28％；单个BCMA CAR-T细胞的结果相似，其中mFAB抗体检测的比例为57％，BCMA蛋白检测的比例为30％；使用小鼠F(ab)2抗体进行检测，CS1CAR-T细胞具有68％的CAR+细胞，而对照T细胞则为阴性(图11A)。
在供体#890中转导PMC743CAR，结果显示，mFAB检测的CAR+细胞的比例为81％，BCMA蛋白检测的比例为42％(图11B)。基于供体#890的BCMA CAR和CS1CAR的转导也获得了相似的数据，含有约80％CAR+细胞。
基于供体#999的PMC743CAR转导也观察到高百分比的CAR+细胞(图11C)。、
上述结果表明，本发明的PMC743CAR可以有效转导，使得CAR+细胞以较高比例表达。
实施例6 CS1-BCMA-CAR-T细胞特异性杀伤CS1阳性细胞
利用实施例5制备的来自3个供体的PBMC的CS1-BCMA CAR-T细胞进行杀伤性检测。采用类似方法制备单特异性CS1-CAR-T细胞和BCMA-CAR-T细胞，将其用作对照。使用CHO-BCMA和CHO-CS1作为靶细胞，采用与实施例2类似的方法进行细胞毒性测定。
结果显示，CS1-BCMA CAR-T细胞可以同时杀伤BCMA阳性和CS1阳性细胞(图12)。CS1-BCMA细胞的杀伤作用与BCMA-CAR-T细胞对CHO-BCMA细胞的杀伤作用相似，与来自同一供体的CS1-CAR-T细胞对CHO-CS1细胞的杀伤作用也相似或稍低。由于CS1-CAR-T细胞不杀伤CHO-BCMA细胞，而BCMA-CAR-T细胞不杀伤CHO-CS1细胞，因此，各CAR-T细胞的杀伤是特异性的。
采用与实施例4类似的方法进行IFN-γ分泌水平的检测。
结果显示，CS-1-BCMA-CAR-T细胞针对CS1阳性和BCMA阳性细胞分泌高水平的IFN-γ(图13)。在CHO-BCMA细胞中，CS-1-BCMA-CAR-T细胞的IFN-γ分泌显著高于Mock CAR-T细胞，并且高于单特异性的BCMA-CAR-T细胞。
进一步分析IL-6的分泌情况。就CRS safe CAR-T细胞而言，所有3个供体的IL-6水平最低。
实施例7在体内实验中，CS1-BCMA-CAR-T细胞显著阻断RPMI8226异种移植肿瘤的生长
使用多发性骨髓瘤RPMI8226异种移植肿瘤模型分析CS1-BCMA-CAR-T细胞的体内杀伤情况。
将2×106个RPMI8226-荧光素酶阳性的细胞(ATCC,CCL-155TM)静脉注射至NSG小鼠，第二天通过静脉注射1×107个CS1-BCMA-CAR-T细胞。
结果显示，CS1-BCMA-CAR-T细胞显著延迟了肿瘤的生长，与对照组相比，p<0.05(图14)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本申请涉及的序列和相关信息如下：
Figure BDA0002925003340000221
Figure BDA0002925003340000231
序列表
<110> 武汉思安医疗技术有限公司
<120> 双特异性CS1-BCMA CAR-T细胞及其应用
<130> P2020-1658
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Asn Ile Cys Pro His Ser Gly Glu Asn Thr Glu Tyr Asp Thr Ile Pro
275 280 285
His Thr Asn Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asp Pro Ala Asn Thr Val Tyr
290 295 300
Ser Thr Val Glu Ile Pro Lys Lys Met Glu Asn Pro His Ser Leu Leu
305 310 315 320
Thr Met Pro Asp Thr Pro Arg Leu Phe Ala Tyr Glu Asn Val Ile
325 330 335
<210> 13
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu
165 170 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180

Claims (15)

1.一种双特异性嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构如下式I所示：
L-scFv1-I-scFv2-H-TM-C-CD3ζ (I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为任选的信号肽序列；
I为柔性接头；
H为任选的铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
scFv1为靶向CS1的抗原结合结构域，scFv2为靶向BCMA的抗原结合结构域；
其中，所述靶向CS1的抗原结合结构域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和
所述靶向BCMA的抗原结合结构域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述靶向CS1的抗原结合结构域的结构如下式A所示：
VH1-VL1 (A)；
式中，VH1为抗CS1抗体重链可变区；VL1为抗CS1抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键。
3.权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述靶向BCMA的抗原结合结构域的结构如下式C所示：
VL2-VH2 (C)；
式中，VL2为抗BCMA抗体轻链可变区；VH2为抗BCMA抗体重链可变区；“-”为连接肽或肽键。
4.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的scFv1和/或scFv2为鼠源、人源、人源和鼠源嵌合、或者全人源化的单链抗体可变区片段。
5.权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述L为CD8来源的信号肽，其氨基酸序列如SEQID NO:7所示。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的CAR。
7.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求6所述的核酸分子。
8.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达有权利要求1所述的CAR。
9.如权利要求8所述的免疫细胞，其特征在于，所述细胞为CAR-T细胞或CAR-NK细胞。
10.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的CAR、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、或权利要求8所述的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
11.一种权利要求1所述的CAR、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、或权利要求8所述的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为CS1和/或BCMA阳性肿瘤。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的CS1和/或BCMA阳性肿瘤包括多发性骨肉瘤。
14.一种用于制备权利要求8所述工程化的免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的如权利要求6所述的核酸分子、或如权利要求7所述的载体。
15.一种制备工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，所述的免疫细胞表达权利要求1所述的CAR，所述方法包括以下步骤：
(a)提供待改造的免疫细胞；和
(b)将权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的载体转导入所述免疫细胞内，从而获得所述工程化的免疫细胞。
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Application publication date: 20210511

Assignee: SHENYANG SUNSHINE PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Assignor: WUHAN SIAN MEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

Contract record no.: X2023980053889

Denomination of invention: Bispecific CS1-BCMA CAR-T cells and their applications

Granted publication date: 20220315

License type: Exclusive License

Record date: 20231225