CN109575143A

CN109575143A - 双特异性cd20-cd19-car及其应用

Info

Publication number: CN109575143A
Application number: CN201811643180.XA
Authority: CN
Inventors: 杨林; 游凤涛
Original assignee: PERSONGEN BIOMEDICINE (SUZHOU) CO Ltd
Current assignee: PERSONGEN BIOMEDICINE (SUZHOU) CO Ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109575143B

Abstract

本发明提供了一种基于人源化CD20抗体和CD19抗体的新型双特异CD20‑CD19‑CAR载体的构建及应用。具体地，本发明提供了一种嵌合抗原受体CAR，所述CAR含有靶向CD19的scFv和靶向CD20的scFv，靶向CD19的scFv含有SEQ ID No.:8所示的重链可变区和SEQ ID No.:9所示的轻链可变区，靶向CD20的scFv含有SEQ ID No.:10所示的重链可变区和SEQ ID No.:11所示的轻链可变区。利用本发明构建的双特异CD20‑CD19‑CAR载体的CAR‑T细胞展现出非常好的体外杀伤效果。

Description

双特异性CD20-CD19-CAR及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于人源化CD20抗体和CD19抗体的新型双特异CD20-CD19-CAR载体的构建及应用。

背景技术

近年来，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法作为一种强大的新型过继免疫治疗技术，已显示出非常有效的治疗效果，被用于治疗多种实体和血液癌症，特别是针对B细胞淋巴细胞白血病和淋巴瘤的CD19-CAR-T疗法在临床上展现出非常好的治疗效果，另外，CD20也是B细胞肿瘤的一个理想靶点。但是单靶点治疗的缺点是当肿瘤细胞下调抗原表达后很容易产生复发，因此构建可以同时靶向双靶点的双特异性CAR-T可以降低肿瘤细胞的逃逸，降低复发率，此外，如果双特异CAR中的抗体序列都是人源化的序列，可以进一步降低双特异CAR-T的免疫原性。

因此，本领域迫切需要开发一种基于人源化CD20抗体和CD19抗体的新型双特异CD20-CD19-CAR载体。

发明内容

本发明的目的就是提供一种基于人源化CD20抗体和CD19抗体的新型双特异CD20-CD19-CAR载体的构建及应用。

在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体CAR，所述CAR含有靶向CD19的scFv和靶向CD20的scFv，其中，所述靶向CD19的scFv含有SEQ ID No.:8所示的重链可变区和SEQ ID No.:9所示的轻链可变区，所述靶向CD20的scFv含有SEQ ID No.:10所示的重链可变区和SEQ ID No.:11所示的轻链可变区。

QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGVSLPDYGVSWIRQPPGKALEWLAVIWGSETTYYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID No.:8)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDIAVYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEI(SEQ ID No.:9)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQTPGQRLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTTVTVS(SEQ ID No.:10)

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASSSVSYIHWYQQKPGKAPKLLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTSFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIKRTV(SEQ ID No.:11)

在另一优选例中，所述CAR的结构如下式I所示：

L-scFv1-I-scFv2-H-TM-C-CD3ζ(I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

I为柔性接头；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

scFv1和scFv2两者中一个为靶向CD19的抗原结合结构域，另一个为靶向CD20的抗原结合结构域。

在另一优选例中，所述的scFv1为靶向CD20的抗原结合结构域，所述scFv2为靶向CD19的抗原结合结构域。

在另一优选例中，所述的scFv1和scFv2可以是各自独立的，也可以是串联的结构。

在另一优选例中，L的序列如SEQ ID NO.:1所示。

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID No.:1)

在另一优选例中，H的序列如SEQ ID NO.:2所示。

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID No.:2)

在另一优选例中，TM的序列包括源于ICOS的跨膜区，优选地TM的序列如SEQ IDNO.:3所示。

WLPIGCAAFVVVCILGCILICWL(SEQ ID No.:3)

在另一优选例中，所述共刺激信号分子包括ICOS来源的共刺激信号分子，和/或4-1BB来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，所述ICOS来源的共刺激信号分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQ ID No.:4)

在另一优选例中，所述4-1BB来源的共刺激信号分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID No.:5)

在另一优选例中，所述CD3ζ的序列如SEQ ID NO.:6所示。

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID No.:6)

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的序列如SEQ ID NO.:7所示。

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQTPGQRLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTTVTVSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASSSVSYIHWYQQKPGKAPKLLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTSFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIKRTVGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGVSLPDYGVSWIRQPPGKALEWLAVIWGSETTYYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDIAVYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID No.:7)

在另一优选例中，所述I的序列如SEQ ID NO.:18所示。

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No.:18)

在另一优选例中，所述靶向CD19的抗原结合结构域的结构如下式A或式B所示：

V_H1-V_L1 (A)

V_L1-V_H1 (B)；

式中，V_H1为抗CD19抗体重链可变区；V_L1为抗CD19抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述靶向CD20的抗原结合结构域的结构如下式C或式D所示：

V_H2-V_L2 (C)

V_L2-V_H2 (D)；

式中，V_H2为抗CD20抗体重链可变区；V_L2为抗CD20抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键。

在本发明的第二方面，提供了一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体CAR。

在另一优选例中，所述CAR为双特异性CAR，并且所述的CAR同时靶向CD19和CD20。

在另一优选例中，所述CAR同时包含靶向CD19的抗原结合结构域和靶向CD20的抗原结合结构域。

在本发明的第三方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体。

在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述铰链区核酸序列：

(a)编码如SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:12所示的多核苷酸；

GAGAGCAAGTACGGCCCTCCTTGTCCTCCTTGTCCAGCTCCAGAGTTTGAGGGCGGCCCTAGCGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCAGAAGTGACTTGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTTCCAGTCTACCTACCGGGTGGTGTCAGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGATTCTACCCCAGCGACATCGCAGTCGAGTGGGAAAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCAGTGCTGGATAGCGACGGAAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAAAGTCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGTTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCTCGGCAAG(SEQ ID NO.:12)

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:12所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述ICOS的跨膜区的核酸序列：

(a)编码如SEQ ID NO.:3所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:13所示的多核苷酸；

TGGCTGCCTATTGGTTGCGCAGCTTTCGTCGTCGTCTGCATCCTGGGTTGCATCCTGATTTGCTGGCTG(SEQ ID NO.:13)

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:13所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸分子包含共刺激信号分子编码序列，所述共刺激信号分子编码序列包括ICOS来源的共刺激信号分子编码序列，和/或4-1BB来源的共刺激信号分子编码序列，其中

所述ICOS来源的共刺激信号分子编码序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:4所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:14所示的多核苷酸；

ACCAAGAAGAAGTACAGCTCTAGCGTGCACGACCCTAACGGCGAGTACATGTTCATGCGGGCCGTCAACACCGCCAAAAAGAGCCGGCTGACCGACGTGACACTG(SEQ ID NO.:14)

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:14所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.:4所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸；

所述4-1BB来源的共刺激信号分子编码序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:5所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:15所示的多核苷酸；

AAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCAGTGCAGACAACACAGGAGGAAGACGGCTGCTCTTGCAGGTTCCCAGAGGAGGAGGAGGGCGGTTGCGAGCTG(SEQ ID NO.:15)

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:15所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.:5所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD3ζ的胞内信号结构域的核酸序列：

(a)编码如SEQ ID NO.:6所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:16所示的多核苷酸；

AGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCTCCAGCTTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCAGAGATGGGCGGCAAGCCTAGAAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGAAGAGGCAAGGGACACGACGGACTGTATCAGGGACTGAGCACCGCCACAAAGGACACATACGACGCCCTGCATATGCAGGCTCTGCCTCCTAGA(SEQ ID NO.:16)

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:16所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.:6所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的核酸序列：

(a)编码如SEQ ID NO.:7所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:17所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:17所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，并且编码SEQ ID NO.:7所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。

在另一优选例中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.:17所示。

ATGCTGCTGCTGGTGACCTCTCTGCTGCTCTGCGAACTGCCTCACCCAGCCTTTCTGCTGATCCCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGAGCCGAAGTGAAGAAGCCAGGAGCCTCAGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCATTGGGTCCGGCAGACCCCAGGACAGAGACTCGAGTGGATGGGAGCCATCTACCCCGGCAACGGCGATACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGCGTGACCATCACAGCCGATACAAGCGCCAGCACCGCCTACATGGAGCTGTCTAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGATTGGTACTTCAACGTGTGGGGCCAGGGCACAACAGTGACAGTGAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTGGAGGAGGCGGCAGCGATATTCAGCTGACCCAGAGCCCTTCTTTTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACTTGCAGGGCCAGCAGCAGCGTGTCCTACATCCATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAAGCTTTACCCTGACCATCAGCTCTCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCTCCTACATTTGGCGGCGGAACCAAGGTGGAGATCAAGAGAACAGTGGGCGGCGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCAGGAGGAGGCGGATCTCAGGTCACACTGAGAGAGAGCGGACCAGCTCTGGTGAAGCCTACACAGACCCTGACCCTGACTTGCACCTTCAGCGGAGTGTCCCTGCCAGATTACGGAGTGTCTTGGATCAGACAGCCCCCAGGAAAGGCCCTGGAGTGGCTGGCAGTGATTTGGGGAAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGCTGACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCCACCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCTCTTACGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACAACAGTGACCGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGAAATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACACTGTCTCTGAGCCCAGGAGAGAGAGCCACACTGAGTTGCAGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTAGACTGCTGATCTACCACACAAGCAGACTGCACAGCGGCATCCCAGACAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCAGGCTGGAGCCAGAGGACATCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACCAAGCTGGAGATCGAGAGCAAGTACGGCCCTCCTTGTCCTCCTTGTCCAGCTCCAGAGTTTGAGGGCGGCCCTAGCGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCAGAAGTGACTTGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTTCCAGTCTACCTACCGGGTGGTGTCAGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGATTCTACCCCAGCGACATCGCAGTCGAGTGGGAAAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCAGTGCTGGATAGCGACGGAAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAAAGTCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGTTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCTCGGCAAGTGGCTGCCAATTGGCTGCGCAGCCTTTGTCGTCGTGTGCATTCTCGGCTGCATCCTGATTTGTTGGCTGACCAAGAAGAAGTACAGCAGCAGCGTGCACGACCCCAACGGCGAGTACATGTTCATGCGGGCAGTGAACACCGCCAAGAAGAGCAGGCTGACCGACGTGACACTGAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCTCTTGCAGGTTTCCCGAGGAGGAAGAGGGAGGTTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCTCCAGCTTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCAGAGATGGGCGGCAAGCCTAGAAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGAAGAGGCAAGGGACACGACGGACTGTATCAGGGACTGAGCACCGCCACAAAGGACACATACGACGCCCTGCATATGCAGGCTCTGCCTCCTAGATGA(SEQ ID NO.:17)

在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述I的接头的核酸序列：

(a)编码如SEQ ID NO.:18所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:19所示的多核苷酸；

GGCGGCGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCAGGAGGAGGCGGATCT(SEQ IDNO.:19)

在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第三方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA、RNA。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第四方面所述的所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述细胞为T细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本发明第五方面所述的细胞。

在本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本发明第五方面所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括CD19阳性肿瘤。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括CD20阳性肿瘤。

在本发明的第八方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本发明第五方面所述的细胞、或本发明第六方面的药物组合物。

在另一优选例中，所述疾病为肿瘤。

在本发明的第九方面，提供了一种制备CAR-T细胞(CAR-修饰的T细胞)的方法，所述CAR-T细胞表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体，

所述方法包括步骤：将本发明第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的载体转导入T细胞内，从而获得所述CAR-T细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了人源化双特异CD20-CD19-CAR载体结构图。

图2显示了人源化双特异CD20-CD19-CAR-T细胞的转染效率流式检测图。

图3显示了人源化双特异CD20-CD19-CAR-T细胞对过表达CD20或CD19的K562细胞的细胞毒性

图4显示了人源化双特异CD20-CD19-CAR-T细胞对天然表达CD20和CD19的B淋巴细胞白血病细胞(Nalm-6)和淋巴瘤细胞(Raji)的细胞毒性

图5显示了人源化双特异CD20-CD19-CAR-T细胞与Raji和Nalm-6细胞孵育后细胞因子分泌情况

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次构建了一种新型的双特异CD20-CD19-CAR载体。本发明构建的双特异CD20-CD19-CAR是基于人源化CD20抗体序列和人源化CD19抗体序列构建的新型第三代CAR载体(含有ICOS和41BB共刺激分子)，选用人源化抗体序列构建的双特异CAR载体构建的CAR-T细胞临床上可以同时靶向表达CD20抗原或表达CD19抗原的B细胞恶性肿瘤(B细胞白血病和淋巴瘤)，除了可以避免用鼠源抗体构建的CAR-T细胞在人体内产生的免疫原性，而且由于可以同时靶向双靶点，扩大了治疗范围，也可以排除由于单靶点转阴导致的肿瘤复发，为更好的靶向治疗B细胞来源的白血病和淋巴瘤奠定了基础。此外，利用本发明构建的双特异CD20-CD19-CAR载体的CAR-T细胞展现出非常好的体外杀伤效果。在此基础上完成了本发明。

CD19

CD19是一种B细胞表面的95kDa的糖蛋白，从B细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员之一，作为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了B细胞受体的信号转导过程。在CD19缺陷的小鼠模型中，外周淋巴组织中B细胞的数量会出现明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清Ig水平的减低。通常认为，CD19的表达只限于B细胞系(B-cell lineage)，而不表达于多能造血干细胞表面。CD19还表达于大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALLs、CLLs、多毛细胞白血病，和一部分急性髓性白血病细胞的表面。因此，在对白血病/淋巴瘤的治疗中，CD19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是，CD19不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞，这一特征使CD19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，已经研制出了抗CD19的抗体或scFv片段，并且在小鼠模型和人类/灵长类动物中证明了其应用的前景。

嵌合抗原受体(CAR)

本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别CD19和CD20的抗体，较佳地为单链抗体。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物CD19和CD20，可以用于自体和异体肿瘤治疗，可以大规模制备，质量均一稳定，随时可调用给任何患者使用。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本发明的CAR，和CAR-T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗CD19CAR-T细胞引起抗表达CD19的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗CD20-CD19scFv、人Fc铰链区、ICOS跨膜区及胞内区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点包括：

1)本发明的人源化抗体序列构建的双特异CAR载体构建的CAR-T细胞临床上可以同时靶向表达CD20抗原或表达CD19抗原的B细胞恶性肿瘤(B细胞白血病和淋巴瘤)；

2)本发明构建的双特异CD20-CD19-CAR载体的CAR-T细胞可以避免用鼠源抗体构建的CAR-T细胞在人体内产生的免疫原性，提高临床疗效；

3)本发明构建的双特异CD20-CD19-CAR载体的CAR-T细胞由于可以同时靶向双靶点，扩大了治疗范围，也可以排除由于单靶点转阴导致的肿瘤复发，为更好的靶向治疗B细胞来源的白血病和淋巴瘤奠定了基础；

4)利用本发明构建的双特异CD20-CD19-CAR载体的CAR-T细胞展现出非常好的体外杀伤效果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.

人源化双特异CD20-CD19-CAR-T转染效率

本发明人用Fc抗体检测双特异CD20-CD19-CAR-T细胞的CAR阳性率，结果如图2所示，用人源化CD19-CAR-T的阳性率为29.10％。

实施例2.

人源化双特异CD20-CD19-CAR-T细胞对过表达CD20或CD19的K562细胞的细胞毒性

本发明人构建了CD20过表达的K562(K562-CD20)细胞，CD19过表达的K562(K562-CD19)细胞，CD20和CD19同时表达的K562细胞(K562-CD19-CD20)作为靶细胞，评估双特异CD20-CD19-CAR-T细胞的体外杀伤功能，效靶比分别为0.5:1、1:1、5:1、10:1。K562细胞为阴性靶细胞，T细胞为对照效应细胞。

结果如图3所示，与对照的T细胞相比，CD20-CD19-CAR-T细胞对K562-CD20细胞、K562-CD19细胞、K562-CD19-CD20细胞都具有显著的特异性杀伤作用，而对K562细胞(CD20阴性)不具有特异性杀伤，说明构建的人源化双特异CD20-CD19-CAR-T细胞在体外可以对过表达的CD20或CD19的K562细胞产生特异的细胞毒性，而对照K562细胞不具有特异的细胞毒性。

实施例3.

人源化双特异CD20-CD19-CAR-T细胞对天然表达CD20和CD19的B淋巴细胞白血病细胞(Nalm-6)和淋巴瘤细胞(Raji)的细胞毒性

本发明人用构建的人源化双特异CD20-CD19-CAR-T细胞对B淋巴细胞白血病(Nalm-6)和淋巴瘤(Raji)细胞进行体外杀伤实验，效靶比分别为0.5:1、1:1、5:1、10:1。T细胞为对照效应细胞。

结果如图4所示，与对照的T细胞相比，CD20-CD19-CAR-T细胞对Raji和Nalm-6都具有显著的特异性杀伤作用，说明我们构建的人源化双特异CD20-CD19-CAR-T细胞在体外对CD20阳性和CD19阳性的Raji和Nalm-6细胞都具有显著的细胞毒性。

实施例4.

人源化双特异CD20-CD19-CAR-T细胞与Raji和Nalm-6细胞孵育后细胞因子分泌情况

本发明人进一步分析了双特异CD20-CD19-CAR-T细胞与Raji和Nalm-6细胞孵育后细胞因子的释放情况，双特异CD20-CD19-CAR-T细胞与靶细胞孵育的效靶比为1:1和5:1，T细胞组作为对照组，检测的细胞因子为IL-2、IFN-γ、TNF-α、Granzyme B。

结果如图5所示，T细胞与Raji细胞共孵育后基本不会产生或产生非常低的细胞因子，而双特异CD20-CD19-CAR-T细胞与Raji细胞孵育后，产生了显著的细胞因子释放，而与Nalm-6细胞共孵育结果表明，与T细胞对照组相比，除了对IFN的释放没有显著增高外，双特异CD20-CD19-CAR-T细胞对其它细胞因子的释放都有显著提高，这些结果证明了双特异CD20-CD19-CAR-T细胞可以被天然表达CD19和CD20抗原的肿瘤细胞特异性激活。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司

<120> 双特异性CD20-CD19-CAR及其应用

<130> P2018-2465

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 2

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly

1 5 10 15

Cys Ile Leu Ile Cys Trp Leu

20

<210> 4

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr

1 5 10 15

Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp

20 25 30

Val Thr Leu

35

<210> 5

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 7

<211> 968

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

20 25 30

Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly

50 55 60

Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr

65 70 75 80

Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr

85 90 95

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp

115 120 125

Tyr Phe Asn Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

145 150 155 160

Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

165 170 175

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Tyr

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser

195 200 205

Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

275 280 285

Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu

290 295 300

Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val

305 310 315 320

Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Val

325 330 335

Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg

340 345 350

Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met

355 360 365

Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys His

370 375 380

Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

385 390 395 400

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

405 410 415

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu

420 425 430

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

435 440 445

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

450 455 460

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro

465 470 475 480

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

485 490 495

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly

500 505 510

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Glu

515 520 525

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu

530 535 540

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

545 550 555 560

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

565 570 575

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

580 585 590

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr

595 600 605

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

610 615 620

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

625 630 635 640

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

645 650 655

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

660 665 670

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

675 680 685

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

690 695 700

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

705 710 715 720

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

725 730 735

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

740 745 750

Ser Leu Gly Lys Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val

755 760 765

Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr

770 775 780

Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala

785 790 795 800

Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu Lys Arg

805 810 815

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

820 825 830

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

835 840 845

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

850 855 860

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

865 870 875 880

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

885 890 895

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

900 905 910

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

915 920 925

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

930 935 940

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

945 950 955 960

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

965

<210> 8

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu

65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105

<210> 10

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 11

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 11

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val

100 105

<210> 12

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 12

gagagcaagt acggccctcc ttgtcctcct tgtccagctc cagagtttga gggcggccct 60

agcgtgtttc tgtttcctcc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gaccccagaa 120

gtgacttgcg tggtggtgga cgtgtctcag gaggaccccg aggtgcagtt caattggtac 180

gtggacggcg tggaggtgca caacgctaag accaagccca gggaggagca gttccagtct 240

acctaccggg tggtgtcagt gctgacagtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaggag 300

tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg cctagcagca tcgagaagac catcagcaag 360

gccaagggcc agcctagaga gcctcaggtg tacaccctgc ctcctagcca ggaggagatg 420

accaagaacc aggtgtccct gacttgcctc gtgaagggat tctaccccag cgacatcgca 480

gtcgagtggg aaagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc tccagtgctg 540

gatagcgacg gaagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaaaag tcgctggcag 600

gagggcaacg tgttcagttg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660

aagagcctga gcctgagcct cggcaag 687

<210> 13

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 13

tggctgccta ttggttgcgc agctttcgtc gtcgtctgca tcctgggttg catcctgatt 60

tgctggctg 69

<210> 14

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 14

accaagaaga agtacagctc tagcgtgcac gaccctaacg gcgagtacat gttcatgcgg 60

gccgtcaaca ccgccaaaaa gagccggctg accgacgtga cactg 105

<210> 15

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 15

aagaggggcc ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gccagtgcag 60

acaacacagg aggaagacgg ctgctcttgc aggttcccag aggaggagga gggcggttgc 120

gagctg 126

<210> 16

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 16

agggtgaagt tcagcagaag cgccgacgct ccagcttatc agcagggcca gaaccagctg 60

tacaacgagc tgaacctggg caggagagag gagtacgacg tgctggacaa gaggagaggc 120

agagacccag agatgggcgg caagcctaga aggaagaacc cccaggaggg cctgtacaac 180

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagagg 240

agaagaggca agggacacga cggactgtat cagggactga gcaccgccac aaaggacaca 300

tacgacgccc tgcatatgca ggctctgcct cctaga 336

<210> 17

<211> 2907

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 17

atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctcacccagc ctttctgctg 60

atccctcagg tgcagctggt gcagtcagga gccgaagtga agaagccagg agcctcagtg 120

aaggtgtctt gcaaggccag cggctacacc ttcaccagct acaacatgca ttgggtccgg 180

cagaccccag gacagagact cgagtggatg ggagccatct accccggcaa cggcgatacc 240

agctacaacc agaagttcaa gggccgcgtg accatcacag ccgatacaag cgccagcacc 300

gcctacatgg agctgtctag cctgaggagc gaggacacag ccgtgtacta ttgcgccagg 360

agcacctact acggcggcga ttggtacttc aacgtgtggg gccagggcac aacagtgaca 420

gtgagcggag gaggaggaag cggaggagga ggatctggag gaggcggcag cgatattcag 480

ctgacccaga gcccttcttt tctgagcgcc agcgtgggcg acagagtgac catcacttgc 540

agggccagca gcagcgtgtc ctacatccat tggtaccagc agaagccagg caaggctcct 600

aagctgctga tctacgccac cagcaacctg gccagcggcg tgcctagcag attcagcggc 660

agcggaagcg gcacaagctt taccctgacc atcagctctc tgcagccaga ggacttcgcc 720

acctactact gccagcagtg gaccagcaac cctcctacat ttggcggcgg aaccaaggtg 780

gagatcaaga gaacagtggg cggcggagga tctggaggag gaggaagcgg aggaggagga 840

tcaggaggag gcggatctca ggtcacactg agagagagcg gaccagctct ggtgaagcct 900

acacagaccc tgaccctgac ttgcaccttc agcggagtgt ccctgccaga ttacggagtg 960

tcttggatca gacagccccc aggaaaggcc ctggagtggc tggcagtgat ttggggaagc 1020

gagaccacct actacaacag cgccctgaag agcaggctga ccatcagcaa ggacaccagc 1080

aagaaccagg tggtgctgac catgaccaac atggaccccg tggacaccgc cacctactat 1140

tgcgccaagc actactacta cggcggctct tacgccatgg actattgggg ccagggcaca 1200

acagtgaccg tgtctagcgg aggaggagga tctggaggag gaggaagcgg aggaggagga 1260

agcgaaatcg tgctgaccca gtctccagcc acactgtctc tgagcccagg agagagagcc 1320

acactgagtt gcagggccag ccaggacatc agcaagtacc tgaattggta ccagcagaag 1380

ccaggacagg cccctagact gctgatctac cacacaagca gactgcacag cggcatccca 1440

gacagattca gcggcagcgg aagcggcaca gacttcaccc tgaccatcag caggctggag 1500

ccagaggaca tcgccgtgta ctattgccag cagggcaaca ccctgcctta caccttcgga 1560

cagggcacca agctggagat cgagagcaag tacggccctc cttgtcctcc ttgtccagct 1620

ccagagtttg agggcggccc tagcgtgttt ctgtttcctc ccaagcccaa ggacaccctg 1680

atgatcagcc ggaccccaga agtgacttgc gtggtggtgg acgtgtctca ggaggacccc 1740

gaggtgcagt tcaattggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgctaa gaccaagccc 1800

agggaggagc agttccagtc tacctaccgg gtggtgtcag tgctgacagt gctgcaccag 1860

gattggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgtcca acaagggcct gcctagcagc 1920

atcgagaaga ccatcagcaa ggccaagggc cagcctagag agcctcaggt gtacaccctg 1980

cctcctagcc aggaggagat gaccaagaac caggtgtccc tgacttgcct cgtgaaggga 2040

ttctacccca gcgacatcgc agtcgagtgg gaaagcaacg gccagcccga gaacaactac 2100

aagaccaccc ctccagtgct ggatagcgac ggaagcttct tcctgtacag ccggctgacc 2160

gtggacaaaa gtcgctggca ggagggcaac gtgttcagtt gcagcgtgat gcacgaggcc 2220

ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg agcctgagcc tcggcaagtg gctgccaatt 2280

ggctgcgcag cctttgtcgt cgtgtgcatt ctcggctgca tcctgatttg ttggctgacc 2340

aagaagaagt acagcagcag cgtgcacgac cccaacggcg agtacatgtt catgcgggca 2400

gtgaacaccg ccaagaagag caggctgacc gacgtgacac tgaagagggg ccggaagaag 2460

ctgctgtaca tcttcaagca gcccttcatg agacccgtgc agaccacaca ggaggaagac 2520

ggctgctctt gcaggtttcc cgaggaggaa gagggaggtt gcgagctgag ggtgaagttc 2580

agcagaagcg ccgacgctcc agcttatcag cagggccaga accagctgta caacgagctg 2640

aacctgggca ggagagagga gtacgacgtg ctggacaaga ggagaggcag agacccagag 2700

atgggcggca agcctagaag gaagaacccc caggagggcc tgtacaacga gctgcagaag 2760

gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg gcgagaggag aagaggcaag 2820

ggacacgacg gactgtatca gggactgagc accgccacaa aggacacata cgacgccctg 2880

catatgcagg ctctgcctcc tagatga 2907

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 18

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 19

ggcggcggag gatctggagg aggaggaagc ggaggaggag gatcaggagg aggcggatct 60

Claims

1.一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述CAR含有靶向CD19的scFv和靶向CD20的scFv，其中，所述靶向CD19的scFv含有SEQ ID No.:8所示的重链可变区和SEQ ID No.:9所示的轻链可变区，所述靶向CD20的scFv含有SEQ ID No.:10所示的重链可变区和SEQ IDNo.:11所示的轻链可变区。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CAR的结构如下式I所示：

L-scFv1-I-scFv2-H-TM-C-CD3ζ (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

I为柔性接头；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

3.一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，其特征在于，所述CAR-T细胞表达如权利要求1所述的嵌合抗原受体CAR。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的嵌合抗原受体。

5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有如权利要求4所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有如权利要求5所述的所述的载体或染色体中整合有外源的如权利要求4所述的核酸分子。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及如权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的载体、或如权利要求6所述的细胞。

8.如权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的载体、或如权利要求6所述的细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物或制剂。

9.一种治疗疾病的方法，其特征在于，包括给需要治疗的对象施用适量的如权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的载体、或如权利要求6所述的细胞、或如权利要求7所述的药物组合物。

10.一种制备CAR-T细胞(CAR-修饰的T细胞)的方法，其特征在于，所述CAR-T细胞表达如权利要求1所述的嵌合抗原受体，

所述方法包括步骤：将如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求5所述的载体转导入T细胞内，从而获得所述CAR-T细胞。