CN102190728A

CN102190728A - 一种新型人源化抗cd20单克隆抗体

Info

Publication number: CN102190728A
Application number: CN2010101503033A
Authority: CN
Inventors: 刘劼; 张永克
Original assignee: YONGZHUO BOJI (SHANGHAI) BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Yongzhuo Boji (Shanghai) Biological Medical Technology Co., Ltd.; Shanghai Pharmaceuticals Holding Co Ltd
Priority date: 2010-03-17
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2030-03-17
Also published as: DK2548574T3; BR112012022887B1; US20130089540A1; CN102190728B; EP2548574A1; US9045543B2; BR112012022887A2; EP2548574B1; EP2548574A4; ZA201206835B; WO2011113308A1

Abstract

本发明公开了一种新型人源化抗CD20单克隆抗体的设计及制备方法，相关基因，蛋白质序列以及该抗体应用。与鼠抗及人鼠嵌合抗体相比，该人源化抗CD20抗体既保留或提高了可变区的高亲和性，又减低了嵌合抗体的免疫原性，从而达到减少药物副作用，改善临床治疗效果。本发明所述抗体在动物细胞中高效表达，可用于工业化生产。对B细胞淋巴瘤，白血病和与B细胞有关的自身免疫病有广泛应用前景。

Description

一种新型人源化抗CD20单克隆抗体

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体的，本发明涉及单克隆抗体人源化技术，基因重组技术及抗体的表达制备。与鼠抗，人鼠嵌合抗体和其他人源化抗体相比，本发明所涉及的新型人源化抗CD20单克隆抗体进一步降低了抗体的免疫原性，同时保持了良好的抗原识别活性和体内体外抗瘤功能，有更好的临床应用前景。

背景技术

CD20属于MS4A蛋白家族，有四个跨膜区域，C端和N端位于细胞膜内，分子量约为35kDa(Cragg，et al，Curr.Dir.Autoimmun.8：140-174)。CD20作为B淋巴细胞表面膜蛋白，与B淋巴细胞Ca²⁺的跨膜传导密切相关，对B淋巴细胞的增殖和分化具有调节作用。CD20仅在前-B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、激活B淋巴细胞中表达，而在浆细胞、淋巴多能干细胞以及其它组织均无CD20的表达。CD20的自然配体尚未明确。由于CD20在90％以上B细胞非何杰金氏淋巴瘤高度表达(Blood63(6)：1424-1433，1984)，因此CD20成为B细胞淋巴瘤抗体治疗的一个很好靶点。抗CD20单克隆抗体在体内和体外已被证明对B细胞淋巴瘤有很好药效(Reff ME et al，Cancer Control 2002；9：152-66.)。当抗CD20抗体与CD20结合后，可以通过抗体依赖的细胞毒(ADCC)作用(Clynes RA et al.Nat Med，2000；6：443-6)，补体依赖的细胞毒(CDC)作用(Harjunpaa A，et al，Scand J Immunol 2000；51：634-41)，和/或直接诱导肿瘤细胞凋亡(Apoptosis；Pedersen IM，et al，Blood 2002；99：1314-9)等综合机制来杀伤肿瘤细胞。由于抗CD20抗体只针对性地杀伤带有CD20表面抗原的B细胞，与化疗药相比，大大地降低了治疗过程中带来的副作用，因此为非何杰金氏淋巴瘤患者提供了一个有效安全的靶向治疗手段。近年来，抗CD20抗体的研究与临床应用发展迅速。美国食品与药物管理局于1997，2002，2003年分别批准了CD20抗体美罗华(Rituximab)、Zevalin和Bexxar用于非何杰金氏淋巴瘤的治疗。其中，美罗华为人鼠嵌合抗体，包含鼠源单克隆抗体的可变区和人源IgG1重链及κ轻链的恒定区(Gopal and Press，J Lab Clin Med，1999；134：445-450)。Zevalin是鼠单克隆抗体与放射性核素90^Y偶联物。Bexxar则是鼠源单克隆抗体与放射性核素¹³¹I共价偶联而成。单独使用美罗华治疗复发及难治的非何杰金氏淋巴瘤有效率达50％左右，与化疗药物联合使用，则有效率可达90-100％。由于CD20也在毛细胞白血病和B细胞性慢性淋巴细胞白血病表达，近年来，抗CD20抗体临床适应症进一步扩大，美罗华与化疗联合治疗慢性淋巴细胞性白血病已产生了令人满意的结果(Cheson，et al.2006，Cancer Immunol.Immunother.55：188-196.)。由于良好的疗效及较低的副作用，美罗华已经成为销售额最大的抗肿瘤药物之一，2008年的销售额近50亿美元。

此外，B细胞在自身免疫疾病发病机理中也起核心作用。多种自身免疫疾病涉及B细胞异常激活，产生抗自身抗体，介导自身免疫反应。包括急性特发性血小板减少性紫癜，慢性特发性血小板减少性紫癜，重症肌无力，狼疮性肾炎，红斑狼疮和类风湿性关节炎。最常用的治疗药物是皮质激素和细胞毒类药物，这些药物毒性很大，对骨髓，肝脏和肾脏有毒副作用，并且可抑制整个免疫系统，导致严重的感染。近年来，抗B细胞疗法已被证明能有效治疗人自身免疫疾病。美罗华可有效地减少体内B淋巴细胞，消除B细胞产生的自身抗体。用于治疗自身免疫疾病，对类风湿性关节炎，可显著改善症状。FDA已批准美罗华治疗中重度类风湿性关节炎患者(Summers et al，2005.Ann.Pharmacother.39：2091-2095)。

然而给予治疗性抗体的最大隐患是人体对外源抗体蛋白所引起的免疫应答，而产生抗抗体反应(AAR)。鼠源抗体作为外源蛋白，反复刺激人体，可引起超敏反应，被称为人抗鼠抗体反应(HAMA)。因此鼠源抗体在体内可能被抗抗体中和，进而被快速清除，甚至导致严重的过敏反应而致死。另外，鼠源单克隆抗体缺乏人抗体具有的免疫效应功能，如ADCC和CDC作用，而疗效不佳。美罗华作为人鼠嵌合抗体，虽然含有人的Fc段，但在抗体的重轻链可变区仍然是鼠抗序列，仍被人体视为外源蛋白，导致免疫原性，产生中和抗体，降低持续性用药的治疗效果。尤其低剂量长期治疗，更易产生免疫原性。美罗华在治疗系统性红斑狼疮时比治疗非何杰金氏淋巴瘤免疫原性更高(Cartron G.et al，Critical Reviews in Oncology/Hematology，Volume 62)。

为进一步减低免疫原性，产生了以“CDR移植”为主要手段的抗体人源化技术(Riechman et al.Nature，332：323-327，1988)。该技术将鼠抗的CDR区移接连入人抗体的框架区。从而减少鼠抗框架区导致的免疫原性。目前，用此技术获得的人源化抗CD20抗体包括健泰科生物技术公司的2H7单抗(CN101418045A)；免疫医疗公司的A20单抗(CN1662557A)；VACCINEX公司的H1286/L373，大阪大学的1K1791单抗(WO2009031230A1)以及中信国健的9D3单抗。

尽管如此，这类抗体的人源化框架与鼠源性CDR区的氨基酸组合也可能被T细胞识别而引起免疫应答。T细胞对异源蛋白的识别主要由抗原呈递细胞表面的MHC II与蛋白多肽结合后，呈递给T细胞受体，进而活化淋巴细胞，产生免疫应答。因此，设计选择人源框架时，应能够尽可能降低其框架多肽与MHC II(HLA-DR)分子的结合，从而使人源化抗体的免疫应答降低到最小。本发明人源化抗体在鼠2B8(Reff，M.E.等(1994)Blood 83：435-445)的序列基础之上，依靠本申请描述的抗体人源化技术，设计选择了与MHC II(HLA-DR)结合位点少的人胚系(germline)抗体框架序列进行2B8的人源化，大大的减少免疫原性。同时，在低免疫源性框架的前提下，通过分子对接的方法适当调整CDR区的序列结构，可保持或提高良好的抗原识别活性和体内体外抗瘤功能。对多种涉及B细胞异常激活的自身免疫疾病，也有广泛应用前景。

发明内容

本发明涉及一种人源化抗CD20单克隆抗体，该抗体的重链可变区由SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列组成，轻链可变区含有SEQID NO：34，SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列组成。

本发明涉及一种人源化抗CD20单克隆抗体，所述人源化抗CD20单克隆抗体是表1中所示抗体，即为人源化抗体1534、1634、1535、1635或3637。

如上所述的抗体，其中所述抗体可以是一种单价抗体，多价抗体，单链抗体，一种含有单一抗原结合臂的抗体，或Fc区修饰的可与毒性药物结合的抗体。

本发明涉及一种DNA分子，它编码如上所述的抗体。

本发明涉及一种RNA分子，它编码上述所述的抗体，或含有编码如上所述的抗体的DNA序列的互补序列。

本发明涉及一种表达载体，它含有编码如上所述的抗体的DNA分子。

本发明涉及一种宿主细胞，它含有载体，所述载体含有编码如上所述的抗体的DNA分子。

本发明涉及一种组合物，其包含如上所述的抗体以及药学上可接受的载体。

本发明涉及一种组合物，它含有如上所述的抗体以及药学上可接受的辅料制成的制剂，用于对B细胞淋巴瘤，白血病和与B细胞有关的多种自身免疫病的临床治疗。

本发明涉及一种制品，包含一种容器以及容器中的组合物，所述组合物包含如上所述的抗体。

本发明涉及如上所述的人源化CD20结合抗体，在制备治疗CD20阳性癌症、B细胞淋巴瘤、B细胞性慢性淋巴细胞白血病、自身免疫病例如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、狼疮性肾炎、红斑狼疮和类风湿性关节炎的药物中的用途。

本发明涉及一种筛选和制备如上所述人源化抗体的方法：分析鼠抗CD20抗体2B8的重链可变区的序列，根据其重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列对人抗体基因序列库进行比较，找出与鼠抗2B8重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗体(比成熟抗体免疫源性更低)可变区相对应序列。然后经过in silicon方法，如用NetMHCIIpan软件或自编软件，分析所述序列与HLA-DR分子结合的亲和性，选出亲和性最低的框架序列，从而最终确立重链可变区的FR1，FR2，FR3和FR4的人源化序列。在此框架结构的基础上，应用计算机分子模型分析鼠2B8抗CD20抗体的可变区立体空间结构，分析出支持CDR构型所需保留的鼠2B8抗体对应框架氨基酸残基(线性序列邻近CDR抗原结合位点或据CDR 6埃以内的氨基酸残基)，设计出不同组合的人源化重链可变区的序列，优选所述序列；同样，分析鼠抗CD20抗体2B8的轻链可变区的序列，根据其轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列对人抗体基因序列库(NCBI Ig BLAST)进行比较，找出与鼠抗2B8轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应序列，然后经过insilicon分析所述序列与HLA-DR分子结合的亲和性，选出亲和性最低的框架序列，从而最终确立轻链可变区的FR1，FR2，FR3和FR4的人源化序列。在此框架结构的基础上，应用计算机分子摸型分析鼠2B8抗CD20抗体的可变区立体空间结构，分析出支持CDR构型所需保留的鼠2B8抗体对应框架氨基酸残基，设计出不同组合的人源化轻链可变区的序列。

在此基础上，还可以应用分子对接分析CD20抗原靶位(¹⁷⁰ANPS¹⁷³)及其周边氨基酸残基¹⁶⁸E，¹⁶⁹P，¹⁷⁴E和¹⁷⁵K与人源化重链可变区的立体空间结合方式，通过计算静电力，溶液媒合(salvation)，范德华引力和熵值，选择CDR1，CDR2和CDR3序列中可以优化的氨基酸，以改善抗体CDR区域与CD20抗原表位的结合，以获得更好活性抗体，优选该抗体重链可变区含有SEQ ID NO：36；

上述得到的重链可变区和轻链可变区分别连接重链恒定区和轻链恒定区，优选连接来源于健康人B淋巴细胞的重链恒定区IgG1、轻链恒定区κ，从而获得完整的重链和轻链，将不同的重链和轻链进行组合获得所需的抗体分子。

本发明提供了一种新型人源化抗CD20单克隆抗体，其特点是进一步降低了人源化抗体的免疫源性。该抗体由与Seq ID No.15或Seq ID No.16相同的氨基酸序列得到的与CD20结合的重链可变区和与Seq ID No.34或Seq ID No.35相同的氨基酸序列得到的与CD20结合的轻链可变区所组成。本发明的抗体也可通过图10所示位置的CDR区氨基酸优化和通过图11所示位置的氨基酸优化，进一步保留和加强其生物活性。通过组合所得到的人源化抗CD20抗体见表1。

本发明的抗体可以是单价的，多价的或单链的抗体。本发明涉及用该抗体抑制CD20阳性B淋巴细胞的方法及其在医药上的应用。

也可通过修饰本发明抗体的Fc段来改善效应子功能，比如在Fc区一个或多个氨基酸的置换或糖基化修饰可能会增强效应子的功能，以致增强抗体依赖细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的活性。

也可通过与本发明抗体偶联放射性同位素，化疗药物或毒素，从而增强抗体细胞毒活性。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一.抗CD20人源化单克隆抗体的设计和制备

分析鼠抗CD20抗体2B8的重链可变区的序列(详见实施例1)，根据其重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列对人抗体基因序列库(NCBI Ig BLAST)进行比较，找出与鼠抗2B8重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗体(比成熟抗体免疫源性更低)可变区相对应序列。然后经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子(主要为DRB1*0101，DRB1*1501，DRB1*0301，DRB1*0401，DRB1*0404，DRB1*0405，DRB1*0701，DRB1*0802，DRB1*0901，DRB1*1101，DRB1*1302，DRB3*0101，DRB4*0101，DRB5*0101，DQB1*0301，及DQB1*0302，因为这些分子代表全世界绝大多数的II型HLA分子)结合的亲和性，选出亲和性最低的框架序列，从而最终确立重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4的人源化序列分别为FR1：Seq ID.No.3，FR2：Seq ID.No.5/Seq ID.No.6，FR3：Seq ID.No.8，和Seq ID.No.9，FR4：Seq ID.No.14。在此框架结构的基础上，应用计算机分子模型分析鼠2B8抗CD20抗体的可变区立体空间结构，分析出支持CDR构型所需保留的鼠2B8抗体对应框架氨基酸残基(线性序列邻近CDR抗原结合位点或据CDR 6埃以内的氨基酸残基)。设计出不同组合的人源化重链可变区的序列SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。

同样，分析鼠抗CD20抗体2B8的轻链可变区的序列(详见实施例2)，根据其轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列对人抗体基因序列库(NCBI Ig BLAST)进行比较，找出与鼠抗2B8轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应序列。然后经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子结合的亲和性，选出亲和性最低的框架序列，从而最终确立轻链可变区的FR1，FR2，FR3和FR4的人源化序列分别为Seq ID.No.18，Seq ID.No.21，Seq ID.No.22，Seq ID.No.23和Seq ID.No.32。在此框架结构的基础上，应用计算机分子模型分析鼠2B8抗CD20抗体的可变区立体空间结构，分析出支持CDR构型所需保留的鼠2B8抗体对应框架氨基酸残基(线性序列邻近CDR抗原结合位点或据CDR6埃以内的氨基酸残基)。设计出不同组合的人源化轻链可变区的序列SEQ ID No.34和SEQ IDNo.35。

在此基础上，还可以应用分子对接分析CD20抗原靶位(¹⁷⁰ANPS¹⁷³)及其周边氨基酸残基¹⁶⁸E，¹⁶⁹P，¹⁷⁴E和¹⁷⁵K与人源化重链可变区的立体空间结合方式。通过计算静电力，溶液媒合(salvation)，范德华引力和熵值，选择CDR1，CDR2和CDR3序列中可以优化的氨基酸，以改善抗体CDR区域与CD20抗原表位的结合，以期获得更好活性抗体，该抗体重链可变区含有以下序列：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGKGLEWIGAIYPGNSDTNYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARST

同理，根据空间结构分析，人源化轻链的CDR1和CDR2与CD20抗原靶位没有直接结合，只有人源化轻链CDR3与重链的CDR1，CDR2和CDR3形成与CD20抗原靶位(¹⁷⁰ANPS¹⁷³)的结合口袋。所以，主要优化轻链的CDR3。该抗体轻链可变区含有以下序列：

DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQWTSKPPTFGGGTKVEIK(Seq ID No：37)，(图11，hVK-2)。

本发明具体得到的人源化抗体有以下组合：

表1.人源化抗CD20抗体组合

抗体名称	VHSEQ ID	VκSEQ ID
			1534	15	34
1634	16	34
			1535	15	35
1635	16	35
			3637	36	37

该人源化抗CD20抗体具有CD20结合活性并且有诱导ADCC，CDC和CD20阳性恶性B细胞凋亡的活性(见实施例)。

重链恒定区采用人IgG1，轻链恒定区采用人κ，均来源于健康人B淋巴细胞。通过基因工程，重叠延伸PCR，连接可变区和恒定区，得到完整的抗体重轻链基因。编码的人源抗CD20的DNA序列可被重组构建成用于哺乳细胞转录表达的载体。本发明的表达载体含有编码的人源抗CD20单克隆抗体的重链和轻链可变区和恒定区的DNA序列。然而，也可有分别构建两种表达载体，一种是含有重链可变区和恒定区的，另一种是含有轻链可变区和恒定区的，一同转染哺乳细胞。表达载体进一步含有启动子和编码分泌信号肽的DNA序列，以及至少一种用于筛选的抗药基因。所用方法包括DNA合成技术和体外重组技术。适用于本发明的载体可以是病毒的或非病毒的。优选的病毒载体包括腺病毒，腺相关病毒，单纯疱疹病毒，慢性病毒和反转录病毒载体。非病毒载体为质粒。

二.抗体的制备方法

重组抗体的制备方法包括(i)线性化含有编码本发明人源抗CD20单克隆抗体的表达载体(ii)用线性化载体转染哺乳动物细胞，轻链和重链可用不同载体共同转染单个细胞中或用含有重链和轻链编码基因的单一表达载体转染细胞(iii)选择表达抗药基因的转染细胞(iv)从转染细胞中分离出分泌本发明人源化抗CD20单克隆抗体的细胞。具体地，编码本发明抗体的核苷酸可直接引入到宿主细胞中，将细胞在可以充分诱导编码抗体表达的条件下进行培养。任何适用于表达的细胞都可以用作宿主细胞。例如，酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞等。具体地，用通常不产生抗体的哺乳动物细胞系，比如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，Cos-7细胞和其他哺乳动物细胞比如PER.C6细胞。合适的方法包括电穿孔术，lipofactemine，基因枪技术，磷酸钙沉淀，直接的显微注射法等等。方法的选择通常取决于被转化细胞的类型及发生转化的环境。

为了重组抗体的长期、高产率的制备，需要用稳定的表达。在重组质粒中的抗药基因能筛选稳定地将质粒整合到染色体上，并长成可被克隆的细胞集落。

在细胞培养期，转化细胞通过一系列的生物反应器来扩增接种细胞，从培养液中生产并积聚出抗CD20抗体。在培养期，转化细胞通过本领域已知的方法，在含有可同化的碳源(碳水化合物比如葡萄糖或乳糖)，氮源(氨基酸、肽、蛋白质或其退化产物比如蛋白胨、铵盐等)及无机盐(硫酸盐、磷酸盐和/或钠、钾、镁和钙的碳酸盐)的液体介质中进行培养。优选的培养基包括常规的Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)(Sigma)，Ham′s F10(Sigma)，Minimal Essential Medium(MEM)(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)或NCTC-135。这些培养基中的任何一种都可以在必要时加入氨基酸(如谷氨酰胺)，激素或其他生长因子(胰岛素，转铁蛋白或表皮生长因子)，缓冲液，核苷酸，离子表面活性剂和葡萄糖或相等能量源来进行补充。培养基可进一步含有促进生长的微量元素比如螯合铁(比如chelate B，Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)和镁。在培养期，要监测培养条件比如温度，pH等等以确保快速的细胞生长。

制备出的本发明抗体分子，可以通过本领域已知的方法进行纯化。例如，蛋白A亲和色谱法以及离子交换色谱法等蛋白纯化标准技术来进行本发明抗体分子的纯化。

三.制剂

本发明抗体可通过常规方法用一种或多种药学上可接受的辅料制成制剂。术语“药学上可接受的辅料”是指一种或多种有机或无机组分，天然或合成的，与抗体联合可促进其稳定和临床应用的载体。合适的载体包括本领域技术人员已知的药学上可接受的无菌盐水及含水和无水等渗无菌液和无菌混悬液。本发明抗体尤其在150mM氯化钠，pH6.5的25mM柠檬酸盐，脱水草酸三钠，0.05％山梨醇酯80组成的制剂中，有很好的稳定性。

四.给药剂量和方式

有效剂量可以根据个体的情况来确定，并且在某种程度上要考虑到治疗的症状及效果。有效剂量可以根据体外细胞培养或者实验动物的标准药学规程来确定，例如确定LD₅₀(半数致死量)和ED₅₀(半数有效治疗剂量)。毒性与疗效的剂量比为治疗指数，可以表述为LD₅₀/ED₅₀。选取具有较大治疗指数值的治疗方法。从体外细胞培养及动物研究获得的数据可以用于制定人类使用的相关剂量。典型的剂量包括但不限于0.5mg/kg至100mg/kg的范围。该治疗的剂量是在一个低毒或无毒ED₅₀的血浆浓度范围内。这个范围内的剂量可能随着使用剂型与给药途径的不同而有所变化。在一种治疗方案中，治疗的有效剂量可以通过动物模型，估计外周循环血浆浓度范围，来更精确地确定人类的有效剂量。

本发明中的抗体可以通过任何药学上可以接受的方式来给药。这包括注射方式，通过诸如静脉、动脉、皮下的、肌肉内、肿瘤内、腹膜内、心室内，蛛网膜下腔或插入供应局部肿瘤的血管的导管方式等非肠胃途径给药注射方式；或者其他通过体表方式缓释给药。

五、临床治疗应用

使用本发明人源化抗CD20抗体作为治疗B细胞异常所致疾病的主要组分。尤其是，特别应用于非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病以及瓦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)，也包括各种自身免疫性疾病，如免疫介导的血小板减少症，如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、干燥综合症(Sjogren′s syndrome)、多发性硬化症、希德罕氏舞蹈症(Sydenham′s chorea)、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、风湿性关节炎、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、过敏性紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎(Takayasu′s arteritis)、爱迪生氏病(Addison′s disease)、风湿性关节炎、肉样瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture′s syndrome)、阻塞性动脉炎(thromboangitis ubiterans)、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、甲状腺功能亢进、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格内肉芽肿(Wegener′s granulomatosis)、膜性肾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎与纤维性肺泡炎。

该治疗组分至少包括抗CD20抗体，或者联合化疗制剂或免疫调节剂的其他治疗药物。

本发明的抗体也可以是衍生抗体，包括单价的，多价的或单链的抗体。

本发明的抗体也可以是修饰抗体，包括Fc片段的改善，增强效应子功能，比如在Fc区一个或多个氨基酸的置换或糖基化修饰可能会增强效应子的功能，以致增强抗体依赖细胞毒性和/或补体依赖细胞毒性的活性。也可通过与本发明抗体偶联放射性同位素，化疗药物或毒素，以致增强抗体细胞毒活性。

本发明提供的人源化抗CD20单克隆抗体，进一步降低了人免疫原性，保留并提高了治疗效果，为治疗B淋巴细胞瘤和B细胞有关的多种自身免疫病提供了一种安全有效的药物。

说明书附图

图1.与鼠抗2B8重链可变区的FR1序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR1序列。

图2.与鼠抗2B8重链可变区的FR2序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR2序列。

图3.与鼠抗2B8重链可变区的FR3序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR3序列。

图4.与鼠抗2B8重链可变区的FR4序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR4序列。

图5.与鼠抗2B8轻链可变区的FR1序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR1序列。

图6.与鼠抗2B8轻链可变区的FR2序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR2序列。

图7.与鼠抗2B8轻链可变区的FR3序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR3序列。

图8.与鼠抗2B8轻链可变区的FR4序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR4序列。

图9.人源化抗CD20抗体重链可变区序列9A，9B；人源化抗CD20抗体轻链可变区序列9C，9D；9A、9B、9C和9D分别对应序列表中的SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：34、SEQID NO：35。

图10.人源化抗CD20抗体重链可变区优化CDR序列，SEQ ID NO：16和36。

图11.人源化抗CD20抗体轻链可变区优化CDR序列，SEQ ID NO：35和37。

图12.为抗CD20人源化单克隆抗体对CD20⁺ Ramos淋巴瘤细胞特异性结合，对CD20^- T细胞白血病Jurkat细胞无结合。图A：Ramos淋巴瘤细胞；图B：Jurkat白血病细胞。

图13.树突状细胞(DC)-T细胞激活实验测定人源化抗CD20抗体体外免疫原性(n＝20)。

图14.为抗CD20人源化单克隆抗体对CD20+ Ramos淋巴瘤细胞的补体依赖细胞毒性(CDC)结果。

图15.为抗CD20人源化单克隆抗体对CD20+ Ramos淋巴瘤细胞的抗体依赖细胞毒性(ADCC)结果。

图16.为抗CD20人源化单克隆抗体对CD20+ Ramos淋巴瘤细胞的体内药效结果。

具体实施方式

1.抗CD20鼠抗2B8人源化抗体重链可变区框架序列的设计

以下为鼠抗CD20抗体2B8的重链可变区的序列，下划线部分为鼠抗框架序列：

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA

根据以鼠抗CD20抗体2B8的重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列对人抗体基因序列库(NCBI Ig BLAST)进行比较，找出与鼠抗2B8重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗体(比成熟抗体免疫源性更低)可变区相对应FR1，FR2，FR3和FR4序列.

图1为与鼠抗2B8重链可变区的FR1(Seq ID No：1，即QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFT)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR1序列，找出的10个有相似的FR1序列的人胚系(germline)抗体含有2个不同序列，分别为：

Seq ID No：2

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT

Seq ID.No：3

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

再经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，主要的HLA-DR分子为HLA-DRB1-0101，HLA-DR B1-0301，HLA-DR B1-0401，HLA-DR B1-0701，HLA-DR B1-1101，HLA-DR B1-1301，HLA-DR B1-1501，原始鼠源FR1(Seq ID NO：1)序列含有三个潜在的HLA-DR结合位点，人源序列Seq ID No：2含有两个潜在的HLA-DR结合位点，而人源序列Seq ID No：3只有一个较低的HLA-DR潜在结合位点。因此选出亲和性较低的Seq IDNo：3为人源化的重链可变区FR1的框架序列。

同样，图2为与鼠抗2B8重链可变区的FR2(Seq ID No：4，即WVKQTPGRGLEWIG)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR2序列，找出的10个有相似的FR2序列的人胚系(germline)抗体含有2个不同序列，分别为：

Seq ID No：5

WVRQPPGKGLEWIG

Seq ID No：6

WVRQAPGKGLEWVG

再经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，Seq ID NO：5和Seq ID NO：6亲和性均低于鼠源FR2序列，选出亲和性较低的Seq ID No：5或Seq ID No：6为人源化的重链可变区FR2的框架序列。

同样，图3为与鼠抗2B8重链可变区的FR3(Seq ID No：7，即KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR3序列，找出的10个有相似的FR3序列的人胚系(germline)抗体含有2个不同序列，分别为：

Seq ID No：8

RVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

Seq ID No：9

RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

再经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，Seq ID NO：8和Seq ID NO：9亲和性均低于鼠源FR3序列，均可用于作为人源化的重链可变区FR3的框架序列。

同样，图4为与鼠抗2B8重链可变区的FR4(Seq ID No：10，即WGAGTTVTVSA)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR4序列，找出的6个有相似的FR4序列的人胚系(germline)抗体含有3个不同序列，分别为：

Seq ID No：11

WGQGTLVTVSS

Seq ID No：12

WGRGTLVTVSS

Seqe ID No：13

WGQGTMVTVSS

Seq ID No：14

WGQGTTVTVSS

再经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，选出亲和性较低的Seq ID No：14为人源化的重链可变区FR4的框架序列。

所以根据框架序列优化，设计出两种人源化抗体重链可变区序列(图9A，9B)：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQPPGKGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTTVTVSS(Seq ID No：15；参照Seq ID No：9)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTTVTVSS(Seq ID No：16，参照Seq ID No：8)

2.抗CD20鼠抗2B8人源化抗体轻链可变区框架序列的设计

以下为鼠抗CD20抗体2B8的轻链可变区的序列，下线部分为鼠抗框架序列：

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGS GTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK

根据以鼠抗CD20抗体2B8的轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列对人抗体基因序列库(NCBI Ig BLAST)进行比较，找出与鼠抗2B8轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR1，FR2，FR3和FR4序列.

图5为与鼠抗2B8轻链可变区的FR1(Seq ID No：17，即QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTC)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR1序列，找出的10个有相似的FR1序列的人胚系(germline)抗体含有2个不同序列，分别为：

Seq ID No：18

DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITC

Seq ID No：19：

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC

再经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，主要的HLA-DR分子为HLA-DR B1-0101，HLA-DR B1-0301，HLA-DR B1-0401，HLA-DR B1-0701，HLA-DRB1-1101，HLA-DR B1-1301，HLA-DR B1-1501，原始鼠源序列FR1(Seq ID No：17)含有四个潜在的HLA-DR结合位点，人源序列Seq ID No：18)和人源序Seq ID No：19)在潜在的HLA-DR结合位点亲和性明显减低。因此选出亲和性较低的Seq ID No：18为人源化的轻链可变区FR1的框架序列。

同样，图6.为与鼠抗2B8轻链可变区的FR2(Seq ID No：20，即WFQQKPGSSPKPWIY)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR2序列，找出的7个有相似的FR2序列的人胚系(germline)抗体含有4个不同序列，分别为：

Seq ID No：21

WFQQKPGKAPKSLIY

Seq ID No：38

WYQQHPGTVPKPMIY

Seq ID No：39

WFQQKPGQAPRALIY

Seq ID No：40

WFQQKPGQAPRTLIY

再经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，Seq ID NO：21和Seq ID NO：38亲和性均低于鼠源FR2序列，选出亲和性较低的Seq ID No：21为人源化的轻链可变区FR2的框架序列。

同样，图7为与鼠抗2B8轻链可变区的FR3(Seq ID No：22，即GVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR3序列，找出的7个有相似的FR3序列的人胚系(germline)抗体含有5个不同序列，分别为：

Seq ID No：23

GVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYC

Seq ID No：24

GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYC

Seq ID No：25

GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC

Seq ID No：26

GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLQSEDFAVYYC

Seq ID No：27

GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC

再经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，选出亲和性较低的Seq ID.No.23为人源化的轻链可变区FR3的框架序列。

同样，图8为与鼠抗2B8轻链可变区的FR4(Seq ID No：28，即WGAGTTVTVSA)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应FR4序列，找出的5个有相似的FR4序列的人胚系(germline)抗体含有5个不同序列，分别为：

Seq ID No：29

FGQGTKVEIK

Seq ID No：30

FGQGTKLEIK

Seq ID No：31

FGPGTKVDIK

Seq ID No：32

FGGGTKVEIK

Seq ID No：33

FGQGTRLEIK

再经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，选出亲和性较低的Seq ID No：32为人源化的轻链可变区FR4的框架序列。

所以根据框架序列优化，设计出人源化抗体轻链可变区序列(图9C)：

DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKSLIYATSNLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIK(Seq ID No：34)

在此基础上，用计算机分子摸型(Swiss-PdbViewer)分析鼠2B8抗CD20抗体的可变区立体空间结构，分析出44位氨基酸残基P支持CDR构型，保留氨基酸残基P会更有利于CDR的结构(图9D)。

DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIK(Seq ID No：35)。

同理，根据空间结构分析，人源化轻链的CDR1和CDR2与CD20抗原靶位没有直接结合，只有人源化轻链CDR3与重链的CDR1，CDR2和CDR3形成与CD20抗原靶位(¹⁷⁰ANPS¹⁷³)的结合口袋。所以，只需优化轻链的CDR3。该抗体轻链可变区含有以下序列：

本发明具体得到的人源化抗体有以下组合：

表1.人源化抗CD20抗体组合

3.抗CD20人源化单克隆抗体的制备

根据人源化重链序列和轻链序列(表1)，设计并合成编码重链和轻链可变区序列的PCR引物寡核苷酸片段。相邻寡核苷酸片段约有18个碱基重叠，PCR引物寡核苷酸片段一般长约54个碱基。混合同等量的各个PCR引物片段，进行重叠延伸PCR反应。

PCR反应体系：dNTPs 0.2μM(最终浓度)；每个PCR引物片段1μl；10×buffer 3μl；cloned pfu(Invitrogen)1μl；加水至30μl。

PCR反应条件：94℃3min→(94℃30s→56℃30s→72℃1min)×30→72℃10min

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段，经EcoRI酶切后，克隆到pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)载体中，转化到大肠杆菌TOPO10(Invitrogen)后在LB/Kanamycin平板上进行筛选，取10个白色菌斑接种于含有Kanamycin的LB液体培养液中培养，用QIAGEN质粒提取试剂盒(QIAquick PCR purification kit)提取质粒并进行测序，确定重链和轻链可变区序列。

4.构建表达载体

从正常人B细胞分离RNA，用PCR方法获得人重链恒定区Fc片段和轻链恒定区κ片段，并将其预先构建到pcDNA3.1(Invitrogen)表达载体中，经DH5α细菌转化，质粒提取和测序确定阳性克隆。重链可变区由Eco47III/NheI从pCR-BluntII-TOPO的阳性克隆切下，克隆连入pcDNA3.1-Fc表达载体中。轻链可变区由AscI/BsiWI从pCR-BluntII-TOPO的阳性克隆切下，克隆连入pcDNA3.1-κ表达载体中。再次经过DH5α细菌(转化，质粒提取和测序确定阳性克隆。测序结果与表1记录的抗体的编码序列一致)。

5.转染CHO细胞及筛选阳性克隆

细胞系及培养条件：CHO-S细胞(Invitrogen)培养条件为1×CD-CHO(GIBCO)，1×HT(GIBCO)，8mM谷氨酰胺(GIBCO)，培养于37℃，8％ CO₂温箱。

转染CHO-S细胞采用DMRIE-C转染试剂盒(Invitrogen)，按照试剂盒说明书操作。转染后的第三天，细胞培养于上述的培养液并加有500μg/ml G418(GIBCO)和12.5μg/ml嘌呤霉素(Sigma)进行加压筛选。加压约14天后，挑出单克隆，以直接竞争ELISA挑选阳性克隆。挑选出的阳性克隆培养于六孔板中，每个克隆细胞数为2.5×105/ml。六孔板培养后的第四天，检测每个克隆细胞数，并用直接竞争ELISA的方法检测每个克隆细胞抗体表达量。表达率(production rate)以以下公式计算：pg/cell/day＝10⁹×ug/ml(from ELISA，＝mg/L)(Daysin culture)×(Day 0 seeded via cells/ml+Day 3-4 harvested via cells/ml)/2)×1000。对每个克隆细胞抗体表达率进行比较，挑选出表达率最高的表达株，大批量培养。人源化抗-CD20抗体是从细胞培养物上层清液中通过蛋白A的亲和层析柱来纯化的。

6.细胞FACS检测抗体的特异性

以CD20+Ramos细胞(ATCC)和T淋巴细胞白血病Jurkat细胞(ATCC)检测表达抗体对CD20的特异性结合能力。细胞与不同浓度的产物抗体结合，4℃，1小时。用PBS洗三遍，加入100倍稀释的FITC标记的抗人Fcγ特异性二抗(The Jakson Laboratory)，4℃一小时。PBS洗三遍后用FACS仪器检测结合的信号。所发明人源化抗CD20抗体1534、1634、1535、1635、3637均能与CD20+B细胞Ramos特异结合，与CD20-T淋巴细胞白血病Jurkat细胞无结合。3637与抗原结合力进一步提高(图12)。

7.In silicon体外抗体免疫原性体检测

抗体免疫原性用in silicon方法(如NetMHCIIpan或自编程序)分别分析本发明所制备的人源化抗CD20抗体与HLA-DR分子结合的亲和性，并与背景技术中所提及的嵌合抗体和其他人源化抗CD20抗体进行比较。所测定抗CD20抗体重链中含有高亲和位点(亲和力affinity＜100nM)序列见表2。

表2。人源化抗CD20抗体重链与HLA-DR分子结合的亲和性

抗体重链	序列	亲和力(nM)

1534，1535，1634，1635	YMELSSLRS	20.57
			YFNVWGQGT	88.72

3637HC	YMELSSLRS	20.57
			hA20VH2	VRQAPGQGL	76.88
	LEWMGAIYP	71.79
				YMELSSLRS	20.57
H1286	VRQAPGQGL	76.88
				FKGKATITA	69.29
	YMELSSLRS	20.57
			美罗华	LQQPGAELV	67.68
	VKPGASVKM	71.22
				VKQTPGRGL	81.66
	FKGKATLTA	64.52
				YMQLSSLTS	16.57
	YFNVWGAGT	72.34

嵌合抗体美罗华重链含有6个HLA-DR高亲和位点(Kd＜100nM)。人源化抗CD20抗体hA20VH2(免疫医疗公司)和H1286/L373(VACCINEX公司)重链含有3个高亲和位点(Kd＜100nM)；而本发明人源化抗CD20抗体1534，1535，1634，1635重链含有2个高亲和位点，3637进一步减少到只含有1个高亲和位点，因此本发明人源化抗CD20抗体的重链免疫原性比背景技术中所提的嵌合抗体和其他人源化抗CD20抗体明显降低。

所测定抗CD20抗体轻链中含有高亲和位点(亲和力affinity＜100nM)序列见表3。

抗体	序列	亲合力(nM)

1534，1535，1634，1635	VMTQSPAFL	46.11
			MTQSPAFLS	35.89
	LIYATSNLA	39.67
			IYATSNLAS	53.45

3637	VMTQSPAFL	46.11
				MTQSPAFLS	35.89
	LIYATSNLA	39.67
				IYATSNLAS	53.45
hA20VK	LTQSPSSLS	36.95
				WIYATSNLA	31.84
	IYATSNLAS	73.45
				LASGVPVRF	76.15
L373	MTQSPSSLS	50.14
				LIYAASSLQ	67.47
	IYAASSLQS	71.96
				LQSGVPSRF	80.28
	YTLTISSLQ	91.97
			美罗华	IVLSQSPAI	79.06
	VLSQSPAIL	67.87
				LSQSPAILS	27.23
	LSASPGEKV	72.8
				WIYATSNLA	31.84
	IYATSNLAS	73.45
				LASGVPVRF	76.15

嵌合抗体美罗华轻链含有7个HLA-DR高亲和位点(Kd＜100nM)。人源化抗CD20抗体H1286/L373(VACCINEX公司)的轻链含有5个高亲和位点；hA20VK(免疫医疗公司)含有4个高亲和位点；而本发明人源化抗CD20抗体1534，1535，1634，1635及3637的轻链虽也含有4个高亲和位点，但亲和力比hA20VK略低。因此本发明人源化抗CD20抗体的轻链免疫原性比背景技术中所提的嵌合抗体美罗华明显降低，比其他人源化抗CD20抗体进一步降低。

8.树突状细胞(DC)-T细胞激活实验测定抗体体外免疫原性.

将从正常志愿者(n＝20)获取的血液吸入至肝素化的注射器中，与相同体积不含Ca²⁺/Mg²⁺的HBSS(Life Technologies)混合，置于淋巴细胞梯度分离剂(Life Technologies)上分层，并且在800g离心30分钟。收集在分界面上的外周血单核细胞，在HEPES缓冲盐水中洗涤，并且再次悬浮于测定培养基(RPMI 1640培养基(Life Technologies)中。所得外周血单核细胞继续在50ml添加1∶100稀释的beta-mercaptoethanol无血清AIM V media(Gibco)贴壁培养2小时收获单核细胞。加入800units/ml的GM-CSF(Endogen)和500units/ml的IL-4(Endogen)；继续培养5天。然后再加入0.2units/ml的TNFα(Endogen)和终浓度为50units/ml的IL-1α(Endogen)继续培养2天。第7天，加入50mg/ml的MitomycinC 1小时，以停止树突状细胞的继续分化，然后以600G离心收集分化成熟的树突状细胞。以2×10⁴细胞/孔(100ul)接种于一个圆底的96孔培养板。用CD4+ Cellect Kit(Biotex)的负向选择来收集人CD4+T细胞：外周血单核细胞悬浮于4ml DPBS和1ml的Cell reagent(Cellect Kit)，然后以600G离心收集细胞，重新悬浮于2ml的DPBS，过Cellect柱，洗脱的CD4+细胞以2×10⁶/ml收集在含有2％人血清的AIMV培养基。在含有100ul树突状细胞的96孔培养板中加入10ul，浓度为5mM的检测抗体1534、1634、1535、1635、3637，然后每孔加入100ul的CD4+细胞。激活的T细胞增值用alamarblue试剂测定。将结果换算成T细胞激活指数(Stimulation Index，SI)。所发明人源化抗CD20抗体的T细胞激活指数比美罗华明显降低(图13)。其结果与In silicon体外抗体免疫原性体检测相符，从而证明所发明人源化抗CD20抗体的免疫原性进一步降低。

9.体外补体依赖细胞毒性(CDC)试验

从大约1×10⁶/ml的RPMI(含15％热灭活的Gibco FBS)悬浮液中收集Ramos细胞，并且在完全培养基(RPMI+15％热灭活的Gibco FBS)中悬浮在4×10⁵个细胞/ml，并且以25μL/孔接种于一个白色平底的96孔培养板。使用培养基将人源抗CD20抗体1534、1634、1535、1635、3637稀释至4倍合适浓度。抗体以每份25μL/孔的形式添加到细胞中。在DMSO中制备10mg/mL的毛地黄皂苷(Sigma，D5628)，并且将其用培养基稀释至浓度为400μg/mL。毛地黄皂苷以25μL/孔的形式加入到细胞中来显示最大细胞溶解，仅加入培养基的孔用来显示自然溶解。加入50μL/孔来自Biorclamation的正常人血清(含人补体)后该培养板在室温下孵育10分钟。之后该培养板在37℃孵育1小时。孵育后，加入阿尔玛蓝(alamar blue)，然后培养板在37℃、5％CO₂的孵育箱中过夜。次日，室温条件下在一个混合器中冷却该培养基15分钟。使用一个96孔的荧光计检测荧光强度。细胞溶解的百分率为用以下公式表示：％补体依赖的溶解＝[(样品RFU-自然溶解RFU)/(最大细胞溶解RFU-自然溶解RFU)]×100。人源化抗CD20抗体1534、1634、1535、1635、3637溶解大约50％的Ramos靶细胞的EC50为1.2μg/mL-2.0μg/ml。相比之下，没有在对照抗体(Avastin)中观察到明显的细胞溶解(图14)。

10.体外抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)试验

正常志愿者获取的血液吸入至肝素化的注射器中，与相同体积不含Ca²⁺/Mg²⁺的HBSS(Life Technologies)混合，置于淋巴细胞梯度分离剂(Life Technologies)上分层，并且在800g离心30分钟。收集在分界面上的PBMC，在HEPES缓冲盐水中洗涤，并且再次悬浮于测定培养基，即含1％热灭活FBS(HyClone Laboratories，Logan，UT)，2nM L-谷氨酰胺，10mMHEPES，和50mg/mL庆大霉素的RPMI 1640培养基(Life Technologies)中。将置于50mL分析缓冲液中的Ramos细胞(ATCC)(10⁴个细胞/孔)和各种浓度的人源抗CD20抗体1534、1634、1535、1635、3637(置于50mL分析缓冲液中)加入到圆底的96孔培养板上。将此混合物在37℃进预培养30分钟。接着将50μL的5×10⁵效应细胞分配于各孔并且在37℃孵育4h。使用40∶1的效应细胞∶靶细胞比率。该培养板在250g离心10分钟，然后收集上清液。使用细胞毒性检测试剂盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)及制造商的说明来检测上清液中的乳酸脱氢酶活性。

2份样本的平均吸光率用来计算毒性的百分比。在4小时的孵育期中大约25-35％的CD20+Ramos细胞被人源化抗CD20抗体1534、1634、1535、1635、3637溶解(图15)。

11.动物药效学实验

给Balb/c裸鼠在第0天时皮下注射Ramos细胞(1×10⁷个细胞/0.1ml/每只小鼠)。肿瘤的尺寸用测径器测量，肿瘤的大小使用公式(长×宽²)/2来计算。当肿瘤大小其平均值达到100mm³(80-160mm³)时，根据肿瘤大小把荷瘤小鼠随机分配成3组。两周内的每个周一、周三和周五，腹腔内给药，即以5mg/kg施以人源化抗CD20抗体1534、1634、1535、1635、3637，PBS(作为阴性对照)及Rituximab(5mg/kg，作为阳性对照)，共计给药7次。肿瘤的体积两周内的每周一、周三和周五测量。如图15所示，对照组中，肿瘤的大小两周中很快增长到＞3000mm³。而无论使用Rituximab阳性对照组还是本发明的人源化抗CD20抗体的小鼠肿瘤的增长都明显抑制，显示出在人源化抗CD20抗体与Rituximab有相似或更好的抗肿瘤活性(图16)。

序列表

<110>刘劼

<120>一种新型人源化抗CD20单克隆抗体

<160>40

<170>PatentIn Version 3.3

<210>1

<211>30

<212>PRT

<213>智人(Home Sapiens)

<400>1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

<210>2

<211>30

<212>PRT

<213>智人(Home Sapiens)

<400>2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

<210>3

<211>30

<212>PRT

<213>智人(Home Sapiens)

<400>3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

<210>4

<211>14

<212>PRT

<213>智人(Home Sapiens)

<400>4

Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210>5

<211>14

<212>PRT

<213>智人(Home Sapiens)

<400>5

Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210>6

<211>14

<212>PRT

<213>智人(Home Sapiens)

<400>6

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

1 5 10

<210>7

<211>32

<212>PRT

<213>智人(Home Sapiens)

<400>7

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210>8

<211>32

<212>PRT

<213>智人(Home Sapiens)

<400>8

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210>9

<211>32

<212>PRT

<213>智人(Home Sapiens)

<400>9

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210>10

<211>11

<212>PRT

<213>智人(Home Sapiens)

<400>10

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210>11

<211>11

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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

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Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

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Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

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Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

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Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys

20

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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly

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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys

20

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

20

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Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

1 5 10 15

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Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

1 5 10 15

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Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210>24

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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210>25

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Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

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Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

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Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

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Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

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<400>28

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

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<211>10

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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210>30

<211>10

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<400>30

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

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<211>10

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<400>31

Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

<210>32

<211>10

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<400>32

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

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<211>10

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Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

1 5 10

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<400>34

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

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Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe SerGly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>35

<211>106

<212>PRT

<213>智人(Home Sapiens)

<400>35

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<400>36

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<400>37

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly

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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu

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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Pro Pro Thr

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Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Thr Val Pro Lys Pro Met Ile Tyr

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<400>39

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210>40

<211>15

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<213>智人(Home Sapiens)

<400>40

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr

1 5 10 15

Claims

1.一种与HLA-DR分子亲合力降低的人源化CD20抗体重链可变区序列，它是Seq ID NO：15及其衍生序列，SEQ ID NO：16及其衍生序列，SEQ ID NO：36及其衍生序列。

2.一种与HLA-DR分子亲合力降低的人源化CD20抗体轻链可变区序列，它是SEQ ID NO：34及其衍生序列，SEQ ID NO：35及其衍生序列，SEQ ID NO：37及其衍生序列。

3.一种人源化抗CD20抗体，它含有上述权利要求1所述任一序列与权利要求2所述任一序列的两两组合而成的序列，它含有下述序列之一：

1)SEQ ID NO：15及其衍生序列和SEQ ID NO：34及其衍生序列组合的序列；

2)SEQ ID NO：16及其衍生序列和SEQ ID NO：34及其衍生序列组合的序列；

3)SEQ ID NO：15及其衍生序列和SEQ ID NO：35及其衍生序列组合的序列；

4)SEQ ID NO：16及其衍生序列和SEQ ID NO：35及其衍生序列组合的序列；

5)SEQ ID NO：36及其衍生序列和SEQ ID NO：37及其衍生序列组合的序列。

4.如权利要求3任一所述抗体，它还含有人IgG1重链恒定区和人κ轻链恒定区。

5.一种含有权利要求1-2任一所述可变区序列的抗体。

6.权利要求3-5的任一所述抗体，它是抗体1534、1634、1535、1635、3637。

7.一种DNA分子，它编码上述权利要求1-2任一所述可变区或编码上述权利要求3-6任一所述抗体。

8.一种用于哺乳细胞转录表达的表达载体，是病毒的或非病毒的，它含有权利要求3-6所述抗体的DNA分子。

9.一种宿主细胞，它含有权利要求8所述载体。

10.一种组合物，它含有权利要求3-6任一所述抗体以及药学上可接受的辅料制成的制剂，用于对B细胞淋巴瘤，白血病和与B细胞有关的多种自身免疫病的临床治疗。

11.一种制品，包含一种容器以及容器中的组合物，所述组合物为权利要求10所述的组合物。

12.权利要求3-6任一所述的人源化CD20结合抗体，在制备治疗CD20阳性B细胞淋巴瘤、B细胞性慢性淋巴细胞白血病、自身免疫病例如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、狼疮性肾炎、红斑狼疮和类风湿性关节炎的药物中的用途。