CN1210307C - 抗cd20人源化单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供具有潜在医学及药学价值的CD20人源化单克隆抗体，其相关基因序列和表达系统。本发明所述抗体在哺乳动物细胞中的高表达，而且，其产物生物活性也明显提高。就应用于临床上治疗B淋巴细胞瘤而言，具有巨大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及单克隆抗体技术，抗体人源化技术，以及基因重组技术。尤其是抗CD20的人源化单克隆抗体。
背景技术
近年来，肿瘤的单克隆抗体治疗是一个研究十分活跃的领域，取得了可喜的进展。对非霍奇金淋巴瘤的单克隆抗体导向治疗也取得了十分重要的进展。已有的研究发现，临床治疗效果最好的是CD20的单克隆抗体。
研究证明，在适当条件下CD20与抗体的结合，能够活化酪氨酸激酶和半胱氨酸蛋白酶，从而介导细胞的凋亡。抗CD20抗体主要是通过抗体依赖的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用、诱导肿瘤细胞凋亡等机制来杀伤肿瘤细胞。CD20在B淋巴细胞分裂周期从G0向G1转变时不同的结合具有调节作用，抗CD20抗体与CD20结合，改变了CD20的功能，势必对B淋巴细胞生长具有影响，不同的抗CD20抗体由于结合位点不同，可引起不同的结合效应。
目前，国内外已经获得了抗CD20的鼠源和人源化单克隆抗体，有的已经在临床研究中获得良好的结果，显示了巨大的应用前景。但一直以来都需要对人免疫原性更小，表达量更高，以及具有其他优良特性的多克隆抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供具有潜在医学及药学价值的CD20人源化单克隆抗体，其相关基因序列和表达系统。
为了实现上述目的，本发明实施了以下技术方案。
本发明提供一种CD20人源化单克隆抗体，包括人源恒区，其重链可变区选自SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：11，和SEQ ID NO：13；其轻链可变区选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，和SEQ ID NO：15；当所述轻链可变区为SEQ ID NO：3时，重链可变区不是SEQ ID NO：4。
本发明还提供了一种DNA分子，编码CD20人源化单克隆抗体的重链可变区或轻链可变区。重链可变区的DNA序列选自：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：9，和SEQ ID NO：14。轻链可变区的DNA序列选自：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，和SEQ ID NO：16。
本发明还提供一种载体，包含所述DNA分子。
本发明还提供一种宿主细胞，包含所述人源化抗体的表达系统。所述的宿主细胞可以是从大肠杆菌等原核细胞例如到CHO等哺乳动物细胞各种适合的细胞。其选择是本领域的常规技术。
优选实施方式之一中，宿主细胞包含相容性表达载体，该载体中包含本发明所述的DNA分子。
本发明还提示了本发明抗体在制备诊断和/或治疗CD20相关疾病中的用途。
本发明的CD20人源化单克隆抗体，实现了在CHO细胞中的高表达，而且，其产物生物活性也明显提高。就应用于临床上治疗B淋巴细胞瘤而言，具有巨大潜力。
附图说明
图1：单克隆抗体9D3、7D3、4E5与2H7的序列比较。其中，分图A是它们重链可变区氨基酸序列比较；分图B是它们轻链可变区氨基酸序列比较；分图C是9D3和2H7重链可变区DNA序列的比较；分图D是9D3和2H7轻链可变区编码序列的比较。
图2：表达载体pMG18-3K的图谱。其中，Ck表示人抗体kappa轻链的恒定区基因；IgG1 constant表示人抗体IgG1的重链恒定区基因(GenBank AccessionNumber P01857，所选载体的N-端序列为Ser-Gla-Ala-Cys-Cys，)；pA表示SV40加poly(A)位点。
图3：用Western印迹方法检测各细胞系表达强度的研究结果。
图4：多克隆抗体特异性荧光染色竞争实验。其中分图A为7D3对B淋巴细胞进行处理后再用Texas Red标记的9D3进行竞争性复染；分图B为7D3对B淋巴细胞处理再用Texas Red标记的4E5复染；分图C为7D3对B淋巴细胞处理后再用Texas Red标记的Rituximab复染；分图D为9D3对B淋巴细胞处理后再用Texas Red标记的7D3复染；分图E为9D3对B淋巴细胞处理后再用Texas Red标记的4E5复染；分图F为9D3对B淋巴细胞处理后再用Texas Red标记的Rituximab复染；分图G为4E5对B淋巴细胞处理后再用Texas Red标记的7D3复染；分图H为4E5对B淋巴细胞处理后再用Texas Red标记的9D3复染；分图I为4E5对B淋巴细胞处理后再用Texas Red标记的Rituximab复染。
具体实施方式
一.CD20单克隆抗体的制备
采用人CD20+B淋巴细胞瘤细胞株DHL-4(Demidem A，Lam T，Alas S，Hariharan K，Hanna N，Bonavida B.，Chimeric anti-CD20(IDEC-C2B8)monoclonalantibody sensitizes a B cell lymphoma cell line to cell killing by cytotoxic drugs.Cancer Biother Radiopharm 1997 Jun；12(3)：177-86)作为免疫原。用总量为5×107新鲜培养的成熟B淋巴细胞，加入完全弗氏佐剂，充分研磨至完全乳化后常规皮下多点注射10日龄Balb/c小鼠，每点注射50微升，共6点。然后以1周间隔共5次重复注射以加强免疫反应，并对血清抗体水平进行监测。最后一次静脉注射5×106新鲜细胞/PBS混合液，3日后杀死小鼠，取出脾脏。
常规方法分离脾脏单细胞，并确定细胞活性＞90％。将脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞10∶1混合离心共沉淀，在37℃水浴锅中加入PEG(1400MW)进入细胞融合，融合时间为1分钟、2分钟、5分钟和10分钟。间隔5分钟加入新鲜无血清培养基1毫升、2毫升、5毫升和10毫升。离心沉淀后将细胞加入到20％FCSRPMI-1640培养液中，转入96孔板进行培养。24小时后加入1×HAT选择培养液。每3天更换新鲜培养基1次，至长出克隆。
选择单克隆形成孔，在第14天取出上清液，进行成熟B淋巴细胞荧光染色。简而言之，上清与B淋巴细胞37度温育30分钟，1XPBS洗涤10次，加入FITC标记的兔抗鼠抗体作为二抗，1XPBS洗涤10次，含有1％Tween-20的1XPBS洗涤10次，含有0.5％Triton X-100的1XPBS洗涤10次，在酶标仪上读取650nm处的荧光强度。阳性孔保留。选择出3个高表达细胞株，表达量＞1mg/L，在96孔培养条件下，稳定至第5代克隆。用Gibco公司的试剂盒进行单抗类型鉴定。结果，根据克隆在96孔板上的位置，3个克隆的名称和类型为：7D3、9D3和4E5(均为IgG(2a，k))。
已知，CD20单克隆抗体可体外诱导细胞凋亡。用CD20+B淋巴细胞瘤细胞株DHL-4进行单抗活性测定。阴性对照为抗人CD3嵌合抗体(OKT3)(Genentech)。阳性对照为Rituximab(Genentech)和2H7(例如Genentech)。加入细胞和单抗后第5～7天进行细胞计数和溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑(MTT)检测(参见例如：孙卫民，王惠琴编著，《细胞因子研究方法》，1999，p65～67)。
CD20单克隆抗体的生物活性试验结果(存活细胞％)
抗体浓度 阴性对照 阳性对照 待测单抗
(μg/ml) OKT3 Rituximab 2H7 9D3 7D3 4E5
1 100.0 66.7 94.3 93.2 99.6 87.9
10 100.0 32.1 38.4 32.2 46.5 33.7
100 100.0 19.4 29.1 30.7 56.7 22.8
从上述结果可以看出，加入抗体后存活细胞数量明显减少，说明上述单克隆抗体具有明显的杀伤CD20+的B淋巴细胞。其中，9D3对细胞的杀伤能力与阳性对照相似。
二.单克隆抗体可变区测序
因为抗体基因下游的恒定区序列为已知，所以用5’RACE(cDNA末端快速扩增)的方法来获取单抗9D3，7D3和4E5的可变区基因。
合成以下引物：
GSP1-H 5′-AGCTGGGAAG GTGTGCACAC CACT-3’(SEQ ID NO：17)
GSP2-H 5′-CAGAGT TCC AGG TCA AGG TCA-3’(SEQ ID NO：18)
GSP3-H 5′-CTT GAC CAG GCA TCC TAG AGT-3’(SEQ ID NO：19)
GSP1-L 5′-TTG CTG TCC TGA TCA GTC CAA CT-3’(SEQ ID NO：20)
GSP2-L 5′-TGT CGT TCA CTG CCA TCA ATC TT-3’(SEQ ID NO：21)
GSP3-L 5′-TTG TTC AAG AAG CAC ACG ACT GA-3’(SEQ ID NO：22)
AAP 5′-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3’(SEQ ID NO：23)
AUAP 5′-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’(SEQ ID NO：24)
其中，GSP表示基因特异性引物，AAP代表5’-RACE截短锚引物，AUAP代表截短通用扩增引物。GSP1距离可变区基因最远，用于逆转录反应。GSP2和GSP3用于嵌套PCR，其中GSP3在GSP2内。
用Gibco公司的Trizol Reagent试剂分别提取5×106杂交瘤细胞9D3，7D3和4E5的总RNA。按照5’-RACE试剂盒说明书以GSP1为引物将总RNA逆转录成cDNA，。然后给第一链cDNA的3’末端加上poly(C)尾，加尾后用GSP2和AAP为引物进行PCR扩增，将扩增产物稀释100倍再以AUAP和GSP3为引物进行嵌套PCR扩增。两次PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃5分钟；94℃45秒，60℃45秒，72℃1分10秒，30个循环：72℃7分钟。嵌套PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段(轻链长度321bp，重链长度366bp)。克隆到pGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌TG1细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选，取8个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了9D3，7D3和4E5的重链和轻链可变区序列。
9D3可变区的DNA序列和氨基酸序列：
单克隆抗体9D3重链可变区基因序列(5′→3′，366bp)(SEQ ID NO：1)：
CAGGCCTACCTGCAGCAGTCCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGG
CCTCCGGCTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCCGCCAGGGCCTGGAGTG
GATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCTCCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTG
ACCGTGGACAAGTCCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGTGT
ACTTCTGCGCCCGCGTGGTGTACTACTCCAACTCCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCACCGGCACCAC
CGTGACCGTGTCCTCC 366
单克隆抗体9D3的轻链可变区基因序列(5′→3′，321bp)(SEQ ID NO：2)：
CAGATCGTGCTGTCCCAGTCCCCCGCCATCCTGTCCGCCTCCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCC
GCGCCTCCTCCTCCGTGTCCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCTCCTCCCCCAAGCCCTGGAT
CTACGCCCCCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCGCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCTCCTAC
TCCCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACC
CCCCCACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGCGC 321
单克隆抗体9D3重链可变区的推断氨基酸序列(122氨基酸)(SEQ ID NO：3)：
QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATL
TVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSS
单克隆抗体9D3轻链可变区的推断氨基酸序列(107氨基酸)(SEQ ID NO：4)：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSY
SLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGAGTKLELKR
7D3可变区的DNA序列和氨基酸序列
单克隆抗体7D3的重链可变区基因序列(5′→3′，366bp)(SEQ ID NO：5)
CAGGCTCAACTACAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCGTGCAAGG
CTTCTGGCTACACATTTACCCGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTAGACAGGGCCTGGAATG
GATTGGATATATTTATCCAGGAAATGGTGATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTG
ACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCGGTCT
ATTTCTGTGCAAGACGTACTTATTATAGTAACTCTTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCAC
GGTCACCGTCTCTTCG 366
单克隆抗体7D3的轻链可变区基因序列(5′→3′，321bp)(SEQ ID NO：6)
001 CAAATCGTTC TCACTCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA
051 GAAGGTCACA ATGACCTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAGT TACATGAATT
101 GGTACCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCT TTACTTGGAT TTATGCCCCA
151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG
201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA
251 CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTAATAACC CACCCACGTT CGGTGCTGGC
301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG A
单克隆抗体7D3重链可变区的推断氨基酸序列(122氨基酸)(SEQ ID NO：7)
QAQLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTRYNMHWVKQTPRQGLEWIGYIYPGNGDTNYNQKFKGKATL
TVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRTYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSS
单克隆抗体7D3轻链可变区的推断氨基酸序列(107氨基酸)(SEQ ID NO：8)
QIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSY
SLTISRVEAEDAATYYCQQWSNNPPTFGAGTKLELKR
4E5可变区的DNA序列和氨基酸序列
单克隆抗体4E5的重链可变区基因序列(5′→3′，366bp)(SEQ ID NO：9)
001 CAGGTTCAAC TACAGCAGTC TGGGGCTGAG CTGGTGAGGC CTGGGGCCTC
051 AGTGAAGTCC TCCTGCAAGG CTTCTGGCTA CACATTTACC AGTTACACTA
101 TGCACTGGGT AAAGCAGACA CCTAGACAGG GCCTGGAATG GATTGGAGCT
151 ATTTATCCAG GAAATGGTGA TACTTCCTAC AATCAGAAGT TCAAGGGCAA
201 GGCCACACTG ACTGTAGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAC ATGCAGCTCA
251 GCAGCCTGAC ATCTGAAGAC TCTGCGGTCT ATTTCTGTGC AAGATATTAC
301 CAATCCGATC AATCTTACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCA CAGGGACCAC
351 GGTCACCGTC TCCTCT
单克隆抗体4E5的轻链可变区基因序列(5′→3′，321bp)(SEQ ID NO：10)
001 CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CAGTCTGCAT CTCCAGGGGA
051 GAAGGTCACA ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAGT TACATGCACT
101 GGTACCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCCCA
151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG
201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA
251 CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTTTTAACC CACCCACGTT CGGTGGATGC
301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG A
单克隆抗体4E5重链可变区的推断氨基酸序列(122氨基酸)(SEQ ID NO：11)
QVQLQQSGAELVRPGASVKSSCKASGYTFTSYTMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKAT
LTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARYYQSDQSYWYFDVWGTGTTVTVSS
单克隆抗体4E5轻链可变区的推断氨基酸序列(107氨基酸)(SEQ ID NO：12)
QIVLSQSPAIQSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTS
YSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGDGTKLELKR
利用DNAstar软件将三种新CD20单抗：9D3、7D3和4E5与已知的2H7的序列进行了氨基酸和DNA序列比较。根据图1所示，发现9D3、7D3和4E5的氨基酸序列和DNA序列均不相同，但9D3与2H7的氨基酸序列完全相同，但它们的DNA序列却是不同的。
三.人源化嵌合单克隆抗体表达载体的构建
采用PCR反应分别给以上的抗体可变区加上适当的酶切位点。其中重链可变区的5′端设计XbaI酶切位点，3′端加上NheI位点，在轻链可变区基因5′端设计HindIII位点，3′端加上BsiWI位点。
所用的PCR引物为：
VL-有义链：5′-TCC
TCTAGACAAATTSTTCTCTHCCAGTC-3′；(SEQ ID NO：25)
VL-反义链：5′-GTT
GCTAGCTCGSTTCAGCTCWAGCTTGG-3′；(SEQ ID NO：26)
VH-有义链：5′-AGG
AAGCTTCAGGCHTAACTACAGCAGTC-3′；(SEQ ID NO：27)
VH-反义链：5′-TGA
CGTAGGTGAGSAGACGGTGDCCGTGRTC-3′(SEQ ID NO：28)
其中，下划线表示加入的酶切位点；前3个碱基表示保护碱基；根据前述本发明所得单抗的序列，H＝A，C，T；S＝C或G；D＝A，G或T；R＝A或G；W＝A或T。
进行普通PCR。将所得PCR产物克隆到pGEM-T(Promega出品)中进行序列测定确证为所需的正确目的基因。然后用XbaI和NheI将抗体重链可变区基因从载体pGEM-T上切下插入到表达载体pMG18-3K相应位点，再用HindIII和Bsi WI将抗体轻链可变区从载体pGEM-T上切下插入到表达载体pMG18-3K相应位点(参见DEVELOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORINGBASED ON INCP-9 PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas School of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，BirminghamB15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus Stare University ScorinaAv.4，Minsk 220080 Belarus)。最后构成了嵌合抗体的表达载体pC9D3，pC7D3，pC4E5，分别含嵌合抗体基因c9D3，c7D3和c4E5。
四.人源化重组单克隆抗体VL和VH的设计
根据人源化要求(参见，例如humanization of the murine anti-human CD3monoclonal antibody OKT3.Hum Antibod Hybridoma，1994，5(1，2)：41)，同时兼顾哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，对9D3的VL和VH基因进行重组设计：
重组9D3 VH的氨基酸序列(122个氨基酸)为(SEQ ID NO：13)：
QAYLQNSGAEKVRPGASVKMSCSASGYTFMSYNMYWVKQTTRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKSGAGKA
TLTVDKSDSTAYMQLSKLTSEDSAVYFDARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVGASS
重组9D3 VH的DNA序列为(SEQ ID NO：14)：
CAGGCCTACCTGCAGAACTCCGGCGCCGAGAAGGTGCGCCCCGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCTCC
GCCTCCGGCTACACCTTCATGTCCTACAACATGTACTGGGTGAAGCAGACCACCCGCCAGGGCCTGGAG
TGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCTCCTACAACCAGAAGTCCGGCGCCGGCAAGGCC
ACCCTGACCGTGGACAAGTCCGACTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAAGCTGACCTCCGAGGACTCC
GCCGTGTACTTCGACGCCCGCGTGGTGTACTACTCCAACTCCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCACC
GGCACCACCGTGGGCGCCTCCTCC
重组9D3 VL的氨基酸序列(107个氨基酸)为(SEQ ID NO：15)：
QIVLSKNPAILSASPGEHKSMTCRASSSVDYMHWLQQKPGDSPKPWIYAASNLNSGVPADHKGSGSGTS
YSLTIGHVEAEDAATSYCQQWSFNKPTFGAGTLLELKR
重组9D3 VL的DNA序列为(SEQ ID NO：16)：
CAGATCGTGCTGTCCAAGAACCCCGCCATCCTGTCCGCCTCCCCCGGCGAGCACAAGTCCATGACCTGC
CGCGCCTCCTCCTCCGTGGACTACATGCACTGGCTGCAGCAGAAGCCCGGCGACTCCCCCAAGCCCTGG
ATCTACGCCGCCTCCAACCTGAACTCCGGCGTGCCCGCCGACCACAAGGGCTCCGGCTCCGGCACCTCC
TACTCCCTGACCATCGGCCACGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTCCTACTGCCAGCAGTGGTCCTTC
AACAAGCCCACCTTCGGCGCCGGCACCCTGCTGGAGCTGAAGCGC 321
五.人源化重组单克隆抗体VL和VH基因的制备
根据重组9D3 VH DNA序列与天然序列的比较，设计，合成并纯合得到用于定点突变的引物：
T1：CAGGCCTACCTGCAGAACTCCGGCGCCGAGAAGGTGCGCC(SEQ ID NO：29)
T2：GATGTCCTGCTCCGCCTCCGG(SEQ ID NO：30)
T3：CACCTTCATGTCCTACAACATGTACTGGGTGAAGCAGACCACCCGCCAG(SEQ ID NO：31)
T4：CAACCAGAAGTCCGGCGCCGGCAAGGCCAC(SEQ ID NO：32)
T5：GACAAGTCCGACTCCACCG(SEQ ID NO：33)
T6：GCTGTCCAAGCTGACCTCCG(SEQ ID NO：34)
T7：GTGTACTTCGACGCCCGC(SEQ ID NO：35)
T8：CCACCGTGGGCGCCTCCTCC(SEQ ID NO：36)
将上述T1-T8引物(终浓度为100nM)与9D3重链DNA模板(分离自大肠杆菌的pEGM-T[9D3])终浓度为20nM)按照常规方法进行共变性和共复性(参见《分子克隆实验室指南》，金冬雁等，1992，科学出版社)，然后用DNA点突变试剂盒(Invitrogen产品)进行突变，所有操作按照厂家说明书进行。简而言之，将上述所有寡核苷酸引物T1～T8混合物与模板进行变性和复性后用T4 DNA连接酶(MBI产品，操作参照厂家说明进行)进行连接，然后用T7 DNA聚合酶(Promega产品，操作参照厂家说明进行)进行延伸，用T4 DNA连接酶再次连接。最后用DpnI(NEB产品)将上述的杂合分子进行消化，除去模板链。同理，合成突变9D3 VL链。用未被消化的突变链分别转化(常规氯化钙法)大肠杆菌DH5α菌株。经过酶切筛选和测序后筛选出序列完全正确的克隆。然后，将轻链可变区和重链可变区分别用XbaI/NheI和HindIII/Bsi WI进行双酶切，在1.5％琼脂糖电泳上进行分离，胶回收(用Promega公司的胶回收试剂盒按照厂家说明书进行)。回收的重链可变区和轻链可变区插入到pMG18-3K表达载体上获得重组表达质粒，记作pH9D3。
五.单克隆抗体的表达
上述构建的带有嵌合抗体的表达载体pC9D3，pC7D3，pC4E5和人源化pH9D3的表达载体转染大肠杆菌DH5a。然后接种于100毫升LB培养基中进行扩增。用Qiagen公司的Ultrapure质粒DNA纯化试剂盒抽提纯化质粒DNA。用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述纯化的质粒DNA采转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。
转化的CHO细胞在选择培养基上进行连续9周的MTX选择，最后在96孔板上进行极度稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。
挑出的单克隆细胞系在RPM1641培养基上进行培养，对上清进行Western印迹实验，根据染色反应判断表达强度。结果发现pC9D3，pC7D3，pC4E5和人源化pH9D3转化的四个CHO细胞系具有明显较高的表达强度。如图3所示，泳道3为C7D3，泳道5为C9D3，其余泳道的表达量很低。40泳道为C4E5，第41泳道为人源化的H9D3。其余泳道相关抗体的表达量很低。
六.人源化单克隆抗体的生物活性研究
单克隆抗体的纯化：
采用蛋白A亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化本发明的鼠源单克隆抗体9D3、7D3、4E5、嵌合单抗C9D3、C7D3、C4E5和人源化单抗h9D3。SDS-PAGE电泳证明，所得产物纯度大于90％。
以上亲和层析的产物再次经过分子筛层析，经SE-HPLC方法证明获得的产品纯度＞98％。这些样品可以用于以下的进一步分析与研究。
特异性荧光染色(竞争试验)
用纯化的抗体9D3，7D3和4E5对成熟B细胞、前B细胞进行染色。如图4所示，发现细胞可以被特异性染色，而对照细胞(成纤维细胞，CD20阴性)株对染色无反应。而且，当第一种抗体处理B淋巴细胞后，第二种抗体仍然能够与B淋巴细胞结合，证明上述4种单抗4E5、9D3、7D3和Rituximab相互间不存在结合竞争。这说明这3个细胞株产生的抗体所结合的免疫决定簇彼此是不同的，而且与标准单抗也是不同的。嵌合C 9D3与阳性对照具有竞争性，说明它们结合的是同一个抗原决定簇。
沉淀实验
Western印迹试验表明，本发明中的9D3，7D3，4E5及其它们的嵌合和人源化变异抗体都与对照Rituximab一样，可以与CD20蛋白特异性沉淀和结合。
体外细胞毒性试验
已知，CD20单克隆抗体可体外可诱导细胞凋亡。用CD20+B淋巴细胞瘤细胞株DHL-4进行单抗活性测定。阴性对照为人CD3人源化单抗OKT3。阳性对照为Rituximab和2H7)。加入细胞和单抗后第5～7天进行细胞计数和MTT检测。
抗CD20单克隆抗体的生物活性试验结果(存活细胞％)
| 抗体浓度(μg/ml) | |||
| 1 | 10 | 100 | |
| OKT3(阴性对照) | 100.0 | 100.0 | 98.1 |
| Rituximab(阳性对照) | 50.3 | 12.6 | 29.4 |
| 2H7(阳性对照) | 67.6 | 19.1 | 39.6 |
| C9D3(嵌合) | 59.2 | 10.3 | 30.7 |
| C7D3(嵌合) | 110.1 | 27.3 | 39.4 |
| C4E5(嵌合) | 95.7 | 10.8 | 29.7 |
| H9D3(人源化) | 61.3 | 12.7 | 28.6 |
从上述结果可以看出，加入抗体后存活细胞数量明显减少，说明上述单克隆抗体具有明显的杀伤CD20+的B淋巴细胞。其中，C9D3和H9D3对细胞的杀伤能力与阳性对照相似。
体内细胞毒性试验
DHL-4淋巴瘤细胞按照5×106/只小鼠的量皮下注射免疫缺陷性小鼠，待肿瘤长至0.3×0.3(cm)以上时，注射以下CD20单抗，在第10天按照每只小鼠5毫克进行注射。注射后第10天、第20天和第30天测量肿瘤的大小，结果如下：
10天 20天 30天
OKT3(阴性对照) 0.3×0.35 0.65×0.95 1.4×1.5
Rituximab(阳性对照) 0.28×0.31 0.45×0.40 0.60×0.81
C4E5 0.27×0.29 0.35×0.42 0.55×0.63
C9D3 0.28×0.30 0.36×0.40 0.51×0.62
H9D3 0.30×0.28 0.45×0.50 0.61×0.97
上述结果说明，与阴性对照相比，注射抗体后体内肿瘤的生长受到明显的抑制。
序列表
<110>上海兰生国健药业有限公司
<120>抗CD20人源化单克隆抗体
<130>016013
<160>36
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>366
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>1
caggcctacc tgcagcagtc cggcgccgag ctggtgcgcc ccggcgcctc cgtgaagatg 60
tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt gaagcagacc 120
ccccgccagg gcctggagtg gatcggcgcc atctaccccg gcaacggcga cacctcctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgtggaca agtcctcctc caccgcctac 240
atgcagctgt cctccctgac ctccgaggac tccgccgtgt acttctgcgc ccgcgtggtg 300
tactactcca actcctactg gtacttcgac gtgtggggca ccggcaccac cgtgaccgtg 360
tcctcc 366
<210>2
<211>321
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
cagatcgtgc tgtcccagtc ccccgccatc ctgtccgcct cccccggcga gaaggtgacc 60
atgacctgcc gcgcctcctc ctccgtgtcc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120
tcctccccca agccctggat ctacgccccc tccaacctgg cctccggcgt gcccgcccgc 180
ttctccggct ccggctccgg cacctcctac tccctgacca tctcccgcgt ggaggccgag 240
gacgccgcca cctactactg ccagcagtgg tccttcaacc cccccacctt cggcgccggc 300
accaagctgg agctgaagcg c 321
<210>3
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>3
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>4
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>4
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210>5
<211>366
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>5
caggctcaac tacagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcctc agtgaagatg 60
tcgtgcaagg cttctggcta cacatttacc cgttacaata tgcactgggt aaagcagaca 120
cctagacagg gcctggaatg gattggatat atttatccag gaaatggtga tactaattac 180
aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacgtact 300
tattatagta actcttactg gtacttcgat gtctggggca cagggaccac ggtcaccgtc 360
tcttcg 366
<210>6
<211>321
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>6
caaatcgttc tcactcagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacctgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgaatt ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccct ttacttggat ttatgcccca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtaataacc cacccacgtt cggtgctggc 300
accaagctgg agctgaaacg a 321
<210>7
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>7
Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>8
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>8
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210>9
<211>366
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>9
caggttcaac tacagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcctc agtgaagtcc 60
tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacacta tgcactgggt aaagcagaca 120
cctagacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180
aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagatattac 300
caatccgatc aatcttactg gtacttcgat gtctggggca cagggaccac ggtcaccgtc 360
tcctct 366
<210>10
<211>321
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>10
caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc cagtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccca aaccctggat ttatgcccca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaacc cacccacgtt cggtggatgc 300
accaagctgg agctgaaacg a 321
<210>11
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ser Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Gln Ser Asp Gln Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>12
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>12
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Gln Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210>13
<211>123
<212>PRT
<213>人造序列
<400>13
Gln Ala Tyr Leu Gln Asn Ser Gly Ala Glu Lys Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Ser Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Met Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Thr Thr Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser
50 55 60
Gly Ala Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Asp Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Gln Leu Ser Lys Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Asp Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Gly Ala Ser Ser
115 120
<210>14
<211>369
<212>DNA
<213>人造序列
<400>14
caggcctacc tgcagaactc cggcgccgag aaggtgcgcc ccggcgcctc cgtgaagatg 60
tcctgctccg cctccggcta caccttcatg tcctacaaca tgtactgggt gaagcagacc 120
acccgccagg gcctggagtg gatcggcgcc atctaccccg gcaacggcga cacctcctac 180
aaccagaagt ccggcgccgg caaggccacc ctgaccgtgg acaagtccga ctccaccgcc 240
tacatgcagc tgtccaagct gacctccgag gactccgccg tgtacttcga cgcccgcgtg 300
gtgtactact ccaactccta ctggtacttc gacgtgtggg gcaccggcac caccgtgggc 360
gcctcctcc 369
<210>15
<211>107
<212>PRT
<213>人造序列
<400>15
Gln Ile Val Leu Ser Lys Asn Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu His Lys Ser Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asp Tyr Met
20 25 30
His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Asp Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Ala Ser Asn Leu Asn Ser Gly Val Pro Ala Asp His Lys Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly His Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Ser Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Lys Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Leu Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210>16
<211>321
<212>DNA
<213>人造序列
<400>16
cagatcgtgc tgtccaagaa ccccgccatc ctgtccgcct cccccggcga gcacaagtcc 60
atgacctgcc gcgcctcctc ctccgtggac tacatgcact ggctgcagca gaagcccggc 120
gactccccca agccctggat ctacgccgcc tccaacctga actccggcgt gcccgccgac 180
cacaagggct ccggctccgg cacctcctac tccctgacca tcggccacgt ggaggccgag 240
gacgccgcca cctcctactg ccagcagtgg tccttcaaca agcccacctt cggcgccggc 300
accctgctgg agctgaagcg c 321
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>17
agctgggaag gtgtgcacac cact 24
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>18
cagagttcca ggtcaaggtc a 21
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>19
cttgaccagg catcctagag t 21
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>20
ttgctgtcct gatcagtcca act 23
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>21
tgtcgttcac tgccatcaat ctt 23
<210>22
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>22
ttgttcaaga agcacacgac tga 23
<210>23
<211>36
<212>DNA
<213>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(24，25，29，30，34，35)
<223>n＝i
<400>23
ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>24
ggccacgcgt cgactagtac 20
<210>25
<211>29
<212>DNA
<213>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>h＝a，c，t；s＝c或g；
<400>25
tcctctagac aaattsttct cthccagtc 29
<210>26
<211>29
<212>DNA
<213>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>s＝c或g；w＝a或t
<400>26
gttgctagct cgsttcagct cwagcttgg 29
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>h＝a，c，t；
<400>27
aggaagcttc aggchtaact acagcagtc 29
<210>28
<211>31
<212>DNA
<213>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>s＝c或g；d＝a，g或t；r＝a或g；w＝a或t
<400>28
tgacgtacgt gagsagacgg tgdccgtgrt c 31
<210>29
<211>40
<212>DNA
<213>引物
<400>29
caggcctacc tgcagaactc cggcgccgag aaggtgcgcc 40
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>30
gatgtcctgc tccgcctccg g 21
<210>31
<211>49
<212>DNA
<213>引物
<400>31
caccttcatg tcctacaaca tgtactgggt gaagcagacc acccgccag 49
<210>32
<211>30
<212>DNA
<213>引物
<400>32
caaccagaag tccggcgccg gcaaggccac 30
<210>33
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>33
gacaagtccg actccaccg 19
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>34
gctgtccaag ctgacctccg 20
<210>35
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>35
gtgtacttcg acgcccgc 18
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>36
ccaccgtggg cgcctcctcc 20
Claims (9)
1.一种CD20人源化单克隆抗体，包括非人源的重链可变区和轻链可变区以及人源的其他区域，所述抗体的重链可变区和轻链可变区选自：重链可变区SEQ ID NO：7和轻链可变区SEQ ID NO：8，重链可变区SEQ ID NO：11和轻链可变区SEQ ID NO：12，或重链可变区SEQ ID NO：13和轻链可变区SEQ ID NO：15。
2.一种DNA分子，它编码权利要求1中所述的重链可变区序列SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，它选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：14。
4.一种DNA分子，它编码权利要求1中所述的轻链可变区序列SEQ IDNO：8，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15。
5.根据权利要求4所述的DNA分子，它选自SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：16。
6.一种载体，包含编码重链可变区SEQ ID NO：7和轻链可变区SEQ ID NO：8，重链可变区SEQ ID NO：11和轻链可变区SEQ ID NO：12，或重链可变区SEQ IDNO：13和轻链可变区SEQ ID NO：15的DNA分子。
7.一种宿主细胞，包含权利要求6所述载体。
8.根据权利要求7所述宿主细胞，所述宿主细胞选自大肠杆菌和CHO。
9.权利要求1所述抗体在制备诊断和/或治疗CD20相关疾病的制剂中的用途。
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2001
- 2001-11-16 CN CNB011322268A patent/CN1210307C/zh not_active Expired - Lifetime
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| CX01 | Expiry of patent term |
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