CN108017717A - 一种用于体外高效定向扩增的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于体外高效定向扩增的嵌合抗原受体及其应用。具体地，本发明提供一种具有体外特异选择性的CAR编码分子，该分子通过引入人源化的分选结构域，在感染目的细胞后，可以通过二次分选方法将表达CAR阳性的目的细胞进行高效分选，实现其体外的定向扩增，显著提高CAR阳性目的细胞在终产品中的比例，提高了CAR基因修饰性免疫细胞制品的工艺制备效率，为该类技术产品在临床的进一步推广和应用提供更为稳定的技术保证。

Description

一种用于体外高效定向扩增的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和免疫细胞治疗领域，涉及一种用于体外高效定向扩增的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)是一种由抗原特异性抗体，跨膜结构域，胞内信号共刺激结构域等多个不同功能域嵌合而成的人工受体分子。该类分子的主要特点在于可以通过其表达识别相关抗原抗体的结构域直接识别靶细胞，并通过胞内信号共刺激结构域的活化，激活被该类受体修饰的免疫细胞，例如T细胞，直接通过细胞杀伤途径对靶细胞进行杀伤。与体内存在的天然T细胞杀伤途径相比，CAR介导的细胞杀伤作用突破了MHC分子限制性的制约，一方面提高了效应细胞的杀伤活性，另一方面提高了效应细胞对发生MCH分子突变的靶细胞的识别和杀伤效率。

目前，CAR基因修饰主要应用于包括T细胞和NK细胞等具有直接杀伤的免疫细胞介导的靶向抗肿瘤免疫治疗中，针对的适应症主要为血液肿瘤，包括难治复发性慢性B细胞淋巴瘤(CLL)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，多发性骨髓瘤(MM)等；针对的靶点包括CD19，CD20，CD133等。2017年9月，诺华公司研发的针对儿童及年轻成年人的靶向CD19的CAR修饰性T细胞治疗性产品Kymriah已经正式被FDA批准上市，用于难治复发性急性B细胞淋巴瘤的治疗。这是全球正式获批的第一个基因修饰性免疫细胞制品，标志着CAR基因修饰疗法的安全性和有效性进入到了临床应用验证阶段。

但是，目前在CAR修饰性免疫细胞制备的工艺过程中依然存在着诸多技术难点亟待攻克。其中，如何获得高纯度的CAR阳性目的细胞就是一个普遍性难题。虽然目前不同的研究团队通过电转法，提高病毒MOI，以及二次感染等方式提高了T细胞对CAR编码病毒的感染效率，一定程度上提高了CAR阳性细胞的比例，但是取得的进展非常有限。

因此，本领域迫切需要一种可以高效分选的CAR阳性目的细胞以及提高CAR阳性细胞比例的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以高效分选的CAR阳性目的细胞以及提高CAR阳性细胞比例的方法。

本发明的另一目的是提供一种用于体外高效定向扩增的嵌合抗原受体及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体的结构如下式I所示：

F₀-F₁-L₁-Z-L₂-F₂-H-TM-C-CD3ζ (I)

其中，

F₀为无或信号肽序列；

F₁和F₂两者中一个为抗人CD19的单链抗体重链可变区，另一个为抗人CD19的单链抗体轻链可变区；

Z为分选结构域，所述分选结构域Z为分选结构域，所述分选结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8中第151-160位、SEQ ID NO.:12中第151-158位、或SEQ ID NO.:13中第151-159位所示；

L₁和L₂为无或连接肽；

H为无或绞链区；

TM为跨膜结构域；

C为无或共刺激信号受体酪氨酸激活基序；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

其中，“-”为连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述F₁-L₁-Z-L₂-F₂的长度(或ScFv与分选结构域的长度)为237-343个氨基酸，优选地247-303个氨基酸。

在另一优选例中，所述F₁和F₂的长度(即ScFv轻重链的长度)各自独立地为107-130个氨基酸，较佳地107-124个氨基酸。

在另一优选例中，所述L₁和L₂的长度各自独立地为0-10个氨基酸，较佳地0-5个氨基酸。

在另一优选例中，所述L₁-Z-L₂的长度为10-30个氨基酸，优选地10-20个氨基酸。

在另一优选例中，所述Z选自人核蛋白La/SS-B的C端结构域第95-104位氨基酸序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.:8中第151-160位所示。

在另一优选例中，所述Z含有8个氨基酸的链霉亲和素II标签，氨基酸序列如SEQID NO.:12中第151-158位所示(WSHPQFEK)。

在另一优选例中，所述Z含有9个氨基酸的链霉亲和素标签II，氨基酸序列如SEQID NO.:13中第151-159位所示(NWSHPQFEK)。

在另一优选例中，所述分选结构域不影响或基本不影响所述CAR与所述CAR靶向的抗原的结合。“基本不影响”指包含所述分选结构域的CAR与靶向抗原的结合能力G1与不含分选结构域的CAR的与靶向抗原的结合能力G0的比值，即G1/G0≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％。

在另一优选例中，所述F₀选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、或其组合。优选地，所述F₀为CD8来源的信号肽。

在另一优选例中，所述F₀的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8中第1-21位所示。

在另一优选例中，所述L₁或L₂的序列如SEQ ID NO.:8中第146-150位所示(GGGGS)，或为GGGGSGGGGS(SEQ ID NO.:10)。

在另一优选例中，所述F₁为靶向人源的CD19抗原的单链抗体重链可变区或轻链可变区。优选地，所述F₁为靶向人源的CD19抗原的单链抗体重链可变区。

在另一优选例中，所述F₁和F₂为靶向人源的CD19抗原的单链抗体重链可变区和轻链可变区。优选地，所述F₁和F₂的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:8中第22-145位和第166-276位所示。

在另一优选例中，所述H选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。优选地，所述H为CD8来源的铰链区。

在另一优选例中，所述TM选自下组的蛋白的跨膜区：CD8、CD28、或其组合。优选地，所述TM为CD8来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述H-TM的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8中第277-345位所示。

在另一优选例中，所述C选自下组的蛋白的共刺激信号分子：CD28、CD137、OX40、或其组合。

在另一优选例中，所述C-CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8中第346-499位所示。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:12或SEQ ID NO.:13所示。

本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(CAR)。

在另一优选例中，所述的多核苷酸序列包含选自下组的一种或多种核酸序列：

(1)序列如SEQ ID NO.:1所示的所述F₀的编码序列；

(2)序列如SEQ ID NO.:2所示的所述H-TM的编码序列；

(3)序列如SEQ ID NO.:3所示的所述C-CD3ζ的编码序列；

(4)序列如SEQ ID NO.:4所示的所述Z的编码序列；和

(5)序列如SEQ ID NO.:5和6所示的所述F₁和F₂的编码序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体包括本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体是病毒载体，优选地为慢病毒载体。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体；和/或

所述宿主细胞基因组中整合有外源的本发明第二方面所述的多核苷酸；和/或

所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体。

在另一优选例中，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞是人细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞是NK细胞或T细胞。

本发明的第五方面，提供了一种基因工程化的NK细胞或T细胞，所述NK细胞或T细胞为哺乳动物的NK细胞或T细胞，并且所述的NK细胞或T细胞的细胞膜上表达有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体。

在另一优选例中，所述NK细胞或T细胞是离体。

在另一优选例中，所述NK细胞或T细胞是自体或异体的。

在另一优选例中，所述NK细胞或T细胞来自灵长目动物。

在另一优选例中，所述NK细胞或T细胞是人细胞。

本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含：本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体或本发明第五方面所述NK细胞或T细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物组合物是液态制剂。

在另一优选例中，所述药物组合物是注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物中所述NK细胞或T细胞的浓度为1×10⁵-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁶-1×10⁷个细胞/ml。

本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体或本发明第五方面所述NK细胞或T细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、间皮瘤、胰腺癌、多发性骨髓瘤、或其组合。

本发明的第八方面，提供了一种制备本发明第五方面所述的NK细胞或T细胞的方法，所述方法包括步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入NK细胞或T细胞内，从而获得所述NK细胞或T细胞。

本发明的第九方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第五方面所述的细胞、或本发明第六方面六所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述疾病为肿瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了CD19-sCAR，CD19-CAR慢病毒表达载体酶切鉴定结果。M：DNA标准品，1：pLenti-CMV-CD19-sCAR病毒表达载体，3：pLenti-CMV-CD19-CAR病毒表达载体，2、4：pLenti-CMV空载体。

图2-1显示了感染CD19-sCAR和CD19-CAR病毒的T细胞体外扩增能力测定；图2-2显示了在使用筛选肽抗体刺激后两种携带不同CAR分子T细胞的体外扩增能力。

图3-1显示了表达不同CAR受体的T细胞在终产品中的纯度；图3-2显示了表达不同CAR受体的NK细胞在终产品中的纯度。

图4显示了表达不同CAR受体的T细胞终产品中不同细胞亚群的比例。

图5-1显示了表达不同CAR分子的T细胞体外杀伤效能评价；图5-2显示了表达不同CAR分子的NK细胞体外杀伤效能评价。

图6显示了不同CAR分子修饰的T细胞体外杀伤相关因子释放活性测试。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地获得一种具有体外特异选择性的CAR编码分子，该分子通过引入人源化的分选结构域，在感染目的细胞后，可以通过二次分选方法将表达CAR阳性的目的细胞进行高效分选，实现其体外的定向扩增，显著提高CAR阳性目的细胞在终产品中的比例，提高了CAR基因修饰性免疫细胞制品的工艺制备效率，为该类技术产品在临床的进一步推广和应用提供更为稳定的技术保证。同时，本发明分选结构域与抗人CD19的单链抗体可变区组合，得到的所述CAR经过二次分选刺激后，可以二次激活T细胞或NK细胞，增殖效率显著提高。本发明的基因工程化T细胞或NK细胞对CD19阳性细胞具有更好的肿瘤杀伤活性和更高的杀伤相关因子的释放水平。在此基础上完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

如本文所用，术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

如本文所用，术语“表位(epitope)”又叫抗原决定基(antigenic determinant)，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，可被抗体特异性识别的抗原部分。在本发明中，所述分选结构域具有特定表位，当其为游离态或存在于所述CAR时，均能被抗分选结构域抗体识别。

分选结构域

在本发明中，所述嵌合抗原受体含有分选结构域，所述分选结构域具有以下特征：

(a)具有特定表位，且所述表位不存在L₁和L₂中；

(b)当分选结构域为游离态或存在于所述CAR时，所述分选结构都能被抗分选结构域抗体识别；和

(c)不影响或基本不影响所述CAR与所述CAR靶向的抗原的结合。

在另一优选例中，所述Z为人核蛋白La/SS-B来源的多肽；在另一优选例中，所述Z来源于人核蛋白La/SS-B的85-115位的氨基酸序列；优选地来源于人核蛋白La/SS-B的C端结构域第95-104位氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗分选结构域抗体为抗人核蛋白La/SS-B多肽抗体。

在另一优选例中，所述Z的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8中第151-160位所示，或SEQID NO.:12中第151-158位所示，或SEQ ID NO.:13中第151-159位所示。

嵌合抗原受体(CAR)

如本文所用，嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)包括细胞外结构域、任选的铰链区、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括任选的信号肽和靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激分子和ζ链部分。CAR在T细胞中表达时，胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子如IL-2和IFN-γ等，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达的抗原的抗体，较佳地为单链抗体。在一个实施方式中，所述scFv的结构为F₁-L₁-Z-L₂-F₂。在另一优选例中，所述scFv的结构为F₁-Z-F₂。

在一个实施方式中，本发明CAR的结构为F₀-F₁-L₁-Z-L₂-F₂-H-TM-C-CD3ζ。优选地，本发明CAR的序列如SEQ ID NO.:8所示，其中粗体为分选结构域。

其中，在SEQ ID No.:8中第1-21位为信号肽F₀；第22-145位为单链抗体重链可变区F₁；第146-150位为连接肽L₁；第151-160位为分选结构域Z；第161-165位为连接肽L₂；第166-276位为单链抗体轻链可变区F₂；第277-345位为铰链区及跨膜区H-TM；第346-499位为胞内信号转导和激活结构域C-CD3ζ。

在另一优选例中，本发明CAR的序列如SEQ ID NO.:12所示，其中粗体为分选结构域。

其中，在SEQ ID No.:12中第1-21位为信号肽F₀；第22-145位为单链抗体重链可变区F₁；第146-150位为连接肽L₁；第151-158位为分选结构域Z；第159-163位为连接肽L₂；第164-274位为单链抗体轻链可变区F₂；第275-343位为铰链区及跨膜区H-TM；第344-497位为胞内信号转导和激活结构域C-CD3ζ。

在另一优选例中，本发明CAR的序列如SEQ ID NO.:13所示，其中粗体为分选结构域。

其中，在SEQ ID No.:13中第1-21位为信号肽F₀；第22-145位为单链抗体重链可变区F₁；第146-150位为连接肽L₁；第151-159位为分选结构域Z；第160-164位为连接肽L₂；第165-275位为单链抗体轻链可变区F₂；第276-344位为铰链区及跨膜区H-TM；第345-498位为胞内信号转导和激活结构域C-CD3ζ。

编码序列

本发明还涉及编码根据本发明的嵌合抗原受体的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:8、12或13所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:8、12或13所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

在本发明较佳的实施方式中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:7所示。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明融合蛋白的功能。

本发明的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

在本发明的一个实施方式中，所述嵌合抗原受体的编码多核苷酸序列如SEQ IDNO.:7所示。

ATGGCTCTGCCAGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCAGCTAGACCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGAGCAGAACTCGTGAGACCAGGCAGCAGCGTGAAGATCTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCTCTAGCTATTGGATGAATTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATTGGACAGATTTGGCCCGGCGACGGCGATACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACAGCCGACGAGTCTAGCAGCACAGCCTACATGCAGCTGAGCTCTCTGGCCAGCGAGGATAGCGCCGTGTACTTTTGCGCCAGAAGGGAGACCACAACAGTGGGCCGGTACTACTACGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGCGGCTCTAAGCCTCTGCCAGAAGTGACAGACGAGTACGGCGGAGGAGGAAGCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCAGCTTCTCTGGCAGTGTCTCTGGGACAGAGGGCTACCATCTCTTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGATTACGACGGCGACAGCTACCTGAATTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACGACGCCTCCAACCTGGTGTCCGGCATCCCTCCCAGATTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACAGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACATACCATTGCCAGCAGAGCACAGAGGACCCCTGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAGATCAAGACAACCACCCCAGCCCCTA GACCTCCTACACCAGCCCCTACAATCGCCTCTCAGCCTCTGAGCCTGAGGCCAGAAGCTTGTAGACCCGCAGCAGGA GGAGCAGTGCATACAAGGGGCCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCAGGAACTTGCGGAGT GCTGCTGCTGTCTCTGGTCATCACCCTGTATTGCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCT TCATGCGGCCAGTGCAGACAACACAGGAGGAGGACGGTTGCAGCTGCAGATTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGC GAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCTCCAGCCTATAAACAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCT GAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCAGAGATGGGCGGCAAGCCTA GAAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCTTACAGCGAGATCGGC ATGAAGGGCGAGAGGAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTATCAGGGACTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTA CGACGCTCTGCACATGCAGGCTCTGCCTCCTAGATAA(SEQ ID NO.:7)

在另一优选例中，信号肽F₀的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCGTCCG(SEQID NO.:1)

在另一优选例中，铰链区及跨膜区H-TM的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

ACCACCACCCCGGCGCCGCGTCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGTCCGGAAGCGTGCCGTCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGTGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATTACCCTGTATTGC(SEQ ID NO.:2)

在另一优选例中，胞内信号转导和激活结构域C-CD3ζ的编码多核苷酸序列如SEQID NO.:3所示。

AAACGTGGCCGTAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGTCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGTTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGTGTGAAATTTAGCCGTAGCGCGGATGCGCCGGCGTATAAACAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGTCGTGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGTCGTGGCCGTGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGTCGTAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGTCGTCGTGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGT(SEQ ID NO.:3)

在另一优选例中，分选结构域Z的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

AAACCGCTGCCGGAAGTGACCGATGAATAT(SEQ ID NO.:4)

在另一优选例中，分选结构域Z的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:14所示。

TGGAGCCATCCGCAGTTTGAAAAA(SEQ ID NO.:14)

在另一优选例中，L₁或L₂的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:11所示。

GGCGGCGGCGGCAGC(SEQ ID NO.:11)

在另一优选例中，F₁的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCGGAACTGGTGCGTCCGGGCAGCAGCGTGAAAATTAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATGCGTTTAGCAGCTATTGGATGAACTGGGTGAAACAGCGTCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCCAGATTTGGCCGGGCGATGGCGATACCAACTATAACGGCAAATTTAAAGGCAAAGCGACCCTGACCGCGGATGAAAGCAGCAGCACCGCGTATATGCAGCTGAGCAGCCTGGCGAGCGAAGATAGCGCGGTGTATTTTTGCGCGCGTCGTGAAACCACCACCGTGGGCCGTTATTATTATGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ ID NO.:5)

在另一优选例中，F₂的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

GATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGGCGAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCCAGCGTGCGACCATTAGCTGCAAAGCGAGCCAGAGCGTGGATTATGATGGCGATAGCTATCTGAACTGGTATCAGCAGATTCCGGGCCAGCCGCCGAAACTGCTGATTTATGATGCGAGCAACCTGGTGAGCGGCATTCCGCCGCGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAACATTCATCCGGTGGAAAAAGTGGATGCGGCGACCTATCATTGCCAGCAGAGCACCGAAGATCCGTGGACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTAAA(SEQ ID NO.:6)

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术在所述T细胞或NK细胞上表达本发明CAR的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明CAR的T细胞或NK细胞。一般来说包括步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述T细胞或NK细胞。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择T细胞或NK细胞为宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

载体

本发明还提供了含有编码本发明所述CAR的多核苷酸的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常通过可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

所述表达盒或核酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，该表达盒或核酸序可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物(如人T细胞)、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，具体如本发明第六方面所述。在一个实施方式中，所述药物组合物为液态制剂。优选地，所述药物组合物为注射剂。优选地，所述药物组合物中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述药物组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括含本发明多核苷酸的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞或NK细胞)进行的治疗性应用。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗CD19CAR-T细胞引起抗表达CD19的细胞的特异性免疫应答。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。

本发明的CAR-T细胞或CAR-NK细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩展细胞，ii)将本发明多核苷酸或载体引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用含本发明多核苷酸的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。本发明CAR-T细胞CAR-NK细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞或CAR-NK细胞。

本发明的CAR-T细胞或CAR-NK细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞或NK细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞或NK细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞或NK细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞或NK细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞或NK细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞或NK细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞或NK细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点

(1)本发明的CAR具有体外特异选择性，可以通过二次分选方法将表达CAR阳性的目的细胞进行高效分选，实现其体外的定向扩增，显著提高CAR阳性目的细胞在终产品中的比例，CAR阳性细胞纯度高，提高了CAR基因修饰性免疫细胞制品的工艺制备效率，为该类技术产品在临床的进一步推广和应用提供更为稳定的技术保证。

(2)本发明CAR具有二次激活T细胞或NK细胞的作用，经过二次分选刺激后，扩增效率显著提高。

(3)与正常T细胞或NK细胞相比，本发明的基因工程化T细胞或NK细胞增值能力和扩增性质基本相同，对CD19阳性细胞具有更好的肿瘤杀伤活性，并且具有更高的杀伤相关因子的释放水平。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.特异选择性CAR分子的制备

设计特异性引物，利用PCR方法从人cDNA文库中定向扩增T细胞受体蛋白CD8分子的前导肽结构域(SEQ ID No.1)，铰链区及跨膜区的编码序列(SEQ ID No.2)；扩增T细胞受体蛋白CD3分子的胞内信号转导结构域CD3ζ和CD137分子的胞内信号激活结构域的编码序列(SEQ ID No.3)。CAR分子中的特异选择性结构域来源于人核蛋白La/SS-B的C端结构域第95-104氨基酸编码序列(SEQ ID No.4)，该序列通过化学合成方法进行制备，并插入到CAR分子中的人源化单链抗体ScFv编码区域的VL与VH结构域之间。所述CAR的结构为F₀-F₁-L₁-Z-L₂-F₂-H-TM-C-CD3ζ，氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。将上述不同编码序列利用筑巢式PCR进行体外拼接和扩增，构建含有特异选择性结构域的嵌合抗原受体编码序列。本发明以抗人CD19人源化单链抗体为例，构建了含有上述选择性序列的靶向CD19的嵌合抗原受体分子CD19-sCAR用于详细说明该CAR分子结构域在下游制备CAR基因修饰性T细胞中的应用。

实施例2.嵌合抗原受体表达载体的构建

将实施例1中的CAR编码序列(SEQ ID NO.:7)利用分子克隆技术克隆到慢病毒表达载体pLenti-CMV中。为比较本发明中进行了修饰后的CAR分子在制备嵌合抗原受体T细胞中的优势，利用常规的靶向CD19抗原的CAR分子(氨基酸序列如SEQ ID NO.:9所示，专利号：CN103492406A)作为对照，构建了CD19-CAR病毒表达载体。上述慢病毒表达载体与病毒包装辅助质粒，编码病毒核衣壳蛋白Gag/Pol和Rev的质粒psPAX2和编码病毒包膜蛋白的质粒pVSVG一同使用，用于后续不同CAR基因编码慢病毒的制备。图1为利用琼脂糖凝胶电泳对携带不同CAR蛋白编码序列的病毒表达载体鉴定的结果。

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.:9)

实施例3.CAR基因编码病毒的制备

利用HEK193T作为包装细胞进行CAR基因编码病毒的制备。将对数生长期的HEK293T细胞消化，800rpm离心5分钟，弃去培养基后用含有10％FBS(Gbico公司)的DMEM培养基(Gbico公司)重悬。进行细胞计数后，将细胞悬液的密度调整至3.6×10⁶/ml，放置于37℃细胞培养箱中待用。病毒包装质粒的转染使用Lipofectamine 3000试剂盒(ThermoFisher公司)，并按照试剂盒说明书进行操作。将慢病毒包装需要的三种质粒，包括含有不同CAR基因的病毒载体以及实施例2中提到的二种辅助质粒，与Lipofectamine3000按照说明书推荐比例混合配制成DNA脂质体复合物，室温下静置15分钟。静置结束后，取一块6孔培养板，将DNA-脂质体复合物加入到6孔板中，每孔1ml，再将之前制备的HEK293T细胞悬液轻柔混匀，加入到6孔板中，与脂质体复合物混匀。培养板放入培养箱继续培养，分别在培养24小时和48小时收集含有病毒的培养上清。在最后一次收集上清后，将上清2000g离心10分钟，用0.45μm的滤膜过滤，分装后冻存于-80℃保存待用。

实施例4.CAR编码基因修饰的T细胞的体外制备

使用肝素抗凝管采集健康人外周血30mL，利用淋巴细胞分离液进行分离，分离时的离心条件为800g，25℃，15分钟。离心机加速参数设置为1，降速参数设置为0。离心结束后，将白膜层转移至一支新的离心管内，用D-PBS重悬细胞，400g，离心10min。细胞用含有5％正常人AB血清的X-VIVO15培养基(LONZA公司)重悬，调整细胞密度为1-2×10⁶/mL。使用偶联了CD3/CD28抗体的磁珠(Gbico公司)进行T细胞分选，分选过程按照说明书进行。分选后的细胞，用含有1000IU/mL IL-2的X-VIVO-15培养基重悬，接种至预包被10μg/mLRetronectin(Takara公司)和5μg/mL OKT-3(Takara公司)的培养瓶中，接种密度为1-2×10⁶/mL，放入37℃培养箱中进行培养。

培养24小时后，取出细胞放置于显微镜下观察细胞状态，并进行慢病毒感染。按照以下方法感染编码CD19-sCAR以及其对照CAR蛋白的病毒。将细胞收集，400g，离心10min，并重悬，细胞密度调整为3-5×10⁶/mL，接种于预包被10μg/mL Retronectin的培养瓶中。病毒从-80℃冰箱中取出，放置于冰上融化。根据被感染的细胞数，病毒滴度，按照MOI＝50计算所需要的病毒量。将病毒用X-VIVO-15培养基稀释后，与细胞混合，加入终浓度为8μg/mL的polybrene(Sigma公司)，混匀后放入培养箱培养。8小时后，更换新鲜培养基，继续培养。

培养至第5天，将感染编码CD19-sCAR蛋白病毒的T细胞收集，按照T细胞分选的方法，使用包被了抗人核蛋白La/S-BB多肽抗体的磁珠进行第二次分选，分选时磁珠与T细胞的比例为1:1。分选后的细胞接种于培养瓶中继续培养。之后，不同组的T细胞根据细胞生长状态每2-3天进行补液，保持细胞密度在1-1.5×10⁶/mL，培养至第14天，完成制备。制备后的细胞收集后用细胞冻存液冻存，用于后续的各项分析。

图2中2-1图为感染不同CAR蛋白分子的T细胞在培养过程中的增殖曲线。结果显示，各组T细胞的增殖能力基本相同，没有显著性差异，说明在CAR分子中引入特异性选择结构域，不影响CAR基因修饰后T细胞的增殖能力。图2-2为感染不同CAR蛋白分子的T细胞在使用筛选肽进行二次分选刺激后的增殖曲线图。从图中可以看出，经过二次分选刺激后，CD19sCAR T的增殖效率显著高于对照组CAR-T。图3-1为利用流式细胞分析技术对不同组CAR基因修饰T细胞终产品进行CAR阳性细胞纯度的分析结果，显示CD19-sCAR-T细胞的纯度显著高于对照组，说明特异性选择结构域的引入可以有效的提高终产品中CAR阳性细胞的比例，提高了终产品的纯度。而细胞亚群分析结果显示，与对照组相比，不同细胞亚群在终产品中的比例两组间没有显著差异，说明CD19-sCAR分子在T细胞中的表达不会改变不同亚群细胞在体外的扩增性质(图4)。

实施例5.CAR编码基因修饰的NK细胞的体外制备

使用肝素抗凝管采集健康人外周血35mL，利用淋巴细胞分离液进行分离，分离时的离心条件为800g，25℃，15分钟。离心机加速参数设置为1，降速参数设置为0。离心结束后，将白膜层转移至一支新的离心管内，用D-PBS重悬细胞，400g，离心10min。细胞用含有10％正常人AB血清的SCGM培养基(Cellgenix公司)重悬，调整细胞密度为1-2×10⁶/mL。将重悬后的细胞接种至培养瓶或者培养皿中，接种密度1.5×10⁶/mL，向培养体系中加入终浓度为5ng/mL的OKT-3，20μg/mL的小鼠抗人CD16单克隆抗体，以及1000IU/mL IL-2，放入37℃培养箱中进行培养。

在培养后的第3-4天，按照实施例4中描述的方法进行慢病毒的感染以及感染后阳性NK细胞的分选。分选后的细胞培养至第14天，将细胞收获，冻存于-193℃长期保存，或者直接将新鲜细胞用于后续的实验分析。终产品中CAR阳性NK纯度如图3-2所示，CD19sCAR-NK终产品中的CAR阳性NK比例，显著高于CD19CAR-NK。

实施例6.体外杀伤效能评价

使用CD19阳性人B细胞淋巴瘤Raji细胞系，利用LDH释放法评价了CD19-sCAR组和CD19-CAR组的体外杀伤活性。LDH释放的检查使用Progema公司试剂盒，并按照试剂盒说明书进行操作。利用各组的吸光光度值，根据公式1计算杀伤能力。具体方法为，收集对数生长期的Raji细胞，调整细胞悬液密度为4×10⁶/mL，以2×10⁴/50μL/孔接种至U型底96孔板中。将不同组CAR-T细胞收集后重悬，按照E/T为25:1，12.5:1，6.25:1以及3.125:1的比例与Raji细胞混合后共培养。培养4小时后收集细胞上清，按照试剂盒说明书检测LDH释放，评价不同组CAR-T细胞的杀伤活性。如图5-1所示，表达CD19-sCAR的T细胞具有比对照组更好的杀伤活性。

在测定CD19sCAR-NK的杀伤实验中，选择Raji细胞系作为靶细胞，按照上述方法进行操作，评价感染了不同CAR蛋白分子的NK细胞对Raji的杀伤效果，使用正常的NK细胞作为对照。实验结果如图5-2所示，表达CAR蛋白的NK细胞对Raji的杀伤能力显著高于对照组NK细胞，而CD19sCAR-NK对Raji细胞的杀伤能力要强于CD19CAR-NK。

公式1：

杀伤效率(％)＝(实验组-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(效应细胞最大释放-效应细胞自发释放)×100％

实施例7.细胞因子释放检测

使用ELISA试剂盒(欣博盛公司)检测不同CAR基因修饰的T细胞在杀伤过程中T细胞杀伤相关细胞因子IL-2，INF-γ以及TNF-α的释放水平。将Raji细胞按照实施例5中的接种量接种至U型底96孔培养板中，将表达不同CAR分子的T细胞按照E/T＝25:1的比例与Raji细胞混合，进行共培养。培养12小时后，收集细胞上清，按照ELISA试剂盒说明进行操作，分别检测培养上清中IL-2，INF-γ以及TNF-α因子的浓度。如图6所示，表达CD19-sCAR受体的T细胞的杀伤相关因子的释放水平显著高于表达对照CAR受体的T细胞，说明使用本发明方法制备的CAR修饰性T细胞具有更好的杀伤活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 首都医科大学宣武医院

<120> 一种用于体外高效定向扩增的嵌合抗原受体及其应用

<130> P2017-2347

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atggcgctgc cggtgaccgc gctgctgctg ccgctggcgc tgctgctgca tgcggcgcgt 60

ccg 63

<210> 2

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accaccaccc cggcgccgcg tccgccgacc ccggcgccga ccattgcgag ccagccgctg 60

agcctgcgtc cggaagcgtg ccgtccggcg gcgggcggcg cggtgcatac ccgtggcctg 120

gattttgcgt gcgatattta tatttgggcg ccgctggcgg gcacctgcgg cgtgctgctg 180

ctgagcctgg tgattaccct gtattgc 207

<210> 3

<211> 462

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacgtggcc gtaaaaaact gctgtatatt tttaaacagc cgtttatgcg tccggtgcag 60

accacccagg aagaagatgg ctgcagctgc cgttttccgg aagaagaaga aggcggctgc 120

gaactgcgtg tgaaatttag ccgtagcgcg gatgcgccgg cgtataaaca gggccagaac 180

cagctgtata acgaactgaa cctgggccgt cgtgaagaat atgatgtgct ggataaacgt 240

cgtggccgtg atccggaaat gggcggcaaa ccgcgtcgta aaaacccgca ggaaggcctg 300

tataacgaac tgcagaaaga taaaatggcg gaagcgtata gcgaaattgg catgaaaggc 360

gaacgtcgtc gtggcaaagg ccatgatggc ctgtatcagg gcctgagcac cgcgaccaaa 420

gatacctatg atgcgctgca tatgcaggcg ctgccgccgc gt 462

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

aaaccgctgc cggaagtgac cgatgaatat 30

<210> 5

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caggtgcagc tgcagcagag cggcgcggaa ctggtgcgtc cgggcagcag cgtgaaaatt 60

agctgcaaag cgagcggcta tgcgtttagc agctattgga tgaactgggt gaaacagcgt 120

ccgggccagg gcctggaatg gattggccag atttggccgg gcgatggcga taccaactat 180

aacggcaaat ttaaaggcaa agcgaccctg accgcggatg aaagcagcag caccgcgtat 240

atgcagctga gcagcctggc gagcgaagat agcgcggtgt atttttgcgc gcgtcgtgaa 300

accaccaccg tgggccgtta ttattatgcg atggattatt ggggccaggg caccaccgtg 360

accgtgagca gc 372

<210> 6

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatattcagc tgacccagag cccggcgagc ctggcggtga gcctgggcca gcgtgcgacc 60

attagctgca aagcgagcca gagcgtggat tatgatggcg atagctatct gaactggtat 120

cagcagattc cgggccagcc gccgaaactg ctgatttatg atgcgagcaa cctggtgagc 180

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ccggtggaaa aagtggatgc ggcgacctat cattgccagc agagcaccga agatccgtgg 300

acctttggcg gcggcaccaa actggaaatt aaa 333

<210> 7

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggctctgc cagtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgcagctaga 60

ccccaggtgc agctgcagca gtcaggagca gaactcgtga gaccaggcag cagcgtgaag 120

atctcttgca aggccagcgg ctacgccttc tctagctatt ggatgaattg ggtgaagcag 180

cggccaggac agggactgga gtggattgga cagatttggc ccggcgacgg cgataccaac 240

tacaacggca agttcaaggg caaggccacc ctgacagccg acgagtctag cagcacagcc 300

tacatgcagc tgagctctct ggccagcgag gatagcgccg tgtacttttg cgccagaagg 360

gagaccacaa cagtgggccg gtactactac gccatggact attggggcca gggcacaacc 420

gtgacagtgt ctagcggagg aggcggctct aagcctctgc cagaagtgac agacgagtac 480

ggcggaggag gaagcgacat ccagctgacc cagagcccag cttctctggc agtgtctctg 540

ggacagaggg ctaccatctc ttgcaaggcc agccagagcg tggattacga cggcgacagc 600

tacctgaatt ggtatcagca gatccccggc cagcctccta agctgctgat ctacgacgcc 660

tccaacctgg tgtccggcat ccctcccaga ttcagcggaa gcggcagcgg cacagacttc 720

accctgaaca tccaccccgt ggagaaggtg gacgccgcca cataccattg ccagcagagc 780

acagaggacc cctggacctt tggcggcgga acaaagctgg agatcaagac aaccacccca 840

gcccctagac ctcctacacc agcccctaca atcgcctctc agcctctgag cctgaggcca 900

gaagcttgta gacccgcagc aggaggagca gtgcatacaa ggggcctgga cttcgcttgc 960

gacatctaca tttgggcccc tctggcagga acttgcggag tgctgctgct gtctctggtc 1020

atcaccctgt attgcaagcg gggccggaag aagctgctgt acatcttcaa gcagcccttc 1080

atgcggccag tgcagacaac acaggaggag gacggttgca gctgcagatt cccagaggag 1140

gaggaaggcg gctgcgagct gagagtgaag ttcagcagga gcgccgacgc tccagcctat 1200

aaacagggac agaaccagct gtacaacgag ctgaacctgg gcagaagaga ggagtacgac 1260

gtgctggaca agaggagagg cagagaccca gagatgggcg gcaagcctag aaggaagaac 1320

ccccaggagg gcctgtacaa cgagctgcag aaggacaaga tggccgaggc ttacagcgag 1380

atcggcatga agggcgagag gagaagaggc aaaggccacg acggactgta tcagggactg 1440

agcacagcca ccaaggacac ctacgacgct ctgcacatgc aggctctgcc tcctagataa 1500

<210> 8

<211> 499

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr

115 120 125

Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Pro Leu Pro Glu Val Thr Asp Glu Tyr

145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu

165 170 175

Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln

180 185 190

Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile

195 200 205

Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val

210 215 220

Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

225 230 235 240

Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His

245 250 255

Cys Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

260 265 270

Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

275 280 285

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

290 295 300

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

305 310 315 320

Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

325 330 335

Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

340 345 350

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

355 360 365

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

370 375 380

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

385 390 395 400

Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

405 410 415

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

420 425 430

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

435 440 445

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

450 455 460

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

465 470 475 480

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

485 490 495

Pro Pro Arg

<210> 9

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

260

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggcggcggcg gcagc 15

<210> 12

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr

115 120 125

Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val

165 170 175

Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val

180 185 190

Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly

195 200 205

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly

210 215 220

Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

225 230 235 240

Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln

245 250 255

Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

260 265 270

Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

275 280 285

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

290 295 300

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

305 310 315 320

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

325 330 335

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

340 345 350

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

355 360 365

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

370 375 380

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln

385 390 395 400

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

405 410 415

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

420 425 430

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

435 440 445

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

450 455 460

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

465 470 475 480

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

485 490 495

Arg

<210> 13

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr

115 120 125

Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly

145 150 155 160

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

165 170 175

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

180 185 190

Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro

195 200 205

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser

210 215 220

Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

225 230 235 240

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys

245 250 255

Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

260 265 270

Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

275 280 285

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

290 295 300

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

305 310 315 320

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

325 330 335

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

340 345 350

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

355 360 365

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

370 375 380

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys

385 390 395 400

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

405 410 415

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

420 425 430

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

435 440 445

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

450 455 460

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

465 470 475 480

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

485 490 495

Pro Arg

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tggagccatc cgcagtttga aaaa 24

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构如下式I所示：

F₀-F₁-L₁-Z-L₂-F₂-H-TM-C-CD3ζ(I)

其中，

F₀为无或信号肽序列；

F₁和F₂两者中一个为抗人CD19的单链抗体重链可变区，另一个为抗人CD19的单链抗体轻链可变区；

Z为分选结构域，所述分选结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8中第151-160位、SEQID NO.:12中第151-158位、或SEQ ID NO.:13中第151-159位所示；

L₁和L₂为无或连接肽；

H为无或绞链区；

TM为跨膜结构域；

C为无或共刺激信号受体酪氨酸激活基序；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

其中，“-”为连接肽或肽键。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述F₁和F₂的氨基酸序列分别如SEQID NO.:8中第22-145位和第166-276位所示。

3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:12或SEQ ID NO.:13所示。

4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)。

5.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体；和/或

所述宿主细胞基因组中整合有外源的权利要求4所述的多核苷酸；和/或

所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体。

7.一种基因工程化的NK细胞或T细胞，其特征在于，所述NK细胞或T细胞为哺乳动物的NK细胞或T细胞，并且所述的NK细胞或T细胞的细胞膜上表达有权利要求1所述的嵌合抗原受体。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含：权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的载体或权利要求7所述NK细胞或T细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

9.权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述载体、或权利要求7所述的NK细胞或T细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

10.一种制备权利要求7所述的NK细胞或T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的载体转导入NK细胞或T细胞内，从而获得所述NK细胞或T细胞。