CN115491360A - 一种靶向nkg2d配体和folr1双打靶点car t的制备及应用 - Google Patents

一种靶向nkg2d配体和folr1双打靶点car t的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可以靶向于FOLR1和NKG2D配体双靶点的嵌合抗原受体CAR‑免疫细胞及其应用。本发明的CAR‑T细胞的应用可以覆盖更广范围的卵巢癌肿瘤细胞。本发明的CAR‑T细胞在传统CAR‑T基础上进行结构优化，使其分泌BiTE，可以实现对双靶点的杀伤；同时更大限度的调动回输的T细胞，从而更加高效地实现对肿瘤细胞的杀伤。

Description

一种靶向NKG2D配体和FOLR1双打靶点CAR T的制备及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向NKG2D配体和FOLR1双打靶点CAR T的制备及应用。
背景技术
在全球范围内，卵巢癌是女性第七大常见癌症，也是第八大致死癌症。尽管外科方法和化学疗法已有进步，5年生存率仍低于45％。更重要的是，每年确诊的病例数量也在增加，这对女性生命造成了严重威胁。
细胞免疫治疗是一种新型精准靶向疗法，具有显著疗效的肿瘤治疗模式，尤其是CAR-T。CAR-T细胞疗法首先从患者体内收集细胞，然后通过激活和基因工程对其进行修饰，使得T细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)。嵌合抗原受体是由胞外抗原结合区即识别肿瘤相关抗原的scFv、跨膜区和胞内信号域等组成。这些CAR-T细胞被会回输到患者体内，它们可以识别和消灭表达指定抗原的肿瘤细胞。
叶酸受体1(Folate receptor1，FOLR1)又名叶酸受体α或叶酸结合蛋白，相较于肿瘤组织，其在正常组织上表达较低。它表达在细胞质膜上，可以介导细胞摄取叶酸并影响下游通路促进肿瘤生长。研究显示，FOLR1在大多数的卵巢癌(在恶性卵巢癌中的表达占76％)及子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌及乳腺癌中高表达，它可介导细胞摄取叶酸或产生调控信号来促进肿瘤细胞生长。FOLR1的这种表达模式使其成为适用于CAR-T细胞治疗卵巢癌的一个良好的靶点。
NKG2D是一种重要的激活受体，表达于人类自然杀伤细胞(NK)、自然杀伤T细胞(NKT)、γδT细胞、CD8+T细胞以及一些自身反应性或免疫抑制的CD4+T细胞的表面。在人类细胞中，NKG2D配体(NKG2DLs)包括主要组织相容性复合体MHCI类相关链A和B(MICA和MICB)和6种独特的长16结合蛋白(UL-BP1-6)。这些分子在正常细胞中表达水平低或无法检测到，但在受压、恶性转化和感染细胞的表面迅速出现。并且，大多数人类肿瘤细胞都表达NKG2D配体，包括卵巢癌。因此，NKG2D配体也是一个治疗卵巢癌比较好的潜在靶点。
鉴于肿瘤的异质性,使用上述单一靶点并不能很好的实现对卵巢癌的治疗。另外，由于现行的基因修饰方法限制，很难实现回输的T细胞能够100％的被修饰。再加上一般T细胞很难浸润到实体瘤中，NKG2D配体则在肿瘤微环境中的各种类型的肿瘤细胞和免疫抑制细胞(例如Treg和髓样衍生的抑制细胞(MDSC))上表达，可以为打开肿瘤微环境提供帮助，因此这些配体为癌症治疗提供了有吸引力的靶标。
而若将上述的FOLR1与NKG2D两个靶点联用，目前同时实现对两种靶点杀伤的方法主要有双特异性CAR-T。但是，其仍然存在一些缺陷，由于现行的基因修饰方法限制，很难实现回输的T细胞能够高效地被修饰，而且也不能调动患者体内的T细胞。
因此，本领域迫切需要开发出一种能够高效被修饰的、较大限度被调动回输的、更加广谱的双特异性的CAR-T细胞。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够高效被修饰的、较大限度被调动回输的、更加广谱的双特异性的CAR-T细胞。
在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体CAR-免疫细胞，所述CAR-免疫细胞含有以下元件：
(a)第一CAR，所述的第一CAR的胞外结合域含有靶向第一靶蛋白的第一结合元件，并且所述的第一CAR的胞外结合域含有或不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；
(b1)任选的第二CAR，所述的第二CAR的胞外结合域含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；
(b2)任选的编码BiTE的核酸序列，其中，所述的BiTE靶向第二靶蛋白；
其中，当所述的第一CAR的胞外结合域不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件时，所述的CAR-免疫细胞含有(b1)和/或(b2)元件；
并且，所述的第一靶蛋白为叶酸受体1(FOLR1)，并且第二靶蛋白为杀伤细胞凝集素样受体(NKG2D)；或者，所述的第一靶蛋白为所述的第一靶蛋白为杀伤细胞凝集素样受体(NKG2D)，并且第二靶蛋白为叶酸受体1(FOLR1)。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括：T细胞、NK细胞或其组合。
在另一优选例中，所述的第一CAR的胞外结合域从N端到C端依次包括：任选的信号肽、靶向第一靶蛋白的第一结合原件、任选的连接序列，和靶向第二靶蛋白的第二结合原件；所述的第一CAR的胞外结合域从N端到C端依次包括：任选的信号肽、靶向第二靶蛋白的第二结合原件、任选的连接序列，和靶向第一靶蛋白的第一结合原件。
在另一优选例中，所述的连接序列是柔性肽段。
在另一优选例中，所述连接序列为(G4S)n，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)。
在另一优选例中，所述的CAR-免疫细胞含有以下元件：
(a)所述的第一CAR的胞外结合域含有靶向第一靶蛋白的第一结合元件，并且不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；和
(b1)第二CAR，所述的第二CAR的胞外结合域含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件。
在另一优选例中，所述的CAR-免疫细胞含有以下元件：
(a)所述的第一CAR的胞外结合域含有靶向第一靶蛋白的第一结合元件，并且不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；和
(b2)编码BiTE的核酸序列，其中，所述的BiTE靶向第二靶蛋白。
在另一优选例中，所述第一CAR或第二CAR的结构如下式I所示：
L-EB-H-TM-C-CD3ζ (I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为任选的信号肽序列；
EB为胞外结合域；
H为任选的铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，式I中的“H-TM-C”的序列可以是CD28的胞外域、CD28的跨膜区和CD28的胞内结构域所组成的全长序列(即Extra_CD28 TM_ICD)。
在另一优选例中，所述Extra_CD28 TM_ICD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述的信号肽是本领域常用的免疫细胞表面分子的信号肽，优选为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、NKG2D，或其组合。
在另一优选例中，所述的信号肽是CD8先导序列(信号肽)，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中，所述的铰链区可以是选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、NKG2D，或其组合。
在另一优选例中，所述铰链区是CD8的铰链区，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在另一优选例中，所述的跨膜结构域可以是本领域常用的免疫细胞表面分子的跨膜区，优选为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、NKG2D、DAP10、DAP12，或其组合。
在另一优选例中，所述跨膜结构域包括源于CD8的跨膜区，其氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
在另一优选例中，所述的共刺激信号分子是选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2，DAP10、DAP12，或其组合。
在另一优选例中，所述共刺激信号分子为4-1BB来源的共刺激信号分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在另一优选例中，所述的靶向第一或第二靶蛋白的第一结合元件或第二结合原件可以是靶向所述靶蛋白的抗体的抗原结合结构域ScFv，所述的ScFv的结构如下式A或式B所示：
VH1-VL1 (A)
VL1-VH1 (B)
式中，VH1为抗体重链可变区；
VL1为抗体轻链可变区；
“-”为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述的靶蛋白是FOLR1；其中，VH1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且VL1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一优选例中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在另一优选例中，所述的靶向第一或第二靶蛋白的第一结合元件或第二结合原件可以是与所述靶蛋白特异性结合的天然序列。
在另一优选例中，所述的第一或第二靶蛋白是NKG2D，并且所述的第一或第二结合原件是NKG2D或其片段。
在另一优选例中，上述的NKG2D序列是由胞外片段组成的氨基酸序列。
在另一优选例中，NKG2D的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，当所述的第二靶蛋白是NKG2D时，所述的BiTE是CD3 ScFv。
在另一优选例中，所述BiTE可以是抗体的Fc区，并且所述免疫细胞是NK细胞。
在另一优选例中，所述的CD3 ScFv中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
在另一优选例中，当所述的CAR-免疫细胞含有元件(a)和元件(b2)时，所述的元件(a)和元件(b2)可源自同一核酸构建物所表达的肽链，所述的肽链从N端到C端具有以下式II的结构：
SP1-B1-H-TM-C-CD3ζ-CS-SP2-B2-I-BiTE-M (式II)
式中，
SP1和SP2各自独立地为任选的信号肽序列；
B1和B2分别为靶向第一靶蛋白的第一结合元件，和靶向第二靶蛋白的第二结合元件；
H、TM、C和CD3ζ的定义与式I相同；
CS为可被蛋白酶特异性识别并切割的位点序列；
I为无或连接序列；
BiTE为靶向第二靶蛋白的序列；
M为任选的标签序列。
在另一优选例中，所述的具有式II结构的肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在另一优选例中，所述的具有式II结构的肽链的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
在另一优选例中，所述的SP1是源自膜蛋白的信号肽，所述膜蛋白可以是本领域常用的免疫细胞表面分子；优选地，所述的源自膜蛋白的信号肽是选自下组的蛋白的信号肽：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、GITR、TLR2、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD154、NKG2D、DAP10、DAP12，或其组合。
在另一优选例中，所述的SP1为CD8的信号肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中，所述的SP2是源自于分泌性蛋白的信号肽序列，所述的分泌型蛋白可以是本领域常规的免疫细胞分泌的蛋白；优选地，所述的分泌性蛋白的信号肽是选自下组的蛋白的信号肽：免疫球蛋白组成亚基、细胞因子(IL-2、IL-12、IL-7、IFN-γ)等。
在另一优选例中，所述的SP2是为Igκ链的信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在另一优选例中，当所述的元件(a)和元件(b2)可源自同一核酸构建物所表达的肽链，并且所述的核酸构建物中具有两个分别用于启动元件(a)和元件(b2)的不同的启动子。
在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的CAR-免疫细胞中的元件(a)、(b1)和/或(b2)。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述的载体包括DNA、RNA。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。
在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有如本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及如本发明第一方面所述的CAR-免疫细胞、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、或如本发明第四方面所述的宿主细胞。
在本发明的第六方面，提供了如本发明第一方面所述的CAR-免疫细胞、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、或如本发明第四方面所述的宿主细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括NKG2D阳性肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括FOLR1阳性肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括NKG2D阳性和FOLR1阳性的任意肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括：卵巢癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤是卵巢癌。
在本发明的第七方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、或如本发明第四方面所述的细胞、或如本发明第五方面所述的药物组合物。
在本发明的第八方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的CAR-免疫细胞的方法，所述方法包括步骤：将如本发明第二方面所述的核酸分子或如本发明第三方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述的CAR-免疫细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了FR1scFV-NKG2D-BB、FR1scFV-BB及FR1scFV-BB-NKG2D-BiTE结构示意图。其中Hinge TM代表CD8的铰链区及跨膜区；4-1BB代表4-1BB的胞内信号区。
图2显示了Tandem-CAR(FR1scFV-NKG2D-BB)与单靶点二代CAR(FR1scFV-BB)的细胞杀伤作用比较。
图3显示了BiTE-CAR(FR1scFV-BB-NKG2D-BiTE)与单靶点二代CAR(FR1scFV-BB)的细胞杀伤作用比较。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种靶向NKG2D和FOLR1双打靶点CAR-T细胞。在本发明中，发明人将FOLR1抗体与NKG2D联用构建双特异性CAR-T细胞。本发明的CAR-T细胞的应用可以覆盖更广范围的卵巢癌肿瘤细胞。本发明的CAR-T细胞在传统CAR-T基础上进行结构优化，使其分泌BiTE，可以实现对双靶点的杀伤；同时更大限度的调动回输的T细胞，从而更加高效地实现对肿瘤细胞的杀伤。在此基础上完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、I 1e(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
嵌合抗原受体(CAR)-免疫细胞
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)-免疫细胞”、“CAR-免疫细胞”、“本发明免疫细胞”可互换使用，均是指本发明第一方面所述的具有元件(a)、(b1)和/或(b2)的，具有双靶点特异性的CAR-免疫细胞。
本发明的CAR-免疫细胞中表达第一CAR和任选的第二CAR。其中，所述的第一CAR和第二CAR中，除了特定的胞外结合域之外，均具有本领域常规的嵌合抗原受体的结构。
在本发明的一个实施方式中，所述的CAR-免疫细胞能够分泌一种BiTE序列，所述的BiTE序列具有靶向相应的第二CAR的功能，其能够将所述CAR-免疫细胞及未修饰的免疫细胞与表达所述第二CAR靶蛋白的靶细胞拉近，从而进一步地促进CAR-免疫细胞对靶细胞的杀伤。
如本文所用，术语“本发明的嵌合抗原受体”是指本发明中的第一CAR和/或第二CAR。
本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别FOLR1的抗体，较佳地为单链抗体。
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
载体
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
制剂
本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，更优地1×104-1×107个细胞/ml。
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
治疗性应用
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)或逆转录病毒载体(RVV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物NKG2D和FOLR1，可以用于自体和异体肿瘤治疗，可以大规模制备，质量均一稳定，随时可调用给任何患者使用。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本发明的CAR，和CAR-T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗NKG2D CAR-T细胞引起对表达FSHR的细胞的特异性免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗FOLR1scFv、NKG2D人Fc铰链区、ICOS跨膜区及胞内区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。
本发明的CAR-免疫细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或i ii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-免疫细胞。
本发明的CAR-免疫细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如贝伐珠单抗、醋酸甲地孕酮分散片、紫杉醇注射液、异环磷酰胺、注射用异环磷酰胺对卵巢癌患者的治疗。在进一步的实施方式中，本发明的CAR-免疫细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明的CAR-免疫细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的主要优点包括：
1)由于肿瘤的异质性，使用单一靶点可能不能很好的实现对卵巢癌的治疗，在本专利中，我们将FOLR1抗体与NKG2D联用构建CAR-T细胞。可以覆盖更广范围的卵巢癌肿瘤细胞。
2)由于现行的基因修饰方法限制，很难实现回输的T细胞能够100％的被修饰。本发明在CAR-T的基础上进行结构优化，使其分泌BiTE,可以实现对双靶点的杀伤，同时更大限度的调动回输的T细胞，实现对肿瘤细胞的杀伤。
3)实体瘤内部混合着抑制性细胞群，这些细胞表达NKG2D配体，如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，髓样抑制细胞(MDSC)，调节性T细胞(Treg)和癌症相关成纤维细胞(CAF)。因此，通过同时靶向FOLR1和NKG2D配体，我们不仅能够降低抗原损失的可能性并提高T细胞的抗肿瘤活性，而且还可以靶向肿瘤微环境中的免疫抑制细胞。
下面结合实施例及对发明进一步说明：下述实施例是说明性的，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的保护范围。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明。本发明所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法；本发明中的试剂，如无特殊说明，均为本领域的常规试剂。
表1本发明的序列
Figure BDA0003122477200000171
Figure BDA0003122477200000181
Figure BDA0003122477200000191
实施例1：Tandem-CAR的功能检测
1.1逆转录病毒病毒包装
(1)Phoenix-GP转导：前一天以总细胞数4E6，体积15ml种到养在T75培养瓶里。培养基为10％FBS的DMEM，37℃，5％CO2培养箱中培养。
(2)准备待转质粒，每个T75培养瓶的用量为：1μg的VSV-G和9μg的CAR载体，950μlOpti-MEM，30μL X-tremeGENE，室温孵育15min后加到T75瓶里。第二天换新鲜的培养基，培养48h。
(3)前一天将PG13细胞以0.075E6/孔种到6孔板里，体积3ml/孔。
(4)第二天用48h Phoenix-GP的纯化的病毒液加入到PG13细胞里，每孔4ml。
(5)FACS检测48h和72h的PG13细胞的CAR分子表达率。表达率高的PG13细胞冻存用于后续CAR-T细胞制备。
1.2逆转录病毒感染的CAR-T细胞制备
(1)将商品化PBMC细胞用含有5‰人血白蛋白的X-VIVO 15(LONZA，04-418Q)培养，起始细胞密度为1×106个细胞/mL。加入CD3抗体，使其终浓度为50ng/mL，并加入100IU/mL的IL-2以激活T细胞扩增。细胞激活48小时后，用于逆转录病毒感染。
(2)Retronectin包被培养板：T细胞活化培养后隔天，PBS稀释至终浓度为20ug/ml的Retronectin包被non-tissue treated培养板，24孔板每孔500μl。避光，4℃过夜备用。
(3)取出包被好的24孔板，吸弃包被液，加入含2％BSA的PBS室温封闭30min。封闭液体积为每孔500μl，吸弃封闭液，用PBS洗板两次。
(4)PG13生产的48或72h新鲜病毒液加入孔内，每孔加0.8ml病毒液，25℃，1500g，离心2h。
(5)弃去上清液，24孔板每孔加入活化后的T细胞0.5×106个，体积1ml，培养基为T细胞培养基中添加IL-2 300IU/ml。32℃，600g，离心30min。
(6)离心完毕后，将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(7)细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补充含IL-2 300IU/ml的T细胞培养液，使细胞扩增到第七天。检测CAR分子阳性率，冻存，用于后续功能验证。
1.3细胞杀伤作用验证
构建Luc+表达的靶细胞SKOV3进行96孔板铺板时，靶细胞2E3/孔，按照的E:T比为0.125:1、0.25：1、0.5：1、1：1加入CAR-T细胞，同时设置只有靶细胞的阴性对照。于37℃5％CO2的培养相中进行培养。到达预设的孵育时间24h时，然后按照Bright-Glo试剂盒说明书进行检测检测CAR-T细胞的杀伤活性，方法参考改试剂盒说明书。细胞毒作用计算方式如下：
细胞毒性％＝(阴性对照-实验组)/阴性对照×100％
细胞杀伤检测结果详见图2。结果显示：Tandem-CAR FR1scFV-NKG2D-BB修饰的CAR-T细胞的杀伤优于二代CAR(FR1scFV-BB)修饰的CAR-T细胞。
实施例2：BiTE-CAR的功能检测
2.1慢病毒病毒包装
按照如图1所示的结构，合成基因并克隆到病毒转至慢病毒载体pWPXLd上，载体测序无误后即可使用。将培养在10cm培养皿中的293T细胞(含10％FBS的DMEM)密度控制在70％-80％。将质粒pWPXLd、pMD2G、psPAX2按照10ug:7.5ug:2.5ug比例加入2mL的Opti-Mem并进行混合，制备3个转染质粒的混合物。然后将其与X-tremeGENE HP DNA TransfectionReagent进行混合。一般来讲，DNA与Transfection Reagent之比为1:3(每10cm培养皿总1000μl)。室温孵育15min。
将混合物逐滴加入已经准备好的上述293培养皿中。置于细胞培养箱培养6h之后，及进行清洗换液，换成15mLDMEM完全培养基。继续培养72h后，收取病毒。
将病毒上清液以约500g离心5分钟，去除细胞碎片，收集上清。然后用0.45μm的滤膜过滤上述回收的上清液。然后进行浓缩15倍，备用。若暂时不用，应该及时分装并在液氮中冷冻，并尽快转移至-80℃冰箱中。
2.2慢病毒感染的CAR-T细胞制备
将商品化PBMC细胞用含有5‰人血白蛋白的X-VIVO 15(LONZA，04-418Q)培养，起始细胞密度为1×106个细胞/mL。
加入CD3抗体，使其终浓度为50ng/mL，并加入300IU/mL的IL-2以激活T细胞扩增。细胞激活48小时后，加入适量病毒和polybrene感染T细胞。800g离心90min，离心后将其置于细胞培养箱培养。
慢病毒感染24h后，将细胞悬液吸出，并按1×106细胞/mL的浓度补加完全新鲜X-VIVO 15培养基。每天观察细胞的密度，适时补加T细胞培养液，使T细胞的密度维持在1×106个细胞/mL左右。继续扩增5-10天，完成CAR-T细胞的制备。
2.3细胞杀伤作用验证
构建HiBit+表达的靶细胞SKOV3进行96孔板铺板时，靶细胞4E3/孔，按照的E:T比为0.3:1、1：1、3：1加入CAR-T细胞，同时设置最大释放组(只有靶细胞，但是进行裂解处理)及自发组(只有靶细胞)。于37℃5％CO2的培养相中进行培养。到达预设的孵育时间24h时，然后按照Nano-
Figure BDA0003122477200000221
HiBiT Extracellular Detection System试剂盒说明书进行检测检测CAR-T细胞的杀伤活性，方法参考改试剂盒说明书。细胞毒作用计算方式如下：
细胞毒性％＝(实验组-自发)/(最大释放组-自发)×100％
细胞杀伤检测结果详见图3。结果显示：BiTE-CAR FR1scFV-BB-NKG2D BiTE修饰的CAR-T细胞的杀伤优于二代CAR(FR1scFV-BB)修饰的CAR-T细胞。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 复星凯特生物科技有限公司
<120> 一种靶向NKG2D配体和FOLR1双打靶点CAR T的制备及应用
<130> P2021-0825
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 3
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 4
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 5
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 7
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln
1 5 10 15
Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile
20 25 30
Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp
35 40 45
Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys
50 55 60
Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr
65 70 75 80
His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp
85 90 95
Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met
100 105 110
Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile
115 120 125
Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
130 135 140
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Thr Gln Gly Ser Ser Gly Tyr Val Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Phe
20 25 30
Ile Gly Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Tyr Thr Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Tyr Asn Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu
115 120
<210> 13
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser
1 5 10 15
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp
35 40 45
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 14
<211> 920
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
Ala Thr Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser
35 40 45
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr
65 70 75 80
Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
85 90 95
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Thr Gln Gly Ser Ser Gly Tyr Val
115 120 125
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
165 170 175
Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Phe Ile Gly Trp Tyr
180 185 190
Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser
195 200 205
Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Tyr Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
290 295 300
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
305 310 315 320
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
325 330 335
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
340 345 350
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
355 360 365
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
370 375 380
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
385 390 395 400
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
405 410 415
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
420 425 430
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
435 440 445
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
450 455 460
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
465 470 475 480
Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
485 490 495
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr
500 505 510
Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp
515 520 525
Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln
530 535 540
Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile
545 550 555 560
Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp
565 570 575
Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys
580 585 590
Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr
595 600 605
His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp
610 615 620
Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met
625 630 635 640
Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile
645 650 655
Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
660 665 670
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
675 680 685
Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr
690 695 700
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
705 710 715 720
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
725 730 735
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser
740 745 750
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
755 760 765
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
770 775 780
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly
785 790 795 800
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile
805 810 815
Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys
820 825 830
Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp
835 840 845
Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr
850 855 860
Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
865 870 875 880
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala
885 890 895
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly
900 905 910
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
915 920
<210> 15
<211> 2763
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
gccaccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60
gccaggccgg aagtgcagct ggtggagagc ggcggcggcc tggtgcagcc tggcggcagc 120
ctgagactga gctgcgccgt gagcggcttc accttcagca attacggcat gagctgggtg 180
agacaggccc ctggcaaggg cctggagtgg gtggccacaa tcagcagcgg cggcagctac 240
acctactacc ctgactccgt gaagggcaga ttcaccatct ccagagacaa tagcaagaat 300
accctgtacc tgcagatgaa tagcctgaga gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcagc 360
acccagggca gcagcggcta cgtgggctac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 420
agcggcggag gcggaagtgg aggcggagga tctggcggcg gaggctctga catccagatg 480
acccagagcc ctagcagcgt gagcgccagc gtgggcgaca gagtgaccat cacctgcaag 540
gccagccagg acatcaccaa tttcatcggc tggtaccagc acaagcctgg caaggcccct 600
aagctgctga tcagctacac cagcatcctg gagagcggcg tgcctagcag attctccggc 660
agcggctccg gcaccgacta caccctgacc atcagcagcc tgcagcctga ggacttcgcc 720
acctactact gcctgcagta ctacaatctg tggaccttcg gcggcggcac caaggtggag 780
atcaagacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 960
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1020
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1080
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1140
gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1320
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1380
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1440
gccctgcccc ctcgcggatc aggagcaaca aacttctcct tgcttaaaca agcaggagat 1500
gtggaagaga atccgggacc tatggaaaca gatacattac tcttatgggt actactgtta 1560
tgggtaccgg gttcaacagg agatatatgg agtgctgtat tcctaaactc attattcaac 1620
caagaagttc aaattccctt gaccgaaagt tactgtggcc catgtcctaa aaactggata 1680
tgttacaaaa ataactgcta ccaatttttt gatgagagta aaaactggta tgagagccag 1740
gcttcttgta tgtctcaaaa tgccagcctt ctgaaagtat acagcaaaga ggaccaggat 1800
ttacttaaac tggtgaagtc atatcattgg atgggactag tacacattcc aacaaatgga 1860
tcttggcagt gggaagatgg ctccattctc tcacccaacc tactaacaat aattgaaatg 1920
cagaagggag actgtgcact ctatgcctcg agctttaaag gctatataga aaactgttca 1980
actccaaata cgtacatctg catgcaaagg actgtgggag gaggaggatc agatatcaaa 2040
cttcaacaat caggagcaga acttgcaaga cctggagcat cagtgaagat gtcttgcaag 2100
acgtccggat acacatttac aagatacaca atgcactggg tgaaacaaag acctggacaa 2160
ggacttgaat ggatcggata catcaaccct tcaagaggat acacaaacta caaccagaag 2220
ttcaaggata aagcaacact tacaacagat aaatcatcat caacagcata catgcaactt 2280
tcatcactta catcagaaga ttcagcagtg tactactgcg caagatacta cgatgatcac 2340
tactgccttg attactgggg gcagggcaca acacttacag tgtcatcagt ggaaggtggc 2400
tcgggtggct ccggaggaag cggagggtca ggaggcgtcg acgatatcca acttacacaa 2460
tcacctgcaa tcatgtcagc atcacctgga gagaaggtta ctatgacatg cagagcatca 2520
tcatcagtgt catacatgaa ctggtaccaa cagaagtccg gaacgtcgcc taagcggtgg 2580
atctacgata catcaaaggt agcctcagga gtgccttaca gattctccgg ctcaggaagt 2640
ggtactagct attcgcttac aatctcatca atggaagcag aagatgcagc aacatactac 2700
tgccaacaat ggtcatcaaa ccctcttaca tttggagcag gaacaaagtt agagcttaaa 2760
taa 2763

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体CAR-免疫细胞，其特征在于，所述CAR-免疫细胞含有以下元件：
(a)第一CAR，所述的第一CAR的胞外结合域含有靶向第一靶蛋白的第一结合元件，并且所述的第一CAR的胞外结合域含有或不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；
(b1)任选的第二CAR，所述的第二CAR的胞外结合域含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；
(b2)任选的编码BiTE的核酸序列，其中，所述的BiTE靶向第二靶蛋白；
其中，当所述的第一CAR的胞外结合域不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件时，所述的CAR-免疫细胞含有(b1)和/或(b2)元件；
并且，所述的第一靶蛋白为叶酸受体1(FOLR1)，并且第二靶蛋白为杀伤细胞凝集素样受体(NKG2D)；或者，所述的第一靶蛋白为所述的第一靶蛋白为杀伤细胞凝集素样受体(NKG2D)，并且第二靶蛋白为叶酸受体1(FOLR1)。
2.如权利要求1所述的CAR-免疫细胞，其特征在于，所述第一CAR或第二CAR的结构如下式I所示：
L-EB-H-TM-C-CD3ζ (I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为任选的信号肽序列；
EB为胞外结合域；
H为任选的铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
3.权利要求1所述的CAR-免疫细胞，其特征在于，当所述的第二靶蛋白是NKG2D时，所述的BiTE是CD3 ScFv。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的CAR-免疫细胞中的元件(a)、(b1)和/或(b2)。
5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有如权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有如权利要求5所述的所述的载体或染色体中整合有外源的如权利要求4所述的核酸分子。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及如权利要求1所述的CAR-免疫细胞、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的载体、或如权利要求6所述的宿主细胞。
8.如权利要求1所述的CAR-免疫细胞、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的载体、或如权利要求6所述的宿主细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物或制剂。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤是卵巢癌。
10.一种制备如权利要求1所述的CAR-免疫细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求5所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述的CAR-免疫细胞。
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