CN110577932A - 一种脐带血来源的嵌合抗原受体t细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脐带血来源的嵌合抗原受体T细胞及其制备和在肿瘤治疗中的应用。具体地，本发明提供了一种脐带血来源的CAR‑T细胞，所述的表达嵌合抗原受体CAR，并且所述CAR‑T细胞的HLA‑I基因表达是被沉默的。本发明的CAR‑T细胞不会产生宿主T细胞对异体细胞的排斥，不会引起宿主NK细胞的杀伤作用或者杀伤作用较弱，在体内存活更长，可发挥异体移植特异性抗肿瘤的作用。

Description

一种脐带血来源的嵌合抗原受体T细胞

技术领域

本发明涉及免疫细胞治疗领域，更具体地涉及一种脐带血来源的嵌合抗原受体T细胞及其制备和在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

随着肿瘤免疫学理论和技术的发展,免疫细胞治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。T淋巴细胞是免疫细胞治疗的重要参与者，大多数成熟T细胞(约95％)的T细胞表面受体(TCR)分子由α链和β链两条异二聚体肽链组成，小部分由γ、δ链组成，即为γδT细胞。

γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，它的杀伤性较强。γδT细胞在外周血及脐血中所占CD3+T细胞比例很低，约为2–10％，其TCR缺乏多样性，可直接识别某些完整的多肽抗原。由于其主要分布于肠道呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织，因此对于黏膜方面的癌症治疗效果突出。目前一些临床前及临床实验发现，γδT细胞在多种肿瘤中都有抗肿瘤的作用。研究发现，在细胞表面人白细胞抗原(HLA)配型成功的异体脐带血造血干细胞移植中(allo HCT)，异体γδT细胞并不会带来移植物抗宿主相关的疾病(GVHD)，因此在异体细胞治疗中具有很大的优势。

目前异体治疗有很多的问题，一是很难找到一个HLA匹配的供体，二是找到供体后，还需要长时间的培养过程和QC检测过程方可回输到患者体内，极大的浪费患者的时间，对于一些进展快的肿瘤患者，能够在短期内进行治疗就显得尤为关键。

CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T Cell，指的是嵌合抗原受体T细胞，其中嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。现在血液肿瘤的临床试验中应用最多的是第二代CARs。本发明采用第二代CarT技术改造的HLA敲除的γδT细胞即可用于异体治疗相关肿瘤。

CAR-T细胞在血液系统恶性肿瘤的治疗中显示出前所未有的疗效，如对晚期复发难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的完全缓解(CR)可达到90％，对慢性淋巴细白血病(CLL)和部分B细胞淋巴瘤的CR达到50％以上。此外，CAR-T细胞在治疗实体瘤方面也表现出很大的潜力。

在传统的CART细胞治疗中，首先分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以非MHC限制方式识别。但这种治疗方式严重受制于患者的个体状况，分离改造细胞所造成的时间和金钱成本也非常高。因此，本领域仍然需要进一步的研究，开发一种可以大规模制备，质量均一稳定，适合异体治疗的CAR-T细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐带血来源的嵌合抗原受体T细胞及其制备和在肿瘤治疗中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞具有以下特征：

(a)所述CAR-T细胞为来源脐带血的γδT细胞；

(b)所述CAR-T细胞表达嵌合抗原受体CAR，所述CAR靶向肿瘤细胞的标志物；和

(c)所述CAR-T细胞的HLA-I基因表达是被沉默的。

在另一优选例中，所述的CAR-T细胞的β2M基因表达是被沉默的，从而使得HLA-I基因表达被沉默。

在另一优选例中，所述CAR-T细胞的β2M基因被敲除，从而使得β2M基因表达被沉默。

在另一优选例中，所述的β2M基因的登录号为NG_012920.2。

在另一优选例中，所述“β2M基因表达是被沉默的”指β2M基因不表达或低表达。

在另一优选例中，所述“低表达”指所述T细胞β2M基因的表达量G1与正常T细胞β2M基因的表达量G0的比值，即G1/G0≤0.5，较佳地G1/G0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。

在另一优选例中，所述γδT细胞的T细胞表面受体(TCR)分子由γ、δ链组成。

在另一优选例中，所述是β2M是所述T细胞HLA-I的β链(轻链)部分。

在另一优选例中，所述的CAR的结构如下式I所示：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

scFv为抗原结合结构域；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的L为GM-CSF。

在另一优选例中，所述scFv为靶向肿瘤抗原的抗体单链可变区序列。

在另一优选例中，所述scFV为靶向选自下组抗原的抗体单链可变区序列：CD19、CD20、CD22、CD123、CD47、CD138、CD33、CD30、mesothelin、EGFR、GPC3、BCMA、ErbB2、NKG2Dligands、LMP1、EpCAM、VEGFR-1、Lewis-Y、ROR1、Claudin18.2、或其组合。

在另一优选例中，所述scFv为靶向CD19的抗体单链可变区序列。

在另一优选例中，所述scFv为来源FMC63的scFv。

在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H为CD28来源的铰链区。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。

在另一优选例中，TM包括CD28来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR或其组合。

在另一优选例中，C包括CD28来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，所述CAR的结构为L-FMC63-CD28-CD3ζ。

在另一优选例中，所述CAR的序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的CAR-T细胞用于异体肿瘤治疗。

在另一优选例中，所述的CAR-T细胞在异体治疗时不会引起GVHD及HVG反应。

在本发明的第二方面，提供了一种制备本发明的第一方面所述的CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：

(A)提供一待改造的T细胞；和

(B)对所述的T细胞进行改造，从而使得所述的T细胞表达所述的CAR，并沉默所述T细胞的HLA-I基因，从而获得本发明的第一方面所述的CAR-T细胞。

在另一优选例中，在步骤(B)中，沉默所述T细胞的HLA-I的β2M基因。

在另一优选例中，在步骤(B)中，包括(B1)将表达所述CAR的第一表达盒导入所述T细胞；和(B2)将表达用于沉默β2M基因的第二表达盒导入所述T细胞；

其中，所述的步骤(B1)和(B2)的次序无任何限定。

在另一优选例中，所述的“次序无任何限定”指对于任何二个步骤而言，可以依次、同时、或以相反次序进行。

在另一优选例中，当步骤(A)中的待改造的T细胞已经表达某一CAR时，则在步骤(B)中，包括(B2)将表达用于沉默β2M基因的第二表达盒导入所述T细胞。

在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的载体为病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

在另一优选例中，所述的第二表达盒包含CRISPR/Cas9(sgRNA和/或Cas9)、反义RNA、或其组合。

在另一优选例中，所述的sgRNA靶向HLA-I的β2M基因。

在另一优选例中，所述的sgRNA的序列如SEQ ID NO.:3和/或4所示。

在另一优选例中，所述的反义RNA包括miRNA、siRNA、shRNA、抑制性mRNA、或dsRNA。

在另一优选例中，所述的第二表达盒包含两条sgRNA。

在本发明的第三方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明的第一方面所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在本发明的第四方面，提供了本发明的第一方面所述的CAR-T细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述的药物或制剂用于预防和/或治疗与所述CAR-T细胞异体的癌症或肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、或其组合。

在本发明的第五方面，提供了一种用于制备本发明的第一方面所述的CAR-T细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒；

(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于沉默β2M基因的第二表达盒或sgRNA。

在另一优选例中，所述的第一和第二核酸序列为独立的或相连的。

在另一优选例中，所述的第一和第二核酸序列位于相同或不同的容器内。

在另一优选例中，所述的第一和第二核酸序列中的任何二个或三个位于同一表达载体。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：(3)第三核酸序列，所述第三核酸序列含有用于表达Cas9蛋白的第三表达盒；或Cas9蛋白。

在本发明的第六方面，本发明的第一方面所述的CAR-T细胞的用途，用于预防和/或治疗异体癌症或肿瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了实施例1中包含的CAR的结构。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种脐带血来源的嵌合抗原受体T细胞及其制备和在肿瘤治疗中的应用。具体地，本发明提供了一种脐带血来源的CAR-T细胞，所述的表达嵌合抗原受体CAR，并且所述CAR-T细胞的HLA-I基因表达是被沉默的。实验表明，本发明的通用型CAR-T细胞可以用于异体肿瘤治疗，且异体输注时不会引起GVHD及HVG反应，改善了异体CAR-T细胞在受体体内的存活及抗肿瘤效果。在此基础上完成了本发明。

具体地，目前异体治疗有很多的问题，一是很难找到一个HLA匹配的供体，二是找到供体后，还需要长时间的培养过程和QC检测过程方可回输到患者体内，极大的浪费患者的时间，对于一些进展快的肿瘤患者，能够在短期内进行治疗就显得尤为关键。

为解决这些问题，本发明利用Crispr-cas9技术特异性敲除γδT细胞中HLA-I的表达，即便HLA不匹配，亦不会产生宿主T细胞对异体细胞的排斥，同时由于脐血来源的细胞其表面NCR配体表达低及HLA-G表达含量高，不会引起宿主NK细胞的杀伤作用或者杀伤作用较弱，在体内存活更长，再利用CAR-T技术使得γδT细胞特异性识别肿瘤抗原并发挥杀伤肿瘤的功效，即可发挥异体移植特异性抗肿瘤的作用。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

嵌合抗原受体(CAR)

本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向CD19的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与CD28信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)₂片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别CD19的抗体，较佳地为单链抗体。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明的CAR中的胞内结构域包括CD28的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。

CAR-T细胞

如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明第一方面所述的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞为来源脐带血的γδT细胞，表达靶向肿瘤细胞的标志物的嵌合抗原受体CAR；且所述CAR-T细胞的HLA-I基因表达是被沉默的。

本发明利用Crispr-cas9技术特异性敲除γδT细胞中HLA-I的表达，即便HLA不匹配，亦不会产生宿主T细胞对异体细胞的排斥，同时由于脐血来源的细胞其表面NCR配体表达低及HLA-G表达含量高，不会引起宿主NK细胞的杀伤作用或者杀伤作用较弱，在体内存活更长，再利用CAR-T技术使得γδT细胞特异性识别肿瘤抗原并发挥杀伤肿瘤的功效，即可发挥异体移植特异性抗肿瘤的作用。。

基因沉默方法

目前常用的基因沉默方法有CRISPR/Cas9、RNA干扰技术、TALENs(transcriptionactivator-like(TAL)effector nucleases)和Zinc finger nucleases(ZFNs)，其中CRISPR/Cas9目前应用前景和效果最好。

CRISPR(clustered regularly interspersed short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是原核生物特有的一种天然免疫系统，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。Ⅱ型CRISPR/Cas系统作为RNA直接介导的基因组编辑工具已经在许多真核生物和原核生物体内成功应用。CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力，从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。

目前，使用CRISPR做基因敲除非常快捷有效。天然的Cas9蛋白具有RuvC和HNH两个内切酶功能域，当提供正确的sgRNA靶向时，可以造成目标序列的双链DNA断裂，依赖于细胞的同源重组和非同源末端连接的修复机制，切断的DNA可以进行再连接。依靠非同源末端连接修复途径容易造成数个碱基的插入和缺失，因此可以造成编码基因的读码框发生改变。当提供两条sgRNA时，可以实现将这两个sgRNA靶向位点之间的序列删除，造成靶目的基因的缺失。

β2微球蛋白(β2M)是HLA的β链(轻链)部分，对HLA的功能起着重要的作用，敲除掉β2微球蛋白，将会使HLA-I类分子失去活性。本发明利用Crispr-Cas9技术定点敲除γδT细胞中HLA分子β链，即β2M片段，达到沉默HLA-I表达的效果。

表达盒

如本文所用，“表达盒”或“本发明表达盒”包括第一表达盒和第二表达盒。所述第一表达盒包含编码所述CAR的核酸序列。所述第二表达盒包含用于沉默β2M的核酸序列。在另一优选例中，本发明还包括用于表达Cas9蛋白的第三表达盒。

在一个实施方式中，所述第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒分别还包括启动子。在一个实施方式中，所述第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒分别还包括终止子。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物CD19，协同激活T细胞，引起T细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗CD19的CAR-T细胞引起抗表达CD19的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-CD19scFv、铰链和跨膜区、和CD28和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的CAR-T细胞可以特异性识别肿瘤抗原并发挥杀伤肿瘤的功效；

(b)本发明的CAR-T细胞不会引起宿主NK细胞的杀伤作用或者杀伤作用较弱，在体内存活更长；

(c)本发明利用Crispr-cas9技术特异性敲除γδT细胞中HLA-I的表达，即便HLA不匹配，亦不会产生宿主T细胞对异体细胞的排斥，可以发挥异体移植特异性抗肿瘤的作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用方法

1.脐带血的采集：

可以以任何医学或者药学可用的方式收集本发明公开用途的脐带血。用于收集脐带血的常规方法是基于通过重力辅助使用的针或插管的使用。脐带血可以收集到血袋、转移袋或无惧塑料管中。脐带血可获自商品化脐血库。且可收集单个或多个脐带。

对切断后的胎儿脐带清洁后进行采血；

将采血袋置于低于脐带的位置，将采血针刺入脐静脉充盈处的下端，利用重力挤压使脐带血进入采血袋内；

边采集脐血边轻轻摇晃采血袋，使得脐带血与抗凝剂充分混合；

当脐静脉塌陷、变白或者采集袋中的脐带血停止流入时即可终止采集脐带血；

采集的脐带血置于室温，24小时内经专门的样本运输盒及转运车转运至GMP生产车间进行分离和培养。

2.脐带血单个核细胞的制备

脐带血运输到生产车间外时，清洁外包装，置于传递窗，并从传递窗转移至车间内；

擦拭外表面后，置于生物安全柜中，

将所采集的脐带血与无菌生理盐水1：1混合稀释后，缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管中(混合物：分离液＝2：1)，600g离心30分钟后，轻轻将白膜层吸出，并转移至一新的离心管中，加入生理盐水重悬后，300g离心8分钟，得到的沉淀即为脐带血单个核细胞。

3.γδT细胞的富集

先用磁珠分选液a重悬收集到的单个核细胞，重选的密度为1×10⁷个细胞/40ul分选液，然后加入γδTCR抗体，与磁珠分选液的体积比为1：4，4℃孵育10min，再加入磁珠分选缓冲液b和磁珠抗体，体积比为b:a＝3:4，磁珠抗体与a体积比为1：2；过阳性分选柱(德国美天旎公司)分离γδTCR+T细胞，PBS清洗柱子3次，300g，5min离心后，弃上清，收集得到的即为γδT细胞。

得到γδT细胞重悬于含有唑来膦酸及IL-2的1640培养基中(含HSA)，密度调至2×10⁶/ml，并加入用OKT3抗体包被的培养瓶内，置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养。

4.慢病毒转导

激活2天后，进行慢病毒转导。

本发明所用的car皆采用二代Car的结构，即胞外为肿瘤抗原的抗体ScFv片段，连接和跨膜区采用CD8的序列，胞内区采用CD137及CD3ζ序列，构建到FUW慢病毒载体骨架中，然后用293T包装病毒，最后根据包装的慢病毒的滴度，用MOI为2-5的比例将慢病毒载体与细胞混合，再用培养基调节细胞密度至1×10⁶/ml，置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养。

5.Cas9-sgRNA基因电转

继续培养两天后，进行Cas9-sgRNA基因电转。

将所需电转的细胞置于离心管内，300g,5min离心后，DPBS洗涤2次，然后用opti-mem重悬至细胞密度为1-3×10⁸/ml，根据细胞的密度计算所需的cas9/sgRNA的量，各30ug/ml。取所需的Cas9与sgRNA，并按一比一混合，室温孵育10min后用加入到电转缓冲液中与细胞混合后加入到电极杯中，用4D-Nucleofector System N(Lonza)电转系统，选择ProgramEO-115程序进行电转。电转结束后，用已经预热的培养基重悬细胞密度至1-2×10⁶/ml，并转移至相应的培养皿中，并置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养。

6.细胞收集与冻存

培养到Day9-14天的细胞，收集至离心管中，用EasySep PE selection kit(Stemcell Technologies)进行富集β2M阴性的γδT细胞，弃磁珠后，进行300g，8min离心，弃上清，用生理盐水洗涤2遍后，用临床级细胞冻存液重悬，灌装至冻存袋并封口后，置于程序降温仪内，并选择免疫细胞冻存程序进行冻存，待细胞温度达到-90℃时，程序结束并转移至液氮冰箱长期保存。

实施例1 CAR19的结构设计

本发明的CAR19结构：使用二代CD19CARs，包含来自FMC63的scFv，来自CD28的铰链和跨膜区，胞内段是CD28和CD3ζ，示意图如图1所示。

该CAR19的DNA序列如下(SEQ ID NO.:1)：

该CAR19的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.:2)：

实施例2慢病毒载体的构建

将CD19CAR克隆至FUW慢病毒载体骨架中，置于EF1α的启动子下，形成Fuw-EF1α-CD19CAR；将Fuw-EF1α-CD19CAR，pMD2.G和psPAX2(addgene)三个质粒使用Lipofectamine2000转入293T(ATCC，CRL-3216)中制备慢病毒表达载体，在第二天和第三天收集病毒上清，超离进行浓缩(Merck Millipore)后获得病毒。

实施例3 CRISPR-Cas9系统的构建

首先在http://crispr.mit.edu网站上选择靶向β2M的保守区第一个外显子的sgRNA序列，选择评分在80以上两个sgRNA序列，敲除效率较高，序列如下：

β2M-gRNA:TATAAGTGGAGGCGTCGCGCTGG(SEQ ID NO.:3)

β2M-gRNA:GAGTAGCGCGAGCACAGCTAAGG(SEQ ID NO.:4)

在设计sgRNA引物时，正向引物含有20bp的目标序列及前面加入T7启动子，20bp互补的序列作为反向引物，以pX330质粒作为模板进行PCR，T7-PCR产物纯化后，并用做MEGAshortscript T7 kit的模板得到的RNA用MEGAclear柱进行纯化并用无RNA水进行洗脱。即得到靶向β2M的RNA序列。

本实施例所用的Cas9质粒购自Addgene.

同时使用Surveyor assay和TIDE来分析所设计的sgRNA敲除效率。

结果表明，同时用两种sgRNA敲除效率高于单用一种sgRNA。本发明最终选择同时电转两种sgRNA和Cas9质粒。敲除效率可达60％以上。

实施例4 CAR19-β 2M^-/-γδT细胞

培养γδT所用培养基为1640+1％HSA+唑来膦酸(5μM)+IL(300IU/ml)+1％Glutamine。

获得脐带血来源的PBMC后，先进行磁珠分选，用TCRγ/δ+T细胞分离试剂盒(目录号130-092-892，Miltenyi Biotec)先用磁珠分选液a重悬收集到的单个核细胞，重悬的密度为1×10⁷个细胞/40ul分选液，然后加入γδTCR抗体，与磁珠分选液的体积比为1：4，4℃孵育10min，再加入磁珠分选缓冲液b和磁珠抗体，体积比为b:a＝3:4，磁珠抗体与a体积比为1：2；过LS分选柱分离γδTCR+T细胞，PBS清洗柱子3次，300g，5min离心后，弃上清，收集得到的即为γδT细胞，收集效率可达90％以上。

得到的γδT细胞用培养基重悬到2×10⁶/ml，转移至包被有OKT3抗体(50ng/ml)的培养瓶内，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。培养2天后收集细胞，离心后用培养基将活化细胞密度重悬到2×10⁶/ml，按照MOI＝4进行添加病毒载体的量，然后再将总的细胞密度调至2×10⁶/ml，接种到相应的培养瓶中，过夜后，收集全部细胞至离心管中，300g，8min离心，弃上清后用培养基重悬到2×10⁶/ml，继续培养1天，进行sgRNA，Cas9电转。

将所有细胞置于离心管内，300g,5min离心后，DPBS洗涤2次，然后用opti-mem重悬至细胞密度为1-3×10⁸/ml，根据细胞的密度计算所需的cas9/sgRNA的量，各30ug/ml。取所需的Cas9与sgRNA，并按一比一混合，室温孵育10min后加入到电转缓冲液中与细胞混合后加入到电极杯中，用4D-Nucleofector System N(Lonza)电转系统，选择Program EO-115程序进行电转。

电转结束后，用已经预热的培养基重悬细胞密度至1-2×10⁶/ml，转移至培养瓶中，并置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养。培养两天后，转移至G-Rex培养瓶内，每两天补充IL-2因子，持续培养至Day14天，收集至离心管中，用EasySep PE selection kit(Stemcell Technologies)进行富集β2M阴性的γδT细胞，弃磁珠后，进行300g，8min离心，弃上清，用生理盐水洗涤2遍后，用临床级细胞冻存液重悬，灌装至冻存袋并封口后，置于程序降温仪内，并选择免疫细胞冻存程序进行冻存，待细胞温度达到-90℃时，程序结束并转移至液氮冰箱长期保存。

结果显示，此次培养能够让Vγ9Vδ2T细胞数量在短时间(14天)内扩增100-1000倍以达到临床使用量。

实施例5流式检测

细胞收集后，在4℃下，在FACS缓冲液(磷酸盐缓冲液，2％FBS，0.1％叠氮化钠)进行染色，染色前和染色之间用FACS缓冲液进行洗涤两次，持续30min。在4℃下用BDCYTOF1X/CYTOPERM^TM(BDBIOSciences)固定20min后进行胞内染色。在4℃下在Perm/Wash缓冲液、10％AB血清中进行胞内染色，持续30min，分别按1：20、1：33以及1：40稀释倍数使用FITC、PE、PerCP/Cy5.5以及APC抗体。在FACSCalibur^TM(BDBIOSciences)上采集样品并用FlowJo软件进行分析。

结果显示，细胞的Car阳性率高于50％，β2M阴性的γδT细胞比例大于99％。

所用抗体如下表格：

实施例6IFN-r的释放

将表达car19的正常γδT细胞和CAR19-β2M^-/-γδT与Raji(Burkitt’s lymphomacell line，ATCC-CCL86)细胞1：1混合，置于RPMI培养基中，密度调制1×10⁶/ml，各100ul，置于96孔板中，共培养过夜，收集上清，离心后取上清检测IFN-r的释放。采用Elisa试剂盒(BDBIOSciences，CAT：550612)进行检测。

结果显示，β2M敲除的Car19γδT与正常的Car19γδT的IFN-r释放量无显著差异，表明β2M基因敲除后并不影响Car19γδT细胞的作用。

实施例7基于流式的细胞毒性实验

用1μM Celltrace Violet(ThermoFisher Scientific)标记靶细胞，于37℃标记25min，加入10ml完全培养基终止标记，并用完全培养基清洗数次；Violet标记的靶细胞与效应细胞Raji按不同比例共培养4小时。加入FITC-AnnexinV and 7-AAD标记死亡靶细胞比例。

结果显示，β2M敲除的Car19γδT与正常的Car19γδT的细胞毒作用无显著差异。

实施例8体内药效实验

选取6-12周大的NOD-Prkdcscid Il2rgnull(NPG)小鼠，腹腔注射2×10⁵Raji-ffluc细胞，50μL DPBS和50μL matrigel matrix(Corning)。两天后检测肿瘤移植物的负荷，分成肿瘤负荷相当的3组，分组后一天分别注射200uL DPBS/mouse，5×10⁶γδT cells/mouse，5×10⁶CD19CAR-γδT cells/mouse，5×10⁶β2M敲除CD19CAR-γδT cells/mouse，CAR-T处理后七天评估小鼠肿瘤负荷，腹腔注射3mg d-luciferin per mice反应四分钟，使用Xenogen IVIS Imaging System拍照，曝光30s。

结果表明，相比对照组，β2M敲除的Car19γδT与正常的Car19γδT组小鼠肿瘤负荷都显著下降，且二者之间作用效果无显著差异。并且，β2M敲除的Car19γδT在体内存活时间较长。表明β2M敲除的Car19γδT与正常的Car19γδT的细胞抗肿瘤效果相近。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 亘喜生物科技（上海）有限公司

<120> 一种脐带血来源的嵌合抗原受体T细胞

<130> P2017-1514

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120

gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180

aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240

ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300

gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360

ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420

ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480

ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540

gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600

agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660

tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720

tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780

acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1080

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1140

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa 1470

<210> 2

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu

260 265 270

Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr

275 280 285

Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

290 295 300

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

305 310 315 320

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

325 330 335

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

340 345 350

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

355 360 365

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tataagtgga ggcgtcgcgc tgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagtagcgcg agcacagcta agg 23

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，其特征在于，所述CAR-T细胞具有以下特征：

(a)所述CAR-T细胞为来源脐带血的γδT细胞；

(b)所述CAR-T细胞表达嵌合抗原受体CAR，所述CAR靶向肿瘤细胞的标志物；和

(c)所述CAR-T细胞的HLA-I基因表达是被沉默的。

2.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的CAR-T细胞的β2M基因表达是被沉默的，从而使得HLA-I基因表达被沉默。

3.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述“β2M基因表达是被沉默的”指β2M基因不表达或低表达，较佳地，所述的“低表达”指所述T细胞β2M基因的表达量G1与正常T细胞β2M基因的表达量G0的比值，即G1/G0≤0.5，较佳地G1/G0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。

4.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的CAR的结构如下式I所示：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

scFv为抗原结合结构域；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

5.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR的序列如SEQ ID NO.:2所示。

6.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的CAR-T细胞用于异体肿瘤治疗。

7.一种制备权利要求1所述的CAR-T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A)提供一待改造的T细胞；和

(B)对所述的T细胞进行改造，从而使得所述的T细胞表达所述的CAR，并沉默所述T细胞的HLA-I基因，从而获得权利要求1所述的CAR-T细胞。

8.一种制剂，所述制剂含有权利要求1所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

9.一种权利要求1所述的CAR-T细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

10.一种用于制备权利要求1所述的CAR-T细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒；

(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于沉默β2M基因的第二表达盒或sgRNA。