CN113005094A

CN113005094A - 通用型嵌合抗原受体修饰的t细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113005094A
Application number: CN202110279010.3A
Authority: CN
Inventors: 经纬; 樊克兴; 金钢
Original assignee: First Affiliated Hospital of Naval Military Medical University of PLA
Current assignee: First Affiliated Hospital of Naval Military Medical University of PLA
Priority date: 2021-03-16
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2021-06-22

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞及其制备方法和应用。通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞，其中，所述T细胞来源于人或动物的脐血。本发明提供的通用型CAR‑T可以使得细胞疗法的适用性扩展到一类人群，而不仅仅局限于单个个体，从而能够实现工业化大规模生产。

Description

通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

近十余年来，随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，肿瘤免疫治疗逐步发展成为国际公认的肿瘤综合治疗第四大模式。美国《科学》杂志更是将肿瘤免疫治疗列位2013年度突破性研究进展第一位，认为其是肿瘤治疗的重大转折点。其中，具有高效特异性、杀伤活性和持久性的嵌合抗原受体修饰的T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cells，CAR-T)疗法受到广泛关注，成为目前最前沿、最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。

CAR-T细胞治疗是将人工改造的外源性嵌合抗原受体基因导入T细胞内进行基因修饰后，经过纯化、体外规模化扩增和活化，回输给患者进行治疗的方法。CAR-T细胞疗法通过外源基因转染技术，把识别肿瘤相关抗原的单链抗体(Single chain fragmentvariable，scFv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，使可以特异识别肿瘤相关抗原的scFv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达CAR的T细胞以抗原依赖、但非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。目前，CAR-T细胞疗法在血液肿瘤的治疗中取得了良好的疗效，在实体瘤的治疗方面仍处于研究阶段。且目前采用的方法多是自体过继细胞治疗(autologous adoptive cell transfer，ACT)，这种方法昂贵并且耗时。对于一部分患者，很难获得足量且状态良好的淋巴细胞用于CAR-T细胞治疗。因此，如果制备通用型的CAR-T可能使得细胞疗法的适用性扩展到一类人群，而不仅仅局限于单个个体，从而能够实现工业化大规模生产。

脐带血是胎儿娩出后残留在脐带和胎盘中的血液。脐带血中淋巴细胞相对不成熟，抗原性较弱。研究表明，脐带血来源的T细胞仅能产生少量的细胞因子，且生物活性较低；与成人外周血T细胞相比，脐带血T细胞产生IL-2水平低于成人外周血，IL-2是活化T细胞分泌的细胞因子，脐带血中低水平的IL-2使其介导的T细胞活化效应降低，依赖淋巴细胞的免疫排斥反应也随之减轻。另外脐带血是废弃的血源，对供体没有负担，来源广泛，易于收集和保存；将有望成为通用型肿瘤治疗产品。

通过从脐带血中提取T细胞进行CAR修饰，获得通用型CAR-T，目前尚未有研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)。

本发明的再一目的在于提供上述CAR-T细胞的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述CAR-T细胞的应用。

根据本发明具体实施方式的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞，所述T细胞来源于人或动物的脐血。

根据本发明具体实施方式的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞，所述T细胞通过对人或动物的脐血进行梯度密度离心、流式分选或免疫磁珠分选方法分离得到。

根据本发明具体实施方式的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、间皮素(mesothelin)scFv、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、4-1BB胞内信号区和免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ依次拼接构成。

根据本发明具体实施方式的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MALPVTALLLPLALLLHAARPEIQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGFNIEDYYIHWVRQMPGKGLEWMGRIDPENDETKYGPIFQGHVTISADTSINTVYLQWSSLKASDTAMYYCAFRGGVYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQKPGQPPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGTHFPGTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

编码所述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAGATTCAGCTCGTGCAATCGGGAGCGGAAGTCAAGAAGCCAGGAGAGTCCTTGCGGATCTCATGCAAGGGTAGCGGCTTTAACATCGAGGATTACTACATCCACTGGGTGAGGCAGATGCCGGGGAAGGGACTCGAATGGATGGGACGGATCGACCCAGAAAACGACGAAACTAAGTACGGTCCGATCTTCCAAGGCCATGTGACTATTAGCGCCGATACTTCAATCAATACCGTGTATCTGCAATGGTCCTCATTGAAAGCCTCAGATACCGCGATGTACTACTGTGCTTTCAGAGGAGGGGTCTACTGGGGACAGGGAACTACCGTGACTGTCTCGTCCGGCGGAGGCGGGTCAGGAGGTGGCGGCAGCGGAGGAGGAGGGTCCGGCGGAGGTGGGTCCGACGTCGTGATGACCCAGAGCCCTGACAGCCTGGCAGTGAGCCTGGGCGAAAGAGCTACCATTAACTGCAAATCGTCGCAGAGCCTGCTGGACTCGGACGGAAAAACGTACCTCAATTGGCTGCAGCAAAAGCCTGGCCAGCCACCGAAGCGCCTTATCTCACTGGTGTCGAAGCTGGATTCGGGAGTGCCCGATCGCTTCTCCGGCTCGGGATCGGGTACTGACTTCACCCTCACTATCTCCTCGCTTCAAGCAGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCTGGCAGGGAACCCACTTTCCGGGAACCTTCGGCGGAGGGACGAAAGTGGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTGA

其中，人CD8α信号肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC

Linker区(Gly4-Ser)3的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：

GGCGGAGGCGGGTCAGGAGGTGGCGGCAGCGGAGGAGGAGGGTCCGGCGGAGGTGGGTCC

人CD8α铰链区(CD8αHinge)的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：

ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT

人CD8α跨膜区(CD8αTM)的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：

ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT

4-1BB胞内信号区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：

AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG

免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：

CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG

间皮素(mesothelin)抗体轻链可变区(Mesoscfv-VL)的基因的核苷酸序列如SEQID NO.9所示：

GATATTGAACTCACACAGTCTCCCGCTATCATGTCTGCTTCTCCCGGCGAGAAAGTGACTATGACTTGCTCTGCTTCCTCTTCTGTGTCCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAATCTGGCACATCCCCTAAACGGTGGATCTACGATACTAGCAAACTGGCATCCGGCGTGCCTGGGCGATTCTCTGGCTCTGGCTCTGGCAACTCTTACTCTCTCACAATCTCATCTGTCGAGGCTGAGGACGATGCCACATACTACTGTCAGCAGTGGTCTAAACACCCACTCACATTCGGCGCTGGCACTAAACTGGAAATAAAAGCGGCC

间皮素(mesothelin)抗体重链可变区(Mesoscfv-VH)的基因的核苷酸序列如SEQID NO.10所示：

CAGGTCCAGCTCCAGCAGTCTGGCCCTGAACTCGAAAAACCTGGCGCTAGCGTGAAAATTTCCTGTAAAGCCTCCGGCTACTCTTTTACTGGCTACACAATGAATTGGGTGAAACAGTCTCACGGCAAATCCCTCGAATGGATCGGACTCATCACACCCTACAATGGCGCCTCTTCCTACAACCAGAAATTCCGGGGCAAGGCAACACTCACTGTGGACAAATCATCCTCTACCGCCTACATGGATCTGCTCTCCCTCACATCTGAGGACTCCGCTGTCTACTTTTGTGCCCGAGGAGGATACGACGGACGAGGATTCGATTACTGGGGACAGGGAACAACTGTGACCGTGTCTAGT

根据本发明的具体实施方式的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)构建含编码嵌合抗原受体基因的慢病毒表达载体；

(2)制备病毒溶液；

(3)用病毒溶液转染脐血来源的T细胞，得到通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞。

优选的，嵌合抗原受体为Meso-CAR；

优选的，表达载体为慢病毒载体pCDH-Meso-CAR。

根据本发明的具体实施方式的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，所述脐血来源的T细胞由包括以下步骤的方法制备得到：

(a)将脐带血和等体积的淋巴细胞分离液混合，进行离心分离，得到单个核细胞；

(b)对单个核细胞进行分选，以获得T细胞；

(c)在培养袋中对分离得到的T细胞进行诱导培养，得到脐血来源的T细胞。

更进一步的，本发明提供一种CAR-T细胞的制备方法，用于全封闭的CAR-T细胞制备设备，其包括：1)将脐带血和等体积的淋巴细胞分离液加入分离培养罐中进行离心分离以获得单个核细胞；2)对上述单个核细胞进行分选以获得T细胞；3)在培养袋中对T细胞进行诱导培养；4)将带有目的基因的载体和经过诱导培养的T细胞按照预设比例混合后进行基因转导；5)在培养袋内对经基因转导的T细胞进行扩增培养；6)获得CAR-T细胞终产品，进行包装。

上述CAR-T细胞的制备方法中，利用分离培养罐制备CAR-T细胞，相比于现有技术中利用培养皿体外培养CAR-T细胞的方式，其步骤规范，更便于实现CAR-T细胞的大规模生产。

根据本发明具体是否方式的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，步骤(a)中，将脐带血和等体积的淋巴细胞以800G离心力，转动15min-30min。

优选的，步骤(b)包括：对离心分离获得的单个核细胞进行洗涤；加入带有T细胞对应标志物抗体的磁珠，以对所述单个核细胞进行孵育；

优选的，步骤(c)包括：向细胞培养体系中加入所述T细胞所需的诱导培养基和细胞因子。用含有300IU/mL的IL-2、50ng/mL的OKT-3和5％人AB血清(购自Invitrogen公司)的AIM-V培养基(购自Invitrogen公司)诱导培养得到T淋巴细胞。

本发明的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备抗癌药物和/或预防癌症药物中的应用。所述癌症是间皮素阳性的间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、肺癌、胆管癌和乳腺癌；优选胰腺癌。

本发明的有益效果：

本发明提供了所述的工程化CAR-T细胞特异性表达CAR，低表达MHC分子，因此采用该通用型CAR-T可以使得细胞疗法的适用性扩展到一类人群，而不仅仅局限于单个个体，从而能够实现工业化大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明所使用的嵌合抗原受体Meso-CAR的结构示意图；

图2显示pCDH-Meso-CAR慢病毒表达载体质粒信息图；

图3显示脐带血来源的Meso-CAR-T细胞MHC限制性测定结果；

图4显示体外情况下，本发明的Meso-CAR-T细胞杀伤Mesothelin⁺A431细胞(人间皮素过表达的A431细胞)的效果，其中，A为体外培养的T细胞；B为转导慢病毒空载体的T细胞；C为Meso-CAR-T细胞；

图5显示Mesothelin⁺A431肿瘤模型中小鼠肿瘤体积变化，其中，A为注射PBS对照；B为注射体外培养的T细胞；C为注射转导慢病毒空载体的T细胞；D为注射Meso-CAR-T细胞；

图6显示Mesothelin⁺A431肿瘤模型中小鼠生存曲线图，其中，A为注射PBS对照；B为注射体外培养的T细胞；C为注射转导慢病毒空载体的T细胞；D为注射Meso-CAR-T细胞。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1构建Meso-CAR表达质粒

1.1全基因合成

合成完整的Meso-CAR序列，并分别在其5’端添加Xba I酶切位点，3’端添加EcoR I酶切位点。

Meso-CAR结构如图1所示，其包括人CD8α信号肽基因、Linker区(Gly4-Ser)3、人CD8α铰链区(CD8αHinge)、人CD8α跨膜区(CD8αTM)、4-1BB胞内信号区、免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ序列，结合Meso抗体轻链可变区(Mesoscfv-VL)、Meso抗体重链可变区(Mesoscfv-VH)。

1.2克隆Meso-CAR到慢病毒表达载体

将pCDH-EF1α-GFP载体及Meso-CAR片段分别用Xba I/EcoR I酶切，分别回收8192b、1477bp片段。使用T4 DNA连接酶连接酶切后的pCDH-EF1α-GFP载体与Meso-CAR，用连接产物转化Trans1-T1感受态，过夜培养，挑取单克隆培养，提取质粒并测序，获得pCDH-Meso-CAR质粒。慢病毒表达载体的信息如图2所示。

实施例2慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

2.1包装慢病毒

细胞处理：转染前24h收集处于对数生长期的第3-10代293T细胞，将293T细胞接种于10cm细胞培养皿中，接种量为1×10^7，细胞在含有10ml 10％FBS的DMEM培养基中生长，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养18小时，细胞密度达到60-80％即可进行转染。

向293T细胞中共转染慢病毒载体质粒(pCDH-Meso-CAR)及其包装质粒(pLP1，pLP2，pLP/VSVG)；

转染后24小时，于荧光显微镜下观察293T细胞转染后GFP荧光表达情况。分别于转染后48小时、72小时收集293T培养上清中，3000rpm离心15分钟，分别收集细胞及上清，反复冻融三次裂解细胞，离心收集上清；

用0.45μm滤器过滤病毒上清，分别获得pCDH-Meso-CAR病毒溶液。

2.2慢病毒的浓缩及病毒滴度测定

分别收集细胞及培养上清，使用PEG6000浓缩病毒，向病毒溶液中加入1/4体积的PEG6000/NaCl溶液(25％PEG6000+4.4％NaCl)，混匀，4℃静置1小时；于4℃，5000rpm离心30分钟；弃上清，加入2mL病毒溶解液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，2mM MgCl₂，5％蔗糖)溶解慢病毒沉淀，并于-80℃储存。

测定病毒滴度。预先接种293T细胞至24孔板，10^5/孔，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养18小时；

溶解病毒，准备从10^-2到10^-7的10倍稀释病毒样品；

去除细胞培养液，加入含有不同病毒量的细胞培养液，并在培养液中加入6ug/mL的聚凝胺(polybrene)，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养2小时；

去除细胞培养液，加入1％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养48小时；

去除细胞培养液，加入含2ug/mL嘌呤霉素、1％FBS的DMEM培养液，置于37℃,5％CO₂细胞培养箱培养72小时；

去除细胞培养液，加入结晶紫染色液，计数被染色克隆数，并计算病毒滴度。

将病毒稀释至10^7TU/mL，于-80℃储存。

实施例3制备CAR-T细胞

(1)将脐带血和等体积的淋巴细胞分离液混合，进行离心分离以获得单个核细胞；取10mL健康人的新鲜血液，用淋巴细胞分离液(购自Mediatech公司)分离外周血单核细胞。

(2)对所述单个核细胞进行分选，以获得T细胞；用CD3+T细胞分选试剂盒(购自Miltenyi Biotec公司)将CD3+T细胞从PBMC中分选出来；

(3)在所述培养袋中对所述T细胞进行诱导培养；用含有300IU/mL的IL-2、50ng/mL的OKT-3和5％人AB血清(购自Invitrogen公司)的AIM-V培养基(购自Invitrogen公司)诱导培养48h，得到T淋巴细胞。

(4)将带有目的基因的载体和经过诱导培养的T细胞按照预设比例混合后进行基因转导；从-80℃取出2mL病毒液，加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺(购自Sigma公司)，用该病毒液重悬1×10⁶个上述诱导培养的T淋巴细胞。

(5)对经基因转导的细胞进行扩增培养:将细胞悬液加入24孔板的1个孔中，1000g，32℃，离心1h。37℃，5％CO2培养箱内培养8h后，1000g，32℃，再次离心1h。吸弃1.4mL培养上清，加入1.4mL新鲜的含有300IU/mL的IL-2、50ng/mL的OKT-3和5％人AB血清的AIM-V培养基，继续培养。每2-3天检测一次细胞浓度，当细胞浓度达到2×10⁶个/mL时，1000g，32℃，离心1h。吸取1mL细胞悬液，加入另一个孔中，分别向两个孔中加入1mL新鲜的含有300IU/mL的IL-2和5％人AB血清的AIM-V培养基，继续扩大培养。如此反复，直至细胞扩增至足够的用量。

(5)获得CAR-T细胞终产品，进行包装。Meso-CAR-T培养14天左右，离心收集，细胞沉淀采用生理盐水重悬。

优选的，上述CAR-T细胞的制备方法中，所述步骤(1)中分离以800G离心力转动15min-30min。

优选的，上述CAR-T细胞的制备方法中，所述步骤(2)包括：

2.1对离心分离获得的单个核细胞进行洗涤；

2.2加入带有T细胞对应标志物抗体的磁珠以对所述单个核细胞进行孵育；

优选的，上述CAR-T细胞的制备方法中，所述步骤(3)为：向扩增培养体系中加入所述T细胞所需的诱导培养基和细胞因子。

实施例4检测CAR-T细胞MHC限制性

流式细胞术检测脐血来源meso-CAR-T细胞的MHC限制性，检测MHC-I/II分子的表达，具体如下；

收集少量培养14天的meso-CAR-T细，胞，2000rpm离心5min，PBS重悬细胞；向细胞中加入相应的流式抗体，4℃孵育15min；PBS洗涤2遍，上机检测。

结果如图3所示，本发明的脐带血来源的CAR-T细胞相较于正常成人外周血T细胞其MHC-II和I类分子的表达水平明显低下,脐带血来源的CAR-T细胞表面的MHC-II分子表达水平为9.1％,I类分子的表达水平为15.6％。

实施例5测定CAR-T细胞杀伤肿瘤活性

5.1测定CAR-T细胞体外杀伤肿瘤活性

将Meso-CAR-T细胞、慢病毒空载体转导的T细胞及未修饰的T细胞分别Meso⁺A431细胞按不同比例混合培养48小时；使用CCK-8检测杀伤肿瘤效果。

结果见图4所示，本发明的Meso-CAR-T细胞可以高效的杀伤Meso阳性细胞，在效靶比1:8的情况下，其杀伤效率达到95.2％,而慢病毒空载体转导的T细胞及未修饰的T细胞杀伤效率仅有38.4％。

本发明的Meso-CAR-T细胞可以高效的杀伤肿瘤阳性细胞，而未经改造的T细胞杀伤效率较差。

5.2体内实验检测CAR-T细胞杀伤肿瘤活性

将20只6-8周龄的NSG小鼠随机分为4组，分别在皮下植入5x10^5Meso⁺A431细胞，观察和测量肿瘤生长情况，直至肿瘤生长至1000mm³，分别通过尾静脉注射Meso-CAR-T细胞、慢病毒空载体转导的T细胞、未处理T细胞及PBS，观察并记录肿瘤体积的变化。

Meso-CAR-T细胞治疗Meso⁺A431肿瘤小鼠模型效果测定：用Meso-CAR-T细胞治疗后，观察和测量肿瘤的生长，并记录小鼠存活率。

结果如图5所示，在进行Meso-CAR-T治疗后，小鼠肿瘤得到明显抑制，随着时间延长，在给药后30天观察发现，Meso-CAR-T治疗组5只荷瘤小鼠的肿瘤完全消失；而使用其他T细胞治疗的小鼠随着时间延长肿瘤继续增长，未表现出明显的肿瘤杀伤效果。

如图6所示，Meso-CAR-T细胞治疗的小鼠在给药后40天内存活率100％，而PBS组在24天内全部死亡，其他两组荷瘤小鼠在32天内全部由于肿瘤体积过大而死亡或实施安乐死。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 中国人民解放军海军军医大学第一附属医院

<120> 通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞及其制备方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Gly Pro Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

85 90 95

Ile Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr

100 105 110

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile

165 170 175

Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

180 185 190

Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile

195 200 205

Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

225 230 235 240

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly

245 250 255

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 2

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

cccgagattc agctcgtgca atcgggagcg gaagtcaaga agccaggaga gtccttgcgg 120

atctcatgca agggtagcgg ctttaacatc gaggattact acatccactg ggtgaggcag 180

atgccgggga agggactcga atggatggga cggatcgacc cagaaaacga cgaaactaag 240

tacggtccga tcttccaagg ccatgtgact attagcgccg atacttcaat caataccgtg 300

tatctgcaat ggtcctcatt gaaagcctca gataccgcga tgtactactg tgctttcaga 360

ggaggggtct actggggaca gggaactacc gtgactgtct cgtccggcgg aggcgggtca 420

ggaggtggcg gcagcggagg aggagggtcc ggcggaggtg ggtccgacgt cgtgatgacc 480

cagagccctg acagcctggc agtgagcctg ggcgaaagag ctaccattaa ctgcaaatcg 540

tcgcagagcc tgctggactc ggacggaaaa acgtacctca attggctgca gcaaaagcct 600

ggccagccac cgaagcgcct tatctcactg gtgtcgaagc tggattcggg agtgcccgat 660

cgcttctccg gctcgggatc gggtactgac ttcaccctca ctatctcctc gcttcaagca 720

gaggacgtgg ccgtctacta ctgctggcag ggaacccact ttccgggaac cttcggcgga 780

gggacgaaag tggagatcaa gaccactacc ccagcaccga ggccacccac cccggctcct 840

accatcgcct cccagcctct gtccctgcgt ccggaggcat gtagacccgc agctggtggg 900

gccgtgcata cccggggtct tgacttcgcc tgcgatatct acatttgggc ccctctggct 960

ggtacttgcg gggtcctgct gctttcactc gtgatcactc tttactgtaa gcgcggtcgg 1020

aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag 1080

gaggacggct gttcatgccg gttcccagag gaggaggaag gcggctgcga actgcgcgtg 1140

aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc tacaagcagg ggcagaacca gctctacaac 1200

gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac 1260

ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag aatccccaag agggcctgta caacgagctc 1320

caaaaggata agatggcaga agcctatagc gagattggta tgaaagggga acgcagaaga 1380

ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac 1440

gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg tga 1473

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

ccc 63

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcggaggcg ggtcaggagg tggcggcagc ggaggaggag ggtccggcgg aggtgggtcc 60

<210> 5

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60

tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120

gacttcgcct gcgat 135

<210> 6

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60

actctttact gt 72

<210> 7

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60

actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120

gaactg 126

<210> 8

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60

tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120

cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180

gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240

agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300

tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336

<210> 9

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatattgaac tcacacagtc tcccgctatc atgtctgctt ctcccggcga gaaagtgact 60

atgacttgct ctgcttcctc ttctgtgtcc tacatgcact ggtaccagca gaaatctggc 120

acatccccta aacggtggat ctacgatact agcaaactgg catccggcgt gcctgggcga 180

ttctctggct ctggctctgg caactcttac tctctcacaa tctcatctgt cgaggctgag 240

gacgatgcca catactactg tcagcagtgg tctaaacacc cactcacatt cggcgctggc 300

actaaactgg aaataaaagc ggcc 324

<210> 10

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caggtccagc tccagcagtc tggccctgaa ctcgaaaaac ctggcgctag cgtgaaaatt 60

tcctgtaaag cctccggcta ctcttttact ggctacacaa tgaattgggt gaaacagtct 120

cacggcaaat ccctcgaatg gatcggactc atcacaccct acaatggcgc ctcttcctac 180

aaccagaaat tccggggcaa ggcaacactc actgtggaca aatcatcctc taccgcctac 240

atggatctgc tctccctcac atctgaggac tccgctgtct acttttgtgc ccgaggagga 300

tacgacggac gaggattcga ttactgggga cagggaacaa ctgtgaccgt gtctagt 357

Claims

1.通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于，所述T细胞来源于人或动物的脐血。

2.根据权利要求1所述的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于，所述T细胞通过对人或动物的脐血进行梯度密度离心、流式分选或免疫磁珠分选方法分离得到。

3.根据权利要求1所述的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、MesoscFv、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、4-1BB胞内信号区和免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ依次拼接构成。

4.根据权利要求1所述的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求1所述的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.权利要求1所述的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)构建含编码嵌合抗原受体基因的慢病毒表达载体；

(2)制备病毒溶液；

7.根据权利要求6所述的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，其特征在于，所述脐血来源的T细胞由包括以下步骤的方法制备得到：

(b)对单个核细胞进行分选，以获得T细胞；

(c)在培养袋中对分离得到的T细胞进行诱导培养，得到脐血来源的活化扩增的T细胞。

8.根据权利要求7所述的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，将脐带血和等体积的淋巴细胞以800G离心力，转动15min-30min。

9.权利要求1所述的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞的应用。

10.权利要求1所述的通用型嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备抗肿瘤药物和/或预防肿瘤药物中的应用。