KR20200101407A - Nk 세포 형질도입 방법 - Google Patents

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라피쥴 바리
마르쿠스 그란친
윙 렁
니나 뫼케르
폴커 후페르트
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밀테니 비오텍 비.브이. & 씨오. 케이지
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Abstract

본 발명은 생물학적 물질을 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자를 사용하여 활성화된 NK 세포로 전달하는 시험관내 방법으로서, a) NK 세포를 활성화시키는 단계, 및 b) 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자를 상기 활성화된 NK 세포에 첨가하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자는 조혈 세포막에 결합하고 융합함으로써 생물학적 물질을 상기 활성화된 NK 세포로 전달할 수 있는 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질을 포함하는 것인 방법을 개시한다. 우선적으로, NK 세포의 활성화는 IL-1 계열 시토카인을 NK 세포에 첨가함으로써 수행된다.

Description

NK 세포 형질도입 방법
본 발명은 일반적으로 생물학적 물질을 세포로 전달하는 분야, 특히 생물학적 물질을 활성화된 자연 살해 (NK) 세포로 전달하는 분야에 관한 것이다.
자연 살해 세포 (이하 "NK 세포"로도 약칭됨)는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포로도 공지된 악성의 퇴행된 세포를 검출하고 파괴할 수 있는 독특한 림프구 집단이다. 또한, NK 세포는 종양 세포와 접촉 시 시토카인을 생성하고 분비한다. 이러한 기능적 특질은 NK 세포를 암 치료를 위한 매력적인 약물로 만든다. 임상 시험은 NK 세포의 임상적 이용 가능성을 강조하였다 (Miller et al. 2005; Rubnitz et al. 2010; Childs & Berg 2013).
환자에 대한 공여 NK 세포의 사용 ("동종이형 사용")은 비-NK 세포, 예컨대 T 세포의 원하지 않는 반-지시 효과로부터 원하는 NK 세포 효과를 분리하기 위해 세포 분리법을 필요로 한다. 이들 방법은 잘 확립되어 있고 (Leung 2014), 폐쇄된 멸균 시스템 내에서 자동화될 수 있다 (Apel et al. 2013).
유전자 조작은, 예컨대 암 치료에서 다양한 임상적 영향을 갖는 NK 세포 특성을 추가로 변형하는 유망한 전략이다 (Childs & Carlsten 2015). 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포로의 임상 시험에서 나타난 바와 같이, 예컨대 CAR 발현 면역 세포의 사용은 암에 대한 유망한 치료 옵션이다. CAR NK 세포는 CAR T 세포에 대한 좋은 대안일 수 있지만, 일차 NK 세포의 유전자 조작은 주요 기술적 도전을 나타낸다 (Klingemann 2014).
전기천공과 같은 형질감염 접근법은 효율적인 트랜스진 전달을 초래하지만, 트랜스진 발현이 일시적이다. 따라서, NK 세포의 형질감염은 지속적인 효과가 필요한 경우 임상적용에 사용될 수 없다. 또한, 형질감염은 또 다른 주요 단점을 나타내는 높은 세포 사멸률을 초래한다.
다른 한편으로, NK 세포의 바이러스 벡터 기반 형질도입은 지속적인 유전자 변형을 위한 옵션이다. NK 세포의 레트로바이러스 형질도입은 가능하지만 높은 바이러스 역가가 필요한 반면, 효율은 여전히 낮다 (Suerth et al. 2015). 더욱 중요한 것은, 레트로바이러스 벡터의 삽입 돌연변이유발로 인해, 레트로바이러스 접근법의 임상적 사용은 임상 연구에서 나타난 유전자독성 효과과 함께 중대한 안전성 우려가 있다 (Aiuti & Roncarolo 2009; Aiuti et al. 2009).
그러나, 레트로바이러스 벡터 그룹 내에서, 렌티바이러스 벡터는 유전자독성이 적고 임상 적용을 위한 보다 안전한 옵션을 나타낸다 (Montini et al. 2009; Papayannakos & Daniel 2013). 불행하게도, 상이한 시토카인 조합으로 자극하고 높은 렌티바이러스 벡터 역가를 사용한 후에도, 약 10%의 NK 세포만이 형질도입될 수 있으며, 이는 NK 세포 항-바이러스 방어 메커니즘에 의해 설명될 수 있다 (Sutlu et al. 2012). TBK1/IKKe 복합체의 억제제인 프로타민 술페이트 및 BX795와 함께 높은 렌티바이러스 벡터 역가를 사용하여 이 형질도입 효율을 약 40%로 증가시킬 수 있다 (Sutlu et al. 2012). 그러나, TBK1은 유사분열에 필수적이며, BX795는 일반적으로 세포주기 정지를 유발하여 비-증식 세포를 초래하는 것으로 공지되어 있다 (Pillai et al. 2015; Bai et al. 2015). 따라서, 중요하고 바람직하지 않은 부작용은 BX795를 강력한 세포 증식을 포함하여 안정한 형질도입 및 적절한 NK 세포 기능성이 절박하게 요구되는 임상적 NK 세포 형질도입에 적합하지 않게 한다.
WO2013/045639A1에는, 변형된 개코 원숭이 (baboon) 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질로 슈도타이핑된 (pseudotyped) 바이러스 벡터를 사용하는 휴지 HSC 및 정지 T 및 B 세포의 형질도입 방법이 개시되어 있다.
결론적으로, 치료를 위해 임상적으로 적용될 수 있는 NK 세포의 효율적이고 지속적인 유전자 변형을 위한 방법 및/또는 바이러스 벡터 입자 시스템은 현재의 최첨단 기술로 충족되지 않는 긴급한 필요성을 나타낸다.
놀랍게도, 일차 인간 NK 세포는 활성화 후 NK 세포 항-바이러스 방어 메카니즘의 억제제에 대한 요구 없이도 본원에 개시된 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질로 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자를 사용하여 효율적으로 형질도입될 수 있는 반면, 정지 NK 세포는 이들 벡터 입자에 의해 효율적으로 형질도입될 수 없다는 것이 밝혀졌다. 형질도입은 낮은 레트로바이러스 벡터 입자 역가, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자 역가에서도 검출 가능하고, 90% 초과에 도달할 수 있으며, 이는 지금까지 보고된 다른 바이러스 벡터 입자로는 보지 못한 것이다. 낮은 벡터 입자 역가를 사용하면 선행 기술의 방법에 비해 실용성이 우수하다. 예컨대, 본원에 개시된 변형된 개코 원숭이 외피 단백질을 갖는 렌티바이러스 벡터 입자는 VSV-G 외피 단백질을 갖는 벡터 입자보다 훨씬 높은 형질도입 효율 (7-10배 더 높음)을 제공한다. 본원에 개시된 형질도입 방법은 세포 사멸을 유발하지 않거나 형질도입된 NK 세포에 다른 독성 효과를 나타내지 않는다. 또한, 상기 방법은 NK 세포 유사분열에 영향을 끼치지 않으므로, 형질도입된 NK 세포는 형질도입되지 않은 대응물과 동일한 수준에서 장기간에 걸쳐 고도로 증식한다. 종합하면, 바람직하지 않은 부작용의 부재 및 사용된 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자의 임상적 순응 특성은 본원에 개시된 방법을 치료 적용을 위한 NK 세포의 안정적인 유전자 변형에 독특하게 한다.
예상치 못하게, 인간 NK 세포의 활성화 및 본원에 개시된 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자의 사용은 높은 빈도의 형질도입된 NK 세포를 초래한다. 우선적으로, NK 세포는 가용성 형태 또는 표면-결합된 자극제 또는 피더 세포의 일부, 예컨대 막 입자를 포함하는 피더 세포에 의해 활성화된다. 더 우선적으로, NK 세포는 적어도 하나의 성장 인자, 예컨대 시토카인 또는 성장 인자, 예컨대 시토카인, 예컨대 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공통-감마쇄 시토카인 또는 IL-1알파, IL1베타, IL-18, IL-33, Il-36, IL37 및 IL38을 포함하지만 이에 제한되지 않는 IL-1 계열 시토카인의 조합에 의해 활성화된다. 더욱 놀랍게도, 형질도입 효율은 상이한 시토카인을 IL-1 계열 시토카인과 함께 조합함으로써, 예컨대 IL-2 및/또는 IL-15를 IL-1 계열 시토카인, 예컨대 IL-18, IL-33, 또는 IL-1베타와 함께 조합함으로써 증가될 수 있다. NK 세포를 활성화시키는 다른 널리 공지된 시토카인에 IL-1 계열 시토카인, 예컨대 IL-18, IL-33 또는 IL-1베타를 첨가하면 NK 세포의 단기간 활성화를 이끌어 선행 기술의 NK 활성화 방법, 즉 IL-1 계열 시토카인의 존재 없이 수행되는 방법의 이용보다 조기에 효율적으로 NK 세포의 형질도입을 가능하게 한다. 본원에 개시된 조건 하에서 본원에 개시된 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질 슈도타이핑된 바이러스 벡터 입자로 형질도입된 활성화된 NK 세포의 퍼센트가 매우 높을 뿐만 아니라 수 주 동안 트랜스진 발현의 감소 없이 안정하게 유지된다는 것은 놀라운 발견이다. 트랜스진 발현 지속기간은, 예컨대 2, 4, 6, 8주 이상에 걸쳐 유지될 수 있다. 생물학적 물질은 또한 바이러스 벡터 입자 대신 본원에 개시된 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질 슈도타이핑된 바이러스-유사 입자에 의해 활성화된 NK 세포로 전달될 수 있다.
더욱 놀랍게도, 이들 NK 세포의 활성화 및 형질도입 전, CX3CR1 음성 및 CX3CR1 양성 NK 세포를 포함하는 샘플로부터 CX3CR1 음성 NK 세포의 농축은, 본원에 개시된 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질 슈도타이핑된 바이러스 벡터 입자로의 우수한 증식 및 형질도입을 초래한다. CX3CR1 음성 NK 세포의 농축은 CX3CR1 음성 및 CX3CR1 양성 세포를 포함하는 NK 세포의 샘플 또는 집단으로부터 CX3CR1 양성 및 CX3CR1 음성 세포를 분리함으로써 달성될 수 있다.
본원에 개시된 활성화된 NK 세포의 형질도입 방법은 또한 우선적으로 GMP 조건 하의 폐쇄 시스템에서 자동화된 공정으로 완전히 실시될 수 있다.
도 1: BaEV 슈도타이핑된 벡터는 GFP의 발현에 의해 입증되는 바와 같이 NK 세포의 높은 형질도입을 허용하지만, NK 세포는 활성화될 필요가 있다.
도 2a: 실험에 사용된 CD3+ T 세포 및 CD3-/CD56+ NK 세포를 PBMC로부터 단리하여 매우 정제된 세포 집단을 수득하였다.
도 2b: VSV-G 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로의 T 세포의 형질도입은 효과가 있지만, NK 세포에 대해서는 높은 역가에서도 매우 비효율적이다.
도 2c: NK-92 세포주에 대한 VSV-G 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로의 형질도입은 일차 NK 세포에 대한 것과 유사하게 비효율적이지만, 놀랍게도 NK-92는 BaEV 슈도타이핑된 벡터로 효율적으로 형질도입될 수 있다.
도 2d: T 세포 및 활성화된 일차 NK 세포 둘 다는 개코 원숭이 외피 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로 매우 효율적으로 형질도입될 수 있다.
도 3a: 놀랍게도, IL-33을 사용한 NK 세포의 짧은 활성화는 IL-33이 없는 것보다 BaEV 슈도타이핑된 벡터를 사용한 NK 세포의 높은 형질도입률을 허용한다.
도 3b: BaEV 슈도타이핑된 벡터를 사용하는 것과 유사하게, IL-33을 사용한 NK 세포의 짧은 활성화는 VSV-G 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터가 사용되는 경우에도 NK 세포의 형질도입률을 증가시킨다.
도 4: IL-18을 이용한 NK 세포의 활성화는 IL-33과 유사한 방식으로 NK 세포의 형질도입률을 증가시켰다.
도 5: BaEV 슈도타이핑된 벡터로 형질도입된 활성화된 NK 세포는 형질도입되지 않은 NK 세포와 동일한 확장률을 나타내며, 이는 형질도입 자체가 세포 사멸을 유도하지 않으며 세포 증식에 영향을 끼치지 않는다는 것을 입증한다.
도 6: BaEV 슈도타이핑된 벡터로의 NK 세포의 형질도입 후 트랜스진 발현은 장기간 안정적이다.
도 7a: NK 세포의 활성화 및 BaEV 슈도타이핑의 이용은 매우 높은 형질도입률을 허용하여, 높은 CAR 발현을 갖는 NK 세포를 생성할 수 있게 한다.
도 7b: 상이한 표적 세포는 표면 마커 CD19에 대한 상이한 발현 프로파일을 나타내며, 이들은 CD19-CAR 발현 NK 세포의 기능 시험에 적합한 표적이 되게 한다.
도 7c: 형질도입 방법은 K562 세포의 사멸에 의해 입증되는 변화되지 않은 높은 세포독성 잠재력을 갖는 CD19-CAR 발현 NK 세포의 생성 및 CD19 양성 RS4;11 및 라지 (Raji) 세포의 사멸에 의해 입증되는 상당히 증가된 CD19-특이적 세포독성 활성을 허용한다.
도 8: 나이브 NK 세포 뿐만 아니라 활성화된 NK 세포를 웨스턴블롯 적용하여 개코 원숭이 외피 수용체 ASCT2의 발현을 점검하였다. 활성화된 NK 세포는 개코 원숭이 외피에 대한 수용체 ASCT2를 발현하였지만, 나이브 NK 세포는 그렇지 않았다.
도 9a: 세포 증식 및 형질도입 검정은 증식 NK 세포만이 개코 원숭이 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로 형질도입 가능하고 휴지 NK 세포는 그렇지 않다는 것을 나타내었다.
도 9b: NK 세포의 증식성이고 형질도입 가능한 서브세트는 CD56bright이다. 반대로, 비증식성이고 형질도입 가능하지 않은 NK 세포는 CD56dim이다.
도 10: NK 세포의 증식되고 형질도입된 서브세트, 증식성이나 비-형질도입된 서브세트 및 휴지 서브세트 사이의 몇몇 NK 세포 수용체의 비교는 휴지 NK 세포가 증식 NK 세포와 상당히 상이한 표현형을 갖는다는 것을 나타내었다. 증식 세포는 더 낮은 CD16 발현, 활성화 수용체 NKp30, NKp44 및 NKG2D의 더 높은 발현 뿐만 아니라 TRAIL 및 NKG2A의 더 높은 발현 경향과 함께 CD56이 더욱 밝았다.
도 11a-b: NK 세포의 증식 및 휴지 서브세트의 세포 표면 단백질의 마커 스크리닝. 5명의 공여자로부터의 NK 세포를 사용하여 유동 세포측정에 의해 371개의 표면 마커를 분석하였다. 휴지 NK 세포와의 직접적인 비교로부터, 증식성이고 GFP 양성인 NK 세포는 32개의 마커를 더 높은 수준으로 발현하고, 5개의 마커를 더 낮은 수준으로 발현하였다 (도 11a). 증식성이고 형질도입 가능한 NK 세포 서브세트에 대한 가장 명백한 마커는 CX3CR1 발현의 부재 및 TRAIL을 강하게 발현하는 세포의 높은 빈도였다 (도 11a 및 11b).
도 12a: 형질도입 및 배양 전에 MCAS 분류를 이용하여 CX3CR1 발현에 기초하여 상이한 NK 세포 서브세트를 분리하였다. 비분류 시, 공여자로부터 혈액 유래된 NK 세포 사이의 CX3CR1의 발현은 86%였고 CX3CR1neg NK 세포는 14%였다. 분류 후, CX3CR1neg NK 세포의 평균 빈도는 CX3CR1에 대한 농축에 의해 2%로 감소되었고, 다른 한편으로 마커에 대한 고갈은 91% CX3CR1neg NK 세포 집단의 농축을 초래하였다.
도 12b: 다르게 분류된 NK 세포 분획의 배양 직후, 우리는 증식에서 유의미한 차이를 관찰하였다. 분류되지 않은 NK 세포 서브세트, CX3CR1 농축 (CX3CR1 양성) NK 세포 서브세트 및 CX3CR1 고갈 (CX3CR1 음성) NK 세포 서브세트 사이의 NK 세포 증식 퍼센트는 각각 28, 11 및 81이었다.
도 12c: NK 세포의 CX3CR1neg 분획은 고도로 형질도입 가능하다. 분류된 NK 세포 분획의 형질도입 2일 후, 분류되지 않은 NK 세포 서브세트, CX3CR1enriched NK 세포 서브세트 및 CX3CR1depleted NK 세포 서브세트의 형질도입률은 각각 21%, 7% 및 69%였다.
도 13: BaEV-슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 및 IL-1 베타를 사용한 NK 세포의 렌티바이러스 형질도입 10일 후 키메라 항원 수용체 (CAR)의 발현.
한 측면에서, 본 발명은 생물학적 물질을 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자를 사용하여 활성화된 NK 세포로 전달하는 시험관내 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) NK 세포를 활성화시키는 단계, 및
b) 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자를 상기 활성화된 NK 세포에 첨가하는 단계,
를 포함하며,
여기서 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자는 조혈 세포막에 결합하여 융합할 수 있는 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질을 포함함으로써, 생물학적 물질을 상기 활성화된 NK 세포로 전달한다.
상기 방법에서, 상기 NK 세포는 인간 NK 세포이다.
상기 방법에서, 활성화될 상기 NK 세포는 NK 세포를 포함하는 샘플, 예컨대 전혈 샘플 또는 예컨대 버피 코트로부터 수득될 수 있는 말초혈액 단핵세포 (PBMC) 샘플에 존재한다.
상기 방법에서, 상기 NK 세포의 활성화 전에, NK 세포는 CX3CR1 양성 및 CX3CR1 음성 NK 세포를 포함하는 집단 또는 샘플로부터 CX3CR1 음성 NK 세포에 대해 농축될 수 있다.
CX3CR1 음성 NK 세포 또는 CX3CR1 음성 NK 세포 서브세트/서브집단의 상기 농축은 CX3CR1 양성 및 CX3CR1 음성 NK 세포를 포함하는 샘플 또는 집단으로부터 분리 공정에서 CX3CR1 음성 세포의 고갈에 의해 수행될 수 있으며, 여기서 고갈된 분획은, 예컨대 분리 방법, 예컨대 세포 분리 방법, 예컨대 MACS® (밀테니 바이오텍 게엠베하 (Miltenyi Biotec GmbH)) 또는 형광 활성화된 세포 분류, 예컨대 항-CX3CR1 항체 또는 그의 단편을 사용하는 유동 세포측정에 의한, CX3CR1 음성 세포를 포함하는 표적 분획이다.
CX3CR1 음성 NK 세포 서브집단 (또는 CX3CR1 음성 NK 세포)은 매우 높은 형질도입률을 달성하므로 본원에 개시된 방법으로 형질도입되는 것이 바람직하다 (실시예 9 참조).
상기 방법에서, 단계 a)에서 활성화될 상기 NK 세포는 CX3CR1 음성 NK 세포이다.
우선적으로, 상기 CX3CR1 음성 NK 세포는 본원에 개시된 방법에서 활성화에 사용되는 NK 세포를 포함하는 조성물에 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 CX3CR1 양성 NK 세포를 포함한다.
조혈 세포막에 결합하고 융합할 수 있는 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질을 포함하는 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스 유사 입자는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 에컨대 WO2013/045639A1에 개시되어 있다.
상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스 유사 입자에서, 조혈 세포막에 결합하고 융합할 수 있는 상기 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질은:
개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질의 막횡단 및 세포외 도메인과 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 외피 당단백질의 세포질 테일 도메인의 융합물을 포함하거나 이로 이루어진 키메라 외피 당단백질; 또는
세포질 테일 도메인에 융합 억제성 R 펩티드가 결여된 변형된 BaEV 외피 당단백질
일 수 있다.
상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스 유사 입자는 적어도:
개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질의 막횡단 및 세포외 도메인과 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 외피 당단백질의 세포질 테일 도메인의 융합물을 포함하거나 이로 이루어진 키메라 외피 당단백질; 또는
세포질 테일 도메인에 융합 억제성 R 펩티드가 결여된 변형된 BaEV 외피 당단백질
을 포함할 수 있다.
상기 방법에서, 상기 NK 세포의 상기 활성화는 상기 NK 세포에 적어도 하나의 시토카인 또는 피더 세포 또는 피더 세포의 막 입자를 첨가하거나 NK 세포 활성화 시약을 사용하여 달성될 수 있다. 종종, 2 내지 3일 후, NK 세포 활성화의 효과는 NK 세포 증식을 이끈다.
상기 방법에서, 상기 적어도 하나의 시토카인은 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공통-감마쇄 시토카인 또는 IL-1a (IL-1알파), IL1b (IL-1베타), IL-18, IL-33, Il-36, IL37 및 IL38을 포함하지만 이에 제한되지 않는 IL-1 계열 시토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 적어도 하나의 시토카인은 IL-2일 수 있다.
상기 적어도 하나의 시토카인은 IL-15일 수 있다.
상기 시토카인은 IL-2 및 IL15일 수 있다.
상기 방법에서, NK 세포를 활성화시키는 시토카인 또는 시토카인의 조합(IL-2 및/또는 IL-15)은 IL-1 계열 시토카인과 조합되어, IL-1 계열 시토카인 부재 하에서의 활성화와 비교하여 상기 NK 세포의 보다 조기의 활성화 ("단기간 활성화")를 초래한다.
상기 방법에서, 상기 NK 세포의 활성화는 NK 세포를 활성화시키는 적어도 하나의 시토카인을 포함하는 시토카인 및 IL-1 계열 시토카인의 조합을 첨가함으로써 달성되어, NK 세포의 단기간 활성화를 초래한다.
상기 방법에서, 상기 시토카인의 조합은 IL-2 및/또는 IL-15 및 IL-1 계열 시토카인이다. IL-1 계열 시토카인 (예컨대, IL-18 또는 IL-33)과 함께 NK 세포를 활성화시키는 하나 이상의 시토카인 (예컨대, IL-2 및/또는 IL-15)의 사용은, 예컨대 NK 세포의 활성화를 위한 배양 공정의 출발과 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자를 사용한 활성화된 NK 세포의 효율적인 형질도입을 허용하는 출발점 사이의 기간을 줄이는 단기간 활성화를 초래한다. 놀랍게도, IL-1 계열 시토카인 및 NK 세포를 활성화시키는 하나 이상의 시토카인 (예컨대, IL-2 및/또는 IL-15)의 조합 및 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자로의 형질도입은, 보다 긴 공정으로 활성화된, 즉 IL-1 계열 시토카인, 예컨대 IL-18, IL-33 또는 IL-1베타의 존재에 의해 유도된 단기간 활성화 과정으로부터 이익을 얻지 못한, NK 세포로의 레트로바이러스 벡터 입자의 형질도입과 비교하여, 더 높은 형질도입률을 초래한다.
상기 IL-1 계열 시토카인은 IL-1알파, IL-1베타, IL-1Ra, IL-18, IL-36Ra, IL-36알파, IL-37, IL-36베타, IL-36감마, IL-38 및 IL-33으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
우선적으로, 상기 IL-1 계열 시토카인은 IL-18, IL-33 또는 IL-1베타일 수 있다.
상기 방법에서, 상기 IL-1 계열 시토카인은 IL-18이고, 이로써 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간, 24시간 (1일), 28시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 (2일) 내의 단기간 활성화를 초래한다.
상기 방법에서, 상기 IL-1 계열 시토카인은 IL-33이고, 이로써 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간, 24시간 (1일), 28시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 (2일) 내의 단기간 활성화를 초래한다.
예컨대, NK 세포를 활성화시키는 것으로 공지된 다른 시토카인과 함께 세포 배양 시스템의 시작에서, IL-1 계열 시토카인, 예컨대 IL-18, IL-33 또는 IL-1베타를 NK 세포를 포함하는 배지에 첨가하면, 상기 IL-1 계열 시토카인의 첨가 후, 빠르면 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간, 24시간 (1일), 28시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 (2일)에 상기 NK 세포의 활성화를 초래한다. 따라서, 우선적으로 세포 배양 배지 중의 NK 세포에 대한 IL-1 계열 시토카인의 첨가는 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간, 24시간 (1일), 28시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 (2일) 이내에 NK 세포의 단기간 활성화를 초래한다.
상기 기재된 시토카인은 당업자에게 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 농도로 상기 NK 세포를 포함하는 세포 배양 배지에 제공될 수 있다.
상기 방법에서, 상기 NK 세포의 상기 활성화는 상기 NK 세포에 다른 시토카인 또는 피더 세포 또는 피더 세포의 막 입자 없이 하나의 IL-1 계열 시토카인의 첨가에 의해 또는 NK 세포 활성화 시약으로 달성될 수 있다.
상기 방법에서, 상기 NK 세포의 상기 활성화는 상기 NK 세포에 피더 세포 또는 피더 세포의 막 입자와 함께 하나의 IL-1 시토카인의 첨가에 의해 또는 NK 세포 활성화 시약으로 달성될 수 있다.
상기 방법에서, 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자에 의한 NK 세포의 형질도입 효율은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%이다.
상기 방법에서, 상기 NK 세포가 상기 레트로바이러스 벡터 입자로 형질도입되는 경우, 상기 생물학적 물질은 하나 이상의 핵산이다.
상기 방법에서, 상기 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자는 렌티바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자이다.
상기 방법에서, 상기 방법은 폐쇄 시스템에서 자동화된 공정으로 수행된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생체내에서 생물학적 물질을 활성화된 NK 세포로 전달함으로써 장애를 앓는 인간의 치료에 사용하기 위한, 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자를 제공하며, 여기서 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자는 조혈 세포막에 결합하고 융합할 수 있는 본 발명에 개시된 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질을 포함함으로써 생물학적 물질을 상기 활성화된 NK 세포로 전달한다.
상기 장애는 상기 NK 세포로 치료될 수 있는 또는 치료 가능한 장애일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 생체내에서 생물학적 물질을 활성화된 NK 세포에 전달함으로써 장애를 앓는 인간의 치료에 사용하기 위한 조합 조성물을 제공한다:
a) NK 세포를 활성화시키는 적어도 하나의 시토카인을 포함하는 제1 조성물, 및
b) 조혈 세포막에 결합하고 융합할 수 있는 본원에 개시된 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질을 포함하는 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물.
상기 장애는 상기 NK 세포로 치료될 수 있는 또는 치료 가능한 장애일 수 있다.
상기 조합 조성물에서, 상기 제1 조성물은 NK 세포를 활성화시키는 적어도 하나의 시토카인을 포함하는 시토카인 및 IL-1 계열 시토카인의 조합을 포함한다.
상기 조합 조성물에서, 상기 시토카인의 조합은 IL-2 및/또는 IL-15 및 IL-1 계열 시토카인을 포함한다.
상기 조합 조성물에서, 상기 IL-1 계열 시토카인은 IL-18, IL-33 또는 IL-1베타이다.
조작된 NK 세포를 제조하기 위한 상기 조합 조성물.
상기 조합 조성물에서, 상기 생물학적 물질은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 활성화된 NK 세포로 생물학적 물질을 전달하기 위한, 조혈 세포막에 결합하고 융합할 수 있는 본원에 개시된 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질을 포함하는 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자의 용도를 제공한다.
조작된 NK 세포를 제조하기 위한 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자의 상기 용도.
슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자의 상기 용도에서, 상기 생물학적 물질은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 수득 가능한 형질도입된 및/또는 조작된 NK 세포를 제공한다.
상기 조작된 NK 세포에서, 상기 NK 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 수득되는 조작된 NK 세포의 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 조성물에서, 상기 조작된 NK 세포는 키메라 항원 수용체를 발현한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 NK 세포를 활성화시키는 적어도 하나의 시토카인을 포함하는 NK 세포의 단기간 활성화를 위한 시토카인 및 IL-1 계열 시토카인의 조합물을 제공한다.
상기 시토카인의 조합물은 IL2 및/또는 IL-15 및 IL-1 계열 시토카인일 수 있다.
상기 IL-1 계열 시토카인은 IL-18, IL-33 또는 IL-1베타일 수 있다.
본 발명의 측면과 관련하여 본원에 정의된 모든 정의, 특징 및 실시양태, 예컨대 본 발명의 제1 측면은 또한 본원에 개시된 본 발명의 다른 측면의 맥락에서 준용된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
레트로비리대 (Retroviridae)는 단일-가닥이고 이배체이고 포지티브-센스 RNA 게놈을 갖는 바이러스 과로서, DNA 중간체로 역전사된 후 숙주 세포 게놈에 편입된다. 레트로비리대-유래된 바이러스는 직경이 80-120 nm인 외피보유 입자이다.
(레트로-/렌티-/감마레트로-) 바이러스 벡터는 상응하는 바이러스 과로부터 유래되는 복제-결핍된 바이러스 입자이다. 이들은 Gag 및 Pol 단백질, 단일-가닥 RNA 게놈을 함유하고 일반적으로 다른 바이러스로부터 유래되는 이종 외피 단백질로, 예컨대 본원에 개시된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질로 슈도타이핑된다. 상기 바이러스 벡터의 RNA 게놈은 바이러스 자손을 생산하기 위한 어떠한 바이러스 유전자도 함유하지 않지만, DNA에서 효율적인 패킹 및 역전사에 필요한 psi 요소 및 LTR을 함유한다. DNA 중간체는 적합한 프로모터, 예컨대 CMV 프로모터의 제어 하에 관심 유전자를 함유할 수 있고, 관심 유전자는 상기 DNA가 숙주 세포의 게놈으로 통합될 때 발현된다. 숙주 세포에 들어가고, RNA 게놈을 전달하고, 관심 유전자를 통합 및 발현하는 공정은 형질도입이라 불린다. 감마레트로바이러스 또는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터의 최소 요건은 당해 분야에 잘 설명되어 있다.
또한, 숙주 세포 게놈에서 레트로바이러스 벡터 게놈을 통합할 수 없는 인테그라제-결핍된 레트로바이러스 벡터 (ID-RV)가 개발되었다. ID-RV는 통상적인 레트로바이러스 벡터로부터 유래되지만 레트로바이러스 인테그라제를 함유하지 않거나 돌연변이된 형태를 함유한다. 숙주 세포로 진입시, 레트로바이러스 벡터 게놈은 세포질에서 역전사되어 핵으로 전달되지만 숙주 세포 게놈으로 안정적으로 통합되지는 않는다. ID-RV는 관심 유전자를 일시적으로 발현하는 데 유용한 도구이다. 레트로바이러스 벡터 및 형질도입의 정의는 또한 통합-결핍된 레트로바이러스 벡터 및 그의 적용을 확장시킨다.
렌티바이러스는 인간 및 다른 포유동물 종에서 긴 잠복 기간으로 특징지어지는 만성의 치명적인 질환을 일으키는 레트로비리대의 속이다. 가장 널리 공지된 렌티바이러스는 비분열 세포를 효율적으로 감염시킬 수 있는 인간 면역결핍 바이러스 HIV이므로, 렌티바이러스 유래된 레트로바이러스 벡터는 유전자 전달의 가장 효율적인 방법 중 하나이다.
감마레트로비리대 (Gammaretroviridae)는 레트로비리대 과의 속이다. 대표적인 종은 뮤린 백혈병 바이러스(murine leukemia virus) 및 고양이 백혈병 바이러스(feline leukemia virus)이다.
바이러스-유사 입자 (VLP)는 바이러스 입자와 유사하지만, 바이러스-유사 입자의 단백질을 코딩하는 바이러스 유전자 물질이 함유되어 있지 않기 때문에 감염 또는 형질도입되지 않는다. 특히, 레트로바이러스 벡터와 관련하여 VLP는 psi 양성 핵산 분자를 함유하지 않는다. 일부 바이러스-유사 입자는 그들의 게놈과 다른 핵산을 함유할 수 있다. 바이러스 구조 단백질, 예컨대 외피 또는 캡시드의 발현은 바이러스-유사 입자 (VLP)의 조립을 초래할 수 있다. 레트로바이러스 벡터와 같이, VLP도 레트로바이러스 벡터에 대한 것와 동일한 외피 구축물을 사용하여 슈도타이핑될 수 있다. VLP는 단백질 뿐만 아니라 핵산을 표적 세포의 세포질로 전달하는 데 사용될 수 있다. 특히, VLP는 백신으로 유용하다.
본원에 사용된 용어 "VLP 흡수"는 VLP가 표적 세포막에 결합함으로써 표적 세포로 핵산 분자, 단백질 또는 펩티드를 방출하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "활성화"는 표적 세포 기능, 증식 및/또는 분화를 증가시키는 세포로 생리학적 변화를 유도하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "슈도타이핑" 또는 "슈도타이핑된"은 외피를 갖는 다른 바이러스로부터 유래된 외피 당단백질을 보유하는 벡터 입자를 지칭한다. 따라서, 본 발명의 렌티바이러스 벡터 또는 벡터 입자의 숙주 범위는 당단백질에 의해 사용되는 세포 표면 수용체의 유형에 따라 확장되거나 변경될 수 있다.
레트로바이러스 벡터를 생성하기 위해, 벡터 입자를 조립하는 데 필요한 gag, pol 및 env 단백질이 패키징 세포주, 예컨대 HEK-293T를 통해 트랜스로 제공된다. 이는 일반적으로 gag, pol 및 env 유전자를 함유하는 하나 이상의 플라스미드로 패키징 세포주를 형질감염시킴으로써 달성된다. 슈도타이핑된 벡터의 생성을 위해, 원래 gag 및 pol 유전자 및 RNA 분자 또는 발현 벡터와 동일한 레트로바이러스로부터 유래된 env 유전자는 상이한 외피보유 바이러스의 외피 단백질(들)로 교환된다.
개코 원숭이 내인성 레트로바이러스(Baboon endogenous retrovirus) 또는 BaEV는 개코 원숭이 DNA에서 다수의 프로바이러스 카피로 존재하는 C형 레트로바이러스이다. WO2013045639A1에는 야생형 BaEV 외피 당단백질 (비-변형된 BaEV 외피 당단백질), 및 야생형 BaEV 당단백질보다 렌티바이러스 표면에 더 높은 수준으로 통합된 한정된 돌연변이 (변형)를 갖는 BaEV 외피 당단백질이 상세히 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "BaEV 외피 당단백질"은 BaEV 외피 당단백질의 야생형 형태, 또는 돌연변이 당단백질이 조혈 세포막에 결합하고 융합하는 야생형 당단백질의 능력을 유지하는 한, 상기 야생형 BaEV 외피 당단백질과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 상기 야생형 BaEV 외피 당단백질의 돌연변이체를 지칭한다.
바람직하게는, 야생형 BaEV 외피 당단백질은 서열번호 1의 서열로 이루어진다. 당업자에게 공지된 바와 같이, BaEV 외피 당단백질은 세포질 테일 도메인, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인으로 구성된다. 외피 당단백질 서열에서 세포질 테일 도메인, 막 관통 도메인 및 세포외 도메인에 상응하는 영역은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 세포질 테일 도메인은 야생형 BaEV 외피 당단백질의 아미노산 530 내지 564에 위치된다. 전형적으로, 막횡단 도메인은 야생형 BaEV 외피 당단백질의 아미노산 507 내지 529에 위치된다. 전형적으로, 세포외 도메인은 야생형 BaEV 외피 당단백질의 아미노산 1 내지 506에 위치된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, BaEV 외피 당단백질의 세포질 테일 도메인은 융합 억제성 R 펩티드가 결여된다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "융합 억제성 R 펩티드"는 티로신 세포내이입 신호 -YXXL- (서열번호 2)를 보유하는 외피 당단백질의 세포질 테일 도메인의 C-말단 부분을 지칭하고, 비리온 성숙 동안 바이러스 프로테아제에 의해 절단되어 외피 당단백질의 막 융합을 향상시킨다. BaEV 외피 당단백질의 융합 억제성 R 펩티드는 전형적으로 야생형 BaEV 외피 당단백질의 아미노산 547 내지 564에 위치된다.
따라서, 특히 바람직한 실시양태에서, 세포질 테일 도메인에 융합 억제성 R 펩티드가 결여된 변형된 BaEV 외피 당단백질은 아미노산 서열 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 특정 실시양태에서, BaEV 외피 당단백질의 세포질 테일 도메인은 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 외피 당단백질의 세포질 테일 도메인으로 대체된다.
뮤린 백혈병 바이러스 외피 당단백질은 바람직하게는 스트레인(strain) 4070A의 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "MLV 외피 당단백질"은 MLV 외피 당단백질의 야생형 형태, 또는 돌연변이 당단백질이 바이러스 코어 단백질, 특히 렌티바이러스 코어 단백질과 상호작용하는 야생형 외피 당단백질의 능력을 보유하는 한, 상기 야생형 MLV 외피 당단백질과 적어도 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 동일한 상기 MLV 외피 당단백질의 돌연변이체를 지칭한다.
외피 당단백질 서열에서 세포질 테일 도메인에 상응하는 영역은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, MLV 외피 당단백질의 세포질 테일 도메인은 야생형 MLV 외피 당단백질의 아미노산 622 내지 654에 위치된다.
따라서, 특히 바람직한 실시양태에서, BaEV 외피 당단백질의 막횡단 및 세포외 도메인 및 MLV 외피 당단백질의 세포질 테일 도메인의 융합물을 포함하거나 이로 이루어진 키메라 외피 당단백질은 아미노산 서열 서열번호 4를 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에서 의도된 표현 "생물학적 물질"은 세포의 구조 및/또는 기능을 변경시킬 수 있는 하나 이상의 화합물을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 생물학적 물질은 하나 이상의 핵산인 것이 바람직하며, 렌티바이러스 벡터 입자의 경우 벡터 입자의 게놈 내에 포함될 수 있다.
본원에서 의도된 "전달하는"은 표적 세포에 결합 시 생물학적 물질을 표적 세포의 막 또는 세포질에 초기에 운반하는 벡터 입자 또는 벡터-유사 입자의 능력에 관한 것이다. 여기서, 일반적으로 표적 세포는 NK 세포이다.
본원에 사용된 용어 "자연 살해 세포 (NK 세포)"는 종종 인간 NK 세포이고, 큰 과립 림프구 (LGL)로 정의되며, 일반적인 림프 전구세포-생성 B 및 T 림프구로부터 분화되는 3종류의 세포를 구성한다. NK 세포는 골수, 림프절, 비장, 편도선 및 흉선에서 분화되고 성숙하여 순환계로 진입하는 것으로 공지되어 있다. NK 세포는 표현형, 기원 및 각각의 이펙터 기능에 의해 자연 살해 T 세포 (NKT)와 다르고; 종종, NKT 세포 활성은 IFNγ를 분비함으로써 NK 세포 활성을 촉진시킨다. NKT 세포와 달리, NK 세포는 T-세포 항원 수용체 (TCR) 또는 pan T 마커 CD3 또는 표면 면역글로불린 (Ig) B 세포 수용체를 발현하지 않지만, 일반적으로 인간에서 표면 마커 CD16 (FcγRIII) 및 CD56을 발현하고, C57BL/6 마우스에서 NK1.1 또는 NK1.2를 발현한다. 인간 NK 세포의 최대 80%도 CD8을 발현한다. 지속적으로 성장하는 NK 세포주는 암 환자로부터 확립될 수 있고 일반적인 NK 세포주는, 예컨대 NK-92, NKL 및 YTS이다.
용어 "역가" 또는 "형질도입 효율"은 표적 세포를 형질도입시키는 능력과 관련하여 벡터 입자를 특성화하고 비교하는 수단으로서 사용된다. 따라서, "증가된 역가" 또는 "증가된 형질도입 효율"을 갖는 벡터 입자는 동일한 부피를 갖는 다른 벡터 입자보다 주어진 벡터 입자 부피에서 더 많은 수의 세포를 형질도입시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "활성화된 NK 세포"는 나이브(naive), 새로 단리된, 비-활성화된 NK 세포와 비교하여 자극 조건에 의한 세포의 변화를 지칭하며, 변화된 유전자 발현 프로파일 또는 변화된 세포 신호전달로 나타나 비-활성화된 NK 세포와 비교하여 상이한 세포 특성을 갖는 NK 세포를 초래한다. "활성화된 NK 세포"는, 예컨대 특정 표면 수용체, 예컨대 NKp44, NKG2D, DNAM-1 또는 TRAIL의 발현을 증가시키거나 시토카인 수용체의 발현을 변화시킬 수 있으며, 예컨대 CD25를 상향-조절할 수 있다. 활성화된 NK 세포는 그들의 세포 주기 단계를 G0의 휴지 세포에서 G1, S 또는 G2로 변화시킬 수 있고, 증식하거나 더 빠르게 증식을 시작할 수 있다.
용어 "CX3CR1 음성 NK 세포" 또는 "CX3CR1neg NK 세포" 또는 "CX3CR1- NK 세포" 또는 "CX3CR1 고갈된 NK 세포" 또는 "CX3CR1depleted NK 세포"는 그들의 세포 표면에서 마커 CX3CR1을 발현하지 않는 NK 세포 집단을 지칭한다.
프락탈카인(fractalkine) 수용체 또는 G-단백질 커플링된 수용체 13 (GPR13)으로도 공지된 CX3C 케모카인 수용체 1 (CX3CR1)은 인간에서 CX3CR1 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. 이름에서 알 수 있듯이, 이 수용체는 케모카인 CX3CL1 (뉴로탁틴(neurotactin) 또는 프락탈카인으로도 불림)에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "단기간 활성화"는, 예컨대 IL-1 계열 시토카인이 아닌 NK 세포를 활성화시키는 것으로 공지된 상이한 시토카인을 사용한 표준 NK 세포 활성화와 비교하여, IL-1 계열 시토카인을, 예컨대 활성화될 NK 세포를 포함하는 세포 배양 배지에 첨가함으로써 NK 세포의 보다 빠른 활성화 가능성을 지칭한다. NK 세포 활성화는 이미 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간, 24시간 (1일), 28시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 (2일) 후 IL-1 계열의 존재 하에 발생한다.
용어 "NK 세포 활성화 시약"은 활성화 신호를 NK 세포에 제공하는 하나 이상의 자극제, 예컨대 CD2 및 CD335에 대한 자극 항체를 커플링한 분자, 예컨대 입자, 비드 또는 나노매트릭스를 지칭한다. 이러한 NK 세포 활성화 시약의 예는 밀테니 바이오텍의 NK 세포 활성화/확장 키트 (밀테니 바이오텍 게엠베하, 독일 베르기쉬 글라드바흐, 주문 번호 130-094-483) 또는 EP2824112B1에 기재된 나노매트릭스이다.
인터류킨-1 계열 (IL-1 계열)은 11개의 시토카인의 그룹으로, 감염 또는 무균 손상에 대한 면역 및 염증 반응의 조절에서 중심적인 역할을 한다.
상기 IL-1 계열 시토카인은 IL-1알파, IL-1베타, IL-1Ra, IL-18, IL-36Ra, IL-36알파, IL-37, IL-36베타, IL-36감마, IL-38 및 IL-33이다. 본원에 개시된 바와 같이, IL-1 계열 시토카인을, 예컨대 다른 시토카인을 사용하는 표준 (선행 기술) NK 세포 활성화 과정에 첨가하면 NK 세포 활성화를 가속화시켜 NK 세포의 단기간 활성화를 초래한다.
IL-1 계열 시토카인은 또한 시토카인의 기능을 보유하면서 일부 아미노산이 결실, 첨가 또는 대체된 그의 변이체일 수 있다. 따라서, 이 정의에는 아미노산 서열 수준에서 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 야생형 시토카인의 아미노산 서열의 변이체가 포함된다. 본 발명의 맥락에서, "서열 동일성"은 당해 분야에 공지된 아미노산 서열에 대한 정렬 프로그램을 이용하는 쌍 정렬을 이용하여 결정될 수 있다.
IL-1 계열 시토카인은 또한 상기 전장(full-length) 시토카인 ("IL-1 계열 시토카인 또는 그의 기능 단편")의 상응하는 부분에 대해 아미노산 서열 수준에서 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 전장 시토카인의 기능 단편일 수 있다.
일반적으로, 모든 아미노산 변이 (즉, IL-1 계열 시토카인의 아미노산의 치환, 첨가 또는 제거)가 이 정의에 포함되며, 이는 본원에 개시된 IL-1 계열 시토카인의 특징 상실을 초래하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 세포에서 프로모터에 의해 추진되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독으로 정의된다.
용어 "피더 세포"는 생존 및/또는 성장을 지지하기 위해 표적 세포 (즉, 본원에서 자연 살해 세포)의 배양물에 첨가되는 세포를 지칭한다. 피더 세포는 온전한(intact) 기능적인 세포외 매트릭스 및 매트릭스-연관된 인자를 제공하며 공지된 및 비공지된 시토카인을 조건화된 배지로 분비한다. 피더 세포는 일반적으로 배양물에서 그들의 증식을 방지하기 위해 성장이 정지되지만 그들의 생존은 유지된다. 성장 정지는 유효량의 방사선 조사 또는 유효량의 화학물질, 예컨대 미토마이신 C로의 처리에 의해 달성될 수 있다. 방사선조사된 말초혈액 단핵세포 (이후 "PBMC"로도 약칭됨), NK 세포가 고갈된 PBMC, 암 세포주, 유전자 조작된 암 세포주 및 엡스타인-바르 바이러스 (이후 "EBV"로도 약칭됨)로의 천연 감염에 의해 불멸화된 림프구를 포함한 몇몇 종류의 피더 세포가 있다.
본원에 사용된 용어 "배양하는"은 NK 세포 유지에 필요한 화학적 및 물리적 조건 (예컨대, 온도, 가스) 및 성장 인자를 제공하는 것을 포함한다. 종종 NK 세포를 배양하는 것은 NK 세포에 확장 (증식) 조건을 제공하는 것을 포함한다. NK 세포 확장을 지지할 수 있는 화학적 조건의 예는 완충제, 혈청, 영양소, 비타민, 항생제, 시토카인 및 NK 세포 확장에 맞는 세포 배양 배지에 종종 제공되는 (또는 수동으로 제공될 수 있는) 다른 성장 인자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, NK 세포 배양 배지는 5% 인간 혈청 유형 AB (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies)), 500 U/mL의 IL-2 (밀테니) 및 10 ng/mL IL-15 (밀테니)로 보충된 NK MACS 연구 배지 (밀테니 바이오텍 게엠베하)를 포함한다. NK 세포를 확장시키는 데 사용하기에 적합한 다른 배지는 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "세포 배양 배지"는 NK 세포 유지에 필요한 화학적 조건을 제공하는 액체를 포함한다. NK 세포 확장을 지지할 수 있는 화학적 조건의 예는 용액, 완충제, 혈청, 혈청 성분, 영양소, 비타민, 시토카인 및 세포 배양 배지에 종종 제공되는 (또는 수동으로 제공될 수 있는) 다른 성장 인자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당해 분야에 공지된 NK 세포를 배양하는 데 사용하기에 적합한 배지는 NK MACS (밀테니), TexMACS (밀테니), CellGro SCGM (셀게닉스 (CellGenix)), X-Vivo 10, X-Vivo 15, BINKIT NK 세포 초기 배지 (코스모 바이오 USA (Cosmo Bio USA)), AIM-V (인비트로겐 (Invitrogen)), DMEM/F12, NK 세포 배양 배지 (업사이트 테크놀로지즈 (upcyte technologies))를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "IL-2" 및 "IL-15"는 시토카인 인터류킨-2 및 인터류킨-15 및 그의 유도체, 예컨대 IL-2 슈퍼카인, IL-2 디프테리아 독소 융합 단백질 또는 IL-15Rα 스시를 지칭한다.
용어 IL-2 및/또는 IL-15는 일반적으로 공통 감마쇄 및 IL2/IL15Rβ (IL2Rβ, CD122로도 공지됨)를 공유하는 IL2 및 IL15에 대한 이종삼량체 수용체에 결합하는 시토카인의 4α-나선 다발 계열의 구성원을 지칭한다 .
본원에 사용된 용어 "유효 농도의 IL-2 및/또는 IL-15를 (반복적으로) 첨가하는"은 1 U/mL 내지 5000 U/mL, 우선적으로 10 U/mL 내지 1000 U/mL, 더 우선적으로 50 내지 500 U/mL의 상기 세포 배양 배지 중의 IL-2의 농도를 지칭하고/하거나 0.1 내지 1000 ng/mL, 우선적으로 1 내지 200 ng/mL, 더 우선적으로 10 내지 100 ng/mL의 상기 세포 배양 배지 중의 IL-15의 농도를 지칭한다. 일반적으로, IL-2 및/또는 IL-15의 농도는 배양 공정 동안 시간이 지남에 따라 감소하므로, IL-2 및/또는 IL-15는 시토카인(들)의 수준을 유효 농도(들)로 유지하기 위해 세포 배양 배지에 반복적으로 첨가될 수 있다. 종종, IL-2 및/또는 IL-15는 세포 배양 배지 변화에 의해 세포 배양물에 다시 첨가될 수 있다. 이와 관련하여 "반복적으로"는 전체 배양 공정 내에서 적어도 하나의 반복을 의미한다. 배양 공정 초기에 IL-2 및/또는 IL-15를 첨가할 필요는 없지만 적어도 제1 배지 변경시, 즉 7일 후에 첨가한다. 그럼에도 불구하고, 배양 공정 초기에 IL2 및/또는 IL-15를 첨가하는 것이 유리하다.
본원에 사용된 용어 "확장" 또는 "증식"은 세포 성장 및 세포수의 증가를 지칭한다. 본원에 사용된 확장 또는 증식은 배양 공정 동안 발생하는 증가된 수의 NK 세포에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "배양 공정" 또는 "배양"은 NK 세포의 배양 및 확장을 지칭하며, 여기서 배양 공정, 즉 NK 세포 확장의 시작일 (출발점)은 제0일로 정의된다. 배양 공정은 조작자가 원하는 만큼 지속될 수 있고 세포 배양 배지가 세포가 생존 및/또는 성장 및/또는 증식할 수 있는 조건을 갖는 한 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "배양 공정의 시작"은 세포 배양 배지에 성장 인자, 예컨대 IL-2 및/또는 IL-15를 첨가함으로써 확장 공정을 시작하는 것, 즉 세포가 그들의 증식 과정을 시작하기 위해 개시되는 것을 지칭한다. IL-1 계열 시토카인, 예컨대 IL-18 또는 IL-33의 첨가는 NK 세포의 활성화 과정을 가속화하고 효율적인 형질도입을 준비하므로, IL-1 계열 시토카인은 NK 세포를 활성화시키는 다른 널리 공지된 시토카인과 함께 배지에 제공되어야 한다. 우선적으로, 유효 농도의 IL-1 계열 시토카인이 세포 배양 배지에 1회만 첨가된다. 대안적으로, 유효 농도의 IL-1 계열 시토카인이 상기 세포 배양 배지에 반복적으로, 예컨대 2회 또는 그 초과로 자주 첨가된다.
본원에 사용된 용어 "유효 농도의 IL-1 계열 시토카인을 (반복적으로) 첨가하는"은 1 U/mL 내지 5000 U/mL, 우선적으로 10 U/mL 내지 1000 U/mL, 더 우선적으로 50 내지 500 U/mL의 상기 세포 배양 배지 중의 상기 IL-1 계열 시토카인의 농도를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "피더 세포의 막 입자"는 피더 세포의 NK 세포 자극 표면 분자를 함유하는 피더 세포의 막 제제를 지칭한다. 피더 세포의 막 입자는 생(live) 피더 세포의 가능한 단점을 피하기 위해 활용될 수 있다. 피더 세포의 막 입자는, 오이어 등 (Oyer 2015)에 의해 예시되는 바와 같이, 질소 캐비테이션(cavitation)을 사용한 세포의 용해 및 파괴에 이어서 밀도 구배 원심 분리에 의한 세포막 분획의 단리 및 정제에 의해 생성될 수 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 방법에서, 피더 세포는 상기 피더 세포의 막 입자로 대체될 수 있다. 우선적으로, 막 입자는 사용된 생 피더 세포에 의해 수득될 수 있는 이들 양에 필적하는 양으로 사용되어야 한다. 우선적으로, 사용된 막 입자의 농도는 100 내지 400 μg/mL, 보다 바람직하게는 150 내지 250 μg/mL일 수 있다. 막 입자의 첨가는 생 피더 세포의 첨가만큼 자주 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조작된 세포" 및 "유전자조작으로 변형된 세포" (본원에서는 본질적으로 NK 세포)는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어는 세포 또는 그의 자손의 유전자형 또는 표현형을 변형시키는 외래 유전자 또는 핵산 서열을 함유 및/또는 발현하는 것을 의미한다. 특히, 상기 용어는 세포가 자연 상태로는 이들 세포에서 발현되지 않는 펩티드 또는 단백질을 안정적으로 또는 일시적으로 발현시키기 위해 당해 분야에 널리 공지된 재조합 방법에 의해 세포가 조작될 수 있다는 사실을 지칭한다. 본 발명에 사용된 용어 "폐쇄 시스템"은 새로운 물질의 도입과 같은 배양 공정을 수행하고 세포의 증식, 분화, 활성화 및/또는 분리와 같은 세포 배양 단계를 수행하면서 세포 배양 오염의 위험을 감소시키는 임의의 폐쇄 시스템을 지칭한다. 이러한 시스템은 GMP 또는 GMP-유사 조건 ("멸균") 하에서 작동하여 임상적으로 적용 가능한 세포 조성물을 생성할 수 있다. 본원에서는 예를 들면, CliniMACS Prodigy® (밀테니 바이오텍 게엠베하, 독일)가 폐쇄 시스템으로 사용된다. 이 시스템은 WO2009/072003에 개시되어 있다. 그러나, 본 발명의 방법의 사용을 CliniMACS® Prodigy로 제한하려는 것은 아니다. 본원에 사용된 용어 "자동화된 방법" 또는 "자동화된 공정"은 장치 및/또는 컴퓨터 및 컴퓨터 소프트웨어의 사용을 통해 자동화되는 임의의 공정을 지칭하며, 그렇지 않으면 조작자에 의해 수동으로 수행되거나 수행될 수 있다. 자동화된 방법 (공정)은 인간 개입이 적고 운반 시간이 줄어든다. 일부 경우에, 본 발명의 방법은 본 발명의 방법의 적어도 하나의 단계가 인간의 지원 또는 개입 없이 수행되는 경우 자동화된다. 우선적으로, 본 발명의 방법은 본원에 개시된 방법의 모든 단계가 인간의 지원 또는 개입 없이 수행되는 경우 자동화된다. 우선적으로, 자동화된 공정은 폐쇄 시스템, 예컨대 CliniMACS® Prodigy에서 실시된다. CAR은 힌지 및 막횡단 영역을 통해 세포 신호전달 분자의 세포질 도메인에 커플링된 특정 표적 항원에 특이적인 항체의 단일쇄 가변 단편 (scFv)를 포함한다. 가장 일반적인 림프구 활성화 모이어티는 세포 트리거링 (예컨대, CD3ζ) 모이어티와 함께 세포 공동-자극 (예컨대, CD28, CD137, OX40, ICOS 및 CD27) 도메인을 포함한다. CAR-매개된 입양 면역요법은 CAR-그래프팅된 세포가 비-HLA-제한된 방식으로 표적 세포 상의 원하는 항원을 직접 인식할 수 있게 한다.
실시양태
본 발명의 한 실시양태에서, 트랜스제닉 핵산, 예컨대 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산은 조혈 세포막에 결합하고 융합할 수 있는 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질로 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자를 사용하여 활성화된 NK 세포로 전달된다.
상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자는 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질의 막횡단 및 세포외 도메인과 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 외피 당단백질의 세포질 테일 도메인의 융합물 또는 세포질 테일 도메인에 융합 억제성 R 펩티드가 결여된 변형된 BaEV 외피 당단백질을 포함하거나 이로 이루어지는 키메라 외피 당단백질을 포함할 수 있다.
NK 세포를 포함하는 세포 배양 배지 중의 NK 세포는, 예컨대 IL-2 및/또는 IL-15를 배지에 첨가함으로써 활성화된다. 2 내지 5일 후, NK 세포 활성화 효과는 NK 세포 증식을 이끈다. 이어서, 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자는 배지에, 즉 활성화된 NK 세포에 첨가될 수 있다. 활성화된 NK 세포는 상기 벡터 입자에 의해 형질도입되고, 배지에서 확장되고, 트랜스진, 예컨대 키메라 항원 수용체를 발현한다.
이들 조작된 NK 세포는 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 트렌스제닉(transgenic) 핵산, 예컨대 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산은 조혈 세포막에 결합하고 융합할 수 있는 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질로 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자를 사용하여 활성화된 NK 세포로 전달된다.
상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자는 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질의 막횡단 및 세포외 도메인과 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 외피 당단백질의 세포질 테일 도메인의 융합물 또는 세포질 테일 도메인에 융합 억제성 R 펩티드가 결여된 변형된 BaEV 외피 당단백질을 포함하거나 이로 이루어진 키메라 외피 당단백질을 포함할 수 있다.
NK 세포를 포함하는 세포 배양 배지 중의 NK 세포는 IL-2 및/또는 IL-15 및 IL-1 계열 시토카인, 예컨대 IL-18 또는 IL-33을 배지에 첨가함으로써 활성화된다. 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간, 24시간 (1일), 28시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 (2일) 후, NK 세포는 활성화된다. 이어서, 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자는 배지에, 즉 활성화된 NK 세포에 첨가된다. 활성화된 NK 세포는 상기 벡터 입자에 의해 형질도입되고, 배지에서 확장되고, 트랜스진, 예컨대 키메라 항원 수용체를 발현한다.
이들 조작된 NK 세포는 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 임상 규모의 세포 분리기 (CliniMACS plus, 밀테니 바이오텍, 독일)를 사용하여 CD3 고갈 및 CD56 농축에 의해 정제된 NK 세포일 수 있다.
이들 정제된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 완전 폐쇄 시스템 (CliniMACS Prodigy®, 밀테니 바이오텍, 독일)에서 모든 자기 표지화(magnetic labeling) 단계를 포함하는 CD3 고갈 및 CD56 농축에 의해 정제될 수 있다.
이들 정제된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 음성 자기 세포 분리에 의해 인간 혈액 샘플, 예컨대 PBMC로부터 정제된 NK 세포일 수 있다. NK 세포는 비-NL 세포에 결합하는 항체 또는 그의 단편의 칵테일에 커플링된 자기 비드(magnetic beads)의 사용에 의해 분리된다. 이어서, 농축된 NK 세포 집단을 포함하는 음성 분획을 NK 세포 활성화 및 차후 형질도입에 적합한 세포 배양 배지에 첨가하며, 즉 배지는 Il-2 및/또는 IL-15 및/또는 IL-18을 포함한다.
이들 정제된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는, 예컨대 WO2013076070A1 (MACSxpress® NK 세포 단리 키트, 밀테니 바이오텍)에 개시된 음성 자기 세포 분리 및 적혈구 침강에 의해 전체 인간 혈액으로부터 정제된 NK 세포일 수 있다.
이들 정제된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 NK 세포의 정제된 서브집단인 NK 세포일 수 있다. 이들 정제된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 정제된 CX3CR1 음성 NK 세포 서브집단인 NK 세포일 수 있다. 이들 정제된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 정제된 KLRG1 또는 CD57 음성 NK 세포 서브집단인 NK 세포일 수 있다. 이들 정제된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 정제된 NKG2C 양성 NK 세포 서브집단인 NK 세포일 수 있다. 이들 정제된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 정제된 기억 유사 NK 세포 서브집단인 NK 세포일 수 있다. 이들 정제된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 시토카인 유도된 기억 유사 NK 세포인 NK 세포일 수 있다. 이들 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 단일 KIR 분자에 대해 양성 또는 특정 KIR 분자에 대해 양성인 정제된 NK 세포 서브집단의 NK 세포일 수 있다. 이들 정제된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 바이러스 펩티드에 특이적인 정제된 NK 세포 서브집단인 NK 세포일 수 있다. 이들 정제된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 시토카인 및 케모카인 분비 서브집단이 농축된 NK 세포일 수 있다. 이들 농축된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 단리된 서브집단인 NK 세포일 수 있다. 이들 단리된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 마이크로칩 기반 세포 분류기, 예컨대 MACSQuant Tyto® (밀테니 바이오텍 게엠베하)를 사용하여 단리된 서브집단인 NK 세포일 수 있다. 이들 단리된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하기 위해 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 태그부착된 단백질, 예컨대 바이오티닐화된 항체에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하기 위해 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하기 위해 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있는 NK 세포일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 하나 또는 다수의 케모카인 수용체를 발현하기 위해 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있는 NK 세포일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 자연 발생의 것보다 더 높거나 더 낮은 친화성 버젼의 NK 세포 수용체를 발현하기 위해 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있는 NK 세포일 수 있다. 상기 NK 세포 수용체는 CD16, CD314/NKG2D, CD335/NKp46, NKp44, NKp30, CD226/DNAM-1 또는 킬러 면역글로불린 유사 수용체의 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 면역조절 분자, 예컨대 PD-L1, CTLA-4, LAG-3, CD39 또는 CD73을 발현하기 위해 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있는 NK 세포일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 억제성 수용체, 예컨대 KIR 분자, NKG2A, PD-1 또는 A2AR의 증가되거나 감소된 발현을 위해 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있는 NK 세포일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 시토카인, 예컨대 IL-2 또는 IL-15을 생성하기 위해 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있는 NK 세포일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 펩티드 치료제 또는 단백질 치료제, 예컨대 치료 항체를 발현하기 위해 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있는 NK 세포일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지 중의 상기 NK 세포는 세포 추적을 위한 단백질, 예컨대 형광 추적을 위한 GFP, 또는 루시페린과 함께 화학발광 추적을 위한 루시페라제를 발현하기 위해 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있는 NK 세포일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, NK 세포 단리, NK 세포 배양 및 NK 세포 형질도입으로 이루어진 방법은 당업자에 의해 공지된 폐쇄 시스템에서 수행된다. 추가의 실시양태에서, 폐쇄 시스템은 세포 프로세싱 장치에 부착된 일회용 튜빙 세트이다. 추가의 실시양태에서, 상기 세포 프로세싱 장치는 CliniMACS Prodigy® (밀테니 바이오텍)이다. 추가의 실시양태에서, 형질도입된 NK 세포는 제2의 폐쇄 시스템에서 더 큰 부피로 추가로 배양된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 NK 세포는 약 200 내지 1000 리터 부피로 대규모 형질도입 후 확장되어 다수의 환자를 위한 유전자조작으로 변형된 NK 세포의 임상 생성물을 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 형질도입된 NK 세포는 저온보존된다. 저온보존된 NK 세포의 분취물은 해동되고 상기 배양 공정에서 추가로 배양되어, 저온보존된 세포 뱅크로부터 출발하는 형질도입된 NK 세포의 생성을 허용한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 NK 세포는 표현형적으로 균일한 세포 생성물의 생성을 위한 제한 희석에 의해 단일 NK 세포로부터 확장된다. 이 균일한 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 NK 세포는 종양 생검으로부터 단리된 종양 침윤 NK 세포이다. 이들 단리된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 NK 세포는 세포 배양 공정에서 제대혈 CD34+ 조혈 전구세포로부터 생성된다. 이들 생성된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 NK 세포는 세포 배양 공정에서 유도된 다능성 줄기 세포로부터 생성된다. 이들 생성된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 NK 세포는 높은 NK 세포 기능성을 위해 선택된 공여자의 혈액으로부터 단리된다. 이들 단리되고 선택된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 NK 세포는 제대혈로부터 단리된다. 이들 단리된 NK 세포는 본원에 개시된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자로 형질도입될 수 있다.
실시예
실시예 1: 놀랍게도, 개코 원숭이 외피 당단백질 (BaEV)로 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터는 NK 세포가 사전-활성화되는 경우 일차 NK 세포의 높은 형질도입 효율을 나타낸다.
버피 코트(buffy coat)로부터 NK 세포 단리를 위해, 말초혈액 단핵세포 (PBMC) 제조를 피콜-플라크 PLUS (Ficoll-Paque PLUS) (GE 헬스케어 (GE Healthcare))를 사용한 표준 밀도-구배 원심 분리에 의해 수행하였다. NK 세포 단리 키트 휴먼 (NK cell isolation kit human) (밀테니 바이오텍)을 PBMC로부터의 NK 세포의 비손상 (untouched) 농축에 적용하였다. 단리된 NK 세포를 3개의 그룹으로 나누고, 상이한 기간 동안 그들을 활성화시키고, GFP를 함유하는 BaEV 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 모든 형질도입은 제조사 프로토콜에 따라 10 ng/ml 벡토푸신(vectofusin) (밀테니 바이오텍) 및 스피노쿨레이션 (spinoculation)으로 수행되었다. NK 세포의 제1 그룹은 단리 직후 형질도입시켰다 (활성화 없음). NK 세포의 제2 그룹은 5% AB 혈청, 500 U/mL IL-2 및 10 ng/ml IL-15를 함유하는 NK MACS 배지 (밀테니 바이오텍)에서 1일 동안 배양한 후 (1일 동안 IL-2 + IL-15에서 활성화됨), 형질도입시켰다. NK 세포의 제3 그룹은 5% AB 혈청, 500 U/mL IL-2 및 10 ng/ml IL-15를 함유하는 NK MACS 배지 (밀테니 바이오텍)에서 2일 동안 배양한 후 (2일 동안 IL-2 + IL-15에서 활성화됨), 형질도입시켰다. 각각의 형질도입된 그룹에 대한 대조군으로서, NK 세포는 바이러스 벡터가 첨가되지 않은 것을 제외하고는 형질도입된 세포와 동일한 조건에서 배양되었다 (비-형질도입됨). 형질도입 3일 후, 비-활성화된 NK 세포는 단지 2.44%의 형질도입을 나타내었다 (활성화 없음, 도 1의 좌측 하부 패널). 다른 한편, 5% AB 혈청, 500 U/mL IL-2 및 10 ng/ml IL-15를 함유하는 NK MACS 배지 (밀테니 바이오텍)에서 1일 및 2일 동안 배양된 NK 세포 그룹은 각각 14.59% 및 22.61%의 GFP 발현을 나타내었다 (도 1, 형질도입됨, 중간 및 우측 하부 패널). 각각의 그룹에서, 비-형질도입된 NK 세포는 어떠한 GFP 발현도 나타내지 않았다 (도 1, 상부 패널, 비-형질도입됨).
실시예 2: 활성화된 NK 세포의 BaEV로의 형질도입은 VSV-G로의 것보다 현저히 높고, 장기간에 걸쳐 안정적이며, 세포 사멸을 유도하지 않는다.
일차 NK 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리하여 순수한 CD3- 및 CD56+ NK 세포를 생성하였다 (도 2a). 밀테니로부터의 CD4에 대한 마이크로비드 및 CD8에 대한 마이크로비드를 사용자 매뉴얼에 따라 사용하여 동일한 혈액 샘플로부터 T 세포를 단리하여 순수한 CD3 양성 T 세포를 생성하였다 (도 2a). 단리 후, NK 세포를 5% AB 혈청, 10 ng/mL IL-15 및 500 U/mL IL-2를 갖는 NK MACS 배지에서 2일 동안 활성화시켰다. 단리 후, 사용자 매뉴얼에 따라, T 세포를 밀테니로부터의 200 U/mL IL-2 및 T 세포 트랜색트 휴먼 (T Cell Transact human)을 갖는 TexMACS 배지에서 2일 동안 활성화시켰다. 이어서, 활성화된 일차 T 세포 및 NK 세포 뿐만 아니라 NK-92 세포주를, VSV-G 외피로 슈도타이핑되거나 BaEV로 슈도타이핑된, GFP 발현물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 함유하는 상청액으로 형질도입시켰다. VSV-G 슈도타이핑된 바이러스 입자로의 형질도입 3일 후, NK 세포는 높은 바이러스 역가에서도 단지 약 2% GFP 발현을 나타내었으나, T 세포는 동일한 조건 하에서 약 77%의 높은 GFP 발현을 나타내었다 (도 2b). 이 관찰은 VSV-G 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로의 NK 세포 형질도입은 비효율적인 반면, T 세포를 포함한 다른 세포 유형에 대해서는 작동한다는 것을 확인시켜준다. 놀랍게도, BaEV 슈도타이핑된 바이러스 벡터로의 NK 세포주 NK-92의 형질도입 3일 후, 거의 100%의 높은 GFP 발현이 관찰되었고, 반면 일차 NK 세포와 유사하게 VSV-G로의 GFP 발현은 비효율적이었다 (도 2c). NK-92 세포를 200 U/mL IL-2를 함유하는 NK MACS 배지에서 활성화 조건 하에 유지시켰다. NK-92에 대한 관찰과 유사하게, BaEV 슈도타이핑된 벡터로의 형질도입이 적용되는 경우 놀랍게도 60%의 높은 비율의 활성화된 일차 NK 세포가 GFP를 발현하여 T 세포와 유사한 형질도입률에 도달하였다 (도 2d). 중요하게도, 시간에 따른 세포수의 증가를 의미하는 확장 속도는 형질도입되지 않은 NK 세포 및 BaEV 슈도타이핑된 것으로 형질도입된 NK 세포에 대해 유사하였으며, 이는 형질도입 방법이 세포 사멸을 유도하지 않거나 NK 세포의 증식에 영향을 끼치지 않음을 나타낸다 (도 5). 이는 치료가 높은 세포 사멸을 유발하는 전기천공과 같은 다른 유전자 변형 방법과 상이하다. 또한, 전기천공과 같은 다른 유전자 변형 방법은 트랜스진의 일시적 발현만을 허용한다. 특히, BaEV 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로의 형질도입 후, 트랜스진을 발현하는 NK 세포의 지속적으로 높은 퍼센트는 수주에 걸쳐 안정적이었다 (도 6).
실시예 3: 놀랍게도, NK 세포의 IL-33로의 짧은 활성화는 IL-33이 없는 것보다 NK 세포의 더 높은 형질도입률을 허용한다.
일차 NK 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리하였다. 정제된 NK 세포를 IL-2 (500 U/mL) 및 IL-15 (10 ng/ml), 또는 IL-2 (500 U/mL), IL-15 (10 ng/ml) 및 IL-33 (30 U/mL)를 함유하는 5% AB 혈청을 갖는 NK MACS 배지에서 2일 동안 활성화시켰다. 제2일에, 세포를 관심 유전자를 함유하는 개코 원숭이 (BaEV) (도 3a) 또는 VSV-G (도 3b) 외피로 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다. 형질도입되지 않은 세포를 형질도입된 세포와 동일한 조건에서 배양하였다. 형질도입 후, 세포를 IL-33이 없는 배지에서 배양하였다. 형질도입된 NK 세포에서의 트랜스진 발현은 형질도입 후 제3일, 제8일 및 제14일에 관심 유전자의 생성물에 대해 지시되는 특정한 모노클로날 항체로 검출되었다. 형질도입 후 제3일에 트랜스진 발현은 각각, IL-33 없이는 16.62%이고 IL-33을 사용한 경우는 21.27%였다 (도 3a, 좌측 하부 패널). 형질도입 후 제8일에 트랜스진 발현은 각각, IL-33 없이는 32.59%이고 IL-33을 사용한 경우는 45.03%였다 (도 3a, 중간 패널). 형질도입 후 제14일에, 트랜스진 발현은 IL-33 없이는 33.66%이고 IL-33을 사용한 경우는 60.17%였다 (도 3a, 우측 하부 패널). 이 결과는 IL-33을 사용한 NK 세포의 사전-자극이 형질도입에 부가적인 효과를 갖는다는 것을 제시한다. 형질도입되지 않은 NK 세포는 매우 낮은 수준의 항체 염색 (1% 미만, 도 3a, 상부 패널)을 나타내었다. VSV-G 외피로 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터는 개코 원숭이 슈도타이핑된 벡터와 비교하여 상당히 더 낮은 형질도입 효율을 나타내었지만, IL-33의 부가적인 효과는 여전히 상당하다 (도 3b).
실시예 4: IL-18은 IL-33과 유사하게 NK 세포 형질도입률을 증가시켰으며, 이는 IL-1 계열 시토카인의 일반적인 역할을 암시한다.
3명의 상이한 공여자로부터 일차 NK 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리하였다. 단리 후, 동일한 공여자로부터의 NK 세포를 20 ng/mL IL-18의 첨가화 함께 또는 IL-18 없이 5% AB 혈청, 10 ng/mL IL-15 및 500 U/mL IL-2를 갖는 NK MACS 배지에서 2일 동안 활성화시켰다. 이어서, 활성화된 일차 NK 세포를 BaEV로 슈도타이핑된 GFP를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입 후, 세포를 IL-18은 없으나 IL-2 및 IL-15를 갖는 배양 배지에서 배양하였다. 형질도입 3일 후, NK 세포는 IL-18 없이 사전-활성화된 경우 40%의 평균 GFP 발현을 보인 반면, 동일한 공여자로부터의 NK 세포는 IL-18로 사전-활성화된 경우 66%의 상당히 높은 GFP 발현을 나타내었다 (도 4).
실시예 5: BaEV 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터의 사용은 활성화된 NK 세포를 CD19 양성 표적 세포의 특이적 사멸을 위한 CD19 CAR로 효율적으로 형질도입시킬 수 있게 한다.
CAR 발현 T 세포는 CD19 양성 B 세포 백혈병의 치료에 대한 임상 시험에서 매우 긍정적인 결과를 초래하였다. CAR NK 세포는 CAR T 세포에 대한 대안일 수 있기 때문에, 우리는 NK 세포 형질도입에 대한 하나의 예시적인 적용으로서 CD19에 대한 CAR로 NK 세포를 형질도입시켰다. 일차 NK 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 4명의 상이한 공여자로부터 단리하였다. 단리 후, 동일한 공여자로부터의 NK 세포를 5% AB 혈청, 10 ng/mL IL-15 및 500 U/mL IL-2를 갖는 NK MACS 배지에서 2일 동안 활성화시켰다. 이어서, 활성화된 일차 NK 세포를 CD19-CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 사용된 "CD19B" CAR 구축물 및 VSV-G로의 형질도입 후 T 세포에서의 그의 발현은 이전에 기술되었다 (Schneider et al. 2017). NK 세포의 형질도입을 위해, BaEV로 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터가 이 작제물에 대해 생성되고 사용되었다. 형질도입 7일 후 CAR 발현 및 NK 세포 세포독성을 분석하였다. 구체적으로, 무혈청 배양 배지에서 NK 세포를 48시간 동안 인큐베이션 한 후, CD19-CAR 발현을 재조합 인간 CD19 Fc (R & D Systems), 25 μg/mL의 30분 동안의 결합 및 Fc에 대한 뮤린 APC 컨주게이션된 mAB (밀테니 바이오텍)를 사용한 유동 세포측정에 의해 결정하였다. 평균적으로, CD19-CAR의 발현은 상이한 공여자로부터의 NK 세포 중에서 70%였으며, 일부 공여자는 90%의 형질도입률에 도달하였다 (도 7a). 상이한 표적 세포주의 표적 세포 사멸을 유동 세포측정-기반 검정에 의해 분석하였다. 표적 세포를 셀트레이스 바이올렛 (CellTrace Violet) (라이프 테크놀로지스)으로 표지하고, 웰당 2x103개 세포를 96-웰 둥근-바닥 플레이트에 시딩하였다. 이어서, 대조군으로서 배지 또는 상이한 NK 대 표적 비율의 NK 세포를 첨가하였다. 24시간 후, 셀트레이스 바이올렛 양성 표적 세포를 유동 세포측정에 의해 정량화하였다. NK 세포를 갖는 샘플 및 NK 세포를 갖지 않는 상응하는 샘플에서 생존 가능한 표적 세포 사이의 차이는 사멸된 표적으로서 정의되었다. K562 세포는 CD19를 발현하지 않지만 (도 7b), NK 세포의 천연 세포독성에 대한 민감성으로 인해 NK 세포의 일반적인 세포독성 잠재력을 시험하기 위한 표준 표적으로 간주될 수 있다. 예상된 바와 같이, CAR NK 세포 및 형질도입되지 않은 NK 세포는 모두 매우 동일한 용량-의존적 방식으로 K562 세포를 매우 효율적으로 사멸시켰으며, 이는 CD19-독립적 천연 세포독성이 형질도입에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 입증한다 (도 7c). K562 세포와 대조적으로, RS4;11 세포는 CD19를 발현하지만 (도 7b), 그들은 NK 세포의 천연 세포독성에 완전히 둔감하다. 결과적으로, 형질도입되지 않은 NK 세포는 RS4;11 세포를 사멸시킬 수 없었으나, CD19-CAR NK 세포는 K562 세포와 같이 효율적으로 RS4;11을 사멸시켰으며, 이는 사용된 CD19 CAR의 높은 기능성 및 특이성을 입증한다 (도 7b). 라지 세포는 CD19 양성이지만 (도 7b) RS4;11와 상이하며, 그들은 비록 K562 세포와 같이 낮은 정도이지만 활성화된 NK 세포의 천연 세포독성에 민감하다. 따라서, 형질도입되지 않은 NK 세포가 이미 용량 의존적 방식으로 라지 세포를 사멸시킬 수 있었지만, 그럼에도 불구하고 CD19 CAR NK 세포에 의한 라지 세포 사멸이 상당히 더 높았으며, 이는 CD-19 특이적 사멸의 부가적인 효과를 암시한다. 결론적으로, NK 세포의 BaEV 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로의 형질도입은 백혈병 표적 세포에 대해 개선된 CD19 특이적 사멸을 갖는 CD19 CAR 발현 NK 세포를 효율적으로 생성하는 것을 가능하게 하였다.
실시예 6: 활성화된 NK 세포는 개코 원숭이 외피에 대한 수용체 ASCT2를 발현하였으나 나이브(naive) NK 세포는 그렇지 않았다.
NK 세포를 IL-2 및 IL-15를 갖는 NK MACS 배지 (밀테니 바이오텍 게엠베하)에서 2일 동안 성장시켜 활성화시켰다. 나이브 세포 및 활성화된 세포 둘 다를 RIPA 용해 완충액에서 용해시키고 ASCT2에 대한 항체를 사용하여 웨스턴블롯 분석을 수행하였다. 이 결과는 개코 원숭이 외피에 대한 수용체, ASCT2가 NK 세포 활성화 후에만 발현되고 (도 8) 나이브 NK 세포에서는 발현되지 않는다는 것을 나타내었으며, 이는 NK 세포가 개코 원숭이 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로 형질도입되기 위해 활성화될 필요가 있다는 것을 제시한다.
실시예 7: 증식 NK 세포는 형질도입 가능하나 휴지 NK 세포는 그렇지 않다.
NK 세포를 증식 염료로 표지하고, 광범위하게 세척한 후, GFP를 함유하는 개코 원숭이 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 증식 및 형질도입 개시 4일 후 세포 증식 및 형질도입을 유동 세포측정에 의해 결정하였다. 결과는 증식 NK 세포만이 개코 원숭이 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로 형질도입 가능하고 휴지 NK 세포는 그렇지 않다는 것을 제시한다 (도 9a). GFP 형질도입된 NK 세포를 항-CD56 항체로 염색하고, CD56 발현 수준을 결정하기 위해 3개의 그룹의 NK 세포 (GFP+, GFP- 증식, 휴지)를 게이팅하였다 (도 9b). 증식되고 형질도입된 NK 세포는 모두 CD56bright이지만, 형질도입되지 않은 휴지 NK 세포는 CD56dim이었으며, 이는 CD56dim NK 서브세트가 증식적이지 않고 형질도입 가능하지 않았다는 것을 제시한다. 다음으로, 우리는 NK 세포의 증식되고 형질도입된 서브세트, 증식성이나 비-형질도입된 서브세트 및 휴지 서브세트 사이에서 다른 NK 세포 수용체를 추가로 비교하였다 (도 10). NK 세포를 증식 염료로 표지하고, 광범위하게 세척한 후, GFP를 함유하는 개코 원숭이 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입 후 제4일에, 세포를 상이한 NK 세포 수용체에 대한 모노클로날 항체로 염색하고, 발현을 유동 세포측정을 이용하여 측정하였다. 상이한 서브세트들 사이에서 일반적으로 공지된 NK 세포 마커의 발현이 도시되어 있다 (도 10). NKp46, DNAM-1, CD94 및 NKG2C의 발현은 모든 상이한 NK 세포 서브세트 사이에서 유사하였다. 증식 세포의 분획 내에서, GFP+ 세포와 GFP- 세포 사이의 상이한 NK 세포 마커 발현의 차이는 유의하지 않았다. 그러나, 몇몇 마커의 발현에 따라, 휴지 NK 세포는 증식 NK 세포와 상당히 상이한 표현형을 가졌다. 증식 세포는 더 낮은 CD16 발현, 활성화 수용체 NKp30, NKp44 및 NKG2D의 더 높은 발현 뿐만 아니라 TRAIL 및 NKG2A의 더 높은 발현 경향과 함께 CD56이 더욱 밝았다. (도 10).
실시예 8: CX3CR1 neg NK 세포 서브세트는 고도로 증식성이고 형질도입 가능하다.
5명의 공여자로부터의 NK 세포를 사용하여 유동 세포측정에 의해 371개의 표면 마커를 분석하였다. 휴지 NK 세포 및 증식 NK 세포의 마커 프로파일 사이의 차이를 분석하였으며, 이는 GFP 발현 집단 및 GFP 음성 집단으로 추가로 구분되었다. 스크리닝으로부터, GFP를 발현하지 않는 휴지 NK 세포와 형질도입되고 GFP를 발현할 수 있는 증식 NK 세포 사이에서 가장 잘 구별되는 마커가 결정되었다. 전반적으로, 휴지 NK 세포와 직접 비교하여, 증식성의 GFP 양성 NK 세포는 32개의 마커를 더 높은 수준으로 발현하고, 5개의 마커를 더 낮은 수준으로 발현하였다 (도 11a). 이들 마커 중, 일부는 발현 수준 뿐만 아니라 특정 마커를 발현하는 NK 세포의 빈도에서도 차이가 있었다. 가장 명백한 것은 증식성의 GFP 양성 NK 세포 사이에서 CX3CR1 발현의 부재 및 TRAIL을 강하게 발현하는 세포의 높은 빈도였다 (도 11b).
실시예 9: CX3CR1 neg NK 세포 서브세트는 개코 원숭이 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터로 고도로 형질도입 가능하고 마커로서 사용될 수 있었다.
증식 및 형질도입과 가장 높은 관련이 있는 표면 분자 중에서 CX3CR1을 선택하여 CX3CR1 마커가 증식 및 형질도입에 대해 상이한 능력을 갖는 NK 세포 서브세트를 직접 구별할 수 있는지 여부를 시험하기 위해 추가 조사하였다. 상이한 NK 세포 서브세트를 형질도입 및 배양 전에 MCAS 분류를 이용하여 그들의 CX3CR1 발현에 기초하여 분리하였다. 분류하지 않는 경우, 상이한 공여자로부터 혈액 유래된 NK 세포 사이에서 CX3CR1의 발현은 86%였으며, 이는 모든 NK 세포의 약 14%의 작은 분율만이 CX3CR1을 발현하지 않았다는 것을 의미한다 (도 5a). 분류 후, CX3CR1neg NK 세포의 평균 빈도는 CX3CR1의 농축에 의해 2%로 감소될 수 있었고, 다른 한편으로 마커에 대한 고갈은 91% CX3CR1neg NK 세포를 초래하였다 (도 12a). 상이하게 분류된 NK 세포 분획의 배양 및 형질도입 직후, 우리는 트랜스진 발현 및 증식률과 관련하여 유의한 차이를 관찰하였다 (도 12b, 12c). 분류되지 않은 분획 사이에서, 증식률 및 GFP 발현율은 각각 28% 및 21%였다. 동시에, 한계 함량의 CX3CR1 음성 세포를 갖는 CX3CR1-농축 분획은 단지 11% 증식 및 7% GFP 양성 세포를 함유하였다. 인상적으로, 높은 시작 빈도의 CX3CR1neg NK 세포를 갖는 CX3CR1-고갈된 분획 사이에서 이미 81%가 증식 중이었고 69%가 GFP 양성이었다. CX3CR1-농축 분획 내에서도, 증식 및 GFP 발현이 주로 남아 있는 CX3CR1neg 세포에서 관찰되었다 (도 12c). 전체적으로, 실험은 BaEV 슈도타이핑된 LV로 효율적으로 형질도입될 수 있는 고도로 증식성인 NK 세포의 서브세트를 확인하였다. 이 NK 세포 서브세트는 CX3CR1 발현의 부재에 의해 명확하게 정의될 수 있었고, 이 특성은 형질도입 가능한 NK 세포에 대한 사전-농축에 사용될 수 있었다.
실시예 10: IL-1 베타는 NK 세포 형질도입률을 증가시켰다.
신선한 NK 세포를 말초혈액 단핵세포 (PBMC)로부터 단리하고 IL-2/IL-15 또는 IL-2/IL-15/IL-1β (IL-1베타)로 3일 동안 자극하였다. 활성화 후 제2일에, 림프구를 3 감염다중도 (MOI)로 형질도입시켰다. 다음날, 세포를 세척하고 IL-2/IL-15의 존재 하에 추가의 7일 동안 확장을 계속하였다. 유전자 조작으로 변형된 NK 세포의 빈도를 검출하기 위해, 세포를 CAR의 scFv 도메인을 특이적으로 표적는 바이오티닐화된 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체로 표지하였다. 바이오틴 컨주게이트의 검출은 항-바이오틴-PE 2차 mAb 표지화를 이용하여 수행되었다. 양성 세포의 퍼센트가 각각 도트 플롯에 표시되며, IL-2, IL-15 및 IL-1 베타로 자극된 신선한 NK 세포가 IL-1 베타가 없는 IL-2/IL-15와 비교하여 우수한 형질도입률을 초래함을 입증한다 (68% 대 52%). 결과는 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
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SEQUENCE LISTING <110> MILTENYI BIOTEC B.V. & CO. KG <120> Method for NK cell transduction <130> Mil_115 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 563 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> wild-type BaEV envelope glycoprotein <400> 1 Met Gly Phe Thr Thr Lys Ile Ile Phe Leu Tyr Asn Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys 20 25 30 Arg Tyr Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro 35 40 45 Pro Ser Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr 50 55 60 Leu Met Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr 65 70 75 80 Ser Pro Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser 85 90 95 Ser Val His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly 100 105 110 Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly 115 120 125 Thr Ser Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser 130 135 140 Pro Cys Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala 145 150 155 160 Pro Ile His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile 165 170 175 Lys Ser Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro 180 185 190 Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu 195 200 205 Met Val Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu 210 215 220 Leu Leu Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu 225 230 235 240 Lys Leu Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser 245 250 255 Tyr Val Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro 260 265 270 Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser 275 280 285 Pro Ser Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe 290 295 300 Ser Asn Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val 305 310 315 320 Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu 325 330 335 Pro Thr Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp 340 345 350 Ile Asp Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp 355 360 365 His Phe Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu 370 375 380 Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu 385 390 395 400 Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser 405 410 415 Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val 420 425 430 Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu 435 440 445 Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys 450 455 460 Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr 465 470 475 480 Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro 485 490 495 Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu 500 505 510 Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile 515 520 525 Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His 530 535 540 Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu 545 550 555 560 Ala Gln Asp <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> tyrosine endocytosis signal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Tyr Xaa Xaa Leu 1 <210> 3 <211> 546 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> modified BaEV envelope glycoprotein wherein the cytoplasmic tail domain is devoid of the fusion inhibitory R peptide <400> 3 Met Gly Phe Thr Thr Lys Ile Ile Phe Leu Tyr Asn Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys 20 25 30 Arg Tyr Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro 35 40 45 Pro Ser Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr 50 55 60 Leu Met Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr 65 70 75 80 Ser Pro Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser 85 90 95 Ser Val His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly 100 105 110 Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly 115 120 125 Thr Ser Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser 130 135 140 Pro Cys Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala 145 150 155 160 Pro Ile His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile 165 170 175 Lys Ser Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro 180 185 190 Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu 195 200 205 Met Val Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu 210 215 220 Leu Leu Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu 225 230 235 240 Lys Leu Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser 245 250 255 Tyr Val Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro 260 265 270 Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser 275 280 285 Pro Ser Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe 290 295 300 Ser Asn Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val 305 310 315 320 Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu 325 330 335 Pro Thr Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp 340 345 350 Ile Asp Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp 355 360 365 His Phe Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu 370 375 380 Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu 385 390 395 400 Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser 405 410 415 Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val 420 425 430 Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu 435 440 445 Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys 450 455 460 Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr 465 470 475 480 Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro 485 490 495 Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu 500 505 510 Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile 515 520 525 Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His 530 535 540 Ala Met 545 <210> 4 <211> 562 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chimeric envelope glycoprotein in a fusion of the transmembrane and extracellular domain of a BaEV envelope glycoprotein and the cytoplasmic tail domain of a MLV envelope glycoprotein <400> 4 Met Gly Phe Thr Thr Lys Ile Ile Phe Leu Tyr Asn Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys 20 25 30 Arg Tyr Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro 35 40 45 Pro Ser Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr 50 55 60 Leu Met Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr 65 70 75 80 Ser Pro Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser 85 90 95 Ser Val His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly 100 105 110 Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly 115 120 125 Thr Ser Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser 130 135 140 Pro Cys Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala 145 150 155 160 Pro Ile His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile 165 170 175 Lys Ser Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro 180 185 190 Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu 195 200 205 Met Val Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu 210 215 220 Leu Leu Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu 225 230 235 240 Lys Leu Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser 245 250 255 Tyr Val Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro 260 265 270 Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser 275 280 285 Pro Ser Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe 290 295 300 Ser Asn Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val 305 310 315 320 Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu 325 330 335 Pro Thr Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp 340 345 350 Ile Asp Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp 355 360 365 His Phe Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu 370 375 380 Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu 385 390 395 400 Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser 405 410 415 Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val 420 425 430 Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu 435 440 445 Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys 450 455 460 Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr 465 470 475 480 Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro 485 490 495 Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu 500 505 510 Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile 515 520 525 Phe Asn Arg Leu Val Gln Phe Val Lys Asp Arg Ile Ser Val Val Gln 530 535 540 Ala Leu Val Leu Thr Gln Gln Tyr His Gln Leu Lys Pro Leu Glu Tyr 545 550 555 560 Glu Pro

Claims (15)

  1. 생물학적 물질을 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자를 사용하여 활성화된 NK 세포로 전달하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은
    a) NK 세포를 활성화시키는 단계, 및
    b) 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자를 상기 활성화된 NK 세포에 첨가하는 단계
    를 포함하고,
    여기서 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자는 조혈 세포막에 결합하고 융합함으로써 생물학적 물질을 상기 활성화된 NK 세포로 전달할 수 있는 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질을 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 NK 세포의 활성화 전에, NK 세포가 CX3CR1 양성 및 CX3CR1 음성 NK 세포를 포함하는 샘플로부터 CX3CR1 음성 NK 세포에 대해 농축되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자가 적어도:
    개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질의 막횡단 및 세포외 도메인과 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 외피 당단백질의 세포질 테일 도메인의 융합물을 포함하거나 이로 이루어진 키메라 외피 당단백질; 또는
    세포질 테일 도메인에 융합 억제성 R 펩티드가 결여된 변형된 BaEV 외피 당단백질
    을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포의 상기 활성화가 상기 NK 세포에 적어도 하나의 시토카인 또는 피더 세포 또는 피더 세포의 막 입자를 첨가하거나 NK 세포 활성화 시약을 사용하여 달성되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 적어도 하나의 시토카인이 IL-2 및/또는 IL-15인 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포의 활성화가 NK 세포를 활성화시키는 적어도 하나의 시토카인을 포함하는 시토카인 및 IL-1 계열 시토카인의 조합을 첨가하여 NK 세포의 단기간 활성화를 초래함으로써 달성되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 시토카인의 조합이 IL2 및/또는 IL-15 및 IL-1 계열 시토카인인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 IL-1 계열 시토카인이 IL-18, IL-33 또는 IL-1베타인 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포의 상기 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자에 의한 형질도입 효율이 적어도 50%인 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포가 상기 레트로바이러스 벡터 입자로 형질도입되는 경우 상기 생물학적 물질이 하나 이상의 핵산인 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자가 렌티바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자인 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 폐쇄 시스템에서 자동화된 공정으로 수행되는 것인 방법.
  13. 생체내에서 생물학적 물질을 활성화된 NK 세포로 전달함으로써 장애를 앓는 인간의 치료에 사용하기 위한, 조혈 세포막에 결합하고 융합함으로써 생물학적 물질을 상기 활성화된 NK 세포로 전달할 수 있는 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질을 포함하는 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자.
  14. 하기를 포함하는, 생체내에서 생물학적 물질을 활성화된 NK 세포에 전달함으로써 장애를 앓는 인간의 치료에 사용하기 위한 조합 조성물:
    a) NK 세포를 활성화시키는 적어도 하나의 시토카인을 포함하는 제1 조성물, 및
    b) 조혈 세포막에 결합하고 융합할 수 있는 변형된 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 (BaEV) 외피 당단백질을 포함하는 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터 입자 또는 그의 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제1 조성물이 NK 세포를 활성화시키는 적어도 하나의 시토카인을 포함하는 시토카인 및 IL-1 계열 시토카인의 조합을 포함하는 것인 조합 조성물.
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