CN107624119B - 一种分子、表达其的细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

提供一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，编码其的核酸，含有该核酸的构建体、表达载体和转化的细胞，以及它们的制药用途。嵌合的免疫抑制检查点受体分子包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域和任选地跨膜结构域为免疫抑制检查点受体分子的相应结构域或基于该结构域进行的基因改造，所述胞内结构域为一个或多个免疫激活信号结构域。转化的细胞具有强肿瘤杀伤作用，且可解除肿瘤免疫抑制微环境，增强肿瘤微环境中的免疫作用；并且，该转化的细胞有自调节功能，可缓解过度的非特异免疫效应和细胞因子风暴等副作用。

Description

一种分子、表达其的细胞及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗技术领域，具体地，涉及一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，编码其的核酸，含有该核酸的构建体、表达载体和转化的细胞，以及它们的制药用途。
背景技术
CAR-T细胞肿瘤治疗现状
2015年10月，国家癌症中心在著名癌症专业期刊《Cancer Letters》上首次发布我国居民癌症现患数据。结果显示，我国5年内诊断为癌症且仍存活的病例数约为749万(其中男性患者368万人，女性患者381万人)，总体5年癌症患病率为556/10万，数据从整体上反映了癌症病人对新治疗研究进展的迫切需求。
而免疫疗法已然成为人类对抗癌症新的希望，而CAR-T治疗血液肿瘤特别是B-ALL白血病的临床试验结果，使其成为了近年来最备受瞩目的肿瘤免疫疗法之一。然而靶向实体瘤的CAR T免疫治疗研究仍然面对巨大的考验：如何突破实体瘤组织壁垒、如何抵抗肿瘤组织内的免疫抑制、免疫细胞如何在缺氧微环境中竞争生存等。
肿瘤治疗的难题，特别是实体瘤及其肿瘤微环境中的免疫抑制作用
肿瘤微环境可下调肿瘤抗原特异性的辅助/毒性杀伤细胞的数量和炎症因子的释放，上调免疫抑制细胞数量和抑制功能，如调节性T细胞(Regulatory T cells)和髓系来源的抑制细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cells)，将正常免疫系统颠覆为促进肿瘤自身生长的优势因素。
针对肿瘤免疫抑制的相应措施现状
针对实体瘤免疫抑制的情况，科学家陆续研发出阻断抑制信号通路，下调肿瘤微环境中的抑制性细胞的方法，如特异性靶向PD-1(Programmed Death 1)、PD-L1(Programmed Death Ligand 1)、CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte-associated Antigen-4)抗体或抑制剂，免疫激活因子等。
在现有技术中，将免疫抑制相关抗原PD-1和CTLA-4应用于肿瘤免疫治疗的手段通常是构建PD-1抗体(Pembrolizumab、Nivolumab)或CTLA-4抗体(Ipilimumab)，或者使用PD-1或CTLA-4的抑制剂或信号通路阻断剂。然而，PD-1抗体和CTLA-4抗体存在一定的限制性，即，抗体需要渗入肿瘤组织中才可发挥疗效，所以抗体的临床应用具有不确定性。据报道，CAR-GD2T细胞联合PD-1抗体进行免疫治疗时，可抵抗肿瘤微环境的免疫抑制作用，加强CART细胞肿瘤杀伤。对于PD-1和CTLA-4的免疫治疗应用，现有技术中也报道了共表达靶向肿瘤相关抗原CAR T和抑制性CAR T(胞外抗原为正常细胞抗原，胞内段为PD-1或者CTLA-4的抑制信号域)，可防止CAR T脱靶现象的发生(脱靶现象：CAR T细胞识别杀伤正常细胞)。
另外，现有技术中还报道了共表达双抗体PD-1和CD19/Mesothelin/PSCA的CAR T，这虽然扩大了靶点范围(表达PD-1或CD19/Mesothelin/PSCA或同时表达两者的肿瘤细胞)，但是忽略了盲目增加细胞杀伤作用所引起的副作用：细胞因子风暴、脱靶现象(正常细胞也表达两个抗原或之一，导致CAR T杀伤正常细胞，引起正常细胞缺失的机体功能缺陷)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，编码其的核酸，含有该核酸的构建体、表达载体和转化的细胞，以及它们的制药用途。本发明的表达所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子的转化的细胞可营造一种肿瘤免疫抑制微环境，具有增强的肿瘤杀伤作用；并且，该转化的细胞有自调节功能，可缓解过度的非特异免疫效应和细胞因子风暴等副作用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
第一方面，本发明提供了一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述胞外结构域和任选地跨膜结构域为免疫抑制检查点受体分子的相应结构域或基于该结构域进行的基因改造，所述胞内结构域为一个或多个免疫激活信号结构域。
作为优选，所述免疫抑制检查点受体分子选自PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、A2AR、B7H3、B7H4、BTLA、IDO、KIR、CD160、2B4(CD244)和VISTA(C10orf54)；
进一步优选地，所述免疫检查点受体分子为PD-1、CTLA-4、LAG3或TIM3。
优选地，所述胞内结构域包含免疫共刺激信号组合和任选的信号肽；
进一步优选地，所述免疫共刺激信号组合包含TLR1和/或TLR2信号结构域；
进一步优选地，所述胞内结构域为TLR1和/或TLR2与41BB和/或CD28信号结构域的组合。
进一步优选地，任选的信号肽为免疫抑制检查点受体分子相对应的信号肽。
进一步优选地，所述胞内结构域还包括CD3ζ胞内结构域；
在具体的优选实施方案中，所述TLR1和/或TLR2信号结构域和任选地41BB和/或CD28信号结构域配置在CD3ζ胞内结构域的N末端侧。
第二方面，本发明提供了编码如第一方面所述的嵌合的免疫抑制检查点受体分子的核酸。
第三方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如第二方面所述的核酸，以及与之可操作连接、可指导所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子在宿主细胞中表达的一个或多个控制序列。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如第三方面所述的核酸构建体；优选地，所述表达载体为慢病毒表达载体。
第五方面，本发明提供了一种转化的细胞，其包含如第二方面所述的核酸，或者其中转化了如第三方面所述的核酸构建体或如第四方面所述的表达载体；
优选地，所述转化的细胞为免疫细胞，进一步优选为T细胞、B细胞或NK细胞。
在具体的实施方案中，所述转化的细胞为宙斯盾细胞毒性T淋巴细胞(S-CTL,Zeushield Cytotoxic T Lymphocyte)，其为过表达免疫抑制向激活转型的检查点分子的淋巴细胞，特别是T淋巴细胞。S-CTL细胞包括表达嵌合的PD-1受体分子的SP-CTL细胞、表达嵌合的CTLA-4受体分子的SC-CTL细胞、表达嵌合的TIM3受体分子的ST-CTL细胞和表达嵌合的LAG3受体分子的SL-CTL细胞等。S-CTL细胞通过在人体T细胞中转染嵌合的免疫抑制-激动转型的检查点分子基因，获得可抵抗免疫抑制的淋巴细胞。S-CTL淋巴细胞具有以下特点：
1)对表达免疫抑制检查点分子的配体(如PD-L1、B7.1、B7.2、Galectin-9、MHC II等)的肿瘤细胞或肿瘤相关免疫抑制细胞具有强效细胞杀伤作用；
2)S-CTL包含天然的免疫抑制检查点受体分子(如PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3等)表达在免疫效应细胞特别是T细胞、NK细胞等表面，与肿瘤细胞或肿瘤相关免疫抑制细胞的配体结合后，可激活S-CTL载体下游的免疫激活信号，促进免疫细胞自身的激活、增殖、识别、杀伤等功能的发挥；
3)S-CTL结构：胞外段和跨膜区域为完全天然的免疫抑制检查点分子结构，用于特异性识别肿瘤细胞表面配体及识别信号在S-CTL细胞内的有效传递；胞内区域为一个或多个免疫激活信号域，其中本发明发现含TLR1和/或TLR2信号激活域的胞内结构域，可进一步促进肿瘤杀伤效应；
4)自调节功能，由于正常淋巴细胞表达天然的免疫抑制检查点分子受体，转化的细胞表达嵌合的免疫抑制-激动转型的检查点分子，而天然的免疫抑制检查点分子受体为传导抑制信号，嵌合的免疫抑制检查点分子受体为传导激活信号，由此可通过免疫效应细胞自身进行反馈表达调控，减缓S-CTL细胞过度激活引起的副作用，如脱靶杀伤、细胞因子风暴；
第六方面，本发明提供了制备如第五方面所述的转化的细胞的方法，其包括：向细胞中引入如第二方面所述的核酸，或者转化如第三方面所述的核酸构建体或如第四方面所述的表达载体的步骤。
第七方面，本发明提供了如第一方面所述的嵌合的免疫抑制检查点受体分子、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的核酸构建体、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的转化的细胞在制备与免疫抑制检查点受体分子对应的配体、优选与PD-L1、B7.1、B7.2、Galectin-9、MHC II的表达相关的疾病的药物中的用途；
优选地，所述疾病为表达免疫抑制检查点受体分子对应的配体、优选表达PD-L1、B7.1、B7.2、Galectin-9、MHC II的肿瘤；
进一步优选地，所述表达免疫抑制检查点受体分子对应的配体、优选表达PD-L1、B7.1、B7.2、Galectin-9、MHC II的肿瘤选自肺癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌。
术语定义
在本发明的上下文中，“免疫检查点”(Immune Checkpoint)是免疫系统中可上调或下调免疫刺激信号的分子，分为免疫刺激检查点分子(Stimulatory Checkpoint)和免疫抑制检查点分子(Inhibitory Checkpoint)。
“免疫抑制检查点”是免疫系统中可下调免疫刺激信号的分子，例如：PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、CD160、2B4(CD244)、VISTA(C10orf54)、TIGIT、LAIR1等。
“免疫激活信号”：淋巴细胞激活过程中，T细胞需要获取两个信号以充分激活；第一信号是抗原特异性的，即通过T细胞受体与抗原递呈细胞APC表面MHC分子结合产生的；第二信号，即共刺激信号，是抗原非特异性的，通过T细胞和APC细胞表面的共刺激信号分子结合产生的。
本发明的嵌合的免疫抑制检查点受体分子的胞内结构域可以包括共刺激信号分子CD28、OX40、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CD40、CD27、CD134、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、CD2、BTLA等的胞内段，或者它们的任意组合。
有益效果
本发明所述转化的细胞是一种新型的肿瘤杀伤细胞，其特异性识别杀伤肿瘤免疫抑制微环境中表达免疫抑制检查点分子配体的细胞，具有低脱靶率；并且，其胞内结构域的独特设计可进一步促进其肿瘤杀伤效应，同时可以有效消除肿瘤免疫抑制作用；而且，本发明所转化的免疫效应细胞(如T细胞等)处于肿瘤微环境中会诱导表达一定量的天然免疫抑制检查点受体分子，其与肿瘤细胞、肿瘤相关免疫抑制细胞或免疫自身表达的抗原结合产生一定的反馈抑制调节信号，对转化的细胞产生的免疫效应有一定的调节作用，即不会导致所转化的细胞过渡激活，引起炎症等不适症状。此外，本发明所转化的激活载体进行了免疫激活优化，包含固有免疫激活信号TLR1/TLR2胞内段，且组合4-1BB、CD28等免疫激活分子胞内段构建共刺激信号，最后联合CD3ζ链构建完整的免疫信号传导，具有极强的免疫激活效果，S-CTL细胞具有极强的杀伤肿瘤细胞、肿瘤相关免疫抑制细胞的功能，如SC-CTL细胞可特异性识别杀伤肿瘤微环境中的CD80+/CD86+肿瘤细胞和肿瘤相关免疫抑制细胞，协同促进抗肿瘤免疫效应。
鉴于上述优势，本发明的表达所述嵌合受体分子的转化的细胞在抗肿瘤治疗中具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1显示实施例1中的合成序列图谱。
图2显示实施例1中构建的pWPXLd-S(PD1)-CTL-2A-EGFP质粒、pWPXLd-S(CTLA-4)-CTL-2A-EGFP质粒、pWPXLd-S(TIM3)-CTL-2A-EGFP质粒和pWPXLd-S(LAG3)-CTL-2A-EGFP质粒图谱。
图3显示流式细胞仪检测SP-CTL细胞的病毒感染阳性率；空白组：不使用CD3流式抗体染色的非转染T细胞。
图4显示流式细胞仪检测SC-CTL细胞的病毒感染阳性率；正常T细胞组：非转染T细胞。
图5显示SP-CTL细胞对人T-ALL细胞系JURKAT-GL的杀伤作用。
图6显示SP-CTL细胞对人非小细胞性肺癌H460-GL的杀伤作用。
图7显示SC-CTL细胞对人B-ALL细胞系NALM6-GL杀伤作用。
图8显示SP-CTL细胞对人非小细胞性肺癌H460-GL的体内杀伤作用。
图9显示SP-CTL细胞对不表达PD-L1的A549细胞的体外杀伤作用。
图10显示SP-CTL细胞对不表达PD-L1的K562细胞的体外杀伤作用。
图11显示流式细胞术检测PD-L1在肺癌细胞系H1299、H460、H23和A549以及前列腺癌细胞系PC3中的表达情况的结果图。
图12显示SP-CTL细胞对表达PD-L1的肺癌细胞系H1299、H460、H23和A549以及前列腺癌细胞系PC3的体外杀伤作用。
图13显示SP-CTL细胞体内识别、杀伤原代肺癌细胞的结果图；其中图13-A显示在不同时间点，各实验组肿瘤组织块的平均体积结果，图13-B显示每个实验组三个重复的肿瘤组织块的尺寸比对图片。
图14显示SP-CTL细胞体内识别、杀伤原代胃癌细胞的结果图；其中图14-A显示每个实验组三个重复的肿瘤组织块的尺寸比对图片，图14-B显示各实验组的肿瘤组织块的平均重量结果。
图15显示SP-CTL细胞体内识别、杀伤原代骨肉瘤细胞的结果图；其中图15-A显示每个实验组六个重复的肿瘤组织块的尺寸比对图片，图15-B显示各实验组的肿瘤组织块的平均重量结果。
图16显示SC-CTL细胞体外特异性识别、杀伤非霍金森淋巴瘤RL细胞的结果图。
图17显示SC-CTL细胞体内特异性识别、杀伤非霍金森淋巴瘤RL细胞的结果图；其中图17-A显示每个实验组两个重复的肿瘤组织块的尺寸比对图片，图17-B显示每个实验组的肿瘤组织块的平均重量结果。
图18显示mSC-CTL细胞体内特异性识别、杀伤原代骨肉瘤细胞的结果图；其中图18-A显示每个实验组的肿瘤组织块的尺寸比对图片，图18-B显示各实验组的肿瘤组织块的平均重量结果。
图19显示SP-CTL、mSC-CTL单独或联合应用在体内特异性识别、杀伤原代肺癌细胞的结果图；其中图19-A显示各实验组肿瘤组织块的平均体积结果，图19-B显示各实验组肿瘤组织块的平均重量结果。
图20显示SP-CTL、mSC-CTL单独或联合应用在体内对肿瘤组织中的CD80+细胞(图20-A)、CD86+细胞(图20-B)及CD11b+Ly6G+细胞(MDSC)(图20-C)的影响。
图21显示B急性淋巴细胞白血病细胞系Nalm6、RL、Raji高表达Lag3配体MHC II。
图22显示SL-CTL细胞可特异性识别和杀伤高表达MHC II配体的B-ALL细胞系Nalm6细胞。
图23显示与肿瘤细胞共孵育的SL-CTL细胞可显著上调炎症因子IL-2(图23A)、IFN-γ(图23A)的蛋白表达和分泌。
图24显示A549细胞在体外不表达Galectin9(Tim3配体)表面蛋白，而体内微环境可诱导肺癌细胞系A549特异性高表达Galectin9表面蛋白。
图25显示原代肺癌细胞1、2、3在病人来源的肿瘤异种移植(PDX，Patient DerivedXenograft)模型中特异性高表达Galectin9表面蛋白。
图26显示ST-CTL可在PDX模型中特异性识别杀伤高表达Galectin9表面蛋白的原代肺癌细胞。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1、S-CTL细胞的制备
质粒构建
1)通过基因合成，得到“免疫抑制检查点分子(信号肽+胞外段+跨膜区)-免疫刺激信号1胞内段-免疫刺激信号2(一般为TLR1或者TLR2)胞内段-CD3ζ”的DNA序列，DNA序列的首尾分别包含PmeI和Spe1限制性酶切位点。合成序列图谱如图1所示。
本发明实施例中所合成的基因序列请见SEQ NO.1(为制备靶向PD-1的S-CTL，即SP-CTL，而合成的DNA序列，结构为PD-1信号肽+胞外段+跨膜区-CD28-TLR1/2-CD3ζ)和SEQNO.2(为制备靶向CTLA-4的S-CTL，即SC-CTL，而合成的DNA序列，结构为CTLA-4信号肽+胞外段+跨膜区-CD28胞内段-TLR1/2胞内段-CD3ζ)和SEQ NO.3(为制备靶向TIM3的S-CTL，即ST-CTL，而合成的DNA序列，结构为TIM3信号肽+胞外段+跨膜区-4-1BB胞内段-TLR2胞内段-CD3ζ)和SEQ NO.4(为制备靶向LAG3的S-CTL，即SL-CTL，而合成的DNA序列，结构为LAG3信号肽+胞外段+跨膜区-4-1BB胞内段-TLR2胞内段-CD3ζ)。
S-CTL(Zeushield Cytotoxic T Lymphocyte)细胞，为基因修饰过表达S-CTL嵌合受体以增强免疫杀伤能力的T淋巴细胞，同时不仅局限于T细胞，过表达S-CTL嵌合受体的免疫效应细胞亦具有增强的免疫杀伤功能。S-CLT嵌合受体，即嵌合的免疫抑制检查点分子，胞外段和跨膜段为天然的人免疫抑制检查点受体分子如PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、CD160、2B4(CD244)、VISTA(C10orf54)、TIGIT、LAIR1等的相应区段，而胞内段为免疫共刺激信号分子包含TLR1/TLR2与TLR3-10、4-1BB、CD28、ICOS、CD27、CD2、OX40、CD30、CD40、LFA-1、CD7、CD2S、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83等胞内段的组合，及其与CD3zeta链连接组成；可特异性识别和杀伤表达免疫抑制检查点配体的肿瘤细胞和肿瘤相关的免疫抑制细胞。
SP-CTL，表达嵌合的PD-1受体的S-CTL细胞，特异性识别杀伤表达PD-L1的肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞或免疫抑制细胞。
SC-CTL，表达嵌合的CTLA-4受体的S-CTL细胞，特异性识别杀伤表达B7.1和/或B7.2的肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞或免疫抑制细胞。
ST-CTL，表达嵌合的TIM3受体的S-CTL细胞，特异性识别杀伤表达Galectin-9的肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞或免疫抑制细胞。
SL-CTL，表达嵌合的LAG3受体的S-CTL细胞，特异性识别杀伤表达MHCⅡ的肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞或免疫抑制细胞。
2)使用Thermo限制性内切酶Pme1和Spe1，分别通过双酶切获得合成的S-CTL DNA片段(SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4)和pWPXLd-EGFP载体的线性化DNA(含粘性末端)。
3)通过琼脂凝胶电泳回收，获得带粘性末端的线性化合成的S-CTL(SEQ NO.1、SEQNO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4)和pWPXLd-EGFP载体DNA片段。
4)通过T4 DNA连接酶(来自Invitrogent公司)，分别连接线性化的SEQ NO.1和pWPXLd-2A-EGFP、线性化的SEQ NO.2和pWPXLd-2A-EGFP，获得pWPXLd-S(PD1/CTLA-4/TIM3/LAG3)-CTL-2A-EGFP质粒，其质粒图谱参见附图2。
S-CTL慢病毒包装
1)培养293T细胞至密度达80-90％，将培养基更换为：DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
2)2-6小时后，用PEI分别将pWPXLd-S(PD1/CTLA-4/TIM3/LAG3)-CTL-2A-EGFP质粒与慢病毒辅助质粒(pMD2.G、psPAX2)共同转染入293T细胞，以空载体pWPXLd-EGFP与辅助质粒共转染作为对照组；
3)分别于转染后24、48和72小时，收集培养基上清，即S(PD1/CTLA-4/TIM3/LAG3)-CTL病毒上清，冻存于-80℃备用。
T细胞激活和慢病毒感染
1)通过Ficoll密度梯度法或红细胞裂解法分离出血液中的单核细胞；
2)通过MACS Pan-T磁珠分选出T细胞，用T细胞培养基(AIM-V加5％FBS、青霉素100U/ml和链霉素0.1mg/ml)稀释至浓度2.5×106个/ml待用；
3)通过包被CD2、CD3、CD28抗体的磁珠(美天旎)刺激T细胞，于37℃、5％CO2条件下的培养箱中培养刺激48h；
4)去除T细胞中磁珠，离心去上清，重悬；
5)加入S(PD1/CTLA-4/TIM3/LAG3)-CTL慢病毒上清和8μg/ml的polybrene和300IU/ml IL-2，病毒加入量为MOI＝10，于37℃，5％CO2条件下的培养箱中培养；
6)24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/ml IL-2的新鲜T细胞培养基重悬，于37℃、5％CO2条件下的培养箱中培养，每2-3天进行半量换液；
7)通过流式细胞技术，检测GFP阳性T细胞S-CTL(SC-CTL或ST-CTL)比例，结果如图3、图4所示。
实施例2、SP-CTL细胞对人白血病细胞系JURKAT的体外杀伤效应
1)在白血病细胞系JURKAT中转导表达荧光素酶(Luciferace)，构建JURKAT-GL报告细胞系；
2)分别将SC-CTL GFP阳性细胞与JURKAT-GL细胞以细胞数1：2比例混合共培养(对照组为加GFP T细胞，空白组为不加T细胞，每组设置三个复孔)；
3)18小时后，轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；
4)通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间设为1秒。
5)杀伤比例计算公式：100％×(空白孔读数-实验孔读数)/空白孔读数，SP-CTL细胞对人白血病细胞系JURKAT的体外杀伤比例如图5所示。
实施例3、SP-CTL细胞对非小细胞性肺癌H460的体外杀伤效应
1)在非小细胞性肺癌H460中转导表达荧光素酶(Luciferace)，构建H460-GL报告细胞系；
2)分别将SP-CTL GFP阳性细胞与H460-GL细胞以细胞数1：2比例混合共培养(对照组为加GFP T细胞，空白组为不加T细胞，每组设置三个复孔)；
3)18小时后，轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；
4)通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，，测定时间设为1秒。
5)杀伤比例计算公式：100％×(空白孔读数-实验孔读数)/空白孔读数(如图四)，SP-CTL细胞对非小细胞性肺癌H460的体外杀伤细胞比例如图6所示。
实施例4、SC-CTL细胞对人白血病细胞系NALM6的体外杀伤效应
1)在白血病细胞系NALM6中转导表达荧光素酶(Luciferace)，构建NALM6-GL报告细胞系；
2)分别将GFP阳性细胞数为3.5×104、1.75×104、8.6×103、4.4×103、2.2×103、1.1×103的SC-CTL病毒感染混合细胞与1×104个NALM6-GL细胞共培养(对照组为加GFP T细胞，空白组为不加T细胞，每组设置三个复孔)；
3)18小时后，轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；
4)通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间设为1秒。
5)杀伤比例计算公式：100％×(空白孔读数-实验孔读数)/空白孔读数，SC-CTL细胞对人白血病细胞系NALM6的体外杀伤比例如图7所示。
实施例5、SP-CTL细胞对人非小细胞性肺癌H460的体内杀伤效应
1)将1×105个H460-GL细胞皮下移植入免疫缺陷小鼠NOD/SCID IL2rg-/-体内；
2)10天后，在H460-GL荷瘤小鼠中注射SP-CTL GFP阳性细胞数为4×106的SP-CTL病毒感染混合细胞，15天后第二次注射4×106的SP-CTL病毒感染混合细胞,对照组为和上述相同操作的注射GFP T细胞的荷瘤小鼠，每个实验组设置三个重复；
3)于肿瘤移植后，第10、14、17、20、23、26、29、32、35天量取H460肿瘤块体积，结果如图8所示。
通过以上检测结果可知，本发明的SP-CTL细胞对表达相应配体的各种各样的肿瘤具有显著的体内、外杀伤效应。
实施例6、SP-CTL细胞的安全性实验
1)在不表达配体PD-L1的肺腺癌细胞系A549和慢性髓系白血病细胞系K562中转导表达荧光素酶(Luciferace)，构建A549-GL、K562-GL报告细胞系；
2)将SP-CTL GFP阳性细胞分别与A549-GL、K562-GL细胞以细胞数1：2比例混合共培养(对照组为加GFP T细胞，每组设置三个复孔)；
3)18小时后，轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；
4)通过多功能酶标仪检测SP-CTL细胞对A549-GL、K562-GL细胞的体外杀伤比例，其结果分别如图9、10所示。
由以上检测结果可知，SP-CTL细胞仅对表达PD-L1的靶细胞具有特异性杀伤作用，对不表达PD-L1的细胞没有杀伤作用，具有稳定的生物安全性。
实施例7、SP-CTL细胞体外识别杀伤肺癌、前列腺癌细胞
1)通过流式细胞技术检测肺癌细胞系(H1299、H460、H23、A549)、前列腺癌细胞系(PC3)细胞中配体PD-L1的表达情况，其结果图11所示；
2)将SP-CTL GFP阳性细胞分别与用荧光素酶GL标记的H1299、H460、H23、A549、PC3细胞(分别简称H1299-GL、H460-GL、H23-GL、A549-GL、PC3-GL)以细胞数1：1、1：2、1：4、1：8、1：16比例混合共培养(对照组为加GFP T细胞，每组设置三个复孔)；
3)18小时后，轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；
4)通过多功能酶标仪检测SP-CTL细胞对H1299-GL、H460-GL、H23-GL、A549-GL、PC3-GL细胞的体外杀伤比例，其结果如图12所示。
由以上检测结果可知，SP-CTL细胞可特异性识别、杀伤表达PD-L1的靶细胞(肺癌细胞、前列腺癌细胞等)。
实施例8、SP-CTL细胞体内识别杀伤原代肺癌细胞
1)用剪刀将原代肺癌组织样本剪成直径为3mm的肿瘤组织小块，皮下移植入免疫缺陷小鼠NOD/SCID IL2rg-/-体内，构建肺癌小鼠模型；
2)20天后，在肺癌小鼠模型中注射SP-CTL GFP阳性细胞数为4×106的SP-CTL病毒感染混合细胞，25天第二次注射4×106的SP-CTL病毒感染混合细胞,对照组为注射GFP T细胞的荷瘤小鼠，每个实验组设置三个重复；
3)于肿瘤移植后第20、24、28、20、23、26、29、32、35天，量取肺癌皮下肿瘤组织块的体积；在不同时间点，各实验组肿瘤组织块的平均体积结果如图13-A所示。
4)于肿瘤移植后第44天，从肺癌小鼠模型中获取肿瘤组织块；每个实验组三个重复的肿瘤组织块的尺寸比对图片如图13-B所示。
通过以上检测结果可知，本发明的SP-CTL细胞在原代肿瘤异质性、免疫抑制微环境等情况下，仍可在体内有效清除原代肺癌细胞。
实施例9、SP-CTL细胞体内识别杀伤原代胃癌细胞
1)用剪刀将原代胃癌组织样本剪成直径为3mm的肿瘤组织小块，皮下移植入免疫缺陷小鼠NOD/SCID IL2rg-/-体内，构建胃癌小鼠模型；
2)20天后，在胃癌小鼠模型中注射SP-CTL GFP阳性细胞数为4×106的SP-CTL病毒感染混合细胞，25天第二次注射4×106的SP-CTL病毒感染混合细胞,对照组为注射GFP T细胞的荷瘤小鼠，每个实验组设置三个重复；
3)于肿瘤移植后第44天，从胃癌小鼠模型中获取肿瘤组织块；每个实验组三个重复的肿瘤组织块的尺寸比对图片如图14-A所示，每个实验组的肿瘤组织块的平均重量结果如图14-B所示。
通过以上检测结果可知，本发明的SP-CTL细胞在原代肿瘤异质性、免疫抑制微环境等情况下，仍可在体内有效清除原代胃癌细胞。
实施例10、SP-CTL细胞体内识别杀伤原代骨肉瘤细胞
1)用剪刀将原代骨肉瘤组织样本剪成直径为3mm的肿瘤组织小块，皮下移植入免疫缺陷小鼠NOD/SCID IL2rg-/-体内，构建骨肉瘤小鼠模型；
2)12天后，在骨肉瘤小鼠模型中注射SP-CTL GFP阳性细胞数为4×106的SP-CTL病毒感染混合细胞，14天第二次注射4×106的SP-CTL病毒感染混合细胞,对照组为注射GFP T细胞的荷瘤小鼠，每个实验组设置六个重复；
3)于肿瘤移植后第38天，从骨肉瘤小鼠模型中获取肿瘤组织块；每个实验组六个重复的肿瘤组织块的尺寸比对图片如图15-A所示，每个实验组的肿瘤组织块的平均重量结果如图15-B所示。
通过以上检测结果可知，本发明的SP-CTL细胞在原代肿瘤异质性、免疫抑制微环境等情况下，仍可在体内有效清除原代骨肉瘤细胞。
实施例11、SC-CTL细胞体外特异性识别杀伤非霍金森淋巴瘤RL细胞
1)将SC-CTL GFP阳性细胞与非霍金森淋巴瘤RL细胞(细胞系均用荧光素酶GL标记)以细胞数2：1、1：1、0.5：1、0.25：1、1：16比例混合共培养(对照组为加GFP T细胞，每组设置三个复孔)；
2)18小时后，轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；
3)通过多功能酶标仪检测SC-CTL细胞对RL-GL细胞的体外杀伤比例，其结果如图16所示。
由以上检测结果可知，SC-CTL细胞可在体外特异性识别和杀伤非霍金森淋巴瘤细胞。
实施例12、SC-CTL细胞体内特异性识别杀伤非霍金森淋巴瘤RL细胞
1)将1×105个RL-GL细胞皮下移植入免疫缺陷小鼠NOD/SCID IL2rg-/-体内,构建RL-GL荷瘤小鼠模型；
2)2天后，在RL-GL荷瘤小鼠中注射SC-CTL GFP阳性细胞数为1×105的SC-CTL病毒感染混合细胞，对照组为注射GFP T细胞的荷瘤小鼠，每个实验组设置三个重复；
3)于肿瘤移植后第28天，从RL-GL荷瘤小鼠小鼠模型中获取肿瘤组织块；每个实验组两个重复的肿瘤组织块的尺寸比对图片如图17-A所示，每个实验组的肿瘤组织块的平均重量结果如图17-B所示。
通过以上检测结果可知，本发明的SC-CTL细胞可在体内有效清除非霍金森淋巴瘤细胞。
实施例13、mSC-CTL细胞体内特异性识别杀伤原代骨肉瘤细胞
通过分子克隆手段，用小鼠CTLA4胞外段+跨膜区(核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示)替换(h)SC-CTL的胞外段+跨膜区，获得mSC-CTL。本实施例目的在于评估mSC-CTL细胞在体内对原代骨肉瘤细胞的特异性识别杀伤作用。具体程序如下：
1)用剪刀将原代骨肉瘤组织样本剪成直径为3mm的肿瘤组织小块，皮下移植入免疫缺陷小鼠NOD/SCID IL2rg-/-体内(每只受体小鼠移植2小块)，构建骨肉瘤小鼠模型；
2)20天后，在骨肉瘤小鼠模型中注射mSC-CTL GFP阳性细胞数为1×105的mSC-CTL病毒感染混合细胞，对照组为注射GFP T细胞的荷瘤小鼠，每个实验组设置三个重复；
3)于肿瘤移植44天，从骨肉瘤小鼠模型中获取肿瘤组织块；每个实验组的肿瘤组织块的尺寸比对图片如图18-A所示，每个实验组的肿瘤组织块的平均重量结果如图18-B所示。
通过以上检测结果可知，本发明的mSC-CTL细胞在原代肿瘤异质性、免疫抑制微环境等情况下，仍可在体内有效清除原代骨肉瘤细胞。
实施例14、mSC-CTL和SP-CTL联合应用体内识别杀伤肿瘤细胞
通过分子克隆手段，用小鼠CTLA4胞外段+跨膜区(核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ.NO 5、6所示)替换(h)SC-CTL的胞外段+跨膜区，获得mSC-CTL；本实施例目的在于评估SP-CTL和mSC-CTL的联合应用对肿瘤细胞的清除作用，评估SC-CTL对小鼠CD80+/CD86+肿瘤辅助细胞(非肿瘤细胞)的识别杀伤作用，并评估该作用在肿瘤清除中的影响。具体程序如下：
1)用剪刀将原代肺癌组织样本剪成直径为3mm的肿瘤组织小块，皮下移植入免疫缺陷小鼠NOD/SCID IL2rg-/-体内，构建肺癌小鼠模型；
2)18天后，将肺癌小鼠模型分为四组，分别注射SP-CTL GFP阳性细胞数为2×105的SP-CTL病毒感染混合细胞(SP-CTL组)，mSC-CTL GFP阳性细胞数为2×105的SP-CTL病毒感染混合细胞(mSC-CTL组)，以及混合的2×105SP-CTL GFP阳性细胞和2×105mSC-CTL GFP阳性细胞(SP-CTL+mSC-CTL联合应用组)，对照组为注射GFP T细胞的荷瘤小鼠，每个实验组设置三个重复；
3)于肿瘤移植后第18、21、24、27、30、33、36天，量取肺癌皮下肿瘤块体积；在不同时间点，各实验组肿瘤组织块的平均体积结果如图19-A所示。
4)于肿瘤移植后第38天，从肺癌小鼠模型中获取肿瘤组织块，每个实验组的肿瘤组织块的平均重量结果如图19-B所示；该结果显示：本发明的SP-CTL联合mSC-CTL细胞可在体内有效且协同清除原代肺癌细胞，且效果比单独使用SP-CTL或mSC-CTL细胞更为显著。
5)取SP-CTL、mSC-CTL、SP-CTL+mSC-CTL联合应用组的肿瘤组织块，研磨、消化为单细胞，通过流式细胞技术检测肿瘤组织块中小鼠的CD80、CD86、MDSC(CD11b+Ly6G+)细胞的比例，其结果如图20-A、20-B、20-C所示。
由以上检测结果可得出如下结论：mSC-CTL不仅可识别杀伤肿瘤细胞，还可识别杀伤CD80+或/和CD86+细胞(除肿瘤细胞外的肿瘤辅助细胞)，而且mSC-CTL对CD80+/CD86+非肿瘤细胞的杀伤作用可有效抑制肿瘤生长。mSC-CTL联合SP-CTL可同时识别杀伤肿瘤细胞和CD80+/CD86+肿瘤辅助性细胞，阻断CD80+/CD86+肿瘤辅助性细胞对肿瘤细胞生长、迁移、耐药、免疫逃逸等的作用，达到更好的肿瘤清除效果。
实施例15、白血病和淋巴瘤细胞高表达Lag3配体MHC II(图21)
通过流式细胞技术检测人B细胞白血病系Nalm6、B细胞淋巴瘤细胞系Raji和RL细胞表面分子人HLA-DR(HLA-DR为MHC II分子关键组分)的表达情况，发现以上三种细胞系均特异性高表达人HLA-DR基因，即特异性高表达MHC II分子(Lag3配体)，表明人B细胞白血病和B细胞淋巴瘤的肿瘤细胞是SL-CTL的潜在靶点细胞。
实施例16、SL-CTL可特异性识别杀伤表达Lag3配体的肿瘤细胞(图22、23)
1)通过(实施例1)慢病毒包装pWPXLd-SL-CTL-2A-EGFP质粒并感染人原代T细胞，获得SL-CTL细胞。
2)将培养扩增后的SL-CTL细胞与靶细胞Nalm6-GL细胞在96孔板中以不同E(Effector)：T(Target)比2：1、1：1、1：2、1：4、1：8混合，共培养18小时。
3)轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；
4)通过多功能酶标仪检测SL-CTL细胞对A549-GL、K562-GL细胞的体外杀伤比例，其结果分别如图22所示。
5)SL-CTL细胞(空白对照组GFP-T)与Nalm6-GL细胞以1:1混合共培养18小时后，通过ELISA检测培养基上清中的白细胞介素2(IL-2)和干扰素γ(IFNγ)的水平，如图23所示。结果显示，与野生T细胞(GFP-T组)相比，SL-CTL细胞能够更高效地杀伤Nalm6靶细胞，而且SL-CTL细胞可分泌更多的炎症因子IL-2和IFNγ。
实施例17、体内的肿瘤细胞可上调自身TIM3配体Galectin9的表达(图24、25)
1)通过流式细胞技术检测A549细胞株不表达Galectin9；
2)将A549细胞移植入免疫缺陷小鼠(如NOD/SCID IL2rg-/-)体内，21天后，取小鼠肿瘤块，研磨裂解成单细胞悬液，检测Galectin9阳性细胞比例，如图24所示；
3)将#1、#2、#3三例病人来源的肺癌样本细胞/组织移植入免疫缺陷小鼠体内，60天后，取小鼠体内人体肺癌肿瘤组织块，研磨裂解为单细胞悬液，通过流式细胞技术检测肿瘤组织块中Galectin9阳性细胞比例，如图25所示。
4)本实施例数据表明，体内的肿瘤细胞(更接近于病人体内的肿瘤状态)相对于体外培养的肿瘤细胞系，特异性上调Galectin9(Tim的配体)表达，表明体内状态(亦包含病人体内状态的肿瘤细胞)的肿瘤细胞是ST-CTL细胞的潜在特异性靶细胞。
实施例18、ST-CTL细胞可在体内特异性识别和杀伤表达TIM3配体的肿瘤细胞(图26)
1)用剪刀将原代肺癌组织样本#2剪成直径为3mm的肿瘤组织小块，皮下移植入免疫缺陷小鼠NOD/SCID IL2rg-/-体内，构建肺癌小鼠模型；
2)20天后，在肺癌小鼠模型中注射ST-CTL GFP阳性细胞数为4×106的ST-CTL病毒感染混合细胞，25天第二次注射GFP阳性细胞数4×106的SP-CTL病毒感染混合细胞,对照组为注射GFP T细胞的荷瘤小鼠，空白(NC)组为无处理(不注射任何T细胞)的荷瘤小鼠，每个实验组设置三个重复；
3)于肿瘤移植后第45天，从三个组实验肺癌小鼠模型中获取肿瘤组织块；并称量肿瘤组织块重量，结果如图26所示。
4)结果发现ST-CTL细胞可在体内抑制肿瘤细胞的生长。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的产品、用途及其使用方式，但本发明并不局限于上述详细用途和使用方式，即不意味着本发明必须依赖上述详细用途和使用方式才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
本文所涉及基因序列的列表
SEQ ID NO.1 PD-1信号肽+胞外段+跨膜区-CD28-TLR1/2-CD3ζ
gtttAAACATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCTTCGAAaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgGAATTCCAGGCCAAAAGGAAGCCCAGGAAAGCTCCCAGCAGGAACATCTGCTATGATGCATTTGTTTCTTACAGTGAGCGGGATGCCTACTGGGTGGAGAACCTTATGGTCCAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCCCTTCAAGTTGTGTCTTCATAAGCGGGACTTCATTCCTGGCAAGTGGATCATTGACAATATCATTGACTCCATTGAAAAGAGCCACAAAACTGTCTTTGTGCTTTCTGAAAACTTTGTGAAGAGTGAGTGGTGCAAGTATGAACTGGACTTCTCCCATTTCCGTCTTTTTGATGAGAACAATGATGCTGCCATTCTCATTCTTCTGGAGCCCATTGAGAAAAAAGCCATTCCCCAGCGCTTCTGCAAGCTGCGGAAGATAATGAACACCAAGACCTACCTGGAGTGGCCCATGGACGAGGCTCAGCGGGAAGGATTTTGGGTAAATCTGAGAGCTGCGATAAAGTCCGCGATCGCAagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcACTAGT
SEQ ID NO.2 CTLA-4信号肽+胞外段+跨膜区-CD28胞内段-TLR1/2胞内段-CD3ζ
GTTTAAACATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCTACCAGGACCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGCATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCTACATGATGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCCAGTGGAAATCAAGTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGACTTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCAGTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCACATTCGAAaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccGAATTCAACATACCCTTAGAAGAACTCCAAAGAAATCTCCAGTTTCATGCATTTATTTCATATAGTGGGCACGATTCTTTCTGGGTGAAGAATGAATTATTGCCAAACCTAGAGAAAGAAGGTATGCAGATTTGCCTTCATGAGAGAAACTTTGTTCCTGGCAAGAGCATTGTGGAAAATATCATCACCTGCATTGAGAAGAGTTACAAGTCCATCTTTGTTTTGTCTCCCAACTTTGTCCAGAGTGAATGGTGCCATTATGAACTCTACTTTGCCCATCACAATCTCTTTCATGAAGGATCTAATAGCTTAATCCTGATCTTGCTGGAACCCATTCCGCAGTACTCCATTCCTAGCAGTTATCACAAGCTCAAAAGTCTCATGGCCAGGAGGACTTATTTGGAATGGCCCAAGGAAAAGAGCAAACGTGGCCTTTTTTGGGCTAACTTAAGGGCAGCCATTAATATTAAGCTGACAGAGCAAGCAAAGAAAGCGATCGCAagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcACTAGT
SEQ ID NO.3 TIM3信号肽+胞外段+跨膜区-4-1BB胞内段-TLR2胞内段-CD3ζgtttaaacatgttttcacatcttccctttgactgtgtcctgctgctgctgctgctactacttacaaggtcctcagaagtggaatacagagcggaggtcggtcagaatgcctatctgccctgcttctacaccccagccgccccagggaacctcgtgcccgtctgctggggcaaaggagcctgtcctgtgtttgaatgtggcaacgtggtgctcaggactgatgaaagggatgtgaattattggacatccagatactggctaaatggggatttccgcaaaggagatgtgtccctgaccatagagaatgtgactctagcagacagtgggatctactgctgccggatccaaatcccaggcataatgaatgatgaaaaatttaacctgaagttggtcatcaaaccagccaaggtcacccctgcaccgactcggcagagagacttcactgcagcctttccaaggatgcttaccaccaggggacatggcccagcagagacacagacactggggagcctccctgatataaatctaacacaaatatccacattggccaatgagttacgggactctagattggccaatgacttacgggactctggagcaaccatcagaataggcatctacatcggagcagggatctgtgctgggctggctctggctcttatcTTCGAAaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgGAATTCCAGGCCAAAAGGAAGCCCAGGAAAGCTCCCAGCAGGAACATCTGCTATGATGCATTTGTTTCTTACAGTGAGCGGGATGCCTACTGGGTGGAGAACCTTATGGTCCAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCCCTTCAAGTTGTGTCTTCATAAGCGGGACTTCATTCCTGGCAAGTGGATCATTGACAATATCATTGACTCCATTGAAAAGAGCCACAAAACTGTCTTTGTGCTTTCTGAAAACTTTGTGAAGAGTGAGTGGTGCAAGTATGAACTGGACTTCTCCCATTTCCGTCTTTTTGATGAGAACAATGATGCTGCCATTCTCATTCTTCTGGAGCCCATTGAGAAAAAAGCCATTCCCCAGCGCTTCTGCAAGCTGCGGAAGATAATGAACACCAAGACCTACCTGGAGTGGCCCATGGACGAGGCTCAGCGGGAAGGATTTTGGGTAAATCTGAGAGCTGCGATAAAGTCCGCGATCGCAagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcACTAGT
SEQ ID NO.4 LAG3信号肽+胞外段+跨膜区-4-1BB胞内段-TLR2胞内段-CD3ζgtttaaacatgtgggaggctcagttcctgggcttgctgtttctgcagccgctttgggtggctccagtgaagcctctccagccaggggctgaggtcccggtggtgtgggcccaggagggggctcctgcccagctcccctgcagccccacaatccccctccaggatctcagccttctgcgaagagcaggggtcacttggcagcatcagccagacagtggcccgcccgctgccgcccccggccatcccctggcccccggccctcacccggcggcgccctcctcctgggggcccaggccccgccgctacacggtgctgagcgtgggtcccggaggcctgcgcagcgggaggctgcccctgcagccccgcgtccagctggatgagcgcggccggcagcgcggggacttctcgctatggctgcgcccagcccggcgcgcggacgccggcgagtaccgcgccgcggtgcacctcagggaccgcgccctctcctgccgcctccgtctgcgcctgggccaggcctcgatgactgccagccccccaggatctctcagagcctccgactgggtcattttgaactgctccttcagccgccctgaccgcccagcctctgtgcattggttccggaaccggggccagggccgagtccctgtccgggagtccccccatcaccacttagcggaaagcttcctcttcctgccccaagtcagccccatggactctgggccctggggctgcatcctcacctacagagatggcttcaacgtctccatcatgtataacctcactgttctgggtctggagcccccaactcccttgacagtgtacgctggagcaggttccagggtggggctgccctgccgcctgcctgctggtgtggggacccggtctttcctcactgccaagtggactcctcctgggggaggccctgacctcctggtgactggagacaatggcgactttacccttcgactagaggatgtgagccaggcccaggctgggacctacacctgccatatccatctgcaggaacagcagctcaatgccactgtcacattggcaatcatcacagtgactcccaaatcctttgggtcacctggatccctggggaagctgctttgtgaggtgactccagtatctggacaagaacgctttgtgtggagctctctggacaccccatcccagaggagtttctcaggaccttggctggaggcacaggaggcccagctcctttcccagccttggcaatgccagctgtaccagggggagaggcttcttggagcagcagtgtacttcacagagctgtctagcccaggtgcccaacgctctgggagagccccaggtgccctcccagcaggccacctcctgctgtttctcatccttggtgtcctttctctgctccttttggtgactggagcctttggctttTTCGAAaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgGAATTCCAGGCCAAAAGGAAGCCCAGGAAAGCTCCCAGCAGGAACATCTGCTATGATGCATTTGTTTCTTACAGTGAGCGGGATGCCTACTGGGTGGAGAACCTTATGGTCCAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCCCTTCAAGTTGTGTCTTCATAAGCGGGACTTCATTCCTGGCAAGTGGATCATTGACAATATCATTGACTCCATTGAAAAGAGCCACAAAACTGTCTTTGTGCTTTCTGAAAACTTTGTGAAGAGTGAGTGGTGCAAGTATGAACTGGACTTCTCCCATTTCCGTCTTTTTGATGAGAACAATGATGCTGCCATTCTCATTCTTCTGGAGCCCATTGAGAAAAAAGCCATTCCCCAGCGCTTCTGCAAGCTGCGGAAGATAATGAACACCAAGACCTACCTGGAGTGGCCCATGGACGAGGCTCAGCGGGAAGGATTTTGGGTAAATCTGAGAGCTGCGATAAAGTCCGCGATCGCAagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcACTAGT
SEQ IDNO.5 mCTLA4胞外段+跨膜区
ATGGCTTGTCTTGGACTCCGGAGGTACAAAGCTCAACTGCAGCTGCCTTCTAGGACTTGGCCTTTTGTAGCCCTGCTCACTCTTCTTTTCATCCCAGTCTTCTCTGAAGCCATACAGGTGACCCAACCTTCAGTGGTGTTGGCTAGCAGCCATGGTGTCGCCAGCTTTCCATGTGAATATTCACCATCACACAACACTGATGAGGTCCGGGTGACTGTGCTGCGGCAGACAAATGACCAAATGACTGAGGTCTGTGCCACGACATTCACAGAGAAGAATACAGTGGGCTTCCTAGATTACCCCTTCTGCAGTGGTACCTTTAATGAAAGCAGAGTGAACCTCACCATCCAAGGACTGAGAGCTGTTGACACGGGACTGTACCTCTGCAAGGTGGAACTCATGTACCCACCGCCATACTTTGTGGGCATGGGCAACGGGACGCAGATTTATGTCATTGATCCAGAACCATGCCCGGATTCTGACTTCCTCCTTTGGATCCTTGTCGCAGTTAGCTTGGGGTTGTTTTTTTACAGTTTCCTGGTCACT
SEQ.ID NO.6 mCTLA4胞外段+跨膜区
MACLGLRRYKAQLQLPSRTWPFVALLTLLFIPVFSEAIQVTQPSVVLASSHGVASFPCEYSPSHNTDEVRVTVLRQTNDQMTEVCATTFTEKNTVGFLDYPFCSGTFNESRVNLTIQGLRAVDTGLYLCKVELMYPPPYFVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILVAVSLGLFFYSFLVT
序列表
<110> 深圳市体内生物医药科技有限公司
<120> 一种分子、表达其的细胞及其制备方法和用途
<130> PCT170422PPC
<160> 6
<170> PatentIn版本3.3
<210> 1
<211> 1547
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtttaaacat gcagatccca caggcgccct ggccagtcgt ctgggcggtg ctacaactgg 60
gctggcggcc aggatggttc ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct 120
ccccagccct gctcgtggtg accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca 180
acacatcgga gagcttcgtg ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca 240
agctggccgc cttccccgag gaccgcagcc agcccggcca ggactgccgc ttccgtgtca 300
cacaactgcc caacgggcgt gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcaatgaca 360
gcggcaccta cctctgtggg gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc 420
tgcgggcaga gctcagggtg acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc 480
cctcacccag gccagccggc cagttccaaa ccctggtggt tggtgtcgtg ggcggcctgc 540
tgggcagcct ggtgctgcta gtctgggtcc tggccgtcat cttcgaaaaa cggggcagaa 600
agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg 660
aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctggaattcc 720
aggccaaaag gaagcccagg aaagctccca gcaggaacat ctgctatgat gcatttgttt 780
cttacagtga gcgggatgcc tactgggtgg agaaccttat ggtccaggag ctggagaact 840
tcaatccccc cttcaagttg tgtcttcata agcgggactt cattcctggc aagtggatca 900
ttgacaatat cattgactcc attgaaaaga gccacaaaac tgtctttgtg ctttctgaaa 960
actttgtgaa gagtgagtgg tgcaagtatg aactggactt ctcccatttc cgtctttttg 1020
atgagaacaa tgatgctgcc attctcattc ttctggagcc cattgagaaa aaagccattc 1080
cccagcgctt ctgcaagctg cggaagataa tgaacaccaa gacctacctg gagtggccca 1140
tggacgaggc tcagcgggaa ggattttggg taaatctgag agctgcgata aagtccgcga 1200
tcgcaagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc 1260
agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac 1320
gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt 1380
acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg 1440
agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg 1500
acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg cactagt 1547
<210> 2
<211> 1526
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gtttaaacat ggcttgcctt ggatttcagc ggcacaaggc tcagctgaac ctggctacca 60
ggacctggcc ctgcactctc ctgttttttc ttctcttcat ccctgtcttc tgcaaagcaa 120
tgcacgtggc ccagcctgct gtggtactgg ccagcagccg aggcatcgcc agctttgtgt 180
gtgagtatgc atctccaggc aaagccactg aggtccgggt gacagtgctt cggcaggctg 240
acagccaggt gactgaagtc tgtgcggcaa cctacatgat ggggaatgag ttgaccttcc 300
tagatgattc catctgcacg ggcacctcca gtggaaatca agtgaacctc actatccaag 360
gactgagggc catggacacg ggactctaca tctgcaaggt ggagctcatg tacccaccgc 420
catactacct gggcataggc aacggaaccc agatttatgt aattgatcca gaaccgtgcc 480
cagattctga cttcctcctc tggatccttg cagcagttag ttcggggttg tttttttata 540
gctttctcct cacattcgaa aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga 600
acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac 660
gcgacttcgc agcctatcgc tccgaattca acataccctt agaagaactc caaagaaatc 720
tccagtttca tgcatttatt tcatatagtg ggcacgattc tttctgggtg aagaatgaat 780
tattgccaaa cctagagaaa gaaggtatgc agatttgcct tcatgagaga aactttgttc 840
ctggcaagag cattgtggaa aatatcatca cctgcattga gaagagttac aagtccatct 900
ttgttttgtc tcccaacttt gtccagagtg aatggtgcca ttatgaactc tactttgccc 960
atcacaatct ctttcatgaa ggatctaata gcttaatcct gatcttgctg gaacccattc 1020
cgcagtactc cattcctagc agttatcaca agctcaaaag tctcatggcc aggaggactt 1080
atttggaatg gcccaaggaa aagagcaaac gtggcctttt ttgggctaac ttaagggcag 1140
ccattaatat taagctgaca gagcaagcaa agaaagcgat cgcaagagtg aagttcagca 1200
ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc 1260
taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg 1320
ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata 1380
agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc 1440
acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca 1500
tgcaggccct gccccctcgc actagt 1526
<210> 3
<211> 1628
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gtttaaacat gttttcacat cttccctttg actgtgtcct gctgctgctg ctgctactac 60
ttacaaggtc ctcagaagtg gaatacagag cggaggtcgg tcagaatgcc tatctgccct 120
gcttctacac cccagccgcc ccagggaacc tcgtgcccgt ctgctggggc aaaggagcct 180
gtcctgtgtt tgaatgtggc aacgtggtgc tcaggactga tgaaagggat gtgaattatt 240
ggacatccag atactggcta aatggggatt tccgcaaagg agatgtgtcc ctgaccatag 300
agaatgtgac tctagcagac agtgggatct actgctgccg gatccaaatc ccaggcataa 360
tgaatgatga aaaatttaac ctgaagttgg tcatcaaacc agccaaggtc acccctgcac 420
cgactcggca gagagacttc actgcagcct ttccaaggat gcttaccacc aggggacatg 480
gcccagcaga gacacagaca ctggggagcc tccctgatat aaatctaaca caaatatcca 540
cattggccaa tgagttacgg gactctagat tggccaatga cttacgggac tctggagcaa 600
ccatcagaat aggcatctac atcggagcag ggatctgtgc tgggctggct ctggctctta 660
tcttcgaaaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac 720
cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag 780
gaggatgtga actggaattc caggccaaaa ggaagcccag gaaagctccc agcaggaaca 840
tctgctatga tgcatttgtt tcttacagtg agcgggatgc ctactgggtg gagaacctta 900
tggtccagga gctggagaac ttcaatcccc ccttcaagtt gtgtcttcat aagcgggact 960
tcattcctgg caagtggatc attgacaata tcattgactc cattgaaaag agccacaaaa 1020
ctgtctttgt gctttctgaa aactttgtga agagtgagtg gtgcaagtat gaactggact 1080
tctcccattt ccgtcttttt gatgagaaca atgatgctgc cattctcatt cttctggagc 1140
ccattgagaa aaaagccatt ccccagcgct tctgcaagct gcggaagata atgaacacca 1200
agacctacct ggagtggccc atggacgagg ctcagcggga aggattttgg gtaaatctga 1260
gagctgcgat aaagtccgcg atcgcaagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg 1320
cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt 1380
acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga 1440
agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca 1500
gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg 1560
gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc 1620
gcactagt 1628
<210> 4
<211> 2387
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtttaaacat gtgggaggct cagttcctgg gcttgctgtt tctgcagccg ctttgggtgg 60
ctccagtgaa gcctctccag ccaggggctg aggtcccggt ggtgtgggcc caggaggggg 120
ctcctgccca gctcccctgc agccccacaa tccccctcca ggatctcagc cttctgcgaa 180
gagcaggggt cacttggcag catcagccag acagtggccc gcccgctgcc gcccccggcc 240
atcccctggc ccccggccct cacccggcgg cgccctcctc ctgggggccc aggccccgcc 300
gctacacggt gctgagcgtg ggtcccggag gcctgcgcag cgggaggctg cccctgcagc 360
cccgcgtcca gctggatgag cgcggccggc agcgcgggga cttctcgcta tggctgcgcc 420
cagcccggcg cgcggacgcc ggcgagtacc gcgccgcggt gcacctcagg gaccgcgccc 480
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ctctcagagc ctccgactgg gtcattttga actgctcctt cagccgccct gaccgcccag 600
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cctggggctg catcctcacc tacagagatg gcttcaacgt ctccatcatg tataacctca 780
ctgttctggg tctggagccc ccaactccct tgacagtgta cgctggagca ggttccaggg 840
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ttgacaatat cattgactcc attgaaaaga gccacaaaac tgtctttgtg ctttctgaaa 1800
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acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg 2280
agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg 2340
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<210> 5
<211> 546
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
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ccttttgtag ccctgctcac tcttcttttc atcccagtct tctctgaagc catacaggtg 120
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tcaccatcac acaacactga tgaggtccgg gtgactgtgc tgcggcagac aaatgaccaa 240
atgactgagg tctgtgccac gacattcaca gagaagaata cagtgggctt cctagattac 300
cccttctgca gtggtacctt taatgaaagc agagtgaacc tcaccatcca aggactgaga 360
gctgttgaca cgggactgta cctctgcaag gtggaactca tgtacccacc gccatacttt 420
gtgggcatgg gcaacgggac gcagatttat gtcattgatc cagaaccatg cccggattct 480
gacttcctcc tttggatcct tgtcgcagtt agcttggggt tgttttttta cagtttcctg 540
gtcact 546
<210> 6
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His
50 55 60
Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln
65 70 75 80
Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly
85 90 95
Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Val Thr
180

Claims (9)

1.一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述胞外结构域和任选地跨膜结构域为免疫抑制检查点受体分子的相应结构域或基于该结构域进行的基因改造，所述胞内结构域为一个或多个免疫激活信号结构域；
所述免疫检查点受体分子为PD-1；
当免疫检查点受体分子为PD-1时，编码所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子的DNA序列如SEQ NO.1所示。
2.编码如权利要求1所述的嵌合的免疫抑制检查点受体分子的核酸。
3.一种核酸构建体，其包含如权利要求2所述的核酸，以及与之可操作连接、可指导所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子在宿主细胞中表达的一个或多个控制序列。
4.一种表达载体，其包含如权利要求3所述的核酸构建体。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体。
6.一种转化的细胞，其包含如权利要求2所述的核酸，或者其中转化了如权利要求3所述的核酸构建体或如权利要求4或5所述的表达载体。
7.如权利要求6所述的转化的细胞，其特征在于，所述转化的细胞为T细胞、B细胞或NK细胞。
8.制备如权利要求6或7所述的转化的细胞的方法，其包括：向细胞基因组中引入如权利要求2所述的核酸，或者转化如权利要求3所述的核酸构建体或如权利要求4或5所述的表达载体的步骤。
9.如权利要求1所述的嵌合的免疫抑制检查点受体分子、如权利要求2所述的核酸、如权利要求3所述的核酸构建体、如权利要求4或5所述的表达载体或如权利要求6或7所述的转化的细胞在制备与免疫抑制检查点受体分子对应的配体的表达相关的疾病的药物中的用途；
所述配体选自PD-L1；
所述疾病为表达免疫抑制检查点受体分子对应的配体的肿瘤；
所述肿瘤为表达PD-L1的肿瘤；
所述肿瘤选自肺癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌和黑色素瘤。
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