CN108137670A - Ny-eso-1特异性tcr及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及NY‑ESO‑1特异性TCR氨基酸序列及其使用方法。

Description

NY-ESO-1特异性TCR及其使用方法
背景技术
治疗癌症患者的一种方法是通过表达用于过继细胞疗法(ACT)的嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体(TCR)对T细胞进行基因修饰以靶向表达在肿瘤细胞的抗原。CAR是这样的抗原受体，其被设计成以非人白细胞抗原依赖性的方式识别细胞表面抗原。尝试使用表达CAR的遗传修饰细胞来治疗某些类型的癌症已经取得了令人瞩目的成功，特别是在表达CD19的液体肿瘤中。参见，例如，Porter David L,Levine Bruce L,Kalos Michael,Bagg Adam,June Carl H:嵌合淋巴性白血病中嵌合抗原受体修饰的T细胞(Chimericantigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia).The NewEngland journal of medicine 365(8):725-33,2011年8月.；Kalos Michael,LevineBruce L,Porter David L,Katz Sharyn,Grupp Stephan A,Bagg Adam,June Carl H:具有嵌合抗原受体的T细胞具有有效的抗肿瘤效果并且可以在晚期白血病中建立记忆(T cellswith chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and canestablish memory in patients with advanced Leukemia).Science translationalmedicine 3(95):95ra73,2011年8月。同样，自体T细胞经工程改造以表达对来源于癌-睾丸抗原NY-ESO-1的MHC限制肽具有特异性的重组T细胞，其对多发性骨髓瘤和肉瘤已经显示出令人印象深刻的临床疗效。参见，例如，Rapoport AP,Stadtmauer EA,Binder-Scholl GK,Goloubeva O,Vogl DT,Lacey SF,Badros AZ,Garfall A,Weiss B,Finklestein J,Kulikovskaya I,Sinha SK,Kronsberg S,Gupta M,Bond S,Melchiori L,Brewer JE,Bennett AD,Gerry AB,Pumphrey NJ,Williams D,Tayton-Martin HK,Ribeiro L,HoldichT,Yanovich S,Hardy N,Yared J,Kerr N,Philip S,Westphal S,Siegel DL,Levine BL,Jakobsen BK,Kalos M,June CH.NY-ESO-1特异性工程改造的T细胞在骨髓瘤中介导持续的抗原特异性抗肿瘤作用(NY-ESO-1-specific TCR-engineered T cells mediatesustained antigen-specific antitumor effects in myeloma).Nat Med.2015年8月；21(8):914-21；Robbins PF,Kassim SH,Tran TL,Crystal JS,Morgan RA,Feldman SA,YangJC,Dudley ME,Wunderlich JR,Sherry RM,Kammula US,Hughes MS,Restifo NP,RaffeldM,Lee CC,Li YF,El-Gamil M,Rosenberg SA.使用经NY-ESO-1反应性T细胞受体基因工程的淋巴细胞的初步试验：长期随访并与应答关联(Pilot trial using lymphocytesgenetically engineered with an NY-ESO-1-reactive T-cell receptor:long-termfollow-up and correlates with response).Clin Cancer Res.2015年3月1日；21(5):1019-27.)。
然而，同样也遇到了缺点，即毒性，尤其是在具有体外增强亲和性的rTCR的情况中(参见，例如,Linette GP,Stadtmauer EA,Maus MV,Rapoport AP,Levine BL,Emery L,Litzky L,Bagg A,Carreno BM,Cimino PJ,Binder-Scholl GK,Smethurst DP,Gerry AB,Pumphrey NJ,Bennett AD,Brewer JE,Dukes J,Harper J,Tayton-Martin HK,JakobsenBK,Hassan NJ,Kalos M,June CH.骨髓瘤和黑素瘤中亲和性增强T细胞的肌联蛋白交叉反应性和心血管毒性(Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity ofaffinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma).Blood.2013年8月8日；122(6):863-71.)。因此，尽管有上述努力，仍然需要更有效且安全的方法来将T细胞重定向至肿瘤或其他感兴趣的靶标。
当前，有几种方法被用于选择用于过继细胞疗法的T细胞受体，包括免疫人类HLA转基因小鼠和从患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中分离TCR(例如，参见；Linnemann C,Heemskerk B,Kvistborg P,Kluin RJ,Bolotin DA,Chen X,Bresser K,Nieuwland M,Schotte R,Michels S,Gomez-Eerland R,Jahn L,Hombrink P,Legrand N,Shu CJ,Mamedov IZ,Velds A,Blank CU,Haanen JB,Turchaninova MA,Kerkhoven RM,Spits H,Hadrup SR,Heemskerk MH,Blankenstein T,Chudakov DM,Bendle GM,Schumacher TN.通过TCR基因捕获高通量鉴定抗原特异性TCR(High-throughput identification ofantigen-specific TCRs by TCR gene capture).Nat Med.2013年11月；19(11):1534-41.；Rosati SF,Parkhurst MR,Hong Y,Zheng Z,Feldman SA,Rao M,Abate-Daga D,BeardRE,Xu H,Black MA,Robbins PF,Schrump DA,Rosenberg SA,Morgan RA.靶向NY-ESO-1的新型小鼠T细胞受体(A novel murine T-cell receptor targeting NY-ESO-1).JImmunother.2014年4月；37(3):135-46。然而，所有这些方法都有潜在的缺点，其鉴定仅在给定的HLA环境中发挥功能的TCR，而这限制了其对某些患者群体的有效性。
TCR是免疫球蛋白超家族的异二聚体细胞表面蛋白质，其与参与介导信号转导的CD3复合物的非变异蛋白质相关联。TCR以αβ和γδ形式存在，两者在结构上相似，但是表达它们的T细胞具有不同的解剖学位置和功能。受体的胞外部分包括两个近膜恒定区，并且两个远膜可变区具有与抗体互补决定区(CDR)类似的多态性环。正是这些环形成了TCR分子的结合位点并确定了肽的特异性。具体而言，CDR1和CDR2主要与MHC分子相互作用，其中CDR3与通过MHC呈递的肽配体特异性地相互作用(Shore DA,Issafras H,Landais E,Teyton L,Wilson IA.CD8的晶体结构与YTS156.7.7Fab复合并且与限定CD8αβ与MHC I型结合模型的其它CD8抗体相互作用(The crystal structure of CD8in complex with YTS156.7.7Faband interaction with other CD8antibodies define the binding mode ofCD8alphabeta to MHC class I).J Mol Biol.2008年12月31日；384(5):1190-202；BorgNA,Ely LK,Beddoe T,Macdonald WA,Reid HH,Clements CS,Purcell AW,Kjer-NielsenL,Miles JJ,Burrows SR,McCluskey J,Rossjohn J.免疫线性T细胞受体的CDR3区域决定肽MHC识别的“能量特征”(The CDR3regions of an immunodominant T cell receptordictate the'energetic landscape'of peptide-MHC recognition).Nat Immunol.2005年2月；6(2):171-80)。对于潜在TCR多样性的数学估计的范围是1012–1015个不同的TCR，然而，为了促进自身耐受、胸腺正和负选择，将个体中原初TCRαβ库(repertoire)的大小降至约2x107TCR/人(Davis,M.M.和Chien,Y.H.刊于《基础免疫学(Fundamental Immunology)》341-366,Lippincott-Raven出版社,费城1999)；Arstila,T.P.等,对人αβT细胞受体多样性的直接估计(A direct estimate of the humanαβT cell receptor diversity).Science1999:286958-961.)。因为TCRα和β链的CDR3区域赋予与MHC呈递的肽相互作用的特异性，CDR3序列变异的表征提供了对抗原选择的T细胞库中T细胞多样性的度量(Liaskou E,Henriksen EK,Holm K,Kaveh F,Hamm D,Fear J,Viken MK,Hov JR,Melum E,Robins H,Olweus J,Karlsen TH,Hirschfield GM.就慢性肝炎基板的高通量T细胞受体测序显示疾病相关库(High-throughput T-cell receptor sequencing across chronic liverdiseases reveals distinct disease-associated repertoires).Hepatology.2015年8月7日.doi:10.1002/hep.28116；Fang H,Yamaguchi R,Liu X,Daigo Y,Yew PY,TanikawaC,Matsuda K,Imoto S,Miyano S,Nakamura Y.通过使用下一代测序对T细胞α和β链的受体深度cDNA测序定量T细胞库(Quantitative T cell repertoire analysis by deep cDNAsequencing of T cell receptorαandβchains using next-generation sequencing).Oncoimmunology.2015年1月7日；3(12):e968467)。有趣的是，TCR库中存在偏倚，因为常常在不同个体间可以观察到相同或近似相同的TCR库，即所谓的“公共TCR”(public TCR)(Miles JJ,Douek DC,Price DA.αβT细胞库中的偏倚：对疾病发病机理和疫苗接种的影响(Bias in theαβT-cell repertoire:implications for disease pathogenesis andvaccination).Immunol Cell Biol.2011年3月；89(3):375-87)。已经假设了这些公共TCR序列的几个特定分子特征(Venturi V,Price DA,Douek DC,Davenport MP.公共T细胞应答的分子偏倚？(The molecular basis for public T-cell responses？)Nat RevImmunol.2008年3月；8(3):231-8)。MHC I型和II型配体也是免疫球蛋白超家族蛋白，但是其专门用于抗原呈递，具有多态性肽结合位点，这使其将短肽片段的多样化阵列呈递至APC细胞表面。
许多论文描述了rTCR异二聚体的生产，其中包括连接相应亚基的天然二硫桥(Garboczi,等,(1996),Nature 384(6605):134-41；Garboczi,等,(1996),J Immunol 157(12):5403-10；Chang等,(1994),PNAS USA 91:11408-11412；Davodeau等,(1993),J.Biol.Chem.268(21):15455-15460；Golden等,(1997),J.Imm.Meth.206:163-169；美国专利号6,080,840)。然而，尽管TCR特异性抗体可以识别这些TCR，但它们均显示无法识别其天然配体(若不是相对较高的浓度)和/或不稳定。
WO 99/60120中描述了一种可溶性TCR，其经正确地折叠，从而使能够识别其天然配体，在一段时间内稳定，并且可以合理的量生产。该TCR包含TCRα或γ链胞外结构域，其通过一对C末端二聚化肽(如亮氨酸拉链)与TCRβ或δ链胞外结构域分别二聚化。这种生产rTCR的策略通常适用于所有的TCR。
NY-ESO-1免疫已经被用于诱导抗体和CD8+CTL应答，但在这些研究中观察到对癌症进展的影响很小(Jager等,Proc Natl Acad Sci USA.2000；97:12198)。过继免疫疗法，即转移具有高抗肿瘤活性的淋巴细胞，可以介导已建立的大肿瘤消退，但是生成HLA相配的反应性淋巴细胞是困难、昂贵且劳动密集的(Rosenberg等,N Engl J Med.1988；319:1676；Walter等,N Engl J Med.1995；333:1038；Mackinnon等,Blood.1995；86:1261；Papadopoulos等,N Engl J Med.1994；330:1185；Dudley等,J Immunother.2003；26:332；Dudley等,Nat Rev Cancer.2003；3:666)。肿瘤浸润淋巴细胞已用于细胞转移治疗，并已经能够识别各种黑素瘤肿瘤相关抗原(TAA)。黑素瘤中公认的TAA是MART-1，其是一种黑素细胞分化抗原，并且在约90％的黑素瘤中表达，而NY-ESO-1在约34％的黑素瘤中表达(Chen等,Proc Natl Acad Sci USA.1997；94:1914)。
Zhao等,(J.Immunol.,2005年4月1日；174(7):4415–4423)描述了分离对NY-ESO-1CT抗原具有特异性的TCR，并将其用于构建逆转录病毒载体，而该逆转录病毒载体能够将抗-NY-ESO-1效应物功能转移至原代人T细胞。针对常见TAA导向的rTCR基因载体具有这样的潜能，其能够用于采用癌症患者自身的转导T细胞治疗大量癌症患者，而不需要从每位患者专门鉴定抗肿瘤T细胞。然而，当前基于rTCR研发ACT的所有方法均依赖于HLA，并且因此受限于某些患者群体。
发明内容
本公开一方面提供了嵌合异二聚体T细胞受体(TCR)多肽，其包括：a)第一多肽，其包括TCRβ链可变区、TCRβ链恒定区、以及任选地跨膜结构域和胞质信号转导结构域；b)第二多肽，其包括TCRα链可变区、TCRα链恒定区、以及任选地跨膜结构域和胞质信号转导结构域；其中，异二聚体TCR特异性结合NY-ESO-1/MHC复合物，其中TCRβ链可变区包括SEQ IDNO:9所示的TCRβ链可变区氨基酸序列，或与其具有至少85％同一性的功能性片段；其中TCRα链可变区包括SEQ ID NO:8所示的同源TCRα链可变区氨基酸序列，或与其具有至少85％同一性的功能性片段；并且其中第一多肽和第二多肽之间存在至少一个二硫键。在某些嵌合TCR的实施方式，β链可变区CDR3包括氨基酸序列CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)。在本文所述嵌合异二聚体TCR的某些其它实施方式中，第一多肽和第二多肽不包括所述跨膜结构域和所述细胞质信号结构域，并且因此该嵌合异二聚体TCR是可溶的。本公开还提供了核酸，其包括编码本文所述嵌合异二聚体TCR的多核苷酸序列。在其它实施方式中，本公开提供了表达载体，其包括编码本文所述嵌合异二聚体TCR的核酸。在某些实施方式中，表达载体是逆转录病毒载体，如慢病毒。在某些实施方式中，本公开还提供了包括本文所述的核酸或本文所述的载体的分离的细胞，其编码任何工程改造的TCR，如本文所述的嵌合异二聚体TCR。在某些实施方式中，分离的细胞是T细胞。
本公开还提供了药物组合物，其包括嵌合异二聚体TCR，或本文所述工程改造的TCR中的任一种，或本文所述表达嵌合异二聚体TCR的载体中的任一种，或编码本文所述嵌合异二聚体TCR的核酸，或经修饰表达本文所述嵌合异二聚体TCR的分离的细胞。
本公开的另一方面提供了单链TCR，其包括TCRβ链可变区、TCRα链可变区、恒定区、以及任选地跨膜结构域和胞质信号转导结构域；其中，TCRβ链可变区CDR3包括选自CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2)、CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)和CASRLAGQETQYF(SEQ IDNO:4)的氨基酸序列；其中，单链TCR对NY-ESO-1/MHC复合物具有特异性。在单链TCR的某些所述方法中，TCRβ链可变区包括SEQ ID NO:9中所示的TCRβ链可变区氨基酸序列，或与其具有至少85％同一性的功能性片段或；并且TCRα链可变区包括SEQ ID NO:8中所示的同源TCRα链可变区氨基酸序列，或与其具有至少85％同一性的功能性片段。
在某些实施方式中，单链TCR是可溶性单链TCR。在这一方面，单链TCR不包括所述跨膜结构域和所述胞质信号转导结构域。
本发明另一方面提供包括多核苷酸序列的核酸，所述多核苷酸编码本文所述的单链TCR。在某些实施方式中，核酸被包括在表达载体中。在某些实施方式中，表达载体是逆转录病毒载体，如慢病毒载体。本公开提供了分离的细胞，其包括核酸或编码本文所述单链TCR的载体。在某些实施方式中，分离的细胞是T细胞。本公开还提供了药物组合物，其包括本文所述单链TCR，编码或还表达单链TCR的载体，编码单链TCR的核酸，和或表达单链TCR的分离的细胞。
本发明的另一方面提供了治疗或抑制哺乳动物对象中NY-ESO-1癌症增殖的方法，其包括将治疗性组合物给予对象，所述组合物包括表达工程改造的TCR(如本文所述的嵌合异二聚体TCR或单链TCR)的分离的细胞；其中所述治疗性组合物以有效治疗对象癌症的量给予。
本公开的另一方面提供了一种治疗方法，其包括：(a)鉴定可能受益于NY-ESO-1癌症疗法的哺乳动物对象，其包括确定来自哺乳动物对象的样品中是否存在如下物质：(i)编码TCR多肽的多核苷酸，所述TCR多肽包括对NY-ESO-1具有特异性的TCRβ链可变区互补决定区3(VβCDR3)，其中，VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)；或CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)，或同时包括这两者；或者(ii)包括对NY-ESO-1具有特异性的VβCDR3的TCR多肽，其中，VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)或CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)，或同时包括这两者；其中(i)和/或(ii)的存在表明对象可能受益于NY-ESO-1癌症疗法；并且(b)将所述NY-ESO-1癌症疗法给予所述哺乳动物对象。在某些方法的实施方式中，VβCDR3包括选自下组的氨基酸序列：CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2)、CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)和CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)、或两种或多种前述VβCDR3的组合。在某些实施方式中，NY-ESO-1癌症疗法包括给予编码NY-ESO-1多肽的载体。在某些实施方式中，载体包括树突细胞，其靶向逆转录病毒载体，如慢病毒载体。在另一些实施方式中，方法还包括向所述对象给予佐剂。在这个方面，佐剂可以是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。在某些实施方式中，GLA配置在稳定的水包油乳液中，或可以在水性制剂中。在某些实施方式中，NY-ESO-1癌症疗法包括向对象给予包括GLA的组合物，所述组合物包括：
(a)下式所示GLA：
其中：
R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；且
R2和R4是C12-C20烷基；以及
(b)药学上可接受的运载体或赋形剂；
其中，组合物并包括抗原。在某些实施方式中，R1、R3、R5和R6是十一烷基，而R2和R4是十三烷基。本文所述方法可以用于任何哺乳动物的治疗，特别是人对象。在某些实施方式中，所述GLA组合物是水性制剂。在其它实施方式中，组合物是如下形式：水包油乳液、油包水乳液、脂质体、胶束制剂或微颗粒。在一实施方式中，待通过该方法治疗的癌症包括固体肿瘤。在该方法，癌症选自：肉瘤、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食管癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑素瘤、肝细胞癌、头颈部癌、胃癌、子宫内膜癌、结直肠癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、骨髓性白血病和急性淋巴母细胞性白血病。在某些实施方式中，该组合物通过皮下、皮内、肌肉内、瘤内或静脉内注射给予。在某些实施方式中，该组合物与一种或多种其它治疗剂或治疗联用。在一实施方式中，治疗剂是免疫检验点抑制剂。在其他实施方式中，治疗剂是激活共同刺激通路的抗体，如抗-CD50抗体。在其他实施方式中，治疗剂是癌症治疗剂，如选自下组的癌症治疗剂：泰索帝、卡铂、曲妥珠单抗、表柔比星、环磷酰胺、顺铂、多西他赛、多柔比星、依托泊甙、5-FU、吉西他滨、氨甲蝶呤和紫杉醇、米托蒽醌、大环内酯B、靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体7A7.27、伏立诺他、罗咪酯肽、二十二碳六烯酸、硼替佐米、紫草素和溶瘤细胞病毒。在其它实施方式中，一种或多种其他治疗性处理是放疗。
本公开的另一方面提供了一种鉴定可能受益于NY-ESO-1癌症疗法的哺乳动物对象的方法，其包括：(a)鉴定来自哺乳动物对象的样品中是否存在(i)编码TCR多肽的多核苷酸，所述TCR多肽包括对NY-ESO-1具有特异性的VβCDR3，其中，该VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)或CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)；或(ii)包括对NY-ESO-1具有特异性的VβCDR3的TCR多肽，其中该VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)或CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)；其中(i)和/或(ii)的存在表明对象有可能受益于NY-ESO-1癌症疗法。在某些方法的实施方式中，VβCDR3包括选自下组的氨基酸序列：CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2)、CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)和CASRLAGQETQYF(SEQ IDNO:4)；或前述VβCDR3中两种或更多种的组合。
本发明的其它方面提供了一种检测细胞或组织的方法，所述细胞或组织上包括以MHC复合物方式呈递的NY-ESO-1肽抗原，所述方法包括：a)将细胞或组织与本文所述的可溶性TCR分子或其功能性片段中的至少一种在这样的条件下接触，所述条件下呈递的NY-ESO-1肽抗原和可溶性TCR或片段之间形成特异性结合复合物，b)在这样的条件下洗涤所述细胞或组织，所述条件适于移除未结合呈递的肽抗原的任何可溶性TCR分子或片段；以及c)检测特异性结合复合物，所述复合物提示包括呈递的肽抗原的细胞或组织。
附图说明
图1：用LV305的处理导致多克隆NY-ESO-1特异性T细胞应答亲和性增加。将来自Tx前和Tx后白细胞去除术样品的冷冻保存的PBMC解冻，并用于建立ELISPOT试验。将200,000个细胞接种至ELISPOT平板的各孔。用不同浓度的NY-ESO-1肽混合物处理细胞，其中包含有11个氨基酸重叠的43个15聚体肽。肽的浓度用2.5ug/mL(1670nM)、0.5ug/mL(334nM)、0.1ug/mL(60nM)和0.02ug/mL(12nM)测试。用肽或对照处理培养基对细胞进行40小时孵育。使用来自C.T.L技术公司(C.T.L Technologies)的自动斑点计数器对斑点进行计数。数据符号表示在各测试浓度下Tx前样品(空心圆形)或Tx后样品(实心方形)中每百万PBMC的斑点形成单位(SFU)的平均数目。误差线表示各处理条件下的标准偏差。
图2：相较于Tx前PBMC，肿瘤抗原特异性TCR序列在PBMC中富集的比较。在该研究中，PBMC收集自LV305处理前和LV305三次疫苗接种后的患者。还从该患者处收集治疗前肿瘤样品。对PBMC和肿瘤样品进行DNA提取，随后进行T细胞受体(TCR)β链的测序分析。使用散点图分析Tx前和Tx后PBMC之间序列相似性，并且也将获自肿瘤样品的TCR序列与患者Tx前和Tx后PBMC进行相似性比较。结果表明，相较于Tx前PBMC，来自肿瘤样品的TCR序列(包括识别肿瘤抗原的肿瘤浸润淋巴细胞)在患者的Tx后PBMC中富集。
图3：通过体外培养(IVS)由Tx后PBMC建立寡克隆培养物，其高度富集NY-ESO-1特异性T。三次疫苗接种LV305后由患者Pt151006收集PBMC。将PBMC在IL-2和IL-7(10ng/mL)存在的情况下培养于具有NY-ESO-1重叠肽(0.5ug/mL，JPT技术公司(JPT Technologies)德国柏林)的OpTmizer T细胞扩增培养基(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中。重复刺激后，通过ELSIPOT试验测量，PBMC培养物针对NY-ESO-1特异性T细胞高度富集。(A)代表性ELISPOT显示，用NY-ESO-1肽池刺激后，寡克隆T细胞的IFN-γ分泌。将细胞(10K/孔)一式三份接种至用抗-IFNγ捕获抗体(MabTech公司)预被覆的ELISPOT平板。用NY-ESO-1肽池(2.5ug/mL)或对照培养基(无抗原)处理细胞，并在CO2孵育器中孵育40小时。然后洗脱细胞，并且在TMB底物添加前用HRP偶联的二抗孵育2小时。通过自动酶标仪对各孔的斑点形成单元(SFU)数进行计数。图像示出无抗原处理的三孔(上排)以及用NY-ESO-1处理的三孔(下排)。(B)总结图表显示无抗原对照和NY-ESO-1肽混合物处理的孔中各孔SFU数量。柱表示各组的平均值±SEM。(C)示出通过TCRβ深度测序分析确定的来自寡克隆培养物的最高克隆。各柱表示具有独特TCRβCDR3序列的一个克隆。y轴显示在寡克隆培养物的所有序列读数中各克隆相对频率(百分比)。6个最高克隆占所有TCR的90％以上，这表明该培养物是高度寡克隆的。
图4：相较于Tx前PBMC，寡克隆培养物中几个高频率TCRβCDR3序列在Tx后PBMC中富集。示出的是比较同一患者Tx前PBMC中的TCR序列(x轴)与Tx后PMBC中TCR序列(y轴)的log标度散点图，NY-ESO01特异性寡克隆培养物源自该患者。将来自寡克隆培养物的序列覆盖在PBMC序列上。重叠序列存在向y轴的偏斜，这表明Tx后PBMC中比Tx前PBMC中以更高频率存在NY-ESO-1特异性序列，从而表明LV305诱导NY-ESO-1特异性T细胞应答。
图5：可以在PT151016Tx后PBMC中检测到在PT151006IVS3中具有20.5％频率的TCRβCDR3克隆。示出的是比较来自PT151006IVS3寡克隆培养物的TCR序列(y轴)与来自第二患者(PT151016)Tx后PBMC中检测的TCR序列的log标度散点图。在IVS3中具有高频率的两个克隆也可在来自9T151016的Tx后样品中检测到。散点图中的方框显示TCRβCDR3区域的氨基酸序列，和PT151016Tx后PBMC中的频率(0.000298)，和IVS3中频率的百分比(20.5)。相似的分析显示，该序列无法在来自PT151016的Tx前PBMC中检测到。
图6：可以在PT151016Tx后PBMC中检测到在PT151006IVS3中具有8.5％频率的TCRβCDR3克隆。示出的是比较来自PT151006IVS3寡克隆培养物的TCR序列(y轴)与来自第二患者(PT151016)Tx后PBMC中的序列的log标度散点图。在IVS3中具有高频率的两个克隆也可在来自9T151016的Tx后样品中检测到。散点图中的方框显示TCRβCDR3区域的氨基酸序列，和PT151016Tx后PBMC中的频率(0.000642)，和IVS3中频率的百分比(8.52)。相似的分析显示，该序列无法在来自PT151016的Tx前PBMC中检测到。
图7：可以在PT151014Tx后PBMC中检测到在PT151006IVS3中具有26.2％频率的TCRβCDR3克隆。示出的是比较来自PT151006IVS3寡克隆培养物的TCR序列(y轴)与来自PT151014Tx后PBMC中的序列的log标度散点图。在IVS3中具有高频率的克隆(26.2％)也可在来自PT151014的Tx后样品中检测到。散点图中的方框显示TCRβCDR3区域的氨基酸序列，和PT151014Tx后PBMC中的频率(0.00076)，和IVS3中频率的百分比(26.2)。相似的分析显示，该序列无法在来自PT151014的Tx前PBMC中检测到。
图8：8位肉瘤患者的Tx前和Tx后PBMC中三个公共TCRβCDR3的频率。该组状图显示来自8位受试患者各自的Tx前(阴影线柱)和Tx后(黑色柱)PBMC中公共TCR的频率。所有患者都接受LV305处理。相关TCRβCDR3的氨基酸序列示于各图表的顶部。也参见表格1-3。
图9：患者之间共有的公共TCR在每个个体中具有不同核苷酸序列。示出的是针对来自三个患者的三个公共TCR的核苷酸序列和氨基酸序列。即使序列在氨基酸水平上相同，不同病人之间在核苷酸水平上仍不存在完全的同源性。这与已经提出的用于产生公共TCR的汇聚重组(convergent recombination)的概念一致(Venturi等,Nat Rev Immunol.,2008)。
图10：公共TCRβCDR3序列具有较短的长度，以及较少的位于VJD结合区的无模板核苷酸添加。(A)示出的是IVS3中TCRβCDR3长度分布(黑色柱)，Pt151006体外培养物中寡克隆NY-ESO-1特异性T细胞，以及来自同一患者的Tx后PBMC中-TCRβCDR3长度分布(阴影线柱)。(B)三个公共TCR的CDR3的核苷酸序列(CDR3编码序列用下划线标注)和氨基酸序列。同样针对各TCR列出结合区中缺失和添加的数量。三个公共TCR都具有相同的CDR3核苷酸长度(n＝39)。这些TCR在结合区还具有相对较少的无模板核苷酸添加。所鉴定的公共TCR中的一个，即CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)，其在N1(VD)和N2(DJ)插入位点不具有核苷酸添加。较短的CDR3长度以及有限的nt添加支持了这些TCR是公共TCR的结论。
图11：针对鉴定的公共TCR CDR3CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)之一的完整TCRα(SEQ ID NO:8)和TCRβ(SEQ ID NO:9)可变区的序列。该CDR3序列在IVS3中具有26.2％的频率，并且还和PT151014和PT151050共有，如表3所列。所示注释是可获得自IMGT数据库(国际ImMunoGeneTics信息系统(The international ImMunoGeneTics information system)；网址IMGT.org)的标注注释。TCRα序列的BLAST检索表明与已知的NY-ESO-1特异性TCRα序列具有同源性。
图12：对编码不同癌症患者的公共TCRβCDR3的多核苷酸序列的比对显示来自不同患者的不同核酸序列编码相同CDR3氨基酸序列。核苷酸序列SEQ ID NO如下所示：第一公共TCRβCDR3–PT006:SEQ ID NO:5；PT016:SEQ ID NO:10；PT050:SEQ ID NO:11；第二公共TCRβCDR3–PT 006:SEQ ID NO:6；PT 016:SEQ ID NO:12；PT 050；SEQ ID NO:13；第三公共TCRβCDR3–PT 006:SEQ ID NO:7；PT 016:SEQ ID NO:14；PT 050:SEQ ID NO:15(同样参见图9)。
图13示出由由NY-ESO-1扩增的T细胞培养物(IVS3)鉴定的TCRβ链的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)，所述IVS3扩增自来自癌症患者的PBMC。如实施例11分离该序列。
图14：MCC患者G2表达NY-ESO-1，并且该表达水平在用G100处理后下降。瘤内G100处理前(基线)和用G100处理后4周时进行肿瘤活检。由快速冷冻的活检组织提取RNA，并且通过使用人panCancer免疫概况试剂盒将200ng的RNA用于Nanostring基因表达分析。示出的是CTAG1B基因的表达，其编码癌睾丸抗原NY-ESO-1。Y轴示出结合密度，其反映了基因表达水平。相较于基线，G100后样品中的表达水平较低。
图15：可以在用G100处理后的MCC患者G2的淋巴结活检中检测到具有公共TCR的T细胞。瘤内G100处理前(基线)和用G100处理后4周时进行肿瘤活检。DNA提取自快速冷冻的活检组织，并且用于TCRβ链CDR3区域的深度测序分析。示出的是两个散点图，其显示以下之间的序列重叠：来自患者G2的肿瘤活检物和分离自寡克隆NY-ESO-1刺激的T细胞培养物(获自LV305试验中的患者151006)的TCR。表(A)示出G100前样品(X轴)和来自LV305患者151006的NY-ESO-1特异性TCR(Y轴)之间的关联。表(B)示出G100后样品(X轴)和来自LV305患者151006的NY-ESO-1特异性TCR(Y轴)之间的关联。G100前淋巴结活检物中用MCC无法检测到的两个公共CDR3序列在G100后处理的引流淋巴结的活检中可以检测到。
图16。可以在抗-CTLA4临床试验患者中检测到三个公共TCRβCDR3序列。示出的是21个抗-CTLA4试验患者中3个公共CDR3氨基酸序列的频率。X轴上的数字表示患者数量。各数量与两个柱相关。左侧柱表示Tx前PBMC中的频率。右侧柱表示Tx后PBMC中的频率。
图17。针对相同的CDR3序列CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)，患者151006和患者151119使用不同的TCRβV基因。大多数TCRβ使用V07-07基因。然而，小百分比的TCRβ受体使用V07-08、V07-06、V07-09、V07-02、V07-03、V07-04或V11-02。在患者151119中，针对该TCRCDR3仅使用V07-08。两个患者都使用相同的TCRβJ基因J01-05。
图18：该图示出通过患者PT151006中至少三个不同核苷酸序列编码的公共TCRβCDR3CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)中的一个。多核苷酸序列以SEQ ID NO:给出。
图19。来自不同临床试验的患者针对相同的CDR3氨基酸序列具有不同的核苷酸序列和不同的TCRβV基因应用。对于第一公共TCR，即CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2)，PT151006(来自LV305试验)和C131-001(来自C131试验)和患者G2-C1W4B(来自G100-MCC试验)分别使用TCRβV07-08、TCRβV02-01和TCRβV28-01。对于第二公共TCR，即CASSLNRDQPQHF(SEQ IDNO:3)，PT151006使用TCRβV07-07。患者131-013使用三个不同的TCRβV，即V05-08、V13-01和V05-05。对于第三公共TCR，即CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)，PT151006、C131-001和G2-C1W4B分别使用TCRβV28-01、TCRβV06-06和TCRβV25-01。
图20。来自PT151006(IVS3)的NY-ESO-1特异性T细胞培养物是CD4T细胞。示出的是用来自正常供体(上排)的PBMC培养的IVS3细胞(下排)的并列染色。用抗-CD3-太平洋蓝(PB)、抗-CD4-FITC、抗-CD8-PerCP和抗-CD56-APC对细胞进行染色。在BD LSRII流式细胞仪上获得样品。使用FlowJo软件进行数据分析。首先在FSC/SSC图区上门选淋巴细胞群，然后将CD4T细胞门选为CD3+CD4+淋巴细胞，并将CD8T细胞门选为CD3+CD8+淋巴细胞。将NK细胞门选为CD3-CD56+淋巴细胞。对照供体PBMC具有预期的CD4、CD8T细胞和NK细胞百分比，如同在健康供体PBMC中通常观察到的一样(上排)。相反，来自PT151006-IVS3的培养细胞显示出缺乏NK细胞和CD8T细胞，并且仅包括CD4T细胞(下排)。
序列鉴定物简述
SEQ ID NO:1是公共TCR CDR3共有序列CASSLNRDXXXXF的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是第一公共TCR CDR3 CASSLNRDYGYTF的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是第二公共TCR CDR3 CASSLNRDQPQHF的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是第三公共TCR CDR3 CASRLAGQETQYF的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是编码TCR V区域的多核苷酸序列，所述TCR V区域包括SEQ ID NO:2中所示的CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是编码TCR V区域的多核苷酸序列，所述TCR V区域包括SEQ ID NO:3中所示的CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是编码TCR V区域的多核苷酸序列，所述TCR V区域包括SEQ ID NO:4中所示的CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是如图11所示的公共TCRα链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是如图11所示的公共TCRβ链可变区的氨基酸序列。该公共TCR具有如SEQ ID NO:4所示的VβCDR3序列。
SEQ ID NO:10是编码TCR V区域的多核苷酸序列，所述TCR V区域包括SEQ ID NO:2中所示的CDR3氨基酸序列(参见图9)。
SEQ ID NO:11是编码TCR V区域的多核苷酸序列，所述TCR V区域包括SEQ ID NO:2中所示的CDR3氨基酸序列(参见图9)。
SEQ ID NO:12是编码TCR V区域的多核苷酸序列，所述TCR V区域包括SEQ ID NO:3中所示的CDR3氨基酸序列(参见图9)。
SEQ ID NO:13是编码TCR V区域的多核苷酸序列，所述TCR V区域包括SEQ ID NO:3中所示的CDR3氨基酸序列(参见图9)。
SEQ ID NO:14是编码TCR V区域的多核苷酸序列，所述TCR V区域包括SEQ ID NO:4中所示的CDR3氨基酸序列(参见图9)。
SEQ ID NO:15是编码TCR V区域的多核苷酸序列，所述TCR V区域包括SEQ ID NO:4中所示的CDR3氨基酸序列(参见图9)。
SEQ ID NO:16是从NY-ESO-1扩增的T细胞培养物(IVS3)鉴定的TCRβ链的氨基酸序列，所述IVS3扩增自来自癌症患者的PBMC，如实施例11所述。该序列示于图13，并且根据IMGT数据库网址概述的方法标注。
SEQ ID NO:17-23是编码来自患者C131-001、G2-C1WB4、C131-013的公共TCRβCDR3序列的核苷酸序列，如图19所示。
SEQ ID NO:24-26是来自全部编码公共TCRβCDR3序列CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)的PT151006的核苷酸序列，如图18所示。
具体实施方式
本公开部分基于这样的发现，一组公共NY-ESO-1特异性TCR氨基酸序列在不同MHCI型单倍型癌症患者之间共有。本文所用术语“公共TCR”指在多个个体之间共有的TCR序列，特别是TCRβ链可变区CDR3(VβCDR3)氨基酸序列(Venturi等.,Nat Rev Immunol.2008；8(3):231-238)。如实施例中所示，经鉴定，在用NY-ESO-1特异性治疗性免疫后，以及用合成的TLR4激动剂G100处理后，公共TCR频率增加。
工程改造的TCR
αβTCR是膜锚定的异二聚体蛋白，其包括作为具有不变链分子复合物部分表达的高度可变的α和β链。Janeway CA Jr,Travers P,Walport M等.(2001).《免疫生物学：健康 和疾病中的免疫系统(Immunobiology:The Immune System in Health and Disease)》.第 五版.词典：加兰德科学出版社(Garland Science)。T细胞受体的各链包括两个胞外结构域：可变(V)区和恒定(C)区。恒定区接近细胞膜，其后跟随着跨膜区域和短胞质尾，而可变区结合肽/MHC复合物。TCRα链和β链的可变结构域各自具有三个高变或互补决定区(CDR)，其中β链的可变区具有额外的超变区域(HV4)，该HV4通常不与抗原接触，因此不被认为是CDR。TCR是膜结合的，然而，由于其短胞质尾，其自身无法介导信号转导，所以TCR需要CD3和ζ以进行信号转导。
本发明提供了对于NY-ESO-1/MHC复合物具有特异性的工程改造的T细胞受体，以及表达本文所述的工程改造的T细胞的分离的细胞。本文所述的某些实施方式中，工程改造的TCR包括α链可变区和β链可变区，两者分别在SEQ ID NO:8和9中提供。在本文所述的其它实施方式中，工程改造的TCR包括SEQ ID NO:9中提供的β链可变区和α链对，这样α/β对形成功能性TCR，其将在MHC的情况下识别NYESO1肽。在具体实施方式中，本文所述工程改造的TCR的VβCDR3包括这样的氨基酸序列，其包括CASSLNRDXXXXF，其中X是氨基酸(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，VβCDR3包括选自下组的氨基酸序列：CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2)和CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)，其各自是落入SEQ ID NO:1共有序列的序列的示例。在其他实施方式中，VβCDR3包括SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列。
在本发明的一个方面，工程改造的TCR是异二聚体TCR。异二聚体TCR包括通过至少一个二硫键连接的两个多肽。异二聚体TCR中的一个多肽包括α链可变区和α链恒定区。在一实施方式中能够，α链多肽任选地包括跨膜结构域。在某些实施方式中，α链多肽任选地包括跨膜结构域和胞质结构域(例如，细胞内信号转导结构域，如CD3ζ链信号转导结构域和任选地共刺激结构域)。异二聚体TCR中的第二多肽包括β链可变区和β链恒定区，以及任选地跨膜结构域。在异二聚体TCR的某些实施方式中，第二多肽包括β链可变区和β链恒定区，以及任选地跨膜结构域和胞质结构域(例如，细胞内信号转导和任选地共刺激结构域)。在这样的实施方式中，即其中异二聚体TCR的第一和第二多肽不包含跨膜结构域和胞质结构域(例如，细胞间信号转导结构域)，异二聚体TCR是水溶性异二聚体。在一实施方式中，异二聚体TCR可以包括一个或多个修饰以稳定表达并将与可能存在于宿主细胞中的天然TCR的相互作用最小化。在某些实施方式中，异二聚体TCR是嵌合异二聚体TCR。
在本发明的一个方面，工程改造的TCR是嵌合T细胞受体(TCR)。本文所用术语“嵌合的”指由不同来源的部分组成的分子，例如，TCR。嵌合分子作为一个整体不是天然产生的，例如，合成的或重组的，尽管组成嵌合分子的部分可以是天然产生的。
在一些实施方式中，本文公开的工程改造的TCR是嵌合异二聚体TCR。嵌合异二聚体TCR包括通过至少一个二硫键连接的两个多肽。异二聚体TCR中的一个多肽包括α链可变区和α链恒定区。α链多肽任选地包括跨膜结构域，或任选地跨膜结构域和胞质结构域(例如，细胞内信号转导结构域，如具有或不具有共刺激结构域的CD3ζ链信号转导结构域)。嵌合异二聚体TCR中的第二多肽包括β链可变区和β链恒定区，以及任选地跨膜结构域，或任选地跨膜结构域和胞质结构域(例如，具有或不具有共刺激结构域的细胞内信号转导)。在这样的实施方式中，即其中嵌合异二聚体TCR的第一和第二多肽不包含跨膜结构域和胞质结构域，嵌合异二聚体TCR是水溶性嵌合异二聚体。
TCR的多肽链是本领域已知的。
本文所述的工程改造的TCR包括抗原结合结构域，其通常包括至少一部分β链可变区和至少一部分α链可变区，其中所述抗原结合结构域对NY-ESO-1/MHC具有特异性，或者特异性地结合NY-ESO-1/MHC。本文所用术语“特异性结合”指TCR在MHC的情况下识别特异性抗原但是基本上不识别或结合组织中不相关抗原/MHC的能力。在一些情况中，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可以用于指蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，以表示该相互作用依赖于存在于化学物质的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)；例如，抗体通常识别并结合特定蛋白质结构，而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，那么在含有标记的“A”和该抗体的反应中存在含有表位“A”(或游离、未结合的“A”)的分子将会降低与该抗体结合的标记的“A”的量。
也考虑了单链TCR(参见，例如，US20100113300)。简单来说，单链(“sc-”)TCR分子包括通过合适肽接头序列共价连接的α链可变区(Vα)和β链可变区(Vβ)。例如，Vα可以通过合适的肽接头序列共价地连接Vβ，所述肽接头融合Vα的C-末端和Vβ的N-末端。本发明的scTCR可以具有Vα–L-Vβ结构，或者可以具有其它取向，例如，Vβ–L-Vα。在某些实施方式中，scTCR还包括恒定结构域(也称为恒定区)。在另一个实施方式中，scTCR还包括恒定结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在一个实施方式中，胞质结构域包括具有或不具有共刺激结构域的细胞内信号转导结构域。sc-TCR融合蛋白的Vα和Vβ通常是约200-400个氨基酸长度，并且与天然产生的TCR的Vα和Vβ至少90％相似，优选100％相似，如同本文所提供的对NY-ESO-1/MHC复合物具有特异性的Vα和Vβ氨基酸序列。述及术语“相同”是表示Vα或Vβ的氨基酸与相应的自然产生的TCR Vβ或Vα100％相同。
在一些实施方式中，本文所述工程改造的TCR包括细胞内信号转导结构域(例如，CD3ζ链信号转导结构域)。本文所述工程改造的TCR的细胞内信号转导结构域(其也被称为胞质信号转导结构域)负责活化表达工程改造的TCR的免疫细胞的正常效用功能的至少一种。术语“效应物功能”指细胞的特定功能。例如，T细胞的效应物功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号转导结构域”或“胞质信号转导结构域”指这样的蛋白质部分，其转导效应物功能信号并引导细胞发挥特定功能。尽管通常可以使用整个细胞内信号转导结构域，但是在很多情况中，并不需要使用整个信号转导结构域。就使用细胞内信号转导结构域的截短部分而言，只要该短截部分转导效应物功能信号，可以使用这种截短部分代替完整的全长信号转导结构域。因此术语细胞内信号转导结构域表示包括足以转导效应物功能信号的细胞内信号转导的任何短截部分。
用于本文所述工程改造的TCR的细胞内信号转导结构域的示例包括，T细胞受体(TCR)和共同受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列，其中所述共同受体与TCR共同起作用以在抗原受体接合后启动信号转导。本文还考虑了NK信号转导分子。因此，考虑在本文用作细胞内信号转导结构域的是构成参与信号转导的CD3复合物的多肽，例如，γ、δ、ε、ζ和ηCD3链。TCR/CD3(T细胞主要的信号转导受体复合物)的多肽中，特别有前景的是ζ和其η同种型链，其表现为同源或异源-S-S-连接的二聚体，并且负责介导由配体TCR识别触发的细胞程序活化程序的至少一部分(Weissman,A.等.EMBO J.8:3651-3656(1989)；Bauer,A.等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3842-3846(1991))。用于本文的细胞内信号转导结构域的其它示例包括MB1链(CD79A)、B29、Fc RIII和Fc RI等。也可以使用其它活化蛋白家族成员的细胞内信号转导部分，如FcγRIII和FcεRI。参见Gross等,FASEB J 6:3370,1992；Stancovski,I.等.,J.Immunol.151:6577,1993；Moritz,D.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:4318,1994；Hwu等,Cancer Res.55:3369,1995；Weijtens,M.E.等.,J.Immunol.157:836,1996；和Hekele,A.等,Int.J.Cancer 68:232,1996；以获得关于考虑用于本文的各种其它跨膜和胞内结构域的公开内容。其它示例包括，IL-2受体(IL-2R)p55(.α.)或p75(.β.)或.γ.链的细胞内信号转导结构域，特别是p75和.γ.亚基，两者负责信号转导T细胞和NK增殖。
已知仅通过TCR生成的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要第二或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说是由两个不同类型的胞质信号序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性第一活化的那些(第一胞质信号转导序列)，和以抗原非依赖性方式作用以提供第二或共刺激信号的那些(第二胞质信号转导序列)。
第一胞质信号转导序列可以刺激方式，或以抑制方式调节TCR复合物的第一活化。以刺激方式作用的第一胞质信号转导序列可包含信号转导基序，已知其是基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
ITAM的示例包括在本文中具体用作细胞内信号转导结构域的第一胞质信号转导序列，其包括来源于如下的那些：TCRζ、cRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在某些具体实施方式中，工程改造的TCR中的胞质信号转导结构域包括来源于CD3ζ的胞质信号转导序列。可用于本文的ζ链部分序列包括细胞内结构域。该跨越人CD3ζ链52-163个氨基酸残基的结构域可以使用标准分子生物学技术扩增。
在一些实施方式中，可以将工程改造的TCR的胞质结构域设计成包括CD3ζ信号转导结构域本身或与其它任何所需胞质结构域接合，所述胞质结构域可以用于本文所使用的TCR的情况中。“共刺激信号转导区”或“共刺激结构域”指工程改造的TCR的部分，其包括共刺激分子的细胞内结构域或其功能性片段。因此，本文所述工程改造的TCR的胞质结构域可以包括细胞内信号转导结构域和共刺激结构域。
“共刺激配体”包括位于抗原呈递细胞(例如，APC，树突细胞，B细胞等)上的分子，其特异性地结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供这样的信号，除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合提供的第一信号之外，该信号介导T细胞应答，包括但不限于，扩增、活化、分化等。共刺激配体可以包括但不限于，CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞内粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、和特异性结合B7-H3的配体。尤其，共刺激配体还包括，特异性结合呈递至T细胞的共刺激分子的抗体，例如但不限于，CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和特异性结合CD83的配体。
共刺激分子是除了抗原受体和其配体的细胞表面分子，所述配体是淋巴细胞对抗原有效应答所需的。这样分子的示例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40L、PD-1、DAP-10、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性结合的配体等。考虑用于本文所述TCR的具体说明性的共刺激结构域来源于4-1BB和CD28，然而，来源于其它共刺激分子的共刺激结构域也在本发明范围内。
本文公开的工程改造的TCR胞质结构域内的共刺激序列和细胞内信号转导序列可以任何顺序彼此连接，其中每个部分都能正确地发出信号。在某些实施方式中，当存在共刺激区域时，其刚好在TM结构域的胞质侧，然后是信号转导结构域(例如，CD3ζ的信号转导结构域)。在其他实施方式中，顺序是颠倒的，其中信号转导部分刚好靠近TM结构域，然后是共刺激结构域(若存在)。任选地，在某些实施方式中，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个氨基酸长度的短寡肽或多肽接头将形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。可以使用各种接头中的任何一种，并且是本领域技术人员已知的
如本文所述，在一些实施方式中，工程改造的TCR还包括跨膜(TM)结构域，以将其锚着至宿主细胞(例如，T细胞、NK细胞)的表面。TM可以来源于TCRα链，TCRβ链，来自CD3ζ链或者可以来源于其它跨膜分子，如CD28或CD4。本领域技术人员将会意识到的是，可以使用能够正确工作的任何TM结构域以将嵌合受体锚着至膜。就跨膜结构域而言，可以设计嵌合TCR以包括跨膜结构域，其融合嵌合TCR的胞外结构域。在一个实施方式中，使用天然关联嵌合TCR中结构域之一的跨膜结构域。在一些情况中，跨膜结构域可以通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免这类结构域结合相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
在一些实施方式中，所述跨膜结构域来源于天然或合成来源。当所述来源是天然来源时，结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。具体用于该发明的跨膜区域包括源自T-细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CDS，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154的那些(即包含至少它们的跨膜区域)。或者，跨膜结构域可以是合成的，再这样的情况中，其可以主要包括疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。在某些方面中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三聚体将出现在合成的跨膜结构域的各末端。任选地，在某些实施方式中，1或2和约10、11、12、13、14或15个氨基酸长度的较短接头形成位于嵌合TCR的胞质信号转导结构域和跨膜结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。
在某些实施方式中，嵌合TCR中的跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在一些情况中，本文所用嵌合TCR的跨膜结构域包括CD8铰链结构域。在某些实施方式中，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，特别是在共刺激区是源自于CD28的实施方式中，因为其基本上便于使所需的扩增/克隆步骤的数量最小化。因此，在某些实施方式中，TM结构域可以来源于与嵌合TCR共刺激或细胞内信号转导结构域相同的分子。然而，这并不是必须的，并且TM结构域可以来源于任何合适的跨膜蛋白，包括但不限于CD8和CD3ζ跨膜结构域。
TCR恒定结构域：用于本发明工程改造的TCR中的恒定结构域可以来源于TCRα链或TCRβ链。这样的恒定结构域是本领域已知的，并且可以由公共序列数据库获得。
在某些实施方式中，一个或多个二硫键可以连接恒定结构域序列的氨基酸残基，所述恒定结构域序列包括在本发明工程改造的TCR中。在一个实施方式中，二硫键位于半胱氨酸残基之间，所述半胱氨酸残基对应在天然TCR中其β碳原子小于0.6nm距离的氨基酸残基。例如，二硫键可以位于半胱氨酸残基之间，所述半胱氨酸残基取代有TRAC*01外显子1的Thr 48和TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等同物的外显子1的Ser 57。其中可引入半胱氨酸以形成二硫键的其它位点是位于针对TCR.α.链的TRAC*01以及针对TCR.β.链的TRBC1*01或TRBC2*01的的外显子1中的如下残基。
TCRα链 TCRβ链 天然β碳分离(nm)
Thr 45 Ser 77 0.533
Tyr 10 Ser 17 0.359
Thr 45 Asp 59 0.560
Ser 15 Glu 15 0.59
除了上述提及的非天然二硫键之外，形成本发明TCR的二聚体TCR或scTCR可以包括对应于天然TCR中通过二硫键连接的残基之间的二硫键。
可溶性TCR
在一些实施方式中，工程改造的TCR是可溶性TCR。通常，“可溶性TCR”包括已经被短截以去除其跨膜区域的TCR链。例如，WO 03/020763描述了生产和测试具有非天然链间二硫键以促进短截的TCR链的连接的可溶性TCR。其他可能合适的可溶性TCR设计的细节可以在WO 99/60120中找到，其描述了非二硫键连接的截短TCR链的产生，其中利用异源亮氨酸拉链与其C-末端融合以促进链连接，并且WO 99/18129中描述了包含通过肽接头共价连接TCR Vβ链的TCRVα链的单链可溶性TCR的产生。Boulter等也描述了用于生产可溶性功能性和稳定TCR异二聚体的方法(参见Boulter等,Protein Eng 2003,16:707-711)。在其实施方式中，本文所述可溶性TCR可以是嵌合的，例如，融合异源性蛋白质，如IL-2或其它细胞因子，抗体的Fc结构域等。说明性的可溶性TCR融合蛋白述于例如Cancer ImmunolImmunother.2004年4月；53(4):345-57；J Immunol.2005年4月1日；174(7):4381-8；ClinImmunol.2006年10月；121(1):29-39。
工程改造的TCR的部分和功能性变体
也考虑本文所述TCR的功能性变体。如本文所用术语“功能性变体”指与亲本TCR具有基本或显著序列同一性或相似性的TCR，其功能性变体保留所述TCR的生物活性，是所述TCR的变体形式。功能性变体包括，例如，本文所述TCR这样的变体，其保留与亲本TRC相似程度、相同程度或较高程度特异性结合亲本TCR对其具有抗原特异性或亲本多肽或蛋白与之特异性结合的NY-ESO-1多肽/MHC复合物能力。在一些实施方式中，功能性变体包括β链可变结构域，其包括与亲本TCR的β链可变结构域氨基酸序列，如本文所提供的序列表中所示β链可变结构域氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，功能性变体包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中所示VβCDR3氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VβCDR3氨基酸序列。
在一些实施方式中，功能性变体包括α链可变将结构域，其包括与亲本TCR的α链可变结构域氨基酸序列，如本文提供的序列表中所示α链可变结构域氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，功能性变体的氨基酸序列可以包括，例如，具有至少一个保守氨基酸取代的亲本TCR的氨基酸序列。保守氨基酸取代是本领域已知的，并且包括这样的氨基酸取代，其中具有某种物理和/或化学性质的一个氨基酸被替换成具有相同化学或物理性质的另一个氨基酸。例如，保守氨基酸取代可以是被另一酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)取代的酸性氨基酸，被另一具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala，Gly，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Trp，Val等)取代具有非极性侧链的氨基酸，被另一碱性氨基酸(Lys，Arg等)取代的碱性氨基酸，被另一个具有极性侧链的氨基酸(Asn，Cys，Gln，Ser，Thr，Tyr等)取代的具有极性侧链的氨基酸等。
或者或另外，功能性变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本TCR的氨基酸序列。在这样的情况下，优选非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能性变体的生物活性。优选地，非保守氨基酸取代增强功能性变体的生物活性，从而相较于亲本TCR、多肽或蛋白质，功能性变体的生物活性增加。
功能性变体氨基酸序列的氨基酸取代可以在氨基酸序列的任何区域。例如，在一些实施方式中，氨基酸取代位于编码功能变体可变区或恒定区的氨基酸序列的区域内。在氨基酸取代位于编码可变区(例如，VβCDR3氨基酸序列，如SEQ ID NO：1)的氨基酸序列区域内的情况下，应当理解的是，氨基酸取代并不显著地降低功能性变体结合母体TCR具其有抗原特异性的肽-MHC复合物的能力。
还提供了工程改造的TCR的功能性变体。在一些实施方式中，功能性部分可以包括任何这样的部分，所述部分包括亲本TCR的连续氨基酸，进而使得功能性部分包括Vβ链的部分，所述Vβ链包括SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列。术语“功能性部分”当涉及TCR时指本发明TCR的任何部分或片段，这些部分或片段保留其作为其一部分的TCR(亲本TCR)的生物学活性。功能性部分包括这样部分的TCR，其保留其作为亲本TCR的能力，例如，特异性地结合NY-ESO-1肽-MHC复合物。
在一些实施方式中，功能性部分包括位于该部分的氨基或羧基末端或两个末端且并不干扰TCR部分的生物学功能的其它氨基酸。
本文所述TCR(包括功能性部分和功能性变体)任选地包括合成氨基酸，其代替一种或多种天然存在的氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸，正亮氨酸，α-氨基正癸酸，高丝氨酸，S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸，反式-3-和反式-4-羟基苯丙氨酸，4-氨基苯丙氨酸，4-硝基苯丙氨酸，4-氯苯丙氨酸，4-羧基苯丙氨酸，β-苯基丝氨酸，β-羟基苯丙氨酸，苯基甘氨酸，α-萘基丙氨酸，环己基丙氨酸，环己基甘氨酸，二氢吲哚-2-羧酸，1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸，氨基马来酸，氨基马来酸单酰胺，N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸，N',N'-二苄基-赖氨酸，6-羟基赖氨酸，鸟氨酸，α-氨基环戊烷羧酸，α-氨基环己烷羧酸，α-氨基环庚烷羧酸，α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸，α,γ-二氨基丁酸，α,β-二氨基丙酸，高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
本文所述TCR(包括功能性部分和功能性变体)可以进行糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、环化，例如通过二硫桥，或转化成酸加成盐和/或任选的二聚化或聚合，或共轭。
在一些实施方式中，需要鉴定存在包括本文所述对NY-ESO-1/MHC复合物具有特异性的CDR3序列的TCR。鉴定TCR存在的方法包括深度测序方法，如可商购自Adaptive生物科技公司(Adaptive Biotechnologies，华盛顿州西雅图)的IMMUNOSEQTM。同样参见Nature,515,568–571(2014年11月27日)；Carreno等,2015Science 348:803-808)。IMMUNOSEQ在实施例2-7中用于发现本文所述TCR CDR3序列，但是本文所述用于检测CDR3序列存在的方法并不限于该方法。检测编码TCR CDR3序列的特定核苷酸序列存在或不存在的任何技术都被考虑用于本文。此外，具有本文所述VβCDR3氨基酸序列的公共TCR可以通过具有为此目的而开发的单克隆抗体的免疫试验直接检测。可以使用的免疫试验包括但不限于，使用诸如以下技术的竞争性试验系统：western印迹、放射性免疫试验、ELISA、“夹心”免疫试验、免疫沉淀试验、沉淀素试验、凝胶扩散沉淀素试验、免疫放射测定试验、荧光免疫试验、蛋白A免疫试验和补体固定试验。此类实验是常规且为本领域熟知的(参见例如，Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验方法》)，第1卷，纽约州约翰韦利森出版公司(John Wiley&Sons，NY))。此外，还可进行诸如Antibodies,ALaboratory Manual(《抗体，实验室手册》)(冷泉港实验室，Ed Harlow和David Lane，1988)中描述的那些常规交错阻断试验。可以使用基于核酸的试验或基于蛋白质的检测试验以确定个体中是否存这样的T细胞，其具有包括本文所述VβCDR3氨基酸序列的TCR。
核酸、载体和细胞
还考虑了这样的核酸，其包括编码本文所述任何工程改造的TCR(或其功能性部分和功能性变体)的核苷酸序列。
本文所用“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常表示DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，合成的或获得自(例如，分离的和/或纯化的)天然来源的，其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸间连接，如氨基磷酸酯连接或硫逐磷酸酯连接，而不是存在于未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。通常优选该核酸不包括任何插入、缺失、转化和/或取代。然而，如本文所讨论的，在一些情况中，核酸包括一个或多个插入、缺失、转化和/或取代。
优选地，本文所述的核酸是重组的。本文所用术语“重组”是指这样的分子，(i)通过将天然或合成的核酸片段连接至可在活细胞中复制的核酸分子而在活细胞外构建的分子，或(ii)由(i)中描述的那些复制而得的分子。出于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。
可以使用本领域已知或市售可得的方法(例如，来自金斯瑞公司(Genscript)、赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)和类似公司)基于化学合成和/或酶连接反应构建该核酸。参见，例如，Sambrook等,同上，以及Ausubel等,同上。例如，使用天然产生的核苷酸或各种修饰的核苷酸可以化学合成核酸，所述修饰的核苷酸被设计成增强分子的生物稳定性或增强杂交后形成的双链体的物理稳定性(例如，硫逐磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。可用于产生核酸的修饰的核苷酸的示例包括但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2、2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、五步苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。或者，可从诸如Macromolecular Resources公司(科罗拉多州柯林斯堡)和Synthegen公司(得克萨斯州休斯敦市)的公司购买一种或多种核酸。
核酸可以包括任何核酸序列，其编码任何工程改造的TCR、多核苷酸、或蛋白质、或其功能性部分或功能性变体。
本公开还包括分离的或纯化的核酸变体，其中该核酸变体包括与编码亲本TCR的核苷酸至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。在某些实施方式中，本公开提供了分离的或纯化的核酸，其包括与本文序列表中所提供的核苷酸序列至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸，其中，这样的变体核苷酸编码功能性TCR，其至少与亲本TCR一样特异性识别其同源MHC-肽复合物(例如，NY-ESO-1肽/MHC复合物)。-{}-
本公开还提供了分离的或纯化的核酸，其包括与本文所述任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或在严格条件下与本文所述任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列优选在高度严格条件下杂交。述及“高度严格条件”表示核苷酸序列与靶序列(本文所述任何核酸的核苷酸序列)以比非特异性杂交可检测强的量特异性杂交。高度严格条件包括这样的条件，该叫天将区分多核苷酸与精确互补序列或仅含有来自随机序列的几个分散的错配的序列，该随机序列恰好与该核苷酸序列匹配的几个小区域(例如，3-10个碱基)。这种具有互补性的小区域比14-17个碱基或更多碱基的全长互补体更容易融解，并且高度严格杂交使其更容易区分。相对高度严格条件将包括，例如，低盐和/或高温条件，如由约0.02-0.1M NaCl或等同物在约50-70℃的温度下提供。这种高度严格条件极少(若存在)允许核苷酸序列和模板或靶链之间的错配，并且特别适合用于检测本文所述任何TCR的表达。通常认为，通过加入增加量的甲酰胺可以使条件变得更加严格。
在某些实施方式中，本文所述核酸可以纳入各种不同类型载体中的任何一个。就此而言，本公开提供了包括本文所述任何一种或多种核酸的一种或多种重组表达载体。出于本文的目的，术语“重组表达载体”表示这样的遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当该构建体包括编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列时，其允许通过宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽，并且载体与细胞在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽表达于细胞中的条件下接触。本文所述载体不是作为一个整体天然产生的。然而，载体的部分可以是天然产生的。本文所述重组表达载体可以包括任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链的或双链的，合成的或部分获自天然来源的，并且其可以包含天然男、非天然或改变的核苷酸。重组表达载体可以包括天然产生的、非天产生的核苷酸间连接，或两种类型的连接。优选地，非天然产生的或改变的核苷酸或核苷酸间连接并不妨碍载体的转录或复制。
本本文所述重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并可用于转化、转染或转导任何合适的宿主。合适的载体包括设计为用于增殖或扩增或用于表达或用于以上两种目的的那些，例如质粒和病毒。载体可以选自如下：pUC系列(fermentas生命科学公司(Fermentas Life Sciences))、pBluescript系列(司查塔基公司(Stratagene)，加利福尼亚州拉荷亚)、pET系列(诺瓦基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(药物生物技术公司(Pharmacia Biotech)，新泽西州皮斯卡塔韦)和pEX系列(克隆泰克公司(Clontech)，加利福尼亚州帕洛阿尔托)和其它市售可得的质粒载体。也可使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(司查塔基公司)、λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的示例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(克隆泰克公司)。动物表达载体的示例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(克隆泰克公司)。
在一些实施方式中，本文所使用的载体是病毒载体，例如，逆转录病毒载体，如慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体。“慢病毒”指能够感染分裂和非分裂细胞的逆转录病毒属。慢病毒的几个示例包括HIV(人类免疫缺陷病毒：包括HIV 1型和HIV 2型)；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿免疫缺陷病毒(SIV)。
示例性慢病毒载体包括但不限于，衍生自HIV-1、HIV-2、FIV、马传染性贫血病毒、SIV和绵羊脱髓鞘性脑白质炎/羊慢性进行性肺炎病毒的载体。使用病毒载体、逆转录和慢病毒病毒载体以及包装细胞用于转导具有包含TCR转基因病毒颗粒的哺乳动物靶细胞的方法是本领域熟知且之前已进行描述，例如在美国专利号8,119,772；Walchli等,2011,PLoSOne 6:327930；Zhao等,J.Immunol.,2005,174:4415-4423；Engels等,2003,Hum.GeneTher.14:1155-68；Frecha等,2010,Mol.Ther.18:1748-57；Verhoeyen等,2009,MethodsMol.Biol.506:97-114中。逆转录病毒和慢病毒构建体和表达系统也是商购可得的。
可以使用标准重组DNA技术制备重组表达载体，所述技术述于例如，《新编分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(2015约翰韦利森公司(JohnWiley&Sons,Inc))或Sambrook等,同上，以及Ausubel等,同上。可以制备环形或线性的表达载体的构建体，以在原核或真核宿主细胞中包含复制系统。复制系统可来源于，例如，CoIEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
在一些实施方式中，重组表达载体包括调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对将导入该载体的宿主类型(如细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，在适当时考虑该载体是基于DNA还是基于RNA。
该重组表达载体可包括一个或多个标志物基因，其允许选择转化或转染的宿主。标志物基因包括杀生物剂抗性，例如，对抗生素、重金属等的抗性，其在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型，等等。用于本发明的表达载体的合适的标志物基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和青霉素抗性基因。
重组表达载体可以包括天然或非天然启动子，其可操作地连接编码工程改造的TCR、多肽或蛋白(包括其功能性部分和功能性变体)的核苷酸序列，或连接编码功能性TCR的变体核苷酸序列，或连接与编码修饰的TCR、多肽或蛋白质的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择(例如强、弱、可诱导、组织特异性和发育特异性)是在本领域公知常识的范围内。类似地，将核苷酸序列与启动子合并也在本领域公知常识的范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和EF1α启动子、泛素启动子、MHC I型或II型启动子、T细胞特异性启动子、细胞因子启动子、或鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。在某些实施方式中，启动子是合成的启动子。
如本文所讨论，在那些使用病毒载体的实施方式中，病毒载体基因组包括希望在靶细胞中表达的感兴趣的序列。对于逆转录病毒，典型地，感兴趣的序列(例如，编码本文所述工程改造的TCR的核酸)位于5'LTR和3'LTR序列之间(或在某些实施方式中可以使用部分5’或3’LTR)。在某些实施方式中，感兴趣的序列与其它遗传元件(例如，包括启动子或增强子的转录调节序列)功能性相关，从而以特定方式调节感兴趣的序列的表达。在某些情况中，有用的转录调节序列是那些在时间和空间上都对活性高度调节的序列。可用于调节组分表达的表达控制元件是本领域已知的，并且包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号、增强子或其它调节元件。
感兴趣的序列和任何其它可表达序列通常与内部启动子/增强子调节序列功能性相关。“内部”启动子/增强子位于病毒载体构建体中5'LTR和3'LTR序列(或其部分序列)之间，并且可操作地连接感兴趣的序列。内部启动子/增强子可以是任何启动子、增强子或已知以功能性关系的方式增强核酸表达的启动子/增强子组合。“功能性相关”和“可操作地连接”非限制性地表示，就启动子和/或增强子而言，序列处于正确的位置和方向，当启动子和/或增强子与正确分子接触时，感兴趣的序列将会被表达。
内部启动子/增强子的选自是基于感兴趣的序列所需的表达模式以及已知启动子/增强子的特殊性质。因此，内部启动子可以是组成型活性的。可以使用的组成型启动子的非限制性示例包括，针对泛素的启动子(美国专利号5,510,474；WO 98/32869，其各自通过引用其全部内容纳入本文)、CMV(Thomsen等,PNAS 81:659,1984；美国专利号5,168,062，其各自通过引用其全部内容纳入本文)、β-肌动蛋白(Gunning等1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4831-4835,通过引用其全部内容纳入本文)和pgk(参见，例如，Adra等1987Gene 60:65-74；Singer-Sam等1984Gene 32:409-417；以及Dobson等1982Nucleic Acids Res.10:2635-2637，前述各自通过引用其全部内容纳入本文)。在一些实施方式中，由载体(例如，假型逆转录病毒基因组)编码的用于控制感兴趣的序列表达的启动子(例如，本文所述工程改造的TCR)是内含子缺陷型启动子。在一些实施方式中，人泛素-C(UbiC)启动子用于控制由病毒载体基因组编码的TCR的表达。在各种实施方式中，修饰该UbiC启动子以去除内含子，即该启动子是内含子缺陷型的。全长UbiC启动子是1250个核苷酸。内含子开始于412，并且一直延伸到末端(412-1250)。出于使异源病毒基因组转录本最小化的目的，可以删除该区域。HIV病毒基因组内有一个天然内含子。因此，包括UbiC启动子的慢病毒在慢病毒基因组中将会具有总共2个内含子。UbiC内含子可以剪接和非剪接形式存在。UbiC的缺失减少异源病毒转录本的可能性，并且保证递送的假型慢病毒颗粒中的均一性。
获自，该启动子可以是组织特异性启动子。在一些优选实施方式中，启动子是靶细胞特异性启动子。例如，启动子可以来自下述所表达的任何产物：T细胞，NK细胞，包括但不限于，IL-2,IL-2R、干扰素γ、MHC I型、MHC II型、CD3、CD11c、CD103、TLR、DC-SIGN、BDCA-3、DEC-205、DCIR2、甘露糖受体、树突细胞相关凝集素-1(Dectin-1)、Clec9A。此外，可以选自启动子以允许感兴趣序列的诱导型表达。用于诱导型表达的许多系统是本领域已知的，包括四环素响应系统，lac操纵子-阻遏物系统，以及对多种环境或生理变化响应的启动子，包括热休克，金属离子，如金属硫蛋白启动子，干扰素，缺氧，类固醇，如孕酮或糖皮质激素受体启动子，辐射，如VEGF启动子。启动子的组合也可用于获得感兴趣基因的所需表达。普通技术人员将能够基于生物体或感兴趣的靶细胞中所需基因表达模式来选择启动子。
病毒基因组可以包含至少一个RNA聚合酶II或III响应性启动子。可以将该启动子可操作地连接至感兴趣的序列，并且也可以连接至终止序列。此外，可以纳入超过一个RNA聚合酶II或III启动子。RNA聚合酶II和III启动子为本领域普通技术人员熟知。RNA聚合酶III启动子合适的范围可见于例如Paule和White,Nucleic Acids Research.,28卷,1283-1298页(2000)中，其通过引用全部内容纳入本文。RNA聚合酶II和III启动子还包括任何合成的或工程改造的DNA片段，其可以直到RNA聚合酶II或III转录下游RNA编码序列。此外，RNA聚合酶II或III(Pol II或III)启动子或用作病毒载体基因组部分的启动子可以是诱导型的。本公开所述方法可以使用任何合适的诱导型Pol II或III启动子。特别合适的Pol II或III启动子包括由Ohkawa和Taira,Human Gene Therapy,11卷,577-585页(2000)和Meissner等Nucleic Acids Research,29卷,1672-1682页(2001)中提供的四环素响应性启动子。
病毒构建体中可能还存在内部增强子以增强感兴趣的基因的表达。例如，可以使用CMV增强子(Boshart等Cell,41:521,1985；其通过引用全部内容纳入本文)。哺乳动物基因组中和病毒基因组(如HIV、CMV)中许多增强子已经被鉴定且表征(参见GenBank)。增强子可与异源启动子联用。本领域普通技术人员将能够根据所需表达模式选自适当的增强子。
病毒载体基因组还可以包含其他遗传元件。可以包括在构建体中元件的类型不受任何限制，并且可以对其进行选择以获得特定结果。例如，可以包括促进靶细胞中病毒基因组进入核的信号。这样的信号的一个示例HIV-1 cPPT/CTS。此外，可以包括促进靶细胞中前病毒整合位点表征的元件。例如，构建体中可以包括tRNA琥珀抑制物序列。病毒基因组构建体中也可以包括来自例如鸡β-球蛋白的绝缘子序列。由于甲基化和异染色质化作用，该元件将降低整合的前病毒在靶细胞中沉默的可能性。此外，绝缘子可以使内部增强子、启动子和外源基因避免染色体上整合位点周围DNA的正向或负向位置效应。此外，载体基因组可以包括设计成增强感兴趣的基因表达的一个或多个遗传元件。例如，可以将土拨鼠肝炎病毒响应元件(WRE)置于构建体中(Zufferey等1999.J.Virol.74:3668-3681；Deglon等2000.Hum.Gene Ther.11:179-190，各自通过引用全部内容纳入本文)。
病毒载体基因组通常通常以可转染到包装或生产细胞系中的质粒形式构建。质粒通常包含用于在细菌中复制质粒的序列。这样的质粒为本领域熟知。此外，包括原核生物复制起点的载体也可以包括其表达赋予可检测或选择性标志物例如耐药性的基因。典型的细菌耐药性产品是赋予氨苄青霉素或四环素抗性的产品。
本发明的重组表达载体可设计为瞬时表达、稳定表达或上述两种表达。同样地，重组表达载体可制备为用于组成型表达或可诱导表达。
此外，可以制备重组表达载体以包括自杀基因。本文所用术语“自杀基因”指这样的基因，其导致表达该自杀基因的细胞死亡。自杀基因可以是这样的基因，其将对试剂(例如，药物)的敏感性赋予该自杀基因表达的细胞，并且当细胞与试剂接触或暴露于试剂时，导致该细胞死亡。自杀基因是本领域已知的(参见，例如，《自杀基因疗法：方法和评论(Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews)》,施普林格公司(Springer),CarolineJ.(英国萨里萨顿的癌症研究所癌症治疗英国癌症研究中心(Cancer Research UK Centrefor Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research,Sutton,Surrey,UK)),胡马纳出版社(Humana Press),2004)并且包括，例如，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶二胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
还提供了包含本文所述重组表达载体中任一种的宿主细胞。本文所用术语“宿主细胞”指可以包含本发明重组表达载体的任何类型的细胞。该宿主细胞可以是真核细胞(例如，植物、动物、真菌或藻类)，或者可以是原核细胞(例如，细菌或原生动物)。该宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体(例如，人)中分离。该宿主细胞可以是粘附性细胞或悬浮的细胞，即悬液形式生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的且包括例如DH5α、大肠杆菌细胞、中华仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞、293F、293T细胞等。具体而言，出于生产用于递送本文所述TCR的病毒颗粒的目的，可以使用293F和293T宿主细胞。出于扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞可以是原核细胞，例如DH5α细胞。出于生产重组修饰的TCR、多肽或蛋白质的目的，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是人细胞。宿主细胞可以是任何细胞类型，可以源自任何类型的组织，并且可以是任何发育阶段。在某些实施方式中，宿主细胞是外周血淋巴细胞(PBL)。在某些实施方式中，宿主细胞是T细胞。
在一些实施方式中，本文所述载体编码TCR(或功能性变体或部分)。就此而言，在TCR是异二聚体TCR的那些实施方案中，TCRβ链和TCRα链两者可由相同载体表达或者可由相同宿主细胞内不同载体表达，从而使得功能性二聚体TCR表达在细胞表面。在TCR是单链TCR的其它实施方式中，本文所述载体包括编码单链TCR或本文所述其它形式的TCR的核酸。.
在其他实施方式中，本文所述的载体可编码超过一个产物。就此而言，待递送的序列可以包括编码本文所述TCR的核酸以及其它感兴趣的核酸，其编码多重基因，该多重基因编码至少一种蛋白质，至少一种siRNA，至少一种微小RNA，至少一种dsRNA或至少一种翻译RNA分子，或其任何组合。例如，待递送的序列可以包括编码一个或多种TCR的一种或多种基因。该一个或多个TCR可与单个疾病或紊乱相关联，或者其可与多种疾病和/或紊乱相关联。在一些情况中，可以包括编码免疫调节蛋白的基因以及编码本文所述TCR的基因，并且该组合可以引起并调节免疫应答至所需方向和规模。在其他情况中，编码siRNA、微小RNA、dsRNA或反义RNA分子的序列可用编码本文所述TCR的基因构建，并且该组合可以调节免疫应答的范围。该产物可以初始融合产物产生，其中编码序列与一个启动子处于功能性关系。或者，可以分开编码产物，并且各编码序列与启动子处于功能性关系。启动子可以相同或不同。
在一些实施方式中，载体包括编码免疫调节分子的多核苷酸序列。示例性免疫调节分子包括GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18IL-21、IL-23、干扰素γ、TNFα、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40、CD40配体(CD40L)、药物诱导型CD40(iCD40)等，或配体，或与其结合的单链抗体。这些多核苷酸通常受控于一种或多种调控元件，其指导编码序列在宿主细胞中的表达。
在某些实施方式中，本文所述载体可以表达检验点抑制剂。检验点抑制剂可由相同载体表达，如本文所述的TCR，或者由分开的载体表达。免疫检验点指免疫系统的多个抑制性通路，其对于维持自身耐受性和调控免疫应答的持续时间和幅度十分重要。肿瘤将某些免疫检验点通路作为免疫耐受的主要机制，特别是对肿瘤抗原有特异性的T细胞。(参见，例如，Pardoll,2012Nature 12:252；Chen和Mellman 2013Immunity 39:1)。本公开提供了这样的免疫检查点抑制剂，其可以由本文所述的表达载体联合本文所述TCR表达。说明性的检查点抑制剂包括，结合并阻断或抑制免疫检查点受体的抗体或其抗原结合片段，或结合并阻断或抑制免疫检验点受体配体的抗体或其抗原结合片段。可被靶向用于阻断或抑制的说明性免疫检验点分子包括但不限于，CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族并表达在所有NK、γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上)、CD160(也称作BY55)和CGEN-15049。免疫检验点抑制剂包括这样的抗体或其抗原结合片段或其他结合蛋白，其结合并阻断或抑制以下一种或多种的活性：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160和CGEN-15049。说明性免疫检验点抑制剂包括特姆单抗(Tremelimumab)(CTLA-4阻断抗体)、抗-OX40、PD-L1单克隆抗体(抗-B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、尼莫单抗(Nivolumab)(抗-PD1抗体)、CT-011(抗-PD1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗-PDL1抗体)、BMS-936559(抗-PDL1抗体)、MPLDL3280A(抗-PDL1抗体)、MSB0010718C(抗-PDL1抗体)和易普利姆玛/伊匹单抗(抗-CTLA-4检验点抑制剂)。
用于表达本文TCR的表达载体(例如，逆转录病毒载体或慢病毒载体)可经工程改造以一次表达超过一种感兴趣的序列，例如，两种、三种、或四种。本领域已知由单个载体同时表达超过一种序列的几种方法。例如，载体可以包括融合编码序列开放阅读框(ORF)的多个启动子，插入编码序列间的剪接信号，其表达通过单个启动子驱动的感兴趣序列的融合，插入编码序列间的蛋白质水解切割位点，插入编码序列间的内部核糖体进入位点(IRES)，插入编码序列间的双向启动子，和/或“自切割”2A肽。可以通过例如内部核糖体进入位点(IRES)元件或病毒2A元件分离待表达于多顺反子表达载体的各组分，以允许由相同启动子分开表达各种蛋白质。IRES元件和2A元件是本领域已知的(美国专利号4,937,190；deFelipe等2004.Traffic 5:616-626，其各种通过引用全部内容纳入本文)。在一个实施方式中，编码弗林蛋白酶切割位点序列(RAKR)的寡核苷(Fang等2005.Nat.Biotech 23:584-590，其通过引用全部内容纳入本文)连接来自手足口病病毒(FMDV；F2A)、猪捷申病毒-1(P2A)、马鼻炎A病毒(ERAV；E2A)和明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV；T2A)的2A样序列(Szymczak等2004.Nat.Biotechnol.22:589-594，其通过引用全部内容纳入本文)，其被用于在多顺反子载体中分离遗传元件。使用标准方法通过检测每种基因的表达可以容易地测试特定多顺反子载体的功效。
使用内部核糖体进入位点(IRES)还可以实现表达两个或多个感兴趣的序列(例如，编码TCRα链和TCRβ链、单链TCR和免疫调节的序列)的表达。IRES使真核生物核糖体能够进入并扫描非5'm7G-帽结构的位置的mRNA。如果在内部定位，例如第一编码区的3'(或顺反子)，那么IRES将使第二编码区在相同的转录本中翻译。第二编码区由IRES后遇到的第一个ATG识别。示例性的IRES元件包括病毒IRES，如小RNA病毒IRES和心病毒(cardiovirus)IRES(参见，例如，美国专利号4,937,190)和存在于5'UTR的非病毒IRES元件(例如，编码免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)转录本的那些元件(Macejak等,Nature,35390-4,1991)；果蝇触角足突变基因(Antennapedia)(Oh等,Genes Dev.6:1643-53,1992)和超级双胸基因(Ultrabithorax)(Ye等,Mol.Cell Biol.,17:1714-21,1997)；纤维元细胞生长因子2(Vagner等,Mol.Cell Biol.,15:35-44,1995)；起始因子eIF4G(Gan等,J.Biol.Chem.273:5006-12,1998)；原癌基因c-myc(Nanbru等,J.Biol.Chem.,272:32061-6,1995；Stoneley,Oncogene,16:423-8,1998)；以及血管内皮生长因子(VEGF)(Stein等,Mol.Cell Biol.,18:3112-9,1998)。
表达两个或多个感兴趣的序列还可以使用双向启动子实现，即其阅读方向指向彼此的两个背对背克隆的启动子或启动子区，并且由此转录侧接启动子区域的两个阅读框。这样的启动子的示例包括PDGF-A、嗜神经JC病毒、BRCA1、钴胺传递蛋白II和二肽基肽酶IV启动子。
慢病毒颗粒的生产
在某些实施方式中，使用逆转录病毒载体准到T细胞以修饰T细胞，进而表达本发明的TCR，以及本文所述的其它感兴趣的序列。本领域已知的各种方法可以用于生产其基因组包括病毒载体基因组RNA拷贝的感染性病毒(例如，逆转录病毒和慢病毒)颗粒。在一方法中，将病毒载体基因组导入包装细胞系，其包含将由病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装到病毒颗粒所需的组分。或者，病毒载体基因组可以包括除了一个或多个感兴趣的序列之外编码病毒组分的一个或多个基因。然而，为了防止该基因在靶细胞中复制，通常将复制所需的内源性病毒基因去除并且在包装细胞系中分开提供。
通常，逆转录病毒颗粒由经一种或多种质粒转染的细胞系产生，该质粒包含生产该颗粒所需的组分。这些逆转录病毒颗粒通常不具有复制能力，即它们仅能够进行单一轮感染。通常来说，利用多个质粒载体将生成载体颗粒的各种遗传组分分开，主要是为了减少重组事件的机会，否则可能生成具有复制能力的病毒。然而，如果需要，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。作为使用多个质粒载体的系统的一个示例，用包含病毒载体基因组的至少一种质粒(即载体基因组质粒)转染细胞系，包括LTR、顺式作用包装序列和感兴趣的序列，其通常可操作地连接异源启动子，编码病毒酶和结构组分的至少一种质粒(即编码诸如Gag和Pol的组分的包装质粒)，和编码包膜糖蛋白的至少一种包膜质粒(例如，来自逆转录病毒或其他合适的包膜糖蛋白(如VSV G、辛德毕斯(Sindbis)包膜、麻疹病毒包膜等)的包膜蛋白)。可使用如本文所述和本领域已知的其它质粒以增强逆转录病毒颗粒生产，例如，Rev-表达质粒。病毒颗粒出芽(bud)穿过细胞膜并且包括这样的核心，其包括含有感兴趣的序列和包膜糖蛋白的基因组。
用本公开的质粒载体转染包装细胞可以通过众所周知的方法实现，并且待使用的方法不受任何限制。许多非病毒递送系统是本领域已知的，包括例如，电穿孔、包括脂质体的基于脂质的递送系统、“裸”DNA的递送和使用聚环糊精化合物的递送，如Schatzlein AG中所述的那些(2001.癌症基因疗法中的非病毒载体：原则和进展(Non-Viral Vectors inCancer Gene Therapy:Principles and Progresses).Anticancer Drugs,其通过引用全部内容纳入本文)。通常使用阳离子脂质和盐处理方法，参见，例如Graham等(1973.Virol.52:456；Wigler等(1979.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1373-76)，通过引用其各自全部内容纳入本文。最常使用的是磷酸钙沉淀方法。然而，也可以使用其它将载体导入细胞的方法，包括核显微注射和细菌原生质融合。
包装细胞系提供包括病毒调节和结构蛋白的组分，这些组分需呈反式以供将病毒基因组RNA包装到逆转录病毒(例如，慢病毒)载体颗粒中。包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。一些合适的包装细胞系包括293(ATCCCCL X)、293T、HeLa(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCCCCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。包装细胞系可以稳定地表达必需病毒蛋白。这样的包装细胞系述于，例如美国专利号6,218,181中，其通过引用全部内容纳入本文。或者，可用编码一种或多种必需病毒蛋白的核酸分子以及病毒载体基因组瞬时转染包装细胞系。收集获得的病毒颗粒，并用于感染靶细胞。通常将编码包膜糖蛋白的基因克隆到诸如pcDNA3(英杰公司，美国加利福尼亚州)的表达载体中。真核细胞表达载体为本领域所熟知，并且可从许多商业来源获得。然后，将诸如293T细胞的包装细胞与编码感兴趣的序列的病毒载体基因组(通常编码抗原)、编码病毒包装组分的至少一种质粒和用于靶分子表达的载体共同转染包膜表达在包装细胞的膜上，并且被纳入病毒载体。
出于本文所提供的目的，本文的TCR可以表达在T细胞或NK细胞或免疫系统的其它合适细胞。T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如，原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞(例如，Jurkat、SupT1等)或获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物，那么由许多来源获得T细胞，包括但不限于，血液、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、单采样品、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或流体。还可以针对T细胞富集或纯化。在一些实施方式中，T细胞是人T细胞。在一些实施方式中，T细胞是分离自人的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+复制T细胞，例如，Th1和Th2细胞、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞(TIL)、记忆T细胞、原初T细胞等。
本公开还提供了包括本文所述的至少一种细胞的细胞群。该细胞群可以是异源的群体，其包括宿主细胞以及至少一种其它细胞(例如，T细胞)或除了T细胞以外的细胞，其中所述宿主细胞包括所述重组表达载体中的任何一种，所述一种其它细胞不包括任何重组表达载体，所述粗了T细胞以外的细胞是例如B细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等。或者，细胞群可以基本上是同源的群体，其中该群体主要包括(例如，基本上由…组成)包含重组表达载体的细胞。该群体也可以是细胞的克隆群体，其中该群体的所有细胞是包括重组表达载体的单个细胞的克隆，因此该群体的所有细胞包括该重组表达载体。在本发明的一个实施方式中，细胞群是包括这样细胞的克隆群，所述细胞包括本文所述的重组表达细胞。
T细胞的离体遗传修饰
如上所述，在某些实施方式中，可能需要使用本文所述病毒载体对T细胞进行离体遗传修饰。就此而言，描述了T细胞的来源，T细胞的培养和扩增。
在进行T细胞扩增和基因修饰之前，由对象获得T细胞的来源。T细胞可由许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。本发明的某些实施方式中，可以使用本领域现有的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方式中，使用本领域技术人员已知的许多技术(如，FICOLLTM分离)可由收集自对象的单位血液T获得细胞。在一个实施方式中，通过单采获得来自个体循环血液的细胞。单采产物通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核血液白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，通过单采收集的细胞经清洗以去除血浆部分，并将该细胞置于合适的缓冲液或培养基中以供后施处理步骤。在本发明的一个实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞。在另一实施方式中，清洗溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。此外，令人惊讶的是，在不存在钙的情况下的初始活化步骤导致放大的活化。本领域普通技术人员将容易理解的，清洗步骤可通过本领域已知的方法实现，如根据制造商的说明书通过使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。清洗后，细胞可以重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca2+PBS、无Mg2+PBS、勃脉力(PlasmaLyte)A或其它具有不具有缓冲液的盐溶液。或者，可以去除单采样品中不需要的组分，并且将细胞直接重悬于培养基中。
在其他实施方式中，通过将红血细胞分裂并将单核细胞耗尽由外周血淋巴细胞分离T细胞，例如，通过PERCOLLTM梯度的离心或通过对流离心洗脱法。诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞的T细胞亚群可以通过正或负选择技术进一步分离。例如，在一个实施方式中，通过用抗-CD3/抗-CD28(即3X28)偶联的珠(如DYNABEADSTMM-450CD3/CD28T)孵育足以阳性选自所需T细胞的一段时间来分离T细胞。在一个实施方式中，该时间段是约30分钟。在另一个实施方式中，该时间段是在30分钟至36小时的范围内或更长，以及其间所有整数值。在另一个实施方式中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在另一个优选实施方式中，该时间段是10至24小时。在一个优选实施方式中，该孵育时间段是约24小时。为了由白血病患者分离T细胞，使用诸如24小时的较长孵育时间可以提高细胞产率。在任何T细胞相较于其它细胞类型较少的情况下，可以使用较长的孵育时间以分离T细胞，如在由肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中。此外，较长孵育时间的使用可以增强捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合CD3/CD28珠的时间和/或通过增加或降低珠与T细胞的比例(如本文后续所述)，可在培养开始时或在过程中的其他时间点优先进行对于或针对T细胞亚群的选择。此外，通过增加或降低珠上或其它表面上抗-CD3和/或抗-CD28抗体的比例，可在培养开始时或在其他所需时间点优先进行对于或针对T细胞亚群的选择。本领域技术人员将会意识到，在本发明中也可以使用多轮选择。在某些实施方式中，人们可能会细胞进行选择步骤，并且将“未选择的”细胞用于活化和扩增过程中。“未选择的”细胞也可以同样进行更多轮的选择。
通过负选择进行的T细胞群富集可以通过与这样抗体的组合实现，所述抗体针对负选择细胞独有的表面标志物。一种方法是通过使用单克隆抗体混合物的负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述单克隆抗体混合物针对呈递至负选择的细胞上的细胞表面标志物。例如，为了通过负选择针对CD4+细胞进行富集，单克隆抗体混合物通常包括针对CD 14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR，和CD8的抗体。在某些实施方式中，人们可能希望针对这样的调节T细胞进行富集或针对这样的调节T细胞进行正选择，所述调节体细胞表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+。或者，在某些实施方式走好哪个，T调节细胞被抗-C25偶联的珠或其它相似的选择方法耗尽。
对于通过正或负选择分离所需细胞群，可以不同的细胞或表面(例如，颗粒，如珠)浓度。在某些实施方式中，人们可能希望显著地降低珠和细胞混合在一起的体积(即，升高细胞的浓度)以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用了20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用了10亿细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用了大于1亿细胞/ml。在另一个实施方式中，使用了1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万细胞/ml的浓度。在其它一个实施方式中，使用了7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿细胞/ml的浓度。在另一些实施方式中，使用了1.25亿或1.5亿/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产率增加、细胞活化和细胞扩增。此外，高细胞浓度的使用允许更有效地捕获这样的细胞，所述细胞可能较弱表达感兴趣的靶抗原，如CD28-负T细胞，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)。这样的细胞群可能具有治疗价值，并且需要获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在某些实施方式中，使用诸如WO 2012/129514中所述的那些方法(该方法的公开通过引用其全部内容纳入本文)，可以用本文所述的慢病毒载体颗粒分离和遗传修饰T细胞的特定亚型。
在相关实施方式中，人们可能希望使用较低浓度的细胞。通过将T细胞和表面(例如，诸如珠的颗粒)的混合物显著地稀释使颗粒和细胞之间的相互作用最小化。由此选择了这样的细胞，其表达待结合颗粒的大量所需抗原。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度中比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一个实施方式中，使用的细胞浓度是5X106/ml。在其他实施方式中，使用的浓度可以是约1X105/ml至1X106/ml，并且可以是其间任何整数。
在其他实施方式中，细胞可以在选择器上在2-10℃或室温下以各种速度孵育各种时间。
也可以将用于刺激的T细胞在清洗步骤后冷冻。不希望受理论的束缚，通过去除粒细胞和细胞群中一定程度上的单核细胞，冷冻和随后的解冻步骤提供了更均匀的产物。经过移除血浆和血小板的清洗步骤后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。本领域中已知许多冷冻溶液和参数并且可以用于本文中，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或这样的培养基，其含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖，20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或31.25％Plasmalyte-A，31.25％右旋糖5％，0.45％NaCl，10％右旋糖酐40和5％右旋糖，20％人血清白蛋白，和7.5％DMSO或其他合适的细胞冷冻培养基，其包含例如羟乙基淀粉(Hespan)和Plasmalyte A，然后将该细胞以1o/分钟冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用控制冷冻的其他方法，以及在-20℃或液氮中进行不受控制的立即冷冻。
在某些实施方式中，将冷冻保存的细胞解冻并如本文所述清洗，并在使用本法所述方法活化前将其在室温静止1小时。
本发明上下文还考虑了在当本文所述扩增细胞可能需要之前的时间段内由对象收集血液样品或单采产品。如此，可以在需要的任何时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离且冷冻所需细胞(如T细胞)，后续用于针对将受益于T细胞疗法的各种疾病或病症(入本文所述的那些)的T细胞疗法。在一个实施方式中，血液样品或单采血液成分取自基本健康的对象。在某些实施方式中，血液样品或单采血液成分取自这样的整体健康对象，其处于患并风险，但是尚未患病，并且将感兴趣的细胞分离且冷冻待用。在某些实施方式中，可以扩增、冷冻并在后续时间使用T细胞。在某些实施方式中，样品收集自刚被诊断出患有本文所述特定疾病但是尚未进行任何治疗的患者。在另一实施方式中，在进行任何相关治疗方式之前将细胞从来自对象的血液样品或单采血液成分中分离，所述相关治疗方式包括但不限于下述试剂的治疗，如那他珠单抗、依法利珠单抗、抗病毒剂、化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯和FK506，抗体或其他免疫净化剂(immunoablative agent)，如CAMPATH、抗-CD3抗体、癌得星(cytoxan)、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢霉素和FK506)或抑制对于生长因子诱导的信号转导十分重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等,Cell 66:807-815,1991；Henderson等,Immun 73:316-321,1991；Bierer等,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在另一个实施方式中，针对患者将细胞分离并冷冻，用于随后与骨髓或干细胞移植联用(例如，之前，同时或之后)，T细胞消除(ablative)疗法使用诸如氟达拉滨、外线束放射治疗(XRT)、环磷酰胺的化疗剂或诸如OKT3或CAMPATH的抗体。在另一实施方式中，在下述之前分离细胞并且可以将其冷冻，用于随后B细胞净化疗法后的治疗，如与CD20反应的试剂，例如，利妥昔(Rituxan)。
在另一实施方式中，从治疗后的患者直接获得T细胞。就此而言，已经观察到在某些癌症治疗(特别是用损害免疫系统的药物的治疗)后，在治疗后不久、患者通常将从治疗恢复期间，获得的T细胞的质量就其离体扩增能力而言可能是最佳的或改善的。类似地，在使用本文所述方法离体操纵后，这些细胞可以处于就增强的移植和体内扩增而言较优的状态。因此，在本发明的上下文中考虑了在该恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血细胞系的其他细胞。此外，在某些实施方式中，可以使用调动(例如，用GM-CSF调动)和调节方案来在受试者中产生这样的条件，其有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增，特别是在治疗后确定一段时间。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
无论是在T细胞离体基因修饰以表达感兴趣的序列之前或之后，通常可以使用本领域已知的方法将T细胞活化和扩增。用于活化和扩增T细胞的说明性方法述于例如美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041以及公开的申请号WO2012/129514和US20060121005中，这些公开通过引用其全部内容纳入本文。
在某些实施方式中，T细胞可以通过与这样的表面接触扩增，所述表面附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂以及刺激T细胞表面共刺激分子的配体。具体而言，可以如本文所述刺激T细胞群，如通过与抗-CD3抗体或其抗原结合片段接触，或固定于表面的抗-CD2抗体接触，或通过与和钙离子载体联合的蛋白质激酶C活化剂(例如，苔藓抑)接触。为了共刺激T细胞表面的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群在适于刺激T细胞增殖的条件下可与抗-CD3抗体或抗-CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，考虑抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。抗-CD28抗体的示例包括9.3，B-T3，XR-CD28(Diaclone，法国贝桑松市)，它们可以本领域所公知的其它方法使用(Berg等,TransplantProc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等,J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在某些实施方式中，第一活化信号是抗-CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的试剂是抗-CD28抗体或其抗原结合片段；并且将两种试剂以相同的分子量共固定于相同的珠。
在某些实施方式中，细胞与颗粒比例的范围是从1:100到100:1和其间的任何整数值，并且在另一实施方式中，可用于刺激T细胞的该比例包括1:9到9:1和其间的任何整数值。如上所述，导致T续表刺激的抗-CD3-和抗-CD28-偶联的颗粒与T细胞的比例可以不同，然而，某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个优选比例是每个T细胞至少1:1颗粒。在一个实施方式中，使用1:1或更小的颗粒与细胞比例。在一特定实施方式中，优选的颗粒:细胞比例是1:5。在其它实施方式中，颗粒与细胞的比例可以根据刺激那天变化。
适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或，X-vivo 15，(隆萨公司(Lonza)))，其可以包括增殖和存活必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)，白细胞介素-2(IL-2)，胰岛素，IFN-γ，IL-4，IL-7，GM-CSF，IL-10，IL-12，IL-15，TGFβ和TNF-α或其它本领域技术人员已知用于细胞生长的添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于，表面活性剂，质体酸盐和还原剂，如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo20，优选添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，要么是无血清，要么补充了适量血清(或血浆)或确定了一组激素，和/或足以使T细胞生长和扩增量的细胞移植。例如青霉素和链霉素的抗抗生素仅包括在试验培养物中，不包括在待注入对象的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可能展现出不同的特征。例如，典型的血液或单采(apheresed)外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群(TH，CD4+)，其比细胞毒性或抑制性T细胞群(Tc，CD8+)更大。通过刺激CD3和CD28受体的T细胞的离体扩增产生T细胞群，其在大约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，T细胞群包含逐渐增多TC细胞群。相应地，取决于治疗的目的，将主要包括TH细胞的T细胞群注入对象可以是有有利的。相似地，如果TC细胞的抗原特异性亚组已经被分离，将该亚组扩增至更大的程度可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8标志物，其它表型标志物显著变化，但是很大程度上，在细胞扩增过程中可重复地进行。因此，这样的可重复性使其能够针对特定目的定制活化的T细胞产物。
在某些实施方式中，本公开考虑了使用基因修饰的T细胞稳定表达本文所述TCR。表达且工程改造TCR的T细胞在本文中被称为嵌合TCR修饰的T细胞。优选地，可以遗传修饰细胞以稳定在其表面表达抗原结合结构域，赋予非MHC依赖性的新型抗原特异性。
包含修饰的T细胞的组合物以及给予修饰的T细胞
在某些实施方式中，本公开提供了包括T细胞的组合物，所述T细胞经使用本文所述慢病毒载体颗粒修饰以表达感兴趣的转基因，如本文所述工程改造的TCR。这样的组合物可以本公开在本文后续所述方法给予对象。
按照本领域技术人员基于本公开将显而易见的已知技术或其变化形式，包括本文所述修饰的T细胞的组合物可以被用于将用于过继免疫疗法的方法和组合物。参见，例如，Gruenberg等的美国专利公布号2003/0170238；同样参见Rosenberg的美国专利号4,690,915。
在一些实施方式中，细胞通过这样进行配置，首先将其由其培养基收获，然后清洗，并将细胞浓缩于适合以治疗有效量给予的介质和容器系统(“药学上可接受的”运载体)。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、Normosol R(雅培公司(Abbott))或Plasma-Lyte A(巴克斯特(Baxter))，并且可以使用5％右旋糖水溶液或林格氏乳酸。该输注介质可以补充由人血清白蛋白。
组合物中治疗有效量的细胞通常大于102个细胞，并且上至106个、上至并且包括108个或109个细胞，并且可以超过1010个细胞。细胞的数量将取决于该组合物预期的最终用途，其中包含的细胞类型也是如此。例如，如果需要对特定抗原具有特异性的细胞，那么该群体将包括大于70％，通常是大于80％、85％和90-95％的这样的细胞。对于本文所提供的用途，系统通常是1升或更少的体积，可以是500ml或更少，甚至是250ml或100ml或更少。因此，所需细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且常常大于107个细胞/ml，常常是108个细胞/ml或更大。可以将免疫细胞的临床相关数量分配成累积等于或超过109、1010或10"个细胞的多次输注或由本领域专业临床医师确定的适当数量的免疫细胞。
诊断和治疗方法
本文还提供了包括工程改造的TCR(例如，本文所述可溶性TCR，和其融合蛋白或嵌合蛋白)的组合物；包括病毒载体颗粒的组合物，所述病毒载体颗粒包括编码工程改造的TCR的序列；或包括特别是T细胞的细胞的组合物，所述细胞表达本文所述的工程改造的TCR，其用于治疗癌症(例如，NY-ESO-1癌症)的方法或用于抑制表达NY-ESO-1的癌细胞的增殖。
就此而言，本文所述的是一种治疗哺乳动物对象中与NY-ESO-1表达相关联的癌症的方法，其包括向该对象给予治疗组合物，该组合物包括选自下组的一种或多种治疗剂：(a)本文所述的工程改造的TCR；(b)包括多核苷酸的分离的细胞，所述多核苷酸编码本文所公开的工程改造的TCR多肽；(c)可溶性TCR或包括该可溶性TCR的嵌合或融合多肽，其在MHC分子的情况中对NY-ESO-1具有特异性；(d)编码工程改造的TCR多肽的多核苷酸；(e)编码在MHC分子的情况中对NY-ESO-1具有特异性的TCR的多核苷酸；(f)包括多核苷酸的病毒载体，所述多核苷酸编码本文对NY-ESO-1/MHC复合物具有特异性的工程改造的TCR多肽；其中将所述治疗组合物以在该对象中有效治疗癌症的量给予该对象。说明性的用于本文所述工程改造的TCR用于本文所述治疗方法和抑制癌症增殖的方法中的本文所述的工程改造的TCR的说明性TCR序列在序列表中提供，并且包括SEQ ID NO:9中提供的β链可变区和SEQ IDNO:8中提供的α链可变区。
就此而言，本文所述是一种治疗哺乳动物对象中与NY-ESO-1表达相关联的癌症的方法，其包括向该对象给予治疗组合物，该组合物包括下述一种或多种治疗剂：(a)包括多核苷酸的分离的细胞，所述多核苷酸编码包括对NY-ESO-1具有特异性的VβCDR3的工程改造的TCR多肽，其中所述VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)，或其其中所述VβCDR3包括SEQ ID NO:2-4中所示氨基酸序列；或者其中所述β链可变区如SEQ ID NO:9中所提供并且所述α链可变区如SEQ ID NO:8中所提供；(b)可溶性TCR或包括该可溶性TCR的嵌合或融合多肽，其包括在MHC分子中对NY-ESO-1具有特异性的Vβ链CDR3，其中所述VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)，或其中VβCDR3包括SEQ ID No:2-4中所示氨基酸序列；(c)编码包括对NY-ESO-1具有特异性的Vβ链CDR3的嵌合TCR多肽的多核苷酸，其中所述VβCDR3包括氨基酸CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)，或其中所述VβCDR3包括SEQ IDNo:2-4中所示氨基酸序列；(d)编码包括Vβ链CDR3的可溶性TCR的多核苷酸，所述Vβ链CDR3在MHC分子中对NY-ESO-1具有特异性，其中所述VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQID NO:1)，或者其中所述VβCDR3包括SEQ ID No:2-4中所述氨基酸序列；(e)包括编码嵌合TCR多肽的多核苷酸的载体，所述嵌合TCR多肽包括对NY-ESO-1具有特异性的Vβ链CDR3；和(f)包括Vβ链CDR3的载体，所述Vβ链CDR3在MHC分子中对NY-ESO-1具有特异性，其中将所述治疗组合物以在该对象中有效治疗癌症的量给予该对象。在本文所述实施方式中的某些中，工程改造的TCR包括α链可变区和β链可变区，两者分别在SEQ ID NO:8和9中提供。
本文所用术语“NY-ESO-1癌症”和“表达NY-ESO-1的癌细胞”指包含表达NY-ESO-1肿瘤抗原细胞的肿瘤。这样的癌症是本领域已知的，并且本领域普通技术人员可以确定NY-ESO-1在特定癌症中的表达。在一些实施方式中，肿瘤是实体瘤。示例性的NY-ESO-1癌症包括但不限于，肉瘤(例如，软组织肉瘤)、黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、NHL(DLCL)、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、肾癌、结直肠癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、成神经细胞瘤、髓样白血病和急性淋巴细胞白血病。
本文还描述了一种抑制哺乳动物中表达NY-ESO-1的癌细胞增殖的方法，其包括向对象给予包括下述一种或多种治疗剂的治疗组合物：(a)包括多核苷酸的分离的细胞，所述多核苷酸编码包括对NY-ESO-1具有特异性的Vβ链互补决定区3(CDR3)的嵌合TCR多肽，其中所述VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)，或者其中所述VβCDR3包括SEQID No:2-4中所示氨基酸序列；(b)包括Vβ链CDR3的可溶性TCR，所述Vβ链CDR3在MHC分子中对NY-ESO-1具有特异性，其中所述VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)，或者其中所述VβCDR3包括SEQ ID No:2-4中所示氨基酸序列；(c)编码包括对NY-ESO-1具有特异性的Vβ链CDR3的嵌合TCR多肽的多核苷酸，其中所述VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)，或者其中所述VβCDR3包括SEQ ID No:2-4中所示氨基酸序列；(d)编码包括Vβ链CDR3的可溶性TCR的多核苷酸，所述Vβ链CDR3在MHC分子中对NY-ESO-1具有特异性，其中所述VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)，或者其中所述VβCDR3包括SEQ ID No:2-4中所示氨基酸序列；(e)包括编码嵌合TCR多肽的多核苷酸的载体，所述嵌合TCR多肽包括对NY-ESO-1具有特异性的Vβ链CDR3；并且(f)包括Vβ链CDR3的载体，所述Vβ链CDR3在MHC分子中对NY-ESO-1具有特异性，其中将所述治疗组合物以在该对象中有效治疗癌症的量给予该对象。在本文所述实施方式中的某些中，工程改造的TCR包括α链可变区和β链可变区，两者分别在SEQ ID NO:8和9中提供。
本文所用“治疗有效量”或“有效量”表示提供治疗或预防益处的量。
也考虑了鉴定有可能受益于治疗组合物(如本文所述组合物)治疗对象的方法。就此而言，该方法包括：(a)鉴定有可能受益于NY-ESO-1癌症疗法的哺乳动物对象包括确定来自哺乳动物对象的样品中是否存在如下物质：(i)编码包括对NY-ESO-1具有特异性的Vβ链CDR3的TCR多肽的多核苷酸，其中所述Vβ链包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)，或其其中所述VβCDR3包括SEQ ID No:2-4中所示氨基酸序列；或者(ii)包括对NY-ESO-1具有特异性的Vβ链CDR3的TCR多肽，其中所述Vβ链包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ IDNO:1)，或者其中所述VβCDR3包括SEQ ID No:2-4中所示氨基酸序列；其中(i)和/或(ii)存在表明该对象将可能受益于NY-ESO-1癌症疗法。
在其他实施方式中，本文也考虑了一种治疗已经鉴定为可能受益于治疗的对象的方法。就此而言，该治疗方法包括：(a)鉴定有可能受益于NY-ESO-1癌症疗法的哺乳动物对象包括确定来自哺乳动物对象的样品中是否存在如下物质：(i)编码包括对NY-ESO-1具有特异性的Vβ链CDR3的TCR多肽的多核苷酸，其中所述Vβ链包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)，或其其中所述VβCDR3包括SEQ ID No:2-4中所示氨基酸序列；或者(ii)包括对NY-ESO-1具有特异性的Vβ链CDR3的TCR多肽，其中所述Vβ链包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)，或者其中所述VβCDR3包括SEQ ID No:2-4中所示氨基酸序列；其中(i)和/或(ii)存在表明该对象将可能受益于NY-ESO-1癌症疗法；并且(b)向该哺乳动物对象给予NY-ESO-1癌症疗法。
编码包括对NY-ESO-1具有特异性的Vβ链CDR3的TCR多肽的多核苷酸的存在可以这样确定，例如，通过诸如那些可商购自Adaptive生物科技公司(华盛顿州西雅图)和实施例2-7中所述的深度测序方法，其中所述Vβ链包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)，或其中VβCDR3包括SEQ ID No:2-4所示氨基酸序列。也可以利用本领域已知检测特定核苷酸序列是否存在的包括多重PCR在内的其它方法以及其它技术。此外，TCR多肽可以通过免疫试验直接检测，该免疫试验采用为此目的开发的适当的四聚体或单克隆抗体。可以使用的免疫试验包括但不限于，使用诸如以下技术的竞争性试验系统：western印迹、放射性免疫试验、ELISA、“夹心”免疫试验、免疫沉淀试验、沉淀素试验、凝胶扩散沉淀素试验、免疫放射测定试验、荧光免疫试验、蛋白A、免疫试验、胞质基因表面驻留和补体固定试验等。此类实验是常规且为本领域熟知的(参见例如，Ausubel等编，2015，Current Protocols inMolecular Biology(《新编分子生物学实验方法》)，第1卷，纽约州约翰韦利森出版公司(John Wiley&Sons，NY))。此外，还可进行诸如Antibodies,A Laboratory Manual(《抗体，实验室手册》)(冷泉港实验室，Ed Harlow和David Lane，1988)中描述的那些常规交错阻断试验。基于核酸或是基于蛋白质的试验可以高频率将携带包括具有本文所述CDR3氨基酸序列的Vβ链的TCR的个体从不携带该诊断克隆型的个体区分。
本文考虑的治疗方法包括任何NY-ESO-1特异性癌症疗法，特别是免疫疗法。在一实施方式中，用于表达本文所述公共TCR的患者的治疗方法如美国专利号9,044,420中所述的那些。在一些实施方式中，NY-ESO-1癌症疗法包括向对象给予包括编码NY-ESO-1多肽的多核苷酸的载体。在一些实施方式中，该载体是是慢病毒载体。在一些实施方式中，载体包括编码NY-ESO-1多肽的多核苷酸。。在一些实施方式中，载体包括编码NY-ESO-1多肽的多核苷酸。。
在一些实施方式中，NY-ESO-1癌症疗法包括向对象给予有效量包括GLA的组合物，所述组合物包括：
(a)式(I)的GLA：
其中：R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；且R2和R4是C12-C20烷基；并且
(b)药学上可接受的运载体或赋形剂；其中该组合物不包括抗原。在本文所述方法的一个实施方式中，R1、R3、R5和R6是十一烷基且R2和R4是十三烷基。在本文所述方法的另一个实施方式中，该哺乳动物是人。在另一个实施方式中，该组合物是水性制剂，且在某些实施方式中，该组合物的形式是水包油乳液、油包水乳液、脂质体、胶束制剂或微粒。
美国专利公开号2008/0131466提供了制剂，如GLA化合物的水性制剂(AF)和稳定的乳液制剂(SE)，这些制剂可用于任意式(I)的化合物。
本文所述GLA在组合物中以这样的量存在：0.1-10μg/剂量、或0.1-20μg/剂量、0.1-30μg/剂量、0.1-40μg/剂量、或0.1-50μg/剂量、或1-20μg/剂量、或1-30μg/剂量、或1-40μg/剂量、或1-50μg/剂量、或0.2-5μg/剂量、或以0.5-2.5μg/剂量的量、或以0.5-8μg/剂量或0.5-15μg/剂量的量。剂量可以是，例如，0.5μg/剂量、0.6μg/剂量、0.7μg/剂量、0.8μg/剂量、0.9μg/剂量、1.0μg/剂量、2.0μg/剂量、3.0μg/剂量、3.5μg/剂量、4.0μg/剂量、4.5μg/剂量、5.0μg/剂量、5.5μg/剂量、6.0μg/剂量、6.5μg/剂量、7.0μg/剂量、7.5μg/剂量、8.0μg/剂量、9.0μg/剂量、10.0μg/剂量、11.0μg/剂量、12.0μg/剂量、13.0μg/剂量、14.0μg/剂量或15.0μg/剂量。可根据对象的血液体积、体重、身体面积、重量或递送途径来调节剂量。在一个实施方式中，瘤内给予1ml中2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg或12μg的GLA。就此而言，可在肿瘤的多个区域等量注射1mL剂量的GLA。在某些实施方式中，将给予约0.01μg/kg至约100mg/kg体重的GLA，通常通过皮内、瘤内、皮下、肌肉内或静脉内途径，或通过其他途径。在某些实施方式中，GLA的剂量是约1μg/kg至约1mg/kg，且在某些实施方式中，范围是约0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.3μg/kg、0.4μg/kg、0.5μg/kg、0.6μg/kg、0.7μg/kg、0.8μg/kg、0.9μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、6μg/kg、7μg/kg、8μg/kg、9μg/kg、10μg/kg至约200μg/kg。对于本领域技术人员而言显而易见的是，给药的次数和频率将取决于宿主的应答。如本文所述，适当剂量还可取决于患者(例如人)的状态，例如疾病的阶段、总体健康状态，以及年龄、性别和体重，和医疗领域技术人员熟悉的其他因素。如本文他处所述，本发明所述GLA组合物不包含抗原。
慢病毒颗粒的递送
可以允许病毒接触靶细胞(例如，T细胞、NK细胞或树突细胞)的任何方式将用于递送本文所述工程改造的TCR的病毒颗粒(例如，逆转录病毒、慢病毒或其它病毒颗粒)递送至递送感兴趣的多核苷酸所需的靶细胞中。有时，人们会将合适量的病毒直接(体内)导入人或其它动物，例如，通过将其注射到体内。合适的动物包括但不限于马、狗、猫、牛、猪、绵羊、兔、鸡或其他鸟类。病毒颗粒可以通过多种途径注射，如静脉内、真皮内、皮下、结节内、腹腔内或粘膜。可以使用皮下注射装置递送病毒，如美国专利号7,241,275、7,115,108、7,108,679、7,083,599、7,083,592、7,047,070、6,971,999、6,808,506、6,780,171、6,776,776、6,689,118、6,670,349、6,569,143、6,494,865、5,997,501、5,848,991、5,328,483、5,279,552、4,886,499中所公开的装置，其所有内容通过引用纳入本文。其他注射位置也是合适的，如直接注入包括靶细胞的器官。例如，可以使用淋巴结内注射、脾内注射或骨髓内注射分别将病毒递送至淋巴结、脾脏和骨髓。根据靶细胞的具体情况和性质，导入可以通过其他方式进行，包括例如吸入或与上皮组织直接接触，例如眼部，嘴或皮肤中的那些。
或者，提供靶细胞并与病毒体外接触，如在培养板中。靶细胞通常是包括树突细胞或T细胞的细胞群，所述树突细胞或T细胞获得自健康对象或者需要治疗或希望刺激对抗原的免疫应答的对象。由对象获得细胞的方法为本领域所熟知，包括静脉切开术、手术切除和活检。还可以通过获得CD34α+人造血祖细胞并使用其它地方所述的体外培养方法(例如，Banchereau等Cell 106,271-274(2001)，通过引用其全部内容纳入)生成人DC。
可将病毒悬浮于培养基，并且添加到培养板、管或其它容器的孔中。包含病毒的培养基可以在细胞铺板之前或细胞已经铺板后添加。通常将细胞在适当量的培养基中孵育以提供存活力并允许培养基中合适浓度的病毒，从而发生宿主细胞的转导。优选地，用病毒孵育细胞足够量的时间以允许病毒感染细胞。优选地，用病毒孵育细胞至少1小时、至少5小时或至少10小时。
在体内和体外递送中，使用包含感染所需靶细胞足够量的病毒颗粒的等分。当待培养靶细胞时，病毒颗粒的浓度常是至少1IU/μL，更优选至少10IU/μl，甚至更优选至少300IU/μL，甚至更优选至少1X104IU/μL，甚至更优选至少1X105IU/μL，甚至更优选至少1X106IU/μL，或甚至更优选至少1X107IU/μL。
用病毒体外感染后可以将靶细胞导入(或再导入)人或其它动物。可以将细胞导入真皮、真皮下或外周血流中。导入动物的细胞优选来自该动物的细胞，以避免不利的免疫应答。也可以使用源自具有相似免疫背景供体的细胞。还可以使用的其它细胞包括被设计成避免不利免疫应答的那些。
例如，可以针对靶细胞进行这些分析：整合、转录和/或感兴趣基因或序列的表达、整合的基因的拷贝数和整合的位置。这样的分析可以在任何时间进行，并且可以通过本领域已知的任何方法进行。
可以通过任何本领域已知的方法对给予病毒或病毒感染的T细胞的对象进行这些分析：感染细胞的位置、病毒递送的多核苷酸或感兴趣基因的表达、免疫应答的刺激和与疾病或紊乱相关症状的监控。
本文公开的感染细胞的方法并不依赖于细胞的个体特异性特征。因此，很容易将它们扩展至各种动物物种。在一些情况中，将病毒颗粒递送至人或人T细胞，并且在其他情况中，将它们递送至诸如小鼠、马、狗、猫或小鼠或鸟类等动物。如本文所讨论，病毒基因组被假型化以赋予其广泛的宿主范围以及靶细胞特异性。本领域技术人员还将意识到适当的内部启动子和其他元件以实现在特定动物物种中感兴趣的序列的所需表达。因此，本领域技术人员将能够修改感染来自任何物种的树突细胞的方法。
联合治疗
本文所述治疗组合物还可以在一种或多种其他治疗剂给予的同时、之前或之后给予。这样的组合疗法可以包括给予包含本文所述治疗组合物和一种或多种其它活性剂的单一药物剂量制剂，以及以其各自分开的药物制剂给予组合物(例如，包括本文所述的工程改造的TCR的组合物，或包括慢病毒载体颗粒的组合物，所述慢病毒载体颗粒包括编码本文所述的工程改造的TCR的序列，或包括经修饰以表达本文所述工程改造的TCR的分离的T细胞的组合物)和各活性剂。例如，本文所述治疗组合物和其它活性剂可以单一口服剂量组合物(如片剂或胶囊)中一起给予哺乳动物对象，或各试剂以分开的口服剂量制剂给予。相似地，本文所述组合物(例如，包括包含编码本文所述工程改造的TCR的序列的慢病毒载体颗粒，或包括用这样的颗粒离体修饰的T细胞的组合物，或包括工程改造的TCR的组合物)和其它活性剂可一起以单一肠胃外剂量组合物(如以盐溶液或其它生理学可接受的溶液)给予哺乳动物对象，或各试剂以分开的胃肠外剂量制剂给予。在使用分开的剂量制剂的情况中，本文所公开的组合物和一种或多种其他活性剂可在基本相同时间(即同时)给予，或在单独的交错时间(即依次)以任意顺序给予；应理解组合疗法包括所有这些方案。因此，在某些实施方式中，还考虑了将本文所公开的一种或多种组合物与一种或多种其它治疗剂联合给予。本领域可以接受这样的治疗剂作为癌症的标准治疗。考虑的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、免疫检查点抑制剂、包括TLR4激动剂的TLR激动剂，如吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)(述于例如US8273361、WO2008/153541和WO2009143457中，其公开内容通过引用其全部内容纳入本文)、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化学治疗剂、放射性治疗剂或其它活性剂和辅助剂。
在某些实施方式中，本文所公开的治疗组合物可与任何数量的免疫检查点抑制剂联合给予。免疫检查点抑制剂包括这样的抗体或其抗原结合片段，其结合并阻断或抑制以下一种或多种的活性：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3和GAL9。说明性的免疫检查点抑制剂包括曲美木单抗(CTLA-4阻断抗体)、抗-OX40、PD-L1单克隆抗体(抗-B7-H1；MEDI4736)、伊匹单抗(ipilimumab)、MK-3475(PD-1阻断剂)、尼弗单抗(Nivolumamb)(抗-PD1抗体)。
在某些实施方式中，本文所公开的组合物可与任何数量的化学治疗剂联合给予。化学治疗剂的示例包括烷化剂，如塞替哌和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲基三聚氰胺；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲二氯二乙胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、吡葡亚硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如阿柔比星、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、C放线菌素、卡奇霉素、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、D放线菌素、道诺霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、去甲氧柔红霉素(idambicin)、马赛罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、波非罗霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、块菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物、如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺素剂，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如叶烷酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝拉布昔(bestrabucil)；比生群；伊达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋胺；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐糖(sizofran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2'0.2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；硫替派；紫杉醇类，如紫杉醇(新泽西州普林斯顿的布里斯托-迈尔斯施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ))和多西他赛(法国安东尼市的罗纳普朗克乐安公司(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France))；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；二羟基蒽醌；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，如TargretinTM(蓓萨罗丁)、PanretinTM(阿利维A酸)；ONTAKTM(地尼白介素)；埃斯培拉霉素；卡培他滨；和上述任意药物的药学上可接受盐、酸或衍生物。该定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、凯奥昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和法乐通(Fareston)；和抗雄激素剂，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述药物的药学上可接受盐、酸或衍生物。
在某些实施方式中，本公开提供了这样一种治疗、抑制与NY-ESO-1表达相关联癌症的进展或预防这种癌症的方法，其通过向患有与NY-ESO-1表达相关联癌症的哺乳动物对象给予治疗有效量的本文所述工程改造的TCR，包括编码本文所公开的工程改造的TCR的核酸的慢病毒载体，或包括用这样的颗粒离体修饰的T细胞的组合物，并且进一步向该患者给予包括假型化慢病毒颗粒的组合物，所述假型化慢病毒颗粒包括靶向树突细胞并且可以因此被用于树突细胞疫苗接种的包膜(参见，例如，美国专利号8329162；8372390；8273345；8187872；8323662和公布的PCT申请WO2013/149167)。以此方式，使用本文所述慢病毒载体通过体内或离体遗传修饰可以生成抗原特异性T细胞，并且其后使用嗜DC慢病毒载体通过树突细胞的主动免疫在体内加强。
在另一实施方式中，本公开提供了这样一种治疗、抑制NY-ESO-1癌症的进展或预防这种癌症的方法，其通过向患有NY-ESO-1癌症的哺乳动物对象给予治疗有效量的包括本文所述工程改造的TCR的组合物，包括这样慢病毒载体的组合物，所述慢病毒载体包括编码本文所述工程改造的TCR的核酸，或包括用这样的颗粒离体修饰的T细胞的组合物，并且其后通过向该患者给予这样的组合物进一步加强该免疫应答，所述组合物包括TLR3激动剂，如吡喃葡糖基脂A(GLA)(参见see e.g.,美国专利号8,273,361和公开的申请WO2012/141984和US20120328655)，有抗原或没有抗原。以此方式，使用本文所述慢病毒载体通过体内或离体遗传修饰可以生成抗原特异性T细胞，然后通过树突细胞的活化在体内加强。
处于本发明方法中将宿主细胞或细胞群给予对象的目的，细胞可以是与宿主同种异体或自体同源的细胞。优选地，细胞与对象是自体同源的。
本文所指对象可以是任何对象。优选地，对象是哺乳动物。本文所用术语“哺乳动物”指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目哺乳动物，如小鼠和仓鼠，以及兔形目哺乳动物，如兔。乳动物优选来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。更优选哺乳动物来自偶蹄目，包括牛科(牛)和猪科(猪)，或者奇蹄目，包括马科(马)。最优选的是，哺乳动物是灵长目、Ceboid或Simoid(猴)或类人猿目(人类和猿)。特别优选的哺乳动物是人。
药物组合物和试剂盒
本文还考虑了这样的药物组合物和试剂盒，其包含一种或多种(1)本文所述的工程改造的TCR；(2)包括编码工程改造的TCR的核酸的病毒颗粒；(3)经修饰以表达本文所述工程改造的TCR的免疫细胞，如T细胞或NK细胞；(4)编码本文所述工程改造的TCR的核酸。在一些实施方式中，本公开提供了包括慢病毒载体颗粒材料的组合物，所述慢病毒载体颗粒包括编码本文所述工程改造的TCR的核苷酸序列(或已经使用本文所述载体颗粒修饰以表达工程改造的TCR的T细胞)。这样的组合物可以本公开在本文后续所述方法给予对象。
按照本领域技术人员基于本公开将显而易见的已知技术或其变形，包括本文所述修饰的T细胞的组合物可以被用于将用于过继免疫疗法的方法和组合物。参见，例如，Gruenberg等的美国专利公开号2003/0170238；同样参见Rosenberg的美国专利号4,690,915，其公开通过引用其全部内容纳入本文。
在一些实施方式中，细胞通过这样进行配置，首先将其由其培养基收获，然后清洗，并将细胞浓缩于适合以治疗有效量给予的培养基和容器系统(“药学上可接受的”运载体)。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、Normosol R(雅培公司(Abbott))或Plasma-Lyte A(巴克斯特(Baxter))，并且可以使用5％右旋糖水溶液或林格氏乳酸。该输注介质可以补充由人血清白蛋白。
组合物中治疗有效量的细胞通常大于102个细胞，并且上至106个、上至并且包括108个或109个细胞，并且可以超过1010个细胞。细胞的数量将取决于该组合物预期的最终用途，其中包含的细胞类型也是如此。例如，如果需要对特定抗原具有特异性的细胞，那么该群体将包括大于70％，通常是大于80％、85％和90-95％的这样的细胞。对于本文所提供的用途，系统通常是1升或更少的体积，可以是500ml或更少，甚至是250ml或100ml或更少。因此，所需细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且常常大于107个细胞/ml，常常是108个细胞/ml或更大。可以将免疫细胞的临床相关数量分配成累积等于或超过109、1010或1011个细胞的多次输注。
本发明提供的药物组合物可以是多种形式，例如，固体、液体、粉末、水性或冻干形式。合适的药物运载体的示例在本领域是众所周知的。可以通过常规方法配置这样的运载体和/或佐剂，并可以合适的剂量给予对象。诸如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂的稳定剂可以保护组合物免于在体内降解。对于旨在通过注射给药的组合物，可包含一种或多种表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等张剂。
可以将本文所述工程改造的TCR或包括编码本文所提供的工程改造的TCR的核苷酸序列的病毒载体颗粒包装成试剂盒。试剂盒可以任选地包括一种或多种组分，如使用说明书、装置和其它试剂及组分，如用于使用该方法的管、容器或注射器。示例性的试剂盒可以包括编码工程改造的TCR的核酸、工程改造的TCR多肽或本文所提供的病毒，并且可以任选地包括使用说明书、用于在对象中检测病毒的装置，用于将组合物给予对象的装置，以及用于将组合物给予对象的装置。
本文也考虑了包括编码感兴趣的基因(例如，工程改造的TCR)的核酸的试剂盒。本文还考虑了这样的试剂盒，其包括编码感兴趣的序列(例如，工程改造的TCR)的病毒载体和任选地编码免疫检查点抑制剂的多核苷酸序列。
本文考虑的试剂盒还包括用于实施这样方法的试剂盒，所述方法用于检测编码本文所公开的公共TCR VβCDR3序列中的任何一种或多种的多核苷酸是否存在。具体而言，这样的诊断试剂盒可以包括用于深度测序的适当的扩增或检测引物集合和其它相关试剂，以检测编码本文所公开公共TCR VβCDR3序列的多核苷酸。在其他实施方式中，本文的试剂盒可以包括用于检测包括TCR VβCDR3的TCR多肽的试剂，如抗体或其它结合分子。诊断试剂盒还可以包含用于确定编码公共TCR VβCDR3序列的多核苷酸存在与否或确定包括本文所公开的公共TCR VβCDR3的TCR多肽存在与否的说明书。
试剂盒还可含有说明书。说明书通常包括这样的有形表达，其描述了病毒，和任选地包括在该试剂盒中的其它组分，和给药方法，包括用于确定对象的适当状态、适当剂量和适当给药方法的方法，从而用于给予病毒。说明书还可包括用于在治疗期间监测对象的指南。
本发明提供的试剂盒还可包括用于向对象给予本文所述组合物的装置。用于给予药物或疫苗的本领域已知的多种装置中的任一种都可包含在本发明提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于：皮下针头、静脉内针头、导管、无针注射装置、吸入器和液体分散器，如点眼药器。通常，用于给予试剂盒病毒的装置将与试剂盒病毒相容；例如，可以将诸如高压注射装置等无针注射装置包括在具有将不会被高压注射损伤的病毒的试剂盒中，但通常不包括具有将被高压注射损伤的病毒的试剂盒中。
本文提供的试剂盒可以包括用于将这样的物质给予对象的装置，所述物质诸如T细胞激活剂或刺激物，或TLR激动剂，如TLR4激动剂(参见例如，美国专利号8,273,361，其公开通过引用其全部内容纳入本文)。可以将本领域已知用于将药物给予对象的多种装置中的任一种包括在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括皮下针头、静脉内针头、导管、无针注射装置，但不是不限于，皮下针头、静脉内针头、导管、无针注射装置、吸入器和液体分散器，如点眼药器。通常，用于给予试剂盒化合物的装置将与化合物给予所需的方法相容。
通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。
实施例
实施例1:采用LV305的处理增加治疗后NY-ESO-1特异性T细胞的多克隆亲和性
该实施例证明，通过ELISPOT的检测，采用LV305的处理增强了识别NY-ESO-1肿瘤抗原的T细胞的多克隆亲和性。
在这项对LV305的研究中，患者接受3次LV305注射，其是一种编码NY-ESO-1肿瘤抗原的树突细胞嗜性(tropic)慢病毒载体。通过ELISPOT检测T细胞对疫苗接种前(Tx前)和疫苗接种后(Tx后)PBMC样品中NY-ESO-1的应答，其中用NY-ESO-1肽混合物刺激细胞40小时，并且通过对用抗-IFN-γ抗体预包覆的平板中的斑点进行计数来测量分泌IFN-γ的T细胞数量。
如图1所示，在测试的所有NY-ESO-1浓度(1670、334、60和12nM)，Tx后T细胞对NY-ESO-1肽混合物的应答比Tx前T细胞高。在进行测试的两个较低浓度(12和60nM)中，并未在Tx前样品中检测到T细胞应答，但是在Tx后样品中存在显著的T细胞应答。这些数据证明，用LV305的处理增强T细胞对NY-ESO-1的应答，并且导致较高亲和性的NY-ESO-1特异性T细胞，其在低浓度的NY-ESO-1肽的存在下识别该抗原。
实施例2：与Tx前PBMC相比，肿瘤抗原特异性TCR序列在Tx后PBMC中富集
该实施例证明，采用LV305的处理导致外周血中NY-ESO-1特异性TCR序列富集。
在该研究中，PBMC收集自LV305处理前和LV305三次接种后的患者。还从该患者处收集Tx前肿瘤样品。对PBMC和肿瘤样品进行DNA提取，随后进行T细胞受体(TCR)β链的测序分析。使用散点图分析Tx前和Tx后PBMC之间的序列相似性。然后，来自肿瘤样品的TCR序列也与Tx前和Tx后PBMC针对相似性进行比较。结果表明，相较于Tx前PBMC，来自浸润肿瘤样品的T细胞的TCR序列在Tx后PBMC中富集。
实施例3：由Tx后PBMC建立了针对NY-ESO-1特异性T细胞高度富集的寡克隆培养物
该实施例证明，由Tx后PBMC建立了针对NY-ESO-1特异性T细胞高度富集的寡克隆培养物。通过使用来自用LV305疫苗接种后患者的PBMC开始培养。将PBMC在IL-2和IL-7(10ng/mL)存在的情况下培养于具有NY-ESO-1重叠肽(0.5ug/mL，JPT科技公司(JPTTechnologies)，德国柏林)的OpTmizer T细胞扩增培养基(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中。重复刺激后以及长期培养(>3个月)后，PBMC培养物针对NY-ESO-1特异性T细胞高度富集。如图3所示，富集的T细胞在用NY-ESO-1肽刺激后分泌大量IFN-γ。TCR测序分析显示该培养物是非常寡克隆的，因为前6个克隆占所有T细胞的超过90％。
实施例4：与Tx前PBMC相比，寡克隆培养物中的高频率TCRβ CDR3序列在Tx后PBMC 中富集
该实施例证明，相较于Tx前PBMC，来自NY-ESO-1刺激的寡克隆培养物(PT151006IVS3)的TCR序列在Tx后PBMC中富集。使用散点图分析Tx前和Tx后PBMC之间的序列相似性(图4)。然后，来自PT151006IVS3的前6个TCR序列也与Tx前和Tx后PBMC针对相似性进行比较。结果表明，相较于Tx前PBMC，来自PT151006IVS3的TCR序列在Tx后PBMC中富集。
实施例5：可以在PT151016Tx后PBMC中检测到在PT151006IVS3中具有20.5％频率 的TCRβ CDR3克隆
该实施例证明，同样在PT151016Tx后PBMC中检测到来自PT151006IVS3的第二优势克隆(图5)。应注意，两个亲本具有不同的I类HLA背景(参见表4)。来自IVS3的第二优势克隆(20.5％频率)TCRβ链的CDR3序列是CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2)。如图5所示，在来自PT151016的Tx后PBMC中以0.0003％的频率检测到该氨基序列，而在来自PT151016的Tx前PBMC中并未检测到该氨基序列。
实施例6：可以在PT151016Tx后PBMC中检测到在PT151006IVS3中具有8.5％频率的 TCRβ CDR3克隆
该实施例证明，同样在PT151016Tx后PBMC中检测到来自PT151006IVS3的第五优势克隆。来自IVS3的第五优势克隆(频率8.5％)TCRβ链的CDR3序列是CASSLNRDQPQHF(SEQ IDNO:3)。如图6所示，在来自PT151016的Tx后PBMC中以0.0006％的频率检测到该氨基序列，而在来自PT151016的Tx前PBMC中并未检测到该氨基序列。
实施例7：可以在PT151014Tx后PBMC中检测到在PT151006IVS3中具有26.2％频率 的TCRβ CDR3克隆
该实施例证明，在PT151014Tx后PBMC中同样检测到来自PT151006IVS3(26.2％频率)的优势克隆。该克隆的CDR3序列是CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)。如图7所示，在来自PT151014的Tx后PBMC中以0.000762％的频率检测到该氨基序列，而在来自PT151014的Tx前PBMC中并未检测到该氨基序列。
实施例8：前6个TCRβ CDR3克隆中的3个是多于一个患者之间共有的公共克隆
该实施例证明，我们发现的3个公共序列在具有不同的HLA背景的多位患者中检测到，并且在LV305治疗后取样的PBMC中频率增加。
TCR的第一公共CDR3序列是CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2)。如表1所示，在来自PT151006的Tx前PBMC中检测到该序列为0.001％，而在来自相同患者的Tx后PBMC中增加到0.003％。在来自PT151006的Tx前PBMC中无法检测到该序列(0％)，而在来自相同患者的Tx后PBMC中可以检测到该序列为0.0003％。在来自PT151050的Tx前PBMC中无法检测到该序列(0％)，而在来自相同患者的Tx后PBMC中可以检测到该序列为0.0003％。
表1. 8位患者的Tx前和Tx后PBMC样品中第一公共TCRβCDR3序列的频率。该表显示收集自用LV305处理之前或之后的不同患者PBMC样品中CDR3序列(CASSLNRDYGYTF)(SEQ IDNO:2)的频率。例如，在来自PT151006的Tx前PBMC中检测到该序列为0.001％，而在来自相同患者的Tx后PBMC中增加到0.003％。在来自PT151006的Tx前PBMC中无法检测到该序列(0％)，而在来自相同患者的Tx后PBMC中可以检测到该序列为0.0003％。在来自PT151050的Tx前PBMC中无法检测到该序列(0％)，而在来自相同患者的Tx后PBMC中可以检测到该序列为0.0003％。
TCRβ的第二公共CDR3序列是CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)。如表2所示，在来自PT151006的Tx前PBMC中检测到该序列为0.0058％，而在来自相同患者的Tx后PBMC中增加到0.017％。该序列还可以在来自该患者的Tx前肿瘤活检中检测到(0.06％)，以及来自相同患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)培养物TIL-PC12-04A1中检测到0.002％。在来自PT151004的Tx前PBMC中无法检测到该序列(0％)，而在来自相同患者的Tx后PBMC中可以检测到该序列为0.000109％。在来自PT151050的Tx前PBMC中无法检测到该序列(0％)，而在来自相同患者的Tx后PBMC中可以检测到该序列为0.0012％。总之，可在8位患者中的6位中检测到该TCR，5/8位患者Tx后样品频率增加，而1/8位患者中降低。
表2. 8位患者的Tx前和Tx后PBMC样品中第二公共TCRβCDR3序列的频率。该表表示收集自用LV305处理之前或之后的不同患者PBMC样品中CDR3序列(CASSLNRDQPQHF)(SEQ IDNO:3)的频率。例如，在来自PT151006的Tx前PBMC中检测到该序列为0.0058％，而在来自相同患者的Tx后PBMC中增加到0.017％。该序列还可以由该患者固定的肿瘤检测到(0.06％)，以及该患者的TIL培养物检测到，其为0.000647％。在来自PT151006的Tx前PBMC中无法检测到该序列(0％)，而在来自相同患者的Tx后PBMC中可以检测到该序列为0.0006％。在来自PT151050的Tx前PBMC中无法检测到该序列(0％)，而在来自相同患者的Tx后PBMC中可以检测到该序列为0.0012％。
TCRβ的第三公共CDR3序列是CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)。如表3所示，在来自PT151006的Tx前PBMC中该序列为0％，而在来自相同患者的Tx后PBMC中增加到0.000196％。在来自PT151-014的Tx前PBMC中无法检测到该序列(0％)，而在来自相同患者的Tx后PBMC中可以检测到该序列为0.000761％。在来自PT151050的Tx前PBMC中还检测到该序列为0.000274％。
表3.8位患者的Tx前和Tx后PBMC样品中第三公共TCRβCDR3序列的频率。该表表示收集自用LV305处理之前或之后的不同患者PBMC样品中CDR3序列(CASRLAGQETQYF)(SEQ IDNO:4)的频率。该序列可在除了PT151006以外的PT151014和PT151050中检测到。
8位患者的Tx前和Tx后PBMC中三个鉴定的公共TCRβCDR3的频率总结在图8中。
实施例9：三个鉴定的公共TCRβ的CDR3具有公共TCR的典型特征
该实施例证明，鉴定的TCRβCDR3序列具有公共TCR的典型特征：(1)它们由不同患者的不同核苷酸序列编码；(2)它们具有相对短的CDR3长度；并且(3)它们具有相对有限的未模板化的核苷酸添加。所有这些特征都是公共TCR的序列的特性(Venturi Nat RevImmunol 2008)。
TCR Vα和Vβ基因区段的多样化取决于不同CDR1和CDR2区域(在不同的V基因区段中编码)的使用。CDR3通过体细胞重组后不同V(D)J种系区段的并列产生，并且由于V(D)J基因重排期间缺乏精确性以及非模板编码的核苷酸(N)在V(D)J接合处的添加进一步增加原初TCR库的多样性(Turner,等,Nature Review Immunology 2006)。
生成公共TCR的一种可能的方式是通过汇聚重组。也就是许多不同的V(D)J重组事件“汇聚”以生成相同的核苷酸序列，并且许多不同的核苷酸序列“汇聚”以编码相同氨基酸序列(Venturi,等,Nature Review Immunology 2008)。如图9和图12所示，我们所鉴定的公共TCR序列在不同个体中具有不同的核苷酸序列。
据报道，相较于非共有TCR，共有的TCR CDR3的aa序列趋于更短，平均短约一个aa残基，并且此外显示出在VD和DJ结合中更低数量的核苷酸(nt)插入(Madi,等,GenomeResearch,2014)。IVS3中TCRβCDR3长度分布的比较显示IVS3中的T细胞(图10A，黑色柱)相比Tx后PBMC中未刺激的T细胞(图10A，阴影线柱)具有相对较短的CDR3区域。如图10B所示，所有三个公共TCR都具有相同的CDR3长度(n＝39核苷酸)。这些TCR在结合区还具有相对较少的无模板(NT)核苷酸(nc)添加。所鉴定的公共TCR中的一个，即CASRLAGQETQYF(SEQ IDNO:4)，其在N1(VD)插入位点不具有NT nc添加并且在N2(DJ)插入位点不具有nt添加。较短长度的表型特征以及有限数量的NT nc添加支持了这些TCRβCDR3序列是公共TCR序列的结论。
实施例10：用LV305处理的患者的HLA组织分型结果
将患者样品送至进行商业HLA组织分型服务。结果总结在如下表4中，并且确认了在共有公共TCR CDR3的患者间HLA-A或HLA-B等位基因中没有重叠。HLA-DR、DP或DQ等位基因在患者间也不相同。
表4：用LV305处理的4位患者的HLA组织分型结果
实施例11：来自用LV305治疗患者的公共TCR的TCRα和TCRβ可变区的测序
使用5’-RLM-RACE(安碧公司(Ambion)，得克萨斯州奥斯汀)进行TCR克隆。该方法可以使无需在事先了解可变结构域序列的情况下鉴定TCR成为可能。简言之，使用提取由NY-ESO-1特异性T细胞分离RNA。然后将纯化的RNA去磷酸化，使用烟草酸焦磷酸酶去帽化，并连接5'衔接体。然后，按照生产商说明，使用M-MLV逆转录酶(安碧公司，得克萨斯州奥斯汀)和随机十聚物由RNA制备cDNA。然后，将该cDNA用于PCR。使用退火至5’衔接体的引物和TCRα或TCRβ的恒定区进行PCR(说明性引物和序列，如pCa1和pCb1，列于出版物中，即Walchli,等,(2011)T细胞受体克隆和表达的实用方法(A Practical Approach to T-CellReceptor Cloning and Expression).PLoS ONE 6(11):e27930；但是出于克隆目的，经修饰添加了限制性位点)。然后消化扩增子，凝胶纯化，并利用纳入PCR引物中的限制性位点克隆到制备的载体中。然后将包含菌落的琼脂平板送出以对克隆的TCR mRNA进行测序。
对来自针对TCRβ的2个分开的PCR轮的151个克隆进行测序。发现两个不同的TCRβ可变区序列以高频率出现，其中一个包含之前鉴定并在SEQ ID NO:4中提供的公共VβCDR3序列。包含公共VβCDR3(SEQ ID NO:4)的全长TCRβ可变区序列在SEQ ID NO:9中提供并示于图11。另一TCRβ可变区序列在SEQ ID NO:16中提供并示于图13(该序列可以被注释，并且使用诸如在IMGT数据库网站上描述的那些标准方法鉴定TCR的不同区域)。对来自2个分开的PCR轮的约100个克隆进行针对TCRα的测序。鉴定单TCRα链可变区，并且在SEQ ID NO:8中提供且示于图11。TCRα序列的BLAST检索表明与已知的NY-ESO-1特异性TCRα序列具有同源性(参见PDB:2BNQ_D；Boulter等,Protein Eng.(2003)16(9):707-711；Chen,J.L.等(2000)J.Immunol.,165,948–955)。在使用SEQ ID NO:9的TCRβ序列的相似检索中并未鉴定出已知的匹配。
实施例12：G100处理后具有公共TCR的NY-ESO-1特异性T细胞浸润肿瘤
该实施例证明，最初由LV305免疫疗法试验中肉瘤患者鉴定的公共TCRβCDR3序列可在来自使用G100的两个不同的临床试验的患者中被检测到，所述G100是处于稳定乳液状态的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)的瘤内注射剂。第一G100试验(NCT02035657)是在梅克尔细胞癌(MCC)患者中GLA-SE的概念验证试验。第二G100试验(NCT02180698)是TLR4激动剂GLA-SE和放射疗法，用于治疗具有转移性软组织肉瘤或无法通过手术切除的软组织肉瘤的患者。在给予G100之前和之后获取肿瘤位点或引流淋巴结的活检物。从活检组织和外周血提取DNA，并进行TCRβCDR3区域的深度测序以评估T细胞库的多样性。出乎意料的是，在梅克尔细胞癌(MCC)和肉瘤患者中也检测到在LV305患者PT151006中鉴定到的几种公共TCR，这些患者通过与辐照组合的瘤内G100治疗受到局部免疫调节。表5至表7列出G100前和G100后PBMC中以及一位MCC患者和两位肉瘤患者活检样品中3个公共TCR的频率。在MCC患者G2和肉瘤患者P13中可检测到第一公共TCRβCDR3，即CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2)。在MCC患者G2和肉瘤患者P12中可检测到第二公共TCRβCDR3，即CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)。在MCC患者G2中可检测到第三公共TCRβCDR3，即CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)。
表5：G100患者中第一公共TCRβCDR3序列(CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2))的频率。示出的是G100前和G100后PBMC和来自G100-MCC患者(G100-MCC-G2)和两位G100-肉瘤患者(G100-肉瘤-P12和G100-肉瘤-P13)的肿瘤活检中公共TCR的存在(频率)。在来自患者G2的Tx后活检中检测到序列为0.000442％，但是并未在Tx前活检或PBMC样品中检测到。
表6：G100患者中第二公共TCRβCDR3序列(CASSLNRDQPQHF)的频率。示出的是G100前和G100后PBMC和来自G100-MCC患者(G100-MCC-G2)和两位G100-肉瘤患者(G100-肉瘤-P12和G100-肉瘤-P13)的肿瘤活检中公共TCR的存在(频率)。在来自G2和的Tx前PBMC中检测到该序列。
表7：G100患者中第三公共TCR TCRβCDR3序列(CASRLAGQETQYF)的频率。示出的是G100前和G100后PBMC和来自G100-MCC患者(G100-MCC-G2)和两位G100-肉瘤患者(G100-肉瘤-P12和G100-肉瘤-P13)的肿瘤活检中公共TCR的存在(频率)。在来自患者G2的Tx后活检中检测到序列为0.000442％，但是并未在Tx前活检或PBMC样品中检测到。
G2是具有表达NY-ESO-1的肿瘤的MCC患者，其在肿瘤内G100治疗后具有完全应答。如图14所示，来自该患者的G100前活检显示NY-ESO-1表达，其在G100后活检中减少约3倍，这与G100治疗后细胞角蛋白(CK20)阳性肿瘤细胞消失后相一致。如图15所示，在G100前活检中无法检测到的两种公共TCRβCDR3在G100后活检查中可检测到。这些数据表明，用G100调节肿瘤微环境可能已经将具有公共TCR的抗原特异性T细胞从外周血中导入肿瘤。这些发现进一步支持了将公共TCRβ序列作为用于NY-ESO-1特异性免疫治疗的生物标志物的研究。
实施例13：来自LV305临床试验的患者中鉴定的公共TCRβCDR3也可以在来自C131 临床试验的患者中检测到
该实施例证明，由来自LV305试验(NCT02122861)的患者PT151006鉴定的三种公共TCRβCDR3序列也可以在来自不同临床试验C131(NCT02387125)的患者中检测到。
C131是在具有表达NY-ESO-1的局部晚期、复发性或转移癌症的患者中进行的CMB305的1b阶段安全性研究(依次给予LV305和G305(G305组成如下：与被称为吡喃葡糖基脂A(GLA)(一种TLR4激动剂)的合成小分子配制的重组NY-ESO-1蛋白，并且被设计成通过诱导抗原特异性CD4“辅助”T细胞来促进CTL应答)。我们使用由PT151006鉴定的公共序列检查了来自13位C131患者的TCRβCDR3库。如表8所示，在13位C131患者中的3位患者中检测到第一公共TCRβCDR3序列，即CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2)；如表9所示，在13位C131患者中的6位患者中检测到第二公共TCRβCDR3序列，即CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)；如表10所示，在13位C131患者中的6位患者中检测到第三公共TCRβCDR3序列，即CASRLAGQETQYF(SEQ IDNO:4)。这些数据显示，来自PT151006的CDR3序列在来自不同试验的患者中共有。在4位患者中，这些公共TCR在给予CMB305方案后被检测到，因此可能是由该治疗所诱导的。
实施例14：鉴定自LV305临床试验的三个公共TCRβ的CDR3可以在来自抗-CTLA-4试 验的患者中检测到
该实施例证明，鉴定自LV305的公共TCRβCDR3序列可以在接受采用特姆单抗的抗-CTLA4mAb疗法的患者中检测到(Robert,等,Clin Can Res,2014)。
在该使用特姆单抗的试验中，在基线和接受特姆单抗后30-60天收集PBMC。使用下一代测序以研究TCRβ的CDR3区域。将21位患者的测序数据保存在可通过AdaptiveImmunoSEQ分析仪软件访问的在线数据库中。来自PT151006-IVS3的CDR3序列和接受抗-CTLA4疗法的21位患者的序列进行比较的数据库查询显示，鉴定自PT151006的3个公共序列也可以在进行CTLA4疗法的那些患者中检测到(图16)。
进行CTLA4阻断治疗的患者中观察到增加的TCR V-βCDR3富集程度(richness)和香农多样性指数(Shannon index diversity)(Robert,等,Clin Can Res,2014)。对于公共TCR的频率，抗CTLA4治疗后，频率增加或减少并没有明确的趋势，并且因患者而异。应注意的是，CTLA4试验中具有完整应答(CR)的三位患者中的一位(GA18)的Tx后PBMC中检测到所有三个公共序列，然而并未在Tx前PBMC中检测到三个公共序列中的任一个。这些公共CDR3序列作为治疗应答的生物标志物的潜在用途需要进一步研究。
实施例15：相同或不同患者中对于相同CDR3的不同TCRβ V的使用
该实施例证明，相同的CDR3区域可与不同患者中或甚至相同患者中的不同TCRβV基因配对。
图17列出通过深度测序分析检测将与相同CDR3关联的不同的TCRβV基因的使用。CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)是第二公共CDR3，其是在PT151006和PT151119检测到的。该CDR3主要使用PT151006中的TCRβV07-07。其还使用PT151006中的TCRβV07-08、TCRβV07-06、TCRβV07-09、TCRβV07-02、TCRΒV07-03和TCRβV07-04。在PT151119中，针对该CDR3仅使用TCR V07-08。这表示不同的患者可以使用不同的TCRβV-基因家族针对相同的CDR3，并且不同的TCRβV-基因可以用于相同的患者针对相同的CDR3。应注意的是，J基因的使用(TCRβJ01-05)对于两种患者都是相同的。
图19列出了来自不同试验患者中TCRβ的V基因和J基因、核苷酸序列和CDR3氨基酸序列。PT151006来自LV305临床试验；C131-001和C131-013来自CMB305试验；G2-C1W4B来自G100试验。该图中的数据表面来自不同试验的患者可以具有相同的CDR3氨基酸序列，但是具有不同的核苷酸序列和不同的TCRβV-基因使用。在患者C131-013的情况中，发现三个不同的核苷酸编码具有不同TCRβV-基因使用的相同CDR3，即CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)。这与PT151006的观察相似，如图17和图18所示。
实施例16：由NY-ESO-1特异性CD4T细胞鉴定公共CDR3
该实施例显示用于鉴定公共TCRβCDR3的体外生成的细胞培养物包括CD4T细胞。
为了表征PT151006-IVS3T细胞培养物的表型，我们将培养的细胞与来自正常供体的未培养的PBMC并列染色。用针对T细胞标志物(CD3、CD4和CD8)和NK细胞标志物(CD56)的单克隆抗体使用荧光染料偶联的单克隆抗体对细胞进行染色，然后在BD LSRII流式细胞仪上分析。使用FlowJo软件进行数据分析。如图20所示，首先在FSC/SSC图区上门选淋巴细胞群，然后将CD4T细胞门选为CD3+CD4+淋巴细胞，并且将CD8T细胞门选为CD3+CD8+淋巴细胞。将NK细胞门选为CD3-CD56+淋巴细胞。对照供体PBMC具有预期的CD4、CD8T细胞和NK细胞百分比，如同在健康供体PBMC中通常观察到的一样。相反，来自PT151006-IVS3的培养细胞显示出缺乏NK细胞和CD8T细胞，并且仅包括CD4T细胞。该数据表明，由PT151006培养的NY-ESO-1特异性T细胞系是CD4T细胞，并且公共TCR是CD4TCR。
也可以组合所述各种实施方式以提供其他实施方式。本说明书中提及的和/或列于申请数据表单中的所有美国专利、美国专利申请公开文本、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开文本均通过引用其全文纳入本文。所述实施方式的各方面可被修改，必要时可应用各种专利、申请和出版物的概念，以提供更多的实施方式。
根据上述详细说明可对实施方式进行这些和其他改变。总体而言，权利要求中所用的术语应不被认为是将权利要求限制到本说明书和权利要求中公开的具体的实施方式，而应认为是包括遵循与所列权利要求等同的完全范围的所有可能的实施方式。因此，权利要求并不受本公开内容限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 免疫设计股份有限公司
<120> NY-ESO-1特异性TCR及其使用方法
<130> 31943/49487A
<150> US 62/216,099
<151> 2015-09-09
<150> US 62/377,276
<151> 2016-08-19
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 公共TCR CDR3共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(12)
<223> Xaa是任何氨基酸
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
aggctggagt tggctgctcc ctcccagaca tctgtgtact tctgtgccag cagacttgcg 60
ggccaagaga cccagtactt cgggcca 87
<210> 23
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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accctggagt ctgccaggcc ctcacatacc tctcagtacc tctgtgccag cagactagcg 60
ggacaggaga cccagtactt cgggcca 87
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<212> DNA
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tgtgctagca gcttgaacag ggaccagccc cagcatttt 39
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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tgtgccagca gcttaaacag ggaccagccc cagcatttt 39

Claims (48)

1.一种嵌合异二聚体T细胞受体(TCR)多肽，其包括：
a.第一多肽，其包括TCR β链可变区、TCR β链恒定区、以及任选地跨膜结构域和胞质信号转导结构域；
b.第二多肽，其包括TCR α链可变区、TCR α链恒定区、以及任选地跨膜结构域和胞质信号转导结构域；
其中，所述异二聚体TCR特异性结合NY-ESO-1/MHC复合物，其中所述TCR β链可变区包括SEQ ID NO:9所示的TCR β链可变区氨基酸序列；其中所述TCR α链可变区包括SEQ IDNO:8所示的同源TCR α链可变区氨基酸序列；并且其中所述第一多肽和所述第二多肽之间存在至少一个二硫键。
2.如权利要求1所述的嵌合TCR，其中，所述TCR β链可变区CDR3包括氨基酸序列CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)。
3.如权利要求1所述的嵌合异二聚体TCR，其是可溶的，其中，所述第一多肽和所述第二多肽不包括所述跨膜结构域和所述胞质信号转导结构域。
4.一种核酸，其包括编码权利要求1所述的嵌合异二聚体TCR的多核苷酸序列。
5.一种表达载体，其包括权利要求4所述的核酸。
6.如权利要求5所述的表达载体，其是逆转录病毒载体。
7.如权利要求5所述的表达载体，其是慢病毒载体。
8.一种分离的细胞，其包括权利要求4所述的核酸或权利要求5所述的载体。
9.如权利要求8所述的细胞，其是T细胞。
10.一种药物组合物，其包括权利要求1所述的嵌合异二聚体TCR、权利要求5所述的载体、权利要求4所述的核酸或权利要求9所述的分离的细胞。
11.一种单链TCR，其包括TCRβ链可变区、TCRα链可变区、恒定区、以及任选地跨膜结构域和胞质信号转导结构域；其中，所述TCRβ链可变区CDR3包括选自CASSLNRDYGYTF(SEQ IDNO:2)、CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)和CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；其中，所述单链TCR对NY-ESO-1/MHC复合物具有特异性。
12.如权利要求11所述的单链TCR，其中，所述TCRβ链可变区包括SEQ ID NO:9中所示的TCR β链可变区氨基酸序列；其中，所述TCRα链可变区包括SEQ ID NO:8中所示的同源TCR α链可变区氨基酸序列。
13.如权利要求11所述的单链TCR，其是可溶的单链TCR；其中，所述单链TCR不包括所述跨膜结构域和所述胞质信号转导结构域。
14.一种核酸，其包括编码权利要求11-14中任一项所述的单链TCR的多核苷酸序列。
15.一种表达载体，其包括权利要求14所述的核酸。
16.如权利要求15所述的表达载体，其是逆转录病毒载体。
17.如权利要求15所述的表达载体，其是慢病毒载体。
18.一种分离的细胞，其包括权利要求14所述的核酸或权利要求16所述的载体。
19.如权利要求18所述的细胞，其是T细胞。
20.一种药物组合物，其包括权利要求11所述的单链TCR、权利要求15所述的载体、权利要求15所述的核酸或权利要求20所述的细胞。
21.一种治疗哺乳动物对象的NY-ESO-1癌症的方法，其包括给予所述对象治疗组合物，所示组合物包括选自权利要求9所述分离的细胞和权利要求19所述分离的细胞的一种或多种治疗剂；其中，以有效治疗对象癌症的量给予所述治疗组合物。
22.一种抑制哺乳动物对象中表达NY-ESO-1的癌细胞增殖的方法，其包括向所述对象给予选自权利要求9所述分离的细胞或权利要求19所述分离的细胞的疗法；其中，所述治疗组合物以有效抑制所述对象中表达NY-ESO-1的癌细胞增殖的量给予。
23.一种治疗癌症的方法，其包括：
(a)鉴定可能受益于NY-ESO-1癌症疗法的哺乳动物对象，其包括确定来自所述哺乳动物对象的样品中是否存在如下物质：
(i)编码TCR多肽的多核苷酸，所述TCR多肽包括对NY-ESO-1具有特异性的TCRβ链可变区互补决定区3(VβCDR3)，其中，所述VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)；或CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)；或同时包括这两者；或者
(ii)包括对NY-ESO-1具有特异性的VβCDR3的TCR多肽，其中，所述VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)；或CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)，或同时包括这两者；
其中，(i)和/或(ii)的存在表明所述对象有可能受益于所述NY-ESO-1癌症疗法；
并且
(b)将所述NY-ESO-1癌症疗法给予所述哺乳动物对象。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述VβCDR3包括选自下组的氨基酸序列：CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2)、CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)和CASRLAGQETQYF(SEQ IDNO:4)、或前述一种或多种的任何组合。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述NY-ESO-1癌症疗法包括给予编码NY-ESO-1多肽的载体。
26.如权利要求23所述的方法，其中，所述载体包括靶向逆转录病毒载体的树突细胞。
27.如权利要求23所述的方法，其还包括向所述对象给予佐剂。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述佐剂是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述GLA配制在稳定的水包油乳液中。
30.如权利要求24所述的方法，其中，所述载体是慢病毒载体。
31.如权利要求23所述的方法，其中，所述NY-ESO-1癌症疗法包括向所述对象给予包括GLA的组合物，所述组合物包括：
(a)下式所示GLA：
其中：
R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；且
R2和R4是C12-C20烷基；以及
(b)药学上可接受的运载体或赋形剂；
其中，所述组合物不包括抗原。
32.如权利要求31所述的方法，其中，R1、R3、R5和R6是十一烷基且R2和R4是十三烷基。
33.如权利要求31所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
34.如权利要求31所述的方法，其中，所述组合物是水性制剂。
35.如权利要求31所述的方法，其中，所述组合物的形式是水包油乳液、油包水乳液、脂质体、胶束制剂或微粒。
36.如权利要求21-35中任一项所述的组合物，其中，所述癌症包括实体瘤。
37.如权利要求21-36中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：肉瘤、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食管癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑素瘤、肝细胞癌、头颈部癌、胃癌、子宫内膜癌、结直肠癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、骨髓性白血病和急性淋巴母细胞性白血病。
38.如权利要求31所述的方法，其中，所述组合物通过皮下、皮内、肌肉内、瘤内或静脉内注射给予。
39.如权利要求21-38中任一项所述的方法，其中，所述组合物与一种或多种其它治疗剂或治疗联用。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述治疗剂是免疫检验点抑制剂。
41.如权利要求39所述的方法，其中，所述治疗剂是激活协同刺激通路的抗体。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述抗体是抗-CD40抗体。
43.如权利要求39所述的方法，其中，所述治疗剂是癌症治疗剂。
44.如权利要求43所述的组合物，所述癌症治疗剂选自：泰索帝、卡铂、曲妥珠单抗、表柔比星、环磷酰胺、顺铂、多西他赛、多柔比星、依托泊甙、5-FU、吉西他滨、氨甲蝶呤和紫杉醇、米托蒽醌、大环内酯B、靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体7A7.27、伏立诺他、罗咪酯肽、二十二碳六烯酸、硼替佐米、紫草素和溶瘤细胞病毒。
45.如权利要求39所述的组合物，其中，所述一种或多种其它治疗处理是放疗。
46.一种鉴定可能受益于NY-ESO-1癌症疗法的哺乳动物对象的方法，其包括：
(a)确定来自所述哺乳动物对象的样品中是否存在如下物质：
(i)编码TCR多肽的多核苷酸，所述TCR多肽包括对NY-ESO-1具有特异性的VβCDR3，其中，所述VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)或CASRLAGQETQYF(SEQ IDNO:4)；或同时包括这两者；或者
(ii)包括对NY-ESO-1具有特异性的VβCDR3的TCR多肽，其中，所述VβCDR3包括氨基酸序列CASSLNRDXXXXF(SEQ ID NO:1)或CASRLAGQETQYF(SEQ ID NO:4)；或同时包括这两者；
其中，(i)和/或(ii)的存在表明所述对象有可能受益于所述NY-ESO-1癌症疗法。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述VβCDR3包括选自下组的氨基酸序列：CASSLNRDYGYTF(SEQ ID NO:2)、CASSLNRDQPQHF(SEQ ID NO:3)和CASRLAGQETQYF(SEQ IDNO:4)、或前述一种或多种的任何组合。
48.一种检测细胞或组织的方法，所述细胞或组织上包括以MHC复合物方式呈递的NY-ESO-1肽抗原，所述方法包括：a)使所述细胞或组织与权利要求3或权利要求13所述可溶性TCR分子或其功能性片段中的至少一种在这样的条件下接触，在所述条件下，呈递的NY-ESO-1肽抗原与所述可溶性TCR或片段之间形成特异性结合复合物，b)在这样的条件下洗涤所述细胞或组织，所述条件适于移除未结合所述呈递的肽抗原的任何可溶性TCR分子或片段；以及c)检测所述特异性结合复合物，所述复合物提示包括所述呈递的肽抗原的细胞或组织。
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