JP2024502170A - 癌のための改良された養子細胞移植療法 - Google Patents

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Abstract

本発明は免疫療法の分野を対象とする。具体的には、本発明は、癌の治療に有用な、養子細胞療法のための改良された細胞組成物と方法を提供する。より具体的には、本発明の実施形態は、活性化細胞傷害性ＣＤ８＋細胞、特に高い細胞傷害性を特徴とするＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋グランザイムＢ＋細胞を高い割合で含む細胞組成物の使用、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から当該細胞組成物を調製する方法、及び癌管理における当該組成物の使用に関する。【選択図】 なし

Description

本発明は免疫療法の分野を対象とする。具体的には、本発明は癌の治療に有用な、養子細胞療法のための改良された細胞組成物と方法を提供する。
養子細胞移植（ＡＣＴ、養子細胞療法とも称される）は、癌免疫療法で最も有望な戦略の１種であり、黒色腫、子宮頸癌、リンパ腫、白血病、胆管癌及び神経芽細胞腫等の様々な種類の癌に対する有効性が証明されている。
ＡＣＴは免疫細胞の抗腫瘍活性の増強を試みる細胞療法である。これは対象から抽出された免疫細胞に基づくが、通常はエクスビボで処理し、大規模に増殖させた後、患者に戻す（自家療法）又は別の個人に移植する（同種異系療法）。ＡＣＴでは、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞及び幹細胞等の様々な免疫細胞を使用することができる。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、患者の腫瘍生検から単離され、エクスビボで増殖されてＡＣＴ組成物を産生する腫瘍特異的Ｔ細胞である。このために、高濃度のＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び照射アロ反応性フィーダー細胞を使用してＴＩＬをエクスビボで増殖することが奨励されており、５日目にＩＬ－２（抗ＣＤ３ではない）を補充する。８～１５日間の増殖で得られた細胞をその後、支持的なＩＬ－２投与と共に患者に戻す。しかし、ＡＣＴ用のＴＩＬ組成物の産生は技術的に困難であり、ＩＬ－２とフィーダー細胞の使用によって望ましくない変異が生じる。更に、このアプローチは、腫瘍試料の入手可能性や、各試料から通常得られる初期ＴＩＬの数が少ないことによって制限される。
ＡＣＴ組成物の産生に使用することができる他の原料は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり、そこからリンパ球集団を単離、増殖、及び／又は様々な手順によって操作し、その有効性を高めることができる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）－ＩＩ依存的細胞傷害性を発揮するために、治療対象に対して自家性又は組織適合性の必要があるＴ細胞とは異なり、ＮＫ細胞（ＣＤ５６又はＣＤ１６の発現とＴＣＲ－ＣＤ３複合体の欠如を特徴とする）やＮＫ－Ｔ細胞等の他のリンパ球集団は、非ＭＨＣＩＩ制限的に作用する。しかし、このような集団は通常、有効性が限られているという特徴があり、臨床効果を示すためには大量の投与を必要とする。
例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞前駆体やＴリンパ球等の様々なリンパ球種で構成されているリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞は、サイトカイン（通常はＩＬ－２）の存在下でＰＢＭＣを培養することによって産生される。このような不均一な細胞組成物は、ＩＬ－２とのインキュベーション後にインビトロで腫瘍細胞のＨＬＡ非依存的溶解を示す。ＬＡＫ細胞は特定の個人において腫瘍退縮を媒介するのに非常に効果的であるが、癌退縮を媒介するには非常に多くの細胞を必要とするため、この治療アプローチを実行するのが難しい場合がある。更に、必要な高用量のＩＬ－２は有毒な副作用を媒介し、その最も一般的なものは、重大な体液貯留を引き起こす毛細血管透過性漏出症候群である。
サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞は、循環前駆体からインビトロで増殖させた非ＭＨＣ制限的な細胞傷害性抗腫瘍細胞である。ＣＩＫ細胞はＴ細胞とＮＫ細胞の両方の特徴を共有する。ＰＢＭＣ、リンパ球除去又は臍帯血から開始するＣＩＫ細胞産生用の増殖プロトコルでは、０日目に１０００Ｕ／ｍＬのヒト組換えヒトインターフェロン－ガンマ（ｒＩＦＮ－γ）を連続的に添加した後、＋１日目に、ＣＤ３（ＯＫＴ３）に対するモノクローナル抗体を５０ｎｇ／ｍＬと５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を添加する必要がある。ＩＬ－２と新鮮な完全Ｘ－ＶＩＶＯ培地（抗ＣＤ３抗体ではない）を５日毎に１４～２１日間添加する。この方法の最後に、２種の主要な細胞集団の産生が報告されている。１種の集団はＣＤ３、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ５６陽性細胞を含み（通常、ＣＩＫと称される）、もう１種の集団はＣＤ３、ＣＤ８及びＮＫＧ２Ｄ陽性細胞とＣＤ５６陰性細胞を含み、細胞傷害活性が欠如していることが報告されている（Introna et al, Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 358）。
ＣＩＫの相対的な安全性プロファイルにも関わらず、臨床診療で使用すると有効性に関して極端な不均一性がもたらされた。治療を受けた患者４２６名に対するＣＩＫ細胞の抗腫瘍効果を調査した１１種の臨床試験の結果から、奏効が報告された３８４名（９０．１％）の内、２４名（５．６％）のみが完全奏効、２７名（６．３％）が部分奏効（ＰＲ）、４０名（９．４％）がやや有効であることが分かった。一方、１６１名（３７．８％）の患者は安定、１２９名（３０．３％）は進行であったが、これはＣＩＫ細胞療法の全体的な有効性は中程度であることを示している（Introna et al，同書）。
ＡＣＴ用の様々な細胞組成物の単離及び／又はエクスビボ増殖のためのプロトコルが開示されている。通常、このようなプロトコルには、サイトカインの存在下での初期刺激及び／又はＴＣＲ／ＣＤ３アクチベーター等の他の刺激、及びそのようなサイトカインとアクチベーターの異なる組み合わせの存在下での増殖又は伝播が含まれることが多い。更に、そのようなプロトコルには、例えば、増殖の前後のいずれかに、アフェレーシス又はフローサイトメトリー又は対応する表面マーカーを標的とするビーズベースの方法によって所望の細胞集団を単離又は富化する追加の工程が含まれることもある。
例えば、ＵＳ２０２０１３８８６１号明細書では、ドナーの末梢血からＣＤ３陰性及びＣＤ５６陽性ＮＫ細胞を単離することを含む、炎症性腸疾患を治療するための養子移植手順が開示されている。ＵＳ１０１４９８６３号明細書では、単離された単核細胞をインビトロで培養し、Ｔ細胞の増殖と活性化を刺激する培養サイトカインを添加し、ＮＫＴ様細胞表面マーカーを使用する細胞選別技法を用いてＮＫＴ様細胞を選別することを含む、単離哺乳動物ＮＫＴ様細胞の調製方法が開示されている。
ＵＳ２０１２２５８０８５号明細書は、腫瘍を有する対象由来の末梢血の細胞試料を用意することと、増殖した細胞集団の少なくとも３５％が活性化ＮＫ細胞とＮＫ様Ｔ細胞を含むまで細胞をインキュベート及び増殖させることと、増殖した細胞を回収することを含む、表現型ＣＤ３－ＣＤ５６＋を有する増殖及び活性化されたＮＫ細胞と表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋を有するＮＫ様Ｔ細胞を取得する方法に関する。特に、ＵＳ２０１２２５８０８５号明細書では、ＰＢＭＣをモノクローナル抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３、１０ｎｇ／ｍＬ）と５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で最初に培養し、５日後に、５％ヒト血清とＩＬ－２を含むがＯＫＴ－３を含まない新鮮な培地を培養物に補充し、これを培養終了まで２～３日毎に行う方法が開示されている。
多くのＡＣＴ組成物の有効性が限られているため、遺伝子改変細胞の使用が提案されている。このような例としては、共有腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープを認識するクローン化組換えＴＣＲαβ鎖を発現するか、又はＴＣＲζ鎖のシグナル伝達ドメインと共刺激分子（ＣＤ２８やＣＤ１３７／４－１ＢＢ等）に融合した腫瘍抗原を認識する免疫グロブリン可変領域で構成されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＰＢＭＣ（又はＮＫ細胞等の他のリンパ球集団）から増殖したＴ細胞が挙げられる。例えば、ＵＳ２０２０３４５７７９号とＵＳ２０２０２２３９２０号では、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）、ＣＩＫ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＬＡＫ細胞及び制御性Ｔ細胞等の様々な細胞集団で発現することができるＣＡＲポリペプチドが開示されている。
近年の癌管理における開発にも関わらず、癌免疫療法で用いることができる更なる手段、改良方法及び細胞組成物が依然として必要とされている。特に、一次的又は二次的な治療に対する非反応性は癌患者の間で非常に蔓延しており、多くの既存の治療はかなりの有害作用を特徴としている。従って、有効性及び／又は安全性を高める治療手法の開発は非常に有益である。更に、生存率の向上及び／又は腫瘍の結合又は保持の強化を示すＡＣＴ用の細胞組成物を得ることが有益となるであろう。
本発明は免疫療法の分野を対象とする。具体的には、本発明は癌の治療に有用な、養子細胞療法（ＡＣＴ）のための改良された細胞組成物と方法を提供する。より具体的には、本発明の実施形態では、高割合の活性化ＣＤ８＋細胞、特にＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋グランザイムＢ＋細胞を含み、細胞傷害性の増強を特徴とする細胞組成物（本明細書では超活性化キラー細胞（ＳＡＫ）と称する）の使用を採用する。本発明は更に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＳＡＫ組成物を産生するための方法、及び癌管理におけるその利用に関する。有利な実施形態によれば、本発明は更に、生存率の向上及び／又は腫瘍の結合及び保持の強化を示す遺伝子改変ＳＡＫ組成物に関する。
本発明は、部分的には、様々な腫瘍細胞に対して非常に強力な抗腫瘍細胞傷害活性を発揮することができるＳＡＫ組成物の開発に基づく。驚くべきことに、本明細書に開示の独特の培養方法によってＰＢＭＣから産生されたＳＡＫ細胞は、他のＰＢＭＣ由来のエフェクター細胞組成物（これまで知られているＡＣＴプロトコルに従って産生された、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ）及びインターロイキン－２（ＩＬ－２）増殖Ｔ細胞組成物が含まれる）よりも腫瘍細胞の根絶において有意に有効であった。更に、産生されたＳＡＫ細胞は、ヒトリンパ腫（Ｒａｊｉ）生着マウスモデルにおいて、インビボでの腫瘍発生の阻害に非常に有効であることが分かった。
本明細書に開示のように、産生されたＳＡＫ集団は、ＣＤ８＋細胞画分全体の表面で検出される高いＮＫＧ２Ｄレベルを特徴とし、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する腫瘍に対して特に有効であることが分かった。本明細書で更に開示のように、ＳＡＫ集団はＦａｓＬ、グランザイムＢ及びパーフォリンの高発現レベルを特徴とするが、その抗腫瘍細胞傷害活性は主にグランザイムＢとパーフォリンによって媒介され、細胞間接触が必要であるにも関わらず、抗ＦａｓＬ中和抗体の使用に対して殆ど非感受性であることが分かった。これは、細胞傷害活性が実質的にＦＡＳ媒介であると報告された、これまで知られているＡＣＴの細胞集団とは対照的である。更に、この細胞は、エフェクター免疫細胞の生存、増殖及び／又は活性にプラスの影響を与えることが知られている受容体の大量の発現や、疲労及び／又は活性化誘発細胞死と関連していることが知られている抑制性チェックポイント分子の発現の最小化等、細胞表面受容体の有利なプロファイルを示すことが実証された。本明細書で更に実証するように、ＳＡＫ細胞は、様々な腫瘍細胞に対してＭＨＣ依存的細胞傷害活性と非ＭＨＣ依存的細胞傷害活性の両方を保有することが分かった。更に、ＳＡＫ細胞の養子移植により安全性が向上し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こすリスクが顕著に減少することが示され、凍結保存後も高レベルの活性が維持された。また、本発明は、部分的には、抗腫瘍活性が増強された遺伝子改変ＳＡＫ組成物の産生にも基づく。
従って、本発明の実施形態では、改善された治療特性を特徴とするＡＣＴ用細胞組成物が提供される。他の実施形態では、本発明は、ＡＣＴ用細胞組成物を産生するための改良方法に関する。幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞組成物は、アフェレーシスの先行工程又は他の精製工程を行わず、腫瘍生検由来の腫瘍特異的細胞を単離する必要もなく、本明細書に開示のエクスビボ増殖プロトコルによってＰＢＭＣ試料から直接有利に産生することができる。幾つかの実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＩＬ－２とＣＤ３アクチベーター（例えば、ＣＤ３特異的刺激抗体）の存在下でのインキュベーション又は培養を少なくとも９日間、典型的には１０～１６日間（例えば、１０～１２日間）行って試料の細胞を増殖させる方法によって産生する。本明細書に開示の有利な実施形態によれば、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下で細胞を増殖して、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを増殖期間を通じて定期的（通常は２～４日毎）に細胞に補充するようにする。
一様相では、インビトロ増殖ＰＢＭＣ（例えば、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生細胞）を含み、その７０～８５％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％がＣＤ３－細胞であって、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示すＡＣＴ細胞組成物が提供される。
一実施形態では、細胞の７～１２％がＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞であり、２０～２８％がＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞であり、１０～１４％がＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５６＋細胞である。他の実施形態では、組成物中のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の量は、組成物中のＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の量の６～８倍である。例示的な実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞に対するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の比率が７～８であることを特徴とする。他の実施形態では、組成物は３％未満のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞を含む。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも４０％は、パーフォリン、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ２から成る群から選択される少なくとも１種のマーカーの表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞は、ＤＮＡＭ－１＋、ＣＴＬＡ－４－細胞として更に特徴付けられる。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも９０％がＣＸＣＲ３の表面発現を特徴とし、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも３０％がＣＸＣＲ６の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の５０％以下が、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴから成る群から選択される複数の免疫チェックポイント分子の表面発現を特徴とする。
他の実施形態では、細胞組成物は、腫瘍細胞に対してグランザイムＢ及び／又はパーフォリンによって媒介される非ＭＨＣ制限細胞傷害活性を示す。他の実施形態では、細胞組成物は、造血器腫瘍細胞と固形腫瘍細胞に対してグランザイムＢ及び／又はパーフォリンによって媒介される非ＭＨＣ制限細胞傷害活性を示す。他の実施形態では、細胞傷害活性は、ＦＡＳ－ＦａｓＬ相互作用によって実質的に媒介されない。他の実施形態では、細胞組成物は、ＧＶＨＤを実質的に誘発することなく、インビボで非組織適合性対象における腫瘍の発生を阻害又は防止することができる。
他の実施形態では、細胞組成物は、インビトロで０．２５：１の比率で２４時間以内に造血器腫瘍細胞を特異的に根絶することができる。他の実施形態では、細胞組成物は、インビトロで造血器腫瘍細胞と０．２５：１の比率で２４時間インキュベートした場合に、有意に造血器腫瘍細胞を特異的に根絶することができる、及び／又は、組成物細胞と腫瘍細胞の比率を１：１としてインビトロで２４時間インキュベートすると腫瘍細胞の８０～９０％が根絶されるように造血器腫瘍細胞を特異的に根絶することができる。他の実施形態では、腫瘍細胞は少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する。他の実施形態では、腫瘍細胞は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３から成る群から選択される複数のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する。他の実施形態では、細胞組成物は５×１０６～１０×１０９個の生細胞を含む。
他の実施形態では、細胞組成物は、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの存在下で少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させることを含む方法によって調製し、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを４８～９６時間毎に補充する。他の実施形態では、インキュベーションは他のサイトカイン又は抗体の非存在下で行う。
他の実施形態では、細胞組成物の細胞を遺伝子改変する。他の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン又はケモカイン受容体、又はそれらの任意の組み合わせの内の少なくとも１種を発現するように細胞を遺伝子改変する。他の実施形態では、ＢＣＭＡ、ＣＤ４７、ＰＤＬ－１、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１６、ＣＤ２７６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＥＦＦＲｖＩＩＩから成る群から選択される抗原に対するＣＡＲを発現するように細胞組成物を遺伝子改変する。他の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ及びＣＤ１２３特異的ＣＡＲのいずれか１種を発現する。他の実施形態では、Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体を発現するように細胞を遺伝子改変する。他の実施形態では、細胞組成物は、外因性ＩＬ－２、外因性ＩＬ－１５、外因性ＩＬ－２１のいずれか１種、又はそれらの任意の組み合わせを発現する。他の実施形態では、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように細胞組成物を改変する。
他の様相では、ＡＣＴ用細胞組成物を産生するための方法であって、
ａ．ＰＢＭＣ試料を提供することと、
ｂ．有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下、且つ他のサイトカイン又は抗体の非存在下で少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させ、このとき、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを４８～９６時間毎に補充することと
を含み、培養物中の生細胞の数を少なくとも２０倍増加させ、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生細胞を含む細胞組成物を得る方法が提供される。
他の実施形態では、唯一の外因的に添加された細胞刺激因子としてのＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下で増殖を行う。他の実施形態では、工程ｂは、５００～１５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と１０～６０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体の存在下で細胞を増殖させることを含み、これらは４８～９６時間毎に１０～１６日間再補充する。他の実施形態では、更なる富化、刺激又は増殖工程に細胞を供しない。他の実施形態では、生細胞の数を少なくとも３０倍増加させるように増殖を行う。他の実施形態では、５×１０６～１０×１０９個の生存可能な単核細胞（その７０～８５％はＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞である）を含む細胞組成物を産生するように増殖を行う。他の実施形態では、インビトロで造血器腫瘍細胞と０．２５：１の比率で２４時間インキュベートした場合に、有意に造血器腫瘍細胞を特異的に根絶することができる細胞組成物を産生するように増殖を行う。他の実施形態では、得られた細胞組成物は、インビトロで０．２５：１の比率で２４時間以内に造血器腫瘍細胞を特異的に根絶することができる。他の実施形態では、工程（ｂ）は細胞を遺伝子改変することを更に含む。他の実施形態では、この方法は、ＣＡＲ、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン又はケモカインの受容体、又はそれらの任意の組み合わせの内の少なくとも１種を発現するように細胞を遺伝子改変することを含む。他の実施形態では、この方法は、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように細胞を改変することを含む。他の実施形態では、この方法は、得られた細胞組成物を凍結保存することを更に含む。
他の実施形態では、この方法によって調製された細胞組成物が提供される。他の実施形態では、
ａ．ＰＢＭＣ試料を提供することと、
ｂ．有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下、且つ他のサイトカイン又は抗体の非存在下で少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させ、このとき、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを２～４日間毎に補充することとで、培養物中の生細胞の数を少なくとも２０倍増加させ、それによって少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生細胞を含む細胞組成物を得ることと、
ｃ．得られた細胞組成物を回収することと
を含む方法によって調製される、ＡＣＴ用細胞組成物が提供される。
他の様相では、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように遺伝子改変された白血球を含む細胞組成物が提供される。
他の実施形態では、細胞の７０～８５％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％がＣＤ３－細胞である。他の実施形態では、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下で少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させることを含み、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを４８～９６時間補充する方法によって細胞組成物を調製する。
他の実施形態では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍の治療用である本発明の細胞組成物が提供される。他の実施形態では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍の治療用するためのＡＣＴ細胞組成物であって、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生存可能なインビトロ増殖ＰＢＭＣを含み、その７０～８５％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％がＣＤ３－細胞であり、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示すＡＣＴ細胞組成物が提供される。他の実施形態では、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように遺伝子改変された白血球を含む、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍の治療に使用するための細胞組成物が提供される。他の実施形態では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍の治療に使用するための、本明細書に開示の方法によって調製される細胞組成物が提供される。
様々な実施形態では、腫瘍は造血器腫瘍又は固形腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は白血病、多発性骨髄腫、前立腺腫瘍又は中皮腫から成る群から選択される。他の実施形態では、腫瘍は少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３から成る群から選択される複数のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する。他の実施形態では、腫瘍は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３を発現する。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＸＣＲ６リガンド、ＣＸＣＲ４リガンド、ＣＸＣＲ２リガンド及びＣＸＣＲ３リガンドから成る群から選択される少なくとも１種のケモカインの発現を特徴とする。
他の実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴから成る群から選択される抑制性免疫チェックポイント分子の少なくとも１種のリガンドの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤による治療に対して抵抗性である。他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１種のＣＴＬＡ－４特異的遮断抗体による治療に対して抵抗性である。他の実施形態では、対象は、チェックポイント分子阻害剤を用いた治療レジメンを受けていない。他の実施形態では、使用は、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３又はそれらの組み合わせに対する少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤を対象に投与することを更に含む。
他の実施形態では、細胞組成物は凍結保存及び解凍を経ている。様々な実施形態では、細胞組成物は、対象に対して自家性、組織適合性同種異系、又は非組織適合性同種異系である。特定の実施形態では、細胞組成物は、対象に対して非組織適合性同種異系である。他の実施形態では、腫瘍はＭＨＣＩ発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを特徴とする。
他の様相では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、腫瘍細胞を治療有効量の本発明の細胞組成物と接触させ、それによって対象の腫瘍を治療することを含む方法が提供される。他の実施形態では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、腫瘍細胞を治療有効量のＡＣＴ細胞組成物と接触させることを含む方法が提供されるが、ＡＣＴ細胞組成物は、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生存可能なインビトロ増殖ＰＢＭＣを含み、その７０～８５％はＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％はＣＤ５６－細胞であり、最大５％はＣＤ３－細胞であって、組成物はインビトロとインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示し、それによって対象の腫瘍を治療する。他の実施形態では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、腫瘍細胞を治療有効量の細胞組成物と接触させることを含む方法が提供されるが、該細胞組成物は、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療するために使用される、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように遺伝子改変された白血球を含み、それによって対象の腫瘍を治療する。他の様相では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、腫瘍細胞を本明細書に開示する方法により調製される細胞組成物の治療有効量と接触させ、それによって対象の腫瘍を治療することを含む方法が提供される。
様々な実施形態では、細胞組成物は、対象に対して自家性、組織適合性同種異系、又は非組織適合性同種異系である。特定の実施形態では、細胞組成物は、対象に対して非組織適合性同種異系である。他の実施形態では、接触はインビボで行う。他の実施形態では、接触はエクスビボで行う。他の実施形態では、細胞組成物は、腫瘍細胞と接触させる前に凍結保存及び解凍を経ている。他の実施形態では、腫瘍は造血器腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は白血病、多発性骨髄腫、前立腺腫瘍又は中皮腫から成る群から選択される。他の実施形態では、腫瘍は少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３から成る群から選択される複数のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する。他の実施形態では、腫瘍は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３を発現する。
他の実施形態では、腫瘍は、ＣＸＣＲ６リガンド、ＣＸＣＲ４リガンド、ＣＸＣＲ２リガンド及びＣＸＣＲ３リガンドから成る群から選択される少なくとも１種のケモカインの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴから成る群から選択される抑制性免疫チェックポイント分子の少なくとも１種のリガンドの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤による治療に対して抵抗性である。他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１種のＣＴＬＡ－４特異的遮断抗体による治療に対して抵抗性である。他の実施形態では、対象は、チェックポイント分子阻害剤を用いた治療レジメンを受けていない。他の実施形態では、使用は、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３又はそれらの組み合わせに対する少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤を対象に投与することを更に含む。他の実施形態では、腫瘍はＭＨＣＩ発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを特徴とする。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の説明と図面から明らかになるであろう。
図１Ａ～１Ｄ： 増殖中の様々な時点（０日目、４日目、６日目、８日目及び１１日目）での超活性化キラー（ＳＡＫ）細胞の特性を示す。図１Ａ： 総生細胞数（×１０６個）。図１Ｂ～１Ｄ： それぞれＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、及びＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の割合（％）のフローサイトメトリー分析。 同上 図２Ａ～２Ｂ： 造血器腫瘍細胞に対する標的細胞：エフェクター細胞の様々な比率でのＳＡＫ細胞の細胞傷害活性。図２Ａ： 白血病（ＴＨＰ－１）細胞に対する効果。図２Ｂ： 多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ８２６６）細胞に対する効果。２４時間のインキュベーション後の生存腫瘍細胞（ＣＦＳＥ＋ＰＩ－）の割合（％）をＦＡＣＳによって評価した。 図３Ａ～３Ｃ： 造血器腫瘍細胞と固形腫瘍細胞に対する標的細胞：エフェクター細胞の様々な比率でのＳＡＫ細胞の細胞傷害活性。図３Ａ： 白血病ＭＶ４－１１細胞に対する効果。図３Ｂ： 前立腺癌ＰＣ３細胞に対する効果。図３Ｃ： 中皮腫癌Ｈ２８細胞に対する効果。 図４Ａ～４Ｂ： 標的細胞：エフェクター細胞の様々な比率において、白血病ＭＶ４－１１細胞に対し、ＳＡＫ細胞は他のエフェクター細胞よりも優れた細胞傷害活性を示す。図４Ａ： サイトカイン誘導キラー細胞（「ＣＩＫ ＩＦＮ」）と比較した効果。図４Ｂ： 活性化リンパ球組成物（「Ｔ細胞ＩＬ－２」）と比較した効果。 図５： 細胞傷害性ＣＤ８＋ＳＡＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現。 図６Ａ～６Ｃ： ＳＡＫ細胞によるエフェクター分子の発現。図６Ａ： ＦａｓＬの発現。図６Ｂ： グランザイムＢの発現。 図６Ｃ： パーフォリンの発現。 図７： 白血病ＭＶ４－１１細胞と共に２４時間インキュベートした後のＳＡＫ細胞によるパーフォリン分泌。 図８Ａ～５Ｃ： 様々な阻害剤の存在下での細胞障害能力の評価を示す。様々な阻害剤の存在下、標的細胞：エフェクター細胞の様々な比率でＳＡＫ細胞をＭＶ４－１１細胞と共にインキュベートした。図８Ａ： グランザイムＢ阻害剤（ＤＣＩ）。図８Ｂ： 抗ＦａｓＬ抗体。図８Ｃ： パーフォリン阻害剤。 図９Ａ～９Ｂ： 増殖１１日目のＣＤ８＋ＳＡＫ細胞でのケモカイン受容体の発現と機能を示す。図９Ａ： ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３の発現（上部パネル、それぞれ左と右）、ＣＸＣＲ４とＣＸＣＲ６（下部パネル、それぞれ左と右）の発現を示す。黒線は、各蛍光マーカー（ＦＩＴＣ、ＡＰＣ又はＰＥ）に結合したアイソタイプ対照抗体（ＩＣ）による染色を示す。図９Ｂ： ケモカインＩＬ－８、ＳＤＦ－１及びＩＰ－１０へのＳＡＫ細胞のトランスウェル遊走。 図１０Ａ～１０Ｃ： ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞の割合として測定した、対照と比較したＣＤ１９＋ＳＡＫ細胞移植後のＮＳＧマウスにおける腫瘍細胞生着の阻害を示す。図１０Ａ： 脾臓への生着。図１０Ｂ： 骨髄（ＢＭ）への生着。図１０Ｃ： 血液中の生着。 図１１Ａ～１１Ｂ： 様々な標的：エフェクター比率でＣＤ１９ＣＡＲ ＳＡＫ細胞によって誘導される細胞傷害性免疫応答を示す。図１１Ａ： ＣＤ１９＋腫瘍細胞（Ｔｏｌｅｄｏ）に対するＳＡＫ細胞とＣＤ１９ＣＡＲ ＳＡＫ細胞の細胞傷害活性。図１１Ｂ： ＣＤ１９－腫瘍細胞（Ｕ９３７）に対するＳＡＫ細胞とＣＤ１９ＣＡＲ ＳＡＫ細胞の細胞傷害活性。 図１２Ａ～１２Ｃ： ＳＡＫ細胞はＰＢＭＣと比較して、ＮＳＧマウスにおいて移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を誘発することが遥かに少ないことを示す。照射ＮＳＧマウスには、ＳＡＫ細胞又はＰＢＭＣを５×１０６個の用量で投与した。図１２Ａ： 生存率。図１２Ｂ： 体重変化。図１２Ｃ： 平均ＧＶＨＤスコアリング（「平均スコアリング」）。 図１３Ａ～１３Ｂ： 様々なＳＡＫ－腫瘍細胞比率における、ＴＨＰ－１又はＭＶ４１１腫瘍細胞に対する凍結－解凍サイクル後のＳＡＫ細胞（「凍結ＳＡＫ」と示す）の細胞傷害活性を、凍結していない新鮮なＳＡＫ細胞（「ＳＡＫ」と示す）と比較したものを示す。図１３Ａ： ＴＨＰ－１細胞に対する活性。図１３Ｂ： ＭＶ４１１に対する活性。 図１４： ＣＤ８＋ＳＡＫ細胞表面での以下の免疫チェックポイント分子のレベルを示す。Ｔｉｍ－３（上部パネル、左）、ＤＮＡＭ－１（上部パネル、右）、ＰＤ－１（中央パネル、左）、ＴＩＧＩＴ（中央パネル、右）、Ｌａｇ－３（下部パネル、左）又はＣＴＬＡ－４（下部パネル、右）。ＡＰＣ又はＰＥ標識非特異的抗体をアイソタイプ対照（ＩＣ）として使用した。 図１５は、ＳＡＫ媒介白血病細胞溶解におけるＭＨＣＩの関与の評価を示す。抗ＭＨＣＩ中和抗体の存在下（「抗ＨＬＡ」）又は非存在下（「対照」）におけるＭＶ４１１細胞に対する細胞傷害効果を生存腫瘍細胞の割合として示す。
本発明は癌の治療に有用な、養子細胞療法（ＡＣＴ）のための改良された細胞組成物と方法に関する。より具体的には、本発明の実施形態では、細胞傷害性の増強（例えば、非組織適合性腫瘍細胞に対する）を特徴とする細胞組成物（本明細書では超活性化キラー細胞（ＳＡＫ）と称する）の使用を採用する。本発明は更に、ＳＡＫ組成物を産生するための方法、及び癌管理におけるその利用に関する。有利な実施形態によれば、本発明は更に、生存率の向上及び／又は腫瘍の結合及び保持の強化を示す遺伝子改変ＳＡＫ組成物に関する。
本発明は、部分的には、ＭＨＣ認識を必要とせずに、様々な腫瘍細胞に対して非常に強力に抗腫瘍細胞傷害活性を発揮することができるＳＡＫ組成物の開発に基づく。驚くべきことに、本明細書に開示の独特の培養方法によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から産生されたＳＡＫ細胞は、他のＰＢＭＣ由来のエフェクター細胞組成物（これまで知られているＡＣＴプロトコルに従って産生された、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ）及びインターロイキン－２（ＩＬ－２）増殖Ｔ細胞組成物が含まれる）よりも腫瘍細胞の根絶において有意に有効であった。更に、産生されたＳＡＫ細胞は、インビボでの腫瘍発生の阻害に非常に有効であり、安全性が向上し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こすリスクが顕著に減少し、凍結保存に適合することも分かった。更に、この細胞は、細胞表面受容体（免疫チェックポイント分子やケモカイン受容体を含む）の有利なプロファイルを示すことが実証された。特に、ＳＡＫ細胞は、ＤＮＡＭ－１を含む活性化受容体の高発現と、抑制性チェックポイント分子（例えば、ＣＴＬＡ－４）の発現の最小化を特徴とすることが分かった。また、本発明は、部分的には、腫瘍特異的活性の増強及び／又は延長を伴う改良治療手法に適した遺伝子改変ＳＡＫ細胞組成物の開発にも基づく。
従って、本発明の実施形態では、改善された治療特性を特徴とするＡＣＴ用細胞組成物が提供される。他の実施形態では、本発明は、ＡＣＴ用細胞組成物を産生するための改良方法に関する。幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞組成物は、アフェレーシスの先行工程又は他の精製工程を行わず、腫瘍生検由来の腫瘍特異的細胞を単離する必要もなく、本明細書に開示のエクスビボ増殖プロトコルによってＰＢＭＣ試料から直接有利に産生することができる。幾つかの実施形態では、ＩＬ－２とＣＤ３アクチベーター（例えば、ＣＤ３特異的刺激抗体）の存在下でのインキュベーション又は培養を少なくとも９日間、典型的には９～１６日間（より典型的には１０～１２日間）行って試料の細胞（例えば、０．２５×１０６～５×１０６個のＰＢＭＣ）を増殖させる。抗ＣＤ３抗体は遊離懸濁液の形態で好都合に使用することができ、プレートに結合させる必要も、同種異系フィーダー細胞によって提示する必要もないことを理解されたい。
特に、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下で有利に細胞を増殖し、全増殖期間を通じて十分な量で維持されるようにする（例えば、少なくとも９日間、５００～１５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と２０～４０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体）。従って、本発明によれば、刺激因子の常時存在は、培地にＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを１～５日毎（通常は２～４日毎）に定期的に補充することによって維持する。例えば、初期濃度約１０００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）と約３０ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ－３）（これらは、培養中２～４日毎（例えば、０日目、４日目、６日目及び８日目）に再補充する）の存在下、約１×１０６個（細胞）／ｍＬの濃度でＰＢＭＣを培養することができる。
更なる有利な実施形態によれば、唯一の細胞刺激因子としてのＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの存在下で増殖を行う。従って、幾つかの実施形態では、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）等の外因的に添加された更なる細胞刺激因子及び／又はフィーダー細胞の非存在下で増殖を行う。他の実施形態では、この方法は、培養物中の生細胞の数を少なくとも２０倍、典型的には平均で少なくとも３０倍（例えば、３０～５５倍）増加させるように行う。他の実施形態では、この方法によって、培養後１１日以内に生細胞数を２５～５５倍増加させる。他の実施形態では、この方法は、少なくとも１．５×１０８個、典型的には２×１０８～４×１０８個の生細胞、最も典型的には５×１０６～１０×１０８個の生細胞、最大約１０×１０９個の生細胞を産生するように行う。
一様相では、インビトロ増殖ＰＢＭＣを含み、その７０～８５％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％がＣＤ３－細胞であって、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示すＡＣＴ細胞組成物が提供される。
他の様相では、ＡＣＴ用細胞組成物を製造するための方法であって、
ａ．ＰＢＭＣ試料を提供することと、
ｂ．有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下、且つ他のサイトカイン又は抗体の非存在下で少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させ、このとき、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを４８～９６時間毎に補充することと
を含み、培養物中の生細胞の数を少なくとも２０倍増加させ、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生細胞を含む細胞組成物を得る方法が提供される。
他の実施形態では、この方法によって調製された細胞組成物が提供される。他の実施形態では、
ａ．ＰＢＭＣ試料を提供することと、
ｂ．有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下、且つ他のサイトカイン又は抗体の非存在下で少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させ、このとき、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを２～４日間毎に補充することとで、培養物中の生細胞の数を少なくとも２０倍増加させ、それによって少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生細胞を含む細胞組成物を得ることと、
ｃ．得られた細胞組成物を回収することと
を含む方法によって調製される、ＡＣＴ用細胞組成物が提供される。
他の様相では、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように遺伝子改変された白血球を含む細胞組成物が提供される。
他の実施形態では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍の治療に使用するための本発明の細胞組成物が提供される。他の実施形態では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍の治療に使用するためのＡＣＴ細胞組成物であって、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生存可能なインビトロ増殖ＰＢＭＣを含み、その７０～８５％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％がＣＤ３－細胞であり、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示すＡＣＴ細胞組成物が提供される。他の実施形態では、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように遺伝子改変された白血球を含む、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍の治療に使用するための細胞組成物が提供される。他の実施形態では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍の治療に使用するための、本明細書に開示の方法によって調製される細胞組成物が提供される。
他の様相では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、腫瘍細胞を治療有効量の本発明の細胞組成物と接触させ、それによって対象の腫瘍を治療することを含む方法が提供される。他の実施形態では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、腫瘍細胞を治療有効量のＡＣＴ細胞組成物と接触させることを含む方法が提供されるが、ＡＣＴ細胞組成物は、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生存可能なインビトロ増殖ＰＢＭＣを含み、その７０～８５％はＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％はＣＤ５６－細胞であり、最大５％はＣＤ３－細胞であって、組成物はインビトロとインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示し、それによって対象の腫瘍を治療する。他の実施形態では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、腫瘍細胞を治療有効量の細胞組成物と接触させることを含む方法が提供されるが、該細胞組成物は、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療するために使用される、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように遺伝子改変された白血球を含み、それによって対象の腫瘍を治療する。
上述の及び他の様相と実施形態を以下で更に詳細に説明し、例示する。
調製方法
幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の細胞組成物を産生するための方法に関する。幾つかの実施形態では、ＡＣＴ用細胞組成物を産生するための方法であって
ａ．ＰＢＭＣ試料を提供することと、
ｂ．有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下、且つ他のサイトカイン又は抗体の非存在下で少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させ、このとき、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを２～４日間毎に補充することとで、培養物中の生細胞の数を少なくとも２０倍増加させ、それによって少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生細胞を含む細胞組成物を得ることと、
ｃ．得られた細胞組成物を回収することと
を含む方法が提供される。
他の実施形態では、この方法は、
ａ．ＰＢＭＣ試料を提供することと、
ｂ．有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下、且つ他のサイトカイン又は抗体の非存在下で少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させ、このとき、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを４８～９６時間毎に補充することと
を含み、培養物中の生細胞の数を少なくとも２０倍増加させ、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生細胞を含む細胞組成物を得る。
本明細書で使用される「ＰＢＭＣ試料」又は「末梢血単核細胞試料」又は「未分画ＰＢＭＣ」という用語は、全ＰＢＭＣ、即ち、所定の亜集団において実質的に富化されていない、丸い核を有する生存可能な白血球の集団を意味する。通常、本発明に係るＰＢＭＣ試料は末梢血から得られており、選択工程には供されておらず、接着ＰＢＭＣ（本質的に９０％超の単球で構成されている）又は非接着ＰＢＭＣ（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞及びＤＣ前駆体を含む）のみを含む。
通常、ＰＢＭＣは、遠心分離（例えば、バフィーコート由来）、密度勾配遠心分離（例えば、フィコール・ハイパック経由）又は当技術分野で既知の他の方法（例えば、末梢血からの抽出又は部分精製）によって得ることができる。例えば、ＰＢＭＣは、血液層を分離する親水性多糖であるフィコールを使用して全血から抽出することができ、ＰＢＭＣは血漿層の下に細胞環を形成する。更に、ＰＢＭＣは、赤血球を優先的に溶解する低張溶解によって全血から抽出することができる。このような手順は当業者には知られている。
本明細書で使用される「増殖」という用語は、細胞複製によって細胞集団の細胞数が増加することを意味する。特に、本明細書に開示のＰＢＭＣ増殖は、本発明に係るＡＣＴ細胞組成物を産生するための、ＰＢＭＣ内の細胞集団のポリクローナル活性化と増殖を含むインビトロ又はエクスビボ培養方法を意味する。通常、例えば、ヒト対象の治療用の臨床グレードのＡＣＴ組成物を産生するために、特定のｃＧＭＰグレードの環境及びｃＧＭＰグレードの培地中で増殖を行う。幾つかの実施形態では、９～１６日間又は１１～１６日間、例えば、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、又は１６日間増殖を行う。
より具体的には、増殖方法中にインターロイキン－２（ＩＬ－２）とＣＤ３アクチベーターを培地に補充する。幾つかの実施形態では、細胞組成物を上述の方法によって調製し、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを４８～９６時間毎、例えば、４８時間毎、４９時間毎、５０時間毎、５１時間毎、５２時間毎、５３時間毎、５４時間毎、５５時間毎、５６時間毎、５７時間毎、５８時間毎、５９時間毎、６０時間毎、６１時間毎、６２時間毎、６３時間毎、６４時間毎、６５時間毎、６６時間毎、６７時間毎、６８時間毎、６９時間毎、７０時間毎、７１時間毎、７２時間毎、７３時間毎、７４時間毎、７５時間毎、７６時間毎、７７時間毎、７８時間毎、７９時間毎、８０時間毎、８１時間毎、８２時間毎、８３時間毎、８４時間毎、８５時間毎、８６時間毎、８７時間毎、８８時間毎、８９時間毎、９０時間毎、９１時間毎、９２時間毎、９３時間毎、９４時間毎、９５時間毎，又は９６時間毎に補充する。
サイトカインＩＬ－２は培養中のリンパ球の成長因子として作用し、例えば、活性化Ｔ細胞の細胞死を防ぐために必要である。ＩＬ－２の活性は、アルファ（ＣＤ２５）、ベータ（ＣＤ１２２）及びガンマ（ＣＤ１３２）と称される３本の鎖で構成される複合体であるＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）への結合及びそれを介したシグナル伝達によって媒介される。二量体ＩＬ－２ＲはメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞とＮＫ細胞によって発現されるが、制御性Ｔ細胞と活性化Ｔ細胞は高レベルの三量体ＩＬ－２Ｒを発現する。本明細書で使用される「インターロイキン２」又は「ＩＬ－２」とは、哺乳動物のＩＬ－２、好ましくはヒトＩＬ－２（例えば、組換え産生されたヒトＩＬ－２）を意味する。幾つかの実施形態では、ヒトＩＬ－２の生物学的等価物として当技術分野で認識されており、ＩＬ－２受容体に選択的に結合し、ヒトリンパ球の増大や増殖をサポートする際に同等の活性を発揮することができるポリペプチド（例えば、ＩＬ－２融合タンパク質、コンジュゲート及びバリアント）を使用することもできる。ＩＬ－２は組換えによって（例えば、本明細書に開示の方法によって）産生することができ、様々な供給元から市販されている。例えば、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入することができる。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）は高度に精製されたｒｈＩＬ－２タンパク質であり、癌免疫療法での臨床使用が承認されている。
ＣＤ３複合体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖と結合し、Ｔ細胞の表面にＴＣＲ－ＣＤ３複合体を形成する。従って、ＣＤ３はＴ細胞マーカーと考えられているが、ＮＫ－Ｔ細胞等の他の特定の細胞集団もＣＤ３表面発現（ＣＤ３＋細胞）を特徴とする一方、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及び骨髄系細胞等の他の細胞型は通常、ＣＤ３表面発現の欠如（ＣＤ３－細胞）を特徴とするものではない。哺乳動物では、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体は、ＴＣＲ鎖及びＣＤ３－ゼータ（ζ鎖）と複合体を形成するＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２個のＣＤ３ε鎖で構成される。本明細書で使用される「ＣＤ３アクチベーター」とは、リンパ球表面のＣＤ３分子（典型的にはヒトＣＤ３分子）に結合することによって、ポリクローナル刺激及び増殖を誘導又は媒介することができる剤である。ＣＤ３アクチベーターの例としては、刺激性ＣＤ３特異的抗体、その抗原結合部分、及びそのコンジュゲートが挙げられる。通常、ＣＤ３アクチベーターは刺激性抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、通常はＣＤ３ε等のＣＤ３シグナル伝達ドメインを指向する。特定の実施形態では、本発明の実施形態で使用される有利なＣＤ３アクチベーターは、ヒトＣＤ３ε鎖に対するマウスモノクローナル抗体であるＯＫＴ３である。Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体を架橋する他の抗体の例としては、ＨＩＴ３ａ及びＵＣＨＴ１抗ＣＤ３ｍＡｂが挙げられる。ＣＤ３アクチベーターの更なる例は、ＣＤ３リガンド及びＣＤ３結合マイトジェンである。このような抗体や剤は様々な供給元から市販されている。例えば、ＯＫＴ３及び他の抗ＣＤ３ｍＡｂは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社やｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手可能である。
本発明の実施形態によれば、他のサイトカイン又は抗体の非存在下でＰＢＭＣを増殖する。換言すれば、ＩＬ－２とＣＤ３アクチベーター以外のサイトカイン及び抗体は培養物に補充（外部から添加）しない。従って、本発明に係る増殖方法は、他種の細胞組成物を産生するのに使用される他の増殖プロトコルとは区別することができる（例えば、ＣＩＫ細胞は特にＩＦＮ－γの存在下で（例えば、ＰＢＭＣ）の増殖によって産生する）。しかし、増殖方法中に、サイトカインを含む様々な因子が培養細胞によって産生され、培地に分泌される場合があることを理解されたい。
更に、本発明に係る増殖方法は、ＩＬ－２及びＣＤ３アクチベーターの常時存在下で行い、ＩＬ－２及びＣＤ３アクチベーターが増殖方法全体を通じて有効量で維持されるようにこれらを連続的又は断続的に補充する。従って、本発明に係る増殖方法は、他種の細胞組成物を産生するのに使用される他の増殖プロトコルとは区別することができる（例えば、ＣＩＫ細胞の産生では、増殖の２日目にＩＬ－２とＯＫＴ３を添加するが、その後ＯＫＴ３を培養物に補充することはない）。
他の実施形態では、唯一の外因的に添加された細胞刺激因子としてのＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下で増殖を行う。従って、共刺激分子（例えば、ＣＤ２８）、抗原（例えば、ＭＨＣ－抗原複合体）等（これらは培養細胞への外因性源である）に対する抗体等、インビトロ又はエクスビボ増殖方法中にリンパ球の活性化及び増殖を誘導するために使用される他の細胞刺激因子は人為的に導入（補充）されない。特定の細胞刺激因子は、増殖方法中に培養細胞によって内因的に産生される場合があることを理解されたい。標準的な組織培養培地（例えば、ＲＰＭＩ等の完全培地）に含まれる様々な因子は、これらの実施形態によれば、外因的に添加された細胞刺激因子とは見なされないことが更に理解されよう。例えば、組織培養血清、例えば、最終濃度が５～１５％、典型的には７～１２％又は８～１３％、より典型的には約１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）存在下で増殖を好都合に行うことができる。
本明細書に開示のように、培養物中の生細胞の数を少なくとも２０倍（又は幾つかの実施形態では３０～６０倍）増加させるように増殖を有利に行い、それによって、５×１０６～１０×１０８個の生細胞（又は他の実施形態では、最大１０×１０９個の生細胞）を含む細胞組成物を得る。本明細書で使用される「生細胞」という用語は、壊死を起こしていない細胞、又は初期又は後期のアポトーシス状態にない細胞を意味する。細胞生存率を求めるためのアッセイは、フローサイトメトリーによって検出可能なヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用する等、当技術分野では既知である。従って、一実施形態では、生細胞はヨウ化プロピジウム摂取を示さず、ホスファチジルセリンを発現しない細胞である。光、蛍光又は電子顕微鏡技法を用いるか、又は色素トリパンブルーの取り込みによって壊死を更に特定することができる。
更に、本発明の産生方法は、増殖工程によって得られる細胞組成物を回収する工程を含む。例えば、細胞を回収し、遠心分離又は他の洗浄工程に供して、残留抗体とサイトカインを除去することができる。幾つかの実施形態では、腫瘍細胞と接触させる前、又は対象へ投与する前に、細胞を適切な希釈剤又は媒体（例えば、ＰＢＳ）に再懸濁することができる。
幾つかの実施形態では、細胞は、富化（例えば、増殖工程前のアフェレーシス、リンパ球アフェレーシス、又は白血球の免疫捕捉）、刺激（例えば、抗原特異的）及び／又は増殖（例えば、フィーダー細胞の存在下での急速増殖プロトコル、又は他の／追加のサイトカイン存在下での増殖）の更なる工程には供されていない。
他の様相では、本発明の細胞組成物を産生する方法であって、
ａ）ＰＢＭＣ試料を提供することと、
ｂ）有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下、少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させ、そのとき有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを２～４日毎に補充することと、
ｃ）得られた細胞組成物を回収することと
を含む方法が提供される。
幾つかの実施形態では、本明細書に開示の本発明の細胞組成物を得るように増殖を行う。他の実施形態では、唯一の外因的に添加された細胞刺激因子としてのＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下で（他のサイトカイン及び抗体の非存在下で）増殖を行う。
他の実施形態では、この方法は、細胞を遺伝子改変して本明細書に開示の細胞組成物を得ることを更に含む。幾つかの実施形態では、得られる細胞組成物は凍結保存に適していることが有利である。従って、ＡＣＴ用の特定の他の細胞組成物とは対照的に、本発明の細胞組成物は効力を実質的に失うことなく、増殖後に凍結し、対象への投与前に解凍することができる。従って、他の実施形態では、この方法は得られた細胞組成物を凍結させることを更に含む。例えば、液体窒素を使用して凍結保存プロトコルを行うことができ、適切な培地（例えば、９０％ＦＣＳ＋１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む）中に細胞を懸濁させるが、これに限定されない。必要に応じて、市販のシステム又は賦形剤（例えば、ＣｒｙｏＳｕｒｅ（登録商標）ＵＳＰグレードの凍結保護剤）を用いる。
他の実施形態では、工程ｂは、５００～１５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と１０～６０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体の存在下で細胞を増殖させることを含み、これらを２～４日毎に１０～１６日間再補充する。他の実施形態では、細胞は更なる富化、刺激又は増殖工程（例えば、工程ｂの前又は後）に供されていない。他の実施形態では、生細胞の数を少なくとも３０倍増加させるように増殖を行う。他の実施形態では、少なくとも５×１０６～１０×１０８個（例えば、５×１０６～１０×１０９個）の生存可能な単核細胞を含む細胞組成物を産生するように増殖を行い、該細胞の７０～８０％（又は他の実施形態では７０～８５％）はＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞である。他の実施形態では、インビトロで腫瘍細胞と０．２５：１の比率で２４時間インキュベートした場合に、有意に造血器腫瘍細胞を特異的に根絶することができる細胞組成物を産生するように増殖を行う。他の実施形態では、工程ｂは、細胞を遺伝子改変して、例えば、本明細書に開示の遺伝子改変細胞組成物を産生することを更に含む。細胞をＣＤ３刺激因子とＩＬ－２の補充に供する前に、細胞を改変（例えば、形質導入又はトランスフェクト）することが有利である。
細胞組成物
他の実施形態では、本明細書に開示の方法によって調製される細胞組成物が提供される。他の実施形態では、本明細書に開示のＳＡＫ細胞を含む細胞組成物が提供される。他の実施形態では、本発明は、本明細書に開示の養子細胞移植（ＡＣＴ）組成物に関する。他の実施形態では、ＡＣＴ細胞組成物であって、５×１０６～１０×１０８個の生存可能なインビトロ増殖ＰＢＭＣを含み、その７０～８０％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％がＣＤ３－細胞であって、インビトロ及びインビボで非組織適合性腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示すＡＣＴ細胞組成物が提供される。他の実施形態では、ＡＣＴ細胞組成物であって、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生存可能なインビトロ増殖ＰＢＭＣを含み、その７０～８５％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％がＣＤ３－細胞であって、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示すＡＣＴ細胞組成物が提供される。
特に明記しない限り、本明細書で使用される「養子移植」という用語は、予め感作された免疫学的剤（例えば、細胞又は血清）をレシピエントに移植する受動免疫療法の形態を意味する。「養子移植免疫療法」、「養子細胞療法」及び「養子細胞免疫療法」という語句は本明細書では互換的に使用され、本発明の細胞組成物等のエフェクター免疫担当細胞を、それを必要とする対象に投与（養子移植）して癌の発症又は症状を緩和又は改善する治療的又は予防的レジメン又はモダリティを意味する。従って、本発明に係るＡＣＴ組成物は、無菌且つ適切な（例えば、ｃＧＭＰグレードの）条件下で産生し、腫瘍性障害を患っているヒト対象に抗腫瘍レジメンの一環として投与する有効量（例えば、少なくとも５×１０６個の細胞、最大約１０×１０９個の細胞）を含む。
本明細書で使用される「インビトロ増殖ＰＢＭＣ」という用語は、インビトロ又はエクスビボでの増殖工程を経て、本明細書に開示の細胞組成物をもたらす、末梢血由来の単核細胞を意味する。従って、このような細胞及び組成物は、腫瘍由来リンパ球（ＴＩＬ、末梢血からではなく腫瘍生検から得られるもの）、白血球細胞株、及び多能性幹細胞からインビトロで分化した白血球等の他の供給源から取得又は由来する白血球組成物とは区別することができる。
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、免疫応答に関与する様々な異なる細胞型の１種であり、ＣＤ３の表面発現（ＣＤ３＋細胞）を特徴とする。Ｔ細胞の活性は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に関連してＴ細胞に提示される抗原によって制御される。次に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）がＭＨＣ抗原複合体に結合する。抗原がＭＨＣと複合体を形成すると、ＭＨＣ抗原複合体はＴ細胞上の特定のＴＣＲに結合し、それによって該Ｔ細胞の活性が変化する。抗原提示細胞によるＴリンパ球の適切な活性化には、ＴＣＲの刺激だけでなく、その共受容体の複合的且つ協調的な関与が必要である。
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞やメモリーＢ細胞への成熟、細胞傷害性Ｔ細胞やマクロファージの活性化等の免疫学的方法において他の白血球を支援する。このような細胞は、その表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞（又はＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞）としても知られている。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。一旦活性化されると、急速に分裂し、活発な免疫応答を調節又は支援するサイトカインと称される小型タンパク質を分泌する。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、又はＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞や腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与する。このような細胞は、表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞（又はＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞）としても知られている。このような細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子に関連する抗原に結合することによって、その標的を認識する。
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、ＣＤ５６、ＣＤ１６及び／又はＣＤ５７の発現と、Ｔ細胞受容体－ＣＤ３複合体の欠如によって定められる末梢血リンパ球のサブセットである。ＮＫ細胞は、特定の細胞溶解酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合して死滅させる能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の疾患細胞を死滅させる能力、及び免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインを放出する能力を特徴とする。
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞又はＮＫ－Ｔ細胞）は、ＴＣＲを発現するＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞である。従来のＭＨＣ分子によって提示されるペプチド抗原を検出する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫ－Ｔ細胞は、非古典的ＭＨＣ分子であるＣＤ１ｄによって提示される脂質抗原を認識する。インバリアント又はＩ型ＮＫ－Ｔ細胞は非常に限られたＴＣＲレパートリーを発現するが、非古典的又は非インバリアントＩＩ型ＮＫＴ細胞はより不均一なＴＣＲαβの利用を示す。適応性又はインバリアント（Ｉ型）ＮＫＴ細胞は、ＴＣＲ Ｖａ２４－Ｊａ１８、Ｖｂ１１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ａＧａｌＣｅｒ、ＣＤ１６１及びＣＤ５６のマーカーの少なくとも１種以上の発現によって特定することができる。
ＣＤ５６としても知られる神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）は、所謂同種親和性相互作用とヘテロ親和性相互作用の両方に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ５６には３種の主要なアイソフォーム（ＮＣＡＭ－１２０、ＮＣＡＭ－１４０及びＮＣＡＭ－１８０）が存在し、全て１種の単一遺伝子からの選択的スプライシングによって産生され、細胞内ドメインの長さが異なる。ＣＤ５６の発現は、末梢血から単離されたＣＤ５６＋細胞の大部分を構成するＮＫ細胞と最も厳密に関連している。しかし、ＣＤ５６は、例えば、他のリンパ系細胞（ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）が挙げられるが、これらに限定されない）でも検出されている。
本明細書において、当業者に既知の方法（例えば、細胞を細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体と接触させ、その後、そのような接触した細胞のフローサイトメトリー分析を行って、抗体が細胞に特異的に結合するかどうかを決定する）を用いて検出するに十分な量で細胞表面上に細胞表面マーカーを発現する場合、この細胞を細胞表面マーカーに対して「陽性」であると見なす。細胞は細胞表面マーカーのメッセンジャーＲＮＡを発現する場合があるが、本明細書に記載の組成物及び方法に対して陽性であると見なされるためには、細胞はその表面に目的のマーカーを発現しなければならないことは理解されたい。同様に、当業者に既知の方法（例えば、細胞を細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体と接触させ、その後、そのような接触した細胞のフローサイトメトリー分析を行って、抗体が細胞に結合するかどうかを決定する）を用いて検出するに十分な量で細胞表面上に細胞表面マーカーを発現しない場合、この細胞を細胞表面マーカーに対して「陰性」であると見なす。
様々な実施形態では、本発明の細胞組成物は、高い相対ＣＤ８＋細胞レベルと低い相対ＣＤ４＋細胞レベルを特徴とする。幾つかの実施形態では、組成物はＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞のＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞に対する比率が高い（少なくとも６：１、例えば、６．５～８．５：１、典型的には７～８：１）ことを特徴とする。換言すれば、組成物中のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の量は、組成物中のＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の量の６～８倍、典型的には７～８倍である。他の実施形態では、細胞組成物は高いＮＫ－Ｔ細胞レベルを特徴とする。他の実施形態では、細胞はＴ細胞に対するＮＫ－Ｔ細胞の比率が高いことを特徴とする。幾つかの実施形態では、細胞組成物はＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞に対するＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５６＋細胞の発生率が１５～３０％、典型的には１９～２５％又は２０～２２％であることを特徴とする。更に他の実施形態では、細胞組成物はＣＤ５６＋細胞に対するＣＤ８＋細胞の比率が高い（例えば、２～４）ことを特徴とする。様々な実施形態では、このような高いレベル及び比率は、本明細書に示すように、元のＰＢＭＣ試料に対する増強、又はＣＩＫ細胞調製物等の他のＡＣＴ組成物に対する増強と関連することがある。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
例えば、幾つかの実施形態では、本発明の細胞組成物は、細胞傷害性ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞が平均して少なくとも６０％、典型的には７５％（例えば、７０～８０％、７０～８５％、７３～７６％又は７３～７８％）存在することを特徴とする。他の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞が７０～８５％存在することを特徴とする。他の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞が最大１５％（例えば、７～１２％、１１～１３％、９～１２％又は８～１１％）、典型的にはＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞が平均して最大１０％存在することを特徴とする。他の実施形態では、平均してＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも１５％がＣＤ８＋ＣＤ５６＋細胞である（例えば、１５～３０％又は１７～２０％）。他の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５６＋細胞が少なくとも９％、典型的には１０～１４％であることを特徴とする。他の実施形態では、細胞組成物はＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５６＋細胞が７～１７％存在することを特徴とする。更に他の実施形態では、細胞組成物はＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞を約８～３５％、典型的には２０～２８％又は２２～２６％含む。他の実施形態では、細胞組成物はＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞を１５～３０％含む。
幾つかの実施形態では、細胞組成物は活性化マーカーとケモカイン受容体の高発現を特徴とする。幾つかの実施形態では、細胞はＮＫＧ２Ｄ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＦＡＳＬ、ＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ２から成る群から選択される少なくとも１種、典型的には複数種の受容体を発現し、各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。例えば、本明細書に示すように、増殖細胞組成物の実質的に全てのＣＤ８＋細胞が活性化マーカーＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現することが分かった（以下の実施例４及び５を参照）。従って、本発明は、その実施形態において、ＣＤ８＋細胞が典型的にはＮＫＧ２ＤとグランザイムＢの発現によっても特徴付けられる改良細胞組成物を提供する。
ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）は、Ｃ型レクチン様受容体のＮＫＧ２ファミリーに属する膜貫通タンパク質である。ヒトにおいては、ＮＫＧ２ＤはＮＫ細胞、γδＴ細胞及びＣＤ８＋αβＴ細胞によって発現され、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する標的細胞に対するエフェクター細胞の機能を促進する活性化受容体として作用する。このようなリガンドは、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質（ＭＩＣ）又はＵＬ－１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリー（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６、及びＵＬＢＰ３）に属する誘導自己タンパク質であり、これらは完全に存在しないか又は正常細胞の表面に低レベルでのみ存在し、感染細胞、悪性細胞、形質転換細胞、老化細胞及びストレスを受けた細胞で過剰発現する。その発現は様々な工程で（様々なストレス経路によって、最も顕著にはＤＮＡ損傷応答によって）調節される。ＮＫＧ２Ｄは、その表面膜発現を促進及び安定化するＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）と結合している。ＮＫＧ２Ｄにはその細胞質ドメインにシグナル伝達モチーフがなく、シグナル伝達はＤＡＰ１０のリン酸化を介したライゲーションの際に生じ、これによって下流のシグナル伝達エフェクター分子が動員され、最終的には細胞障害性が引き起こされる。
更なる実施形態によれば、ＣＤ８＋細胞はパーフォリン及び／又はＦＡＳＬを更に発現することができる。他の実施形態では、ＣＤ８＋細胞はＣＸＣＲ４及び／又はＣＸＣＲ２を更に発現することができる。他の実施形態では、ＣＤ８＋細胞はＣＸＣＲ３及び／又はＣＸＣＲ６を更に発現することができる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも４０％は、パーフォリン、ＦａｓＬ、ＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ２から成る群から選択される少なくとも１種のマーカーの表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも９０％がＣＸＣＲ３の表面発現を特徴とし、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも３０％がＣＸＣＲ６の表面発現を特徴とする。
ＣＸＣケモカイン受容体は、ＣＸＣケモカインファミリーのサイトカインに特異的に結合して応答する内在性膜タンパク質である。構造的には、このような受容体は、細胞膜を７回貫通するため、７回膜貫通（７－ＴＭ）タンパク質として知られるＧタンパク質関連受容体として特徴付けられる。
ＣＸＣＲ４（フーシンとしても知られる）は、その標準リガンドとしてのＣＸＣＬ１２（又はＳＤＦ－１）として知られるケモカインの受容体であり、リンパ球に対する強力な走化性活性を備えた分子である。ＣＸＣＲ４は幅広い細胞分布を有し、様々な造血細胞型（例えば、好中球、単球、Ｔ細胞及びＢ細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞及びマクロファージ）で発現する。ＣＸＣＲ４活性化は細胞遊走と細胞増殖の両方を促進することができ、ＣＸＣＬ１２は、造血幹細胞の骨髄へのホーミングと造血幹細胞の静止において重要であることも知られている。ＣＸＣＲ４の更なるリガンドが幾つか開示されており、例えば、損傷関連分子パターン分子である高移動度グループボックス１タンパク質（ＨＭＧＢ１）、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、自然免疫の調節に関与するサイトカイン、細胞外ユビキチン（ｅＵｂ）及びベータディフェンシン－３（ＨＢＤ３）が挙げられる。
インターロイキン８受容体ベータ（ＩＬ８ＲＢ）としても知られるＣＸＣＲ２は、好中球及び他の特定の細胞型の表面に発現する。ＣＸＣＲ２は、損傷又は感染部位への好中球の動員に関与する主要なサイトカインであり、マクロファージや上皮細胞、気道平滑筋細胞、内皮細胞等の他の細胞型によって産生されるケモカインであるＩＬ－８（ＣＸＣＬ８としても知られる）に高い親和性で結合する。ＣＸＣＲ２の他のリガンドとしては、例えば、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３及びＣＸＣＬ５が挙げられる。
ＣＸＣＲ３とそのリガンド、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１は、インターフェロン誘発炎症反応時の重要な免疫化学誘引物質である。ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＤ１８３）は、様々な細胞型で発現するインターフェロン誘導性ケモカイン受容体であるが、単球、Ｔｈ１Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及び一部の癌細胞で優先的に発現する。ヒトにおけるＣＸＣＲ３には、ＣＸＣＲ３－Ａ、ＣＸＣＲ３－Ｂ、及びケモカイン受容体３代替物（ＣＸＣＲ３－ａｌｔ）の３種のアイソフォームが存在する。ＣＸＣＲ３－ＡはＣＸＣケモカインＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、及びＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ）に結合し、ＣＸＣＲ３－ＢはＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１に加えてＣＸＣＬ４にも結合することができる。
ＣＸＣＲ６（ＳＴＲＬ３３及びＴＹＭＳＴＲとしても知られる）は、例えば、ナイーブＣＤ８＋細胞、ＣＤ３－ＣＤ１６－／ｌｏｗＣＤ５６＋及びＣＤ３－ＣＤ１６ｌｏｗＣＤ５６－ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、及びγδＴ細胞の３０～４０％で発現するケモカイン受容体である。ＣＸＣＲ６はＣＸＣＬ１６にのみ結合し、移植片対宿主病におけるＴ細胞動員、感染後の肝臓常在ＣＤ８Ｔ細胞の維持、肺疾患重症度の調節等、様々な免疫方法で役割を果たす。そのリガンドは、腫瘍細胞の増殖、遊走、浸潤及び転移において重要な役割を果たすα－ケモカインサブファミリーに属する走化性サイトカインである。特に、ＣＸＣＲ６の活性化は腫瘍微小環境での細胞傷害性Ｔ細胞の生存と増殖に重要であり、それによってＴ細胞の消耗を軽減することが示唆された。
更に、本発明に係る細胞組成物はＤＮＡＭ－１の表面発現を更に特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも９０％、９３％、９５％、９７％、典型的には実質的に全て（最大１００％）がＤＮＡＭ－１の表面発現を特徴とする。
ＤＮＡＸアクセサリー分子－１（ＤＮＡＭ－１、ＣＤ２２６）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの膜貫通ネクチン様糖タンパク質であり、ＮＫ細胞とＴ細胞で活性化受容体として作用する。そのリガンドであるＣＤ１１２（ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）としても知られる）とＣＤ１５５（ネクチン－２としても知られる）も同様にネクチンファミリーのメンバーであり、ＤＮＡＭ－１－ＣＤ１１２／ＣＤ１５５軸は、主にＮＫ細胞媒介の腫瘍細胞の死滅における重要な役割で知られている。ＤＮＡＭ－１／ＰＶＲ軸は同種異系活性化Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介溶解に関与する一方、自家状況ではＮＫＧ２Ｄが主要な受容体として現れることが提案されている。
他の実施形態では、本発明の細胞組成物は、抑制性免疫チェックポイント分子の発現の低下を特徴とする。
免疫チェックポイント分子は、自己寛容を誘導することによって、免疫系が自分自身の体を攻撃するのを防ぐ免疫回避機序を表す。通常、免疫チェックポイント受容体はＴ細胞上に存在し、抗原提示細胞上に発現する免疫チェックポイントリガンドと相互作用する。しかし、一部の癌は免疫チェックポイント標的を刺激して攻撃から自身を保護することができる。Ｔ細胞はＭＨＣ分子上に提示された抗原を認識し、活性化されて免疫反応を引き起こすが、これと並行して起こる免疫チェックポイント受容体とリガンドとの相互作用がＴ細胞の活性化を制御する。
免疫チェックポイント受容体には共刺激受容体と抑制性受容体があり、Ｔ細胞の活性化と免疫反応は両受容体間のバランスによって制御される。本明細書で使用される「抑制性免疫チェックポイント分子」という用語は、特に、Ｔ細胞等の免疫エフェクター細胞に発現し、それぞれのリガンドによる結合で抗腫瘍免疫応答の抑制的調節又は阻害を媒介することができる、抑制性免疫チェックポイント受容体を包含する。その例としては、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、及びＴＩＧＩＴが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、本発明のＡＣＴ組成物のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ－３及びＴｉｍ－３から成る群から選択される１種以上の免疫チェックポイント分子の表面発現の低下を特徴とする。様々な実施形態では、このような表面レベルの低下は、本明細書に示すように、元のＰＢＭＣ試料に対する低下、又はＣＩＫ細胞調製物等の他のＡＣＴ組成物に対する低下と関連することがある。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞はＣＴＬＡ－４の実質的な表面発現の欠如を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも９５％、９７％及び最大約１００％がＣＴＬＡ－４－細胞である。細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２）は、制御性Ｔ細胞で構成的に発現する共受容体であり、活性化（癌において特に顕著な現象）の後に従来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞でアップレギュレートされる。ＣＴＬＡ－４は、活性化受容体ＣＤ２８よりも高い親和性と結合力でＡＰＣ上のＣＤ８０とＣＤ８６に結合するため、そのリガンドに対してＣＤ２８を打ち負かしてＴ細胞阻害を促進することができる。
他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の２５％、２０％、１５％又は１０％以下がＰＤ－１の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約１５％がＰＤ－１の表面発現を特徴とする。プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）は、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞及び一部の骨髄細胞集団だけでなく、活性化中に全てのＴ細胞によって発現される。ＰＤ１は持続的な抗原遭遇時に高い持続的な発現レベルを示すことが多く、これは慢性感染症や癌の状況で発生することがある。このような状況では、ＰＤ１が防御免疫を制限する場合がある。ＰＤ１はＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２の２種のリガンドを有し、腫瘍微小環境でのＰＤ－Ｌ１の発現は一般に腫瘍の免疫回避に関連している。
他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の３０％、２５％、２２％、２０％又は１８％以下がＴＩＧＩＴの表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約２０～２２％がＴＩＧＩＴの表面発現を特徴とする。Ｔ細胞免疫グロブリンとＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇｓ等のＮＫ細胞及びＴ細胞に発現する抑制性受容体である。ＴＩＧＩＴ発現は通常、ナイーブ細胞では低いが、活性化の際にはＴ細胞とＮＫ細胞の両方がＴＩＧＩＴをアップレギュレートすることが示されている。ＴＩＧＩＴはＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体：ＰＶＲ、ＮＥＣＬ－５）、ＣＤ１１２及びＣＤ１１３の３種のリガンドを有し、これらは全てネクチン及びＮＥＣＬ分子のファミリーに属する。
他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の５５％、５３％、５１％、５０％又は４８％以下がＬａｇ－３の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約５０～５１％がＬａｇ－３の表面発現を特徴とする。リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３、ＣＤ２２３としても知られる）は、活性化Ｔ細胞、ＴＩＬ、Ｔｒｅｇｓ、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及び形質細胞様ＤＣで発現する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＬＡＧ３はＭＨＣ－ＩＩと相互作用して、同じＭＨＣ分子のＴＣＲとＣＤ４への結合を禁止して、免疫応答におけるＴＣＲシグナル伝達を直接妨げる。更なるＬＡＧ３リガンドとしては、ＦＧＬ－１、α－シヌクレイン原線維（α－ｓｙｎ）、レクチンのガレクチン－３（Ｇａｌ－３）及びリンパ節類洞内皮細胞Ｃ型レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）が挙げられる。ＬＡＧ３は、他の免疫チェックポイント分子と同様に、Ｔ細胞の細胞増殖、活性化及び恒常性を負に制御し、Ｔｒｅｇ抑制機能に役割を果たすことが報告されている。例えば、Ｔ細胞では、ＬＡＧ３はサイトカインとグランザイムの産生と増殖を抑制し、同時に制御性Ｔ細胞への分化を促進する。
他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の５５％、５４％、５２％、５０％又は４８％以下がＴｉｍ－３の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約５０～５４％がＴｉｍ－３の表面発現を特徴とする。ＴＩＭファミリーのメンバーであるＴ細胞免疫グロブリンとムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ３）は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によって発現されると共に、制御性Ｔ細胞、骨髄細胞、ＮＫ細胞及びマスト細胞等の他の多くの細胞型によって発現される。ＴＩＭ３は、複数の異なるリガンド（例えば、ガレクチン９、ホスファチジルセリン、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）及び高移動度タンパク質Ｂ１（ＨＭＧＢ１））を有することが報告されている。ＴＩＭ３は複数の共抑制受容体（チェックポイント受容体）を含むモジュールの一部であり、これらの受容体は、慢性ウイルス感染症や癌における機能不全又は「疲弊した」Ｔ細胞で共発現及び共制御される。
他の実施形態では、細胞組成物は腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を発揮する。幾つかの実施形態では、腫瘍細胞は造血起源である。「造血起源の腫瘍細胞」という語句は、血液細胞又はその前駆体に由来する悪性細胞を意味する。他の実施形態では、腫瘍細胞はリンパ系起源である。他の実施形態では、腫瘍細胞は骨髄起源である。特定の実施形態では、腫瘍細胞は白血病細胞、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。他の特定の実施形態では、腫瘍細胞は多発性骨髄腫細胞である。
例示的な実施形態によれば、細胞組成物は、造血器腫瘍細胞とインビトロで（それぞれ）少なくとも０．２５：１の比率で２４時間インキュベートした場合、造血器腫瘍細胞を特異的に根絶（死滅）することができる。更なる例示的な実施形態によれば、細胞組成物は、造血器腫瘍細胞とインビトロで１：１の比率で２４時間インキュベートした場合に、造血器腫瘍細胞の少なくとも５０％、典型的には６０～９９％、より典型的には約８０～９０％を特異的に根絶することができる。他の実施形態では、腫瘍細胞は少なくとも１種、典型的には複数のＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３が挙げられるが、これらに限定されない）を発現する。他の実施形態では、腫瘍細胞は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３を発現する。他の実施形態では、本明細書に示すように、細胞組成物は、同じ条件下でＣＩＫ組成物よりも高い程度まで造血器腫瘍細胞を特異的に根絶することができる（例えば、エフェクター細胞と腫瘍細胞の比率が１：１の場合は６～１０倍高くなり、エフェクター細胞と腫瘍細胞の比率が０．５：１の場合は最大で約１５倍高くなる）。他の実施形態では、腫瘍細胞は固形腫瘍細胞である。特定の実施形態では、細胞は前立腺腫瘍細胞又は中皮腫細胞である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
本明細書で使用される、腫瘍細胞に対する「特異的根絶」という用語は、標的腫瘍細胞に対して選択的（又は優先的）である、標的化された腫瘍細胞死を意味する。通常、根絶は腫瘍細胞によって誘導される細胞傷害活性によって発揮される（例えば、本明細書に開示の条件下での細胞組成物と腫瘍細胞との接触時）。
本明細書で使用される「細胞障害性」及び「細胞障害活性」という用語は、特に細胞媒介細胞障害性又は細胞溶解、即ち、免疫細胞、特にエフェクター免疫細胞の細胞死滅活性を意味する。免疫系の顕著な細胞傷害性エフェクター細胞には、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）及びＮＫ－Ｔ細胞がある。細胞傷害性細胞（例えば、ＣＴＬ又はＮＫ細胞）は、１種以上の異なる機序（例えば、細胞溶解性顆粒に蓄えられた１種以上の細胞毒素の放出、又はＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）の発現が挙げられるが、これに限定されない）を用いた標的細胞のアポトーシス又は溶解によって標的細胞を死滅させることができる。細胞毒素の例としては、例えば、パーフォリン、グランザイム及びグラニュライシンが挙げられる。現在知られているグランザイムは、グランザイムＡ、Ｂ、Ｈ、Ｋ及びＭである。このような細胞障害性又は細胞溶解活性は、標準的な技法を用いて、例えば、生細胞の選択的標識を使用するアッセイによって測定及び定量化することができる。例えば、二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）及び／又はヨウ化プロピジウムベースのアッセイ、又は当技術分野で既知の他の適切なアッセイを用いることができるが、これに限定されない。
他の実施形態では、細胞傷害活性はグランザイムＢ及び／又はパーフォリンによって媒介される。他の実施形態では、細胞傷害活性はＦＡＳ－ＦａｓＬ相互作用によっては実質的に媒介されない。
パーフォリンは、Ｃａ＋２依存的に標的細胞に移動する孔形成細胞溶解性タンパク質である。パーフォリンは、死滅させる予定の細胞のごく近傍で細胞溶解性顆粒を放出すると、標的細胞の細胞膜に細孔を形成し、そこからグランザイムと関連分子が侵入し、アポトーシスを誘導する。グランザイムＢ（グランザイム２及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連セリンエステラーゼ１としても知られる）は、カスパーゼの切断と活性化により、細胞媒介免疫応答において標的細胞のアポトーシスを迅速に誘導する特に重要なセリンプロテアーゼである。ＦＡＳ受容体は、Ｆａｓ、ＦａｓＲ、アポトーシス抗原１（ＡＰＯ－１又はＡＰＴ）、分化クラスター９５（ＣＤ９５）又は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６（ＴＮＦＲＳＦ６）としても知られ、そのリガンドであるＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）と結合すると、プログラム細胞死（アポトーシス）を引き起こす細胞表面の死受容体である。免疫エフェクター細胞によるＦａｓＬの発現、及びそれに続くＦＡＳ発現標的腫瘍細胞との接触時のＦＡＳ－ＦａｓＬ相互作用は、パーフォリン非依存的に腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができる。このようなパーフォリン非依存的な細胞傷害活性は、パーフォリンモノマーの重合はできないが、細胞媒介細胞溶解が依然として起こるＣａ２＋非依存的な系で検討することができる。
本明細書において、特定の剤又は経路（例えば、パーフォリン、グランザイムＢ又はＦＡＳ－ＦａｓＬ）によって媒介される細胞傷害活性とは、剤の関与又は活性によって誘発される、及び／又は実質的に剤の関与又は活性に依存する活性を意味する。このような活性には、剤が対応するエフェクター細胞内で発現された後に活性化されることが必要である。従って、剤又は経路に対する特定の薬理学的阻害剤又は抗体の存在下で細胞傷害活性は、阻害剤又は抗体の非存在下での同じ条件下での活性と比較して有意に低下する（典型的には少なくとも５０％、より典型的には少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％及び最大１００％の阻害）が、これは、活性が剤（例えば、パーフォリン又はグランザイムＢ）によって媒介されていることを示す。同様に、有意な低下（統計的に有意、又は幾つかの実施形態では５％、１０％、２０％又は３０％以下の低下）がないことは、活性が剤（例えば、ＦａｓＬ）によって媒介されていないことを示す。例えば、本明細書に開示の細胞障害性アッセイは、３，４－ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ）又は他の市販のグランザイムＢ阻害剤、コンカナマイシンＡ（ＣＭＡ）又は他の市販のパーフォリン阻害剤、又はＳｉｇｍａ社又は他の供給業者から市販されている抗ＦａｓＬ（又は抗ＦＡＳ）ブロック抗体の存在下で行うことができる。このようなアッセイの非限定的な例は以下の実施例にて記載する。
本明細書に示すように、本発明に係る細胞組成物は、様々な腫瘍細胞に対してＭＨＣ制限細胞傷害活性と非ＭＨＣ制限細胞傷害活性の両方を有することが見出された。従って、一実施形態では、細胞傷害活性はＭＨＣ依存的である（即ち、細胞上のＭＨＣ分子の存在又は活性が必要である）。他の実施形態では、細胞傷害活性は非ＭＨＣ依存的である。他の実施形態では、細胞傷害活性は実質的にＭＨＣＩ非依存的である。他の実施形態では、細胞傷害活性は実質的にＭＨＣＩＩ非依存的である。
他の実施形態では、本発明の細胞組成物は、非腫瘍細胞に対して実質的な細胞傷害活性を示さずに、腫瘍特異的細胞傷害活性を発揮することができる。他の実施形態では、本発明の細胞組成物は、移植片対宿主（ＧＶＨ）反応又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を実質的に誘導しない。従って、幾つかの実施形態では、本発明の細胞組成物は治療する対象と組織適合性である必要はない。従って、自家性、組織適合性同種異系、及び非組織適合性同種異系ＰＢＭＣ試料を本発明の組成物の調製に使用することができる。
本明細書で使用される「移植片対宿主病」又は「ＧＶＨＤ」という用語は、移植レシピエントの組織に対する移植白血球による攻撃に起因する炎症性疾患を意味する。ＧＶＨＤは通常、免疫低下宿主において移植片の免疫担当細胞によって非自己であると認識された場合に発生し、急性及び／又は慢性ＧＶＨＤを包含する。ＡＣＴの状況では、ＧＶＨＤという用語は、特に、養子移植された免疫細胞によって誘発される、レシピエント対象の非腫瘍細胞、組織及び／又は器官への損傷に起因する病理過程及び臨床症状を意味する。ＧＶＨＤは、上皮組織、特に皮膚、肝臓及び消化管粘膜に対する炎症を介した損傷として現れることが多い。
「組織適合性」という用語は、異なる個体間の組織の類似性を意味する。組織適合性のレベルは、患者とドナーがどの程度適合しているかを表す。主要な組織適合性決定因子はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）である。ＨＬＡタイピングは、潜在的なドナーと潜在的なレシピエントの間で行い、両者のＨＬＡがどの程度一致するかを確認する。本明細書で使用される「組織適合性」という用語は、６種のＨＬＡ抗原（２種のＡ抗原、２種のＢ抗原、及び２種のＤＲ抗原）の全てがドナーとレシピエントとの間で同一である実施形態を意味する。
本明細書で更に示すように、本発明の細胞組成物は、インビボで腫瘍細胞（非組織適合性腫瘍細胞を含む）に対して有意な細胞傷害活性を示す。例えば、本明細書の実施例８に示すように、本発明に係る組成物はリンパ系腫瘍細胞に対して顕著な細胞傷害活性を示し、腫瘍の発生を少なくとも７８％～９７％阻害した。従って、本発明は、幾つかの実施形態において、脾臓における造血器腫瘍の発生を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％又は少なくとも８０％、９０％、９５％又は９７％阻害することができる細胞組成物に関し、各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。更に、本発明に係る有利な組成物（本発明の組成物）は、インビボでの非組織適合性腫瘍細胞に対して、ＰＢＭＣ（一般に、インビボで腫瘍細胞を根絶するのに実質的に有効ではないと考えられている）又はＣＩＫやＬＡＫ等の種々のＰＢＭＣ由来組成物によって発揮されるよりも有意に高い細胞傷害活性を示す。
他の実施形態では、ＡＣＴ細胞組成物であって、５×１０６～１０×１０９個の生存可能なインビトロ増殖ＰＢＭＣを含み、その７０～８５％がＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ－１＋及びグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも６５％がＣＤ５６－細胞であり、最大８％がＣＤ３－細胞であって、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示すＡＣＴ細胞組成物が提供される。他の実施形態では、生細胞の５～１５％がＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞であり、１５～３０％がＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞であり、７～１７％がＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５６＋細胞である。他の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞に対するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の比率が７～８であることを特徴とし、及び／又は５％未満のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞を含む。
遺伝子改変細胞
他の実施形態では、本発明の細胞組成物は遺伝子改変されている。一実施形態では、腫瘍特異性をもたらす少なくとも１種の受容体、例えば、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように細胞が改変されている。他の実施形態では、本発明の組換え構築物、又は以下に開示の組換え構築物の独特な組み合わせを含む細胞組成物が提供される。
ＣＡＲは、標的となる抗原に強く結合する分子の結合部位（即ち「結合部分」）と、リンパ球の活性化につながるシグナル伝達の開始を担う従来の免疫受容体の細胞質ドメイン（「シグナル伝達部分」）を結合する。最も一般的には、使用される結合部分は、標的となる抗原に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦａｂ（抗原結合）断片の構造に由来する。Ｆａｂは２種の遺伝子の産物であるため、対応する配列は通常、短いリンカー断片を介して結合され、これにより重鎖が軽鎖由来のペプチドの上に折り畳まれて天然構造になり、単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）領域が形成される。本来のＣＡＲ系として知られている多くの系は抗体断片をＴ細胞に結合するため、「Ｔボディ」とも称されていた。他の考えられる抗原結合部分としては、ホルモン又はサイトカイン分子のシグナル伝達部分、膜受容体の細胞外ドメイン、及びライブラリーのスクリーニング（例えば、ファージディスプレイ）に由来するペプチドが挙げられる。本発明の組成物に使用されるＣＡＲに適した抗原標的は、本明細書に開示の疾患特異的抗原である。
「抗体」という用語は、インタクトな分子と抗原結合部位を含むその断片の両方を包含することを意味する。本発明によって開示される抗体は完全に合成であってもよく、その場合、抗体のポリペプチド鎖は合成され、場合によっては受容体として本明細書に開示のポリペプチドに結合するように最適化される。このような抗体はキメラ抗体又はヒト化抗体であってもよく、構造が完全に四量体であってもよく、又は二量体であって単一の重鎖と単一の軽鎖のみを含むものであってもよい。
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野では周知である。幾つかの既知の方法のいずれか１種によって抗体を産生することができ、抗体分子のインビボ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング、又は培養中の連続細胞株によるモノクローナル抗体分子の産生を利用することができる。このような方法としては、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ハイブリドーマ技術が挙げられるが、これらに限定されない。インビボで抗体を産生する従来の方法に加えて、当技術分野で周知の方法により、ファージディスプレイ技術を用いてインビトロで抗体を産生することができる（例えば、Current Protocols in Immunology, Colligan et al (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Chapter 17, Section 17.1）。ペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドによって連結された重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって単鎖Ｆｖを調製する。構造遺伝子を発現ベクターに挿入した後、大腸菌等の宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、２種の可変ドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖を合成する。単鎖Ｆｖを産生するための十分なガイダンスが当技術分野の文献に提供されている。
細胞質ドメインに関して、ＣＡＲの設計は、共刺激分子のシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８３、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８及び／又はＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを単独で、又はＣＡＲの状況において有用な他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むように行うことができる。他の実施形態では、ＣＡＲは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、又はそれらの組み合わせから成る群から選択される共刺激分子のシグナル伝達ドメインを含む。例示的な一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変細胞は、所望のＣＡＲ、例えば、抗ＣＤ１９結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを含むレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを細胞に導入することによって産生することができる。或いは、ゲノムに組み込まれずに細胞内で安定に維持されるベクターを使用する。他の実施形態では、本発明のＣＡＲ改変細胞は、そのようなＣＡＲ分子をコードする遺伝子を細胞内に形質導入又はトランスフェクションすることによって産生することができる。
特定の実施形態では、ＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲを発現するように細胞を遺伝子改変する。ＣＤ１９分子（分化クラスター１９）としても知られるＢリンパ球抗原ＣＤ１９、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、Ｔ細胞表面抗原Ｌｅｕ－１２及びＣＶＩＤ３は、ヒトにおいては遺伝子ＣＤ１９によってコードされる膜貫通タンパク質である。ヒトにおいては、ＣＤ１９は全てのＢ系列細胞で発現する。ＣＤ１９はヒトＢ細胞において２種の主要な役割を果たす。一方では、細胞質シグナル伝達タンパク質を膜に動員するアダプタータンパク質として作用し、他方では、ＣＤ１９／ＣＤ２１複合体内で作用して、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路の閾値を低下させる。全てのＢ細胞に存在するため、Ｂリンパ球の発生、リンパ腫診断のバイオマーカーであり、白血病免疫療法の標的として利用することができる。インターロイキン－３受容体（ＣＤ１２３）は、免疫系で重要な可溶性サイトカインであるインターロイキン－３のシグナル伝達を助ける細胞上に存在する分子である。受容体をコードする遺伝子は、Ｘ染色体とＹ染色体の偽常染色体領域に位置する。この受容体はＩ型サイトカイン受容体ファミリーに属し、特有なα鎖と一般のβ（βｃ又はＣＤ１３１）サブユニットが対になったヘテロ二量体である。αサブユニットの遺伝子は４０キロベースの長さで、１２個のエクソンを有する。
ある例示的な実施形態では、ＣＡＲは、４－１ＢＢとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに連結された抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖを含む。他の例示的な実施形態では、ＣＡＲは更なるドメイン（例えば、ＣＤ８由来のヒンジ領域及び／又は膜貫通領域が挙げられるが、これに限定されない）を更に含むことができる。他の例示的な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８とＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに連結された抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖを含むことができる。本発明の実施形態によって使用することができる特定のＣＡＲ分子とそれをコードする構築物の非限定的な例を、以下の実施例８及び９に記載する。
他の実施形態では、他の標的、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ４７、ＰＤＬ－１、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１６、ＣＤ２７６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＥＦＦＲｖＩＩＩに対するＣＡＲを使用することができる。更に他の実施形態では、他の様々なマーカーをＣＡＲ標的として使用することができ、例えば、ＡＦＰ、Ａｘｌ、Ｂ７－Ｈ６、ＢＣＭＡ、ビオチン、ＣＤ１０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２７６、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９９、ＣＥＡ、ＣＬＤＮ１８．２、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＳ１、ＤＬＬ３、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｒｂＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＡＰ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＴＧＢ７、ＬｅＹ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＭＥＬ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、及びＶＥＧＦＲ２が挙げられるが、これらに限定されない。様々な受容体の配列が入手可能であり、遺伝子改変用の核酸構築物の産生に使用することができる。例えば、Ｔ細胞組成物を改変するのに使用される、ＣＤ１９又はＣＤ１２３に対するＣＡＲ構築物は、それぞれＵＳ２０１４０２７１６３５号及びＵＳ２０１４０３２２２１２号に開示されているが、これに限定されない。
他の実施形態では、例えば、癌の治療に有用な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は他の標的に対する、組換えＴＣＲをコードする構築物を使用することができる。よく知られたＴＡＡの非限定的な例は、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００２０９－２１７、ｇｐ１００１５４－１６３、ＣＳＰＧ４、ＮＹ－ＥＳＯ、ＭＡＧＥ－Ａ１、及びチロシナーゼである。このようなＴＣＲ構築物は当技術分野で知られており、組換え法によって取得又は産生することができる。
他の実施形態では、少なくとも１種のサイトカイン、ケモカイン、又はその受容体を発現するように細胞が改変されている。一実施形態では、改変ケモカイン受容体を発現するように細胞を遺伝子改変する。一実施形態では、腫瘍の局在化又は保持を増強するようにケモカイン受容体は改変されている。本明細書において、腫瘍局在化又は保持の増強は、養子移植されたエフェクター細胞が腫瘍微小環境で遊走、浸透及び／又は増殖する能力に関連し、そのようなトランスジェニック受容体がない場合のレベルと比較して、養子移植後の腫瘍において特定可能なエフェクター細胞の相対数の増大として現れる。例えば（例えば、治療対象の腫瘍が骨髄に由来するか、又は骨髄内に存在する場合）、改変ケモカイン受容体は、トランスジェニック細胞の骨髄保持を有利に増強する。特定の実施形態では、改変ケモカイン受容体は、Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体である（例えば、本明細書に記載の腫瘍局在化及び／又は保持の増強をもたらす）。例えば、ＣＸＣＲ４遺伝子でのＷＨＩＭ変異（ＷＨＩＭ症候群の患者で特定）は、コードされた受容体のＣ末端トランケーション（例えば、１５～２０個のＣ末端アミノ酸（ａａ）の除去）と関連している。特定の実施形態では、改変ＣＸＣＲ４は、例えば、Ｒ３３４Ｘ変異（本明細書ではＷＨＩＭ Ｒ３３４ｘ変異とも称され、残基３３３の後にトランケーション変異を含むＣＸＣＲ４であり、後述の配列番号８によって例示）に起因する１９個のＣ末端ａａトランケーションを特徴とする。非限定的な例によると、このような改変細胞は、骨髄に局在する造血器腫瘍や転移の治療に特に有用である。
他の実施形態では、ＩＬ－２ファミリーの少なくとも１種のサイトカインを発現するように細胞が遺伝子改変されている。例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１を外因的に（例えば、構成的又はアップレギュレートするように）発現するように細胞を改変することができる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態では、細胞組成物は、外因性ＩＬ－２、外因性ＩＬ－１５、外因性ＩＬ－２１のいずれか１種、又はそれらの任意の組み合わせを発現する。「外因性」という用語は、細胞又は生物体内のタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドに関して使用される場合、人為的又は天然手段によって細胞又は生物に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドを意味する。外因性核酸は、異なる生物体又は細胞に由来するものであってもよく、生物体又は細胞内に天然に存在する核酸の１個以上の追加のコピーであってもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、天然細胞とは異なる染色体位置にある核酸、又は天然に見出されるものとは異なる核酸配列に隣接する核酸である。外因性核酸はエピソームベクター等の染色体外核酸とすることもできる。
ＩＬ－１５は、上述のＩＬ－２と構造的及び機能的に類似したサイトカインである。ＩＬ－２と同様に、ＩＬ－１５は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）と共通ガンマ鎖（ガンマ－Ｃ、ＣＤ１３２）で構成される複合体に結合し、それを通じてシグナル伝達する。ＩＬ－１５はＩＬ１５遺伝子によってコードされており、ＮＫ細胞の増殖を誘導する。ＩＬ－２１はヒトのＩＬ２１遺伝子によってコードされており、ＮＫ細胞や細胞傷害性Ｔ細胞等の免疫系の増殖を誘導する。
幾つかの実施形態では、細胞は複数の改変を特徴とする。非限定的で有利な実施形態によれば、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように改変された細胞組成物を本明細書で開示する。本明細書に開示のように、幾つかの実施形態では、そのような改変ＳＡＫ細胞組成物は、造血器腫瘍及び白血病等の骨髄に局在する腫瘍の治療に特に有用である。幾つかの実施形態では、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインをコードする核酸構築物によるトランスフェクション、形質導入又は感染によって細胞が修飾されている。他の実施形態では、構築物はウイルスベクターである。他の実施形態では、構築物は、少なくとも１種の翻訳調節配列、例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列、又は２Ａペプチド配列等の自己切断配列を更に含む。例示的な実施形態では、翻訳調節配列は、要素（ｉ）と（ｉｉ）をコードする核酸配列の間、及び／又は要素（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間に位置する。他の特定の実施形態では、要素は構成的に発現される。
他の実施形態では、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように遺伝子改変された白血球を含む細胞組成物が提供される。
他の実施形態では、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインをコードする核酸構築物が提供される。更に他の実施形態では、本明細書に開示の本発明の核酸構築物が提供される。
特に、所望の遺伝子産物を送達及び発現するために使用される発現構築物又はベクターを含む核酸構築物の調製は、当技術分野で知られている。単離された核酸配列は、その天然源から遺伝子全体（即ち、完全遺伝子）又はその一部として得ることができる。核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）又は化学合成によって産生することもできる（例えば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York; Ausubel, et al., 1989, Chapters 2 and 4を参照）。核酸配列としては、天然の核酸配列及びその相同体が挙げられ、例えば、天然の対立遺伝子変異体や、機能的ペプチドをコードする核酸分子の能力を実質的に妨げないような方法で、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、及び／又は反転された改変核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド配列はタンパク質の遺伝コードから推定可能であるが、コードの縮重を考慮する必要があると共に、所謂「Ｗｏｂｂｌｅ ｒｕｌｅ」による、コドンの３番目の位置における古典的な塩基対に対する例外を考慮する必要がある。おおよそヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、同一又は同等のタンパク質をもたらすことができる。組換え産生法を用いて、例えば、大腸菌又は酵母等の微生物の選択宿主細胞は、ポリペプチド又はポリペプチド類似体をコードする特定のＤＮＡ配列を含むハイブリッドウイルス又はプラスミドＤＮＡベクターで形質転換し、ＤＮＡ配列の転写及び翻訳の際に宿主内でポリペプチドを合成する。
本発明の実施形態に従って構築物にクローン化可能なサイトカイン、ケモカイン受容体、ＣＡＲ及び他の遺伝要素の例示的な配列は、以下の実施例８及び９に記載する。例えば、ヒトＩＬ－２の例示的な核酸配列は配列番号３で示され、ヒトＩＬ－１５の例示的な核酸配列は配列番号４で示され、野生型ＣＸＣＲ４の例示的な核酸配列は配列番号７で示され、改変Ｃ’切断型ＣＸＣＲ４の例示的な核酸配列は配列番号８で示され、ＣＤ１９特異的ＣＡＲの例示的な核酸配列は配列番号９で示され、ＣＤ１２３特異的ＣＡＲの例示的な核酸配列は配列番号１で示される。他の実施形態では、少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９３％、９５％、９７％、又は９９％の相同性を保持する、これらの配列の機能的に同等な変異体及び相同体を使用することができる。
当技術分野で知られているように、構築物は他の制御配列又は選択可能マーカーを含むこともできる。核酸構築物（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、このベクターを原核生物、真核生物又は場合によっては両方（例えば、シャトルベクター）における複製及び統合に適したものにする追加の配列を含むことができる。更に、典型的なクローニングベクターには、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳ターミネーター、及びポリアデニル化シグナルが含まれる場合もある。
既に記載した要素に加え、本発明の発現ベクターは通常、クローン化核酸の発現レベルを高めること、又は組換えＤＮＡを保有する細胞の特定を容易にすることを目的とした他の特殊な要素を含むことができる。例えば、多くの動物ウイルスには、許容細胞型におけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列が含まれている。このようなウイルスレプリコンを保持するプラスミドは、プラスミド上又は宿主細胞のゲノムに保持される遺伝子によって適切な因子が提供される限り、エピソーム的に複製される。
ベクターは真核生物レプリコンを含む場合も含まない場合もある。真核生物レプリコンが存在する場合、ベクターは適切な選択可能マーカーを用いて真核細胞内で増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は不可能である。その代わりに、組換えＤＮＡは操作された細胞のゲノムに組み込まれ、プロモーターが所望の核酸の発現を指示する。
哺乳類発現ベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／－）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、及びｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶ及びｐＢＫ－ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ社から入手可能）、ｐＴＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能）及びその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、本明細書に記載の実施形態において有用な構築物のベクター骨格として機能することができる。
レトロウイルス等の真核生物ウイルスの調節エレメントを含む発現ベクターも使用することができる。ＳＶ４０ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＴ７やｐＭＴ２が挙げられる。ウシパピローマウイルス由来のベクターとしては、ｐＢＶ－１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタイン・バーウイルス由来のベクターとしては、ｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５が挙げられる。他のベクターの例としては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする他の任意のベクターが挙げられる。これらは、本発明の構築物のベクター骨格として機能することができる。
上述のように、ウイルスは非常に特殊な感染病原体であり、多くの場合、宿主の防御機構を回避するように進化してきた。通常、ウイルスは特定の種類の細胞に感染し、増殖する。ウイルスベクターのターゲティング特異性は、その天然の特異性を利用して、所定の細胞型を特異的に標的にし、それによって感染細胞に組換え遺伝子を導入する。従って、本発明によって使用されるベクターの種類は、形質転換される細胞の種類に依存する。形質転換される細胞型に応じて適切なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力の範囲内であるため、選択の考慮事項の一般的な説明は本明細書では行わない。
レトロウイルス由来のベクターとしては、例えば、レンチウイルスベクターが挙げられる。「レンチウイルスベクター」及び「組換えレンチウイルスベクター」は、レンチウイルスとして知られるレトロウイルスベクターのサブセットに由来する。レンチウイルスベクターとは、目的の核酸分子を担持し、特定の実施形態においては、目的の核酸分子の発現を指示することができる核酸構築物を意味する。レンチウイルスベクターには、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は遺伝子座定義要素、又は選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸送、メッセンジャーの翻訳後修飾、又はタンパク質の転写後修飾等の他の手段によって遺伝子発現を制御する他の要素が含まれる。このようなベクター構築物には、パッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲＳ）又はその一部、及び使用するレンチウイルスベクターに適切なプラス鎖及びマイナス鎖プライマー結合部位（これらがレトロウイルスベクターにまだ存在しない場合）も含む必要がある。必要に応じて、組換えレンチウイルスベクターは、ポリアデニル化を指示するシグナル、Ｎｅｏ、ＴＫ、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノール、又はＤＨＦＲ等の選択可能マーカー、及び１種以上の制限部位と翻訳終結配列を含むこともできる。例として、そのようなベクターは通常、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。
「レンチウイルスベクター粒子」は本発明内で利用することができ、少なくとも１種の目的の遺伝子を保有するレンチウイルスを意味する。レトロウイルスは選択可能マーカーを含むこともある。組換えレンチウイルスは、感染時にその遺伝物質（ＲＮＡ）をＤＮＡに逆転写し、この遺伝物質を宿主細胞のＤＮＡに組み込むことができる。レンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスエンベロープ、非レンチウイルスエンベロープ（例えば、両種指向性又はＶＳＶ－Ｇエンベロープ）、又はキメラエンベロープを有することができる。
幾つかの実施形態では、改変細胞組成物は、本明細書に開示の本発明のＳＡＫ細胞組成物又はＡＣＴ細胞組成物である。例えば、ＡＣＴ細胞組成物は少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生存可能なインビトロ増殖ＰＢＭＣを含み、その７０～８５％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％はＣＤ３－細胞であり、組成物はインビトロ及びインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示し、本明細書に開示の遺伝子改変に供することができる。
他の実施形態では、他の白血球調製物又は集団（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞及びＤＣ、及び当技術分野で既知の様々なＡＣＴ組成物（例えば、ＴＩＬ、ＣＩＫ及びＬＡＫ）が挙げられるが、これらに限定されない）を改変に使用することができる。しかし、本明細書に開示の本発明の改良構築物によって改変されていない白血球の使用は、本発明の教示及び原理とは区別されるべきであることを理解されたい。特定の実施形態によれば、そのような代替白血球組成物の使用は明確に除外される。
治療用途
他の様相では、本発明の細胞組成物は癌の治療に使用することができる。他の様相では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、腫瘍細胞を治療有効量の本発明の細胞組成物と接触させ、それによって対象の腫瘍を治療することを含む方法が提供される。他の実施形態では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍の治療に使用するためのＡＣＴ組成物であって、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生存可能なインビトロ増殖末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、その７０～８５％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％がＣＤ３－細胞であり、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示すＡＣＴ組成物が提供される。他の実施形態では、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように遺伝子改変された白血球を含む、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍の治療に使用するための細胞組成物が提供される。
本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は同義的に使用され、固形腫瘍と非固形悪性腫瘍の両方を意味する場合がある。他の実施形態では、腫瘍は造血器腫瘍である。リンパ系の造血器腫瘍の非限定的な例としては、例えば、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫が挙げられる。骨髄系の造血器腫瘍の非限定的な例としては、例えば、急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群及び前骨髄球性白血病、線維肉腫や横紋筋肉腫等の間葉起源の腫瘍が挙げられる。他の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。固形腫瘍の非限定的な例としては、例えば、肺腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、及び腎腫瘍が挙げられる。様々な実施形態では、腫瘍は白血病、多発性骨髄腫、前立腺癌、中皮腫、肺癌及び膵臓癌から成る群から選択され、各々の可能性が本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態では、腫瘍は白血病、多発性骨髄腫、前立腺癌及び中皮腫から成る群から選択される。特定の実施形態では、腫瘍はＡＭＬである。
他の実施形態では、腫瘍は少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を特徴とする。幾つかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６、及びＵＬＢＰ３から成る群から選択される。他の実施形態では、腫瘍は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６、及びＵＬＢＰ３から成る群から選択される複数のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する。他の実施形態では、腫瘍は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６、及びＵＬＢＰ３を発現する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
好都合には、対象の腫瘍によるＮＫＧ２Ｄリガンドやチェックポイント分子リガンド等のマーカーの発現は、腫瘍細胞を（例えば、固形腫瘍生検から、又は血液や尿等の体液から）得て、腫瘍細胞の表面上のマーカーの発現を適切なアッセイ（例えば、免疫染色及びフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない）によって検査して確認することができる。このようなアッセイの非限定的な例を本明細書に示す。
他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１種の抑制性免疫チェックポイント分子及び／又はそのリガンドの発現を特徴とする。幾つかの実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３及びそれらの組み合わせの内の少なくとも１種のリガンドを発現することができ、各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＴＩＧＩＴから成る群から選択される抑制性免疫チェックポイント分子の少なくとも１種のリガンドの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＴＩＧＩＴから成る群から選択される複数の抑制性免疫チェックポイント分子のリガンドの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１種のＣＴＬＡ－４リガンド（例えば、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６）の発現を特徴とする。
他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤による治療に対して抵抗性である。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３及びそれらのリガンド及び組み合わせから成る群から選択される少なくとも１種のチェックポイント分子に対する少なくとも１種の阻害剤（例えば、遮断抗体）による治療に対して抵抗性であり、各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
例示的な実施形態によれば、腫瘍は、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））及びトレメリムマブから成る群から選択される少なくとも１種のＣＴＬＡ４特異的阻害剤（例えば、遮断抗体）による治療に対して抵抗性である。他の実施形態では、腫瘍は、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、デュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））及びペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））から成る群から選択される少なくとも１種のＰＤ１特異的阻害剤（例えば、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対する遮断抗体）による治療に対して抵抗性である。他の実施形態では、腫瘍は、チラゴルマブ（ＭＴＩＧ７１９２Ａ）、オシペルリマブ（ＢＧＢ－Ａ１２１７）、ビボストリマブ（ＭＫ－７６８４）、ドムバナリマブ（ＡＢ－１５４）、ＢＭＳ－９８６２０７、ＥＯＳ－４４８、ＡＳＰ－８３７４、ＣＯＭ－９０２、エチギリマブ（ＭＰＨ－３１３）、ＩＢＩ－９３９、ＡＧＥＮ－１３０７、ＣＡＳＣ－６７４、抗ＰＶＲ抗体（ＮＢ－６２５３）、及びＰＨ－８０４から成る群から選択される少なくとも１種のＴＩＧＩＴ特異的阻害剤による治療に対して抵抗性である。他の実施形態では、腫瘍は、ＰＲＳ－３３２、Ｐ１３Ｂ０２－３、ＬＢＬ－００７、エフティラギモドα（ＩＭＰ３２１）、ＬＡＧ５２５（ＩＭＰ７０１）、ＭＫ－４２８０、ＲＥＧＮ３７６７、レラトリマブ（ＢＭＳ－９８６０１６）、ＢＩ ７５４１１１、ＦＳ１１８、テボテリマブ（ＭＧＤ０１３）、ＴＳＲ－０３３、ＩＮＣＡＧＮ２３８５、Ｓｙｍ０２２及びＸｍＡｂ２２８４１から成る群から選択される少なくとも１種のＬＡＧ３特異的阻害剤による治療に対して抵抗性である。他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１種のＴＩＭ３特異的阻害剤、例えば、ＩＣＡＧＮ０２３９０、Ｓｙｍ０２３、ＬＹ３３２１３６７、ＭＧＢ４５３、ＴＳＲ０２２、ＢＧＢＡ４２５、及びＢＭＳ９８６２５８による治療に対して抵抗性である。
他の実施形態では、腫瘍は、複数のチェックポイント阻害剤による治療、又は複数のチェックポイント分子の阻害剤による治療に対して抵抗性である。例えば、腫瘍は、Ｒ０７１２１６６１等のＴＩＭ３とＰＤ１の両方を標的とする二重阻害剤による治療、又はニボルマブとイピリムマブとの併用療法に対して抵抗性となり得るが、これに限定されない。
他の実施形態では、対象は１種以上のチェックポイント分子阻害剤による治療レジメンを受けている。他の実施形態では、対象はチェックポイント分子阻害剤による治療レジメンを受けていない。例えば、ＹＥＲＶＯＹ（商標）（イピリムマブ）は静脈内注入用のヒトＣＴＬＡ－４遮断抗体であり、切除不能又は転移性黒色腫の治療が対象である。ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）は、切除不能又は転移性黒色腫の治療に適応されるＰＤ－１遮断抗体である。ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）は、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、頭頸部扁平上皮癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性が高い又はミスマッチ修復欠損のある癌、マイクロサテライト不安定性が高い又はミスマッチ修復欠損のある結腸直腸癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、子宮内膜癌、腫瘍変異負荷の高い癌、皮膚扁平上皮癌、及び三種陰性乳癌の治療に適応されるＰＤ－１遮断抗体である。ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）（アテゾリズマブ）は、局所進行性又は転移性尿路上皮癌、転移性ＮＳＣＬＣ、ＥＧＦＲ又はＡＬＫゲノム腫瘍異常のない転移性非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、進展期小細胞肺癌（ＥＳ－ＳＣＬＣ）、切除不能又は転移性ＨＣＣ、及び黒色腫の治療に適応されるプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）遮断抗体である。ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標）（デュルバルマブ）は、プラチナベースの化学療法と放射線療法を同時に実施した後に疾患が進行しない切除不能なステージＩＩＩのＮＳＣＬＣの成人患者の治療に適応されるＰＤ－Ｌ１遮断抗体であり、ＥＳ－ＳＣＬＣ成人患者の第一選択治療として、エトポシドとカルボプラチン又はシスプラチンのいずれかとの併用を行う。ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）（アベルマブ）は、ＭＣＣ、ＵＣ、及びＲＣＣの治療に適応されるＰＤ－Ｌ１遮断抗体である。
他の実施形態では、上述の方法又は使用は、本明細書に開示の少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤の投与（本発明の細胞組成物と同時又は逐次組み合わせ）を更に含む。例えば（例えば、腫瘍がＬａｇ－３、Ｔｉｍ－３又はＴＩＧＩＴの少なくとも１種のリガンドの表面発現を特徴とする場合）、上述の方法又は使用は、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３又はＴＩＧＩＴそれぞれに対する少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤の投与を更に含む。他の実施形態では、上述の方法又は使用は、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３、又はそれらの組み合わせに対する少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤の投与を更に含む。更に他の実施形態では、本発明の細胞組成物を唯一の治療剤として使用することができる。例えば、本発明の組成物は、ＣＴＬＡ－４又はＰＤ－１の少なくとも１種のリガンドの表面発現を特徴とする腫瘍の治療における単独療法として使用することができるが、これに限定されない。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
他の実施形態では、腫瘍は、ＣＸＣＲ６リガンド、ＣＸＣＲ４リガンド、ＣＸＣＲ２リガンド及びＣＸＣＲ３リガンドから成る群から選択される少なくとも１種のケモカインの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＸＣＲ６リガンド、ＣＸＣＲ４リガンド及びＣＸＣＲ３リガンドから成る群から選択される少なくとも１種のケモカインの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＸＣＲ６リガンド、ＣＸＣＲ４リガンド、ＣＸＣＲ２リガンド及びＣＸＣＲ３リガンドから成る群から選択される複数のケモカインの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＸＣＲ６リガンド、ＣＸＣＲ４リガンド及びＣＸＣＲ３リガンドから成る群から選択される複数のケモカインの発現を特徴とする。特定の実施形態では、腫瘍は、ＣＸＣＲ４リガンド（例えば、ＣＸＣＬ１２）の発現を特徴とする。他の特定の実施形態では、腫瘍は、ＣＸＣＲ６リガンド（例えば、ＣＸＣＬ１６）の発現を特徴とする。例えば、ＣＸＣＬ１６発現腫瘍としては、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、及び腎臓腫瘍を挙げることができるが、これらに限定されず、各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
他の実施形態では、接触をインビボで行う。従って、本発明の方法は、対象に治療有効量の本発明の細胞組成物（例えば、ＡＣＴ細胞組成物）を投与することを含むことができ、組成物は、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生存可能なインビトロ増殖ＰＢＭＣを含み、その７０～８５％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％がＣＤ３－細胞であって、組成物はインビトロ及びインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示す。他の実施形態では、接触をエクスビボで行う。他の実施形態では、ＩＬ－２の投与と同時に細胞を対象に投与する。更に他の実施形態では（例えば、改良遺伝子改変細胞を使用する場合）、ＩＬ－２の同時投与を行わずに細胞を有利に使用することができ、それによって安全性が高まり、副作用が低減する。
「有効量」又は「治療有効量」とは、本発明の方法において有益な結果を発揮するのに十分な量を意味する。より具体的には、治療有効量は、障害（例えば、癌）の症状を予防、軽減又は改善するのに有効な、又は治療を受ける対象の生存を延長するのに有効な活性成分（例えば、エフェクター細胞）の量を意味する。例えば、対象に投与するための本発明のＡＣＴ組成物は、本明細書に開示のＰＢＭＣから増殖した生細胞を有効量である少なくとも５×１０６～１０×１０８個、典型的には最大約１０×１０９個含む。腫瘍細胞とエクスビボで接触させるための有効量の細胞組成物は、例えば、培養中の各腫瘍細胞に対して少なくとも約０．２５～１個のエフェクター細胞を含むことができる。
インビトロ細胞培養方法の状況において、ＩＬ－２及びＣＤ３アクチベーター等の細胞刺激因子の有効量は、本明細書に開示の有利な表現型調節（例えば、細胞増殖、活性化マーカー（例えば、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ）のアップレギュレーション、及び細胞傷害能力の増強が挙げられるが、これらに限定されない）を発揮するのに十分な量である。例えば、ＩＬ－２の有効量としては組換えヒトＩＬ－２の場合、例えば、５００～１５００、６００～１３００、７５０～１５００又は５００～１２００ＩＵ／ｍＬとすることができ、抗ＣＤ３抗体の有効量としてはＯＫＴ３の場合、例えば、１０～６０、２０～４０、１０～４０又は２０～６０ｎｇ／ｍＬとすることができるが、これに限定されない。
治療有効量の決定は、特に本明細書に記載の詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。本発明の方法で使用される任意の調製物に関して、用量又は治療有効量は、最初にインビトロアッセイ及び細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、動物モデルにおいて用量を処方して、所望の濃度又は力価を得ることができる。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
本明細書に記載の活性成分の毒性及び治療有効性は、インビトロ、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって確認することができる。このようなインビトロアッセイ、細胞培養アッセイ及び動物試験から得たデータは、ヒトにおいて用いる用量範囲を処方する上で使用することができる。投与量は使用する剤形や利用する投与経路に応じて変化し得る。正確な処方、投与経路及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる（例えば、Fingl, E. et al. (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Ch. 1, p.1.を参照）。
他の実施形態では、腫瘍は、ＭＨＣＩ発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを特徴とする。本明細書に示すように、本発明に係る細胞組成物は、様々な腫瘍細胞に対してＭＨＣ依存的細胞傷害活性と非ＭＨＣ依存的細胞傷害活性の両方を有することが見出された。従って、このような細胞組成物は、治療抵抗性の腫瘍（例えば、免疫療法又はチェックポイント分子阻害剤に対して抵抗性）の治療、又は、例えば、ＭＨＣＩ分子の発現の低下、機能喪失突然変異、又は腫瘍に特徴的なＭＨＣＩ経路の他の障害に起因する、ＭＨＣＩ抗原提示障害に関連する免疫回避表現型を示す腫瘍の治療にも有利に使用することができる。
他の実施形態では、細胞組成物は、腫瘍細胞と接触する前に、凍結保存とその後の解凍プロトコルを経ている。本明細書に示すように、本発明の原理に従った細胞組成物は、凍結保存及び解凍後に非常に強力な細胞障害性を示した。また、この活性は、更なる増殖又は操作工程を必要とせずに、解凍時間付近であっても現れた（解凍２４時間以内に、対応する非凍結保存細胞の細胞傷害活性の７０～８０％を保持）。従って、本発明の方法の他の実施形態では、解凍プロトコルは細胞組成物を腫瘍細胞と接触させてから１～３日以内、例えば、３６時間、２４時間、１２時間又は６時間以内に行う。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態では、細胞組成物は、対象に対して自家性、組織適合性同種異系、又は非組織適合性同種異系とすることができ、各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
更なる実施形態
一様相では、本発明は、ＡＣＴ用細胞組成物を産生するための方法であって、
ａ．ＰＢＭＣ試料を提供することと、
ｂ．有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下、且つ他のサイトカイン又は抗体の非存在下で少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させ、このとき、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを２～４日間毎に補充することとで、培養物中の生細胞の数を少なくとも２０倍増加させ、それによって少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生細胞を含む細胞組成物を得ることと、
ｃ．得られた細胞組成物を回収することと
を含む方法を提供する。
他の実施形態では、唯一の外因的に添加された細胞刺激因子としてのＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下で増殖を行う。特定の実施形態では、工程ｂは、５００～１５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と１０～６０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体の存在下で細胞を増殖させることを含み、これらは２～４日間毎に１０～１６日間再補充する。他の実施形態では、細胞は更なる富化、刺激又は増殖工程に供されていない。他の実施形態では、生細胞の数を少なくとも３０倍増加させるように増殖を行う。他の実施形態では、５×１０６～１０×１０８個の生存可能な単核細胞（その７０～８０％はＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞である）を含む細胞組成物を産生するように増殖を行う。他の実施形態では、インビトロで造血器腫瘍細胞と０．２５：１の比率で２４時間インキュベートした場合に、有意に造血器腫瘍細胞を特異的に根絶することができる細胞組成物を産生するように増殖を行う。他の実施形態では、本明細書に開示のように、本発明の細胞組成物を産生するように増殖を行う。
他の実施形態では、工程ｂは細胞を遺伝子改変することを更に含む。他の実施形態では、この方法は、ＣＡＲ及び／又は少なくとも１種のサイトカイン、ケモカイン、又はその受容体を発現するように細胞を遺伝子改変することを含む。例示的実施形態では、この方法は、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように細胞を改変することを含む。他の実施形態では、この方法は、工程ｃで回収した細胞組成物を凍結保存する工程を更に含む。
他の実施形態では、本明細書に開示の方法によって調製される細胞組成物が提供される。
他の様相では、ＡＣＴ細胞組成物であって、５×１０６～１０×１０８個の生存可能なインビトロ増殖ＰＢＭＣを含み、その７０～８０％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％がＣＤ３－細胞であり、インビトロ及びインビボで非組織適合性腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示すＡＣＴ細胞組成物が提供される。
一実施形態では、生細胞の７～１２％がＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞であり、２０～２８％がＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞であり、１０～１４％がＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５６＋細胞である。他の実施形態では、組成物は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞に対するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の比率が７～８であることを特徴とする。他の（追加の又は代替の）実施形態では、組成物はＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞を３％未満含む。
ある実施形態によれば、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも４０％は、パーフォリン、ＦａｓＬ、ＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ２から成る群から選択される少なくとも１種のマーカーの表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも４０％は、パーフォリン、ＦａｓＬ、ＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ２から成る群から選択される複数のマーカーの表面発現を特徴とする。幾つかかの実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約４０％がＦａｓＬを発現し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約５０％がパーフォリンを発現し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約９０％がＣＸＣＲ２を発現し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約１００％がＣＸＣＲ４、グランザイムＢ及びＮＫＧ２Ｄを発現する。
他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも３０％、典型的には少なくとも約４０％が、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ６及びＤＮＡＭ－１から成る群から選択される少なくとも１種のマーカーの表面発現を特徴とする。一実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも９０％がＣＸＣＲ３の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも９０％、典型的には実質的に全てがＤＮＡＭ－１の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも３０％がＣＸＣＲ６の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約９０％がＣＸＣＲ３の表面発現を特徴とし、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の実質的に全てがＤＮＡＭ－１の表面発現を特徴とし、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約３０％がＣＸＣＲ６の表面発現を特徴とする。従って、本発明の実施形態に係るＡＣＴ細胞組成物は、ＮＫＧ２Ｄ＋、グランザイムＢ＋、パーフォリン＋、ＦａｓＬ＋、ＣＸＣＲ４＋、ＣＸＣＲ２＋、ＣＸＣＲ３＋、ＣＸＣＲ６＋及びＤＮＡＭ－１＋で定義されるＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞集団を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の５５％以下、典型的には最大約５０％が、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ－３及びＴｉｍ－３から成る群から選択される１種以上の免疫チェックポイント分子の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約５０％以下が、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ－３及びＴｉｍ－３から成る群から選択される複数の免疫チェックポイント分子の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞は、ＣＴＬＡ－４の実質的な表面発現の欠如を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約５０～５１％がＬａｇ－３の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約５０～５４％がＴｉｍ－３の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約１５％がＰＤ－１の表面発現を特徴とする。他の実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約２０～２２％がＴＩＧＩＴの表面発現を特徴とする。従って、本発明の実施形態に係るＡＣＴ細胞組成物は、ＣＴＬＡ－４－、ＰＤ－１－、ＴＩＧＩＴ－、Ｌａｇ－３＋及びＴｉｍ－３＋で定義されるＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞集団を含む。他の実施形態では、本発明の実施形態に係るＡＣＴ細胞組成物は、ＣＴＬＡ－４－、ＰＤ－１－、及びＴＩＧＩＴ－で定義されるＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞集団を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
幾つかの実施形態では、細胞組成物は、造血器腫瘍細胞に対してＭＨＣ依存的（又はＭＨＣ制限）細胞傷害活性を示す。他の実施形態では、細胞組成物は、造血器腫瘍細胞及び固形腫瘍細胞に対して非ＭＨＣ依存的（又は非ＭＨＣ制限）細胞傷害活性を示す。他の実施形態では、細胞傷害活性はグランザイムＢ及び／又はパーフォリンによって媒介される。他の実施形態では、細胞傷害活性はＦＡＳ－ＦａｓＬ相互作用によって実質的に媒介されない。他の実施形態では、細胞組成物は、ＭＨＣ依存的細胞傷害活性と非ＭＨＣ依存的細胞傷害活性の両方を有する。
他の実施形態では、組成物は、インビトロで造血器腫瘍細胞と０．２５：１の比率で２４時間インキュベートした場合に、有意に造血器腫瘍細胞を特異的に根絶することができる。他の実施形態では、組成物は造血器腫瘍細胞を特異的に根絶することができ、組成物細胞と腫瘍細胞の比率を１：１としてインビトロで２４時間インキュベートすると腫瘍細胞の８０～９０％が根絶する。他の実施形態では、腫瘍細胞は少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する。他の実施形態では、腫瘍細胞は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６、及びＵＬＢＰ３から成る群から選択される複数のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する。
他の実施形態では、組成物は、ＧＶＨＤを実質的に誘発せずに、インビボで非組織適合性腫瘍細胞を特異的に根絶することができる。他の実施形態では、組成物は、ＧＶＨＤを実質的に誘発せずに、インビボで非組織適合性対象における腫瘍発生を阻害又は防止することができる。
他の実施形態では、組成物は、凍結保存及びその後の解凍プロトコルの後、少なくとも７０％、典型的には少なくとも８０％の抗腫瘍細胞傷害活性を保持する。
他の実施形態では、本明細書に開示の方法によって組成物を調製する。幾つかの実施形態によれば、細胞組成物は、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下で少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させることを含む方法によって調製し、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを２～４日毎に補充する。他の実施形態では、細胞組成物のインキュベーションは、他のサイトカイン又は抗体の非存在下で行う。
他の実施形態では、細胞組成物を遺伝子改変する。他の実施形態では、ＣＡＲを発現するように細胞組成物を遺伝子改変する。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ４７、ＰＤＬ－１、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１６、ＣＤ２７６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＥＦＦＲｖＩＩＩから成る群から選択される抗原を指向する。特定の実施形態では、組成物の細胞は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲを発現する。他の実施形態では、少なくとも１種のサイトカイン、ケモカイン、又はその受容体を発現するように細胞組成物を遺伝子改変する。他の実施形態では、改変ケモカイン受容体を発現するように細胞組成物を遺伝子改変する。他の実施形態では、改変ケモカイン受容体は、Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含むＣＸＣＲ４受容体である。他の実施形態では、細胞組成物はＩＬ－２、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１を外因的に発現する。特定の実施形態では、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように細胞組成物は改変されている。
他の実施形態では、この方法は、工程ｃで得られる細胞組成物の凍結保存を更に含む。他の実施形態では、方法は、凍結保存した細胞組成物を解凍プロトコルに供する（例えば、それを必要とする対象へ投与する前）ことを更に含む。他の実施形態では、この方法は、工程ｃの後に、凍結保存とその後の解凍プロトコルを更に含み、細胞組成物は、凍結保存前の細胞組成物の抗腫瘍細胞傷害活性特性の少なくとも７０％、典型的には少なくとも８０％を保持する。
他の様相では、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように遺伝子改変された白血球を含む細胞組成物が提供される。他の実施形態では、細胞組成物は、細胞の７０～８０％がＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％がＣＤ５６－細胞であり、最大５％がＣＤ３－細胞であることを特徴とする。他の実施形態によれば、細胞組成物は、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下で少なくとも９日間ＰＢＭＣを増殖させることを含む方法によって調製し、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを２～４日毎に補充する。
幾つかの実施形態では、本明細書に開示の本発明の細胞組成物は、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍の治療に使用するためのものである。一実施形態では、腫瘍は造血器腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。幾つかの実施形態では、腫瘍は、白血病、多発性骨髄腫、前立腺腫瘍又は中皮腫から成る群から選択される。他の実施形態では、腫瘍は少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍細胞は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６、及びＵＬＢＰ３から成る群から選択される複数のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する。他の実施形態では、腫瘍細胞は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６、及びＵＬＢＰ３を発現する。
他の実施形態では、腫瘍は、ＣＸＣＲ６リガンド、ＣＸＣＲ４リガンド、ＣＸＣＲ３リガンド及びＣＸＣＲ２リガンドから成る群から選択される少なくとも１種のケモカインの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＸＣＲ６リガンド、ＣＸＣＲ４リガンド、及びＣＸＣＲ３リガンドから成る群から選択される少なくとも１種のケモカインの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍はＣＸＣＲ６リガンドの発現を特徴とする。特定の実施形態では、腫瘍はＣＸＣＲ６リガンドであるＣＸＣＬ１６の発現を特徴とする。
他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１種の抑制性免疫チェックポイント分子及び／又はそのリガンドの発現を特徴とする。幾つかの実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３及びそれらの組み合わせの内の少なくとも１種のリガンドを発現することがあり、各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＴＩＧＩＴから成る群から選択される抑制性免疫チェックポイント分子の少なくとも１種のリガンドの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＴＩＧＩＴから成る群から選択される複数の抑制性免疫チェックポイント分子のリガンドの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１種のＣＴＬＡ－４リガンド（例えば、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６）の発現を特徴とする。
他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤による治療に対して抵抗性である。幾つかの実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３及びそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１種のチェックポイント分子の阻害剤による治療に対して抵抗性となり得るが、各々の可能性は本発明の別の実施形態を表す。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＴＩＧＩＴから成る群から選択される少なくとも１種のチェックポイント分子の阻害剤による治療に対して抵抗性である。他の実施形態では、腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＴＩＧＩＴの阻害剤による治療に対して抵抗性である。
例えば、本発明の細胞組成物は、ＣＴＬＡ－４の実質的な発現を欠いていることが本明細書で示されており、従って、唯一の治療剤としてのＣＴＬＡ－４遮断抗体（例えば、イピリムマブ及び／又はトレメリムマブ）による治療に対して抵抗性の腫瘍の治療に特に有利となり得る。従って、他の実施形態では、対象はチェックポイント分子阻害剤による治療レジメンを受けていない。
他の例では、本発明の細胞組成物は、Ｔｉｍ－３及び／又はＬａｇ－３を発現する腫瘍の治療に使用することができ、例えば、それぞれＴｉｍ－３阻害剤及び／又はＬａｇ－３阻害剤を用いた併用療法に使用することができる。従って、他の実施形態では、対象は、例えば、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３又はそれらの組み合わせに対する少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤による治療レジメンを受けているが、各々の可能性が本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態では、上述の使用は、例えば、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３又はそれらの組み合わせに対する少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤の投与を更に含み、各々の可能性が本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態では、この使用は、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３又はそれらの組み合わせに対する少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤の投与を更に含む。幾つかの実施形態では、本発明に係る細胞組成物の使用によって、既存の抗癌療法、例えば、免疫チェックポイント阻害剤の用量を低下又は最小限にすることができる。
他の様相では、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、本明細書に開示の本発明の治療有効量の細胞組成物に腫瘍細胞を接触させることを含む方法が提供される。
一実施形態では、細胞組成物は、対象に対して自家性、組織適合性同種異系、又は非組織適合性同種異系である。特定の実施形態では、細胞組成物は、対象に対して非組織適合性同種異系である。他の実施形態では、接触をインビボで行う。他の実施形態では、接触をエクスビボで行う。他の実施形態では、腫瘍は造血器腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を特徴とする。他の実施形態では、腫瘍細胞は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６、及びＵＬＢＰ３から成る群から選択される複数のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する。他の実施形態では、腫瘍細胞は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６、及びＵＬＢＰ３を発現する。
本発明の幾つかの実施形態をより十分に説明するために以下の実施例を提示する。しかし、これらの実施例は本発明の広い範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
超活性化キラー（ＳＡＫ）細胞の産生と特徴付け
フィコール・ハイパック密度遠心分離（Ｓｉｇｍａ社製）によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト血液から単離した。ＰＢＭＣをＲＰＭＩ培地（完全培地＋ＭＥＭ ＮＥＡＡ×１及び０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール）に１×１０６個（細胞）／ｍＬの濃度で再懸濁させ、０日目に１０００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製）と３０ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で刺激した。４日目、６日目及び８日目に新鮮な培地＋ｒｈＩＬ－２と抗ＣＤ３を添加して培養を維持した。細胞を少なくとも１１日間増殖させ、様々な時点で回収して更なる分析に備えた。
増殖率を評価するために、回収した細胞をトリパンブルーで染色し、０日目、４日目、６日目、８日目及び１１日目に生細胞の総数をカウントした。結果を図１Ａに示すが、９回の別々の実験から得た平均±標準偏差を示す。図１Ａに示すように、細胞は絶えず増殖し、１１日間の培養後に３０．５５倍の増殖率に達した。
次に、フローサイトメトリーによる免疫表現型分析を以下のように行った。様々な時点で細胞を回収し、洗浄し、様々なモノクローナル抗体で４℃にて３０分間染色し、フローサイトメトリーで分析した。次の抗体、即ち、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４、ＡＰＣ抗ＣＤ８、Ｐｅｒｃｐ抗ＣＤ３、及びＰＥ抗ＣＤ５６（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を使用した。結果を図１Ｂ～１Ｄに示すが、各図には９回の別々の実験から得た平均値±標準偏差を示す。
図１Ｂ～１Ｄに示すように、増殖細胞集団全体におけるＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞とＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の割合（％）は経時的に徐々に上昇したが、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の割合（％）は経時的に低下した。１１日目の様々な亜集団の平均値と割合を表１にまとめる（９回の独立した実験の平均値±ＳＤ）。１１日目の亜集団を表２で更に特徴付ける（全組成物からの各亜集団の％、５回の独立した実験の平均値±ＳＤ）。ＣＤ８＋ＣＤ５６＋／ＣＤ８＋は、総ＣＤ８＋集団の内のＣＤ８＋ＣＤ５６＋のパーセンタイルを表す。
Figure 2024502170000001
Figure 2024502170000002
２５名の個々のドナーから得た試料の包括的分析から、組成物は平均７４．６±１．６％のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞と１２±１％のＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞によって特徴付けられた。更に、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞とＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の比率は少なくとも６：１、典型的には約７～８：１であった。得られた細胞（本明細書では超活性化キラー（ＳＡＫ）細胞と称する）を、以下の実施例で詳述するように更なる分析に供した。
比較として、ＡＣＴ用のＰＢＭＣ由来エフェクター細胞（即ち、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ））を調製するための他の既知のプロトコルも試験した。ＣＩＫの調製では、ＰＢＭＣをＲＰＭＩ培地（完全培地＋ＭＥＭ ＮＥＡＡ×１及び０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール）に１×１０６個（細胞）／ｍＬの濃度で再懸濁させ、０日目に１０００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＦＮ－γ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）で刺激した。１日目に、５０ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と５００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２（Ｒ ａｎｄ Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）を添加した。４日目、６日目及び８日目に新鮮な培地＋５００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を添加して培養を維持した。細胞を少なくとも１１日間増殖させた。１１日目にＣＩＫ細胞を回収し、更なるアッセイに備えた。上で詳述したように、ＳＡＫ細胞も同時に増殖させた。１１日目のＣＩＫ集団の特徴付けを表３に示す。
Figure 2024502170000003
表１～３から分かるように、ＳＡＫ細胞は、増殖１１日目では表現型がＣＩＫ細胞とは異なっており、ＳＡＫ細胞組成物では、ＣＩＫ細胞組成物に比べて全ＣＤ８＋細胞の内のＣＤ８＋ＣＤ５６＋細胞の割合が有意に高く、ＣＩＫ細胞組成物に比べてＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の割合が有意に低い。
更に、ＡＣＴを目的とするＣＩＫ細胞は、更なる亜集団の相対的割合（例えば、ＣＤ３－細胞とＣＤ５６＋細胞の発生率（これはＣＩＫ細胞においてより高い）が挙げられるが、これに限定されない）によって本明細書に記載のＳＡＫ細胞と更に区別される。ＣＩＫ細胞組成物は通常、２１日間の増殖後に、上述のＣＩＫプロトコルに本質的に相当する方法によって癌患者に投与する。このような組成物は、典型的には平均含量が少なくとも３０％のＣＤ５６＋細胞、より典型的には最大約５０％～８０％のＣＤ５６＋細胞を特徴とし、平均含量が少なくとも５％、より典型的には最大約１０％～７０％のＣＤ３－細胞を特徴とする。例えば、これまでに報告された様々な例示的ＣＩＫ組成物は、２１日目において、４０～８０％のＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞、２０～６０％のＣＤ３＋ＣＤ５６－細胞、及び１～１０％のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞；３５％のＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞、６５％のＣＤ３＋ＣＤ５６－細胞、及び２．２３％のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞（平均値、９０％の総ＣＤ３＋細胞）；又は３１．６％のＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞、４１．５％のＣＤ３＋ＣＤ５６－細胞、及び１１．７％のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞（中央値）を含むことを特徴としていた。
ＳＡＫ細胞の抗腫瘍細胞傷害活性
様々な腫瘍細胞（本明細書では標的細胞とも称される）に対するエフェクター細胞（ＳＡＫ）の影響を評価するために、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）ベースのアッセイを用いて細胞障害性アッセイを行った。ＳＡＫ細胞を培養１１日目に回収した。標的細胞を製造業者の指示に従ってＣＦＳＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で標識し、９６ウェルプレートに２×１０４個（細胞）／ウェルの濃度で播種した。エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比率を０．２５：１、０．５：１、１：１、２：１、５：１、１０：１及び３０：１としてエフェクター細胞を標的細胞に添加した。２４時間後、ＣＦＳＥ＋ＰＩ－で標識した標的細胞をフローサイトメトリーによって分析した。生細胞のパーセンタイルは、（エフェクター細胞を含むＣＦＳＥ＋ＰＩ－細胞の数／エフェクター細胞を含まないＣＦＳＥ＋ＰＩ－細胞の数）×１００で計算した。
ＴＨＰ－１白血病細胞とＲＰＭＩ８２６６多発性骨髄腫細胞を用いて得られた結果をそれぞれ図２Ａ～２Ｂに示すが、各比率における３回の平均値±標準偏差を示す。図２Ａ～２Ｂに示すように、ＳＡＫ細胞は、０．２５：１という低いＥ：Ｔ比率であっても、両方の型の造血器腫瘍細胞株、ＴＨＰ－１及びＲＰＭＩ８２６６に対して強力な細胞傷害活性を示した。Ｅ：Ｔ比率を２：１として使用した場合、ＳＡＫ細胞は約９０％の顕著な死滅効率を示し、抗腫瘍細胞療法としてのＳＡＫ細胞の効力が示された。
ＰＣ３前立腺癌細胞やＨ２８中皮腫癌細胞等の様々な固形腫瘍細胞株について実験を繰り返し、造血ＭＶ４－１１白血病細胞と比較した。結果を図３Ａ～３Ｃに示すが、各比率における３回の平均値±標準偏差を示す。図３Ａ～３Ｃに示すように、ＳＡＫ細胞は、造血ＭＶ４－１１細胞と両方の固形腫瘍細胞株に対して顕著な効力を示した。Ｅ：Ｔ比を上げると、全ての癌細胞株、特にＭＶ４－１１白血病細胞に対するＳＡＫ細胞の有効性が高まった。例えば、ＭＶ４－１１細胞に対して９０％の効率を得るには２：１のＥ：Ｔ比率が必要である一方、ＰＣ３前立腺癌細胞とＨ２８中皮腫癌細胞に対して９０％の効率を得るには３０：１のＥ：Ｔ比率が必要であった。
次に、フローサイトメトリーを用いてＳＡＫ細胞組成物をＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞とＣＤ３＋ＣＤ５６－細胞に分離し、各集団の細胞傷害活性を元のＳＡＫ細胞組成物の細胞傷害活性と比較した。この目的のため、上で詳述したように、各集団を様々なＥ：Ｔ比率（０．２５：１、０．５：１、１：１及び２：１）でＭＶ４－１１細胞とインキュベートした。注目すべきことに、試験した集団の細胞障害能力と完全なＳＡＫ組成物の細胞障害能力との間には、試験したＥ：Ｔ比率のいずれにおいても有意差は見出されなかった。更に、増殖１０日目と１２日目に回収したＳＡＫ細胞組成物を用いて同様の結果が得られた。
従って、ＳＡＫ細胞は、ＭＨＣＩＩ非依存的に様々な腫瘍細胞に対して強力な抗腫瘍細胞傷害活性を示した。更に、細胞傷害活性はＣＤ５６非依存的のように思われる。
ＳＡＫ細胞は、他のＰＢＭＣ由来エフェクター細胞と比較して、有意に向上した抗腫瘍細胞傷害活性を示す
ＳＡＫ細胞が優れた抗腫瘍活性を発揮するという発見の後、ＳＡＫ細胞の細胞傷害活性を他の２種のＰＢＭＣ由来エフェクター細胞、即ち、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ）及び活性化リンパ球組成物（ＩＬ－２増殖Ｔ細胞）と比較した。
ＣＩＫを調製するため、ＰＢＭＣをＲＰＭＩ培地（完全培地＋ＭＥＭ ＮＥＡＡ×１及び０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール）に１×１０６個（細胞）／ｍＬの濃度で再懸濁させ、０日目に１０００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＦＮ－γ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）で刺激した。５０ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と５００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２（Ｒ ａｎｄ Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）を１日目に添加した。４日目、６日目及び８日目に新鮮な培地＋５００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を添加して培養を維持した。細胞を少なくとも１１日間増殖させた。１１日目にＣＩＫ細胞を回収して更なるアッセイに備えた。０日目にＰＢＭＣを５０ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３及び３００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２とインキュベートし、３００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含む新鮮な培地を更に添加した後、ＩＬ－２増殖Ｔ細胞培養物を得た。
未処理のＭＶ４－１１細胞を対照として設定した場合、エフェクター細胞としてＳＡＫ、ＣＩＫ又はＩＬ－２増殖Ｔ細胞を使用し、標的細胞としてＭＶ４－１１白血病細胞を使用して、ＣＦＳＥベースの細胞障害性アッセイを基本的には実施例２に記載のように行った。結果を図４Ａ～４Ｂに示すが、各比率における３回の平均値±標準偏差を示す。
予想外にも、図４Ａ～４Ｂに示すように、ＳＡＫ細胞は、対照エフェクター細胞よりも腫瘍細胞の根絶において有意に有効であることが分かった。ＣＩＫ細胞と比較した場合（図４Ａ）、ＳＡＫ細胞が有意な細胞傷害活性を示すのに必要なＥ：Ｔ比率は低く、ＳＡＫ細胞は、試験した各Ｅ：Ｔ比率で優れた細胞傷害活性を示した。例えば、Ｅ：Ｔ比率が５：１の場合、ＳＡＫ細胞は９０％の効率を示したが、同じ比率でＣＩＫ細胞の効率は僅かに４０％であった（図４Ａ）。ＳＡＫ細胞は、ＩＬ－２増殖Ｔ細胞と比較して更に有効であることが分かった。例えば、Ｅ：Ｔ比率が０．２５：１であっても、ＳＡＫ細胞は６０％の効率を示したが、同じ比率においてＩＬ－２増殖Ｔ細胞は全く有効ではなかった。また、Ｅ：Ｔ比率が２：１であっても、ＳＡＫ細胞は９０％以上の死滅活性を示す一方、ＩＬ－２増殖Ｔ細胞の活性は２５％に過ぎなかった（図４Ｂ）。
従って、ＳＡＫ細胞は、従来既知のＰＢＭＣ由来のエフェクター細胞と比較して、非常に効率的な抗腫瘍細胞傷害活性を発揮することが予想外に見出された。
ＳＡＫ細胞と腫瘍細胞の免疫表現型の特徴付け
ＣＤ８＋ＳＡＫ細胞でのＮＫＧ２Ｄの発現を次のように評価した。実施例１に記載のように調製したＳＡＫ細胞を増殖１１日目に回収し、洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ＮＫＧ２ＤとＡＰＣ標識抗ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で４℃にて３０分間染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ８＋細胞上の抗体による染色を検出し、アイソタイプ抗体対照染色と比較した。
結果を図５に示す。図５に示すように、ＣＤ８＋ＳＡＫ細胞はＮＫＧ２Ｄを高度に発現する。注目すべきことに、ＣＤ８＋細胞の１００％がＮＫＧ２Ｄを発現することが判明し、アイソタイプ対照と比較して平均蛍光強度が８．４倍増加した。
ＳＡＫ細胞はＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を示したので、フローサイトメトリーを用いて様々な種類の腫瘍細胞で各種ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を試験した。結果を以下の表４にまとめる。
Figure 2024502170000004
表４に示すように、ＭＶ４１１白血病細胞は、ＵＬＢＰ３、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６、及びＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ等の様々なＮＫＧ２Ｄリガンドをその表面に高度に発現する。これに対し、Ｈ２８中皮腫細胞は、これらのマーカーを有意に低く、即ち、非有意なレベルで発現する（例えば、ＵＬＢＰ２５６）か、又は検出不可能なレベルで発現する（例えば、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）。
従って、ＳＡＫ細胞はＮＫＧ２Ｄの高発現を特徴とし、ＭＶ４－１１白血病細胞等のＮＫＧ２Ｄリガンドの高発現を特徴とする標的腫瘍細胞に対して特に有効であることが分かった。
ＳＡＫの細胞傷害活性は、ＦａｓＬ－Ｆａｓ相互作用ではなく、主にグランザイムＢとパーフォリンの分泌によって媒介される
ＳＡＫ細胞の死滅機序を調べるため、基本的には実施例４に記載のように、ＣＤ８＋ＳＡＫ細胞でのＦＡＳＬ、グランザイムＢ及びパーフォリンの発現レベルを調べた。即ち、ＳＡＫ細胞を増殖１１日目に回収し、洗浄し、ＰＥ抗ＦａｓＬ ＡＰＣ抗パーフォリン抗体又はＰＥ抗グランザイムモノクローナル抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で４℃にて３０分間染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ８＋細胞上の抗体による染色を検出し、アイソタイプ抗体対照染色と比較した。
図６Ａ～６Ｃに示す結果は、ＣＤ８＋細胞傷害性細胞集団によるＦａｓＬ、グランザイムＢ及びパーフォリンの高発現を実証する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表される、マーカー特異的抗体で染色したＣＤ８＋細胞での発現レベルをアイソタイプ対照抗体の発現レベルと比較したものを以下の表５にまとめる。表５に示すように、ＣＤ８＋細胞の４０％がＦａｓＬ陽性であり、５０％がパーフォリン陽性であり、１００％がグランザイムＢを発現する。
Figure 2024502170000005
次に、標的誘導パーフォリン分泌を次のように調べた。５×１０３個のＳＡＫ細胞（１１日目）をＭＶ４－１１細胞に０．２５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で２４時間添加した。２４時間後、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Ａｂｃａｍ社製）を使用して培地上清中のパーフォリンの濃度を調べた。図７に示すように、標的ＭＶ４－１１腫瘍細胞とのインキュベーション後にパーフォリン分泌レベルが上昇した。
死滅機序を更に特徴付けるため、様々な阻害剤の存在下、基本的には実施例２に記載のようにＣＦＳＥベースの細胞障害性アッセイを行った。この目的のため、試験した阻害剤の有無に関わらず、白血病ＭＶ４－１１細胞をＳＡＫ細胞と共に培養し、未処理のＭＶ４－１１細胞を対照として設定した。次の阻害剤、即ち、３，４－ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ：グランザイムＢ阻害剤、Ｓｉｇｍａ社製）、コンカナマイシンＡ（ＣＭＡ：パーフォリン阻害剤、Ｓｉｇｍａ社製）及び抗ＦａｓＬ遮断抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を使用した。標的細胞とのインキュベーションの２時間前に、５０μＭのＤＣＩ、１０００ｍＭのＣＭＡ又は５μｇ／ｍＬの抗ＦａｓＬをＳＡＫ細胞に添加した。白血病ＭＶ４－１１標的細胞に対するＳＡＫの細胞傷害活性を、（エフェクター細胞の存在下でのＣＦＳＥ＋ＰＩ－細胞の数／エフェクター細胞の非存在下でのＣＦＳＥ＋ＰＩ－細胞の数）×１００によって計算される生細胞の割合で表した。
結果を図８Ａ～８Ｃに示すが、各比率における３回の平均±標準偏差を示す。図に示すように、グランザイムＢ阻害剤とパーフォリン阻害剤はＳＡＫ細胞の細胞傷害活性を有意に低下させたが（それぞれ図８Ａと８Ｃ）、抗ＦａｓＬ抗体とのインキュベーションは生細胞の割合の減少に殆ど又は全く影響を及ぼさなかった（図８Ｂ）。
従って、特定の理論又は作用機序に束縛されたくはないが、ＳＡＫ細胞は、ＦａｓＬ－Ｆａｓ相互作用よりもグランザイムＢ及びパーフォリン分泌に主に依存する抗腫瘍細胞傷害活性を示すと思われる。
ＳＡＫ遊走能力の特徴付け
ＳＡＫ細胞集団を更に特徴付けるために、次のようにフローサイトメトリーによってケモカイン受容体発現の分析を行った。細胞を様々な時点で回収し、洗浄し、ＡＰＣ抗ＣＸＣＲ４（１２Ｇ５クローン）、ＡＰＣ抗ＣＸＣＲ３、ＰＥ抗ＣＸＣＲ６又はＦＩＴＣ抗ＣＸＣＲ２モノクローナル抗体、更にはＦＩＴＣ又はＡＰＣ（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）でそれぞれ標識した抗ＣＤ８抗体で４℃にて３０分間染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
図９Ａに示す結果から、増殖１１日目のＳＡＫ細胞でのケモカイン受容体ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３（上部パネル、それぞれ左と右）、ＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ６（下部パネル、それぞれ左と右）の発現が分かる。特に、実質的に全てのＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞はＣＸＣＲ４の表面発現を特徴とすることが分かり、残りのケモカイン受容体は平均してＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約９０％（ＣＸＣＲ２とＣＸＣＲ３）又は約３０％（ＣＸＣＲ６）で見出された。
ＳＡＫ細胞上のケモカイン受容体の機能を試験するために遊走アッセイを行った。この目的のため、ケモカインＣＸＣＬ１２、ＩＰ－１０又はｒｈＩＬ－８（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ＥＣ社製）に応答したＳＡＫ細胞の遊走を、孔径５μｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｓｔａｒ社製）を用いて評価した。１％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ培地にＳＡＫ細胞を再懸濁させた。細胞（２×１０５個／ウェル）を総量１００μＬで上部チャンバに添加し、１００ｎｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２又はＩＬ－８、又は５００ｎｇ／ｍＬのＩＰ－１０を補充した６００μＬのＲＰＭＩを下部チャンバに添加した。４時間以内に下部コンパートメントに遊走する細胞の量をＦＡＣＳによって求め、上部チャンバに流入した細胞の割合で表した。
図９Ｂに示す結果から、ＳＡＫ細胞がケモカインＩＬ－８、ＳＤＦ－１及びＩＰ－１０に向かって遊走することが分かる。特に、試験した濃度では細胞の３％がＩＬ－８に向かって遊走したが、細胞の約４０％はＳＤＦ－１に向かって遊走し、約３０％はＩＰ－１０に向かって遊走した。従って、ＳＡＫ集団では、ＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ３依存的な遊走がＣＸＣＲ２依存的な遊走よりも顕著であると思われる。ＳＡＫ細胞でのＣＸＣＲ３とＣＸＣＲ６の発現は、ＳＡＫ細胞がＣＸＣＲ３リガンドＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１１と、ＣＸＣＲ６リガンドＣＸＣＬ１６に向かって遊走する可能性があることも示す。
要約すると、この結果は、ＳＡＫ細胞が腫瘍組織、特にＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６及びＣＸＣＲ６リガンドを発現する腫瘍に動員される能力を示す。更に興味深いのは、ＣＸＣＲ６等の特定のケモカイン受容体が腫瘍微小環境での細胞傷害性Ｔ細胞の生存と増殖に特に重要であることが示唆され、それによってＴ細胞の消耗が抑制されるという所見である。従って、特定の理論又は作用機序に束縛されたくはないが、ＳＡＫ細胞でのＣＸＣＲ６の発現は、表現型の活性化、及び腫瘍微小環境での生存及び増殖の可能性の向上を示すことがある。
インビボでの養子移植
異種移植モデルを産生するために、ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を欠く免疫不全マウス）を３００ｃＧｙで照射した。２４時間後、ＲＡＪＩ細胞（ヒトＢリンパ芽球様株）を最終体積２００μＬで背側尾静脈を介して静脈内（ｉｖ）注射した（１×１０５個（細胞）／マウス）。
次に、マウスに２０×１０６個のＳＡＫ細胞を静脈内（ｉｖ）注射し、５日目、６日目及び７日目に１０μｇのＩＬ－２を腹腔内（ｉｐ）注射した。対照マウスにはＰＢＳを静脈内（ｉｖ）注射し、１０μｇのＩＬ－２を腹腔内（ｉｐ）注射した。マウスを１２日目に屠殺し、分析用に骨髄（ＢＭ）と脾臓を採取した。これらの器官から細胞を単離し、抗ヒトＣＤ２０抗体（生着した腫瘍細胞を特異的に認識する）で染色し、ＢＭと脾臓における生着細胞の割合をＦＡＣＳによって評価した。結果を下の表６に示す。阻害％は１００－（ＳＡＫマウスのＣＤ２０／対照マウスのＣＤ２０×１００）で計算した。
Figure 2024502170000006
表６に示すように、ＳＡＫ細胞の養子移植は、骨髄と脾臓におけるＲａｊｉ細胞の生着を有意に阻害し、特に顕著な有効性によって脾臓における腫瘍発生の約７８％阻害をもたらした。
上で詳述したように実験を繰り返したが、ＢＭ細胞及び脾臓細胞と共に、屠殺したＮＳＧマウスから採取した血液を抗ヒトＣＤ１９抗体で染色した。結果を以下の表７に示すが、阻害％は１００－（ＳＡＫマウスのＣＤ１９／対照マウスのＣＤ１９×１００）で計算した。図１０Ａ～１０Ｃで可視化したが、ＳＡＫ細胞を脾臓（図１０Ａ）、ＢＭ（図１０Ｂ）及び血液（図１０Ｃ）に移植した後のＮＳＧマウスに対する対照ＮＳＧマウスにおけるＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞の割合を示す。
Figure 2024502170000007
表７に示すように、ＳＡＫ細胞の養子移植によって、骨髄、血液及び脾臓におけるＲａｊｉ細胞の生着が有意に阻害され、脾臓における腫瘍発生の約９７％阻害をもたらす顕著な有効性が得られた。これらの知見から、ＳＡＫ細胞のみが腫瘍の増殖と生着を有効に阻害できることが分かる。
遺伝子改変ＳＡＫ
改良された遺伝子改変ＳＡＫ細胞を以下に記載のように調製した。
核酸構築物の産生には、レトロウイルスＭＳＧＶ－１Ｄ３－２８Ｚ Ａｌｌ ＩＴＡＭインタクト発現ベクター（＃１０７２２６、Ａｄｄｇｅｎｅ社製）を以下の改変を加えて使用した。レトロウイルスベクター骨格であるｐＭＳＧＶ１は、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）の末端反復配列を使用するＭＳＣＶベースのスプライスＧＡＧベクター（ｐＭＳＧＶ）の誘導体である。制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｌＩを使用して、プラスミドから「１Ｄ３－２８Ｚ Ａｌｌ ＩＴＡＭインタクト」インサートを除去した。以下に詳述のような様々なｃＤＮＡインサートをＰＣＲによって増幅し、ＮｃｏＩ及びＳａｌＩ制限部位を有するプラスミドに連結した。得られた構築物Ａ～Ｄ（以下の表８に詳述）をＤＮＡ配列決定によって確認した。
Figure 2024502170000008
抗ヒトＣＤ１２３ＣＡＲ（構築物Ａに含まれる）をコードする核酸配列は次の通りである。
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＣＣＧＡＴＡＴＴＧＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＡＴＣＧＣＣＧＧＡＣＴＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣＣＣＴＣＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＡＡＴＴＧＣＣＧＧＧＣＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＣＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＴＴＧＡＧＴＣＧＧＧＴＧＴＧＣＣＧＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＴＣＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＡＡＣＧＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＴＡＣＴＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＧＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＡＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＧＧＡＧＣＧＴＣＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＡＧＧＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＴＡＣＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣＧＴＡＣＴＣＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＡＡＡＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＡＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡＣＴＴＡＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＧＡＧＣＧＧＡＧＧＣＴＡＣＧＡＣＣＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＣＡＣＴＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＴＡＡ（配列番号１）。
ＩＲＥＳ核酸配列（構築物Ａ及びＢに含まれる）は次の通りである。
ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＧＴＴＧＴＡＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＣＧＴＧＧＣＧＧＣＴＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧＴＡＴＴＧＣＧＧＴＡＣＣＣＴＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴＡＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＧＴＡＡＣＴＴＡＧＡＣＧＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＴＡＧＡＡＧＧＧＧＧＴＡＣＡＡＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＡＴＡＧＡＣＴＧＣＴＴＧＣＧＴＧＧＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＴＡＴＧＴＡＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＴＣＧＧＡＡＴＣＴＴＣＧＡＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＡＧＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＡＴＣＣＣＴＣＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＧＴＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＣＣＴＡＴＧＧＣＴＡＡＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＧＴＴＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＴＧＡＡＧＡＧＣＣＴＡＴＴＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＡＧＡＡＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＡＡＴＣＣＣＡＡＣＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＣＡＧＴＧＡＴＴＧＧＣＣＴＧＴＣＧＴＡＡＣＧＣＧＣＡＡＧＴＣＣＧＴＧＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＧＴＧＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣＡＴＡＡＡＧＣＧＡＡＴＴＧＧＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号２）。
ヒトＩＬ－２（受入番号ＢＣ０６６２５７、構築物Ａ及びＢに含まれる）の核酸配列は次の通りである。
ＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＴＴＧＡ（配列番号３）。
ヒトＩＬ－１５（受入番号ＢＣ１００９６１．１、構築物Ｃに含まれる）の核酸配列は以下の通りである。
ＡＴＧＡＧＡＡＴＴＴＣＧＡＡＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＣＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＡＣＴＴＣＴＡＡＡＣＡＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡＡＧＴＧＡＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＣＴＡＴＧＣＡＴＡＴＴＧＡＴＧＣＴＡＣＴＴＴＡＴＡＴＡＣＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＴＣＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＧＴＡＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＣＴＴＧＧＡＧＴＴＡＣＡＡＧＴＴＡＴＴＴＣＡＣＴＴＧＡＧＴＣＣＧＧＡＧＡＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＣＡＴＧＡＴＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＡＴＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＡＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＡＡＴＧＧＧＡＡＴＧＴＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＧＴＴＴＴＧＴＡＣＡＴＡＴＴＧＴＣＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＴ（配列番号４）。
２Ａ要素（構築物Ｃに含まれる）の核酸配列は次の通りである。
ＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＧＴＣＴＡＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＣＣＣＡ（配列番号５）。
ＧＦＰ（構築物Ｂ及びＣに含まれる）の核酸配列は次の通りである。
ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡ（配列番号６）。
野生型ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体は次のアミノ酸配列を有する。
ＭＳＩＰＬＰＬＬＱＩＹＴＳＤＮＹＴＥＥＭＧＳＧＤＹＤＳＭＫＥＰＣＦＲＥＥＮＡＮＦＮＫＩＦＬＰＴＩＹＳＩＩＦＬＴＧＩＶＧＮＧＬＶＩＬＶＭＧＹＱＫＫＬＲＳＭＴＤＫＹＲＬＨＬＳＶＡＤＬＬＦＶＩＴＬＰＦＷＡＶＤＡＶＡＮＷＹＦＧＮＦＬＣＫＡＶＨＶＩＹＴＶＮＬＹＳＳＶＬＩＬＡＦＩＳＬＤＲＹＬＡＩＶＨＡＴＮＳＱＲＰＲＫＬＬＡＥＫＶＶＹＶＧＶＷＩＰＡＬＬＬＴＩＰＤＦＩＦＡＮＶＳＥＡＤＤＲＹＩＣＤＲＦＹＰＮＤＬＷＶＶＶＦＱＦＱＨＩＭＶＧＬＩＬＰＧＩＶＩＬＳＣＹＣＩＩＩＳＫＬＳＨＳＫＧＨＱＫＲＫＡＬＫＴＴＶＩＬＩＬＡＦＦＡＣＷＬＰＹＹＩＧＩＳＩＤＳＦＩＬＬＥＩＩＫＱＧＣＥＦＥＮＴＶＨＫＷＩＳＩＴＥＡＬＡＦＦＨＣＣＬＮＰＩＬＹＡＦＬＧＡＫＦＫＴＳＡＱＨＡＬＴＳＶＳＲＧＳＳＬＫＩＬＳＫＧＫＲＧＧＨＳＳＶＳＴＥＳＥＳＳＳＦＨＳＳ（配列番号７）。改変Ｃ’切断ＣＸＣＲ４（配列番号７の１９個のＣ末端アミノ酸が除去されているＷＨＩＭ Ｒ３３４ｘ変異、ＮＭ＿００１００８５４０．２、構築物Ｄに含まれる）をコードする核酸配列は次の核酸配列を有する。
ＡＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＴＧＣＣＴＣＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＴＡＴＧＡＣＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＣＴＡＡＴＴＴＣＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＡＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＧＧＴＴＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＧＡＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＣＡＴＣＡＣＧＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＴＧＧＧＡＡＣＴＴＣＣＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＴＣＡＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＴＣＴＡＴＧＴＴＧＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＣＣＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＧＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＡＴＴＧＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧＣＡＴＴＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＴＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＴＧＧＣＴＧＣＣＴＴＡＣＴＡＣＡＴＴＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＣＧＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣＡＣＴＧＴＧＣＡＣＡＡＧＴＧＡＴＴＴＣＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＧＣＡＣＴＣＡＣＣＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＧＡＡＡＧＴＡＡ（配列番号８）。
形質導入用のレトロウイルス粒子を調製するために、ｅｃｏ－ｐｈｏｅｎｉｘ細胞を５×１０５個（細胞）の密度で６ウェルプレートに接種し、感染当日に６０～７０％のコンフルエンスまで到達させた。製造業者のプロトコルに従って、リポフェクタミントランスフェクション試薬を使用し、３７℃、５％ＣＯ２で５時間、レトロウイルスプラスミドＭＳＧＶ（試験した構築物を含む）２μｇ／ウェルをＥｃｏ－ｐｈｏｅｎｉｘ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、レトロウイルス粒子を含む上清を回収し、０．４５μｍフィルター（米国マサチューセッツ州、ビルリカ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過して細胞片を除去した。上清を使用してＰＧ１３細胞を形質導入し、ＰＧ１３ベースのパッケージング細胞株を産生し、改変ＭＳＧＶウイルスを産生した。
ＰＧ１３形質導入は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）によって媒介させた。非組織培養２４ウェルプレートをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（ＰＢＳで１：４０に希釈）でコーティングした。プレートを４℃で一晩コーティングした後、２％ＢＳＡで室温（ＲＴ）にて３０分間ブロックし、使用前にＰＢＳで１回洗浄した。トランスフェクトしたｅｃｏ－ｐｈｏｅｎｉｘ細胞由来のウイルス含有上清を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）コーティングプレートに添加し、２時間遠心分離した。次の工程では、ＰＧ１３細胞をウェルに添加し、ウイルスと共に２４時間インキュベートした。３日後、陽性ＰＧ１３細胞（ＦＡＣＳによって検出）を選択し、増殖させた。
得られたウイルス粒子を使用して、基本的には実施例１に記載のように調製したＳＡＫ細胞を増殖方法中に形質導入した。具体的には、新たに単離したＰＢＭＣを、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３と１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で４８時間刺激した。刺激した後、上述のようにレトロウイルスベクターでプレコートした培養皿に移すことによって、レトロウイルスベクター（上述のようにＰＧ１３細胞によって産生する）を細胞に形質導入した。この目的のために、非組織培養２４ウェルプレートをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）でコーティングし、ウイルス含有上清（ＰＧ１３由来）をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）コーティングプレートに添加し、２時間遠心分離した。次の工程では、刺激した細胞をウェルに添加し、ウイルス粒子と共に２４時間インキュベートした。その後、実施例１に記載のように、３０ｎｇの抗ＣＤ３と１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いて細胞を更に増殖させた。ＡＰＣ抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＤ１２３－Ｆｃ及びＰＥ抗Ｆｃ抗体を使用したＦＡＣＳ、又はＧＦＰ分析によって陽性（構築物含有）細胞を検出及び定量し、対応する外因性遺伝子を発現することを確認した。
同様に、構築物Ａ及びＤを２Ａ配列と共にプラスミド骨格にクローン化し、ＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、改変ＣＸＣＲ４受容体、及びＩＬ－２（抗ＣＤ１２３－ＩＲＥＳ－ＩＬ－２－２Ａ－ＣＸＣＲ４ｗｈｉｍ）を構成的に発現することができる核酸構築物を産生する。結合した構築物を上述のようにＳＡＫ細胞に形質導入する。同様に、構築物ＣＸＣＲ４ｗｈｉｍ－ＩＲＥＳ－ＩＬ－２を産生し、新たに調製したＳＡＫ細胞に形質導入する。
基本的にはそれぞれ実施例２及び７に記載のように、様々な構築物を形質導入した細胞をインビトロ及びインビボでの抗腫瘍活性についてアッセイする。
ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現する遺伝子改変ＳＡＫ細胞の細胞傷害活性
ＣＤ１９ＣＡＲを発現する遺伝子改変ＳＡＫ細胞（ＣＤ１９発現Ｂ細胞悪性腫瘍を認識するように改変）を基本的には実施例８に記載のように調製し、次のように変更した。
ｓｃＦｖ標的ドメイン（ＣＤ１９に特異的）、ＣＤ８由来ヒンジ領域、ＣＤ８由来膜貫通領域、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ鎖細胞内シグナル伝達ドメインを発現するようにベクターを操作した。核酸構築物の産生には、ＣＤ１９ＣＡＲ配列を有するレトロウイルスＭＳＧＶ－１Ｄ３－２８Ｚ Ａｌｌ ＩＴＡＭインタクト発現ベクターを使用した。制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｌＩを使用して、プラスミドから「１Ｄ３－２８Ｚ Ａｌｌ ＩＴＡＭインタクト」インサートを除去した。ＣＤ１９ＣＡＲｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、ＮｃｏＩ及びＳａｌＩ制限部位を有するプラスミドに連結した。得られた構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。
ＣＤ１９ＣＡＲ（センス鎖）をコードする核酸配列は次の通りである。
ｇｃｃａｃｃａｔｇｇｃｔｃｔｇｃｃｃｇｔｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｔｃｃｔｇｃｃａｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｔｃａｃｇｃｃｇｃｔｃｇｃｃｃａｃａａｇｔｃｃａｇｃｔｔｃａａｇａａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇｇｔｃｔｇｇｔｇａａｇｃｃａｔｃｔｇａｇａｃｔｃｔｇｔｃｃｃｔｃａｃｔｔｇｃａｃｃｇｔｇａｇｃｇｇａｇｔｇｔｃｃｃｔｃｃｃａｇａｃｔａｃｇｇａｇｔｇａｇｃｔｇｇａｔｔａｇａｃａｇｃｃｔｃｃｃｇｇａａａｇｇｇａｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｃｇｇａｇｔｇａｔｔｔｇｇｇｇｔａｇｃｇａａａｃｃａｃｔｔａｃｔａｔａａｃｔｃｔｔｃｃｃｔｇａａｇｔｃａｃｇｇｇｔｃａｃｃａｔｔｔｃａａａｇｇａｔａａｃｔｃａａａｇａａｔｃａａｇｔｇａｇｃｃｔｃａａｇｃｔｃｔｃａｔｃａｇｔｃａｃｃｇｃｃｇｃｔｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃｃａａｇｃａｔｔａｃｔａｃｔａｔｇｇａｇｇｇｔｃｃｔａｃｇｃｃａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃｔｃｔｇｇｔｃａｃｔｇｔｇｔｃａｔｃｔｇｇｔｇｇａｇｇａｇｇｔａｇｃｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇａｇｃｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｃｔｃｃｇｇａｇｇｔｇｇｃｇｇａａｇｃｇａａａｔｃｇｔｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｔｇｃａａｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｔｔｃｔｃｃｃｇｇｇｇａａｃｇｇｇｃｔａｃｃｃｔｔｔｃｔｔｇｔｃｇｇｇｃａｔｃａｃａａｇａｔａｔｃｔｃａａａａｔａｃｃｔｃａａｔｔｇｇｔａｔｃａａｃａｇａａｇｃｃｇｇｇａｃａｇｇｃｃｃｃｔａｇｇｃｔｔｃｔｔａｔｃｔａｃｃａｃａｃｃｔｃｔｃｇｃｃｔｇｃａｔａｇｃｇｇｇａｔｔｃｃｃｇｃａｃｇｃｔｔｔａｇｃｇｇｇｔｃｔｇｇａａｇｃｇｇｇａｃｃｇａｃｔａｃａｃｔｃｔｇａｃｃａｔｃｔｃａｔｃｔｃｔｃｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｇｔｃｔａｃｔｔｃｔｇｃｃａｇｃａｇｇｇｔａａｃａｃｃｃｔｇｃｃｇｔａｃａｃｃｔｔｃｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃａａｇｃｔｔｇａｇａｔｃａａａａｃｃａｃｔａｃｔｃｃｃｇｃｔｃｃａａｇｇｃｃａｃｃｃａｃｃｃｃｔｇｃｃｃｃｇａｃｃａｔｃｇｃｃｔｃｔｃａｇｃｃｇｃｔｔｔｃｃｃｔｇｃｇｔｃｃｇｇａｇｇｃａｔｇｔａｇａｃｃｃｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇｇｇｃｃｇｔｇｃａｔａｃｃｃｇｇｇｇｔｃｔｔｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｃｇａｔａｔｃｔａｃａｔｔｔｇｇｇｃｃｃｃｔｃｔｇｇｃｔｇｇｔａｃｔｔｇｃｇｇｇｇｔｃｃｔｇｃｔｇｃｔｔｔｃａｃｔｃｇｔｇａｔｃａｃｔｃｔｔｔａｃｔｇｔａａｇｃｇｃｇｇｔｃｇｇａａｇａａｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｃｔｔｔａａｇｃａａｃｃｃｔｔｃａｔｇａｇｇｃｃｔｇｔｇｃａｇａｃｔａｃｔｃａａｇａｇｇａｇｇａｃｇｇｃｔｇｔｔｃａｔｇｃｃｇｇｔｔｃｃｃａｇａｇｇａｇｇａｇｇａａｇｇｃｇｇｃｔｇｃｇａａｃｔｇｃｇｃｇｔｇａａａｔｔｃａｇｃｃｇｃａｇｃｇｃａｇａｔｇｃｔｃｃａｇｃｃｔａｃａａｇｃａｇｇｇｇｃａｇａａｃｃａｇｃｔｃｔａｃａａｃｇａａｃｔｃａａｔｃｔｔｇｇｔｃｇｇａｇａｇａｇｇａｇｔａｃｇａｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａａｇｃｇｇａｇａｇｇａｃｇｇｇａｃｃｃａｇａａａｔｇｇｇｃｇｇｇａａｇｃｃｇｃｇｃａｇａａａｇａａｔｃｃｃｃａａｇａｇｇｇｃｃｔｇｔａｃａａｃｇａｇｃｔｃｃａａａａｇｇａｔａａｇａｔｇｇｃａｇａａｇｃｃｔａｔａｇｃｇａｇａｔｔｇｇｔａｔｇａａａｇｇｇｇａａｃｇｃａｇａａｇａｇｇｃａａａｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇａｃｔｇｔａｃｃａｇｇｇａｃｔｃａｇｃａｃｃｇｃｃａｃｃａａｇｇａｃａｃｃｔａｔｇａｃｇｃｔｃｔｔｃａｃａｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｇｃｃｔｃｇｇ（配列番号９）。
形質導入用のレトロウイルス粒子の調製は、実施例８に記載のように行った。陽性（構築物含有）細胞の検出及び定量化は、ＣＤ１９－ＦｃとＰＥ抗Ｆｃ抗体を使用したＦＡＣＳ分析によって行い、ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子を発現することを確認した。
ＣＤ１９陽性細胞（Ｔｏｌｅｄｏ）とＣＤ１９陰性細胞（Ｕ９３７）に対するＣＤ１９ＣＡＲ ＳＡＫ細胞の細胞傷害活性を対照ＳＡＫ細胞と比較して測定した。ＣＦＳＥベースの細胞傷害性アッセイは、エフェクター細胞としてＳＡＫ及びＣＤ１９ＣＡＲ ＳＡＫ細胞を使用し、標的細胞としてＴｏｌｅｄｏ及びＵ９３７細胞を使用して、基本的には実施例２に記載のように行った。ＣＤ１９＋（Ｔｏｌｅｄｏ）細胞とＣＤ１９－（Ｕ９３７）細胞についての結果をそれぞれ図１１Ａと１１Ｂに示すが、各比率における３回の平均±標準偏差を示す。
図１１Ａに示すように、ＣＤ１９ＣＡＲ ＳＡＫ細胞は、対照ＳＡＫ細胞よりもＴｏｌｅｄｏ細胞（ＣＤ１９陽性細胞）を根絶する上で有意に有効であることが分かった。
ＣＤ１９ＣＡＲ ＳＡＫ細胞は、試験した各々のＥ：Ｔ比率において優れた細胞傷害活性を示した。例えば、Ｅ：Ｔ比率が１：１の場合、ＣＤ１９ＣＡＲ ＳＡＫ細胞は９３％の効率を示したが、同じ比率における対照ＳＡＫ細胞の効率は５４％に過ぎなかった。これに対し、Ｕ９３７細胞に対するＣＤ１９ＣＡＲ ＳＡＫと対照ＳＡＫの細胞傷害活性は同一であり、これは、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞の活性の増強がＣＤ１９発現腫瘍細胞に特異的であることを意味する。
これらの結果から、ＣＡＲ ＳＡＫが従来のＣＡＲ Ｔ細胞の有効な代替物となり得ること、特に従来のＣＡＲ Ｔ細胞では治療効果が乏しい固形腫瘍に対して有効となり得ることが分かる。
インビボのアロ反応性
ＳＡＫ細胞が移植片対宿主（ＧＶＨ）反応と移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を誘発する可能性を特徴付けるため、ＮＳＧマウスにＳＡＫ細胞又はＰＢＭＣを注射し、ＧＶＨＤの発症を１ヶ月間モニターした。この目的のため、先ずＮＳＧマウスを３００ｃＧｙで照射した。２４時間後、ＳＡＫ細胞又はＰＢＭＣ（ヒト血液から精製）を最終体積２００μＬで背側尾静脈を介して静脈内（ｉｖ）注射した（マウス１匹当たり５×１０６個の細胞）。急性ＧＶＨＤ臨床スコアを週に３回計算した。次の４種のパラメータ（姿勢、活動性、毛皮の質感、及び皮膚の完全性）の各々を０（存在しない場合）又は２（存在する場合）でスコア化した。マウス体重も週に３回測定した。結果を図１２Ａ～１２Ｃに示す。
注射後約１５日で、ＰＢＭＣを投与したマウスはＧＶＨＤの臨床徴候を示し始めた（図１２Ｃ）。マウスは毛づくろいがされていないため、汚らしく見えた。体重も減り始めた。ＰＢＭＣで処理した全てのマウスは重度の急性ＧＶＨＤを発症し、１７日以内に死亡した（図１２Ａ）。対照的に、ＳＡＫ細胞で処理したマウスではＧＶＨＤの徴候が最小限に抑えられ、全てのマウスが生存した。これらのマウスは、ＰＢＭＣ群と比較して体重減少が軽度であった（図１２Ｂ）。
これらの結果は、組織適合性のない対象の治療を含め、臨床における同種異系使用へのＳＡＫ細胞の適合性を示すと共に、ＳＡＫ細胞が既存の養子細胞移植治療プロトコルに対する有効な改善となり得ることを示す。
凍結保存したＳＡＫ細胞の細胞障害性の評価
ＳＡＫ細胞を市販の治療製品として使用するには、その産生及び凍結方法を臨床使用前に有利に評価する必要がある。解凍したＳＡＫ細胞の細胞傷害活性を評価するため、凍結２４時間後に該細胞を回収し、ＭＶ４１１及びＴＨＰ－１白血病標的細胞と様々な比率で共培養した。
この目的のため、増殖１１日目の新鮮なＳＡＫ細胞（実施例１に記載）を冷凍培地（９０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）＋１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む）中で凍結させ、液体窒素に移して凍結保存させた。得られた凍結保存ＳＡＫ細胞を解凍２４時間後に細胞障害性アッセイに使用し、１１日目の新鮮なＳＡＫ細胞（凍結とその後の解凍を経ていない）の細胞障害活性と比較した。結果を図１３Ａ～１３Ｂに示す。
図１３Ａ及び１３Ｂに示すように、解凍したＳＡＫは新鮮なＳＡＫと比較して細胞傷害活性が低下したが、これは、凍結融解サイクルがＳＡＫ細胞の生存率及び／又は活性にある程度影響を及ぼし得ることを示す。しかし、凍結保存されたＳＡＫ細胞は、Ｅ：Ｔ比率が低くてもＭＶ４１１（図１３Ｂ）及びＴＨＰ－１（図１３Ａ）細胞に対して有意且つ強力な細胞傷害活性を示し、対応する新鮮なＳＡＫ細胞の細胞傷害活性の少なくとも約７０～８０％を保持した。
従って、この結果から、ＳＡＫ細胞が調製直後だけでなく、凍結保存後も使用できる可能性があることが分かる。更に、細胞組成物は、追加の増殖又は操作の工程を必要とせずに、解凍直後に非常に強力な細胞障害性を示すことが本明細書で実証されている。従って、ＳＡＫ細胞を含む細胞組成物は、貯蔵寿命の長い安定した製品として製造及び流通することができ、これは凍結保存によって容易になる。これは、凍結保存に対して感受性が高いことが報告されているＮＫ細胞等の他の免疫細胞集団に基づく特定の細胞療法とは対照的であり、固形腫瘍の臨床治療における多数の失敗に関連していることが示唆される特性である（Mark et al., Nat Commun 11, 5224 (2020)）。
ＳＡＫ細胞での免疫チェックポイント分子の発現
ＣＤ８＋ＳＡＫ細胞での免疫チェックポイント分子の存在を次のように評価した。実施例１に記載のように調製したＳＡＫ細胞を増殖１１日目に回収し、洗浄し、ＰＥ標識抗Ｔｉｍ－３抗体（図１４上部パネル、左）、ＡＰＣ標識抗ＣＴＬＡ－４抗体（図１４上部パネル、右）、ＡＰＣ標識抗ＰＤ－１抗体（図１４中央パネル、左）、ＡＰＣ標識抗ＴＩＧＩＴ抗体（図１４中央パネル、右）又はＰＥ標識抗Ｌａｇ－３抗体（図１４下部パネル、左）のいずれかで４℃にて３０分間染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＡＰＣ又はＰＥ標識抗ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）とアイソタイプ対照抗体も使用した。抑制性チェックポイント分子Ｔｉｍ－３、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及びＬａｇ－３に加えて、活性化受容体ＤＮＡＭ－１（図１４下部パネル、右）の存在もＳＡＫ細胞上で評価した。
図１４に示すように、注目すべきは、実質的に全てのＣＤ８＋細胞が活性化受容体ＤＮＡＭ－１を発現することが分かった。これに対し、抑制性免疫チェックポイント分子は検出不可能であるか、又は検出されても低いレベルであった。特に、ＳＡＫ細胞はＣＴＬＡ－４を全く発現せず、発現したＰＤ－１とＴＩＧＩＴのレベルが低かったが、これは、対応するリガンドを発現する腫瘍による阻害の可能性が低いことを示す。
異なるドナーの試料中の様々な表面マーカーを発現する細胞の割合を定量すると、ＣＤ８＋細胞の９９％～１００％がＤＮＡＭ－１を発現し、細胞の約０％がＣＴＬＡ－４を発現し、細胞の１２％～１５％がＰＤ－１を発現、細胞の２０％～２２％がＴＩＧＩＴを発現することが分かった。Ｌａｇ－３とＴｉｍ－３の表面発現は、それぞれＣＤ８＋細胞の約５１％～６３％及び５４％～９７％で見られた。
次に、ＳＡＫ細胞上のチェックポイント分子の発現をＣＩＫ細胞上のチェックポイント分子の発現と比較した。基本的には実施例１に記載したように、同じドナーから組成物を調製し、細胞を１１日目に回収し、上述したようにフローサイトメトリーによる表現型分析に供した。結果を以下の表９に示すが、各細胞型における各表示マーカーの染色時に測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すと共に、ＣＩＫ細胞と比較したＳＡＫ細胞における相対発現（倍数増加、ＳＡＫ細胞のＭＦＩ／ＣＩＫ細胞のＭＦＩ、「ＳＡＫ／ＣＩＫ」と表示）を示す。
Figure 2024502170000009
表９に示すように、種々の増殖プロトコルによって調製した細胞は、表面マーカーの独特の発現プロファイルに関する様々な表現型を示した。特に、ＳＡＫ細胞は、１１日目に回収した対応するＣＩＫ細胞よりも顕著に高いレベルの試験マーカーを示す。従って、この結果から、容易に利用可能な方法によってＳＡＫ細胞を容易に特定し、他の細胞組成物と区別できることが実証される。また、１１日目のＣＩＫ細胞よりもＳＡＫ細胞において高いレベルでリンパ球活性化中に上昇することが知られている表面マーカーの存在は、改良増殖方法中にＳＡＫ細胞が「超活性化」表現型に適応することを更に示唆する。
ＮＫ細胞とＴ細胞の機能は、抑制性受容体（例えば、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３及び／又はＣＴＬＡ－４）と活性化受容体（例えば、ＤＮＡＭ－１）のバランスによって調節且つ維持されることが知られている。更に、抑制性免疫チェックポイント受容体の遮断は、Ｔ細胞の消耗を効果的に逆転させ、Ｔ細胞の抗腫瘍能力を回復させる上で重要となり得る。従って、抑制性免疫チェックポイント分子の遮断がＳＡＫ細胞活性にも影響を及ぼし得ることについて関心が高まっている。
注目すべきは、ＳＡＫ細胞は１１日間の増殖後に、ＣＩＫ細胞と比較して腫瘍細胞に対する細胞傷害能力が顕著に向上することが本明細書で実証されたことである（例えば、実施例３）。特定の理論又は作用機序に束縛されたくはないが、本明細書に開示の様々な受容体とエフェクター分子との独特のバランスを特徴とするＳＡＫ細胞の「超活性化」表現型は、腫瘍細胞に対する好ましい機能的能力と関連している場合がある。
要約すると、本明細書に開示の有利なプロトコルによって産生したＳＡＫ細胞は、免疫チェックポイント分子やケモカイン受容体等の細胞表面受容体の有利なプロファイルを示すことが分かった。特に、ＳＡＫ細胞は、免疫エフェクターの生存、増殖及び／又は活性にプラスの影響を与えることが知られているＤＮＡＭ－１とＣＸＣＲ６の発現を特徴とすることが分かった。特定の理論又は作用機序に束縛されたくはないが、これらの結果は、腫瘍回避を最小限に抑えることができる、活性化表現型を特徴とするＡＣＴ組成物を産生する能力と一致する。
主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）の関与
ＭＶ４－１１白血病細胞（混合型Ｂ骨髄単球性白血病のヒト細胞株、本明細書ではＭＶ４１１とも称する）に対するＳＡＫ細胞の死滅機序をＭＨＣクラスＩの阻害剤を使用して調べた。細胞傷害性アッセイは基本的には実施例２に記載のように行い、ＳＡＫ細胞を添加する１時間前に、ＭＶ４１１細胞を１μｇ／ｍＬの抗ＭＨＣＩ抗体（Ｗ６／３２クローン、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）と共にインキュベートした。結果を図１５に示すが、腫瘍死滅の程度は、（エフェクター細胞の存在下でのＣＦＳＥ＋ＰＩ－細胞の数／エフェクター細胞の非存在下でのＣＦＳＥ＋ＰＩ－細胞の数）×１００で計算した生細胞のパーセンタイルで示す。データは各比率における３回の平均値±標準偏差を示す。
図１５に示すように、ＭＶ４１１細胞でのＭＨＣクラスＩの遮断は、用量依存的にＳＡＫ細胞による該細胞の死滅を阻害した。しかし、この阻害は完全ではなく、ＳＡＫ細胞はＭＨＣＩ阻害剤の存在下でも細胞傷害活性の少なくとも４０％を保持していた。
従って、この結果から、ＳＡＫ細胞が白血病細胞に対してＭＨＣＩ依存的細胞傷害活性と非ＭＨＣＩ依存的細胞傷害活性の両方を示すことが分かる。注目すべきことに、エフェクターＳＡＫ細胞は組織適合性ではないため、両方の活性はＨＬＡ対立遺伝子の適合性を必要としなかった。従って、本発明に係るＳＡＫ細胞を含む組成物は、ダウンレギュレートされたＭＨＣ－Ｉ発現及び／又は活性を特徴とする免疫回避性腫瘍又は治療抵抗性腫瘍の治療にも有利に使用することができる。
要約すると、本明細書に記載の結果から、組織適合性対象と非組織適合性対象の両方における様々な起源の腫瘍の治療に対するＳＡＫ細胞の適合性が実証される。本明細書で実証したように、ＳＡＫ細胞は、造血器腫瘍と固形腫瘍に対して顕著な抗腫瘍活性を示し、ＨＬＡ適合性がない場合でも抗腫瘍効力を保持し、更には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こすリスクを顕著に抑制することで明らかなように、安全性の向上を示した。特定の理論又は作用機序に束縛されたくはないが、様々な腫瘍細胞に対するＳＡＫ細胞の細胞傷害活性は、本明細書で示すように、ＮＫＧ２Ｄ及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介活性を伴うことがある。
特定の実施形態の上述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするものであるため、他者は現在の知見を応用することによって、過度の実験を行わずに一般概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を様々な用途に容易に改変及び／又は適応させることができる。従って、そのような適応や改変は、開示された実施形態の均等物の意味及び範囲内で理解されるべきであり、また、そのように意図されている。本明細書で使用される表現又は用語は説明を目的としたものであり、限定を目的とするものではないことを理解されたい。開示された様々な機能を実施するための手段、材料及び工程は、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態をとることができる。
配列番号１： 抗ヒトＣＤ１２３ ＣＡＲ
配列番号２： ＩＲＥＳ核酸配列
配列番号５： ２Ａエレメント
配列番号６： ＧＦＰ
配列番号９： ＣＤ１９ ＣＡＲ

Claims (73)

  1. インビトロ増殖末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、その７０～８５％はＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％はＣＤ５６－細胞であり、最大５％はＣＤ３－細胞であって、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を示す、養子細胞移植（ＡＣＴ）用の細胞組成物。
  2. 細胞の７～１２％はＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞であり、２０～２８％はＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞であり、１０～１４％はＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５６＋細胞である、請求項１に記載の細胞組成物。
  3. 組成物中のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の量は、組成物中のＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の量の６～８倍である、請求項２に記載の細胞組成物。
  4. ３％未満のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  5. 前記ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも４０％は、パーフォリン、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ２から成る群から選択される少なくとも１種のマーカーの表面発現を特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  6. 前記ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞は、ＤＮＡＭ－１＋、ＣＴＬＡ－４－細胞として更に特徴付けられる、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  7. 前記ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも９０％はＣＸＣＲ３の表面発現を特徴とし、前記ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも３０％はＣＸＣＲ６の表面発現を特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  8. 前記ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の５０％以下は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴから成る群から選択される複数の免疫チェックポイント分子の表面発現を特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  9. 前記腫瘍細胞に対してグランザイムＢ及び／又はパーフォリンによって媒介される非ＭＨＣ制限細胞傷害活性を示す、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  10. 前記細胞傷害活性は、ＦＡＳ－ＦａｓＬ相互作用によって実質的に媒介されない、請求項９に記載の細胞組成物。
  11. 移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を実質的に誘発することなく、インビボで非組織適合性対象における腫瘍の発生を阻害又は防止し得る、請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  12. インビトロで０．２５：１の比率で２４時間以内に造血器腫瘍細胞を特異的に根絶することができる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  13. 前記腫瘍細胞は少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する、請求項１２に記載の細胞組成物。
  14. 前記腫瘍細胞は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３から成る群から選択される複数のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する、請求項１３に記載の細胞組成物。
  15. ５×１０６～１０×１０９個の生細胞を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  16. 有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの存在下で少なくとも９日間にわたりＰＢＭＣを増殖させることを含み、前記有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを４８～９６時間毎に補充する方法によって調製する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  17. インキュベーションを他のサイトカイン又は抗体の非存在下で行う、請求項１６に記載の細胞組成物。
  18. 前記細胞は遺伝子改変されている、請求項１～１７のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  19. 前記細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン又はケモカイン受容体、又はそれらの任意の組み合わせの内の少なくとも１種を発現するように遺伝子改変されている、請求項１８に記載の細胞組成物。
  20. 前記細胞は、ＢＣＭＡ、ＣＤ４７、ＰＤＬ－１、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１６、ＣＤ２７６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＥＦＦＲｖＩＩＩから成る群から選択される抗原に対するＣＡＲを発現するように遺伝子改変されている、請求項１９に記載の細胞組成物。
  21. ＣＤ１９特異的ＣＡＲ及びＣＤ１２３特異的ＣＡＲのいずれか１種を発現する、請求項２０に記載の細胞組成物。
  22. 前記細胞は、Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体を発現するように遺伝子改変されている、請求項１８に記載の細胞組成物。
  23. 外因性インターロイキン－２（ＩＬ－２）、外因性ＩＬ－１５、外因性ＩＬ－２１のいずれか１種、又はそれらの任意の組み合わせを発現する、請求項１８に記載の細胞組成物。
  24. （ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように改変されている、請求項１８に記載の細胞組成物。
  25. 養子細胞移植（ＡＣＴ）用の細胞組成物を産生するための方法であって、
    ａ．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料を用意することと、
    ｂ．有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下、且つ他のサイトカイン又は抗体の非存在下で少なくとも９日間にわたりＰＢＭＣを増殖させ、このとき、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを４８～９６時間毎に補充することと
    を含み、培養物中の生細胞数を少なくとも２０倍に増加させ、少なくとも５×１０６～１０×１０８個の生細胞を含む細胞組成物を得る、方法。
  26. 前記ＩＬ－２及び前記ＣＤ３アクチベーターを唯一の外因的に添加された細胞刺激因子とし、これらが常時存在する条件下で増殖を行う、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記工程ｂは、５００～１５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と１０～６０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体の存在下で細胞を増殖させることを含み、これらを４８～９６時間毎に１０～１６日間再補充する、請求項２５又は２６に記載の方法。
  28. 前記細胞を更なる富化、刺激又は増殖工程に供しない、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記生細胞の数を少なくとも３０倍に増加させるように増殖を行う、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. ５×１０６～１０×１０９個の生存可能な単核細胞を含み、その７０～８５％はＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞である細胞組成物を産生するように増殖を行う、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 産生された前記細胞組成物は、インビトロで０．２５：１の比率で２４時間以内に造血器腫瘍細胞を特異的に根絶し得る、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記工程ｂは細胞を遺伝子改変することを更に含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
  33. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン又はケモカインの受容体、又はそれらの任意の組み合わせの内の少なくとも１種を発現するように前記細胞を遺伝子改変することを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. （ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように細胞を改変することを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 産生された前記細胞組成物を凍結保存することを更に含む、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 請求項２５～３５のいずれか一項に記載の方法によって調製された細胞組成物。
  37. （ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ又はＣＤ１２３特異的ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｃ末端テールドメインの変異又はトランケーションを含む改変ＣＸＣＲ４受容体、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１から成る群から選択される少なくとも１種のサイトカインを発現するように遺伝子改変された白血球を含む、細胞組成物。
  38. 細胞の７０～８５％はＮＫＧ２ＤとグランザイムＢを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、少なくとも７０％はＣＤ５６－細胞であり、最大５％はＣＤ３－細胞である、請求項３７に記載の細胞組成物。
  39. 有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターの常時存在下で少なくとも９日間にわたり末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を増殖させることを含み、有効量のＩＬ－２とＣＤ３アクチベーターを４８～９６時間毎に補充する方法によって調製された、請求項３７又は３８に記載の細胞組成物。
  40. 腫瘍の治療を必要とする対象における腫瘍の治療用である、請求項１～２４及び３６～３９のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  41. 前記腫瘍は造血器腫瘍又は固形腫瘍である、請求項４０に記載の治療用の細胞組成物。
  42. 前記腫瘍は白血病、多発性骨髄腫、前立腺腫瘍又は中皮腫から成る群から選択される、請求項４０に記載の治療用の細胞組成物。
  43. 前記腫瘍は少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を特徴とする、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の治療用の細胞組成物。
  44. 前記腫瘍は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３から成る群から選択される複数のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する、請求項４３に記載の治療用の細胞組成物。
  45. 前記腫瘍は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３を発現する、請求項４４に記載の治療用の細胞組成物。
  46. 前記腫瘍は、ＣＸＣＲ６リガンド、ＣＸＣＲ４リガンド、ＣＸＣＲ２リガンド及びＣＸＣＲ３リガンドから成る群から選択される少なくとも１種のケモカインの発現を特徴とする、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の治療用の細胞組成物。
  47. 前記腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴから成る群から選択される抑制性免疫チェックポイント分子の少なくとも１種のリガンドの発現を特徴とする、請求項４０～４６のいずれか一項に記載の治療用の細胞組成物。
  48. 前記腫瘍は、少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤による治療に対して抵抗性である、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の治療用の細胞組成物。
  49. 前記腫瘍は、少なくとも１種のＣＴＬＡ－４特異的遮断抗体による治療に対して抵抗性である、請求項４８に記載の治療用の細胞組成物。
  50. 前記対象は、チェックポイント分子阻害剤を用いた治療レジメンを受けていない、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の治療用の細胞組成物。
  51. 前記治療は、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３又はそれらの組み合わせに対する少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤を前記対象に投与することを更に含む、請求項４０～５０のいずれか一項に記載の治療用の細胞組成物。
  52. 前記細胞組成物は凍結保存及び解凍を経ている、請求項４０～５１のいずれか一項に記載の治療用の細胞組成物。
  53. 前記細胞組成物は、前記対象に対して自家性、組織適合性同種異系、又は非組織適合性同種異系である、請求項４０～５２のいずれか一項に記載の治療用の細胞組成物。
  54. 前記細胞組成物は、前記対象に対して非組織適合性同種異系である、請求項５３に記載の治療用の細胞組成物。
  55. 前記腫瘍は、ＭＨＣＩ発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを特徴とする、請求項４０～５４のいずれか一項に記載の治療用の細胞組成物。
  56. 腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、腫瘍細胞を治療有効量の請求項１～２４及び３６～３９のいずれか一項に記載の細胞組成物と接触させ、それによって対象の腫瘍を治療することを含む方法。
  57. 前記細胞組成物は、前記対象に対して自家性、組織適合性同種異系、又は非組織適合性同種異系である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記細胞組成物は、前記対象に対して非組織適合性同種異系である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記接触をインビボで行う、請求項５６に記載の方法。
  60. 前記接触をエクスビボで行う、請求項５６に記載の方法。
  61. 前記細胞組成物は、前記腫瘍細胞と接触させる前に凍結保存及び解凍を経ている、請求項５６に記載の方法。
  62. 前記腫瘍は造血器腫瘍又は固形腫瘍である、請求項５６に記載の方法。
  63. 前記腫瘍は白血病、多発性骨髄腫、前立腺腫瘍又は中皮腫から成る群から選択される、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記腫瘍は少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を特徴とする、請求項６２に記載の方法。
  65. 前記腫瘍は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３から成る群から選択される複数のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記腫瘍は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＬＡＥ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２５６及びＵＬＢＰ３を発現する、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記腫瘍は、ＣＸＣＲ６リガンド、ＣＸＣＲ４リガンド、ＣＸＣＲ２リガンド及びＣＸＣＲ３リガンドから成る群から選択される少なくとも１種のケモカインの発現を特徴とする、請求項５６に記載の方法。
  68. 前記腫瘍は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴから成る群から選択される抑制性免疫チェックポイント分子の少なくとも１種のリガンドの発現を特徴とする、請求項５６に記載の方法。
  69. 前記腫瘍は、少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤による治療に対して抵抗性である、請求項５６に記載の方法。
  70. 前記腫瘍は、少なくとも１種のＣＴＬＡ－４特異的遮断抗体による治療に対して抵抗性である、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記対象は、チェックポイント分子阻害剤を用いた治療レジメンを受けていない、請求項６８に記載の方法。
  72. Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３又はそれらの組み合わせに対する少なくとも１種のチェックポイント分子阻害剤を前記対象に投与することを更に含む、請求項５６に記載の方法。
  73. 前記腫瘍は、ＭＨＣＩ発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを特徴とする、請求項５６に記載の方法。
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