KR20160068960A - 면역요법을 위한 다클론성 감마 델타 t 세포 - Google Patents

면역요법을 위한 다클론성 감마 델타 t 세포 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서 항-종양, 항-바이러스 및 항-박테리아 반응성을 갖는 다클론성 γδ T 세포의 임상적으로 적절한 양을 확장시키는 방법이 제공된다. 다클론성 γδ T 세포는 고형 종양을 포함하는 다양한 종양뿐만 아니라 다른 병태, 예컨대 바이러스 감염 및 박테리아 감염을 표적화할 수 있다.

Description

면역요법을 위한 다클론성 감마 델타 T 세포{POLYCLONAL GAMMA DELTA T CELLS FOR IMMUNOTHERAPY}
본 출원은 2013년 10월 25일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/895,626호의 우선권 유익을 주장하며, 이 기초출원의 전문은 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 발명은 미국방부에 의해 부여된 등록번호 제10626252호 하에서 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 의학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특정 양상에서, 본 발명의 분야는 면역요법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 임상-등급 다클론성 γδ T 세포의 제조 및 이러한 세포를 이용하는 치료 방법에 관한 것이다.
인간 γδ T 세포는 세포 접촉 시 세포용해를 포함하는 효과기 기능의 범위를 나타내는 선천성과 적응성 품질을 둘 다 가진다(Bonneville et al., 2010). 종양 표적 세포의 인식 및 후속적 사멸은 γ 및 δ T-세포 수용체(TCR) 쇄의 이형이합체에 의해 달성된다. 인간 TCR 가변(V) 영역은 14개의 독특한 Vγ 대립유전자, 3개의 독특한 Vδ 대립유전자(Vδ1, Vδ2 및 Vδ3), 및 Vα 대립유전자와 일반 명명법을 공유하는 5개의 Vδ 대립유전자(Vδ4/Vα14, Vδ5/Vα29, Vδ6/Vα23, Vδ7/Vα36 및 Vδ8/Vα38-2)를 정한다(Lefranc, 2001). TCRα/TCRβ 이형이합체를 발현시키는 T 세포는 대략 95%의 말초혈(PB) T 세포를 구성하고, 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 분자와 관련하여 펩타이드를 인식한다(Turchinovich and Pennington, 2011). 대조적으로, TCRγδ 리간드는 MHC 제한과 독립적으로 인식되지만, PB 내에서 빈번하지 않다(T 세포의 1% 내지 5%)(Bonneville et al., 2010; Kabelitz et al., 2007; Xu et al., 2011).
인간 γδ T 세포는 종양 세포를 용해시키고 면역요법에 대해 조짐을 보이는 고유한 능력을 나타낸다. 이와 같이, 다수의 TCRγδ 리간드는 암 세포 상에 존재하여, γδ TCR의 다클론성 레퍼토리를 유지하는 확장 접근이 인간 적용의 관심을 끌 가능성을 상승시킨다. Vγ9Vδ2 T 세포의 양자 전달(adoptive transfer)은 암의 시험용 치료에 대해 객관적 임상 반응을 갖지만, 비-Vγ9Vδ2 T 세포의 투여는 아직 수행되지 않았다(Kondo et al., 2008; Lang et al., 2011; Nagamine et al., 2009; Nicol et al., 2011; Wilhelm et al., 2003). 반일치(haploidentical) αβ T 세포-고갈 조혈 줄기 세포 이식물(HSCT)의 수용자 중에서 백혈병의 장기간 관해는 공여체-유래 Vδ1 T 세포의 증가된 생착 빈도와 상관관계가 있었다(Godder et al., 2007; Lamb et al., 1999; Lamb et al., 1996; Lamb et al., 2001). 지금까지 Vδ1음성Vδ2음성 T 세포의 치료적 영향을 기재한 보고는 없었으며, 이 서브세트는 Vδ1 및 Vδ2 TCR을 발현시키는 T 세포와 직접적으로 비교되지 않았다. 따라서, 비-Vγ9Vδ2 계통의 지식과 인간 적용에서 상당한 격차가 있다.
아미노비스포스포네이트, 예를 들어, 졸레드론산(Zol)은 임상 용도를 위해 γδ T 세포의 Vγ9Vδ2 서브세트를 증식시키는데 사용되었다(Stresing et al., 2007; Thompson et al., 2010). 다른 γδ T 세포 계통은 아미노비스포스포네이트에 의해 증식되지 않는다. 그렇더라도, 암 면역요법으로서 Vγ9Vδ2 γδ T 세포를 사용한 임상 시험은 일부 객관적 반응을 나타내었지만, 단일 요법으로서 치유력이 있지는 않았다(Nicol et al., 2011; Wilhelm et al., 2003). γδ T 세포의 더 다양한 세트를 증식시킥 위해 플레이트-결합 항체 및 사이토카인 칵테일이 사용되었지만, (i) 그들은 일관된 Vδ1 및 Vδ1음성Vδ2음성 빈도를 달성하지 못하였고, (ii) γδ T 세포의 절대 수는 임상적으로 적절하지 않았으며(108개 미만의 세포), (iii) 그들은 Vγ 빈도를 완전히 분석하지 못하였고, (iv) 이들 시약이 우수 의약품 제조관리 제도(good manufacturing practice: GMP) 품질에서 모두 이용가능하지 않기 때문에, 그들은 임상에 대해 직접적으로 전환가능하지 않다(Dokouhaki et al., 2010; Kang et al., 2009; Lopez et al., 2000). 따라서, 생체밖에서 γδ T 세포를 확장시키는 임상적으로 적절한 방법, 및 이에 의해 생성되는 세포가 크게 필요로 된다.
본 명세서에서 항-종양, 항-바이러스, 및 항-박테리아 반응성을 갖는 다클론성 γδ T 세포의 임상적으로 적절한 양을 확장시키는 방법이 제공된다. γδ T 세포는 고형 종양을 포함하는 다양한 종양뿐만 아니라 다른 병태, 예컨대 바이러스 및 박테리아 감염을 표적화할 수 있다.
일 실시형태에서, 적어도 약 109개의 정제된 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물이 제공된다. 세포 조성물은 적어도 약 109, 1010, 1011개 이상의 정제된 γδ T 세포를 포함할 수 있다. 일 양상에서, 정제된 γδ T 세포는 Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성 TCR 서브세트일 수 있다. 일 양상에서, 정제된 γδ T 세포는 Vγ2, Vγ3, Vγ7, Vγ8, Vγ9, Vγ10 또는 Vγ11 TCR 쇄와 Vδ1, Vδ2, Vδ3, Vδ5, Vδ7 또는 Vδ8 TCR 쇄의 임의의 조합을 발현시킬 수 있다. 일 양상에서, 정제된 γδ T 세포는 본질적으로 동일한 유전자 물질을 가질 수 있다. 일 양상에서, 정제된 γδ T 세포는 키메라 항원 수용체를 함유하지 않을 수도 있다.
일 양상에서, 세포 조성물은 NK 세포 또는 αβ T 세포를 함유하지 않을 수도 있다. 일 양상에서, γδ T 세포는 CD3을 발현시킬 수 있다. 추가 양상에서, γδ T 세포는 CD38, CD95, CD25, CD27, CD28, CD45 또는 CCR7을 발현 또는 공동발현시킬 수 있다. 일 양상에서, γδ T 세포는 CXCR4, CCR4, CLA, CD4, CD8, CD122, CD127, CD56, CD57 또는 PD-1을 발현시키지 않을 수도 있다.
다양한 양상에서, 본 실시형태의 γδ T 세포는 치료 가능성을 개선시키기 위해 유전자 편집될 수 있다. 이러한 유전자 편집은, 예를 들어, 인공 뉴클레아제(들)의 사용에 의해 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 이러한 유전자 편집은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T-세포 수용체(TCR)의 발현을 통해 γδ T 세포의 특이성을 재지시할 수 있다. 이러한 유전자 편집은 귀소(homing), 사이토카인 생성, 리사이클 킬링(recycle killing) 및/또는 개선된 생착을 개선시킴으로써 γδ T 세포의 효능을 개선시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 본 실시형태의 세포 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일 실시형태에서, 본 실시형태의 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 포함하는 세포의 샘플을 얻는 단계; 및 인터류킨-2(IL-2) 및 인터류킨-21(IL-21)의 존재 하에 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 인공 항원 제시 세포(aAPC)와 함께 배양시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 배양시키는 단계는 T-세포 집단을 확장시키기 위해 제한된 시간 기간 동안 생체밖에서 일어날 수 있다. 일 양상에서, 배양시키는 단계는 아미노비스포스포네이트(예를 들어, 졸레드론산)와 함께 배양시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 양상에서, 세포의 샘플은 말초혈 샘플 또는 제대혈 샘플일 수 있다. 다른 양상에서, 세포의 샘플은 조직으로부터 얻을 수 있다. 다른 양상에서, 세포의 샘플은 단일 대상체로부터 얻을 수 있다. 대상체는 공여체 또는 환자일 수 있다. 일부 양상에서, 단일 공여체로부터 생성된 γδ T 세포는 하나 이상의 동종이계 수용자(allogeneic recipient) 내로 주입될 수 있다. 일 양상에서, γδ T 세포는 인간 γδ T 세포일 수 있다.
일부 양상에서, 배양시키는 단계 전에 γδ T 세포의 초기 집단의 정제는, 예컨대 상자성 비드 선택 또는 유세포 분석법을 이용하는 단리/풍부화를 포함할 수 있다. 이러한 선택은 세포의 샘플로부터 CD56-발현 세포 및 TCRαβ-발현 세포를 고갈시키는 단계를 포함할 수 있다. γδ T 세포의 순도는 하나 이상의 γδ TCR에 대해 특이적인 단클론성 항체로 염색되는 TCR의 존재에 기반할 수 있다.
일 양상에서, aAPC는 유전자 이식 K562 세포일 수 있다. 일 양상에서, aAPC는 CD137L을 발현시킬 수 있다. 다른 양상에서, aAPC는 CD19, CD64, CD86 또는 mIL15를 추가로 발현시킬 수 있다. 특정 양상에서, aAPC는 적어도 하나의 항-CD3 항체 클론, 예를 들어, OKT3 및/또는 UCHT1을 발현시킬 수 있다. 일 양상에서, aAPC는 불활성화될(예를 들어, 조사될(irradiated)) 수 있다. 일 양상에서, aAPC는 감염성 물질에 대해 시험되었고, 감염성 물질이 없다는 것이 확인될 수 있다. 이러한 aAPC를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일 양상에서, 제1 다클론성 γδ T-세포 집단은 약 104 내지 약 106개 γδ T 세포를 포함할 수 있다. 일 양상에서, 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 aAPC와 함께 배양시키는 단계는 약 10:1 내지 약 1:10; 약 3:1 내지 약 1:5; 약 1:1 내지 약 1:3(aAPC에 대해 γδ T 세포); 또는 그 안에서 유도가능한 임의의 범위의 비에서 세포를 배양시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포와 aAPC의 공동 배양은 약 1:1, 약 1:2 또는 약 1:3의 비일 수 있다.
일 양상에서, 배양물 내 aAPC는 매주 보충될 수 있다. 일 양상에서, 제1 다클론성 γδ T 세포 집단을 aAPC와 함께 배양시키는 단계는 적어도 2주 동안 배양시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 양상에서, 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 aAPC와 함께 배양시키는 단계는 다클론성 γδ T 세포 수의 적어도 100배 증가를 초래할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 실시형태의 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 포함하는 세포의 샘플을 얻는 단계; 및 적어도 하나의 항-CD3 항체 클론, 예를 들어, OKT3 및/또는 UCHT1의 존재 하에, 그리고 추가로 인터류킨-2(IL-2) 및 인터류킨-21(IL-21)의 존재 하에 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 배양시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 항-CD3 항체 클론은 aAPC의 표면 상에서 발현될 수 있다. 다른 양상에서, 항-CD3 항체 클론은 마이크로비드의 표면 상에 있을 수 있다.
일부 양상에서, 배양시키는 단계는 T-세포 집단을 확장시키기 위해 제한된 시간 기간 동안 생체 밖에서 일어날 수 있다. 일 양상에서, 배양시키는 단계는 아미노비스포스포네이트(예를 들어, 졸레드론산)와 함께 배양시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 양상에서, 세포의 샘플은 말초혈 샘플 또는 제대혈 샘플일 수 있다. 다른 양상에서, 세포의 샘플은 단일 대상체로부터 얻을 수 있다. 대상체는 공여체 또는 환자일 수 있다. 일 양상에서, γδ T 세포는 인간 γδ T 세포일 수 있다. 일부 양상에서, γδ T 세포는 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 유도 다능성 줄기세포로부터 유래될 수 있다.
일부 양상에서, 배양시키는 단계 전에 γδ T 세포의 초기 집단의 정제는 상자성 비드 선택 또는 유세포 분석법을 포함할 수 있다. 이러한 선택은 세포의 샘플로부터 CD56-발현 세포 및 TCRαβ-발현 세포를 고갈시키는 단계를 포함할 수 있다. γδ T 세포의 순도는 γδ TCR에 대해 특이적인 단클론성 항체에 의해 염색되는 TCR의 존재 및 αβ TCR에 대한 염색의 부재에 기반할 수 있다.
일 양상에서, 제1 다클론성 γδ T 세포 집단을 aAPC와 함께 배양시키는 단계는 적어도 2주 동안 배양시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 양상에서, 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 배양시키는 단계는 다클론성 γδ T 세포 수의 적어도 100-배 증가를 초래할 수 있다.
일 실시형태에서, 유효량의 세포 조성물 또는 본 실시형태의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일 양상에서, 환자는 인간 환자일 수 있다.
일 양상에서, 질환은 암일 수 있다. 특정 양상에서, 암은 혈액학적 또는 고형암, 예컨대 T-세포 ALL, B-ALL, CML, 결장암, 난소암, 신경모세포종, 뇌 종양(들), 또는 췌장암일 수 있다. 일부 양상에서, 환자는 사전 항암 요법을 받을 수 있다. 일 양상에서, 환자는 관해에 있을 수 있다. 또 다른 양상에서, 환자는 암의 증상이 없을 수 있지만, 검출가능한 암 세포를 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 질환은 바이러스 감염(예를 들어, 거대세포바이러스(CMV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV))일 수 있다. 또 다른 양상에서, 질환은 박테리아 감염일 수 있다. 일 양상에서, 질환은 패혈증일 수 있다.
일 양상에서, 세포 조성물은 환자에 대해 동종이계일 수 있다. 다양한 양상에서, 동종이계 세포 조성물은 환자와 HLA를 공유할 수 있거나, 또는 공유하지 않을 수도 있다. 다른 양상에서, 세포 조성물은 환자에 대해 자가 유래(autologous)일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 실시형태의 방법에 따라 세포 조성물을 생성하는 단계 및 치료가 필요한 환자에게 유효량의 상기 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
일부 양상에서, 일부 양상에서 1회 이상, 예컨대 별도로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상을 포함하는 본 명세서에 기재된 세포 집단으로부터의 유효량의 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 의학적 병태를 지니는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 환자의 질환 치료에서 사용을 위해 세포 집단을 포함하는 조성물 또는 본 실시형태의 약제학적 조성물이 제공된다. 질환은 암(예를 들어, T-세포 ALL, B-ALL, AML, 결장암, 난소암, 췌장암 등), 바이러스 감염(예를 들어, 거대세포바이러스(CMV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)), 또는 박테리아 감염(예를 들어, 패혈증)일 수 있다. 일 양상에서, 세포 조성물은 환자에 대해 동종이계일 수 있다. 다른 양상에서, 세포 조성물은 환자에 대해 자가일 수 있다. 다른 실시형태에서, 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 본 실시형태의 세포 집단의 용도가 제공된다.
본 발명의 방법 및/또는 조성물과 관련하여 논의되는 실시형태는 본 명세서에 기재되는 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 방법 또는 조성물에 관한 실시형태는 본 발명의 다른 방법 및 조성물에 대해 마찬가지로 적용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 단수의 용어는 하나 이상을 의미할 수 있다. 단어 "포함하는"과 함께 사용될 때 본 명세서에서 청구범위(들)에서 사용되는 바와 같은 단수의 단어는 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 본 개시내용이 유일한 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침하더라도, 유일한 대안을 지칭하거나 또는 대안이 상호 배타적인 것으로 달리 명확하게 표시되지 않는 한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "다른"은 적어도 두번째 이상을 의미할 수 있다.
본 명세서 전체적으로 용어 "약"은 값이 장치, 값을 결정하기 위해 사용되는 방법 또는 연구 대상체 중에 존재하는 변형에 대해 오차의 고유한 변형을 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내지만, 단지 예시의 방법에 의해 제공된다는 것이 이해되어야 하는데, 본 발명의 정신과 범주 내에서 다양한 변화 및 변형이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하게 될 것이기 때문이다.
다음의 도면은 본 명세서의 부분을 형성하며 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 구체적 실시형태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 하여 더 양호하게 이해될 수 있다.
도 1A 내지 도 1G. 벌크( 다클론성 ) 집단으로서 IL-2 및 IL-21의 존재 하에 γ-조사된 aAPC 상에서 PB- 유래된 γδ T 세포의 지속적 증식. (A) aAPC 및 사이토카인 상에서 공동배양 전(제0일) 및 후에(제22일) γδ T 세포의 빈도. 일곱의 대표적인 공여체 중 하나를 4회의 독립적 실험으로부터 나타낸다. (B) 공동배양의 제22일에 CD3, CD56, TCRαβ 및 TCRγδ의 발현. 일곱의 대표적인 공여체 중 하나를 4회의 독립적 실험으로부터 나타낸다. (C) 다클론성 γδ T 세포의 추론된 세포수, 여기서 3개의 화살표는 aAPC의 첨가를 나타낸다. 검정색 선은 2개의 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 4)이고, 각각의 회색선은 개개 공여체이다. (D) 막-결합 IL-15(mIL15), CD86 및/또는 CD137L을 발현시키는 aAPC에 덧붙여 IL-2 및 IL-21과 함께 공동발현시킨 γδ T 세포의 9일에 걸쳔 증가 배수. 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 3)이고, 각각의 형상은 개개 공여체를 나타낸다. 통계학적 분석을 위해 본페로니(Bonferroni) 사후 검정을 이용하는 이원 분산 분석을 사용하였다. *p < 0.05; **p < 0.01. (E) 가용성 재조합 IL-2 및/또는 IL-21 중 하나의 존재 하에서 aAPC와 함께 공동발현시킨 γδ T 세포(클론 #4)의 9일에 걸친 증가 배수. 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 3)이고, 각각의 형상은 개개 공여체를 나타낸다. 통계학적 분석을 위해 본페로니 사후 검정을 이용하는 이원 분산 분석을 사용하였다. *p < 0.05. (F) γδ T 세포 상에서 TCRδ1 및 TCRδ2 쇄의 대표적인 확장은 aAPC 클론 #4 및 사이토카인 상에서 22일 동안 수치적으로 확장되었다. 두 독립적 실험으로부터의 4개의 대표적인 공여체 중 하나를 나타낸다. (G) aAPC(클론 #4) 및 사이토카인 상에서 22일 동안 증식시킨 다클론성 γδ T 세포 상에서 TCRδ1+TCRδ2음성, TCRδ1음성TCRδ2+, 및 TCRδ1음성TCRδ2음성 쇄의 세포 표면 발현 빈도. 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 4)이고, 각각의 형상은 개개 공여체를 나타낸다.
도 2. 도입된 공자극 분자의 영향을 덮을 수 없는 γδ T 세포와의 공동 배양을 위해 발생시킨 aAPC. K562 세포를 잠자는 미녀(Sleeping Beauty: SB) 트랜스포사제 및 막-결합 IL-15(mIL15)의 변이체를 발현시키는 SB 트랜스포존을 이용하여 전기천공시키고, 이때 IL-15 사이토카인/펩타이드는 IL-15 수용체-α에 융합된다. 유전자 변형된 세포는 aAPC 클론 A6를 생성하기 위해 FACS에 의해 분류된 단일-세포였다. aAPC 클론 A6은 aAPC 클론 #4보다는 mIL15의 상이한 변이체를 사용한다는 것을 주목한다. 이어서, CD86 또는 CD137L 중 하나를 함유하는 SB 트랜스포사제 및 SB 트랜스포존을 이용하여 클론 A6를 전기천공시켰고, 유전자 변형된 세포는 생성된 aAPC 클론 A3 및 D4에 대해 FACS에 의해 분류된 단일 세포였다. aAPC의 세포 표면 면역표현형을 나타내며, 여기서 전방 산란을 x-축 상에 나타내고, mIL15, CD86 및 CD137L은 각각 상부, 중간 및 하부 y-축 상에 나타낸다.
도 3A 내지 도 3D. aAPC 상에서 UCB -유래 γδ T 세포의 확장. γδ T 세포를 CD3 및 TCRγδ에 의한 염색에 기반하여 FACS에 의해 분류하였고 가용성 재조합 IL-2 및 IL-21의 존재 하에 aAPC 클론 #4를 이용하여 매주 자극하였다. (A) 공동 배양물로부터의 총 추론 세포수, 여기서 검정색 선은 4회의 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 5)를 나타내고, 회색선은 개개 공여체이다. 화살표는 γ-조사된 aAPC의 첨가를 나타낸다. IL-2 및 IL-21을 이용하는 aAPC 상에서 확장 5주 후에 유세포 분석법에 의한 대표적인 공여체(4회의 독립적 실험으로부터 5 중 1)의 (B) CD3(y-축) 및 TCRγδ(x-축), (C) TCRαβ(y-축) 및 TCRγδ(x-축), 및 (D) CD3(y-축) 및 CD56(x-축)의 확장. 사분 빈도를 위쪽의 우측 모서리에 나타낸다.
도 4A 내지 도 4D. aAPC 상에서 증식 및 활성화된 γδ T 세포 내 Vδ 및 Vγ mRNA 의 존재비. aAPC/IL-2/IL-21 상에서 공동 배양의 22일에 DTEA에 의해 PBMC-유래 γδ T 세포 내에서 (A) Vδ 및 (B) Vγ 대립유전자에 대한 mRNA 종 암호의 정량화. PBMC에 대해 기재한 바와 같이 aAPC/IL-2/IL-21 상에서 공동 배양의 제34일 내지 제35일에 DTEA에 의한 UCB-유래 γδ T 세포 내 (C) Vδ 및 (D) Vγ 대립유전자에 대한 mRNA 종의 정량화. 상자-수염 그림(Box-and-whiskers plot)은 25% 및 75% 백분율을 나타내며, 여기서 선은 상부로부터 하부까지 최대, 평균 및 최소를 나타낸다(n=4). 그래프 하부에서 실선은 DTEA 음성 대조군의 평균 ± 2xSD로부터 계산한 검출 한계(limit-of-detection: LOD)를 나타낸다. 샘플 LOD에 비해 각각의 대립유전자에 대해 스튜던트 대응표본 단측 t 검정을 수행하였다. *p < 0.05 및 **p < 0.01
도 5. UCB로부터 유래되고 aAPC 상에서 증식된 γδ T 세포에 대한 TCRδ1 및 TCRδ2 쇄의 표면 발현. IL-2 및 IL-21의 존재 하에 aAPC 클론 #4 상에서 공동발현의 35일 후 UCB로부터 유래된 γδ T 세포 상에서 TCRδ2(y-축) 및 TCRδ1(x-축)의 유세포 분석법의 발현. 사분 빈도(백분율)를 상부 우측 모서리에 나타낸다. T 세포를 4회의 독립적 실험에서 증식시켰다.
도 6A 내지 도 6F. IL-2 및 IL-21의 존재 하에 γ -조사된 aAPC에 대한 분리된 집단으로서 PB-유래 Vδ T 세포 서브세트의 지속된 증식. aAPC(클론 #4) 및 사이토카인에 의한 2회의 7일 자극 후에, γδ T 세포의 벌크 집단을 각각 TCRδ1+TCRδ2음성, TCRδ1음성TCRδ2+ 및 TCRδ1음성TCRδ2음성으로서 정의한 T 세포의 염색에 기반한 FACS에 의해 Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성 서브세트로 분리시켰다. (A) 단리된 군으로서 aAPC 및 사이토카인 상에서 수치적 확장의 15일 후에 γδ T 세포의 Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성 서브세트에 대한 TCRδ1 및 TCRδ2 쇄의 발현(좌측으로부터 우측으로). 4개의 대표적인 공여체 중 하나를 두 독립적 실험으로부터 풀링시킨다. 유동 플롯 내의 사분 빈도(백분율)를 상부 우측 모서리에 나타낸다. (B) 단리된 군으로서 aAPC 및 사이토카인에 대한 수치적 확장 15일 후에 γδ T 세포의 서브세트 내 TCRδ1+TCRδ2음성(열린 막대), TCRδ1음성TCRδ2+(검정색 막대) 및 TCRδ1음성TCRδ2음성(회색 막대) 세포 표면 단백질 발현의 빈도. 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 4)이다. (C) 사이토카인 및 총 세포 계수의 존재 하에 aAPC 클론 #4(화살표)에 의해 2회 자극한 각각의 단리된 Vδ 서브세트의 증식을 나타낸다. 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 4)이다. (D 내지 F) 분리된 서브세트로서 aAPC 및 사이토카인 상의 증식 15일 후 γδ T-세포 서브-집단 내 (D) Vδ1*01, (E) Vδ2*02, 및 (F) Vδ3*01에 대한 mRNA 종의 존재비를 동정 및 측정하기 위해 직접적 TCR 발현 어레이(DTEA)를 사용하였다. 상자-수염 그림 플롯은 25% 및 75% 백분율을 나타내며, 여기서, 선은 상부로부터 하부까지 최대, 평균 및 최소를 나타낸다(n = 4). 통계적 분석을 위해 스튜던트 대응표본 양측 t 검정을 수행하였다. **p < 0.01 및 ***p < 0.001
도 7A 내지 도 7E. aAPC , IL-2 및 IL-21에 대해 분리 및 확장된 γδ T 세포 내 공유된 Vα / Vδ 대립유전자의 mRNA 발현. IL-2 및 IL-21의 존재 하에 aAPC 클론 #4 상에서 Vδ1, Vδ2, 및 Vδ1음성Vδ2음성 집단의 공동 발현 15일 후 DTEA에 의한 공유된 Vδ 및 Vα 대립유전자의 발현. 각각의 분리된 서브세트에서 (A) Vδ4 (Vα14), (B) Vδ5(Vα29), (C) Vδ6(Vα23), (D) Vδ7(Vα36), 및 (E) Vδ8(Vα38-2)의 검출. 상자-수염 그림은 25% 및 75% 백분율을 나타내며, 여기서, 선은 상부로부터 하부까지의 최대, 평균 및 최소를 나타낸다(n = 4). 집단 간의 통계학적 분석을 위해 스튜던트 대응표본 2원 t-검정을 수행하였다.
도 8A 내지 도 8O. γδ T-세포 서브세트 내 Vγ 쇄에 대한 mRNA 종 암호의 존재비. PB로부터의 다클론성 γδ T 세포를 IL-2 및 IL-21의 존재 하에 aAPC 클론 #4를 이용하여 2회 자극하고 나서, 이어서, FACS를 TCRδ1+TCRδ2음성, TCRδ1음성TCRδ2+ 및 TCRδ1음성TCRδ2음성 서브-집단으로 분리시켰다. 이어서 이들을 IL-2 및 IL-21의 존재 하에 aAPC 클론 #4를 이용하여 2회 이상 단리된 서브세트로서 자극하였다. DTEA를 사용하여 (A) Vγ1*01, (B) Vγ2*02, (C) Vγ3*01, (D) Vγ5*01, (E) Vγ6*01, (F) Vγ7*01, (G) Vγ8*01M, (H) Vγ8*01X, (I) Vγ9*01, (J) Vγ9*02, (K) Vγ10*01, (L) Vγ11*01, (M) Vγ11*02, (N) VγA*01, 및 (O) VγB*01에 대해 mRNA 암호화를 동정 및 정량화하였다. 상자-수염 그림은 25% 및 75% 백분율을 나타내며, 여기서 선은 상부로부터 하부까지의 최대, 평균 및 최소를 나타낸다(n = 4). Vδ-분류 집단 간의 각각의 대립유전자에 대해 스튜던트 대응표본 양측 t-검정을 수행하였다. *p < 0.05 및 **p < 0.01
도 9A 내지 도 9B. IL-2 및 IL-21을 이용하여 aAPC 상에서 증식시킨 다클론 성 γδ T 세포의 면역표현형. (A) 개폐(네 공여체 중 하나의 대표를 2개의 독립적 실험으로부터 나타냄) 및 (B) 배양 제22일에 PBMC-유래 다클론성 γδ T 세포의 유세포 분석에 의한 표면 마커의 빈도. 선은 두 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 4)를 나타내며, 여기서 각각의 기호는 개개 공여체를 나타낸다.
도 10A 및 도 10H. aAPC , IL-2 및 IL-21 상에서 증식시킨 Vδ T-세포 서브세트의 면역표현형. Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성 서브세트를 분리시킨 집단으로서 증식 15일 후에 분석하였다. (A) Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성 서브세트에서 CD3(x-축) 및 TCRγδ(y-축) 발현의 유세포 분석법 플롯(좌측으로부터 우측으로). (B) Vδ1(적색), Vδ2(검정색), 및 Vδ1음성Vδ2음성(파랑) T-세포 서브세트 내 TCRγδ 염색의 평균 형광 강도(MFI), 여기서 각각의 형상은 상이한 공여체를 나타내며, 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링한 평균± SD(n = 4)이다. (C) Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성 서브세트 상에서 CD4(x-축) 및 CD8(y-축) 발현의 대표적인 유세포 분석법 플롯(좌측으로부터 우측으로) 및 (D) Vδ1(적색), Vδ2(검정색), 및 Vδ1음성Vδ2음성(파랑) T 세포에서 빈도의 요약, 여기서 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 3)이며, 각각의 형상은 상이한 공여체를 나타낸다. (E) CCR7(x-축) 및 CD62L(y-축), (F) CD28(x-축) 및 CD27(y-축), 및 (G) Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성 서브세트에서 CD45RA(x-축) 및 CD27(y-축) 발현(좌측으로부터 우측으로)의 유세포 분석법 플롯. (H) 부분 (G)에 표시한 바와 같이 CD27 및 CD45RA의 발현에 기반한 분화 상태에 대한 γδ T 세포의 배치. 각각의 형상은 상이한 공여체를 나타내며, 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 3)이다. 모든 유동 플롯은 두 독립적 실험으로부터 4개의 정상 공여체를 나타낸다. 유동 플롯의 사분 빈도(백분율)를 상부 우측 모서리에 나타낸다.
도 11A 내지 도 11D. 다클론성 γδ T 세포에 의해 분비된 사이토카인 및 케모카인. γ-조사된 aAPC 클론 #4 상에서 IL-2 및 IL-21과 함께 공동 배양의 제22일에, T 세포를 37℃에서 6시간 동안 CM(모의(mock)) 또는 백혈구 활성화 칵테일(LAC; PMA/이노마이신)과 함께 인큐베이션시켰다. (A) TH2 사이토카인, (B) TH17 사이토카인, (C) TH1 사이토카인, 및 (D) 케모카인의 존재를 검출하기 위해 27-플렉스 루미넥스(27-Plex Luminex) 어레이를 이용하여 조직 배양 상청액을 얻었다. 데이터는 두 독립적 실험에서 4 공여체로부터 풀링한 평균 ± SD이며, 각각의 공여체는 다중복합 분석 전에 풀링한 3회 중복 실험 웰을 가졌다. 각각의 사이토카인 또는 케모카인에 대해 모의 그룹과 LAC 그룹 사이의 통계학적 분석을 위해 스튜던트 t검정을 수행하였다. *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001
도 12A 내지 도 12F. 종양 세포에 대한 반응에서 IFNγ 분비를 위한 TCRγ δ에 대한 의존. NMS(음성 대조군) 또는 중화 TCRγδ 항체(αTCRγδ; 클론 IM)와 함께 종양 세포를 공동발현시키기 1시간 전에 그리고 공동발현시키는 6시간 동안 다클론성 γδ T 세포를 인큐베이션시켰다. T-세포 서브세트를 개폐하고 IFNγ 생성을 평가하기 위해 세포를 TCRδ1, TCRδ2, CD3 및 IFNγ에 대해 염색하였다. 개폐 전략은 (A) 활성화된 T-세포 게이트에서 전방 및 측방 산란(각각 FSC 및 SSC)의 분리, (B) T-세포 게이트에서 종양 세포의 오염으로부터 CD3+ T 세포의 단리, 및 (C) TCRδ1+TCRδ2음성, TCRδ1음성TCRδ2+ 및 TCRδ1음성TCRδ2음성에 각각 기반한 Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성으로의 분리였다. (D) CAOV3 난소 암 세포와 함께 공동발현시키고 NMS(개방) 또는 αTCRγδ(음영)로 처리한 Vδ1, Vδ2, 및 Vδ1음성Vδ2음성 게이트를 상술하는 히스토그램의 비교(좌측으로부터 우측으로). 히스토그램 다음의 수는 MFI이다. 유동 플롯은 두 독립적 실험에서 CAOV3 세포와 함께 공동 배양시킨 3개의 PB 공여체 중 하나를 나타낸다. (E) CAOV3 및 (F) OC314 세포에 반응한 IFNγ 분비의 저해 백분율을 다음의 식에 기반한 각각의 Vδ T-세포 서브세트에 대해 계산하였다: 저해(%) = 100 - 100 x [(MFI종양 + T 세포 - MFIT 세포 단독)αTCRγδ/(MFI종양 + T 세포 - MFIT 세포 단독)NMS]. 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 3)이다.
도 13A 내지 도 13G. 다클론성 γδ T 세포에 의한 종양 세포주 패널의 특이적 용해. (A) 동종이계 공여체( 대표적인 공여체 중 하나)로부터의 B 세포, (B) B-ALL 세포주: RCH-ACV, (C) T-ALL 세포주: 주카트(Jurkat), (D) CML 세포주: K562, (E) 췌장암 세포주: BxPc-3, (F) 결장암 세포주: HCT-116, 및 (G) 난소암 세포주: OC314 및 CAOV3에 대해 효과기(다클론성 γδ T 세포) 대 표적(E:T) 비를 증가시킴에 따라 표준 4시간 CRA를 수행하였다. 각각의 선은 효과기 다클론성 γδ T 세포의 개개 PB 공여체를 나타내고, 여기서 데이터는 두 독립적 실험으로부터 평균 ± SD(n = 3개 웰/분석)이다.
도 14A 내지 도 14G. 다클론성 γδ T 세포에 의한 종양 세포주 패널의 시 험관내 용해. (A) 자가 B 세포, (B) 동종이계 B 세포(4개의 공여체 중 하나), (C) B-ALL 세포주: cALL-2, (D) 미분화 백혈병 세포주: 카수미(Kasumi)-3, (E) K562-유래 aAPC 클론 #4, (F) 췌장암 세포주: CaPan-2, MiaPaCa-2, 및 Su8686, 및 (G) 난소암 세포주: A2780, EFO21, EFO27, Hey, IGROV1, OAW42, OVCAR3, 및 UPN251에 대한 효과기(다클론성 γδ T 세포) 대 표적(E:T) 비를 증가시킴에 따라 표준 4시간 CRA를 수행하였다. 각각의 선은 개개의 γδ T-세포 집단(PB 공여체로부터 유래)을 나타내고, 용해 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링한 평균 ± SD(n = 3 웰/분석)로서 제시한다는 것을 나타낸다.
도 15A 내지 도 15D. Vδ T-세포 서브세트에 의한 혈액학적 및 고형 종양 세포의 특이적 용해. (A) 주카트, (B) K562, (C) OC314 및 (D) CAOV3암 세포주를 표적화하는 Vδ1(원), Vδ2(정사각형), 및 Vδ1음성Vδ2음성(삼각형) γδ T-세포 서브세트 효과기에 의해 표준 4시간 CRA. 데이터를 두 독립적 실험으로부터 풀링시키며, CRA 내 3회 중복 측정으로부터의 공여체 평균의 평균 ± SD(n = 4)이다.
도 16A 내지 도 16B. γδ T-세포 서브세트에 의한 장기간 사멸 가능성. (A) CAOV3 및 (B) UPN251 난소 종양 세포를 6-웰 플레이트 내에서 파종시키고 나서, 밤새 인큐베이션시켜 부착을 확립하였다. 이어서, Vδ1, Vδ2, 또는 Vδ1음성Vδ2음성 서브세트로부터의 T 세포를 2일 동안 종양 세포와 함께 공동발현시켰다. 남아있는 부착 세포를 웰로부터 효소적으로 제거하고 나서, 살아있는 세포에 대해 계수화한다. T 세포가 없는 종양 세포는 양성 대조군으로서 작용하였고, 종양 세포가 없는 T 세포는 음성 대조군으로서 작용하였다. 사멸(%) = (살아있는 세포)공동 배양/(살아있는 세포)종양 단독 × 100. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터 풀링한 평균± SD(n = 3)이다.
도 17A 내지 도 17C. 다클론성 γδ T 세포에 의한 종양 용해의 저해. (A) IL-2 및 IL-21의 존재 하에 aAPC 클론 #4에 대한 증식의 22일 후 PB로부터 다클론성 γδ T 세포에 대한 CD3, DNAM1, 및 NKG2D의 대표적인 발현. 두 독립적 실험으로부터의 4개의 공여체 중 하나를 나타낸다. 유동 플롯의 사분 빈도를 각각의 플롯의 상부 우측 모서리에 나타낸다. 누적 빈도(백분율)를 평균± SD(n = 4)로서 나타내고, 각각의 형상은 상이한 공여체를 나타낸다. (B) NKG2D, DNAM1, TCRγδ(클론 B1), 및 TCRγδ(클론 IM)에 대한 중화 항체를 사용하여 표준 4시간 CRA에서 12:1의 E:T 비로 주카트(좌) 또는 OC314(우) 종양 표적의 사멸을 차단시켰다. 항체를 1시간 동안 그리고 3㎍/㎖에서 CRA 동안 T 세포와 함께 사전 인큐베이션시켰다. NMS는 항체의 첨가를 위한 대조군으로서 작용하였고, 항체가 없는 웰을 정규화 목적을 위해 사용하였다. 항체가 없는 웰에 대해 특이적 용해를 정규화시켜 다음에 의해 정의되는 상대적 세포용해를 수득하였다: 상대적 세포용해(%) = (특이적 용해)항체를 지님/(특이적 용해)항체 없음 x 100. 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링시킨 3회 중복 정규화 CRA 측정으로부터의 평균 ± SD이다(n = 4 공여체). 통계학적 분석을 위해 본페로니 사후검정에 의한 이원분산분석을 사용하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 (C) 0.3, 1, 및 3㎍/㎖에서 항체를 지니는 다클론성 γδ T 세포에 의한 주카트(좌) 및 OC314(우) 세포의 세포 용해의 NMS에 의한 용량-의존적 저해(원), TCRγδ IM 항체(정사각형s), 또는 풀링시킨(삼각형) 항체(DNAM1, NKG2D, TCRγδ(B1), 및 TCRγδ(IM)에 대해 특이적). 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링 및 정규화시킨 3회 중복물로부터의 평균 ± SD(n = 4 공여체)이다.
도 18A 내지 도 18C. IL-2 및 IL-21과 함께 aAPC 상에서 증식/활성화된 다클론성 γδ T 세포 및 γδ T-세포 서브세트의 양자 전달 시 난소암의 생체내 클리어런 스. CAOV3-effLuc-mKate 종양 세포(마우스 당 3 × 106개)를 -제8일에 NSG 마우스 내로 i.p.로 주사하고 나서, PBS(비히클/모의) 또는 γδ T 세포를 이용하여 치료를 시작하였을 때 제0일까지 생착시켰다. 4개의 T-세포 용량을 제0일, 제7일, 제14일 및 제21일에 각각 3 × 106, 6 × 106, 10 × 106, 및 15 × 106개 세포와 함께 복강내로 투여하였다. (A) 비히클, Vδ1, Vδ2, Vδ1음성Vδ2음성, 및 다클론성 γδ T-세포 처리군에서 제0일(상부 패널) 또는 제72일(하부 패널)에서 BLI 이미지. 이미지는 두 독립적 실험으로부터의 6 내지 14마리 마우스를 나타낸다. (B) 제0일(검정색) 및 제72일(파랑색)에 마우스의 BLI 측정, 여기서 각각의 형상은 개개 마우스를 나타내고, 선은 평균이며(n = 6-14), 데이터는 두 독립적 실험으로부터 풀링된다. 통계학적 분석을 위해 스튜던트 대응표본 양측 t-검정을 수행하였고, p 값을 나타낸다. (C) 비히클(열린 정사각형) 또는 다클론성 γδ T 세포(꽉 찬 정사각형)로 처리한 마우스의 전반적인 생존. 게한-브레슬로우-윌콕손(Gehan-Breslow-Wilcoxon) 시험을 사용하여 p값을 계산하였다. H = 위험률.
도 19. 증강된 반딧불이 루시퍼라제 ( e ffLuc ) 및 mKate를 공동발현시키기 위해 사용한 DNA 플라스미드 pLVU3G - e ffLuc - T2A - mKateS158A의 개략도. 주석은, LTR: 긴 말단 반복부; HIV cPPT: HIV 중심 폴리퓨린관; B1: 게이트웨이 제공부위 B1; effLuc: 증강된 반딧불이 루시퍼라제; T2A: T2A 리보솜 슬립 부위; mKate S158A: 증강된 mKate 적색 형광 단백질; B2: 게이트웨이 제공부위 B2; HBV PRE: B형 간염 번역 후 조절 요소; HIV SIN LTR: HIV 자기-불활성화 긴 말단 반복부; ampR: 암피실린 내성(β-락타마제).
도 20. γδ T 세포의 단리 및 증식을 위한 대안의 프로토콜. 첫째로, CD56+ NK 세포 및 TCRαβ+ αβ T 세포는 마이크로비드를 사용하여 처음 추출된다. 남아있는 세포는 γδ T 세포 집단의 증식 및 확장을 선택적으로 촉진시키기 위해 aAPC의 존재 하에 인큐베이션시킨다.
도 21. γδ T 세포의 확장. 새로운 공여체 PBMC로부터의 CD3+ T 세포를 나타내며(좌측 패널), 대안의 단리 프로토콜을 이용하는 확장 후에 세포와 비교한다(우측 패널).
도 22. 췌장암 세포주 10.05 by γδ 및 αβ T 세포의 특이적 용해. 췌장암 세포주에 대해 효과기(다클론성 γδ T 세포) 대 표적(E:T) 비를 증가시키면서 표준 4시간 CRA를 수행하였다. 데이터는 두 독립적 실험으로부터의 평균± SD이다(n = 3 웰/분석).
인간 γδ T 세포는 천연 항-종양 면역을 갖지만, 임상에서 그들의 효용은, 다른 γδ T-세포가 종양을 인식하고 사멸시킬 수 있다고 해도, 하나의 계통(Vγ9Vδ2)으로 제한되어 있다. γδ T-세포 면역요법에 대한 다클론성 접근은 종양 표면 상에서 다중 리간드를 표적화하고 치료적 효능을 최대화할 수 있었다. 그러나, 다클론성 γδ T 세포의 임상적으로 적절한 확장은 아직 달성되지 않았다. 종양 표면 상에서 다중 리간드의 인식은 δ와 γ TCR 쇄의 이형이합체로 구성되는 γδ T 세포 표면 상에서 발현된 T 세포 수용체(TCR)에 의해 매개된다. 게다가, γδ T-세포 TCR은 주조직 적합성 복합체(MHC) 제한의 외부에서 항원을 인식하는데, 이는 αβ T 세포와 대조적으로 MHC와 관련하여 그들의 항원을 인식한다. 따라서, MHC 미스매치된 γδ T 세포는 관련없는 환자에게 제공될 수 있으며, 종양-반응성 T 세포의 보편적인 공급원으로서 작용한다. 이와 같이, 하나의 공여체로부터 생성된 γδ T 세포는 공여체와 HLA를 공유할 수도 있거나 또는 공유하지 않을 수도 있는 하나 이상의 동종이계 수용자에게 주입될 수 있다. 이는 "선반 재고(off-the-shelf)" 요법을 제공하는데, 이때 γδ T 세포는 사전준비되고 요구 시 주입될 수 있다.
γ와 δ쇄의 이형이합체로 구성된 T-세포 수용체(TCR)를 발현시키는 T 세포는 악성 세포를 사멸시키는 능력을 나타내지만, Vδ1 및 Vδ3 아이소타입을 발현시키거나 또는 다클론성 레퍼토리를 사용하는 세포의 직접적 사용은 아직 달성되지 않았다. 본 발명자들은 정해진 γδ TCR을 발현시키는 인간 T 세포를 임상적으로 흥미로운 수로 확장시키기 위해 K562 종양 세포주로부터 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 공학 처리하였다. 증식된 γδ T 세포는 그들이 Vγ2, Vγ3, Vγ7, Vγ8, Vγ9, Vγ10 및 Vγ11 TCR 쇄와 함께 Vδ1, Vδ2, Vδ3, Vδ5, Vδ7 및 Vδ8을 발현시킴에 따라 다클론성이었다. 나이브, 중추 기억 및 효과기 기억 T 세포의 집단은 각각 Vδ1, Vδ1음성Vδ2음성 및 Vδ2 TCR 쇄의 발현이 지배적이었다. 종양 세포를 용해시키는 T 세포의 효능은 분화 순서에 따랐다(Vδ2>Vδ1음성Vδ2음성>Vδ1). 난소암 이종이식물은 Vδ 서브세트 및 다클론성 γδ T 세포에 의해 상당히 제거되었는데, 이는 치료된 마우스의 전반적인 생존을 상당히 증가시켰다.
본 명세서에 제공된 방법은 (i) 다클론성 γδ T 세포를 생성하고, (ii) 빈도와 세포 생존도 둘 다에서 다른 기법에 비해 대단히 우수한 방식으로 Vδ1 서브세트의 확장을 제공하며, (iii) 독성 성분인 아미노비스포스포네이트를 이용하는 방법에 비해 우수한 생존도를 지니는 Vδ2 세포를 생성하고, (iv) Vδ1음성Vδ2음성 서브세트를 성공적으로 증식시켰다. 상기 방법에서 사용되는 aAPC는 임상 용도를 위해 즉시 이용가능하며, 따라서, 본 기술의 임상적 번역을 간소화한다. Vδ1 세포는 인간 내로 결코 직접 주입된 적이 없었다. Vδ1음성Vδ2음성 서브세트는 이제 인간에서 처음으로 시험될 수 있는 항-종양 면역을 가진다.
현재 개시된 aAPC 확장 기법은 시작량을 제한하고, (i) 순환 γδ T 세포의 제한된 시작량, (ii) 고정된 클로노타입에 대해 γδ T 세포 초기 집단의 분극, 및 (iii) γδ T 세포 증식을 지속하기 위해 다른 T 세포 유형, 즉, αβ T 세포에 대해 사용되는 확장 프로토콜의 불능의 현재의 장애를 제거하는 것으로부터 외견상 제한되지 않은 수의 다클론성 γδ T 세포를 증식시킬 수 있다. 현재 개시된 기법은 (i) 현재 임상적 GMP 시설에서 aAPC를 이용하는 것, (ii) 소용적의 말초혈 중에 존재하는 시작량으로부터 임상적으로 적절한 수(109개 초과의 세포)에 대해 다클론성 γδ T 세포를 수치적으로 확장시키는 aAPC의 능력, 및 (iii) 종양 세포 표면의 다중 분자를 표적화하는 동시에 요법으로부터 종양 탈출에 대한 기회를 최소화하고 치료 효능을 최대화할 가능성을 지니는 γδ T 세포의 하나 이상의 계통의 사용의 경쟁적 이점을 가진다. 이들 다클론성 γδ T 세포는 시험한 모든 종양 유형(ALL, CML, 결장암, 난소암, 췌장암)을 사멸시킬 수 있었지만, 비관련 개체로부터의 정상 조직(B 세포)에 대해 반응하지 않았다. 따라서, 고정 또는 목적으로 하는 레퍼토리를 지니는 다클론성 γδ T 세포의 거대 뱅크가 제조되고, 예를 들어 암의 치료를 위해 안전하게 관련없는 환자에게 제공될 수 있었다.
본 발명은 양자 T 세포 요법을 위한 세포 요법 생성물을 생성하며, 적어도 4개의 잠재적 용도를 가진다. 첫째로, 다클론성 γδ T 세포는 관련없는 개체에게 제공될 수 있는 종양 반응성 T 세포의 보편적 공급원으로서 사용될 수 있었다. 이는 T 세포의 보편적 공급원이 치료될 각각의 환자에 대해 자가 T 세포를 생성하는 것과 관련되는 비용을 감소시킬 수 있기 때문에 상업적 매력을 가진다. 둘째로, 다클론성 γδ T 세포는, 예를 들어, 특이적 종양 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 도입을 통해 그들의 종양 반응성을 증가시키도록 추가로 조작될 수 있다. 셋째로, 다클론성 γδ T 세포는 또한 항-바이러스 활성(거대세포바이러스(CMV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV))를 가지고, 면역저하된(immunocompromised) 환자, 예를 들어 조혈 줄기 세포 이식물(HSCT)을 받는 암환자에서 바이러스 감염 및/또는 기회감염의 보호를 위한 직접적 면역요법으로서 사용될 수 있다. 넷째로, 다클론성 γδ T 세포의 보편적 세트의 이식물은 박테리아 감염 및 패혈증의 제어에서 사용될 수 있다.
I. 면역계 및 면역요법
일부 실시형태에서, 의학적 장애는 면역 반응을 유발하는 다클론성 γδ T-세포 집단의 전달에 의해 치료된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 암 또는 감염은 면역 반응을 유발하는 다클론성 γδ T-세포 집단의 전달에 의해 치료된다. 따라서, 면역학적 반응의 기본적 이해가 필요하다.
적응성 면역계의 세포는 림프구로 불리는 백혈구의 유형이다. B 세포 및 T 세포는 주된 유형의 림프구이다. B 세포 및 T 세포는 동일한 다능성 조혈 줄기 세포로부터 유래되며, 그들이 활성화된 후까지 서로 구분되지 않는다. B 세포는 체액성 면역 반응에서 큰 역할을 하는 반면, T 세포는 세포-매개 면역 반응에서 직접적으로 수반된다. 그들은 T-세포 수용체(TCR)로 불리는 그들의 세포 표면 상에서 특이적 수용체의 존재에 의해 다른 림프구 유형, 예컨대 B 세포 및 NK 세포와 구별될 수 있다. 거의 모든 다른 척추동물에서, B 세포 및 T 세포는 골수 내 줄기 세포에 의해 생성된다. T 세포는 흉선으로 이동하고 흉선에서 발생되는데, 그들로부터 그들의 명칭이 유래된다. 인간에서, 림프구 풀의 대략 1% 내지 2%는 2차 림프성 조직 내에서 그들의 특이적 항원을 발견하기 위해 항원-특이적 림프구에 대한 기회를 최적화하도록 매시간 재순환된다.
T 림프구는 골수 내 조혈 줄기 세포로부터 생기며, 전형적으로 성숙까지 흉선샘으로 이동한다. αβ T 세포는 그들의 막 상에서 독특한 항원 결합 수용체(T-세포 수용체)를 발현시키는데, 다른 세포의 표면 상에서 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자와 관련하여 항원을 단지 인식할 수 있다. γδ T 세포는 αβ T 세포와는 다른 순환 T 림프구의 작은 서브세트이다. γδ T 세포는 외래 미생물, 또는 바이러스 감염 또는 암과 같은 스트레스에 의해 유도되는 내인성 세포 생성물 중 하나로부터 유래될 수 있는 펩타이드 항원과 비-펩타이드 항원을 둘 다 인식할 수 있다. αβ T 세포와 달리, γδ T 세포는 MHC-제한되지 않는다.
γδ T 세포는 αβ T 세포의 좋은 특이성 특징을 결여하기 때문에, 그들은 감염 및 종양에 대해 일선의 감시 기능을 제공하는 더 원시적인 면역 메커니즘을 나타내는 것으로 제안되었다(Boismenu et al., 1997). 몇몇 연구는 다양한 바이러스, 박테리아 및 기생충에 대한 γδ T 세포의 반응(Bukowski et al., 1994; Wallace et al., 1995; Lang et al., 1995; Elloso et al., 1996)뿐만 아니라 다양한 유래의 종양 세포의 용해를 매개하는 그들의 능력을 기록하였다(Zocchi et al., 1990; Kitayama et al., 1993; Choudhary et al., 1995). 이들 결과는 γδ T 세포가 암 및 감염성 질환의 치료에서 치료 가능성을 가질 수 있다는 것을 시사한다.
II. 실시형태에 관련된 방법 및 조성물
특정 양상에서, 본 발명은 다클론성 γδ T 세포를 인공 항원 제시 세포와 함께 배양시키는 단계를 포함하는 다클론성 γδ T 세포의 제조 및/또는 확장방법을 포함한다. 특정 양상에서, γδ T 세포는 1차 인간 γδ T 세포, 예컨대 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)로부터 유래된 γδ T 세포이며, PBMC는 G-CSF, 골수 또는 제대혈을 이용하는 자극 후에 수집된다. 세포는 aAPC와 함께 공동 배양에서 벌크 집단으로서 생체밖에서 며칠, 몇 주, 또는 수개월 동안 증식될 수 있다. 공동 배양은 103, 104, 105, 106, 107 또는 108개의 γδ T 세포, 또는 그로부터 유도가능한 임의의 수, 및 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 aAPC, 또는 그로부터 유도가능한 임의의 수에 의해 개시될 수 있다. 공동 배양은 γδ T 세포 대 aAPC의 비 1 대 2로 개시되는 것이 바람직하다.
γδ T 세포는 IL-2, 또는 통상의 감마쇄(예를 들어, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 및 기타)에 결합하는 기타 사이토카인에 의한 자극에 의해 확장될 수 있다. γδ T 세포의 확장은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 U/㎖의 IL-2에 의해 투여될 수 있으며; 바람직하게는 확장은 50U/㎖의 IL-2에 의해 자극된다. γδ T 세포의 확장은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100ng/㎖의 IL-21에 의해 자극될 수 있으며; 바람직하게는 상기 확장은 30ng/㎖의 IL-21에 의해 자극된다. 상기 자극은 1주당 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회, 바람직하게는 1주 당 3회로 일어날 수 있다. 추가 양상에서, 확장된 γδ T 세포는 동결보존될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, γδ T 세포는 치료가 필요한 개체, 예컨대 암 또는 감염을 가질 수 있는 개체에게 전달된다. 이어서, 세포는 각각의 암, 병원성 세포 또는 병원균 감염 세포를 공격하기 위해 개체의 면역계를 증강시킨다. 일부 경우에, 개체에게 γδ T 세포의 1회 이상의 용량이 제공된다. 개체에게 γδ T 세포의 2회 이상의 용량이 제공되는 경우에, 투여 사이의 지속기간은 개체에서 증식을 위한 시간을 허용하는데 충분하여야 하며, 구체적 실시형태에서, 용량 사이의 지속기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상이다. γδ T 세포는 환자에 대해 동종이계 또는 자가일 수 있다.
본 치료 방법이 유용한 종양은 임의의 악성 세포 유형, 예컨대 고형 종양 또는 혈액 종양에서 발견되는 것을 포함한다. 예시적인 고형 종양은 췌장, 결장, 막창자, 위, 뇌, 두부, 경부, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선 및 유방으로 이루어진 군으로부터 선택된 기관의 종양을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 혈액학적 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성종양, 백혈병, 림프종, 아세포종, 골수종 등의 종양을 포함한다. 본 명세서에 제공된 방법을 이용하여 치료될 수 있는 암의 추가적인 예는 폐암(소-세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함), 복막암, 위 또는 위 암(위장암 및 위장 기질암을 포함), 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장 또는 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암 및 흑색종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
암은 구체적으로는 다음의 조직학적 유형을 가질 수 있지만, 하기로 제한되지 않는다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화; 거대 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평세포 암종; 림프표피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행세포 암종; 유두상 이행세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성; 담도암종; 간세포 암종; 복합형 간세포 암종 및 담도암종; 육주상 선암종; 선양 낭포 암종; 선종폴립 내 선암종; 선암종, 가족성 용종증; 고형 암종; 유암종, 악성; 기관지-폐포 선암종; 유두상 선암종; 난염성 암종; 호산성 암종; 호산성 선암종; 호염기성 암종; 투명세포 선암종; 과립세포 암종; 소포성 선암종; 유두상 및 소포성 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신피질 암종; 자궁내막양 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지선 선암종; 귀지 선암종; 점막표피양 암종; 낭선종; 유두상 낭선종; 유두상 장액성 낭선종; 점액성 낭선종; 점액성 선암종; 인환세포 암종; 침윤성 관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 파제트병, 유선; 선방 세포 암종; 선편평 암종; 선암종 w/편평상피화생; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 난포막종, 악성; 과립막 세포종양, 악성; 남성아세포종, 악성; 세르톨리 세포 암종; 간질세포종, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방외 부신경절종, 악성; 갈색세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무흑색소성 흑색종; 표재 확산 흑색종; 흑색점 악성 흑색종; 말단 흑자성 흑색종; 결절성 흑색종; 거대색소 모반 내 악성 흑색종; 유상피세포 흑색종; 청색모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유성 조직구증, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아형 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 혼합종양, 악성; 뮐러 혼합종양; 신아세포종; 간아세포종; 암육종; 간엽소포종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상종양, 악성; 활막 육종; 중피종, 악성; 미분화세포종; 배아형 암종; 기형종, 악성; 난소갑상선종, 악성; 융모막 암종; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관주피세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 방피질성 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 간충직 연골육종; 골거대세포종; 유잉 육종; 치원성 종양, 악성; 사기질모세포성 치아육종; 에나멜상피종, 악성; 에나멜 아세포 섬유육종; 송과체종, 악성; 척색종; 신경교종, 악성; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 섬유질 성상세포종; 성모세포종; 교모모세포종; 핍지교종; 핍지모세포종; 원시 신경외배엽성; 소뇌 육종; 신경절모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 뇌수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경초종, 악성; 과립세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨; 부육아종; 악성 림프종, 소세포성 림프종; 악성 림프종, 거대세포, 미만성; 악성 림프종, 소포성; 균상식육종; 기타 명시된 비-호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저등급/소포성 비호지킨 림프종(NHL); 소세포성 림프종(SL) NHL; 중간 등급/소포성 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 소 비분할 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역 증식 소장병증; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구 백혈병; 골수성 육종; 모발세포 백혈병; 만성 림프구성백혈병(CLL); 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 급성 골수성 백혈병(AML); 및 만성 골수아구성 백혈병.
일부 양상에서, γδ T 세포는, 예를 들어, 제대혈, 말초혈, 인간 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기세포의 뱅크로부터 얻어진다. 치료적 효과를 위한 적합한 용량은 바람직하게는 일련의 투약 주기에서, 예를 들어, 적어도 105 또는 약 105 내지 약 1010개 세포/용량일 것이다. 예시적인 투약 요법은 제0일에 적어도 약 105개의 세포로 시작해서, 예를 들어 환자내 용량 상승 계획을 시작해서 몇 주 내에 약 1010개 세포의 표적 용량까지 증분적으로 상승하는 4회의 1주 투약 주기로 이루어진다. 적합한 투여 방식은 정맥내, 피하, 강내(예를 들어, 병원보유체-접근 장치에 의해), 복강내, 및 종양 덩어리 내로의 직접 주사를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 암 또는 감염성 질환을 치료하는데 유용한 다른 잘-확립된 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 단독으로 전달되든 다른 제제와 조합하여 전달되든, 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 경로를 통해 그리고 특정 효과를 달성하기 위해 포유류, 특히 인간, 신체의 다양한 부위에 전달될 수 있다. 당업자는 하나 이상의 경로가 투여를 위해 사용될 수 있다고 해도, 특정 경로가 다른 경로보다 더 즉시의 그리고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 국소 또는 전신 전달은 체강 내로 또는 근육내, 정맥내, 문맥내, 간장내, 복막, 피하 또는 진피내 투여를 포함하는 비경구 투여에 의한 제형의 적용 또는 점적주입을 포함하는 투여에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단위 제형으로 제공될 수 있되, 각각의 투약 단위, 예를 들어, 주사는 사전결정된 양의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성제와 적절한 조합으로 함유한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 단위 제형은 인간 및 동물 대상체에 대해 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 별도의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 사전결정된 양의 본 발명의 조성물을 단독으로 또는 목적으로 하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 다른 활성제와 조합하여, 적절하다면 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 비히클과 함께 함유한다. 본 발명의 신규한 단위 제형에 대한 명시는 특정 대상체에서 약제학적 조성물과 관련된 특정 약력학에 의존한다.
바람직하게는 유효량 또는 충분한 수의 단리된, 다클론성 γδ T 세포는 조성물 중에 존재하며, 장기간, 특이적, 항-종양 반응이 이러한 치료가 없는 다른 결과보다 종양 크기를 감소시키거나 또는 종양 성장 또는 재성장을 제거하기 위해 확립되도록 대상체 내에 도입된다. 바람직하게는, 대상체 내로 도입된 다클론성 γδ T 세포의 양은 다른 동일한 조건에 비교할 때 종양 크기의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 감소를 야기하되, 다클론성 γδ T 세포는 존재하지 않는다.
따라서, 투여되는 다클론성 γδ T 세포의 양은 투여 경로를 고려하여야만 하며, 목적으로 하는 치료 반응을 달성하기 위해 충분한 수의 다클론성 γδ T 세포가 도입될 수 있어야 한다. 더 나아가, 본 명세서에 기재된 조성물 중에 포함된 각각의 활성제의 양(예를 들어, 접촉될 각각의 세포 당 양 또는 특정 체중 당 양)은 적용이 상이하면 다를 수 있다. 일반적으로, 임의의 적합한 양이, 예를 들어 초과의 세포(예를 들어, 5 × 108개 초과의 세포), 또는 미만의 세포(예를 들어, 1 × 107 개 미만의 세포)를 이용하여 이용될 수 있다고 해도, 다클론성 γδ T 세포의 농도는 바람직하게는 적어도 약 1 × 106 내지 약 1 × 109 다클론성 γδ T 세포, 훨씬 더 바람직하게는, 약 1 × 107 내지 약 5 × 108 다클론성 γδ T 세포로 치료 중인 대상체에서 제공되기에 충분하여야 한다. 투약 스케줄은 웰-확립 세포 기반 요법에 기반할 수 있거나(예를 들어, Topalian and Rosenberg, 1987; 미국 특허 제4,690,915호), 또는 대안의 연속적 주입 전략이 사용될 수 있다.
이들 값은 본 발명의 실행을 위해 본 발명의 방법을 최적화할 때 실행자에 의해 이용될 다클론성 γδ T 세포 범위의 일반적 가이드를 제공한다. 특정 적용에서 보장될 바와 같이 본 명세서에서 이러한 범위의 인용은 결코 더 높은 양의 또는 더 적은 양의 구성성분의 사용을 불가능하게 하지 않는다. 예를 들어, 실제 용량 및 스케줄은 조성물이 다른 약제학적 조성물과 조합하여 투여되는지 여부에 따라서, 또는 약동학의 개체내 차이, 약물 소실(drug disposition) 및 대사에서 개체간 차이에 따라서 다를 수 있다. 당업자는 특정 상황의 존재에 따라 임의의 필수적 조절을 용이하게 만들 수 있다.
III. 인공 항원 제시 세포
일부 경우에, aAPC는 실시형태의 치료 조성물 및 세포 요법 생성물을 제조함에 있어서 유용하다. 항원-제시 시스템의 제조 및 사용에 관한 일반적 가이드에 대해, 예를 들어, 미국 특허 제6,225,042호, 제6,355,479호, 제6,362,001호 및 제6,790,662호; 미국 특허 출원 공개 제2009/0017000호 및 제2009/0004142호; 및 국제 특허 출원 공개 제WO2007/103009호를 참조한다.
aAPC 시스템은 적어도 하나의 외인성 보조 분자를 포함할 수 있다. 보조 분자의 임의의 적합한 수 및 조합이 사용될 수 있다. 보조 분자는 보조 분자, 예컨대 공자극 분자 및 부착 분자로부터 선택될 수 있다. 예시적인 공자극 분자는 CD86 및 B7.1을 포함하는데(B7.1는 이전에 B7로서 알려졌으며, 또한 CD80로서 알려졌음), 특히 T 세포의 표면 상에서 CD28 및/또는 CTLA-4 분자에 결합함으로써, 예를 들어 T-세포 확장, Th1 분화, 단기간 T-세포 생존 및 사이토카인 분비, 예컨대 인터류킨 (IL)-2에 영향을 미친다(문헌[Kim et al., 2004] 참조). 부착 분자는 탄수화물-결합 당단백질, 예컨대 셀렉틴, 막관통 결합 당단백질, 예컨대 인테그린, 칼슘-의존적 단백질, 예컨대 카데린, 및 단일 경로 막관통 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리 단백질, 예를 들어, 세포-대-세포 또는 세포-대-기질 접촉을 촉진시키는, 예컨대 세포내 부착 분자(ICAM)를 포함할 수 있다. 예시적인 부착 분자는 LFA-3 및 ICAMs, 예컨대 ICAM-1을 포함한다. 공자극 분자 및 부착 분자를 포함하는 예시적인 보조 분자의 선택, 클로닝, 제조 및 발현에 유용한 기법, 방법 및 시약은, 예를 들어, 미국 특허 제6,225,042호, 제6,355,479호, 및 제6,362,001호에서 예시된다.
다른 바람직한 실시형태에서, aAPC는 (예를 들어, 화학적 처리 또는 조사에 의해) 불활성화될 수 있고, 따라서 본질적으로 세포 성장 또는 복제는 불활성화 후에 일어나지 않는다. 따라서 불활성화는 aAPC의 중요한 APC 기능을 유지하는 한편, aAPC를 이용하여 개발된 세포 요법 생성물의 안전성에 관한 걱정을 완화시킨다. 가교 및 aAPC와 관련된 방법에 대해, 본 명세서에 참고로서 포함된, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2009/0017000호를 참조한다. 후속적으로, 불활성화된 aAPC 배양물은 다클론성 γδ T 세포의 치료적으로 효과적인 집단을 불활성화시키고 풍부하게 하는데 적절한 시간만큼 길게 유지될 수 있다.
IV. 키메라 항원 수용체
본 명세서에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 인공 T-세포 수용체 T-바디, 단일쇄 면역수용체, 키메라 T-세포 수용체, 또는 키메라 면역수용체를 지칭할 수 있고, 예를 들어, 특정 면역 효과기 세포 상에서 인공 특이성을 접합시키는 공학 처리된 수용체를 포함한다. CAR은 T 세포 상에 단클론성 항체의 특이성을 부여함으로써, 예를 들어 양자 세포 용법에서 사용하기 위해 다수의 특이적 T 세포가 생성되도록 사용될 수 있다. 구체적 실시형태에서, CAR은, 예를 들어 종양 관련 항원에 세포의 특이성을 향하게 한다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인, 및 길이가 다르고 종양 관련 항원 결합 영역을 포함할 수 있는 세포밖 도메인을 포함한다. 특정 양상에서, CAR은 단클론성 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편(scFv)의 융합을 포함하고, CD3-제타에 막관통 도메인 및 엔도도메인을 융합시켰다. 다른 CAR 설계의 특이성은 수용체(예를 들어, 펩타이드)의 리간드로부터 또는 패턴-인식 수용체, 예컨대 덱틴(Dectin)으로부터 유래될 수 있다. 특정 경우에, 항원-인식 도메인의 이격은 활성화-유도 세포사를 감소시키도록 변형될 수 있다. 특정 경우에, CAR은 추가적인 공자극 신호전달, 예컨대 CD3-제타, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10 및/또는 OX40에 대한 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 분자는 공자극 분자, 영상화를 위한 수용체 유전자(예를 들어, 양전자 단층촬영에 대해), 프로드러그의 첨가 시 T 세포를 조건적으로 제거하는 유전자 산물, 귀소 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인 및 사이토카인 수용체를 포함하는 CAR과 함께 공동발현될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "T-세포 수용체(TCR)"는 감마 및 델타(γ/δ) 쇄의 이형이합체로 구성된 T 세포 상의 단백질 수용체를 지칭한다. 본 발명의 실시형태에서, TCR은, 예를 들어, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포 및 감마 델타 T 세포를 포함하는, TCR을 포함하는 임의의 세포 상에서 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원"은 항체 또는 T-세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 추가적으로 B 및/또는 T 림프구의 생성을 야기하는 체액성 면역 반응 및/또는 세포의 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 실시형태는 항원-특이적 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드, 세포내 신호전달 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 신호전달 모티프를 포함하는 세포밖 도메인을 포함하는 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된 CAR(hCAR)을 포함하는 항원-특이적 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 비롯한 핵산을 수반한다. 특정 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 항원 사이의 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인식할 수 있다. 패턴 인식 수용체, 예컨대 덱틴(Dectin)-1은 탄수화물 항원에 대한 특이성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 결합 영역은 단클론성 항체의 상보성 결정 영역, 단클론성 항체의 가변 영역, 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 해당 특이성은 수용체에 결합되는 펩타이드(예를 들어, 사이토카인)으로부터 유래된다. 상보성 결정 영역(CDR)은 항원을 보충하는 항원 수용체(예를 들어, 면역글로불린 및 T-세포 수용체) 단백질의 가변 도메인에서 발견되는 짧은 아미노산 서열이며, 따라서 특정 항원에 대해 특이성을 지니는 수용체를 제공한다. 항원 수용체의 각각의 폴리펩타이드 쇄는 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다. 항원 수용체는 전형적으로 2개의 폴리펩타이드 쇄로 구성되기 때문에, 항원과 접촉될 수 있는 각각의 항원 수용체에 대해 6개의 CDR이 있다-각각의 중쇄 및 경쇄는 3개의 CDR을 함유한다. 면역글로불린 및 T-세포 수용체와 관련된 대부분의 서열 변이가 CDR에서 발견되기 때문에, 이들 영역은 때때로 초가변 도메인으로서 지칭된다. 이들 중에서, CDR3은 그것이 VJ(중쇄 및 TCR αβ 쇄의 경우에 VDJ)의 재조합에 의해 암호화됨에 따라 가장 큰 가변성을 나타낸다.
인간 CAR 핵산은 인간 환자에 대해 세포 면역요법을 증강시키는 인간 유전자라는 것이 상정된다. 구체적 실시형태에서, 본 발명은 전장 CAR cDNA 또는 암호 영역을 포함한다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 특정 인간 단클론성 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편(scFv)의 VH 및 VL쇄의 단편, 예컨대 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,109,304호에 기재된 것을 포함할 수 있다. 단편은 또한 인간 항원-특이적 항체의 다수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 더 구체적인 실시형태에서, 단편은 인간 세포에서 발현을 위해 인간 코돈 선호도에 최적화된 서열에 의해 암호화된 항원-특이적 scFv이다.
배열은 다량체, 예컨대 다이어바디(diabody) 또는 다량체일 수 있다. 다량체는 다이어바디로서 지칭된 것 내로 경쇄 및 중쇄의 가변 부분의 쌍을 교차시킴으로써 형성될 가능성이 크다. 작제물의 힌지 부분은 전체적으로 결실되는 것으로부터 제1 시스테인이 유지되고, 세린 치환보다는 프롤린으로 치환되며, 제1 시스테인까지 절단되는 것까지의 다수의 대안을 가질 수 있다. Fc 부분은 결실될 수 있다. 안정하고/하거나 이량체화되는 임의의 단백질은 이 목적을 위한 작용을 할 수 있다. Fc 도메인 중 단지 하나, 예를 들어 인간 면역글로불린으로부터의 CH2 또는 CH3 도메인을 사용할 수 있다. 또한 이량체화를 개선시키기 위해 변형된 인간 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있었다. 또한 면역글로불린의 힌지 부분만을 사용할 수 있다. 또한 CD8알파 부분을 사용할 수 있었다.
본 발명의 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포의 정상 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 초래하며, 이때 키메라 수용체가 위치되었다. 용어 "효과기 기능"은 분화된 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 나이브, 줄기-세포 유사, 기억 또는 기억 유형 T 세포에서 효과기 기능은 항원-의존적 증식을 포함한다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 도입하고 세포가 전문화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 보통 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 것이지만, 다수의 경우에, 전체 세포내 폴리펩타이드를 사용하는 것은 필수적이지 않을 것이다. 세포내 신호전달 도메인의 절단 부분이 용도를 발견할 수 있는 정도로, 이러한 절단 부분은 그것이 효과기 기능 신호를 도입하는 한 무결함 쇄 대신에 사용될 수 있다. 따라서 용어 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 도입하는데 충분한 세포 내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다. 예는 T-세포 수용체의 제타 쇄 또는 임의의 그의 상동체(예를 들어, 에타, 델타, 감마 또는 엡실론), MB1 쇄, B29, Fc RIII, Fc RI, 및 신호전달 분자의 조합물, 예컨대 CD3ζ 및 CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, OX40, 및 이들의 조합물뿐만 아니라 다른 유사한 분자 및 단편뿐만 아니라 ITAM을 변형시키는 것과 같은 신호전달 모이어티에 대한 돌연변이를 포함한다. 활성화 단백질 패밀리의 다른 구성원의 세포내 신호전달 부분, 예컨대 FcγRIII 및 FcεRI이 사용될 수 있다.
항원-특이적 세포밖 도메인 및 세포내 신호전달-도메인은 막관통 도메인, 에컨대 인간 IgG4Fc 힌지 및 Fc 영역에 의해 연결될 수 있다. 대안은 인간 CD4 막관통 도메인, 인간 CD28 막관통 도메인, 막관통 인간 CD3ζ 도메인, 또는 하나 이상의 시스테인-돌연변이된 인간 CD3ζ 도메인(들), 또는 다른 인간 막관통 신호전달 단백질로부터의 다른 막관통 도메인, 예컨대 CD16 및 CD8 및 에리트로포이에틴 수용체를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR 핵산은 다른 공자극 수용체, 예컨대 막관통 도메인 및 변형된 CD28 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 서열을 포함한다. 다른 공자극 수용체는 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10 및 4-1BB(CD137) 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. CD3ζ 에 의해 개시되는 1차 신호에 추가적으로, 인간 CAR 내에 삽입되는 인간 공자극 수용체에 의해 제공되는 추가적인 신호는 T 세포의 전체 활성화에 중요하며, 양자 면역요법의 생체내 지속 및 치료적 성공을 개선시킬 수 있었다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 단리된 핵산 세그먼트, 및 CAR을 암호화하는 DNA 서열을 혼입시키는 발현 카세트에 관한 것이다. 본 발명의 벡터는 주로 조절된 진핵생물 프로모터, 예를 들어, MNDU3 프로모터, CMV 프로모터, EF1알파 프로모터 또는 유비퀴틴 프로모터의 제어 하에서 면역 세포, 바람직하게는 T 세포에 목적으로 하는 유전자를 전달하기 위해 설계된다. 또한 벡터는 다른 이유가 없다면, 시험관내에서 그들의 조작을 용이하게 하기 위해 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 다른 실시형태에서, CAR은 DNA 주형으로부터 전사된 시험관내 mRNA로부터 발현될 수 있다.
키메라 항원 수용체 분자는 재조합체이며, 항원에 결합하고 그들의 세포질 꼬리에 존재하는 하나 이상의 면역수용체 활성화 모티프(ITAM)를 통해 활성화 신호를 도입하는 그들의 능력에 의해 구별된다. 항원-결합 모이어티(예를 들어, 단일쇄 항체(scFv)로부터 생성됨)를 이용하는 수용체 작제물은 "보편적"이 되는 추가적인 이점을 얻으며, 즉, 그들은 HLA-독립적 방식으로 표적 세포 표면 상에서 천연 항원과 결합한다. 예를 들어, 몇몇 연구실은 CD3 복합체의 제타쇄(ζ), Fc 수용체 감마쇄, 및 sky 타이로신 키나제의 세포내 부분에 대한 서열 암호에 융합된 scFv 작제물에 대해 보고하였다. CTL에 의한 종양 인식 및 용해를 포함하는 재지시된 T 세포 효과기 메커니즘은 몇몇 뮤린 및 인간 항원-scFv:ζ 시스템에서 보고되었다.
지금까지 비-인간 항원 결합 영역은 전형적으로 키메라 항원 수용체를 구성하는데 사용되고 있다. 비-인간 항원 결합 영역, 예컨대 뮤린 단클론성 항체를 이용하는 것에 의한 잠재적 문제는 인간 효과기 기능성의 결여 및 종양 덩어리 내로 침투하는 것의 불능이다. 다시 말해서, 이러한 항체는 보체-의존적 용해를 매개할 수 없거나 또는 항체-의존적 세포 독성 또는 CAR을 매개하는 세포를 파괴하기 위한 Fc-수용체 매개 식세포작용을 통해 인간 표적 세포를 용해할 수 없을 수도 있다. 더 나아가, 비-인간 단클론성 항체는 외래 단백질로서 인간 숙주에 의해 인식될 수 있고, 따라서, 이러한 외래 항체의 반복된 주사는 유해한 과민감 반응을 야기하는 면역 반응의 유도를 야기할 수 있다. 뮤린-기반 단클론성 항체에 대해, 이는 종종 인간 항-마웃스 항체(HAMA) 반응으로서 지칭된다. 따라서, 인간 항체의 사용은 그들이 뮤린 항체만큼 강한 HAMA 반응을 유발하지 않기 때문에 더 바람직하다. 유사하게, CAR에서 인간 서열의 사용은 면역-매개 인식을 회피하며, 따라서 수용자에 의해 야기되고 HLA와 관련하여 가공된 항원을 인식하는 내인성 T 세포에 의한 제거를 회피할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 a) 세포내 신호전달 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 항원 결합 영역을 포함하는 세포밖 도메인을 포함한다.
구체적 실시형태에서, CAR 내 세포내 수용체 신호전달 도메인은, 예를 들어 단독으로 또는 CD3제타와 연속해서 T 세포 항원 수용체 복합체, 예컨대 CD3의 제타쇄, 또한 Fcγ RIII 공자극 신호전달 도메인, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2의 신호전달 도메인을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 세포내 도메인(세포질 도메인으로서 지칭될 수 있음)은 TCR 제타쇄, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2R베타/CD122, IL-2R알파/CD132, DAP10, DAP12 및 CD40 중 하나 이상의 부분 또는 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인 내에서 내인성 T 세포 수용체 복합체의 임의의 부분을 사용한다. 하나 또는 다중 세포질 도메인이 사용될 수 있는데, 소위 제3 세대 CAR은, 예를 들어, 추가적 또는 상승적 효과를 위해 함께 융합된 적어도 2 또는 3개의 신호전달 도메인을 갖기 때문이다.
키메라 항원 수용체의 특정 실시형태에서, 수용체의 항원-특이적 부분(항원 결합 영역을 포함하는 세포밖 도메인으로서 지칭될 수 있음)은 종양 관련 항원, 또는 덱틴-1과 같은 패턴-인식 수용체에 의해 인식되는 탄수화물 항원을 포함하는 병원균-특이적 항원 결합 도메인을 포함한다. 종양 관련 항원은 그것이 종양 세포의 세포 표면 상에서 발현된다면, 임의의 종류를 가질 수 있다. 종양 관련 항원의 예시적인 실시형태는 CD19, CD20, 암태아성 항원, 알파태아단백, 타이로신-단백질 키나제 막관통 수용체(ROR)1, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, 상피성 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, CAR은 소량의 종양-관련 항원이 있을 때 지속성을 개선시키기 위해 막-결합 사이토카인과 함께 공동발현될 수 있다. 예를 들어, CAR은 막-결합 IL-15와 함께 공동발현될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포내 종양 관련 항원, HA-1, 서바이빈, WT1 및 p53은 표적화될 수 있다. 이는 HLA와 관련하여 세포내 종양 관련 항원으로부터 기재된 가공된 펩타이드를 인식하는 보편적 T 세포 상에서 발현된 CAR에 의해 달성될 수 있다. 추가로, 보편적 T 세포는 HLA와 관련하여 세포내 가공 종양 관련 항원을 인식하는 T-세포 수용체 쌍을 발현시키도록 유전자 변형될 수 있다.
병원균은 임의의 종류를 가질 수 있지만, 구체적 실시형태에서, 병원균은, 예를 들어, 진균, 박테리아 또는 바이러스이다. 예시적인 바이러스 병원균은 아데노바이러스과, 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 거대세포바이러스(CMV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), JC 바이러스, BK 바이러스, HSV, 바이러스의 HHV 패밀리, 피코르나바이러스과, 헤르페스바이러스과, 헤파드나바이러스과, 플라비바이러스과, 레트로바이러스과, 오르토믹소바이러스과, 파라믹소바이러스과, 파포바바이러스과, 폴리오마바이러스, 랍도바이러스과, 및 토가바이러스과의 패밀리의 바이러스 병원균을 포함한다. 예시적인 병원균 바이러스는 천연두, 인플루엔자, 볼거리, 홍역, 수두, 에볼라 및 풍진을 야기한다. 예시적인 병원성 진균은은 칸디다(Candida), 아스퍼질러스(Aspergillus), 크립토코커스(Cryptococcus), 히스토플라즈마(Histoplasma), 뉴모시스티스(Pneumocystis) 및 스타키보트리스(Stachybotrys)를 포함한다. 예시적인 병원성 박테리아는 스트렙토코커스(Streptococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 쉬겔라(Shigella), 캄필로박터(Campylobacter), 스타필로코커스(Staphylococcus), 헬레코박터(Helicobacter), 이콜라이, 리케챠(Rickettsia), 바실러스(Bacillus), 보르데텔라(Bordetella), 클라미디아(Chlamydia), 스피로체테스(Spirochetes) 및 살모넬라(Salmonella)를 포함한다. 일 실시형태에서, 병원성 수용체 덱틴-1은 진균의 세포벽 상에서 탄수화물 구조를 인식하는 CAR을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 덱틴-1의 특이성에 기반하여 CAR을 발현시키도록 유전자 변형된 T 세포는 아스퍼질러스(Aspergillus)를 인식하고, 균사 성장을 표적화할 수 있다. 다른 실시형태에서, CAR은 바이러스 감염 및 병리를 방해하기 위해 바이러스 결정소(예를 들어, CMV 및 에볼라로부터의 당단백질)를 인식하는 항체에 기반하여 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 병원성 항원은 CAR 내 세포밖 도메인이, 예컨대 덱틴-1을 통해 진균 세포벽의 탄수화물 패턴을 인식하는 아스퍼질러스 탄수화물 항원이다.
본 발명에 따른 키메라 면역수용체는 바람직하게는 그것이 재조합 DNA 기법을 이용하여 생성된다고 해도 임의의 공지된 수단에 의해 생성될 수 있다. 키메라 수용체의 몇몇 영역을 암호화하는 핵산 서열이 준비되며, 분자 클로닝의 표준 기법(게놈 라이브러리 선별, PCR, 프라이머-보조 결찰, 효모 및 박테리아로부터의 scFv 라이브러리, 부위-지정 돌연변이유발 등)에 의해 완전한 암호화 서열 내로 조립될 수 있다. 얻어진 암호화 영역은 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 발현 숙주 동종이계 T-세포주를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 핵산 작제물 또는 핵산 서열 또는 폴리펩타이드는 T 세포 내로 형질전환 또는 도입될 수 있고 산물(예를 들어, 키메라 항원 수용체)을 생성하기 위해 전사 및 번역될 수 있는 DNA 분자를 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명에서 사용되는 예시적인 핵산 작제물(폴리뉴클레오타이드)에서, 프로모터는 본 발명의 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되고, 즉, 그들은 키메라 수용체를 암호화하는 DNA로부터 전령 RNA의 전사를 촉진하도록 위치된다. 프로모터는 게놈 유래이거나 또는 합성적으로 생성될 수 있다. T 세포에서 사용하기 위한 다양한 프로모터(예를 들어, CD4 프로모터)는 당업계에 잘 공지되어 있다. 프로모터는, 유도가, 예를 들어 특이적 세포 유형 또는 특이적 수준의 성숙과 관련될 때, 구성적 또는 유도성일 수 있다. 대안적으로, 다수의 잘 공지된 프로모터가 또한 적합하다. 관심 대상의 프로모터는 β-액틴 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 인간 거대세포바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 및 프렌드 비장 병소 형성 바이러스 프로모터를 포함한다. 프로모터는 인핸서와 관련될 수도 있고 또는 관련되지 않을 수도 있되, 인핸서는 특정 프로모터와 자연적으로 관련될 수도 있고 또는 상이한 프로모터와 관련될 수도 있다.
키메라 수용체를 암호화하는 오픈 리딩 프레임의 서열은 게놈 DNA 공급원, cDNA 공급원으로부터 얻을 수 있거나, 또는 (예를 들어, PCR을 통해) 합성될 수 있거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 따라서, 인트론이 mRNA를 안정화하거나 또는 T 세포-특이적 발현을 제공한다는 것을 발견하기 때문에, cDNA 또는 이들의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, mRNA를 안정화시키기 위해 내인성 또는 외인성 비-암호화 영역을 사용하는 것이 더 유리할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 발현을 위해, 키메라 수용체의 N-말단 구성성분을 암호화하는 핵산 서열의 천연 유래 또는 내인성 전사 개시 영역은 표적 숙주에서 키메라 수용체를 생성하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 구성적 또는 유도성 발현을 허용하는 외인성 전사 개시 영역이 사용될 수 있되, 발현은 표적 숙주, 목적으로 하는 발현 수준, 표적 숙주 등의 특성에 따라서 제어될 수 있다.
마찬가지로, 키메라 수용체를 표면 막으로 보내는 신호 서열은 키메라 수용체의 N-말단 구성성분의 내인성 신호 서열일 수 있다. 선택적으로, 일부 예에서, 이 서열을 상이한 신호 서열로 교환하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 선택된 신호 서열은 T 세포의 분비 경로와 양립가능하여야 하며, 따라서 키메라 수용체는 T 세포의 표면 상에서 제시된다.
유사하게, 종결 영역은 키메라 수용체의 C-말단을 암호화하는 핵산 서열의 천연 유래 또는 내인성 전사 종결 영역에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, 종결 영역은 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 대부분에 대해, 종결 영역의 공급원은 일반적으로 재조합 단백질의 발현에 중요한 것으로 고려되지 않으며, 매우 다양한 종결 영역이 발현에 유해하게 영향을 미치는 일 없이 사용될 수 있다.
당업자에 의해 인식될 바와 같이, 일부 경우에, CAR 내 항원 결합 도메인의 말단에서 소수의 아미노산, 예를 들어 보통 10개 이하, 더 보통으로는 5개 이하의 잔기가 결실될 수 있다. 또한, 가장자리에서 소수의 아미노산, 보통 10개 이하, 더 보통으로는 5개 이하를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 아미노산의 결실 또는 삽입은 편리한 제한 부위, 조작의 용이함, 발현 수준의 개선 등을 제공하는 구성의 필요의 결과일 수 있다. 추가로, 하나 이상의 아미노산의 상이한 아미노산으로의 치환이 유사한 이유로 생길 수 있으며, 보통 임의의 하나의 도메인 내에서 약 5개 초과의 아미노산을 치환하지 않는다.
본 발명에 따른 키메라 수용체를 암호화하는 키메라 작제물은 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 대부분에 대해 천연 서열이 사용될 수 있기 때문에, 적절하다면 다양한 구성성분을 적절하게 결합시키기 위해 천연 유전자는 단리 및 조작될 수 있다. 따라서, 키메라 수용체의 N-말단 및 C-말단을 암호화하는 핵산 서열은 유전자의 원치않는 부분의 결실을 야기하는 적절한 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용함으로써 단리될 수 있다. 대안적으로, 클로닝된 유전자의 제한 소화는 키메라 작제물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 두 경우 중 하나에서, 평활말단이거나 또는 상보적 중복을 갖는 제한 부위를 제공하도록 서열이 선택될 수 있다.
키메라 작제물을 제조하기 위한 다양한 조작은 시험관내에서 수행될 수 있으며, 특정 실시형태에서, 키메라 작제물은 표준 형질전환 또는 형질감염 방법을 이용하여 적절한 숙주 내에서 클로닝 및 발현을 위해 벡터 내로 도입된다. 따라서, 각각의 조작 후에, DNA 서열의 결합으로부터 얻어진 작제물은 클로닝되며, 벡터는 단리되고, 서열이 목적으로 하는 키메라 수용체를 암호화한다는 것을 보장하도록 서열은 선별된다. 서열은 제한 분석, 서열분석 등에 의해 선별될 수 있다.
본 발명의 키메라 작제물은 이들 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나 또는 종양의 성장 또는 재성장을 방지함으로써 암을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에서의 적용을 발견한다. 따라서, 본 발명은 추가로 대상체의 단리된 T 세포 내로 본 발명의 키메라 작제물을 도입하고 형질전환된 T 세포를 대상체 내로 재도입함으로써 대상체 내 종양을 감소 또는 제거하는 항-종양 반응을 달성하는 것에 의해 대상체에서의 성장을 감소시키거나 또는 종양 형성을 방지하는 방법에 관한 것이다. 사용될 수 있는 적합한 T 세포는 세포독성 림프구(CTL) 또는 붕괴가 필요한 T 세포 수용체를 갖는 임의의 세포를 포함한다. 당업자에게 잘 공지되어 있는 바와 같이, 대상체로부터 이들 세포를 단리시키기 위한 다양한 방법을 용이하게 이용가능하다. 예를 들어, 세포 표면 마커 발현을 이용하거나 또는 상업적으로 입수가능한 키트(예를 들어, 일리노이주 락포드에 소재한 피어스사(Pierce)로부터의 아이소셀(ISOCELL)(상표명))를 이용함.
키메라 작제물은 네이키드 DNA로서 또는 적합한 벡터 내에서 대상체 자체의 T 세포 내로 도입될 수 있다는 것이 상정된다. 네이키드 DNA를 이용하는 전기천공법에 의해 T 세포를 안정하게 형질감염시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,410,319호를 참조한다. 네이키드 DNA는 일반적으로 발현을 위해 적절한 배향으로 플라스미드 발현 벡터 내에 함유된 본 발명의 키메라 수용체를 암호화하는 DNA를 지칭한다. 유리하게는, 네이키드 DNA의 사용은 본 발명의 키메라 수용체를 발현시키는 T 세포를 생성하는데 필요한 시간을 감소시킨다.
대안적으로, 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터)는 키메라 작제물을 T 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 비-바이러스 벡터, 예컨대 잠자는 미녀 시스템을 포함하는 수송에 참여하는 DNA 및 mRNA 종이 사용될 수 있다. 다른 플라스미드는 에피솜 플라스미드로서 존재하는 DNA 종을 포함한다. 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 적합한 벡터는 대상체의 T 세포에서 비-복제성이다. 바이러스에 기반한 다수의 벡터가 공지되어 있으며, 여기서, 세포 내에서 유지되는 바이러스의 복제수는 세포의 생존도를 유지하기에 충분히 낮다. 예시적인 벡터는 본 명세서에 개시된 pFB-neo 벡터(스트라젠(STRATAGENE)(등록상표))뿐만 아니라 HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV에 기반한 벡터를 포함한다.
일단 형질감염 또는 형질도입된 T 세포가 목적으로 하는 조절로 그리고 목적으로 하는 수준에서 표면 막 단백질로서의 키메라 수용체를 발현시킬 수 있다는 것이 확립되면, 키메라 수용체가 목적으로 하는 신호 유도를 제공하기 위해 숙주 세포 내에서 기능성인지의 여부를 결정할 수 있다. 후속적으로, 형질도입된 T 세포는 대상체 내에서 항-종양 반응을 활성화시키기 위해 대상체에게 재도입 또는 투여된다. 투여를 용이하게 하기 위해, 본 발명에 따른 형질도입된 T 세포는 약제학적 조성물로 제조되거나 또는 추가로 약제학적으로 허용가능할 수 있는 적절한 담체 또는 희석제와 함께 생체내 투여를 위해 적절한 이식물로 제조될 수 있다. 이러한 조성물 또는 이식물의 제조 수단은 당업계에 기재되었다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980)] 참조). 적절하다면, 형질도입된 T 세포는 그들의 각각의 투여 경로에 대해 보통의 방법으로 반고체 또는 액체 형태의 제제, 예컨대 캡슐, 용액, 주사, 흡입제 또는 에어로졸로 제형화될 수 있다. 당업계에 공지된 수단은 그것이 표적 조직 또는 기관에 도달될 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 방지 또는 최소화하기 위해 또는 조성물의 점진적 방출을 보장하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 키메라 수용체를 발현시키는 세포를 유발하지 않는 약제학적으로 허용가능한 형태가 사용된다. 따라서, 바람직하게는 형질도입된 T 세포는 평형염류용액, 바람직하게는 행크스 평형염류용액, 또는 정상 식염수를 함유하는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
V. 본 발명의 키트
본 명세서에 기재된 임의의 조성물이 키트에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 또한 세포를 확장시키는데 적합한 시약, 예컨대, 배지, aAPC, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함할 수 있는 키트에서 동종이계, 다클론성 γδ T 세포가 제공된다.
상기 키트는 하나 이상의 적합하게 분취된 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 조성물을 생성하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트의 구성성분은 수성 매질로 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 구성성분이 위치될 수 있고, 바람직하게는 적합하게 분취될 수 있는 적어도 하나의 바이러스, 시험관, 플라스크, 보틀, 주사기 또는 기타 용기 수단을 포함할 수 있다. 키트 내에 하나 이상의 구성성분이 있는 경우, 키트는 또한 일반적으로 추가적인 구성성분이 별도로 위치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가적인 용기를 함유할 것이다. 그러나, 구성성분의 다양한 조합이 바이알 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 다클론성 γδ T 세포 및 상업적 판매를 위해 밀폐되는 임의의 다른 시약 용기를 수용하기 위한 수단을 전형적으로 포함할 것이다. 이러한 용기는, 예를 들어 목적으로 하는 바이알이 보유되는 사출성형 또는 블로우 성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
VI. 실시예
다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 입증하기 위해 포함한다. 다음의 실시예에 개시되는 기법은 본 발명의 실행에서 제대로 작용한다는 것이 본 발명자에 의해 발견된 기법을 나타내며, 따라서 그의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어 다수의 변화가 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 비슷하거나 또는 유사한 결과를 개시하고 여전히 얻는 구체적 실시형태에서 이루어질 수 있다는 것을 인식하여야 한다.
실시예 1 - 암 면역요법에 대한 γδ T 세포의 서브세트
γδ T 세포가, 예컨대 K562 세포에 대해 내인성 항암 활성을 갖는다는 것을 고려하여(D'Asaro et al., 2010; Lamb et al., 1999), 본 발명자들은 종양 세포가 다클론성 γδ T 세포를 증식시키는 세포 기질의 역할을 하는지의 여부를 시험하였다. K562 세포는 생체밖에서 αβ T 세포 및 NK 세포를 활성화 및 수치적으로 확장시키기 위해 인공 항원 제시 세포(aAPC)로서 작용하도록 유전자 변형시켰다(Denman et al., 2012; Maus et al., 2002; Numbenjapon et al., 2006; Singh et al., 2013; Suhoski et al., 2007). 본 발명자들은 사이토카인과 조합한 γ-조사된 K562-유래 aAPC(클론 #4로 표기, CD19, CD64, CD86, CD137L, 및 막-결합 IL-15의 뮤테인을 공동발현시키도록 유전자 변형시킴; mIL15)가 Vγ2, Vγ3, Vγ7, Vγ8, Vγ9, Vγ10 및 Vγ11 TCR과 함께 Vδ1, Vδ2, Vδ3, Vδ5, Vδ7 및 Vδ8을 발현시키는 다클론성 T 세포의 증식을 지속시킬 수 있다는 것을 결정하였다. 본 발명자들은 이들 서브세트가 분화 상태(나이브, 중추 기억 및 효과기 기억)에 대해 상이하고, 종양 세포를 사멸시키는 그들의 능력이 다르다는 것을 입증한다. 이들 비교는 양자 면역요법, 암 생물학 및 면역학과 연루되었다.
aAPC 상에서 다클론성 γδ T 세포의 생체밖 수치적 확장은 공동 자극 및 사이토카인에 의존한다. γδ T 세포의 양자 전달은 말초혈 단핵세포(PBMC)로부터 시작하는 수가 제한적이기 때문에 생체밖 증식을 필요로 한다(림프구 풀 상에서의 개폐: 3.2% ± 1.2%; 평균 ± 표준 편차(SD); n = 4). PBMC로부터 단리된 γδ T 세포를 가용성 재조합 IL-2 및 IL-21의 존재 하에 공자극 분자를 발현시키도록 공학 처리된 γ-조사된 K562-유래 aAPC(클론 #4) 상에서 22일 동안 공동배양시켰는데, 이는 CD3 및 TCR γδ을 동종으로 공동발현시키는 T 세포 집단의 결과물을 생성하였다(97.9% ± 0.6%; 평균 ± SD; n = 4; 도 1A). NK 세포(CD3음성CD56+) 및 αβ T 세포(TCR αβ+)는 이들 배양물이 없었다(도 1B). 증식에 대한 이 접근은 3주 내에 106개 미만의 총 개시 세포로부터 109개 초과의 γδ T 세포를 수득하였는데(도 1C), 이는 4.9 × 103 ± 1.7 × 103 (평균 ± SD; n = 4) 배수 증가를 나타내었다. aAPC가 다클론성 γδ T 세포 증식을 뒷받침한다는 것을 나타내는 공동 배양 후에 TCRδ1+TCRδ2음성, TCRδ1음성TCRδ2+ 및 TCRδ1음성TCRδ2음성의 집단을 검출하였다(도 1F 및 도 1G). 따라서, aAPC 및 재조합 인간 사이토카인은 PBMC로부터 유래된 γδ T 세포의 적은 시작 수로부터 다클론성 γδ T 세포의 강한 수치적 확장을 뒷받침하였다.
aAPC에 대한 외인성 사이토카인의 첨가 및 공자극 분자(mIL15, CD86 및 CD137L)의 존재를 γδ T 세포의 결과물을 뒷받침하는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 모 K562 세포를 유전자 변형시켜 개개의 공자극 분자를 발현시키고 γδ T 세포의 증식에 대한 도입 준자의 영향을 평가하기 위하여 균질한 발현을 달성하도록 클로닝시켰다(도 2). 외인성 IL-2와 IL-21과의 공동 발현을 γδ T 세포 및 γ-조사된 K562의 5 세트를 이용하여 개시하였다: (i) 모, (ii) mIL15+, (iii) mIL15+CD86+, (iv) mIL15+CD137L+ 및 (v) mIL15+CD86+CD137L+ (클론 #4). γδ T 세포를 사이토카인과 병행하여 배양시켰고, APC는 가용성 IL-2 및 IL-21이 γδ T 세포의 단지 제한된 수치적 확장을 뒷받침하였다는 것을 입증하지 못하였다(도 1D). 모 K562 세포를 첨가할 때 증가된 증식은, 이들 세포 상에서 내인성 분자가 증식에 대해 γδ T 세포를 활성화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. CD86을 지니거나 또는 없는 mIL15의 발현은 모 K562에 비해 γδ T 세포가 증식되는 능력을 더 개선시키는 것으로 나타나지 않았다. 대조적으로, mIL15+CD137L+ 및 mIL15+CD86+CD137L+ aAPC의 공동배양에 의해 γδ T 세포의 상당히 더 높은 증식 속도를 관찰하였다. 따라서, CD137L은 사이토카인의 존재 하에 K562 세포 상에서 γδ T 세포의 증식을 지속하는데 중요한 것으로 나타난다. IL-2 및 IL-21이 클론 #4 상에서 공동 배양으로부터 제거되었을 때, γδ T 세포의 증식을 중단시켰고, 이들 사이토카인은 함께 γδ T 세포 증식 속도에 대해 추가적인 이점을 나타내었다(도 1E). 이는 생체밖 γδ T 세포의 증식을 유도하기 위해 IL-2와 IL-21 둘 다와 aAPC 클론 #4를 조합하는 접근을 입증하였다.
aAPC에 대한 신생아 γδ T 세포의 생체밖 수치적 확장. 동종이계 제대혈(UCB)을 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)을 겪고 있는 환자에서 조혈작용을 회복하기 위해 사용한다. 조혈작용을 회복하기 위해 수집한 UCB 단위 내에서 단핵세포의 제한된 존재비는 양자 전달을 위해 직접 이용가능한 신생아 γδ T 세포의 수를 축소시킨다. 따라서, 본 발명자들은 aAPC가 γδ T 세포의 감소된 시작 수로부터 증식을 지속하는지의 여부를 평가하였다. 형광 활성화 세포 정렬 분석(Fluorescence activated cell sorting: FACS)을 사용하여 104개의 UCB-유래 γδ T 세포(전형적인 UCB 단위의 ~0.01%)를 단리시켰고, 이를 IL-2 및 IL-21과 함께 aAPC 클론 #4 상에서 공동배양시켰다. 35일 후에, 평균 1011개의 UCB-유래 γδ T 세포(범위: 6 × 109 내지 3 × 1011; n = 5)가 104개로 시작하는 γδ T 세포로부터 증식됨에 따라 세포 수의 107-배 증가가 있었다(도 3A). 2회의 추가적인 자극을 UCB로부터 유래된 γδ T 세포에 대해 수행하여, 임상적으로 적절한 수로 증식을 위한 그들의 가능성을 강조하기 위해 PBMC와 비교하였다. γδ T-세포 집단은 CD3 및 TCRγδ의 균일한 공동 발현을 나타내었고(도 3B), TCRαβ+ T 세포(도 3C) 및 CD3음성CD56+ NK 세포(도 3D)는 없었다. 종합적으로, 이들 데이터는 IL-2 및 IL-21과 함께 사용할 때 aAPC 클론 #4가 작은 시작 집단으로부터의 UCB-유래 γδ T 세포의 생체밖 증식을 지속할 수 있다는 것을 입증한다.
γδ T 세포는 aAPC에 대한 증식 후에 다클론성을 발현시키고 TCRγδ 레퍼토리를 정하였다. γδ T 세포가 aAPC 상에서 수치적으로 확장될 수 있다는 것을 확립할 때, 본 발명자들은 증식 세포의 TCR 레퍼토리를 결정하는 것을 추구하였다. 여기서 γδ T 세포 내 TCR 발현의 다중도를 정량화하는 "직접적 TCR 발현 어레이"(DTEA)로 칭해지는 비-효소적 디지털 다중복합 어레이를 사용하여 aAPC-확장 γδ T 세포가 다클론성 TCR 레퍼토리를 나타내는지의 여부를 평가하였다(Zhang et al., 2012). 8종의 Vδ 대립유전자 중 4종(Vδ1, Vδ2, Vδ3 및 Vδ8)(도 4A)을 PBMC-유래 γδ T 세포에서 검출하였고, Vγ2, Vγ7, Vγ8(두 대립유전자), Vγ9, Vγ10 및 Vγ11과 함께 공동 발현시켰다(도 4B). 유사하게, PBMC로부터 Vδ2 세포의 존재비는 감소되고, Vγ2는 더 많았고, Vγ3, Vδ5 및 Vδ7 세포의 존재는 보이지 않았지만, Vδ 및 Vγ 쇄의 다클론성 TCR 레퍼토리를 UCB로부터 확장된 γδ T 세포에서 관찰하였다(도 4C 및 4D). 따라서, aAPC는 PBMC와 UCB 둘 다로부터 다클론성 TCR 레퍼토리를 유지하는 γδ T 세포를 확장시켰다.
본 발명자들은 TCRδ-특이적 항체를 지니는 다클론성 집단을 정렬시키고 단리시킨 배양물 상에서 DTEA를 반복함으로써 이들 mRNA 데이터를 입증하는 것을 추구하였다. 상업적으로 입수가능한 단지 2개의 TCRδ-특이적 mAb가 있으며, 그들은 Vδ1>Vδ1음성Vδ2음성>Vδ2 다음에 TCRδ 빈도를 이용하여 PBMC(도 1F 및 1G) 및 UCB(도 5)로부터의 aAPC-확장된 γδ T 세포 내에서 3개의 별도의 Vδ 집단(Vδ1: TCRδ1+TCRδ2음성, Vδ2: TCRδ1음성TCRδ2+, 및 Vδ1음성Vδ2음성: TCRδ1음성TCRδ2음성)을 동정하였는데, 이는 DTEA를 확증하였다. PBMC-유래 γδ T-세포 풀로부터의 FACS 단리된 서브세트는 별도의 집단으로서 클론 #4를 이용하여 증식시켰는데, 이는 TCRδ 아이소타입의 발현에 의해 평가한 바와 같이 그들의 동일성을 유지하였고(도 6A 및 도 6B), 정렬된 서브세트 간에 aAPC에 대한 증식 속도의 차이는 관찰되지 않았다(도 6C). DTEA는 이들 단리된 Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성 집단이 Vδ1*01(도 6D), Vδ2*02(도 6E) 및 Vδ3*01(도 6F) mRNA를 각각 우세하게 발현시켰다는 것을 입증하였다. 다른 Vδ2 대립유전자(Vδ1*01_07 및 Vδ1*01_75)의 발현은 다클론성 γδ T 세포(도 4A) 및 각각의 정렬된 서브세트가 없었다. 소량의 Vδ4 (도 7A), Vδ5(도 7B), Vδ6(도 7C) 및 Vδ7(도 7D) mRNA 종을 Vδ 발현을 위해 정렬시킨 T 세포의 3개 서브세트에서 검출하였다. Vδ8 mRNA는 정렬시킨 Vδ1음성Vδ2음성 세포에 배타적으로 존재하였고(도 7E), 이들 T 세포는 PBMC로부터의 벌크 γδ T 세포 내 Vδ8의 주된 기여자일 가능성이 있다(도 4A). 종합적으로, 이들 결과는 (i) 단리된 Vδ1 및 Vδ2 서브세트가 Vδ mRNA 발현에 대해 깨끗하다는 것을 나타내며, (ii) PBMC로부터의 TCRδ1음성TCRδ2음성 γδ T 세포가 Vδ3 및 Vδ8 mRNA를 주로 발현시켰다는 것을 입증하며, (iii) Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성 T-세포 서브세트는 aAPC 상에서 별도로 증식될 수 있다는 것을 확립하였다.
이어서, 각각 3개의 단리된 Vδ 서브세트 내에서 대립유전자 쌍 및 Vγ 레퍼토리에 대한 통찰을 얻기 위해 DTEA를 사용하여 Vγ TCR 사용을 평가하였다. 전반적으로, Vδ1 및 Vδ1음성Vδ2음성 서브세트는 Vγ 쇄와 그들의 쌍이 다르지 않았지만(p = 0.419; 이원 ANOVA), Vγ 발현은 Vδ1 T 세포(p < 0.0001)와 Vδ1음성Vδ2음성 T 세포 둘 다에 비해 Vδ2 T 세포에서 유의하게 달랐다(p < 0.0001). 이는 또한 각각의 Vγ 대립유전자에 대한 경향에서 관찰되었는데, 여기서 Vδ1 및 Vδ1음성Vδ2음 성 T 세포는 Vδ2 T 세포와 달랐다(도 8). 사실, Vγ2*02(도 8B), Vγ8*01M(도 8G), Vγ*01X(도 8H), Vγ9*01(도 8I) 및 Vγ9*02(도 8J) mRNA 종의 존재비에 대해 Vδ 서브세트 사이에 유의한 차이가 검출되었다. 따라서, 각각의 Vδ 서브세트 내에서 다양한 Vγ mRNA 사용은 IL-2 및 IL-21과 함께 aAPC 상에서 증식 시 달성된 다클론성 레퍼토리를 강화시켰다. 본 발명자들의 지식에 대해, 이는 지금까지 Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성 서브세트를 발현시키는 T 세포 중에서 Vγ 사용의 가장 상세한 평가이다.
증식된 γδ T-세포 서브세트는 그들의 치료 가능성을 예측하는 별도의 마커 를 발현시킨다. T-세포 기능, 예컨대 기억, 귀소 및 세포용해를 그들의 표면 표현형에 의해 예측할 수 있다. 본 발명자들은 다클론성 γδ T 세포를 특정규명하기 위한 마커의 패널을 탐구하였다(도 9). aAPC에 대한 공동 배양의 22일 후에, 모두는 아니지만 대부분의 γδ T 세포는 CD4음성CD8음성이었다. 이들 T 세포는 CD38 및 CD95의 발현에 의해 측정한 바와 같이 활성화되었지만, CD57의 발현 및 예정된 사멸-1(programmed death-1: PD-1)의 부재에 의해 증명되는 바와 같이 고갈시키지 않았다. 대부분의 세포는 CD27 및 CD28 공자극 리간드를 발현시켰고, 나이브(CD45RA) 마커 이상으로 항원-경험(CD45RO)에 대한 선호가 있었다. 피부, 림프절 및 골수에 대한 귀소를 위한 그들의 가능성은 각각 CCR4, CCR7/CD62L 및 CXCR4/CLA의 발현에 의해 입증되었다. 이들 데이터는 활성화된 γδ T 세포를 증식시키는 aAPC의 능력과 일치되며, 항원은 기억 형성 및 조직에 대한 귀소를 위한 가능성을 경험하였다.
증식에 대한 본 발명자들의 접근은 그들이 Vδ1, Vδ2와 Vδ1음성Vδ2음성 계통 간을 구별할 수 있게 하며, 따라서 그들은 γδ T 세포의 하위 집단이 그들의 치료 가능성을 예측하는 마커 발현에서 별도의 차이를 가질 수 있는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 TCRγδ에 대한 mAb 염색 강도가 별도의 MFI를 지니는 집단을 동정하였다는 것을 주목하였다(도 1A). Vδ2 T 세포는 TCRγδ저 그룹화에 대응하며(43 ± 9; 평균 ± SD; n = 4), Vδ1음성Vδ2음성 T 세포가 TCRγδ중간 그룹화에 대응하고(168 ± 40), Vδ1 T 세포는 TCRγδ고 그룹화에 대응한다(236 ± 56)(도 10A 및 도 10B). CD4 및 CD8은 통상적으로 γδ T 세포 상에서 발현되지 않지만, 분리된 서브세트 내 CD4 및 CD8의 발현에서 변이가 검출되었다(도 10C 및 도 10D). Vδ2 세포와는 별개의 것으로서 Vδ1 및 Vδ1음성Vδ2음성 집단을 나타낸 CCR7/CD62L(도 10E) 및 CD27/CD28(도 10F)을 포함하는 αβ T 세포 중에서의 기억을 기재하기 위해 사용한 정규 마커의 발현에서 차이를 관찰하였다. 그러나, CD27 및 CD45RA의 발현에 기반하여 인간 γδ T-세포 기억을 보고하였고(도 10G), 여기서 CD27+CD45RA+, CD27+CD45RA음성, CD27음성CD45RA음성 및 CD27음성CD45RA+는 TN, TCM, TEM 및 TEMRA에 각각 대응한다(Caccamo et al., 2011; Pang et al., 2012). 대부분의 TN 세포는 Vδ1이며, 대부분의 TCM은 Vδ1음성Vδ2음성이고, 대부분의 TEM 세포는 Vδ2이며, 모든 Vδ 서브세트는 적어도 일부의 TN, TCM 및 TEM 집단을 가졌다. 대조적으로, 사실상 임의의 Vδ 서브세트에서 TEMRA는 검출되지 않았다(도 10G 및 도 10H). 이들 상이한 면역표현형을 고려하면, 본 발명자들은 상이한 기능적 속성이 3종의 γδ T-세포 서브세트에 기인할 수 있다는 것을 제안한다.
γδ T-세포 서브세트는 종양에 대한 반응에서 생성된 인터페론-γ를 예측한 다. γδ T 세포는 활성화에 반응하여 사이토카인을 생성할 수 있다. 따라서, aAPC-증식된 γδ T 세포가 요법 동안 염증성 환경을 조성하는지의 여부를 결정하기 위해 사이토카인 및 케모카인의 다중복합 분석을 수행하였다. TCR 활성화를 모방하기 위해 백혈구 활성화 칵테일(LAC)로서 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) 및 이노마이신을 사용하였다. 배지를 이용한 세포 모의-활성화는 음성 대조군으로서 작용하였다. LAC-처리 γδ T 세포로부터 TH2 사이토카인 IL-4, IL-5 및 IL-13의 유의한 생성은 관찰되지 않았지만, 기준으로부터 IL-10 생성의 적은 증가가 있었다(도 11A). 대조적으로, IL-1RA, IL-6 및 IL-17은 TH17 염증성 반응과 일치되는 LAC-처리 γδ T 세포에 의해 유의하게 분비되었다(도 11B). 게다가, 프로-염증성 TH1 사이토카인 IL-2, IL-12(p70), 인터페론-γ(IFNγ) 및 종양 괴사 인자-α(TNFα)는 모의-처리 대조군에 비해 LAC에 대한 노출 시 γδ T 세포에 의해 유의하게 생성되었다(도 11C). 케모카인 CCL3(대식세포 염증성 단백질-1α; MIP1α), CCL4 (MIP1β) 및 CCL5(활성화에 대해 조절된 정상 T-세포 발현 및 분비(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted; RANTES)를 존재비에서 검출하였다(도 11D). CCR5는 이들 케모카인 중 모두 셋에 결합하지만(Rostene et al., 2007), γδ T 세포의 단지 6% ± 2%(평균 ± SD; n = 4)는 이 수용체를 발현시켰다. 응집에서, γδ T 세포의 비-특이적 활성화는 세포 기반 면역요법에 대해 바람직한 바와 같이 크게 전염증성 반응을 야기하였다.
IFNγ는 모든 평가한 사이토카인 중에서 가장 반응성이었으며(도 11C) 종양에 대한 γδ T-세포 반응에 대한 마커로서 선택하였다. 세포내 사이토카인 발현을 사용하여 유세포 분석법에 의해 Vδ T 세포 서브세트를 분리시켰고, 종양에 대한 그들의 반응을 평가하였다(도 12A 내지 도 12C). 난소암 세포와 함께 aAPC-증식/활성화된 다클론성 γδ T 세포의 공동 배양은 각각 855 ± 475, 242 ± 178 및 194 ± 182(평균 ± SD; n = 4)의 IFNγ MFI에 의해 나타낸 바와 같이 Vδ2 > Vδ1 > Vδ1음성Vδ2음성 후에 IFNγ 생성의 체계를 야기하였다(도 12D). IFNγ의 생성은 TCRγδ 중화 항체에 의해 차단되었는데, 이는 종양에 대한 이런 사이토카인 반응이 각각의 γδ T-세포 서브세트에서 TCRγδ를 통해 매개되었다는 것을 시사하였다(도 12D 내지 도 12F). 이들 데이터는 사이토카인 반응이 그의 TCRγδ에 의해 동정한 바와 같이 γδ T 세포 서브타입에 의존적이라는 전제를 뒷받침한다.
다클론성 γδ T 세포 및 Vδ T 세포 서브세트는 광범위한 종양 세포를 용해시킨다 . aAPC-증식/활성화된 γδ T 세포가 전염증성 매개체를 생성하기 위해 활성화될 수 있다는 것을 확립한 후에, 본 발명자들은 광범위한 종양 세포주를 용해시키는 그들의 능력을 시험하였다(도 13 및 도 14). 다클론성 γδ T 세포는 자가 또는 동종이계 정상 B 세포에 대해 사실상 세포용해를 나타내지 않았지만, 동종이계 B-세포 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 세포주 RCH-ACV 및 cALL-2를 사멸시킬 수 있었다. T-세포 ALL 세포주 주카트는 또한 세포용해에 대해 민감하였는데, 이는 γδ T 세포가 B-세포와 T-세포 악성 종양을 표적화하기 위해 사용될 수 있었다는 것을 시사하였다. 카수미-3은 γδ T 세포에 의해 사멸된 CD33+CD34+ 미분화 백혈병 세포주인데, γδ T 세포에 의해 최소로 분화된 종양을 표적화한다는 것을 뒷받침한다. 만성 골수성 백혈병(CML) 세포주 K562 및 K562-유래 클론#4 aAPC를 다클론성 γδ T 세포에 의해 사멸시켰다. 결장 암종 세포주 HCT-116과 같이 췌장암 세포주, BxPc-3, CaPan-2, MiaPaCa-2 및 Su8686을 γδ T 세포에 의해 용해시켰다. 10종의 난소 세포주를 민감도가 감소되는 다음의 순서로 다클론성 γδ T 세포에 의해 사멸시켰다: CAOV3 > EFO21 > UPN251 > IGROV1 > OC314 > Hey > A2780 > OVCAR3 > OAW42 > EFO27. 이들 세포용해 데이터는 시험관내에서 광범위한 종양을 특이적으로 사멸시키는 동종이계 다클론성 γδ T 세포의 능력을 강조한다.
본 발명자들은 다음에 3개의 분리된 γδ T-세포 집단의 사멸 가능성을 결정하였다. 혈액학적(주카트) 및 K562 및 고형(OC314 및 CAOV3) 종양 세포주는 모두 3개의 Vδ 계통에 의해 용해되었다(도 15). 별도의 용해 순서를 순위 Vδ2>>Vδ1음성Vδ2음성>Vδ1를 이용하여 모든 표적에 대해 관찰하여 4시간 분석에서 사멸 가능성을 정하였다(도 15). 이는 Vδ2>Vδ1음성Vδ2음성>Vδ1 다음에 TEM 세포의 빈도로서 T-세포 분화 면역표현형과 일치되었고(도 10H) TEM 세포는 덜 분화된 T 세포에 비해 더 높은 효과기 가능성을 갖는 것으로 보고되었다(2007년 6월). Vδ 서브세트와 종양 세포 사이의 공동 발현 48시간 후에 사멸을 평가하기 위해 장기간 분석을 취하였다(도 16). CAOV3 및 UPN251 종양 세포의 95% 초과가 2일 내에 모두 3개의 서브세트에 의해 제거되었다. 종합적으로, Vδ1음성Vδ2음성 하위-집단의 상이한 효율 및 항-종양 활성을 처음에 관찰하였지만 이들 데이터는 aAPC 상에서 증식된 각각의 Vδ 계통이 종양을 용해시킬 수 있다는 것을 확립하였다.
종양 용해의 효율은 TCRγδ , NKG2D 및 DNAM1에 의해 영향을 받는다. 본 발명자들은 T 세포에 의한 세포용해가 항체에 의해 수용체를 차단시킴으로써 TCRγδ에 직접적으로 의존하는지의 여부를 결정하는 것을 추구하였다. 실험적 접근은 γδ T 세포가 DNAM1 및 NKG2D를 공동발현시킨다는 것을 고려하였는데(도 17A), 이는 사멸을 위해 T 세포와 NK 세포를 둘 다 활성화시킬 수 있다(Bauer et al., 1999; Gilfillan et al., 2008). NKG2D, DNAM1 및 TCRγδ에 특이적인 항체(클론 B1)는 주카트 및 OC314 세포의 용해를 감소시킴에 있어서 최소 영향을 가졌다. 대조적으로, 항체 차단 TCRγδ(클론 IM)는 주카트와 OC314 세포 둘 다의 사멸을 감소시켰다(도 17B). 항체의 풀(NKG2D, DNAM1, TCRγδ와 결합)은 용량 의존적 방석으로 주카트(65% ± 8%의 감소) 및 OC314(71% ± 10%의 감소) 세포(도 17B 및 도 17C)의 γδ T-세포 매개 세포용해의 추가 감소를 야기하였다. 응집에서, 이들 결과는 사멸을 위한 aAPC-증식/활성화된 γδ T 세포의 활성화가 다원적이지만, TCRγδ에 의존적이라는 것을 입증하였다.
확립된 난소암 이종이식물은 γδ T 세포의 양자 전달에 의해 제거된다. 인간암에 대한 면역요법으로서 aAPC-증식/활성화된 다클론성 γδ T 세포의 양자 전달을 제안한다. 이를 모델링하기 위해, NSG 마우스에 CAOV3-effLuc-mKate 난소암 세포의 복강내(i.p.) 주사를 투여하였고, 이어서, 처리군에 대해 무작위화하였다. 생착 8일 후에, 비히클, Vδ1, Vδ2, Vδ1음성Vδ2음성 또는 다클론성 γδ T 세포 중 하나를 마우스에 복강내로 (용량을 상승시키면서) 투여하였다(도 18). 비침습적 생발광 영상화(BLI)를 이용하는 실험 동안 종양 부하를 연속적으로 모니터링하였다. 확립된 종양(도 18A 상부 패널 및 도 18B)은 비히클(모의) 치료 마우스에서 성장을 계속하였지만, Vδ1(p = 0.001), Vδ2(p < 0.001), Vδ1음성Vδ2음성(p < 0.001), 및 다클론성(p < 0.001) γδ T 세포로 치료한 마우스에서 유의하게 감소되었다(도 18A 하부 패널 및 도 18B). 다클론성 γδ T 세포에 의한 치료는 모의-치료 마우스에 비해 전반적인 생존이 개선되었으며(p = 0.0001), 여기서 마우스의 90%는 난소암 이종이식에서 생존하였고, 치료가 없는 마우스에 대한 위험률은 20.4였다(도 18C). 이는 3종의 Vδ 서브세트가 생체내에서 종양을 표적화하는 그들의 능력을 비교한 첫 번째 시간이며, 생체내 항-종양 활성에 대해 Vδ1음성Vδ2음성 T 세포의 첫 번째 평가이다. 요컨대, γδ T 세포는 생체내 암을 치료함에 있어서 효과적이었으며, 따라서 세포-기반 암 치료에 대해 매력적인 접근을 나타낸다.
실시예 2 - 재료 및 방법
세포주 및 세포 배양. HCT-116(카탈로그 번호 CCL-247), 카수미-3(카탈로그 번호 CRL-2725) 및 K562(카탈로그 번호 CCL-243) 세포주를 미국 미생물 보존센터(ATCC; 버지니아주 매너서스에 소재)로부터 획득하였다. 주카트(카탈로그 번호 ACC 282) 세포주를 독일 생물 자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen: DSMZ; 독일)로부터 받았다. K562는 앞서 기재한 바와 같이 aAPC(클론 #4)로서 기능하도록 유전자 변형되었다(Manuri et al., 2010; Singh et al., 2011). B-세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL) 세포주 cALL-2 및 RCH-ACV 세포주는 제프 티너 박사(Dr. Jeff Tyner)(OHSU)로부터 얻었고, 췌장암 세포주(BxPC-3, CaPan-2, MiaPaCa-2 및 Su8686)는 비지 라마찬드란 박사(Dr. Viji Ramachandran)에 의해 제공받았고(MDACC), 난소암 세포주(A2780, CAOV3, EFO21, EFO27, Hey, IGROV1, OAW42, OC314, OVCAR3 및 UPN251)는 로버트 씨 바스트 주니어(Robert C. Bast, Jr.)(MDACC)에 의해 제공받았다. 세포 배양물을 (i) RPMI(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 깁코(Gibco)): K562 모세포, aAPC 클론 #4, aAPC 클론 A6, aAPC 클론 A3, aAPC 클론 D4, 주카트, cALL-2, RCH-ACV, 카수미-3, A2780, EFO21, EFO27, Hey, IGROV1, OC314, OVCAR3 및 UPN251, (ii) DMEM(미조리주 세인트 루이스에 소재한 시그마(Sigma)): 293-METR, CAOV3, BxPC-3, CaPan-2, MiaPaCa-2, OAW42 및 Su8686, 또는 (iii) 맥코이의 5A(시그마): HCT-116에서 유지하였다. 각각의 배지를 10% 열-불활성화 태아 소 혈청(유타주 로건에 소재한 하이클론(Hyclone) 및 1% 글루타맥스(GLUTAMAX)(등록상표)-100(깁코)로 보충하였다. UPN251 및 OAW42 세포를 인슐린-트랜스페린-셀레늄 용액(깁코)으로 보충하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2를 이용하는 습윤화된 조건 하에서 배양시켰다.
γδ T 세포의 증식. 사전 동의를 받은 후에 말초혈 단핵세포(PBMC) 및 제대혈(UCB)을 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)(GE 헬스케어)에 의해 건강한 지원자로부터 단리시켰다(Singh et al., 2008). 108개의 해동시킨 PBMC를 CD56 마이크로비드(카탈로그 번호 130-050-401, 캘리포니아주 오번에 소재한 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))으로 처음에 처리하고 나서, LS 칼럼(카탈로그 번호 130-042-401, 밀테니 바이오텍) 상에서 분리시켜 배양물로부터 NK 세포를 고갈시켰다. 이어서, CD56 고갈 정렬로부터 비표지 세포를 TCRγ/δ+ T-세포 단리 키트(카탈로그 번호 130-092-892, 밀테니 바이오텍)로 표지하고 나서, LS 칼럼 상에 두어서 자기에 부착시킨 다른 세포로부터의 비표지 분획에서 γδ T 세포를 분리시켰다. γδ T 세포를 완전 배지(CM; RPMI, 10% FBS, 1% 글루타맥스(GLUTAMAX)(등록상표))에서 외인성 IL-2(알데류킨(Aldeleukin); 스위스에 소재한 노바티스; 50U/㎖, aAPC 첨가일에 시작하여 주당 3회 첨가) 및 IL-21(카탈로그 번호 AF20021; 뉴저지주 록키 힐에 소재한 페프로테크(Peprotech); 30ng/㎖, aAPC 첨가일에 시작하여 주당 3회 첨가)의 존재 하에 1개의 T 세포 대 2회의 γ-조사된(100 Gy) aAPC(클론 #4)의 비로 자극하였다. 세포를 가용성 사이토카인의 존재 하에 2 내지 5주 동안 7주마다 aAPC의 첨가에 의해 연속적으로 재작하였다. T-세포 배양물에 대한 첨가 전에 aAPC 클론 #4에 대한 CD19, CD64, CD86, CD137L 및 eGFP(IgG4 Fc에 대해 프레임 내에 융합된 IL-15 펩타이드는 만연하였고, eGFP와 함께 공동발현시킴)의 공동 발현의 확인을 수행하였다(Singh et al., 2011). 형광 활성화 세포 정렬(FACS)을 사용하여 Vδ1 (Vδ1+Vδ2음성), Vδ2(Vδ1음성Vδ2+) 및 Vδ1음성Vδ2음성 (Vδ1음성Vδ2음성) 집단을 단리시켰고, 이를 aAPC 클론 #4, 표현형에 의해 상기와 같이 2회 자극하고 나서, 기능 분석을 위해 사용하였다. UCB-유래 γδ T 세포를 항-TCRγδ 및 항-CD3 mAb를 이용하여 해동시킨 단핵세포로부터 FACS에 의해 단리시켰으며 PBMC에 따라 aAPC/사이토카인에 대해 5주 동안 자극하였다.
aAPC에 대한 γδ T 세포의 공동 발현. 증식을 위해 사이토카인 상에서 γδ T 세포의 의존도를 평가하기 위하여, 공동배양을 105개 γδ T 세포 및 2 × 105개 aAPC(클론 #4)에 의해 개시하였고, 이어서, 동일 용적의 (i) CM, (ii) CM 및 100U/㎖ IL-2, (iii) CM 및 60ng/㎖ IL-21, 또는 (iv) CM, 100U/㎖ IL-2, 및 60ng/㎖ IL-21에 첨가하였다. 수율을 결정하기 위해 공동 배양을 개시하고 9일 후에 T 세포를 셀로미터(CELLOMETER)(등록상표) 오토 T4 세포 계수기(매사추세츠주 로렌스에 소재한 넥스셀롬(Nexcelom))를 이용하여 열거하였다. 하나 이상의 공자극 분자를 이용하여 K562 세포를 유전자 변형시켜 3개의 새로운 aAPC를 생성하였다(도 2). IL-15Rα 및 SB11 트랜스포사제에 대해 프레임 내에 융합된 IL-15 펩타이드를 발현시키는 잠자는 미녀(SB) 트랜스포존을 뉴클레오펙터(NUCLEOFECTOR)(등록상표) II(스위스 바젤에 소재한 론자(Lonza) 및 키트 V(카탈로그 번호 VCA-1003, 론자)를 이용하는 뉴클레오펙션에 의해 모 K562 세포(CD86음성 및 CD137L음성) 내로 공-전기 전달하였다. FACS를 사용하여 mIL15+ 세포를 단리시키고, 클론(클론 A6로 표기; mIL15+CD86음성CD137L음성)을 확립하고, 이어서 CD86 또는 CD137L을 발현시키는 SB11 및 SB 트랜스포존을 이용하여 전기천공하였다. 세포는 클론 A3(mIL15+CD86+CD137L음 성) 및 D4(mIL15+CD86음성CD137L+)를 얻기 위해 다시 정렬한 FACS였다. 공동 배양을 100U/㎖ IL-2 및 60ng/㎖ IL-21로 보충한 CM 중의 105개의 γδ T 세포와 함께 개시하고 나서 2 × 105개의 γ-조사한 (i) 모 K562 세포, (ii) 클론 A6, (iii) 클론 A3, (iv) 클론 D4, (v) 클론 #4 aAPC, 또는 (vi) aAPC 없음에 첨가하였다. 사이토카인 실험을 위해 상기 기재한 바와 같이 개시한 후 9일에 T 세포를 열거하였다.
유세포 분석법. 세포는 표 1에서 상술한 항체에 의한 표현형이었다. 아이소타입 대조군을 사용하여 개폐를 입증하였다. 20 내지 30분 동안 4℃에서 FACS 완충제(인산염-완충 식염수, 2% 소 태아 혈청, 0.1% 아자이드나트륨) 중에서 염색을 수행하고 나서, 염색 전에 그리고 염색 사이에 FACS 완충제를 이용하는 2회 세척을 수행하였다. BD 사이토픽스/사이토펌(BD CYTOFIX/CYTOPERM)(상표명)(캘리포니아주, 샌디에이고에 소재한 BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))을 이용하여 20분 동안 4℃에서 고정 및 침투 후에 세포내 염색을 행하였다. 30분 동안 4℃에서 펌/세척 완충제, 10% 인간 AB 혈청 중에서 세포내 염색을 수행하였다. FITC, PE, PerCP/Cy5.5 및 APC 항체를 각각 1:20, 1:40, 1:33 및 1:40 희석에서 사용하였다. 샘플을 FACSCalibur(상표명)(캘리포니아주 산 호세에 소재한 BD 바이오사이언시스) 상에서 얻고 나서, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(버전 7.6.3)를 이용하여 분석하였다.
DTEA에 의한 mRNA 분자의 존재비 및 동질성. aAPC 상에서 공동 배양시킨 후 표시한 시간에, T 세포를 160㎕ RLT 완충제(퀴아젠(Qiagen))/106개 세포의 비로 용해시키고 나서, -80℃에서 냉동시켰다. RNA 용해물을 해동시키고 나서, 관심 대상의 mRNA를 검출하기 위해 다중목합 표적-특이적 색-암호화 수용체 및 바이오티닐화된 포획 프로브를 이용하여 65℃에서 최소 12시간 혼성화 후에 엔카운터(NCOUNTER)(등록상표) 분석 시스템(워싱턴주 시애틀에 소재한 나노스트링 테크놀로지즈(NanoString Technologies))을 이용하여 즉시 분석하였다. 선택한 mRNA 전사체에 대해 RefSeq 등록 번호로부터 2개의 코드 집합을 생성하고 나서, 설계자 TCR 발현 어레이(DTEA)를 위한 특이적 리포터 및 포획 프로브 쌍을 생성하기 위해 사용하였다. (i) 비표적 분자에 대한 리포터-표적 프로브쌍의 교차-혼성화에 기인하여 표적을 벗어난 효과를 최소화하고, (ii) 특정 유전자에 대해 모두는 아니더라도 대부분의 전사 변이체를 표적화하며, (iii) 효율적으로 혼성화하는 리포터-포획 엔카운터(등록상표) 프로브 쌍을 동정하였다. DTEA 데이터를 스파이크 양성 대조군 RNA와 하우스키핑 유전자(ACTB, G6PD, OAZ1, POLR1B, POLR2A, RPL27, Rps13 및 TBP) 둘 다에 대해 정규화시켰다. 모든 샘플에 대한 합을 개개 샘플에 대한 계수의 합으로 나눈 것의 평균으로부터 스파이크 양성 대조군 정규화 인자를 계산하였다. 모든 샘플에 대한 기하학적 평균을 개개 샘플에 대한 계수의 기하학적 평균으로 나눈 것의 평균으로부터 스파이크 양성 대조군 정규화 인자를 계산하였다. 정규화 계수를 보고하였다.
사이토카인 분비. 사이토카인의 발현을 세포 내 염색에 의해 평가하고 나서, 조직 배양 상청액 내로 사이토카인의 분비를 루미넥스(LUMINEX)(등록상표) 다중복합 분석에 의해 평가하였다. 전자를 위해, γδ T 세포를 0.6, 2.0 및 6.0㎍/㎖의 농도로 37℃에서 1시간 동안 정상 마우스 혈청(NMS; 잭슨 이뮤노리서치(ImmunoResearch)) 또는 TCRγδ 차단 항체(클론 IMMU510 (IM); 펜실베니아 피츠버그에 소재한 써모 피셔(써모 피셔)) 중 하나와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, T 세포를 동일한 용적 및 수의 표적 세포(CAOV3 또는 OC314)에 첨가하여 0.3, 1.0 및 3.0㎍/㎖의 최종 항체 농도를 수득하였다. 공동배양물을 브레펠딘-에이(Brefeldin-A)(골지플러그(GolgiPlug); BD 사이언시스)의 존재 하에 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켜 사이토카인의 외포작용 및 분비를 차단하였다. 이어서, 공동배양물을 (i) 표면 마커, 예를 들어, CD3, TCRδ1 및 TCRδ2에 대해 염색하고, (ii) BD 사이오픽스/사이토펌(BD CYTOFIX/CYTOPERM)(상표명)(카탈로그 번호 555028, BD 바이오사이언시스)을 이용하여 고정 및 침투시키고, (iii) 세포내 IFNγ에 대해 염색하며, (iv) 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 사이토카인 분비를 평가하기 위한 공동배양물을 CM(모의 치료) 또는 백혈구 활성화 칵테일(LAC; 5ng/㎖ PMA 및 500ng/㎖ 이노마이신)에 대해 24시간 동안 인큐베이션시키고, 3중 웰로부터의 상청액을 풀링하고 나서 루미넥스(LUMINEX)(등록상표)100(텍사스주 오스틴에 소재한 xMap 테크놀로지즈(xMap Technologies))을 이용하여 BIO-PLEX® 인간 사이토카인 그룹 I 27-플렉스 분석(카탈로그 번호 L50-0KCAF0Y, 캘리포니아주 허큘레스에 소재한 바이오래드 테크놀로지즈(BioRad Technologies))에 의해 분석하였다.
크롬 방출 분석. 앞서 기재한 바와 같이 표준 4시간 CRA를 이용하여 시험관내 특이적 용해를 평가하였다(Singh et al., 2011). 건강한 공여체로부터의 B 세포를 각 분석일에 CD19 마이크로비드(카탈로그 번호 130-050-301, 밀테니 바이오텍)를 이용하여 단리시키고, 표적 세포로서 사용하였다. NKG2D(클론 1D11; BD 바이오사이언시스), DNAM1(클론 DX11; BD 바이오사이언시스), TCRγδ(클론 B1; BD 바이오사이언시스) 및 TCRγδ(클론 IM)에 특이적인 항체를 12:1의 E:T 비로 CRA 중에서 0.3, 1.0 및 3.0㎍/㎖에서 중화 실험을 위해 사용하였다. 동일 농도에서 NMS를 음성 대조군으로서 사용하였고, 항체가 없는 웰을 데이터 정규화 목적을 위해 사용하였다.
장기간 사멸 분석. 부착 종양 세포(CAOV3 또는 UPN251)를 4 × 104개 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에서 파종하였다. 다음날, 5 × 105개 γδ T 세포를 각각의 웰이 첨가하고 나서, 동일한 수를 종양 세포가 없는 웰(단지 배지)에 첨가하였다. 종양 세포 중 하나의 웰은 성장을 위한 양성 대조군으로서 첨가한 동일 용적의 CM을 가졌다. 2일 후, 상청액을 채취하고 나서, 웰을 PBS에서 세척하고, 남아있는 종양 세포를 트립신-EDTA로 채취하고 나서, 열거하였다. 남아있는 종양 세포의 존재비를 모의-치료 종양 세포에 대해 정규화시켰다.
CAOV3 세포의 렌티바이러스 패키징 및 형질도입. BLI(Rabinovich et al., 2008)에 의한 비-침습적 영상화를 위해 종양 세포 내로 증강된 반딧불이 루시퍼라제(effLuc)를 도입하기 위해 다른 곳에 기재된 프로토콜(Turkman et al., 2011)의 변형 형태에 따라 렌티바이러스 입자를 패키징하였다. 간략하게, 패키징 세포(293-METR)를 T125 플라스크 상에서 플레이팅하고 나서, 제조업자의 설명서(인비트로젠(Invitrogen))에 따라 리포펙타민 2000 형질감염 시약과 함께 pCMV R8.2, VSV-G 및 pLVU3G-effLuc-T2A-mKateS158A(도 19) 플라스미드를 이용하여 다음날에 형질감염시켰다. 형질감염 후 48 및 72시간에 바이러스 입자를 채취하고 나서, 100 kDa NMWL 필터(카탈로그 번호 UFC810096, 매사추세츠주 빌러리카에 소재한 밀리포어(MilliPore))를 통해 농축시켰다. CAOV3 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 다음날 effLuc-mKate에 대한 바이러스 암호를 8㎍/㎖ 폴리브렌과 함께 첨가하였다. 플레이트를 1,800rpm에서 1.5시간 동안 교반시키고, 6시간 후에 바이러스-조건화 상청액을 DMEM 완전 배지로 대체하였는데, 이는 다음날 바꾸었다. 형질도입한 CAOV3의 단일-세포 클론은 모 세포주와 동일한 형태를 나타낸 제한 희석에 의해 유래되었고, 클론 1C2가 높은(>106 신호 대 노이즈비) effLuc 활성을 지니는 균일한 mKate 형광을 갖기 때문에 그것을 선택하였다.
마우스 실험. 생체내 항-종양 효능을 NSG 마우스(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rγtm1Wjl/SzJ; 잭슨 래버러토리즈)에서 평가하였다. CAOV3-effLuc-mkate(클론 1C2; 3 × 106개 세포/마우스) 종양을 복강내(i.p.) 주사에 의해 확립하고 나서, 마우스를 처리군 내로 무작위로 분포시켰다. 8일 후에(제0일로 표기), 복강내로 투여한 γδ T 세포를 이용하여 용량 상승 요법을 개시하고, 음성 대조군으로서 PBS를 복강내로 투여하였다. T-세포 용량은 제0일, 제7일, 제14일 및 제21일에 각각 3 × 106, 6 × 106, 107, 및 1.5 × 107개였다. 실험과정 동안 비-침습적 BLI를 수행하여 IVIS(등록상표)-100 이미저(캘리퍼)를 이용하여 검출한 바와 같은 D-루시페린(카탈로그 번호 122796, 매사추세츠주 홉킨톤에 소재한 캘리퍼(Caliper))의 피하 투여 후 CAOV3-effLuc-mKate의 종양 부하를 연속적으로 측정하였다. 리빙 이미지(LIVING IMAGE)(등록상표) 소프트웨어(버전 2.50, 제노젠(Xenogen), 캘리퍼)를 이용하여 BLI를 분석하였다.
사용한 항체.
항체 특이성 클론 공급자
CD3 SK7 BD 바이오사이언시스
CD4 RPA-T4 BD 바이오사이언시스
CD8 RPA-T8 BD 바이오사이언시스
CD19 HIB19 BD 바이오사이언시스
CD25 M-A251 BD 바이오사이언시스
CD27 M-T271 BD 바이오사이언시스
CD28 L293 BD 바이오사이언시스
CD32 FLI8.26 (2003) BD 바이오사이언시스
CD38 HB7 BD 바이오사이언시스
CD45RA HI100 BD 바이오사이언시스
CD45RO UCHL1 BD 바이오사이언시스
CD56 B159 BD 바이오사이언시스
CD57 NK-1 BD 바이오사이언시스
CD62L Dreg 56 BD 바이오사이언시스
CD64 10.1 BD 바이오사이언시스
CD86 2331 FUN-1 BD 바이오사이언시스
CD95 DX2 BD 바이오사이언시스
CD122 TM-베타 1 BD 바이오사이언시스
CD127 HIL-7R-M21 BD 바이오사이언시스
CD137L C65-485 BD 바이오사이언시스
CCR7 TG8 이바이오사이언시스(eBiosciences)
CXCR4 12G5 BD 바이오사이언시스
CLA HECA-452 BD 바이오사이언시스
CCR4 1G1 BD 바이오사이언시스
ICOS ISA-3 이바이오사이언시스
PD-1 MIH4 BD 바이오사이언시스
TCRαβ WT31 BD 바이오사이언시스
TCRγδ B1 BD 바이오사이언시스
TCRγδ IMMU510 써모 피셔(Thermo Fisher)
TCRδ1 TS-1 써모/피어스
TCRδ2 B6 BD 바이오사이언시스
TCRγ9 B3 BD 바이오사이언시스
NMS 015-000-120 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)
DNAM1 DX11 BD 바이오사이언시스
NKG2D 1D11 BD 바이오사이언시스
IL15 34559 알앤디 시스템즈(R&D Systems)
IFNγ 4S.B3 BD 바이오사이언시스
실시예 3 - 토의
본 연구는 혈액학적 악성 종양 및 고형 종양에 대해 광범위 반응성을 보유하는 γδ T 세포의 다중 집단의 지속적 증식을 위한 세포의 플랫폼으로서 aAPC 클론 #4를 확립한다. 특정 Vδ TCR 사용을 발현시키는 T 세포는 암에 대한 임상 반응과 관련되었다. 예를 들어, Vδ1 T 세포는 요법을 위해 직접적으로 주입하지 않았다. 본 발명자들의 데이터는 이들 세포가 항-종양 면역을 매개하고 암 요법을 위해 Vδ1 T 세포의 양자 전달을 지지한다는 것을 확립한다. 본 발명자들의 증식/활성화된 Vδ2 T 세포는 종양 세포 및 사이토카인 생성의 가장 높은 사멸을 나타내었다. 표적화 종양에서 Vδ1음성Vδ2음성-T 세포에 대한 역할은 이전에 알려져 있지 않았지만; 그러나, 본 발명자들의 결과는 Vδ1음성Vδ2음성 세포가 항-종양 활성을 나타내고, 이 서브세트가 또한 면역저하된 환자에 대해 이점을 가질 수 있었다는 것을 직접적으로 나타낸다. 응집에서, 본 명세서의 데이터는 종양 및 기회바이러스 감염에 대한 치료로서 모든 Vδ TCR 유형의 발현을 유지하는 γδ T 세포의 양자 전달에 대한 자극을 제공한다.
공학 처리된 aAPC는 다클론성 TCR 레퍼토리를 유지하는 다수의 γδ T 세포를 생성하고 종양을 사멸시키지만, 정상 세포는 사멸시키지 않는 능력을 갖기 위해 사용할 수 있다. 다클론성 γδ T 세포 주입에 대한 접근은 전염증 사이토카인의 생성을 포함하고 시험관내 및 생체내 종양에 대해 직접적 세포독성을 발휘하는 효과기 기능의 범위를 나타내는 TN, TCM 및 TEM γδ T 세포를 생성하는 aAPC 능력에 의해 추가로 뒷받침된다. 클론 #4는 현재의 우수 의약품 제조관리 제도(cGMP)에 따라 모세포 뱅크로서 생성하며, 인간 적용을 위해 임상-등급 γδ T 세포를 생성하는 투명한 경로를 제공한다. 임상 시험은 이제, 처음으로 감염을 치료할 가능성을 지니는 고형 종양과 혈액학적 종양 둘 다에 대한 TCRγδ 요법의 다클론성 레퍼토리를 유지하는 T 세포의 양자 전달의 효능을 시험할 수 있다.
실시예 4 - γδ T 세포의 단리 및 증식을 위한 대안의 프로토콜
대안의 γδ T 세포 단리 절차. 상자성 마이크로비드와 함께 인큐베이션시키고 자기장의 존재 하에 강자성 구체(밀테니)로 이루어진 연속적 칼럼을 통해 실행함으로써 환자 연층으로부터의 말초 혈액 단핵세포(PBMC)는 CD56+ 자연 살해(NK) 세포 및 αβ T 세포가 고갈되었다. 더 많은 림프구 집단 중에서 γδ T 세포를 함유하는 남아있는 세포는 IL-2 및 IL-21의 존재 하에 세포(aAPC)를 활성화 및 증식시키는 변형된 K562 상에서 배양시켜, γδ T 세포의 선택적 확장을 야기한다(도 20 참조).
이 단리 방법은 CD56 비드와 TCRαβ 비드가 둘 다 임상-등급 시약으로서 이용가능하기 때문에 유리하다. 제안된 확장 프로토콜(IL-2 및 IL-21의 존재 하에 aAPC를 이용)은 동일하다.
새로운 공여체 PBMC로부터의 CD3+ T 세포를 변형된 단리 프로토콜을 이용하는 확장 후에 세포와 비교하였다. 처음에, γδ T 세포는 말초혈 내의 부수적 집단이다. NK 세포 및 αβ T 세포의 고갈 다음에 aAPC에 대한 증식은 γδ T 세포를 확장시켰다(도 21).
γδ T 세포에 의한 췌장암 세포주의 특이적 용해는 CD56+ 세포의 연속적 고갈 후에 PBMC로부터 확장되며, TCRαβ+ 세포를 도 22에 나타낸다. γδ T 세포는 췌장암 세포주에 대한 고유한 활성을 나타내는 반면, αβ T 세포는 그렇지 않았다.
실시예 5 - γδ T 세포의 증식을 위한 추가적인 대안의 프로토콜
γδ T 세포는 별도의 결과를 야기하는 상이한 항-CD3 항체 클론을 이용하여 촉발될 것이다(Dopfer et al., 2014). 예를 들어, 클론 OKT3을 사용하여 γδ T 세포로부터 사이토카인 생성을 유도할 수 있고, 클론 UCHT1을 사용하여 표적 세포에 대해 더 큰 세포독성을 유도할 수 있다.
γδ T 세포는 또한 IL-2 및 IL-21의 존재 하에 OKT3, UCHT1 또는 항체 둘 다를 장입한 aAPC 상에서; 또는 IL-2 및 IL-21의 존재 하에 OKT3, UCHT1 또는 항체 둘 다를 장입한 마이크로비드 상에서 증식될 수 있을 것이다.
다양한 암 세포주 및 시험관내 및 생체내 1차 암과 싸우는 γδ T 세포의 유효성을 다양한 확장 메커니즘 후에 시험할 것이다.
* * *
본 명세서에 개시 및 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시형태에 대해 기재되었지만, 해당 변형은 본 발명의 개념, 정신 및 범주로부터 벗어나는 일 없이 본 명세서에 기재한 방법에 대해 그리고 단계들에서 또는 단계들의 순서에서 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 더 구체적으로는 화학적으로- 그리고 생리학적으로 관련된 특정 제제는 본 명세서에 기재된 제제를 대신할 수 있는 한편, 동일 또는 유사한 결과가 달성될 수 있다는 것이 분명할 것이다. 당업자에게 분명한 모든 이러한 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정해지는 본 발명의 정신, 범부 및 개념 내에 있는 것으로 여겨진다.
참고문헌
다음의 참고문헌은 그들이 본 명세서에 제시되는 것에 보충적인 예시적 절차 또는 다른 상세한 설명을 제공하는 정도로 본 명세서에 참고로서 구체적으로 포함된다.
미국 특허 제4,690,915호
미국 특허 제6,225,042호
미국 특허 제6,355,479호
미국 특허 제6,362,001호
미국 특허 제6,410,319호
미국 특허 제6,790,662호
미국 특허 제7,109,304호
미국 특허 출원 공개 제2009/0017000호
미국 특허 출원 공개 제2009/0004142호
국제특허출원 공개 WO2007/103009
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Claims (56)

  1. 적어도 약 109개의 정제된 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물로서, 상기 γδ T 세포는,
    (a) Vδ1, Vδ2 및 Vδ1음성Vδ2음성 TCR 서브세트를 가지고;
    (b) 본질적으로 동일한 유전자 물질을 가지며; 그리고
    (c) 키메라 항원 수용체를 함유하지 않는, 세포 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 NK 세포 또는 αβ T 세포를 함유하지 않는, 세포 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 γδ T 세포는 CD3을 발현시키는, 세포 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 γδ T 세포는 CD57 또는 PD-1을 발현시키지 않는, 세포 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 세포 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 세포 조성물의 생성방법으로서,
    (a) 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 포함하는 세포의 샘플을 얻는 단계; 및
    (b) 인터류킨-2(IL-2) 및 인터류킨-21(IL-21)의 존재 하에 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 인공 항원 제시 세포(aAPC)와 함께 배양시킴으로써, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 세포 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 세포 조성물의 생성방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포의 샘플로부터 CD56-발현 세포 및 TCRαβ-발현 세포를 고갈시키는 단계를 더 포함하는, 세포 조성물의 생성방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 세포의 샘플은 말초혈 샘플, 제대혈 샘플 또는 조직 샘플인, 세포 조성물의 생성방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 세포의 샘플은 단일 대상체로부터 얻어지는, 세포 조성물의 생성방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 제1 다클론성 γδ T-세포 집단은 약 104 내지 약 106개의 γδ T 세포를 포함하는, 세포 조성물의 생성방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 aAPC는 유전자 이식 K562 세포인, 세포 조성물의 생성방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 aAPC는 CD137L을 발현시키는, 세포 조성물의 생성방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 aAPC는 CD19, CD64, CD86 및 mIL15를 더 발현시키는, 세포 조성물의 생성방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 aAPC는 적어도 하나의 항-CD3 항체 클론을 발현시키는, 세포 조성물의 생성방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항-CD3 항체 클론은 OKT3 및/또는 UCHT1인, 세포 조성물의 생성방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 aAPC는 OKT3 및 UCHT1을 발현시키는, 세포 조성물의 생성방법.
  17. 제6항에 있어서, 상기 aAPC는 불활성화되는, 세포 조성물의 생성방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 aAPC는 조사되는(irradiated), 세포 조성물의 생성방법.
  19. 제6항에 있어서, 상기 aAPC는 감염성 물질에 대해 시험되고 감염성 물질이 없는 것으로 확인된, 세포 조성물의 생성방법.
  20. 제6항에 있어서, 상기 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 aAPC와 함께 배양시키는 것은 상기 세포를 약 10:1 내지 약 1:10(γδ T 세포 대 aAPC)의 비로 배양시키는 것을 포함하는, 세포 조성물의 생성방법.
  21. 제6항에 있어서, 상기 배양물 내 상기 aAPC는 매주 보충되는, 세포 조성물의 생성방법.
  22. 제6항에 있어서, 상기 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 aAPC와 함께 배양시키는 것은 적어도 2주 동안 배양시키는 것을 포함하는, 세포 조성물의 생성방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 aAPC와 함께 배양시키는 것은 다클론성 γδ T 세포의 수의 적어도 100배 증가를 초래하는, 세포 조성물의 생성방법.
  24. 제6항에 있어서, 단계 (b)는 상기 배양물을 아미노비스포스포네이트로 처리하는 단계를 더 포함하는, 세포 조성물의 생성방법.
  25. 제6항에 있어서, 상기 γδ T 세포는 인간 γδ T 세포인, 세포 조성물의 생성방법.
  26. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 세포 조성물의 생성방법으로서,
    (a) 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 포함하는 세포의 샘플을 얻는 단계; 및
    (b) 적어도 하나의 항-CD3 항체 클론의 존재 하에 그리고 추가로 인터류킨-2(IL-2) 및 인터류킨-21(IL-21)의 존재 하에 상기 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 배양시킴으로써 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 세포 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 세포 조성물의 생성방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 세포의 샘플로부터 CD56-발현 세포 및 TCRαβ-발현 세포를 고갈시키는 단계를 더 포함하는, 세포 조성물의 생성방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항-CD3 항체 클론은 OKT3 또는 UCHT1인, 세포 조성물의 생성방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항-CD3 항체 클론은 OKT3 및 UCHT1인, 세포 조성물의 생성방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항-CD3 항체 클론은 aAPC의 표면 상에서 발현되는, 세포 조성물의 생성방법.
  31. 제26항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항-CD3 항체 클론은 마이크로비드의 표면 상에 있는, 세포 조성물의 생성방법.
  32. 제26항에 있어서, 상기 제1 다클론성 γδ T-세포 집단을 배양시키는 것은 적어도 2주 동안 배양시키는 것을 포함하는, 세포 조성물의 생성방법.
  33. 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 세포 조성물 및 제5항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 질환은 암인, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 암은 T-세포 ALL, B-ALL, CML, 결장암, 난소암, 신경모세포종, 뇌 종양 또는 췌장암인, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 질환은 바이러스 감염인, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 바이러스 감염은 거대세포바이러스(CMV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)인, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  38. 제33항에 있어서, 상기 질환은 박테리아 감염인, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 질환은 패혈증인, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  40. 제33항에 있어서, 상기 세포 조성물은 상기 환자에 대해 동종이계인, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  41. 제33항에 있어서, 상기 세포 조성물은 상기 환자에 대해 자가인, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  42. 제34항에 있어서, 상기 환자는 사전 항암 요법을 겪는, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 환자는 관해에 있는, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 환자는 암 증상이 없지만, 검출가능한 암세포를 포함하는, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  45. 제33항에 있어서, 상기 환자는 인간 환자인, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  46. 환자에서 질환을 치료하는 방법으로서,
    (a) 제6항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법에 따른 세포 조성물을 생성하는 단계; 및
    (b) 유효량의 상기 세포 조성물을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  47. 환자에서의 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단을 포함하는 조성물 또는 제5항에 따른 약제학적 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 질환은 암인, 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 암은 T-세포 ALL, B-ALL, CML, 결장암, 난소암 또는 췌장암인, 조성물.
  50. 제47항에 있어서, 상기 질환은 바이러스 감염인, 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 바이러스 감염은 거대세포바이러스(CMV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)인, 조성물.
  52. 제47항에 있어서, 상기 질환은 박테리아 감염인, 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 질환은 패혈증인, 조성물.
  54. 제47항에 있어서, 상기 세포 조성물은 상기 환자에 대해 동종이계(allogeneic)인, 조성물.
  55. 제47항에 있어서, 상기 세포 조성물은 상기 환자에 대해 자가 유래(autologous)인, 조성물.
  56. 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단의 용도.
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