BR112021006254A2

BR112021006254A2 - composições e métodos relativos a células t¿d engenheiradas e não engenheiradas para tratamento de tumores sólidos

Info

Publication number: BR112021006254A2
Application number: BR112021006254-8A
Authority: BR
Inventors: Daulet Kadyl Satpayev; Marissa Ann Herrman; Jason Michael Romero; Yifeng Frank Jing; Zili An; Aya Jakobovits
Original assignee: Adicet Bio, Inc.
Priority date: 2018-10-01
Filing date: 2019-10-01
Publication date: 2021-07-27
Also published as: US20210388109A1; SG11202103234RA; KR20210087458A; EA202190915A1; AU2019354395A1; WO2020072546A2; IL281943A; CA3115059A1; MX2021003744A; JP2022513321A; CN113272016A; WO2020072546A3; EP3860716A2

Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS RELATIVOS A CÉLULAS T (gama delta) ENGENHEIRADAS E NÃO ENGENHEIRADAS PARA TRATAMENTO DE TUMORES SÓLIDOS. Aspectos da invenção incluem composições e métodos para tratamento de tumores sólidos com células T (gama delta) engenheiradas ou não engenheiradas. Em algumas modalidades, as células T (gama delta) compreendem um construto de receptor de antígeno quimérico (CAR). O construto CAR pode conter um domínio de ligação anti-TryD, um domínio de dobradiça CD8alfa e transmembranar, um domínio coestimulatório, um domínio de sinalização de 003zeta, uma combinação dos mesmos ou todos os mesmos. O construto CAR pode conter um domínio de ligação anti-GPC3, um domínio de dobradiça CD8alfa e transmembrana, um domínio coestimulatório, um domínio de sinalização de CD3zeta, uma combinação dos mesmos ou todos os mesmos. O construto de CAR pode conter um domínio codificando para uma citocina de cadeia gama comum secretada, tal como um domínio sIL15.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS RELATIVOS A CÉLULAS T γδ

ENGENHEIRADAS E NÃO ENGENHEIRADAS PARA TRATAMENTO DE TUMORES SÓLIDOS

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório U.S. 62 / 739.826, depositado em 1º de outubro de 2018, cujos conteúdos são aqui incorporados para todos e quaisquer fins.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada eletronicamente em formato ASCII e é, por meio deste, incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 8 de janeiro de 2020, é denominada ADC-0006-PCT_SL.txt e possui 48.406 bytes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A terapia celular adotiva sofreu iteração quase constante por mais de trinta (30) anos desde os primeiros dias com foco em ativação de linfocina básica e/ou infiltração de tumor até estratégias mais recentes engenheirando essas células imunes para expressar receptores de antígenos geneticamente engenheirados, tal como receptores de antígenos quiméricos (CARs)s. Embora tenha havido algumas dicas e indicações do potencial curativo dessas abordagens ao longo do caminho, ainda há muito a ser feito. Em particular, a erradicação de tumor bem-sucedida por linfócitos CAR-T depende da persistência da célula CAR-T e da função efetora, mas um excesso de qualquer um pode disparar efeitos de enxerto versus hospedeiro no paciente. Além disso, os tecidos sólidos, em particular, apresentam um problema devido à falta de estimulação positiva disponível e à presença de um ambiente inibidor. Como tal, a técnica está testando uma miríade de estratégias de coestimulação tanto em células T quanto NK, e em células T αβ em particular, com um objetivo de equilibrar eficácia com segurança. Notavelmente, a tradução prática de qualquer dessas várias abordagens para células T γδ é, na melhor das hipóteses incerta, dada a atual falta de compreensão em torno dos requisitos de coestimulação de células T γδ em comparação com células T αβ. Ver, por exemplo., Ribot et al., “Searching for “signal 2”: costimulation requirements of γδ T cells”, Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68:2345-2355. Consequentemente, estratégias melhoradas ainda são necessárias para melhorar a especificidade ou seletividade das células, para melhorar a segurança das células, por exemplo, reduzindo ou evitando efeitos de enxerto versus hospedeiro (GVH), para melhorar a eficácia das células contra célula de tumor sólido, por exemplo, evitando supressão de funções efetoras e para melhorar a atividade e/ou sobrevida das células mediante administração a sujeitos. São fornecidos métodos, células, composições, kits e sistemas que atendem a essas necessidades.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Aspectos da invenção incluem uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação que se liga especificamente a um complexo de proteína- peptídeo compreendendo um peptídeo de antígeno associado a tumor (TAA) e uma proteína MHC, em que o complexo é expresso na superfície de uma célula de tumor sólido, opcionalmente em que o domínio de ligação se liga ao complexo de uma maneira restrita a HLA; um domínio de dobradiça CD8α; um domínio transmembranar CD8α; uma região de sinalização coestimulatória selecionada de uma região de sinalização coestimulatória 4-1BB e uma região de sinalização coestimulatória CD27; e um domínio de sinalização CD3ζ. Aspectos da invenção incluem ainda uma célula T γδ não engenheirada descrita aqui e uma célula T γδ compreendendo um ácido nucleico codificando um construto CAR descrito neste documento, em que a célula T γδ expressa funcionalmente o CAR codificado de ácido nucleico na superfície da célula T γδ. Aspectos da invenção incluem ainda uma pluralidade de células T γδ conforme descrito neste documento.

Aspectos da invenção incluem ainda um método para fazer a célula T γδ ou a pluralidade de células T γδ descritas neste documento.

Aspectos da invenção incluem ainda uma composição farmacêutica compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável e uma célula T γδ ou pluralidade de células T γδ descritas neste documento.

Aspectos da invenção incluem ainda contatar uma célula de tumor sólido com uma quantidade eficaz de morte de células de tumor de uma célula T γδ como aqui descrita ou com uma pluralidade de células T γδ aqui descritas.

Em um aspecto, a presente invenção fornece uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende (a) um domínio de ligação que se liga especificamente a um complexo proteína-peptídeo compreendendo um peptídeo de antígeno associado a tumor (TAA) e uma proteína MHC, em que o complexo é expresso na superfície de uma célula de tumor sólido, opcionalmente em que o domínio de ligação se liga ao complexo de uma maneira restrita a HLA; (b) um domínio de dobradiça, tal como um domínio de dobradiça CD8α; (c) um domínio transmembranar, tal como um domínio transmembranar CD8α; (d) uma região de sinalização coestimulatória ou combinação de regiões de sinalização coestimulatórias, opcionalmente em que a(s) região(ões) de sinalização coestimulatória são selecionadas de uma região de sinalização coestimulatória 4-1BB (CD137) e uma região de sinalização coestimulatória CD27; e (e) um domínio de sinalização, tal como um domínio de sinalização CD3ζ.

Em algumas modalidades, os elementos anteriores (a)-(e) são codificados na fita sentido do ácido nucleico isolado na ordem 5' para 3'. Em algumas modalidades, o TAA compreende uma região contígua de TyrD.

Em algumas modalidades, a região contígua de TyrD compreende pelo menos, ou pelo menos cerca de, 4 e não mais que, ou não mais que cerca de, 12 aminoácidos contíguos de TyrD, preferencialmente, ou preferencialmente cerca de, 7, 8 ou 9 aminoácidos contíguos de TyrD.

Em algumas modalidades, a região contígua de TyrD é TyrD369-377. Em algumas modalidades, o domínio de ligação que se liga especificamente ao complexo de MHC de peptídeo TAA se liga especificamente a HLA-A2/TyrD369-377. Em algumas modalidades, o domínio de ligação se liga especificamente ao epítopo ligado por, ou compete com, um anticorpo compreendendo: uma CDRH1 compreendendo TSGMGVS (SEQ ID NO: 33); uma CDRH2 compreendendo HIYWDDDKRYNPSLKS (SEQ ID NO: 34); uma CDRH3 compreendendo KDYGSSFYAMHY (SEQ ID NO: 35); uma CDRL1 compreendendo KASQDIHNYIA (SEQ ID NO: 36); uma CDRL1 compreendendo YTSTLQP (SEQ ID NO: 37); e uma CDRL2 compreendendo LQYDNLWT (SEQ ID NO: 38). Em outro aspecto, o domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno associado a tumor (TAA) expresso em uma superfície de uma célula de tumor sólido, opcionalmente em que o antígeno é um complexo proteína-peptídeo, em que a proteína é uma proteína MHC, em que o domínio de ligação liga o complexo proteína-peptídeo de uma maneira restrita a HLA, e o CAR codificado da sequência de ácido nucleico isolada compreende (b) um domínio de dobradiça, tal como um domínio de dobradiça CD8α; (c) um domínio transmembranar, tal como um domínio transmembranar CD8α; (d) uma região de sinalização coestimulatória ou combinação de regiões de sinalização coestimulatórias, opcionalmente em que a(s) região(ões) de sinalização coestimulatória são selecionadas de uma região de sinalização coestimulatória 4-1BB (CD137) e uma região de sinalização coestimulatória CD27; e (e) um domínio de sinalização, tal como um domínio de sinalização CD3ζ.

Em algumas modalidades, os elementos anteriores (a)-(e) são codificados na fita sentido do ácido nucleico isolado na ordem 5' para 3'. Em algumas modalidades, o domínio de ligação se liga especificamente a um epítopo dentro de GPC3 expresso na superfície de uma célula de tumor sólido.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação compreende as seguintes regiões determinantes de complementaridade (CDRs), liga o mesmo epítopo GPC3 como um anticorpo compreendendo as seguintes CDRs e / ou compete pela ligação a um epítopo de GPC3 com um anticorpo compreendendo as seguintes CDRs: uma CDRH1 compreendendo uma sequência de DYEMH (SEQ ID NO: 39) (ou GYTFTDYEMH (SEQ ID NO: 40)); uma CDRH2 compreendendo uma sequência de ALDPKTGDTAYSQKFKG (SEQ ID NO: 41); uma CDRH3 compreendendo uma sequência de FYSYTY (SEQ ID NO: 42); uma CDRL1 compreendendo uma sequência de RSSQSLVHSNRNTYLH (SEQ ID NO: 43); uma CDRL2 compreendendo uma sequência de KVSNRFS (SEQ ID NO: 44); e / ou uma CDRL3 compreendendo uma sequência de SQNTHVPPT (SEQ ID NO: 45). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos ou modalidades anteriores ou qualquer um dos ácidos nucleicos que codificam CAR aqui descritos, o CAR codificado compreende: um domínio de dobradiça CD8α compreendendo SEQ ID NO:1 (PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY) ou SEQ ID NO:2 (TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY); ou um domínio transmembrana CD8α compreendendo SEQ ID NO:3 (IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC); e/ou um domínio de sinalização CD3ζ. Em alguns casos, o domínio de sinalização de CD3ζ compreende a sequência de SEQ ID NO: 4 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG

GKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD ALHMQALPPR); ou SEQ ID NO: 5 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYD

VLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR). Em algumas modalidades, o CAR compreende uma região de sinalização coestimulatória de 4-1BB compreendendo SEQ ID NO:6

(KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL); ou uma região de sinalização coestimulatória de CD27 compreendendo SEQ ID NO: 7. (QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP), ou o ácido nucleico isolado codifica a região de sinalização coestimulatória de 4-1BB compreendendo SEQ ID NO:6 e a região de sinalização coestimulatória de CD27 compreendendo SEQ ID NO:7. Em algumas modalidades de qualquer uma das anteriores, ou conforme descrito neste documento, o ácido nucleico isolado codifica ainda uma citocina secretada; ou uma interleucina de cadeia gama comum secretada; ou uma interleucina de cadeia gama comum secretada, tal como IL-15, de preferência em que a interleucina de cadeia gama comum secretada, tal como IL-15, compreende uma sequência polipeptídica de interleucina operativamente ligada a uma sequência sinal de secreção (por exemplo, um sinal de secreção de SEQ ID NO: 12 ou 26). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica uma IL-15 secretada, de preferência em que a IL-15 compreende a sequência de SEQ ID NO:14, mais preferencialmente em que a IL-15 compreende a sequência de 14 operativamente ligada a uma sequência de sinal de secreção de SEQ ID NO:12, ou em que a IL-15 compreende a sequência da SEQ ID NO:14 operativamente ligada a uma sequência de sinal de secreção de SEQ ID NO: 26. Em alguns casos, a citocina secretada, interleucina de cadeia gama comum e/ou IL-15 são codificadas no terminal carbóxi para a região de ligação, domínios de dobradiça e transmembrana, domínio de sinalização e/ou endodomínio de coestimulação.

Em alguns casos, a citocina secretada, interleucina de cadeia gama comum e/ou IL-15 são codificados na fita sentido 3' da região codificando a região de ligação, domínios de dobradiça e transmembrana, domínio de sinalização e/ou endodomínio de coestimulação.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica uma região de ligante multicistrônica configurada para facilitar tradução do CAR e da citocina secretada, citocina de cadeia gama comum ou IL-15 como polipeptídeos separados. Em algumas modalidades, a região de ligante multicistrônica codifica uma uma sequência polipeptídica de clivagem e/ou autoclivagem. Em alguns casos, a sequência de autoclivagem é uma sequência de autoclivagem P2A, F2A, T2A ou E2A. Em alguns casos, a sequência de clivagem é uma sequência de clivagem de furina. Em alguns casos, a sequência de clivagem (por exemplo, sequência de clivagem de furina) é amino terminal para uma sequência de autoclivagem. Em algumas modalidades, a região de ligante multicistrônica codifica um sítio de entrada de ribossomo interno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um terminal amino de região de ligante multicistrônica para a interleucina ou citocina ou sinal de secreção de interleucina ou citocina, de preferência em que a região de ligante multicistrônica compreende uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 15-17, 25, ou 27-30 ou uma combinação das mesmas, ou codifica um sítio de entrada de ribossomo interno, por exemplo, SEQ ID NO: 31 ou 32. Em algumas modalidades, o sinal de secreção compreende uma sequência de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 26, de preferência SEQ ID NO: 12; e / ou o domínio sIL15 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 14; e / ou a sequência de clivagem P2A compreende uma sequência de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 25; e / ou a sequência de clivagem da furina compreende uma sequência de SEQ ID NO: 16; e / ou o CAR compreende, na ordem amino a carbóxi, uma sequência de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga especificamente a HLA-A2/TyrD369-377 e o ácido nucleico codifica SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga especificamente a GPC3 e o ácido nucleico codifica SEQ ID NO: 20 ou 22. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende a sequência da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, 23 ou

24.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação a CAR, como um dos polipeptídeos codificados por qualquer um dos ácidos nucleicos anteriores ou um polipeptídeo aqui descrito.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula T, por exemplo, γδ, compreendendo o polipeptídeo anterior, ou compreendendo um ácido nucleico que codifica um CAR aqui descrito, em que a célula expressa funcionalmente o domínio de ligação do polipeptídeo ou CAR codificado de ácido nucleico na superfície da célula.

Em algumas modalidades, a célula exibe atividade de morte celular in vitro e / ou in vivo contra uma célula de tumor sólido que exibe a expressão da superfície celular do antígeno associado ao tumor (TAA). Em algumas modalidades, a atividade de morte de célula de tumor sólido da referida célula é maior do que um nível inato de atividade de morte de célula de tumor sólido in vitro e / ou in vivo em uma célula de controle que não compreende um construto CAR.

Em algumas modalidades, a célula exibe o aumento da atividade de morte de célula de tumor sólido contra célula de tumor sólido HLA classe I+ . Em algumas modalidades, a atividade de morte de célula de tumor sólido ou aumento da atividade de morte de célula de tumor sólido persiste por, por cerca de, pelo menos, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias após o primeiro contato com a célula de tumor sólido.

Em algumas modalidades, a célula prolifera em resposta ao contato com uma célula de tumor sólido que exibe a expressão da superfície celular do antígeno associado ao tumor (TAA). Em algumas modalidades, a célula exibe proliferação aumentada em resposta ao contato com uma célula de tumor sólido que exibe expressão de superfície celular do antígeno associado ao tumor (TAA) em comparação com uma célula de controle que não expressa funcionalmente o CAR codificado de ácido nucleico na superfície da célula.

Em algumas modalidades, a célula prolifera em um organismo hospedeiro que compreende a célula de tumor sólido que exibe a expressão da superfície celular do antígeno associado ao tumor (TAA). Em algumas modalidades, a proliferação celular ou aumento da proliferação celular persiste por, por cerca de, pelo menos, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias após o primeiro contato com a célula de tumor sólido.

Em algumas modalidades, a célula expressa uma ou mais citocinas pró-inflamatórias, opcionalmente em que uma ou mais citocinas pró-inflamatórias compreendem fator de necrose tumoral alfa ou interferon gama, após contato com a célula de tumor sólido, de preferência em uma quantidade maior do que uma célula de controle que não expressa funcionalmente o CAR codificado por ácido nucleico na superfície da célula.

Em algumas modalidades, a célula exibe resposta reduzida, substancialmente reduzida, essencialmente nenhuma ou nenhuma resposta de enxerto versus hospedeiro quando introduzida em um hospedeiro alogênico em comparação com uma resposta de enxerto versus hospedeiro exibida por uma célula T αβ administrada a um hospedeiro alogênico.

Em algumas modalidades, a célula T, por exemplo, γδ exibe resposta reduzida, substancialmente reduzida, essencialmente nenhuma ou nenhuma resposta de enxerto versus hospedeiro quando introduzida em um hospedeiro alogênico em comparação com uma resposta de enxerto versus hospedeiro exibida por uma célula T αβ administrada a um hospedeiro alogênico.

Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T γ.

Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T δ.

Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T γδ.

Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T δ1, δ2, δ3 ou δ4, de preferência uma célula T δ2- δ, mais preferencialmente uma célula T δ1 δ.

Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T γδ δ1, uma δ2, uma δ3 ou uma δ4, de preferência uma célula T δ2- γδ, mais preferencialmente uma célula T δ1 γδ.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma pluralidade de qualquer uma das células anteriores, como, por exemplo, células T γδ, ou uma pluralidade de células, como, por exemplo, células T, γδ, conforme descrito neste documento.

Em algumas modalidades, a pluralidade compreende pelo menos cerca de 108 células como 108, por exemplo, células T γδ, preferivelmente 108 células, por exemplo, células T γδ, a cerca de 1011 células, por exemplo, células T, γδ.

Em algumas modalidades, a pluralidade compreende uma composição que é pelo menos 60%, 80%, ou cerca de 60%, ou 80% a cerca de 90%, ou 95% de células δ1, δ2, δ3 ou δ4, como, por exemplo, células T γδ de preferência células T γδ δ1 ou δ2, mais preferencialmente células T δ2- γδ, mais preferencialmente células T γδ δ1. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de produção de uma célula, como uma células T, por exemplo, γδ, como aqui descrito, ou uma pluralidade de células, como, por exemplo, células T γδ, como aqui descrito, em que o método compreende transfectar as células T com um construto compreendendo uma sequência de ácido nucleico isolada como aqui descrito.

Em alguns casos, o método compreende, por exemplo, transdução gama, retroviral.

Em alguns casos, o método compreende expansão ex vivo da(s) célula(s), em que a expansão ex vivo é realizada antes da transfecção e/ou após transfecção da sequência de ácido nucleico isolada.

Em alguns casos, o método compreende expansão ex vivo da(s) célula(s), em que a expansão ex vivo é realizada antes da transfecção e após transfecção da sequência de ácido nucleico isolada.

Em alguns casos, o método compreende expansão ex vivo da(s) célula(s), em que a expansão ex vivo é realizada após transfecção da sequência de ácido nucleico isolada.

Em algumas modalidades, o método compreende produzir de cerca de 108 células, por exemplo, células T γδ, a cerca de 1011 células, como, por exemplo, células T γδ, que expressam funcionalmente um CAR aqui descrito dentro de cerca de 30 dias de transfecção.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável e uma célula ou pluralidade de células como aqui descrito, tal como, por exemplo, γδ,

célula(s) T aqui descrita.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para matar uma célula de tumor sólido, o método compreendendo contatar a célula de tumor sólido com uma quantidade eficaz de matar células de tumor de qualquer uma das células anteriores ou pluralidade de células ou composições farmacêuticas, ou uma célula ou pluralidade de células ou composição farmacêutica como aqui descrito.

Em alguns casos, a célula ou pluralidade de células são, por exemplo, célula(s) T γδ.

Em algumas modalidades, o método compreende introduzir uma quantidade terapeuticamente eficaz da(s) célula(s), por exemplo, célula(s) T γδ ou da composição farmacêutica em um organismo hospedeiro compreendendo a célula de tumor sólido.

Em algumas modalidades, o método compreende introduzir em um organismo hospedeiro compreendendo a célula de tumor sólido uma quantidade terapeuticamente eficaz das células, tais como, por exemplo, células T, γδ, ou uma composição farmacêutica dos mesmos e simultaneamente ou sequencialmente administrar um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum.

Em algumas modalidades, a administração de um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreende administrar simultaneamente com a introdução da(s) célula(s) T ou sequencialmente uma quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum eficaz para elevar proliferação , atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T introduzida(s), preferencialmente em que o método compreende administrar IL-2, mais preferencialmente em que o método compreende administrar IL-15. Em algumas modalidades, os um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreendem administrar uma quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum eficaz para elevar proliferação, atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) introduzida(s) antes e/ou após introdução da(s) célula(s). Em algumas modalidades, os um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreendem linfodepleção antes de introduzir a(s) célula(s) T γδ.

Em algumas modalidades, os um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreendem secreção de uma ou mais citocinas de cadeia gama comum das células introduzidas.

Em algumas modalidades, o método reduz a carga de tumor in vivo no organismo hospedeiro e/ou aumenta o tempo de sobrevida médio do organismo hospedeiro em comparação com um organismo controle, em que o organismo controle não é tratado com a(s) célula(s) ou a composição farmacêutica.

Em algumas modalidades, o método é um método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um uso de uma quantidade eficaz de matar células de tumor de qualquer uma das células anteriores ou uma célula como aqui descrito (tal como uma, por exemplo, uma célula T γδ); uma pluralidade de tais células ou uma composição farmacêutica contendo tais células na fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer de célula de tumor sólido em um sujeito em necessidade do mesmo.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz das células, em que o câncer compreende células de tumor sólido que exibem expressão de superfície de célula de TyrD ou GPC3. Em algumas modalidades, o método compreende simultaneamente com a administração de células ou sequencialmente, administrar um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum.

Em algumas modalidades, o método compreende realizar uma pluralidade de administrações das células, em que o intervalo entre a pluralidade de administrações é de pelo menos cerca de uma semana, de preferência pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 12 semanas e/ou no máximo uma vez a cada 6 ou 12 meses.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso em qualquer um dos métodos anteriores ou um método aqui descrito.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento por referência na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é uma ilustração esquemática de uma modalidade de um receptor de antígeno quimérico (CAR) contendo um endodomínio de sinalização coestimulatórios (à esquerda) ou dois endodomínios de sinalização coestimulatórios (à direita). Como utilizado neste documento, endodomínios de sinalização coestimulatórios também são referidos como endodomínios de coestimulação ou endodomínios coestimulatórios. Endodomínios de sinalização coestimulatórios exemplificativos úteis em CARs exemplificativos incluem, sem limitação, CD28; CD137 (4-1BB); CD278 (ICOS); CD27; CD134 (OX40); TLR2 e combinações dos mesmos. A Fig. 2 ilustra a citotoxicidade in vitro de células T γδ engenheiradas e não engenheiradas aqui descritas contra as linhagens de células de melanoma 526 e WM266.1-Luc. A Fig. 3 ilustra a eficácia terapêutica in vivo de células T γδ aqui descritas em um modelo de camundongo subcutâneo de células WM266.4 NOD scid gama (NSG). A Fig. 4 ilustra um processo de fabricação para a produção de células γδ CAR-T engenheiradas e células γδ CAR-T não engenheiradas, por exemplo, para o tratamento de tumores sólidos. A Fig. 5 ilustra a atividade citotóxica de células T Vδ1 transduzidas com construtos CAR de controle ou construtos direcionados ao polipeptídeo de tirosinase. A Fig. 6 ilustra a eficiência de transdução de células Vδ1 com um construto de CAR anti-glipicano 3 (GPC3), incluindo IL-15 solúvel (sIL15) (SEQ ID NO: 14) e sIL15 otimizado por códon (WO 2007 / 037780A2). A Fig. 7 ilustra a atividade citotóxica de células T Vδ1 não transduzidas ou transduzidas com construtos de CAR anti-GPC3 contra um painel de linhagem de células de câncer de fígado com diferentes níveis de expressão de GPC3.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições: Para fins de interpretar este relatório descritivo, as seguintes definições se aplicarão e, sempre que apropriado, termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa. No caso de qualquer definição estabelecida conflitar com qualquer documento incorporado neste documento por referência, a definição estabelecida abaixo prevalecerá. A menos que definidos de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como compreendido geralmente por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. "Cerca de", conforme usado neste documento se referindo a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, se destina a abranger variações de ±20% ou ±10%, mais preferencialmente ±5%, ainda mais preferencialmente ±1%, e ainda mais preferencialmente ±0,1% do valor especificado, uma vez que tais variações sejam apropriadas para realizar os métodos divulgados. O termo "células T γδ (células T gama delta)", como aqui utilizado, se refere a um subconjunto de células T que expressam um receptor de célula T distinto (TCR), ou seja, γδTCR, em sua superfície, composto por uma cadeia γ e uma cadeia δ. O termo "células T γδ" inclui especificamente todos os subconjuntos de células T γδ incluindo, sem limitação, células T γδ Vδ1 e Vδ2, Vδ3, bem como células T γδ naïve, de memória efetora, memória central e diferenciadas terminalmente.

Como outro exemplo, o termo "células T γδ" inclui células T γδ Vδ4, Vδ5, Vδ7 e Vδ8, bem como células T γδ Vγ2, Vγ3, Vγ5, Vγ8, Vγ9, Vγ10 e Vγ11. Em algumas modalidades, as células T γδ são Vδ1-, Vδ2-, ou Vδ1- e Vδ2-. Composições e métodos para fazer e usar células T γδ engenheiradas e não engenheiradas e/ou subtipos das mesmas incluem, sem limitação, aqueles descritos em US 2016/0175358; WO 2017/197347; US 9499788; US 2018/0169147; US 9907820; US 2018/0125889 e US 2017/0196910, o conteúdo de cada um dos quais é incorporado por referência para todos os fins, incluindo as referidas composições e métodos para fazer e usar células T γδ engenheiradas e não engenheiradas e/ou subtipos das mesmas.

O presente pedido contempla ainda células T, ou outros leucócitos ou linfócitos engenheirados, que expressam uma cadeia γ ou uma cadeia δ, opcionalmente em combinação com um segundo polipeptídeo para formar um TCR funcional.

Esses leucócitos ou linfócitos engenheirados, que expressam uma cadeia γ ou uma cadeia δ, podem ser usados nos métodos ou estar presentes nas composições aqui descritas.

Conforme usado neste documento, o termo "linfócito T" ou "célula T" se refere a uma célula imune que expressa ou expressou CD3 (CD3+) e um Receptor de Célula T (TCR+). Células T desempenham um papel central em imunidade mediada por célula.

Uma célula T que “expressou” CD3 e um TCR foi engenheirado para eliminar expressão de superfície de célula CD3 e/ou TCR.

Como utilizado neste documento, o termo "TCR" ou "receptor de célula T" se refere a uma proteína de sinalização de superfície de célula heteróloga dimérica formando um receptor alfa-beta ou gama-delta ou combinações dos mesmos. αβTCRs reconhecem um antígeno apresentado por uma molécula MHC, ao passo que γδTCR pode reconhecer um antígeno independentemente de apresentação de MHC.

O termo "MHC" (complexo de histocompatibilidade principal) se refere a um subconjunto de genes que codificam proteínas apresentadoras de antígeno de superfície de célula.

Em humanos, esses genes são chamados de genes de antígeno de leucócito humano (HLA). Aqui, as abreviações MHC ou HLA são usadas intercambiavelmente. "Ativação", como utilizado neste documento, se refere ao estado de uma célula T que foi suficientemente estimulada para induzir a proliferação celular detectável.

Ativação também pode estar associada à produção de citocina induzida e funções efetoras detectáveis.

O termo "células T ativadas" se refere a, dentre outras coisas, células T que estão sofrendo divisão celular.

O termo "anticorpo", como aqui utilizado, se refere a uma molécula de imunoglobulina que liga especificamente a um antígeno.

Anticorpos podem ser imunoglobulinas intactas derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes e podem ser porções imunorreativas de imunoglobulinas intactas.

Anticorpos são tipicamente tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina.

Os anticorpos na presente invenção podem existir em uma variedade de formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, Fv, Fab e F(ab)2, bem como anticorpos de cadeia simples e anticorpos humanizados (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). O termo "fragmento de anticorpo" se refere a uma porção de um anticorpo intacto e se refere às regiões variáveis determinantes antigênicas de um anticorpo intacto.

Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, Fab, Fab′, F(ab′)2 e fragmentos Fv, anticorpos lineares, anticorpos scFv e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos.

Uma "cadeia pesada de anticorpo", conforme usado neste documento,

se refere ao maior dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes em moléculas de anticorpo em suas conformações ocorrendo naturalmente.

Uma "cadeia leve de anticorpo", como utilizado neste documento, se refere ao menor dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes em moléculas de anticorpos em suas conformações ocorrendo naturalmente.

As cadeias leves κ e λ se referem aos dois principais isótipos de cadeia leve de anticorpo.

Pelo termo "anticorpo sintético", como utilizado neste documento, queremos dizer um anticorpo que é gerado usando tecnologia de DNA recombinante, tal como, por exemplo, um anticorpo expresso por um bacteriófago como aqui descrito.

O termo também deve ser interpretado como significando um anticorpo que foi gerado pela síntese de uma molécula de DNA codificando o anticorpo e cuja molécula de DNA expressa uma proteína de anticorpo, ou uma sequência de aminoácido especificando o anticorpo, em que o DNA ou a sequência de aminoácido foi obtida usando DNA sintético ou tecnologia de sequência de aminoácido que está disponível e é bem conhecida na técnica.

O termo "antígeno" ou "Ag", conforme usado neste documento, é definido como uma molécula que provoca uma resposta imune.

Essa resposta imune pode envolver tanto a produção de anticorpo quanto a ativação de células imunologicamente competentes específicas, ou ambas.

O versado na técnica entenderá que qualquer macromolécula, incluindo proteínas ou peptídeos, pode servir como um antígeno.

Além disso, antígenos podem ser derivados de DNA recombinante ou genômico.

Um versado na técnica entenderá que qualquer DNA que compreende uma sequência de nucleotídeo ou uma sequência de nucleotídeo parcial codificando uma proteína que elicita uma resposta imune, portanto, codifica um "antígeno" como esse termo é usado neste documento.

Além disso, um versado na técnica entenderá que um antígeno não precisa ser codificado apenas por uma sequência de nucleotídeo de comprimento total de um gene.

É prontamente evidente que a presente invenção inclui, mas não está limitada, ao uso de sequências de nucleotídeos parciais de mais de um gene e que essas sequências de nucleotídeos são arranjadas em várias combinações para elicitar a resposta imune desejada.

Além disso, um versado na técnica entenderá que um antígeno não precisa ser codificado por um "gene" de forma alguma.

É prontamente evidente que um antígeno pode ser gerado, sintetizado ou pode ser derivado de uma amostra biológica.

Tal amostra biológica pode incluir, mas não está limitada a uma amostra de tecido, uma amostra de tumor, uma célula ou um fluido biológico.

O termo "epítopo" inclui qualquer determinante de proteína, determinante de lipídeo ou de carboidrato capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T.

Determinantes epitópicos geralmente consistem em agrupamentos de superfície ativa de moléculas, tal como aminoácidos, lipídeos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas.

Diz-se que um anticorpo liga especificamente um antígeno quando a constante de dissociação de equilíbrio (KD) está em uma faixa de 10-6 – 10-12M.

O termo "receptores de antígenos quiméricos (CARs)," como aqui utilizado, pode se referir a receptores de células T artificiais, T-bodies, imunorreceptores de cadeia simples, receptores de células T quiméricos ou imunorreceptores quiméricos, por exemplo, e abranger receptores engenheirados que enxertam uma especificidade artificial em uma célula efetora imune particular.

CARs podem ser empregados para transmitir a especificidade de um anticorpo monoclonal a uma célula T, desse modo permitindo que um grande número de células T específicas seja gerado, por exemplo, para uso em terapia de célula adotiva.

Em modalidades específicas, CARs dirigem especificidade da célula para um antígeno associado a tumor, por exemplo.

Em algumas modalidades, CARs compreendem um domínio de ativação intracelular (permitindo que a célula T ative mediante engate da fração de direcionamento com a célula alvo, tal como uma célula de tumor alvo), um domínio transmembranar e um domínio extracelular que pode variar em comprimento e compreende uma região de ligação de antígeno de tumor, por exemplo, associada a doença ou distúrbio.

Em aspectos particulares, CARs compreendem fusões de fragmentos variáveis de cadeia simples (scFv) derivados de anticorpos monoclonais, fundidos a CD3-zeta um domínio transmembranar e endodomínio.

A especificidade de outros desenhos de CAR pode ser derivada de ligandos de receptores (por exemplo, peptídeos) ou de receptores de reconhecimento de padrão, tal como as Dectins.

Em certos casos, o espaçamento do domínio de reconhecimento de antígeno pode ser modificado para reduzir morte de célula induzida por ativação.

Em certos casos, CARs compreendem domínios para sinalização coestimulatória adicional, tal como CD3ζ, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP 10/12 e/ou OX40, ICOS, TLRs (por exemplo, TLR2), etc.

Em alguns casos, moléculas podem ser coexpressas com o CAR, incluindo moléculas coestimulatórias, genes repórter para imageamento (por exemplo, para tomografia por emissão de pósitrons), produtos de gene que ablacionam condicionalmente as células T mediante adição de uma pró-droga, receptores homing, quimiocinas, receptores de quimiocinas, citocinas e receptores de citocinas.

Além disso, um versado na técnica entenderá que um domínio coestimulatório não precisa ser codificado apenas por uma sequência de nucleotídeo de comprimento total de um gene.

O termo "efeito antitumor", como aqui utilizado, se refere a um efeito biológico que pode ser manifestado por uma diminuição em volume de tumor, uma diminuição no número de células de tumor, uma diminuição no número de metástases, um aumento na expectativa de vida , ou melhora de vários sintomas fisiológicos associados à condição cancerígena.

Um "efeito antitumor" também pode ser manifestado pela capacidade dos peptídeos, polinucleotídeos, células e anticorpos da invenção na prevenção da ocorrência de tumor em primeiro lugar.

O termo "autoantígeno" significa, de acordo com a presente invenção, qualquer autoantígeno que seja erroneamente reconhecido pelo sistema imune como sendo estranho.

Autoantígenos compreendem, mas não estão limitados a, proteínas celulares, fosfoproteínas, proteínas de superfície celular, lipídeos celulares, ácidos nucleicos, glicoproteínas, incluindo receptores de superfície de célula.

Conforme usado neste documento, o termo "autólogo" se refere a qualquer material derivado de um indivíduo que mais tarde será reintroduzido no mesmo indivíduo.

Conforme usado neste documento, o termo "alogênico" se refere a material derivado de um animal que é posteriormente introduzido em um animal diferente da mesma espécie.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere à quantidade de uma composição que elicitará uma resposta biológica ou médica de um tecido, sistema ou sujeito que está sendo procurada pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" inclui aquela quantidade de uma composição que, quando administrada, é suficiente para prevenir desenvolvimento de, ou aliviar até certo ponto, um ou mais dos sinais ou sintomas do distúrbio ou da doença (por exemplo, tumor sólido) sendo tratada.

A quantidade terapeuticamente eficaz variará dependendo da composição, da doença e de sua severidade e da idade, do peso, etc., do sujeito a ser tratado.

Para "tratar" uma doença como o termo é usado neste documento, significa reduzir a frequência ou severidade de pelo menos um sinal ou sintoma de uma doença ou um distúrbio experimentado por um sujeito.

A administração “em combinação com” um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) e sequencial em qualquer ordem.

O termo "farmaceuticamente aceitável", como utilizado neste documento, se refere a um material incluindo, mas não se limitando, a um sal, transportador ou diluente, que não anula a atividade biológica ou as propriedades do composto e é relativamente não tóxica, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de maneira deletéria com qualquer dos componentes da composição na qual ele está contido. "Codificação" se refere à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, tal como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir como modelos para síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos tendo ou uma sequência definida de nucleotídeos (isto é, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas resultantes dos mesmos.

Assim, um gene codifica uma proteína se transcrição e tradução do mRNA correspondente a esse gene produzir a proteína em uma célula ou outro sistema biológico.

Tanto a fita codificadora, cuja sequência de nucleotídeos é idêntica à sequência de mRNA e é geralmente fornecida em listagens de sequências, quanto a fita não codificadora, usada como o modelo para transcrição de um gene ou cDNA, podem ser referidas como codificando a proteína ou outro produto desse gene ou cDNA. “Isolado” significa alterado ou removido do estado natural.

Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não é "isolado", mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcialmente ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é "isolado". Um ácido nucleico ou uma proteína isolada pode existir em forma substancialmente purificada ou pode existir em um ambiente não nativo, tal como, por exemplo, uma célula hospedeira.

A menos que especificado de outra forma, uma "sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido" inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácido.

Sequências de nucleotídeos que codificam proteínas e RNA podem incluir íntrons.

Os termos "paciente", "sujeito", "indivíduo" e semelhantes são usados intercambiavelmente neste documento e se referem a qualquer animal, suscetível aos métodos descritos neste documento.

Em certas modalidades não limitativas, o paciente, sujeito ou indivíduo é um humano.

Pelo termo "liga especificamente", como aqui utilizado com respeito a um anticorpo, entende-se um anticorpo que reconhece um antígeno específico, mas não reconhece ou liga substancialmente a outras moléculas em uma amostra.

Por exemplo, um anticorpo que liga especificamente a um antígeno de uma espécie também pode ligar a esse antígeno de uma ou mais espécies.

Porém, essa reatividade de espécies cruzadas não altera por si só a classificação de um anticorpo como específico.

Em outro exemplo, um anticorpo que liga especificamente a um antígeno também pode ligar a diferentes formas alélicas do antígeno.

No entanto, essa reatividade cruzada por si só não altera a classificação de um anticorpo como específico.

Em alguns casos, os termos "ligando especificamente" ou "ligando especificamente" podem ser usados em referência à interação de um anticorpo, uma proteína ou um peptídeo com uma segunda espécie química, para significar que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epítopo) na espécie química; por exemplo, um anticorpo reconhece e liga a uma estrutura de proteína específica em vez de às proteínas em geral.

Se um anticorpo é específico para o epítopo "A", a presença de uma molécula contendo epítopo A (ou livre, A não marcado), em uma reação contendo "A" marcado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo.

Em algumas modalidades, ligação específica pode ser caracterizada por uma constante de dissociação de equilíbrio de pelo menos cerca de 1x10-8 M ou menos(por exemplo, uma KD menor indica uma ligação mais estreita). Os métodos para determinar se duas moléculas ligam especificamente são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância de plásmon de superfície e semelhantes.

Além disso, anticorpos multiespecíficos que ligam a um primeiro antígeno e um ou mais antígenos adicionais ou um anticorpo biespecífico que liga a duas regiões diferentes de um antígeno são, no entanto, considerados anticorpos que "ligam especificamente", como aqui utilizado.

Tumores sólidos são tumores que compreendem uma massa tumoral de pelo menos cerca de 10 ou pelo menos cerca de 100 células de tumor.

O tumor sólido pode ser um tumor de tecido mole, um tumor sólido primário ou uma lesão metastática.

Exemplos de tumores sólidos incluem, por exemplo, sarcomas, adenocarcinomas e carcinomas, de vários sistemas de órgãos, como aqueles que afetam o fígado, pulmão, mama, linfoide, gastrointestinal (por exemplo, cólon), trato geniturinário (por exemplo, células renais, uroteliais), próstata e faringe.

Os adenocarcinomas incluem doenças malignas, como a maioria dos cânceres de cólon, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer de fígado, carcinoma de células não pequenas do pulmão, câncer do intestino delgado e câncer de esôfago.

Em uma modalidade, o câncer é um melanoma, por exemplo, um melanoma em estágio avançado.

Lesões metastáticas dos cânceres acima mencionados também podem ser tratadas ou prevenidas usando os métodos e composições da invenção.

Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados incluem câncer ósseo, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina,

carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma dos tecidos moles, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância,câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasia do sistema nervoso central (CNS), linfoma primário do CNS, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, Sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de células escamosas, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo aqueles induzidos por amianto, e combinações dos referidos cânceres.

Em uma modalidade preferida, a célula de tumor sólido expressa, ou superexpressa, TyrD ou um fragmento do mesmo.

Em algumas modalidades, a célula de tumor sólido expressa ou superexpressa um complexo HLA:peptídeo contendo um fragmento TyrD.

Em algumas modalidades, o fragmento TyrD é TyrD369-377. Em algumas modalidades, o HLA é um HLA de classe I, como HLA- A2. Em algumas modalidades, a célula tumoral sólida expressa ou superexpressa HLA-A2/TyrD369-377. Em algumas modalidades, a célula de tumor sólido expressa, ou superexpressa, glypican3 (GPC3). Em algumas modalidades, a célula de tumor sólida expressa ou superexpressa um epítopo de GPC3 que está especificamente ligado por um anticorpo anti-GPC3, receptor de células T ou receptor de antígeno quimérico descrito em U.S. 7.919.086; WO 2014/180306; WO 2018/019772; WO 2016/049459; WO 2003/000883; WO 2006/046751; WO 2007/047291; WO 2016/086813; WO 2016/047722; WO 2016/036973; Cancer Res. 2008;68:9832–9838; Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 19;110(12):E1083-91, os conteúdos de cada um dos quais são incorporados por referência na totalidade e para todos os fins e em particular para os domínios de ligação, anticorpos, fragmentos de anticorpo, regiões determinantes de complementaridade, polipeptídeos contendo as referidas regiões determinantes de complementaridade, ácidos nucleicos que codificam para as referidas regiões determinantes de complementaridade, e especificidades de epítopos e ensaios para determinar a especificidade de epítopos aqui descritos.

Em algumas modalidades, a célula de tumor sólida expressa ou superexpressa um epítopo de glypican3 que é especificamente ligado pelo anticorpo anti-GPC3 GC33. Em algumas modalidades, o tumor sólido expressa ou superexpressa um complexo HLA:peptídeo contendo um fragmento GPC3. Em algumas modalidades, o HLA é um HLA de classe I, como HLA- A2. Em algumas modalidades, o tumor sólido expressa, ou superexpressa, um complexo HLA:peptídeo contendo um peptídeo GPC3144–152 . Em algumas modalidades, o tumor sólido expressa, ou superexpressa, um complexo HLA: peptídeo contendo um peptídeo GPC3298-306 . Ver, Oncoimmunology. 2012 Nov 1; 1(8): 1448–1450. "Cassete de expressão" se refere a um ácido nucleico compreendendo sequências de controle de expressão operativamente ligadas a um ácido nucleico codificando um transcrito ou polipeptídeo a ser expresso.

Um cassete de expressão compreende elementos de cis-ação suficientes para expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro.

Cassetes de expressão podem ser um componente de um vetor, tal como um cosmídeo, um plasmídeo (por exemplo, nu ou contido em um lipossoma) ou um vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociado). Um cassete de expressão pode estar em uma célula hospedeira, tal como uma célula T γδ.

Faixas: em toda esta divulgação, vários aspectos da invenção podem ser apresentados em um formato de faixa.

Deve ser entendido que a descrição em formato de faixa é meramente para conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção.

Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todas as possíveis subfaixas, bem como valores numéricos individuais nessa faixa.

Por exemplo, a descrição de uma faixa, tal como de 1 a 6, deve ser considerada como tendo divulgado especificamente subfaixas, tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 e 6. Isto se aplica independentemente da amplitude da faixa.

Construtos de Receptor de Antígeno Quimérico: Aspectos da invenção incluem ácidos nucleicos codificando CARs e construtos e vetores contendo tais ácidos nucleicos.

Em alguns casos, o ácido nucleico é um, por exemplo, componente heterólogo de um cassete de expressão.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico é, por exemplo, um componente heterólogo de um vetor retroviral.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico é, por exemplo, um componente heterólogo uma célula T β ou γδ e, de preferência, uma célula T γδ.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico é, por exemplo, um componente heterólogo de uma célula γ+ T e/ou uma célula T δ+ . Em algumas modalidades, o ácido nucleico é, por exemplo, um componente heterólogo de célula α- T e/ou uma célula β- T.

São descritos aqui ácidos nucleicos codificando um domínio de ligação CAR que liga especificamente a um antígeno associado a tumor (TAA) expresso em uma superfície de uma célula de tumor sólido; Um exemplo de TAA é a tirosinase (TyrD) ou um fragmento de peptídeo da mesma.

Em alguns casos, o TAA é glypican3 ou um fragmento de peptídeo do mesmo.

Em alguns casos, o TAA é um peptídeo ligado a uma molécula HLA, como uma molécula HLA classe I.

Peptídeos de tirosinase que se ligam a moléculas de HLA de classe I (também aqui referidos indistintamente como epítopos de tirosinase restritos a HLA, epítopos de tirosinase restritos a HLA e antígenos de tirosinase restritos a MHC) são derivados da enzima tirosinase (Número de acessão do Genebank: NP_000363.1) e têm tipicamente 8-10 aminoácidos de comprimento, ligam-se à ranhura α1-α2 da cadeia pesada por meio de dois ou três resíduos de âncora que interagem com os bolsos de ligação correspondentes na molécula de HLA.

A tirosinase é uma glicoproteína ligada a N associada à membrana e é a enzima chave na síntese de melanina.

É expresso em todos os melanócitos saudáveis e em quase todas as amostras de tumor de melanoma (H.

Takeuchi, et al., 2003; S.

Reinke, et al., 2005). Os peptídeos derivados desta enzima são apresentados em moléculas MHC de classe I e são reconhecidos por linfócitos T citolíticos autólogos em pacientes com melanoma [T.

Wolfel, et al., 1994; Brichard, et al., 1993; Renkvist et al, Cancer immunology immunotherapy 2001 50:3-15; Novellino L, et al., March 2004 update.

Cancer Immunol Immunotherapy. 54:187-207, 2005]. Peptídeos tumorais restritos de tirosinase HLA derivados de antígenos associados a tumores (TAA) podem ser encontrados no site do Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura dei Tumori em www.istitutotumori.mi.it.

Exemplos não limitativos de peptídeos antigênicos de tirosinase restritos ao MHC de classe I são fornecidos em WO2008 / 120202, que é totalmente incorporado neste documento por referência em sua totalidade, por exemplo, na Tabela 139 de WO2008 / 120202. De acordo com algumas modalidades da invenção, o peptídeo antigênico da tirosinase é o peptídeo TyrD369-377 . Domínios de ligação que se ligam especificamente a TyrD, um epítopo dentro de TyrD, incluindo, mas não se limitando àqueles que se ligam de maneira restrita a HLA (por exemplo, HLA de classe I), incluem, sem limitação, aqueles descritos em WO 2016/199140; WO 2016/199141; US 9688739; e no pedido copendente PCT / IB2017 / 053539, os conteúdos de cada um dos quais são incorporados por referência na totalidade e para todos os efeitos, incluindo, mas não se limitando a composições e métodos para identificar, fazer e usar domínios de ligação que ligam especificamente TyrD, ou um epítopo dentro de TyrD, por exemplo, de forma restrita a HLA ou independente de HLA.

Os peptídeos GPC3 que se ligam a moléculas HLA de classe I (também aqui referidos indistintamente como epítopos GPC3 restritos a HLA, epítopos GPC3 restritos a HLA e antígenos GPC3 restritos a MHC) são derivados da proteína glypican3 (Número de acessão do Genebank: NM_001164617.2) e têm tipicamente 8-10 aminoácidos de comprimento, ligam-se à ranhura α1-α2 da cadeia pesada por meio de dois ou três resíduos de âncora que interagem com os bolsos de ligação correspondentes na molécula de HLA.

Como utilizado neste documento, um domínio de ligação, CAR ou célula T CAR, que se liga especificamente a TyrD e / ou se liga especificamente a um epítopo dentro de TyrD inclui, sem limitação, domínios de ligação, CARs ou células CAR T que se ligam especificamente a um fragmento de peptídeo TyrD.

Os domínios de ligação, CARs ou células CAR T que se ligam especificamente a um fragmento de peptídeo TyrD podem ligar especificamente o fragmento de peptídeo TyrD referenciado de uma maneira restrita a HLA.

Da mesma forma, como utilizado neste documento, uma célula que expressa TyrD na superfície da célula inclui células que expressam, ou superexpressam, um fragmento de peptídeo TyrD na superfície da célula, tal como em um complexo de peptídeo:HLA.

Como utilizado neste documento, um domínio de ligação, CAR ou célula T CAR, que se liga especificamente a GPC3 e / ou se liga especificamente a um epítopo dentro de GPC3 inclui, sem limitação, domínios de ligação, CARs ou células CAR T que se ligam especificamente a um fragmento de peptídeo GPC3. Os domínios de ligação, CARs ou células CAR T que se ligam especificamente a um fragmento de peptídeo GPC3 podem ligar especificamente o fragmento de peptídeo GPC3 referenciado de uma maneira restrita a HLA.

Da mesma forma, como utilizado neste documento, uma célula que expressa TyrD na superfície da célula inclui células que expressam, ou superexpressam, um fragmento de peptídeo GPC3 na superfície da célula, tal como em um complexo de peptídeo:HLA.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga ao antígeno conforme expresso em um polipeptídeo funcional de comprimento total na superfície de uma célula.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga ao antígeno conforme apresentado em um complexo MHC:antígeno.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga ao antígeno de uma maneira restrita a HLA.

Os domínios de ligação que exibem especificidade para complexos MHC:antígeno são descritos, por exemplo, em WO / 2016/199140 e WO / 2016/199141. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação anti-TyrD tendo uma CDRH1 compreendendo TSGMGVS (SEQ ID NO: 33), uma CDRH2 compreendendo HIYWDDDKRYNPSLKS (SEQ ID NO: 34), uma CDRH3 compreendendo KDYGSSFYAMHY (SEQ ID NO: 35 ), CDRL1 compreendendo KASQDIHNYIA (SEQ ID NO: 36), uma CDRL1 compreendendo YTSTLQP (SEQ ID NO: 37) e / ou uma CDRL2 compreendendo LQYDNLWT (SEQ ID NO: 38). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação anti-GPC3 tendo uma CDRH1 compreendendo DYEMH (SEQ ID NO: 39) (ou GYTFTDYEMH (SEQ ID NO: 40)), uma CDRH2 compreendendo ALDPKTGDTAYSQKFKG (SEQ ID NO: 41), uma CDRH3 compreendendo FYSYTY (SEQ ID NO: 42), CDRL1 compreendendo RSSQSLVHSNRNTYLH (SEQ ID NO: 43), uma CDRL2 compreendendo KVSNRFS (SEQ ID NO: 44) e / ou uma CDRL3 compreendendo SQNTHVPPT (SEQ ID NO: 45). A presente divulgação também contempla os domínios de ligação anti- TyrD ou anti-GPC3 que competem pela ligação com uma sequência aqui fornecida.

Pode-se determinar se um domínio de ligação anti-TyrD liga ao mesmo epítopo que, ou compete por ligação com, um anticorpo de referência ou domínio de ligação usando métodos conhecidos.

Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste liga ao mesmo epítopo que um domínio de ligação de referência, pode-se permitir que o domínio de ligação de referência seja deixado ligar a TyrD em condições de saturação.

Em seguida, a capacidade de um domínio de ligação de teste para ligar à molécula

TyrD pode ser avaliada.

Se o domínio de ligação de teste é capaz de ligar a TyrD após ligação de saturação com o domínio de ligação de referência, pode-se concluir que o domínio de ligação de teste liga a um epítopo diferente do domínio de ligação de referência.

Por outro lado, se o domínio de ligação de teste não for capaz de ligar a TyrD em seguida a ligação de saturação com o domínio de ligação de referência, então, o domínio de ligação de teste pode ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo domínio de ligação de referência.

Para determinar se um domínio de ligação compete por ligação com um domínio de ligação de referência, a metodologia de ligação acima descrita é realizada em duas orientações: em uma primeira orientação, o domínio de ligação de referência é deixado ligar TyrD em condições de saturação seguido por avaliação de ligação do domínio de ligação de teste à molécula TyrD.

Em uma segunda orientação, o domínio de ligação de teste é deixado ligar a uma molécula TyrD em condições de saturação, seguido de avaliação de ligação do domínio de ligação de referência à molécula TyrD.

Se, em ambas as orientações, apenas o primeiro domínio de ligação (saturação) é capaz de ligar à molécula TyrD, então, conclui-se que o domínio de ligação de teste e o domínio de ligação de referência competem por ligação a TyrD.

Como será apreciado por uma pessoa versada na técnica, um domínio de ligação que compete por ligação com um domínio de ligação de referência pode não necessariamente ligar ao epítopo idêntico como o domínio de ligação de referência, mas pode bloquear estericamente a ligação do domínio de ligação de referência ligando um epítopo sobreposto ou adjacente.

Os métodos descritos acima para determinar a competição e a ligação do epítopo com um domínio de ligação anti-TyrD podem da mesma forma ser aplicados a domínios de ligação anti-TyrD.

Dois domínios de ligação ligam ao mesmo epítopo ou epítopo sobreposto se cada um inibir competitivamente (bloquear) a ligação do outro ao antígeno.

Isto é, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um domínio de ligação inibe ligação do outro em pelo menos 50%, por exemplo, 75%, 90% ou mesmo 99%, conforme medido em um ensaio de ligação competitiva (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). Alternativamente, dois domínios de ligação têm o mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam ligação de um domínio de ligação reduzirem ou eliminarem ligação do outro.

Dois domínios de ligação têm epítopos sobrepostos se algumas mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam ligação de um domínio de ligação reduzirem ou eliminarem ligação do outro.

Experimentação de rotina adicional (por exemplo, mutação de peptídeo e análises de ligação) pode, então, ser realizada para confirmar se a ausência observada de ligação do domínio de ligação de teste é, de fato, devida à ligação ao mesmo epítopo que o domínio de ligação de referência ou se bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada.

Experimentos deste tipo podem ser realizados utilizando ELISA, RIA, ressonância de plásmon de superfície, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação quantitativo ou qualitativo disponível na técnica.

A presente divulgação fornece anticorpos e CARs com "identidade substancial" ou "similaridade substancial" para as sequências fornecidas neste documento nas regiões CDR ou framework.

O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se referindo a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo, indica que, quando alinhado de forma otimizada com outro ácido nucleico (ou a fita de complementaridade do outro ácido nucleico), há identidade de sequência de nucleotídeo em %, por exemplo , pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou

100% das bases de nucleotídeos, conforme medido por qualquer algoritmo bem conhecido de identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou GAP, conforme discutido abaixo.

Uma molécula de ácido nucleico com identidade substancial para uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em certos casos, codificar um polipeptídeo tendo a mesma ou substancialmente semelhante sequência de aminoácido que o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.

Conforme aplicado a polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou "substancialmente similar" significa que duas sequências de peptídeos, quando alinhadas de forma otimizada, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de gap padrão, compartilham pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou 100% de identidade de sequência.

Em alguns aspectos, posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativas.

Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não mudará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína.

Em casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a percentagem ou o grau de semilaridade podem ser ajustados para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição.

Meios para realizar este ajuste são bem conhecidos pelos especialistas na técnica.

Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol.

Biol. 24: 307-331, que está aqui incorporado por referência.

Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais de hidroxila alifática: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais acídicas: aspartato e glutamato e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina.

Grupos de substituição de aminoácidos conservativos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.

Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer mudança tendo um valor positivo na matriz de probabilidade log PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45, aqui incorporado por referência.

Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer mudança tendo um valor não negativo na matriz de probabilidade log PAM250. Identidade e/ou similaridade de sequência para polipeptídeos é tipicamente medida usando software de análise de sequência.

Software de análise de proteína combina sequências semelhantes usando medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácidos conservativas.

Por exemplo, software GCG contém programas, tal como GAP e BESTFIT que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tal como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína tipo selvagem e uma muteína da mesma.

Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. Sequências de polipeptídeo também podem ser comparadas usando FASTA com parâmetros padrão ou recomendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e percentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson (2000) supra). Sequências também podem ser comparadas usando o algoritmo de pesquisa de homologia Smith- Waterman usando uma pesquisa de gap affine com uma penalidade de abertura de gap de 12 e uma penalidade de extensão de gap de 2, matriz BLOSUM de 62. Outro algoritmo preferido quando comparando uma sequência divulgada aqui com uma base de dados contendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros padrão.

Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J.

Mol.

Biol. 215: 403-410 e (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

São fornecidos aqui CARs anti-TyrD ou anti-GPC3 compreendendo variantes de qualquer das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas). Por exemplo, a presente divulgação inclui CARs anti- TyrD tendo sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 20 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos, ou 1 substituição de aminoácido em relação a qualquer das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR (por exemplo, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3) divulgadas neste documento.

Por exemplo, um CAR anti- TyrD pode compreender 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituição de aminoácidos (por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas) em relação a qualquer das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR (por exemplo, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3) aqui divulgadas.

Da mesma forma, a presente divulgação inclui CARs anti-GPC3 tendo sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 20 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos ou 1 substituição de aminoácido em relação a qualquer das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR (por exemplo, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3) divulgadas neste documento.

Por exemplo, um CAR anti-GPC3 pode compreender 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituição de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas) em relação a qualquer das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR (por exemplo, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3) aqui divulgadas.

Domínios de ligação exemplificativos aqui descritos compreendem tipicamente, na ordem do terminal amino ao carbóxi, uma região de cadeia pesada seguida por uma região de cadeia leve (VH-VL). Quando uma certa ordem de região VH e VL no domínio de ligação é explicitamente ou implicitamente descrita, a presente divulgação também é entendida para descrever a modalidade alternativa na qual a ordem de regiões VH e VL é invertida, por exemplo, em um scFV ou um CAR compreendendo um domínio de ligação scFv.

Assim, a descrição de uma ordem VH- VL também descreve a ordem VL-VH alternativa, por exemplo, em um scFV ou um CAR compreendendo um domínio de ligação de scFv.

Além disso, a descrição de uma ordem VL-VH também descreve a ordem VH-VL alternativa, por exemplo, em um scFV ou um CAR compreendendo um domínio de ligação de scFv.

Geralmente, ácidos nucleicos codificando CAR aqui descritos incluem uma porção de ligante extracelular que codifica um ligante de peptídeo que liga o domínio de ligação a um domínio transmembranar.

Porções de ligante exemplificativas incluem, sem limitação, uma porção de ligante que codifica o domínio de dobradiça CD8α, por exemplo, SEQ ID NO:1 (PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY) ou SEQ ID NO:2 (TTTPAPRP PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY). Tipicamente, a região codificando o ligante peptídico (por exemplo, domínio de dobradiça CD8α) é 3' da região codificando o domínio de ligação e 5' de uma região codificando um domínio transmembranar.

Os ácidos nucleicos codificando CAR aqui descritos incluem um domínio transmembranar.

O domínio transmembranar pode ligar um domínio de ligação a antígeno extracelular, por exemplo, e dobradiça, a um ou mais componentes de sinalização intracelular.

Por exemplo, o domínio transmembranar pode ligar um domínio de ligação a antígeno, por exemplo, e dobradiça, a um domínio de sinalização de CD3ζ e, opcionalmente, com um ou dois endodomínios de coestimulação.

Domínios transmembranares exemplificativos incluem, sem limitação, um domínio transmembranar CD8α, por exemplo, SEQ ID NO: 3 (IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC). Tipicamente, a região codificando o domínio transmembranar (por exemplo, domínio transmembranar CD8α) está a 3' da região codificando o ligante peptídico (por exemplo, domínio de dobradiça CD8α) e 5' de uma região codificando um ou mais domínios citoplasmáticos.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica uma região citoplasmática contendo um ou mais domínios citoplasmáticos.

A região codificando a região citoplasmática está tipicamente 3' da região codificando o domínio transmembranar.

Os domínios citoplasmáticos são tipicamente domínios de sinalização que fornecem um sinal de ativação para proliferação de célula T γδ, atividade citotóxica e/ou expressão de citocina pró-inflamatória (por exemplo, TNF-α ou IFNγ). Um domínio citoplasmático exemplificativo é um domínio de sinalização CD3ζ.

Em algumas modalidades, o domínio de sinalização CD3ζ é ou compreende SEQ ID NO: 4 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGR

REEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERR RGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR). Em algumas modalidades, o domínio de sinalização CD3ζ é ou compreende a SEQ ID NO: 5 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDV

LDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR). Em algumas modalidades, a região citoplasmática contém múltiplos (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) domínios de sinalização, tal como múltiplos (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) domínios de sinalização CD3ζ, por exemplo, cada selecionado independentemente de SEQ ID NO: 4 e 5. Em algumas modalidades, a região citoplasmática contém múltiplos (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) domínios de sinalização não CD3ζ e um domínio de sinalização CD3ζ. Em algumas modalidades, a região citoplasmática contém um domínio de sinalização não CD3ζ e múltiplos (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) domínios de sinalização CD3ζ. Os domínios de sinalização adicionais ou alternativos incluem, sem limitação. A região citoplasmática pode conter um ou mais endodomínios de coestimulação. Uma região codificando um ou mais endodomínios de coestimulação pode estar a 5' ou 3' de uma região codificando um domínio de sinalização. Em algumas modalidades, a região codificando um ou mais endodomínios de coestimulação está a 5' da região codificando um domínio de sinalização. Em algumas modalidades, uma região codificando um ou mais endodomínios de coestimulação está a 5' de um domínio de sinalização e uma região adicional codificando um ou mais endodomínios de coestimulação está a 3' do domínio de sinalização. Endodomínios de coestimulação exemplificativos incluem, sem limitação, CD28; CD137 (4-1BB); CD278 (ICOS); CD27; CD134 (OX40); e endodomínios de coestimulação TLR2 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, modalidades de sinalização adicionais podem ser incluídas para aumentar a proliferação, persistência e / ou atividade citotóxica das células γδ-T aqui descritas.

Por exemplo, em algumas modalidades, o construto CAR pode codificar uma citocina de cadeia gama comum solúvel na extremidade 3' do ácido nucleico isolado.

A região de codificação de citocina de cadeia gama comum pode ser ligada à porção 5' do construto CAR através de uma região de codificação de ligante T2A, de modo que a citocina de cadeia gama comum seja clivada do polipeptídeo CAR e secretada pela célula.

Em algumas modalidades, o construto codifica pelo menos um endodomínio de coestimulação 4-1BB e, opcionalmente, um segundo endodomínio de coestimulação selecionado de um endodomínio de coestimulação 4-1BB, ICOS, CD28 e CD27. Em algumas modalidades, o construto codifica pelo menos dois endodomínios de coestimulação 4-1BB ou dois endodomínios de coestimulação 4- 1BB em combinação com um, dois, três ou quatro ou mais endodomínios de coestimulação selecionados de um 4-1BB, ICOS, CD28 e CD27. Em algumas modalidades, o endodomínio de coestimulação 4-1BB compreende SEQ ID NO: 6 (KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCEL). Em algumas modalidades, o construto codifica um endodomínio de coestimulação CD27 e, opcionalmente, um segundo endodomínio de coestimulação selecionado de um endodomínio de coestimulação 4-1BB, ICOS, CD28 e CD27. Em algumas modalidades, o construto codifica um endodomínio de coestimulação de CD27 e um endodomínio de coestimulação 4-1BB.

Em algumas modalidades, o construto codifica dois endodomínios de coestimulação CD27. Em algumas modalidades, o endodomínio de coestimulação CD27 compreende SEQ ID NO: 7 (QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQED YRKPEPACSP). Em algumas modalidades, o construto codifica um sinal de secreção, por exemplo, SEQ ID NO: 12 (MALPVTALLLPLALLLHAARP) operativamente ligado para facilitar secreção de um polipeptídeo C-terminal, tal como uma citocina que suporta a ativação, citotoxicidade e/ou persistência de uma célula T (por exemplo,

célula CAR-T). Em algumas modalidades, o sinal de secreção é um sinal de secreção de SEQ ID NO: 26 (MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEA). Em algumas modalidades, o construto codifica um sinal de secreção, por exemplo, SEQ ID NO: 12 operativamente ligado para facilitar secreção de uma citocina de cadeia gama comum, tal como IL-15 ou um fragmento ativo da mesma, por exemplo, SEQ ID NO: 14 (NWVNVISDLKKIED

LIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSL SSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS). Outras sequências de IL- 15, incluindo sequências de ácido nucleico otimizadas por códon codificando sIL15 são divulgadas em WO 2007/037780. Citocinas de cadeia gama comuns exemplificativas incluem IL-2 e IL-15. Em algumas modalidades, a citocina de cadeia gama comum é selecionada de IL-2, IL-7 e IL-15. Em algumas modalidades, o construto codifica uma ou mais regiões ligantes multicistrônicas, por exemplo, entre um domínio de sinalização e/ou endodomínio de coestimulação e um sinal de secreção operativamente ligado para facilitar secreção de uma citocina. Uma região ligante multicistrônica é uma região de sequência polipeptídica ou sequência de RNA que facilita a produção de múltiplos polipeptídeos distintos de um único produto de transcrição. Em algumas modalidades, a região de ligante multicistrônica codifica uma sequência de clivagem. Sequências de clivagem adequadas incluem sequências de autoclivagem, tal como uma sequência de clivagem P2A, F2A, E2A ou T2A e/ou sequências que são clivadas por uma protease endógena, tal como furina. Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é uma sequência de clivagem P2A. Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é uma sequência de clivagem de furina. Em algumas modalidades, as sequências de clivagem são uma sequência de clivagem P2A e uma de furina. Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é a sequência de clivagem P2A de SEQ ID NO: 15 (SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é uma sequência de clivagem de furina de SEQ ID NO: 16 (RAKR). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é uma sequência de clivagem P2A + furina de SEQ ID NO: 17 (RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENP GP). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é a sequência de clivagem P2A de SEQ ID NO: 25 (SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é ou compreende uma sequência de clivagem P2A de SEQ ID NO: 27 (ATNFSLLKQAGDVEENPGP). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é ou compreende uma sequência de clivagem F2A de SEQ ID NO: 28 (VKQTLNNFDLLKLAGDVESNPGP). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é ou compreende uma sequência de clivagem E2A de SEQ ID NO: 29 (QCTNYALLKLAGDVESNPGP). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é ou compreende uma sequência de clivagem T2A de SEQ ID NO: 30 (EGRSLLTCGDVEENPGP). Em certos aspectos, múltiplas sequências de autoclivagem podem ser codificadas no terminal carbóxi para um domínio de sinalização e/ou coestimulatório e amino-terminal para uma citocina secretada codificada (por exemplo, citocina de cadeia gama comum, tal como IL-15), de preferência em que as múltiplas sequências de autoclivagem são independentemente selecionadas do grupo que consiste em uma sequência de clivagem P2A, uma sequência de clivagem T2A, uma sequência de clivagem E2A e uma sequência de clivagem F2A.

Em certos aspectos, uma ou mais sequências de autoclivagem e uma ou mais sequências clivadas por uma protease endógena são codificadas em um construto aqui descrito.

Em certas modalidades, um sítio de reconhecimento de protease endógena é codificado amino terminal para uma sequência de autoclivagem.

Em algumas modalidades, a região de ligante multicistrônica codifica um sítio de entrada de ribossomo interno.

Um sítio de entrada de ribossomo interno exemplificativo é codificado por SEQ ID NO: 31 (CTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTAT

ATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCT GGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGA ATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGA AGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGG CGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGG CGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAAT GGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCC CATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAG

TCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTT TGAAAAACACGATGATA). Outro sítio de entrada de ribossomo interno exemplificativo é codificado por SEQ ID NO: 32 (AGCAGGTTTCCCCAACTGACACAAAACGTGCAACTTGAAACTCCGCCTGGTCTT

TCCAGGTCTAGAGGGGTAACACTTTGTACTGCGTTTGGCTCCACGCTCGATCCA CTGGCGAGTGTTAGTAACAGCACTGTTGCTTCGTAGCGGAGCATGACGGCCGT GGGAACTCCTCCTTGGTAACAAGGACCCACGGGGCCAAAAGCCACGCCCACAC GGGCCCGTCATGTGTGCAACCCCAGCACGGCGACTTTACTGCGAAACCCACTT TAAAGTGACATTGAAACTGGTACCCACACACTGGTGACAGGCTAAGGATGCCCT TCAGGTACCCCGAGGTAACACGCGACACTCGGGATCTGAGAAGGGGACTGGG

GCTTCTATAAAAGCGCTCGGTTTAAAAAGCTTCTATGCCTGAATAGGTGACCGG AGGTCGGCACCTTTCCTTTGCAATTACTGACCAC). Outros sítios de entrada de ribossomo internos adequados incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em Nucleic Acids Res. 2010 Jan;38(Database issue):D131-6. doi: 10.1093/nar/gkp981. Epub 2009, 16 de novembro, aqueles descritos em iresite.org, aqueles descritos em WO 2018/215787,

a sequência descrita em Nº de acessão GenBank KP019382.1, e o elemento IRES divulgado no No. de acessão GenBank LT727339.1, cujo conteúdo é incorporado por referência na totalidade e para todos os fins e em particular para os sítios de entrada do ribossomo interno e seu uso aqui descrito. Regiões ligantes multicistrônicas adicionais, incluindo autoclivagem de clivagem e elementos IRES, são divulgadas em US 2018/0360992 e US 8.865.467. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO:8 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIHNYIAWY

QQKPGKAPKLLIHYTSTLQPGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQYDN LWTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGF SLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLT MTNMDPVDTATYYCARKDYGSSFYAMHYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIA SQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQ

NQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR), um polipeptídeo hD11-CD8-BBz compreendendo um domínio de ligação anti-TyrD hD11 (anti-TyrD369- 377), uma dobradiça CD8α e região transmembranar, um endodomínio de coestimulação 4-1BB e um domínio de sinalização CD3ζ. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo anti-TyrD369-377-CD8-BBz compreende a sequência de SEQ ID NO:9 (ATGTCCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACG

CCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTCACAACTATATAG CTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCACTATACAT CCACTTTGCAACCAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACA GATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACT GTCTACAGTATGATAATCTCTGGACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAAATCA AACGGGGTGGAGGTGGATCTGGAGGAGGAGGATCCGGTGGAGGAGGTCAGAT CACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGC TGACCTGCACCTTCTCTGGGTTCTCACTCAGCACTAGTGGAATGGGTGTGTCCT GGATCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACACATTTATTGG GATGATGATAAGCGCTACAACCCATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCACCAAG GACACCTCCAAAAACCAGGTGGTCCTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGAC ACAGCCACATATTACTGTGCACGAAAGGACTACGGTAGTAGCTTCTATGCTATG CACTACTGGGGTCAAGGAACCCTAGTCACCGTGTCGAGTACCACGACGCCAGC GCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTG CGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGG GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAA ACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAG GAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACT GAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTG GACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGA AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAG GCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACG

ATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTC ACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência otimizada por códon codificando uma região de dobradiça CD8α. Sequências de ácido nucleico da região dobradiça de CD8α otimizadas por códon exemplificativos incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 10

(ACCACCACCCCTGCACCAAGGCCCCCGACTCCCGCGCCCACCATCGCGTCAC A

GCCTCTTAGCCTGCGACCGGAAGCATGCAGACCAGCTGCCGGGGGGGCCGTG CATACGAGAGGTTTGGACTTCGCCTGCGAT). Em algumas modalidades, a região de dobradiça CD8α é codificada pela seguinte sequência SEQ ID NO:11 (ACCACGACGCCAGCG

CCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGC

GCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGC TGGACTTCGCCTGTGAT). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 18 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIHNYIAWY

QQKPGKAPKLLIHYTSTLQPGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQYDN LWTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGF SLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLT MTNMDPVDTATYYCARKDYGSSFYAMHYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIA SQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQ NQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRSGSGATNFS LLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDA

TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTE SGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS*), um polipeptídeo hD11-CD8-BBz- sIL15 compreendendo um anti-TyrD hD11 (anti-TyrD369-377) domínio de ligação, uma dobradiça CD8α e região transmembranar, um endodomínio de coestimulação 4-1BB, um domínio de sinalização de CD3ζ, uma sequência de clivagem furina-P2A e um sinal de secreção operativamente ligado a um domínio IL-15.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo hD11-CD8-BBz-sIL15 compreende a sequência de SEQ ID NO: 19 (ATGTCCGTGCCTACCCAG

GTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACGCCAGATGCGACATCCAGAT GACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAC TTGCAAGGCGAGTCAGGACATTCACAACTATATAGCTTGGTATCAGCAGAAACC AGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCACTATACATCCACTTTGCAACCAGGGGT CCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAG CAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCTACAGTATGATAATCTC TGGACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAAATCAAACGGGGTGGAGGTGGATC TGGAGGAGGAGGATCCGGTGGAGGAGGTCAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGTC CTACGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGCTGACCTGCACCTTCTCTGGGT TCTCACTCAGCACTAGTGGAATGGGTGTGTCCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGA AAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACACATTTATTGGGATGATGATAAGCGCTACAAC CCATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCACCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTG GTCCTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACATATTACTGTGCA CGAAAGGACTACGGTAGTAGCTTCTATGCTATGCACTACTGGGGTCAAGGAACC CTAGTCACCGTGTCGAGTACCACCACCCCTGCACCAAGGCCCCCGACTCCCGC GCCCACCATCGCGTCACAGCCTCTTAGCCTGCGACCGGAAGCATGCAGACCAG CTGCCGGGGGGGCCGTGCATACGAGAGGTTTGGACTTCGCCTGCGATATCTAC ATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTAT CACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCA TTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTT CCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGC AGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATC TAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCT GAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACA ATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAA GGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTA CAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC CGCGCGAAGCGATCAGGCAGCGGGGCGACAAATTTCAGCCTTCTGAAACAAGC AGGCGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCAATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGC TCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGAACTGGGTGAATGTA ATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTAC TTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGC TTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATG ATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAA

TGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAA AGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 20 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMH

WVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLTSED TAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGDVVMTQSPLSLPVTP GEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIAS QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRK KLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQN

QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*), um polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação GC33 anti-GPC3, uma dobradiça CD8α e região transmembranar, um endodomínio de coestimulação 4-1BB e um domínio de sinalização CD3ζ. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo GC33-CD8-BBz compreende a sequência de SEQ ID NO: 21 (ATGTCCGTGCCTACCCAGG

TGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACGCCAGATGCCAAGTGCAGCTG GTCCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCTGGCGCCAGCGTGAAGGTGTCCT GCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCGACTACGAGATGCACTGGGTGCGGCAG GCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGCTCTGGACCCCAAGACCGGCG ACACCGCTTATAGCCAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCCTGACAGCTGATAAGA GCACAAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACACCGCC GTGTACTACTGCACCAGATTCTACAGCTACACCTACTGGGGCCAGGGGACCCT GGTGACAGTGTCTAGCGGTGGAGGTGGATCTGGAGGAGGAGGATCCGGTGGA GGAGGTGATGTGGTGATGACCCAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACCCCTGG AGAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAATCTCTGGTGCACAGCAACC GGAACACATACCTGCACTGGTACCTGCAGAAACCTGGCCAGAGCCCCCAGCTG CTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGA TCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCTAGAGTGGAAGCCGAGGA CGTGGGCGTGTACTACTGCAGCCAGAACACCCACGTGCCCCCCACCTTCGGCC AGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACA CCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCC GGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTG ATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCAC TGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAA ACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTG CCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCA GGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGA GCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCC GGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGG CCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTG GGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGG

TCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC CCCCTCGCTAA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 22 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMH

WVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLTSED TAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGDVVMTQSPLSLPVTP GEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIAS QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRK KLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQN QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAG DVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTES

DVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKE CEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS*), um polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação GC33 anti-GPC3, uma dobradiça CD8α e região transmembranar, um endodomínio de coestimulação 4-1BB, um domínio de sinalização CD3ζ, uma furina e região de clivagem P2A e um sinal de secreção operativamente ligado a um domínio IL-15. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo GC33-CD8-BBz-sIL15 compreende a sequência de SEQ ID NO: 23 (ATGTCCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACG

CCAGATGCCAAGTGCAGCTGGTCCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCTGG CGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCGACTACG AGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGC TCTGGACCCCAAGACCGGCGACACCGCTTATAGCCAGAAGTTCAAGGGCAGAG TGACCCTGACAGCTGATAAGAGCACAAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGC CTGACCAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGATTCTACAGCTACAC CTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGGTGGAGGTGGATCT GGAGGAGGAGGATCCGGTGGAGGAGGTGATGTGGTGATGACCCAGAGCCCTC TGAGCCTGCCTGTGACCCCTGGAGAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGC CAATCTCTGGTGCACAGCAACCGGAACACATACCTGCACTGGTACCTGCAGAAA CCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGG CGTGCCTGATAGATTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGA TCTCTAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCAGCCAGAACACC CACGTGCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGACCACGAC GCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTG TCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACG AGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGAC TTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAG AAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACT CAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATG TGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAG GGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGA TGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAG AGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATG GCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGG GGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGAC GCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGTAGCGGGGCTACGAACTTCTC CCTTCTTAAACAAGCGGGAGACGTGGAAGAAAATCCCGGACCTATGGCCTTACC AGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGA ACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATG CATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAA CAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGA TGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTG TCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAG

GAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCAT CAACACTTCTTGA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo GC33-CD8-BBz-sIL15 compreende a sequência de SEQ ID NO: 24 (ATGTCCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACG

CCAGATGCCAAGTGCAGCTGGTCCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCTGG CGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCGACTACG AGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGC TCTGGACCCCAAGACCGGCGACACCGCTTATAGCCAGAAGTTCAAGGGCAGAG TGACCCTGACAGCTGATAAGAGCACAAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGC CTGACCAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGATTCTACAGCTACAC CTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGGTGGAGGTGGATCT GGAGGAGGAGGATCCGGTGGAGGAGGTGATGTGGTGATGACCCAGAGCCCTC TGAGCCTGCCTGTGACCCCTGGAGAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGC CAATCTCTGGTGCACAGCAACCGGAACACATACCTGCACTGGTACCTGCAGAAA CCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGG CGTGCCTGATAGATTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGA TCTCTAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCAGCCAGAACACC CACGTGCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGACCACGAC GCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTG TCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACG AGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGAC TTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAG AAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACT CAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATG TGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAG GGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGA TGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAG AGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATG GCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGG GGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGAC GCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGTAGCGGGGCTACGAACTTCTC CCTTCTTAAACAAGCGGGAGACGTGGAAGAAAATCCCGGACCTATGGCCTTACC AGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGA ACTGGGTGAATGTGATCAGCGATCTGAAGAAGATCGAGGATCTGATCCAGTCCA TGCACATCGATGCCACCCTGTATACCGAGAGCGATGTGCACCCCAGCTGCAAG GTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAGCTGCAGGTGATCTCCCTGGAGTC CGGAGATGCCAGCATCCACGATACCGTGGAGAATCTGATCATCCTGGCCAACA ACAGCCTGTCCTCCAATGGCAATGTGACCGAGTCGGGATGCAAGGAGTGCGAG

GAGCTGGAGGAGAAGAATATCAAGGAGTTTCTGCAGAGCTTTGTACATATTGTC CAAATGTTCATCAACACTTCTTGA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado é um ácido nucleico linear. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado é um vetor, como um vetor plasmídeo, um vetor adenoviral, um vetor viral adeno-associado, um vetor viral, um vetor retroviral (por exemplo, um vetor retroviral gama) ou um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado, ou, por exemplo, uma porção contígua do mesmo contendo o domínio de ligação domínio transmembranar e um ou mais endodomínios de sinalização e/ou coestimulação é integrado no genoma de uma célula hospedeira, tal como um hospedeiro de célula T γδ. Em uma modalidade exemplificativa, o ácido nucleico isolado é vetor retroviral.

Células T γδ: Aspectos da invenção incluem células T γδ que expressam funcionalmente um ácido nucleico isolado aqui descrito e, desse modo, expressam um CAR na superfície da célula T γδ.

Aspectos da invenção podem, adicionalmente ou alternativamente, incluir células T γδ com atividade citotóxica in vitro ou in vivo contra uma célula de tumor sólido que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA). Em alguns casos, a atividade citotóxica é atividade inata.

Em alguns casos, a citotoxicidade é pelo menos em parte significativamente (> cerca de 25%), ou inteiramente, devido à presença de um construto CAR tendo um domínio de ligação que liga especificamente ao TAA expresso na superfície da célula de tumor sólido.

Em alguns casos, as células T γδ exibem atividade de matança de célula de tumor sólido da referida célula T γδ é maior do que um nível inato de atividade in vitro e/ou in vivo de atividade de matança de célula de tumor sólido em uma célula T γδ de controle.

Em alguns casos, a célula T γδ de controle não compreende um construto CAR.

Em alguns casos, a célula T γδ de controle compreende um construto CAR carecendo de um domínio de ligação aqui descrito, uma região de dobradiça aqui descrita, um domínio transmembranar aqui descrito, um domínio de sinalização aqui descrito e/ou um endodomínio de coestimulação aqui descrito.

Em alguns casos, a citotoxicidade é pelo menos em parte significativamente (> cerca de 25%), ou inteiramente, devida à presença de um construto CAR tendo um domínio de ligação que liga especificamente TyrD ou um epítopo dentro de TyrD. como TyrD369-377. . Em alguns casos, a citotoxicidade é pelo menos em parte, significativamente (> cerca de 25%), ou inteiramente, devido à presença de um construto CAR tendo um domínio de ligação que se liga especificamente a TyrD ou um epítopo dentro de TyrD, como TyrD369-377 de maneira restrita HLA (por exemplo, restrita por HLA classe I). Em alguns casos, a citotoxicidade é, pelo menos em parte, significativamente (> cerca de 25%), ou inteiramente, devido à presença de um construto CAR com um domínio de ligação que se liga especificamente a HLA-A2/TyrD369-377. Em alguns casos, as células T γδ expressam funcionalmente um CAR codificado por um ácido nucleico isolado aqui descrito que se liga especificamente a TyrD ou um fragmento de peptídeo do mesmo.

Em algumas modalidades, células T γδ aqui descritas podem exibir citotoxicidade restrita a HLA (por exemplo, restrita a HLA classe I). Em outras modalidades, a maioria (> 50%), substancialmente toda (> 90%) ou toda a atividade citotóxica não é restrita por HLA (por exemplo, HLA classe I restrita). Atividade citotóxica restrita por HLA pode ser avaliada comparando citotoxicidade in vitro contra uma linhagem de célula de tumor HLA (por exemplo, HLA classe I) (nula) versus citotoxicidade in vitro contra uma linhagem de célula de tumor HLA + (por exemplo, HLA classe I+). Em algumas modalidades, a atividade citotóxica restrita pr HLA é pelo menos em parte significativamente (> 25%), ou inteiramente, fornecida pelo uso de um domínio de ligação tipo Receptor de células T.

Domínios de ligação tipo receptor de célula T são domínios de ligação que reconhecem especificamente o antígeno quando apresentado na superfície de uma célula em complexo com uma molécula de MHC.

Domínios de ligação tipo Receptor de célula T são descritos adicionalmente, por exemplo, em WO 2016/199141. Células T γδ aqui descritas podem exibir atividade de matança de célula de tumor sólido robusta e/ou persistente.

Em alguns casos, a atividade de morte de células tumorais sólidas pode persistir por pelo menos cerca de 6 dias a 120 dias, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias, a partir do primeiro contato com uma célula de tumor sólido.

Em alguns casos, a atividade de morte de células de tumor sólido de uma célula T γδ aqui descrita, ou uma progênie da mesma, pode persistir por pelo menos cerca de 6 dias a 120 dias, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias, desde o primeiro contato com uma célula de tumor sólido, ou a partir da administração da célula T γδ aqui descrita.

Esta atividade de morte de célula de tumor sólido persistente pode ser exibida in vitro, in vivo, ou in vitro e in vivo.

Aspectos da invenção podem adicionalmente ou alternativamente, incluir células T γδ que proliferam em resposta a contato com células que exibem expressão de superfície de célula, ou superexpressão, do antígeno associado a tumor (TAA). As células que exibem expressão de superfície celular do antígeno associado a tumor (TAA) podem ser células normais, como células endoteliais normais.

As células que exibem expressão de superfície de célula, ou superexpressão, do antígeno associado a tumor (TAA) podem ser células de tumor sólido.

Em alguns casos, a proliferação é uma atividade inata.

Em alguns casos, a proliferação é pelo menos em parte, significativamente (> cerca de 20% ou> cerca de 25%), ou inteiramente, devido à presença de um construto CAR tendo um domínio de ligação que se liga especificamente ao TAA expresso na superfície da célula.

Em alguns casos, as células T γδ exibem um nível maior de proliferação in vitro e/ou in vivo em comparação com uma célula T γδ de controle.

Em alguns casos, a célula T γδ de controle não compreende um construto CAR.

Em alguns casos, a proliferação é pelo menos em parte significativamente (> cerca de 20 ou > cerca de 25%), ou inteiramente, devida à presença de um construto CAR tendo um domínio de ligação que liga especificamente TyrD ou um epítopo dentro de TyrD.

Em alguns casos, células T γδ exibindo proliferação em resposta a contato com uma célula que exibe expressão de superfície de célula de TyrD expressam funcionalmente um CAR específico de TyrD codificado por um ácido nucleico isolado aqui descrito.

As células T γδ aqui descritas podem exibir proliferação robusta e /ou persistente em um organismo hospedeiro que compreende que exibe expressão de superfície de célula, ou superexpressão, do antígeno associado a tumor (TAA). Em alguns casos, a proliferação pode persistir por pelo menos cerca de 6 dias a 120 dias, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias, desde o primeiro contato com uma célula que exibe expressão de superfície celular, ou superexpressão, do antígeno associado ao tumor (TAA) ou a partir de uma data de administração da célula T γδ ao organismo hospedeiro.

Em alguns casos, a proliferação de uma célula T γδ aqui descrita, ou uma progênie da mesma, no organismo hospedeiro que compreende a célula que exibe expressão de superfície de célula, ou superexpressão, do antígeno associado a tumor (TAA) pode persistir por pelo menos cerca de 6 dias a 120 dias, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias, do primeiro contato com a célula ou da data da primeira administração da célula T γδ ao organismo hospedeiro.

Em alguns casos, a proliferação no organismo hospedeiro é pelo menos em parte significativamente (> cerca de 20% ou > cerca de 25%), ou inteiramente, devida à presença de um construto CAR tendo um domínio de ligação que liga especificamente TyrD ou um epítopo dentro de TyrD.

Em alguns casos, células T γδ exibindo proliferação no organismo hospedeiro compreendendo uma célula que exibe expressão de superfície de célula de TyrD expressam funcionalmente um CAR específico de TyrD codificado por um ácido nucleico isolado aqui descrito.

Em algumas modalidades, as células T γδ aqui descritas expressam, ou expressam persistentemente, citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral alfa ou interferon gama após contato com a célula que expressa ou superexpressa TyrD ou um fragmento de peptídeo do mesmo na superfície da célula.

Em algumas modalidades, as células T γδ aqui descritas, ou progênie da mesma, expressam ou expressam persistentemente, citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral alfa ou interferon gama após contato com a célula que expressa ou superexpressa TyrD ou um fragmento de peptídeo do mesmo na superfície da célula, por exemplo, em um organismo hospedeiro que compreende a célula que expressa ou superexpressa TyrD ou um fragmento de peptídeo do mesmo na superfície da célula.

Em algumas modalidades, a célula T γδ, ou uma composição farmacêutica contendo a célula T γδ, exibe essencialmente nenhuma ou nenhuma resposta enxerto versus hospedeiro quando introduzida em um hospedeiro alogênico.

Em algumas modalidades, a célula T γδ, ou uma composição farmacêutica contendo a célula T γδ, exibe um nível clinicamente aceitável de resposta de enxerto versus hospedeiro quando introduzida em um hospedeiro alogênico.

Em algumas modalidades, um nível clinicamente aceitável é uma quantidade de resposta enxerto versus hospedeiro que não requer cessação de um tratamento de célula T γδ para atingir um tratamento terapeuticamente eficaz.

Em algumas modalidades, um nível clinicamente aceitável de resposta enxerto versus hospedeiro (GvHD) é uma resposta aguda que é menos severa que o Grau C de acordo com uma escala de graduação IBMTR aplicável.

A gravidade de resposta aguda enxerto versus hospedeiro é determinada por uma avaliação do grau de envolvimento da pele, do fígado e do trato gastrointestinal.

Os estágios de envolvimento de órgãos individuais são combinados para produzir um grau geral, que tem significância prognóstica.

GvHD Grau I(A) é caracterizado como doença suave, GvHD grau II(B) como moderado, grau III(C) como severa e grau IV(D) com risco de vida.

O sistema de graduação IBMTR define a severidade de GvHD aguda da seguinte forma (Rowlings et al., Br J Haematol 1997; 97:855): ● Grau A - Estágio 1 apenas envolvimento de pele (erupção maculopapular acima de <25 por cento do corpo) sem envolvimento do fígado ou gastrointestinal ● Grau B - Estágio 2 envolvimento de pele; Estágio 1 a 2 envolvimento de intestino ou fígado ● Grau C - Estágio 3 envolvimento de qualquer sistema de órgão (eritrodermia generalizada; bilirrubina 6,1 a 15,0 mg/dL; diarreia 1.500 a 2.000 mL/dia) ● Grau D - Estágio 4 envolvimento de qualquer sistema de órgão (eritrodermia generalizada com formação bolhosa; bilirrubina >15 mg/dL; diarreia >2.000 mL/dia OU dor OU íleo). Ver também, Schoemans et al., Bone Marrow Transplantation volume 53, páginas 1401–1415 (2018), por exemplo, nas Tabelas 1 e 2, que divulga critérios para avaliar e graduar GvHD aguda.

Em algumas modalidades, a célula T γδ, ou uma composição farmacêutica contendo a célula T γδ, exibe resposta enxerto versus hospedeiro reduzida ou substancialmente reduzida quando introduzida em um hospedeiro alogênico em comparação com uma resposta enxerto versus hospedeiro exibida por células T αβ de controle, ou uma composição farmacêutica de controle compreendendo as células T αβ de controle, administradas a um hospedeiro alogênico.

Em alguns casos, a célula T αβ de controle é uma célula T αβ de controle não engenheirada alogênica.

Em alguns casos, a célula T αβ de controle não compreende um CAR ou não compreende o mesmo CAR que uma célula T γδ de referência.

As células T γδ aqui descritas podem ser células T γδ δ1, δ2, δ3 ou δ4, ou combinações das mesmas.

Em alguns casos, as células T γδ são principalmente (>50%), substancialmente (>90%), essencialmente todas ou inteiramente células T γδ δ2-. Em alguns casos, as células T γδ são principalmente (>50%), substancialmente (>90%), essencialmente todas ou inteiramente células T γδ δ1. As células T γδ podem ser obtidas de um doador alogênico ou autólogo.

As células T γδ podem ser, parcialmente ou totalmente purificadas, ou não purificadas, e expandidas ex vivo.

Métodos e composições para expansão ex vivo incluem, sem limitação, aqueles descritos em WO 2017/197347. A expansão pode ser realizada antes ou depois, ou antes e depois de um construto CAR ser introduzido na(s) célula(s) T γδ.

As células T γδ descritas neste documento podem ser armazenadas, por exemplo, criopreservadas, para uso na transferência de célula adotiva.

Métodos para Inibir ou Matar Células de Tumor Uma ou múltiplas populações de células T γδ não engenheiradas, populações de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas, tendo atividade citotóxica contra uma célula de tumor sólido, podem ser administradas a um sujeito em qualquer ordem ou simultaneamente.

Se simultaneamente, as múltiplas populações de células T γδ, não engenheiradas, populações de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas, da invenção podem ser fornecidas em uma forma única unificada, tal como uma injeção intravenosa, ou em múltiplas formas, por exemplo, como múltiplas infusões intravenosas, s.c., injeções ou pílulas.

A população de células T γδ não engenheiradas, a população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas da invenção podem ser empacotadas juntas ou separadamente, em um único pacote ou em uma pluralidade de pacotes.

Uma ou todas as populações de células T γδ não engenheiradas, populações de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas da invenção podem ser dadas em doses múltiplas.

Se não simultânea, a temporização entre as doses múltiplas pode variar até cerca de uma semana, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses ou cerca de um ano.

Em alguns casos, uma população de células T γδ não engenheiradas enriquecidas, população de células T γδ enriquecidas e/ou misturas das mesmas da invenção podem proliferar dentro do corpo de um sujeito, in vivo, após a administração a um sujeito.

Uma ou mais populações de células T γδ não engenheiradas, uma ou mais populações de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas, podem ser congeladas para fornecer células para tratamentos múltiplos com a mesma preparação de células.

Uma ou mais populações de células T γδ não engenheiradas, uma ou mais populações de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas, da divulgação e composições farmacêuticas compreendendo as mesmas, podem ser empacotadas como um kit.

Um kit pode incluir instruções (por exemplo, instruções escritas) sobre o uso da população de células T γδ não engenheiradas, da população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas e composições compreendendo as mesmas.

Em alguns casos, um método para tratar um câncer sólido compreende administrar a um sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de células T γδ não engenheiradas, uma população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas, em que a administração trata o câncer sólido.

Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz da população de células T γδ não engenheiradas, da população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas é administrada por pelo menos cerca de 10 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, δ horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, δ dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses ou 1 ano.

Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz da população de células T γδ não engenheiradas, da população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas é administrada por pelo menos uma semana.

Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz da população de células T γδ não engenheiradas, da população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas é administrada por pelo menos duas semanas.

Uma população de células T γδ não engenheiradas, uma população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas, aqui descritas, podem ser administradas antes, durante ou após a ocorrência de uma doença ou condição e a temporização de administração de uma composição farmacêutica contendo a população de células T γδ pode variar.

Por exemplo, a população de células T γδ pode ser usada como um profilático e pode ser administrada continuamente a sujeitos com uma propensão a condições ou doenças, a fim de diminuir a probabilidade da ocorrência da doença ou condição.

A administração inicial pode ser via qualquer rota prática, tal como por qualquer rota aqui descrita usando qualquer formulação aqui descrita.

Em alguns exemplos, a administração de uma população de células T γδ da divulgação é uma administração intravenosa.

Uma ou múltiplas dosagens da população de células T γδ podem ser administradas assim que for praticável após o início de um câncer sólido e por um período de tempo necessário para o tratamento da doença imune, tal como, por exemplo, cerca de 24 horas a cerca de 48 horas, de cerca de 48 horas a cerca de 1 semana, de cerca de 1 semana a cerca de 2 semanas, de cerca de 2 semanas a cerca de 1 mês, de cerca de 1 mês a cerca de 3 meses.

Em algumas modalidades, uma ou múltiplas dosagens da população de células T γδ podem ser administradas anos após o início do câncer e antes ou depois de outros tratamentos.

Em algumas modalidades, a população de células T γδ é administrada simultaneamente ou sequencialmente com um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum(ns). Como aqui utilizado, "um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum(s): se refere a um método, ou combinação de métodos, que altera o estado fisiológico de um sujeito, de modo que pelo menos um nível de citocina de cadeia gama comum seja elevado no sujeito.

Em algumas modalidades, o método eleva o nível de uma ou mais citocinas de cadeia gama comuns selecionadas do grupo que consiste em IL-2, IL-7 e IL-15, de preferência em que o método eleva o nível de IL-15 no sujeito.

Em algumas modalidades, o método compreende linfodepleção.

Em algumas modalidades, o método compreende administrar uma ou mais citocinas de cadeia gama comuns ao sujeito.

Em alguns casos, IL-2, IL-7 e/ou IL-15, preferencialmente IL-15, são administradas.

Em algumas modalidades, o método compreende secreção de citocinas de cadeia gama comuns de uma célula T administrada, por exemplo, célula T γδ.

Em alguns casos, IL-2, IL-7 e/ou IL-15, de preferência IL-15, são secretadas.

Em algumas modalidades, a administração de um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum(ns) compreende linfodepleção antes de introduzir a(s) célula(s) T γδ.

Em algumas modalidades, a administração de um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreende administrar simultaneamente com a introdução da(s) célula(s) T γδ ou sequencialmente uma quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum eficaz para elevar proliferação , atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T γδ introduzida(s), preferencialmente em que o método compreende administrar IL-2 ou um ou mais miméticos da mesma, mais preferencialmente em que o método compreende administrar IL-15 ou um ou mais miméticos da mesma.

A quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum(ns) pode ser uma quantidade eficaz para elevar proliferação, atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T γδ introduzida(s) antes e/ou após introdução da(s) célula(s) T γδ.

Quantidades exemplificativas de IL-15 incluem, sem limitação, entre 0,01 - 10 µg/kg/dose a cada 24 horas.

Quantidades exemplificativas de IL-2 incluem, sem limitação, entre cerca de 3x106 e cerca de 22x106 unidades a cada 8 - 48 horas.

Por exemplo, o regime de dosagem para IL2 em RCC é de 600.000 Unidades Internacionais/kg (0,037 mg/kg) IV q8h infundido durante 15 minutos por um máximo de 14 doses.

Em algumas modalidades, a administração de um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum(ns) compreende linfodepleção antes de administrar a(s) célula(s) T γδ e administração simultaneamente com a introdução de célula(s) T γδ ou sequencialmente uma quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum(ns) eficazes para aumentar a proliferação, atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T γδ introduzidas.

EXEMPLOS Exemplo 1 PBMCs humanas a 1x106/mL em um meio de cultura de célula modificado foram ativadas em anticorpo anti-Vδ1 pré-revestido D1-08 ou D1-35 por 5 dias na presença de IL-2 (100 U/mL) em placas de 24 poços (Costar). No dia 5, culturas de células foram transduzidas com construtos γ-retrovirais codificando receptor de antígeno quimérico anti-TyrD (SEQ ID NOs: 8) na presença de retronectina. No dia 6, células foram devolvidas ao meio de cultura modificado e posteriormente expandidas com alimentação e substituição de IL-2 conforme necessário. Nos dias 17, 18 ou 19, as células foram colhidas e células T αβ restantes foram depletadas usando o kit AutoMACS® (Miltenyi Biotec). A pureza da população de células γδ e a eficiência de transdução foram avaliadas por FACS. Paralelamente, culturas de células não transduzidas foram expandidas da mesma maneira, sem adicionar o sobrenadante retroviral. Como mostrado na Fig. 2, as células Vδ1 expandidas não transduzidas eliciaram algum grau de citotoxicidade contra a linhagem de células de melanoma 526 e WM266.1-Luc que são conhecidas por expressarem tirosinase e apresentarem o peptídeo Tyr369-377. Esta citotoxicidade foi aumentada pela introdução de um CAR anti-TyrD. Citotoxicidade foi determinada por medição de luminescência total em placas de 96 poços adicionando substrato luminescente D-Luciferina (Perkin Elmer) após 18 h de coincubação em razões E/T indicadas. Exemplo 2 Células WM266.4-Luc (4x106 por animal) foram implantadas subcutaneamente em camundongos NSG (Jackson Labs). Quando os tumores atingiram o tamanho de 100-200 mm3, os animais foram tratados com células 6x106 anti-TyrD CAR+ Vδ1. Os animais foram dosados concomitantemente com IL-2 (60.000 U/dose) 3 vezes por semana ao longo do estudo.

Os resultados estão ilustrados na FIG. 3. Como mostrado na Fig. 3, os animais administrados com as células anti-TyrD CAR + Vδ1 exibiram um controle robusto da carga tumoral.

Exemplo 3 Os construtos Tyr CAR foram introduzidos em células T Vδ1 conforme descrito acima e as células foram expandidas e testadas em ensaio de citotoxicidade contra células WM266.4-Luc.

Controle, construtos de CAR não direcionados a TyrD foram usados como controle.

Os resultados são ilustrados na Fig. 5 e mostram a citotoxicidade aumentada proporcionada pelos construtos de CAR anti-TyrD.

Exemplo 4 PBMCs humanas a 1 x 106/mL em meio de crescimento foram ativadas em uma placa de 24 poços (Costar) pré-revestida com anticorpo anti-Vδ1 D1-08 ou D1-35 por 5 dias na presença de IL-2 (100 U/mL). No dia 5, as culturas de células foram transduzidas com construtos γ-retrovirais que codificam o receptor de antígeno quimérico anti-GPC3 (SEQ ID NO: 20 (GC33 CAR) ou SEQ ID NO: 22 (GC33 CAR + sIL15 e GC33 CAR + CO sIL15)) na presença de retronectina.

O CAR GC33 é codificado pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 21; GC33 CAR + sIL15 é codificado pela sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 23; GC33 CAR + CO sIL15 inclui uma região de codificação de sIL15 otimizada por códon e é codificado pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24. No dia 6, células foram devolvidas ao meio de cultura e posteriormente expandidas com alimentação e substituição de IL-2 conforme necessário.

Nos dias 17, 18 ou 19, as células foram colhidas e células T αβ restantes foram depletadas usando o kit AutoMACS® (Miltenyi Biotec). A pureza da população de células γδ e a eficiência de transdução foram avaliadas por FACS (Fig. 6). Resumidamente, as células CAR-T foram coradas incubando as células com 1 µg / mL de GPC3 biotinilado recombinante solúvel (R&D Systems). Detecção de ligação foi realizada usando estreptavidina-PE na diluição sugerida pelo fabricante de 1:500. Paralelamente, culturas de células não transduzidas foram expandidas da mesma maneira, sem adicionar o sobrenadante retroviral.

As células expandidas foram testadas no ensaio de citotoxicidade in vitro em GPC3 positivo (HepG2, Hep3B, PLC / PRF / 5). Como mostrado na Fig. 7, células Vδ1 expandidas não transduzidas induzem algum grau de citotoxicidade contra linhagens de células de câncer de fígado que são conhecidas por expressarem GPC3. Esta citotoxicidade é potencializada pela introdução de GPC3 CAR, com ou sem citocina sIL15 engenheirada para ser expressa em tandem.

Citotoxicidade foi determinada por medição de luminescência total em placas de 96 poços adicionando substrato luminescente D-Luciferina (Perkin Elmer) após 18 h de coincubação em razões E/T indicadas. * * * O precedente ilustra meramente os princípios da invenção.

Será apreciado que aqueles versados na técnica serão capazes de conceber várias disposições que, embora não explicitamente descritas ou mostradas aqui, incorporem os princípios da invenção e estejam incluídas dentro de seu espírito e escopo.

Além disso, todos os exemplos e a linguagem condicional citados aqui destinam-se principalmente a ajudar o leitor a entender os princípios da invenção e os conceitos contribuídos pelos inventores para promover a técnica, e devem ser interpretados como sendo sem limitação a tais exemplos e condições especificamente recitados.

Além disso, todas as declarações aqui recitando princípios e aspectos da invenção, bem como exemplos específicos da mesma, se destinam a abranger equivalentes tanto estruturais quanto funcionais dos mesmos.

Além disso, pretende-se que tais equivalentes incluam equivalentes atualmente conhecidos e equivalentes desenvolvidos no futuro, ou seja, quaisquer elementos desenvolvidos que executem a mesma função, independentemente da estrutura.

O escopo da presente invenção, portanto, não se destina a ser limitado aos aspectos exemplares mostrados e descritos aqui.

Pelo contrário, o escopo e o espírito da presente invenção são concretizados pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Sequência de ácido nucleico isolada codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), CARACTERIZADA pelo fato de que o CAR compreende a. um domínio de ligação que liga especificamente a um complexo de proteína-peptídeo compreendendo um peptídeo de antígeno associado a tumor (TAA) e uma proteína MHC, em que o complexo é expresso em uma superfície de uma célula de tumor sólida, opcionalmente em que o domínio de ligação liga ao complexo de uma maneira restrita de HLA; b. um domínio de dobradiça CD8α; c. um domínio transmembrana CD8α; d. uma região de sinalização coestimulatória selecionada de uma região de sinalização coestimulatória de 4-1BB e uma região de sinalização coestimuladora CD27; e e. um domínio de sinalização CD3ζ.

2. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que (a) - (e) estão na ordem 5' para 3'.

3. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o TAA compreende uma região contígua de TyrD.

4. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a região contígua de TyrD compreende pelo menos, ou pelo menos cerca de, 4 e não mais que, ou não mais que cerca de, 12 aminoácidos contíguos de TyrD, preferencialmente, ou preferencialmente cerca de, 7 , 8 ou 9 aminoácidos contíguos de TyrD.

5. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a região contígua de TyrD é TyrD369-377.

6. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação que liga especificamente ao complexo de MHC de peptídeo de TAA liga especificamente HLA-A2/TyrD369-377.

7. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação liga especificamente ao epítopo ligado por, ou compete com, um anticorpo compreendendo: a. uma CDRH1 compreendendo TSGMGVS (SEQ ID NO: 33); b. uma CDRH2 compreendendo HIYWDDDKRYNPSLKS (SEQ ID NO: 34); c. uma CDRH3 compreendendo KDYGSSFYAMHY (SEQ ID NO: 35); d. uma CDRL1 compreendendo KASQDIHNYIA (SEQ ID NO: 36); e. uma CDRL1 compreendendo YTSTLQP (SEQ ID NO: 37); e f. uma CDRL2 compreendendo LQYDNLWT (SEQ ID NO: 38).

8. Sequência de ácido nucleico isolada codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), CARACTERIZADA pelo fato de que o CAR compreende a. um domínio de ligação que liga especificamente a um antígeno associado a tumor (TAA) expresso em uma superfície de uma célula de tumor sólida, opcionalmente em que o antígeno é um complexo proteína-peptídeo, em que a proteína é uma proteína de MHC, em que o domínio de ligação liga ao complexo proteína -peptídeo de uma maneira restrita de HLA; b. um domínio de dobradiça CD8α; c. um domínio transmembrana CD8α; d. uma região de sinalização coestimulatória selecionada de uma região de sinalização coestimulatória de 4-1BB e uma região de sinalização coestimuladora CD27; e e. um domínio de sinalização CD3ζ.

9. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 8,

CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação liga especificamente um epítopo dentro de GPC3 expresso na superfície de uma célula de tumor sólida.

10. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação compreendendo as seguintes regiões determinantes de complementaridade (CDRs) liga ao mesmo epítopo de GPC3 como um anticorpo compreendendo as seguintes CDRs e/ou compete por ligação a um epítopo de GPC3 com um anticorpo compreendendo as seguintes CDRs: a. uma CDRH1 compreendendo uma sequência de DYEMH (SEQ ID NO: 39) (ou GYTFTDYEMH (SEQ ID NO: 40)); b. uma CDRH2 compreendendo uma sequência de ALDPKTGDTAYSQKFKG (SEQ ID NO: 41); c. uma CDRH3 compreendendo uma sequência de FYSYTY (SEQ ID NO: 42); d. uma CDRL1 compreendendo uma sequência de RSSQSLVHSNRNTYLH (SEQ ID NO: 43); e. uma CDRL2 compreendendo uma sequência de KVSNRFS (SEQ ID NO: 44); e/ou uma f. CDRL3 compreendendo uma sequência de SQNTHVPPT (SEQ ID NO: 45).

11. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o CAR compreende: a. um domínio de dobradiça CD8α compreendendo SEQ ID NO:1 (PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY) or SEQ ID NO:2 (TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY); b. um domínio transmembrana CD8α compreendendo SEQ ID NO:3 (IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC); e/ou c. um domínio de sinalização de CD3ζ compreendendo: (i) SEQ ID NO:4

(RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRK

NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR); ou (ii) SEQ ID NO:5 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN

PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR).

12. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que o CAR compreende: a. uma região de sinalização coestimuladora 4-1BB compreendendo SEQ ID NO:6 (KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL); ou b. uma região de sinalização coestimuladora de CD27 compreendendo SEQ ID NO:7. (QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP), ou em que o ácido nucleico isolado codifica a região de sinalização coestimulatória de 4-1BB compreendendo SEQ ID NO:6 e a região de sinalização coestimuladora de CD27 compreendendo SEQ ID NO:7.

13. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido nucleico ainda codifica: a. uma citocina secretada; ou b. uma interleucina de cadeia gama comum secretada; ou c. uma IL-15 secretada, de preferência em que a IL-15 compreende a sequência de SEQ ID NO: 14, mais preferencialmente em que a IL-15 compreende a sequência de SEQ ID NO: 14 operavelmente ligada a uma sequência de sinal de secreção de SEQ ID NO: 12, ou em que a IL-15 compreende a sequência de SEQ ID NO: 14 operavelmente ligada a uma sequência de sinal de secreção de SEQ ID NO:

26; ou d. uma interleucina de cadeia gama comum secretada, de preferência IL-15, e um terminal amino de região de ligante multicistrônico para a interleucina ou o sinal de secreção de interleucina, de preferência em que a região de ligante multicistrônico compreende uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 15-17, 25, or 27-30, ou uma combinação dos mesmos, ou codifica um sítio de entrada de ribossomo interno, por exemplo, SEQ ID NO: 31 ou 32.

14. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a. o sinal de secreção compreende uma sequência de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 26, preferencialmente SEQ ID NO: 12; e/ou b. o domínio sIL15 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 14; e/ou c. a sequência de clivagem de P2A compreende uma sequência de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 25; e/ou d. a sequência de clivagem de furina compreende uma sequência de SEQ ID NO: 16; e/ou e. o CAR compreende, em ordem amino para carbóxi, uma sequência de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14.

15. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a. o domínio de ligação liga especificamente a HLA-A2/TyrD369-377 e o ácido nucleico codifica SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 18; b. o domínio de ligação liga especificamente a GPC3 e o ácido nucleico codifica SEQ ID NO: 20 ou 22.

16. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido nucleico compreende a sequência de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, 23, ou 24.

17. Polipeptídeo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um receptor de antígeno quimérico compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por qualquer um dos ácidos nucleicos isolados anteriores das reivindicações 1 a 16.

18. Célula T γδ, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um polipeptídeo da reivindicação 17 ou que compreende um ácido nucleico codificando um construto CAR de qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que a célula T γδ expressa funcionalmente o um domínio de ligação do polipeptídeo ou do CAR codificado por ácido nucleico na superfície da célula T γδ.

19. Célula T γδ, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ exibe atividade de matança de célula in vitro e/ou in vivo contra uma célula de tumor sólido que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA).

20. Célula T γδ, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade de matança de célula de tumor sólido da referida célula T γδ é maior que um nível inato de atividade de matança de célula de tumor sólido in vitro e/ou in vivo em uma célula T γδ de controle que não compreende um construto de CAR.

21. Célula T γδ, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ exibe a elevada atividade de matança de célula de tumor sólido contra células de tumor sólido HLA classe I+.

22. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade de matança de célula de tumor sólido ou elevada atividade de matança de célula de tumor sólido persiste, por cerca de, por pelo menos, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias após o primeiro contato com a célula de tumor sólido.

23. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22,

CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ prolifera em resposta a contato com uma célula de tumor sólido que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA).

24. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ exibe elevada proliferação em resposta a contato com uma célula de tumor sólido que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA) em comparação com uma célula T γδ de controle que não expressa funcionalmente o CAR codificado por ácido nucleico na superfície da célula T γδ.

25. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ prolifera em um organismo hospedeiro que compreende a célula de tumor sólido que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA).

26. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25, CARACTERIZADA pelo fato de que a proliferação de célula T γδ ou elevada proliferação de célula T γδ persiste, por cerca de, por pelo menos, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias após o primeiro contato a célula de tumor sólido.

27. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ expressa citocinas pró-inflamatórias compreendendo fator de necrose tumoral alfa ou interferon gama após contato com a célula de tumor sólido.

28. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ exibe resposta de enxerto versus hospedeiro reduzida, substancialmente reduzida, essencialmente nenhuma ou nenhuma quando introduzida em um hospedeiro alogênico em comparação com uma resposta de enxerto versus hospedeiro exibida por uma célula T αβ administrada a um hospedeiro alogênico.

29. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ é uma célula T γδ δ1, uma δ2, uma δ3 ou uma δ4, de preferência uma célula T γδ δ2, mais preferencialmente uma célula T γδ δ1.

30. Pluralidade de células T γδ, CARACTERIZADA pelo fato de que é de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 29.

31. Pluralidade de células T γδ, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de que a pluralidade compreende pelo menos cerca de 108 células T γδ, de preferência de cerca de 108 células T γδ a cerca de 1011 células T γδ.

32. Pluralidade de células T γδ, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, CARACTERIZADA pelo fato de que a pluralidade compreende uma composição que é pelo menos 60%, 80%, ou de cerca de 60%, ou 80% a cerca de 90%, ou 95% de células T γδ δ1, δ2, δ3, ou δ4, preferencialmente células T γδ δ1 ou δ2, mais preferencialmente células T γδ δ2-, mais preferencialmente células T γδ δ1.

33. Método para fazer a célula T γδ de qualquer uma das reivindicações 18 a 29, ou uma pluralidade de células T γδ, de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende transfectar célula(s) T γδ com um construto compreendendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende transdução retroviral, de preferência transdução gama retroviral.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende expansão ex vivo da(s) célula(s) T γδ, em que a expansão ex vivo é realizada antes da transfecção e/ou após transfecção da sequência de ácido nucleico isolada.

36. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável e uma célula T γδ de qualquer uma das reivindicações 18 a 29 ou uma pluralidade de células T γδ de qualquer uma das reivindicações 30 a 32.

37. Método para matar uma célula de tumor sólido, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende contatar a célula de tumor sólido com uma quantidade eficaz de matança de célula de tumor de uma célula T γδ de qualquer uma das reivindicações 18 a 29; uma pluralidade de células T γδ de qualquer uma das reivindicações 30 a 32; ou uma composição farmacêutica da reivindicação

36.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende introduzir uma quantidade terapeuticamente eficaz da(s) célula(s) T γδ ou da composição farmacêutica em um organismo hospedeiro compreendendo a célula de tumor sólido.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende introduzir em um organismo hospedeiro compreendendo a célula de tumor sólido uma quantidade terapeuticamente eficaz da(s) célula(s) T γδ ou da composição farmacêutica e simultaneamente ou sequencialmente administrar um ou mais métodos para elevar a(s) citocina(s) de cadeia gama comum.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração de um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreende administrar simultaneamente com a introdução da(s) célula(s) T γδ ou sequencialmente uma quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum eficaz para elevar proliferação , atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T γδ introduzida(s), preferencialmente em que o método compreende administrar IL-2, mais preferencialmente em que o método compreende administrar IL-15.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que os um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreendem administrar uma quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum eficaz para elevar proliferação, atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T γδ introduzida(s) antes e/ou após introdução da(s) célula(s) T γδ.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, CARACTERIZADO pelo fato de que os um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreendem linfodepleção antes de introduzir a(s) célula(s) T γδ.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, CARACTERIZADO pelo fato de que os um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreendem secreção de uma ou mais citocinas de cadeia gama comum das células T γδ introduzidas.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o método reduz a carga de tumor in vivo no organismo hospedeiro e/ou aumenta o tempo de sobrevivência médio do organismo hospedeiro em comparação com um organismo controle, em que o organismo controle não é tratado com a(s) célula(s) T γδ ou a composição farmacêutica.

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 44, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é um método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo.

46. Uso de uma quantidade eficaz de matança de célula de tumor de uma célula T γδ de qualquer uma das reivindicações 18 a 29; uma pluralidade de células T γδ de qualquer uma das reivindicações 30 a 32; ou composição farmacêutica da reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer de célula de tumor sólido em um sujeito em necessidade do mesmo.

47. Método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T γδ, em que o câncer compreende células de tumor sólido que exibem expressão de superfície de célula de TyrD ou GPC3.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende simultaneamente com a administração de células T γδ ou sequencialmente, administrar um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum.

49. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende realizar uma pluralidade de administrações das células T γδ, em que o intervalo entre a pluralidade de administrações é de pelo menos cerca de uma semana, de preferência pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 12 semanas e/ou no máximo uma vez a cada 6 ou 12 meses.

50. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso em qualquer um dos métodos das reivindicações 47 a 49.