BR112020024246A2

BR112020024246A2 - pelo menos um polinucleotídeo recombinante, célula recombinante, receptor de antígeno quimérico, polinucleotídeo que codifica o receptor de antígeno quimérico, vetor, vírus, composição farmacêutica, e, método para tratar câncer

Info

Publication number: BR112020024246A2
Application number: BR112020024246-2A
Authority: BR
Inventors: Preet M. Chaudhary
Original assignee: University Of Southern California
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2019-06-01
Publication date: 2021-03-02
Also published as: CO2020016586A2; JP2024073564A; JP2021525509A; TW202018083A; AU2019279084A1; EP3802822A4; IL279100A; MX2020012927A; EA202092945A1; WO2019232503A1; SG11202011837UA; CA3101510A1; KR20210057705A; ZA202007393B; US20210137977A1; EP3802822A1; CN113286879A

Abstract

''PELO MENOS UM POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, CÉLULA RECOMBINANTE, RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, POLINUCLEOTÍDEO QUE CODIFICA O RECEPTOR DE ANTÍGENOQUIMÉRICO, VETOR, VÍRUS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER. A divulgação fornece diversos domínios de ligação de antígeno e plataformas para a construção de receptores de antígenos quiméricos convencionais e de próxima geração para terapias celulares adotivas para câncer, infecção, doenças alérgicas, degenerativas e imunológicas. Também são fornecidas abordagens para ativação e expansão de células T imunes para terapias celulares adotivas para câncer, infecções, doenças alérgicas, degenerativas e imunológicas.

Description

1 / 308 PELO MENOS UM POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, CÉLULA RECOMBINANTE, RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO,

POLINUCLEOTÍDEO QUE CODIFICA O RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, VETOR, VÍRUS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E,

MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER Referência cruzada a pedidos relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório US Nº 62 / 679.741, depositado em 1 de junho de 2018, cujas divulgações são aqui incorporadas para todos os fins.

CAMPO DE INVENÇÃO

[002] São fornecidos aqui diversos domínios de ligação ao antígeno e novas plataformas para a construção de receptores de antígenos quiméricos convencionais e de próxima geração para terapias celulares adotivas para câncer, infecção, doenças alérgicas, desgerativas e imunológicas. Também são fornecidas novas abordagens para ativação e expansão de células T imunes para terapias celulares adotivas para câncer, infecções, doenças alérgicas, degenerativas e imunológicas.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003] Acompanhando esta apresentação é uma lista Sequence intitulado “Sequence_ST25.txt”, criado em 1º de junho de 201 9 e ter 80,373,218 bytes de dados, máquina formatado em IBM-PC, o sistema operacional MS-Windows. A listagem de sequências é deste modo incorporada aqui por referência na sua totalidade para todos os fins. Antecedentes

[004] CARs são receptores imunológicos sintéticos, que podem redirecionar as células T para matar seletivamente as células tumorais. Ao contrário do receptor fisiológico de células T (TCR), que envolve complexos HLA-peptídeo, os CARs envolvem moléculas que não requerem processamento de peptídeo ou expressão de HLA para serem reconhecidas. Os

2 / 308 CARs de primeira geração iniciais foram construídos através da fusão de um domínio de ligação de antígeno baseado em scFv (fragmento de cadeia única variável) a um domínio transmembranar CD8 inerte, ligado a um domínio de sinalização citoplasmático derivado de CD3-ζ ou da cadeia γ do receptor Fc. Para superar a falta de co-estimulação de células T, os CARs de primeira geração foram ainda modificados através da incorporação dos domínios citoplasmáticos de sinalização de células T do receptor co-estimulador s.

[005] Apesar do sucesso com células CAR-T, há vários limitação s para esta abordagem, incluindo toxicidades como “Síndrome de liberação de citocinas'(CRS) e neurotoxicidades. A inclusão do domínio coestimulatório no construto CAR resulta em sinalização tônica não fisiológica através do receptor, o que por sua vez pode contribuir para sua toxicidade e falta de persistência.

[006] Para superar algumas das limitações de projeto de CARs convencionais de 2ª geração, vários projetos alternativos, coletivamente denominados CARs de próxima geração, foram descritos, incluindo Ab-TCR (WO 2017/070608 A1 aqui incorporado por referência), fusão de receptor de TCR proteínas ou TFP (WO 2016/187349 A1 aqui incorporado por referência), Receptores Imunológicos Sintéticos (SIRs) (ver WO 2018/102795 A1, aqui incorporado por referência), acoplador de antígeno de célula T trifuncional (Tri-TAC) (ver, WO 2015/117229 A1, aqui incorporado por referência). Esses designs alternativos de CAR, em geral, carecem de um domínio coestimulatório. Sumário

[007] As seguintes modalidades e aspectos das mesmas são descritos e ilustrados em conjunto com sistemas, composições e métodos que se destinam a ser exemplares e ilustrativos, não limitantes em escopo.

[008] Em certas formas de realização, a divulgação proporciona composições compreendendo células efectoras geneticamente modificadas

3 / 308 (tais como as células NK e células T) que incluem polinucleótidos que codificam os receptores de antigénios quiméricos, receptores imunitários sintéticos (SIRS) e semelhantes t chapéu pode ser usado em adoptiva terapia celular para o tratamento de câncer, doenças infecciosas, autoimunes e degenerativas.

[009] Em certas modalidades, a divulgação fornece uma plataforma de receptores imunes sintéticos, designados zSIRs, contendo duas cadeias CD3z. As sequências polinucleotídicas das cadeias de CD3z que podem ser usadas na construção de zSIR são fornecidas, por exemplo, SEQ ID NO: 67 e

71. O correspondente amino ácido sequenecs são fornecidas em SEQ ID NO: 4066 e 4070, respectivamente. A divulgação prevê que o fragmento vL de um anticorpo pode ser unido a uma das duas cadeias CD3z e o fragmento vH pode ser unido à outra cadeia CD3z. Quando as duas cadeias (por exemplo, vL-CD3z e vH-CD3z) são co-expressas na mesma célula, os fragmentos vL e vH podem ligar seu antígeno cognato e transmitir um sinal de célula T. Em particular, as células T que expressam tal zSIR quando expostas a uma linha celular que expressa o antígeno alvo cognato podem ativar a sinalização de NFAT, induzir a produção de IL2, promover a proliferação de células T, promover a ativação de células T e exercer citotoxicidade. A expressão e a atividade do zSIR podem ser ainda aumentadas pela incorporação de um ligante entre os fragmentos vL / vH e CD3z. Em particular, o IgCL (SEQ ID NO: 28 e 4027) e IgCH domínios (SEQ ID NO: 29 e 4028) derivados de anticorpos servem como ligantes úteis entre os vL /vH e CD3z fragmentos.

[0010] A divulgação futher fornece vários domínios de ligação de antigénios novos que podem ser utilizados na geração de CARs convencionais (por exemplo, 2ª CAR geração contendo 41BB domínio co-estimulador) como CARs bem próxima geração, tais como SIRS, zSIRs, Ab-TCR, Tri -TAC e TFPs, para aplicações em terapia celular adotiva. Em algumas modalidades, esses domínios de ligação ao antígeno são derivados de anticorpos e antígenos

4 / 308 alvo expressos tanto em doenças malignas hematológicas quanto em tumores sólidos. As SEQ ID NOs. de fragmentos de vL, vH e scFv destes domínios de ligação ao antígeno são mostrados na Tabela 3. As SEQ ID Nos das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das cadeias leve (vL) e pesada (vH) são mostradas na Tabela 4. Os ácidos nucleicos e aminoácidos SEQ IDs de CARs convencionais exemplares (ou seja, CARs de 2ª geração contendo domínios co-estimuladores 41BB) e CARs de próxima geração (por exemplo, SIRs, zSIRs, Ab-TCRs e TFP) contendo esses domínios de ligação ao antígeno são fornecidos na Tabela 6 e 7. Os CARs que contenham estes domínios de ligação do antigénio mostra diversa in vitro e in vivo as propriedades, tais como o binding afinidade para os antigios alvo, secreção de citoquina, proliferação, citotoxicidade, esgotamento, e persistência a longo prazo. Como tal, os CARs contendo esses antígenos alvo podem ser usados para gerar uma resposta imune diversa. O polinucleotídeo, polipeptídeos, construtos de expressão, células modificadas de forma recombinante que expressam CARs compreendendo os domínios de ligação ao antígeno da divulgação, bem como o método de produção e uso de tais polipeptídeos, polinucleotídeos e células são descritos em métodos conhecidos na técnica e métodos descritos em PCT / US2017 / 024843, WO 2014/160030 A2, WO 2016/187349 A1, PCT / US2016 / 058305, WO 2015/117229 A1 e PCT/US17/64379, que são incorporados neste documento por referência em sua totalidade. As células imunes que expressam os CARs, tanto os CARs convencionais quanto os de próxima geração, compreendendo esses domínios de ligação ao antígeno podem ser geradas e usadas para terapia celular adotiva de câncer, doenças infecciosas e imunológicas usando métodos conhecidos na técnica e métodos descritos em PCT / US2017 / 024843, WO 2014/160030 A2, WO 2016/187349 A1, PCT/US2016/058305, WO 2015/117229 A1 e PCT/US17/64379, que são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

[0011] A divulgação também fornece um método para melhorar a

5 / 308 transferência de genes usando vetores lentivirais pela coexpressão da proteína Vif e um CAR (por exemplo, um CAR convencional, SIR, Ab-TCR, Tri-TAC ou um TCR recombinante e semelhantes) ou Vif e qualquer outro gene terapêutico (por exemplo, gene da β-globina para o tratamento da anemia falciforme). Um vetor lentiviral exemplar (pLenti-EF1a-CD8SP-hu-CD19- USC1-LH4-vH-Gly-Ser-Linker-vL-Myc-CD8TM-BBz-2A-Vif) que codifica um CAR e Vif coexpressor é fornecido em SEQ ID NO: 11268. Em algumas formas de realização s, a Vif de proteína é fornecida em trans por co- expressando Vif nas células de empacotamento no momento da embalagem de vetor lentiviral.

Em tal modalidade, a proteína Vif é empacotada junto com o RNA que codifica o vetor lentiviral nas partículas virais e é transferida para as células alvo.

A proteína Vif pode ser expressa nas células de empacotamento por métodos conhecidos na técnica.

Em uma modalidade exemplar, a proteína Vif é expressa nas células de empacotamento por co-transfecção de um vetor de expressão de mamífero (por exemplo, pCDNA3-Vif; SEQ ID NO: 11269) que codifica Vif com o vetor de transferência lentiviral que codifica o gene(s) de interesse (por exemplo, pLenti-EF1α-CD8SP-MYC3-WT1-Ab13-vL-V5- [hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-WT1-Ab13-vH-Myc4-[hTCRa-CSDVP] -F- F2A-PAC- DWPRE; SEQ ID NO: 151) e vetor (es) de empacotamento lentiviral.

Exemplar lentiviral vetor embalagem inclui pMDLg/pRRE (Addgene plasmídeo 12251), que é uma terceira geração plasmídeo de empacotamento de lentivírus que codifica gag e pol e também requer pRSV- Rev (Addgene # 12253) e envelope expressando plasmídeo pMD2.G (Addgene # 12259) para embalagem eficiente.

Outro vetor de empacotamento lentiviral é psPAX2 (plasmídeo Addgene # 12260), que é um plasmídeo de empacotamento lentiviral de 2ª geração e pode ser usado com o plasmídeo de expressão de envelope pMD2.G (Addgene # 12259) para empacotar vetores lentiirais de 2ª ou 3ª geração.

Numa forma de realização exemplar, um plasmídeo que codifica para Vif pode ser co-transfectada com psPAX2 e

6 / 308 pMD2.G plasmídeos para empacotar um 2ª ou um 3ª geração lentiviral vetor. Em uma modalidade exemplar alternativa, um plasmídeo que codifica Vif pode ser co-transfectado com os plasmídeos pMDLg/pRRE, pRSV-Rev e pMD2.G para empacotar um vetor lentiviral de 3ª geração. Vif também pode ser co- expresso a partir do (s) mesmo (s) vetor (es) que codificam outras proteínas de empacotamento lentivirais (por exemplo, gag, Pol e Rev). Em uma modalidade exemplar, o plasmídeo de empacotamento psPAX2 é modificado para também co-expressar Vif por métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade exemplar alternativa, um plasmídeo de empacotamento lentiviral de 3ª geração que codifica Gag e Pol é modificado para também expressar Vif por fusão da sequência de ácido nucleico que codifica Vif em quadro com a sequência de ácido nucleico que codifica Pol e separado dela por uma sequência ligante clivável P2A. Em algumas modalidades, Vif é expresso nas células de empacotamento transitoriamente, enquanto em outras modalidades Vif é expresso nas células de empacotamento de forma estável. Em algumas modalidades, Vif é expresso nas células alvo transitoriamente, enquanto em outras modalidades Vif é expresso nas células alvo de forma estável. Em uma modalidade, Vif é expresso nas células alvo (por exemplo, células T ou células -tronco) transitoriamente por eletroporação de um vetor de expressão de mamífero (por exemplo, pCDNA3-Vif; SEQ ID NO: 11269) que codifica Vif ou por eletroporação do polipeptídeo Vif. As células T arge (por exemplo, células T ou células-tronco) que expressam Vif transitoriamente são subsequentemente infectadas com um vetor lentiviral que codifica um CAR ou qualquer gene terapêutico de interesse (por exemplo, β globina).

[0012] A natureza policlonal da resposta imune é a chave para o seu sucesso no controle de várias infecções. Em contraste, as terapias CAR atuais geralmente dependem do direcionamento de um único antígeno e / ou epítopo único de um único antígeno. A perda do antígeno direcionado ou do epítopo direcionado é uma causa frequente de falha das terapias CAR atuais. Para

7 / 308 superar esta limitação, o disclosure fornece CARs contra vários antigénios e contra múltiplos epitopos de um só antigénio. Esses CARs podem ser usados em combinações adequadas para fornecer uma resposta imune adaptativa policlonal e diversa para a prevenção ou tratamento de doenças, como câncer, doenças infecciosas, doenças autoimunes, doenças alérgicas e doenças degenerativas.

[0013] A divulgação também fornece módulos acessórios que podem ser expressos em células T (por exemplo, células CAR-T, células TCR-T e TILs) que são transferidos de forma adotiva para influenciar sua sobrevivência, proliferação, ativação, funções efetoras (por exemplo, secreção de citocinas, citotoxicidade, etc.), exaustão e persistência in vivo.

[0014] A divulgação fornece pelo menos um polinucleotídeo recombinante que codifica pelo menos um receptor de antígeno quimérico (CAR) de 1ª geração ou de próxima geração, o pelo menos um polinucleotídeo recombinante compreendendo: (a) um primeiro domínio de ácido nucleico que codifica um parcial ou inteiro domínio transmembranar e/ou citoplasmático e, opcionalmente, o domínio extracelular de uma proteína endógena, em que a proteína endógena é expressa na superfície dos linfócitos e desencadeia a ativação e/ou proliferação dos linfócitos; (b) opcionalmente um polinucleotídeo um ligante; e (c) um segundo domínio de ácido nucleico operacionalmente ligado ao primeiro domínio de ácido nucleico, em que o segundo domínio de ácido nucleico codifica um ou mais domínios de ligação ao antígeno TCR não naturais, em que o domínio de ligação é selecionado a partir de um domínio de ligação estabelecido na Tabela 3 ; (d) um terceiro domínio de ácido nucleico opcional que codifica um domínio coestimulador; e um domínio de ácido nucleico adicional opcional que codifica um módulo acessório. Em uma modalidade, o primeiro ácido nucleico codifica parcialmente ou totalmente pelo menos uma cadeia do receptor de células T (TCR), conforme estabelecido na Tabela 13. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o primeiro ácido

8 / 308 nucleico codifica pelo menos um domínio transmembranar na Tabela 13 operacionalmente ligado ao domínio citoplasmático do tipo TCR. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o polinucleotídeo codifica um CAR, em que o CAR compreende: ( i) uma cadeia constante de receptor de células T (TCR) parcial ou inteira tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 75% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 4038 a 4063, 12602-12638, e que pode compreender um módulo co- estimulador opcional; (ii) um linker opcional; e (iii) um ou mais domínio (s) de ligação ao antígeno TCR não natural ligado (s) a (a) selecionado a partir de um domínio de ligação estabelecido na Tabela 3 ; (iv) um módulo acessório opcional; e (v) um dímero de um polipeptídeo compreendendo (i) - (iv). Em outra modalidade ou modalidade adicional, o polinucleotídeo recombinante compreende uma sequência que codifica qualquer uma das sequências na Tabela 2. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o módulo acessório compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 4103- 4117 e 4090-4096. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o CAR codificado compreende (1) qualquer um dos CARs 1-16 da Tabela 1 e/ou (2) uma estrutura principal da Tabela 2; e (3) um domínio de ligação da Tabela 3. Em outra modalidade ou modalidade adicional, (i) é uma cadeia constante de TCR CD3z. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o polinucleotídeo fornece dois receptores de antígenos quiméricos de primeira geração ou de próxima geração. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o polinucleotídeo codifica um dímero de cadeias constantes de CD3z.

[0015] A divulgação também fornece pelo menos um polinucleotídeo recombinante que codifica pelo menos um receptor de antígeno quimérico de próxima geração (CAR), o pelo menos um polinucleotídeo recombinante compreendendo: (a) um primeiro domínio de ácido nucleico que codifica um domínio transmembranar parcial ou completo e / ou domínio citoplasmático e, opcionalmente, o domínio extracelular de uma proteína CD3z endógena tendo

9 / 308 uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4064-4066, 4070-4072 e 4075 -4078, em que a proteína endógena é expressa na superfície dos linfócitos e desencadeia a ativação e / ou proliferação do linfócito; (b) opcionalmente um polinucleotídeo um ligante; e (c) um segundo domínio de ácido nucleico operacionalmente ligado ao primeiro domínio de ácido nucleico, em que o segundo domínio de ácido nucleico codifica um ou mais domínios de ligação ao antígeno TCR não naturais, em que o domínio de ligação é selecionado a partir de um domínio de ligação estabelecido na Tabela 3; e (d) um terceiro domínio de ácido nucleico opcional que codifica um módulo coestimulatório; e um ácido nucleico adicional opcional que codifica um módulo acessório.

Em outra modalidade ou modalidade adicional, as sequências de ácido nucleico que codificam a proteína CD3z endógena são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 67 e 71. Em outra modalidade ou modalidade adicional, pelo menos um CAR de próxima geração compreende dois CARs, cada CAR compreendendo um Cadeia CD3z.

Em outra modalidade, um fragmento vL de um anticorpo está operacionalmente ligado a uma das duas cadeias CD3z e um fragmento vH do anticorpo está operacionalmente ligado à outra cadeia CD3z.

Em outra modalidade ou modalidade adicional, as cadeias vL e vH são selecionadas a partir de pares na Tabela 3 e 4 para um antígeno alvo específico.

Em outra modalidade, um ligante é fornecido entre as cadeias vL/vH e/ou CD3z.

Em outra modalidade, um ligante codificado é selecionado a partir do grupo que consiste em IgCL (SEQ ID NO (DNA): 28 e SEQ ID NO (PRT): 4027) e domínios IgCH (SEQ ID NO (DNA): 29 e SEQ ID NO (PRT): 4028). Em outra modalidade ou modalidade adicional, compreende ainda o terceiro domínio de ácido nucleico que codifica um módulo coestimulatório.

Em outra modalidade ou modalidade adicional, o módulo coestimulatório compreende uma proteína 41BB ou CD28. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o módulo coestimulatório compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que

10 / 308 consiste em SEQ ID NO: 4067 e 4068. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o módulo coestimulatório compreende um domínio de sinalização de qualquer um ou mais de CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 e combinações dos mesmos. Em outra modalidade ou modalidade adicional, compreende ainda o módulo acessório, em que o módulo acessório compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 4103-4117 e 4090-4096.

[0016] A invenção também proporciona uma célula recombinante que expressa um homo- ou hetero-dímero de um 1ª geração ou receptor do antigénio quimérico próxima geração (CAR), a homo ou hetero-dímero compreendendo: (a) um primeiro domínio que codifica um domínio transmembranar parcial ou completo e / ou domínio citoplasmático e, opcionalmente, o domínio extracelular de uma proteína endógena, em que a proteína endógena é expressa na superfície dos linfócitos e desencadeia a ativação e / ou proliferação dos linfócitos; (b) opcionalmente, um ligante peptídico; e (c) um segundo domínio operacionalmente ligado ao primeiro domínio, em que o segundo domínio compreende um ou mais domínios de ligação ao antígeno TCR não naturais, em que o domínio de ligação é selecionado a partir de um domínio de ligação estabelecido na Tabela 3; e (d) um terceiro domínio opcional que codifica um módulo coestimulador, e em que a célula compreende opcionalmente um módulo acessório, em que o homo ou heterodímero se associa na superfície da célula recombinante. Em outra modalidade ou modalidade adicional, a célula é transformada com pelo menos um polinucleotídeo recombinante conforme descrito neste documento. Em outra modalidade ou modalidade adicional, a célula é um linfócito T (célula T). Em outra modalidade ou modalidade adicional, a célula é uma célula T virgem, uma célula T de memória central, uma célula T de memória efetora, Treg ou uma combinação das mesmas. Em outra modalidade, a célula é uma célula assassina natural (NK), uma célula- tronco hematopoiética (HSC), uma célula-tronco embrionária ou uma célula-

11 / 308 tronco pluripotente. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o módulo acessório compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 4103-4117 e 4090-4096. Em outra modalidade, a célula recombinante expressa ou é projetada para expressar HIV1-vif.

[0017] A divulgação fornece um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende (a) um primeiro domínio que codifica um domínio transmembranar parcial ou total e / ou citoplasmático e, opcionalmente, o domínio extracelular de uma proteína endógena, em que a proteína endógena é expressa na superfície de linfócitos e desencadeia a ativação e / ou proliferação dos linfócitos; (b) opcionalmente, um ligante peptídico; e (c) um segundo domínio operacionalmente ligado ao primeiro domínio, em que o segundo domínio compreende um ou mais domínios de ligação ao antígeno TCR não naturais, em que o domínio de ligação é selecionado a partir de um domínio de ligação estabelecido na Tabela 3 ; e (d) um terceiro domínio opcional que codifica um módulo co-estimulador. Em outra ou em outra modalidade, a proteína endógena compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4064-4066, 4070-4072, 4075-4078 e 12637. Em outra ou em outra modalidade, o primeiro ácido nucleico codifica parcial ou totalmente pelo menos uma cadeia de receptor de célula T (TCR) conforme estabelecido na Tabela 13. Em outra ou outra modalidade, o primeiro compreende um domínio transmembranar na Tabela 13 operacionalmente ligado ao domínio citoplasmático de um tipo de TCR correspondente. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o CAR compreende: (i) uma cadeia constante de receptor de células T (TCR) parcial ou total tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 75% de identidade de sequência com uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 4038 a 4063, 12602-12638, e que pode compreender um módulo coestimulatório opcional.

[0018] A divulgação fornece um polinucleotídeo que codifica o receptor de antígeno quimérico conforme descrito acima e aqui.

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[0019] A divulgação também fornece um vetor compreendendo o (s) polinucleotídeo (s) aqui descrito.

[0020] A divulgação também fornece um vírus compreendendo o (s) polinucleotídeo (s) como aqui descrito. Em outra modalidade, o vírus é um retrovírus, um adenovírus, um vírus adeno-associado, um lentivírus, um vírus da varíola ou um vírus herpes.

[0021] A divulgação também fornece uma composição farmacêutica que compreende: qualquer uma ou mais das invenções aqui descritas e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0022] A divulgação também fornecer é um método para o tratamento de cancro que compreende: proporcionar a composio, uma cula recombinante da divulgao e a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição ou célula para o sujeito, de modo a tratar o cancro. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o câncer é câncer do sangue. Em outra modalidade ou modalidade adicional, o câncer de sangue é qualquer um ou mais dentre leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, síndrome mielodisplásica, linfoma, mieloma múltiplo e leucemia linfocítica aguda. Em outra modalidade, o câncer é um tumor sólido..

[0023] Em uma modalidade, é fornecido aqui um ácido nucleico isolado que codifica um SIR (ou seja, um CAR de próxima geração), em que o domínio de ligação ao antígeno do SIR tem como alvo o CD19 e o SIR opcionalmente expressa um códon otimizado variante de K13-vFLIP (K13- opt). Em modalidades exemplares, as sequências de fragmentos de ácido nucleico isolados que alvejam CD19 são estabelecidas em SEQ ID NOs: 14056-14059 e 14109-14112. Em concretizações exemplificativas, as sequências de polipéptido isolado a segmentação CD19 e opcionalmente coexpress K13-vFLIP são s descritas em SEQ ID NOs: 15800-15803 e 15853-

15856. Em algumas modalidades, os fragmentos vL e vH direcionados a CD19 são descritos na Tabela 3 e apresentados nas SEQ ID Nos (DNA): 12662, 12693

13 / 308 e 12656 e 12687 e SEQ ID Nos (PRT): 14406, 14437 e 14400 e 14431. Também são fornecidos aqui polipeptídeos codificados por ácidos nucleicos que codificam SIR e, opcionalmente, que codificam K13-vFLIP, onde o domínio de ligação ao antígeno do SIR tem como alvo o CD19. São fornecidos ainda neste documento vetores que codificam ácidos nucleicos que codificam SIR e K13-vFLIP, em que um domínio específico do tígeno do SIR tem como alvo CD19. Em modalidades exemplificativas, um vetor que codifica um SIR direcionado a CD19 é fornecido na SEQ ID NO: 12641. Também são fornecidas neste documento células geneticamente modificadas (como células T, células NKT) compreendendo vetores que codificam ácidos nucleicos que codificam SIR e K13-vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo o CD19. Também são fornecidos métodos para o tratamento e prevenção de uma doença em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam CD19.

[0024] Em uma modalidade, é fornecido aqui um ácido nucleico isolado que codifica um SIR, em que o domínio de ligação ao antígeno do SIR tem como alvo o MPL e o SIR opcionalmente expressa um códon otimizado variante de K13-vFLIP (K13-opt). Em modalidades exemplares, as sequências de fragmentos de ácido nucleico isolados que alvejam MPL são estabelecidas em SEQ ID NOs: 13791-13792 e 13844-13845. Em modalidades exemplificativas, as sequências polipeptídicas isoladas direcionadas a MPL e, opcionalmente, coexpressando K13-vFLIP são conforme estabelecidas em SEQ ID NOs: 15535-15536 e 15588-15589. Em algumas modalidades, os fragmentos vL e vH direcionados a MPL são descritos na Tabela 3 e apresentados nas SEQ ID Nos (DNA): 12665, 12696 e 12658 e 12689 e SEQ ID Nos (PRT): 14409, 14440 e 14402 e 14433. Também são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados por ácidos nucleicos que codificam SIR e, opcionalmente, codificam K13-vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo MPL. São fornecidos ainda neste

14 / 308 documento vetores que codificam ácidos nucleicos que codificam SIR e K13- vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo MPL. Em modalidades exemplificativas, um vetor que codifica um MPL de direcionamento de SIR é fornecido na SEQ ID NO: 14384. Também são fornecidas neste documento células geneticamente modificadas (como células T, células NKT) compreendendo vetores que codificam ácidos nucleicos que codificam SIR e K13-vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo o MPL. Também são fornecidos métodos para o tratamento e prevenção de uma doença em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam MPL.

[0025] Em uma modalidade, é fornecido aqui um ácido nucleico isolado que codifica um SIR, em que o domínio de ligação ao antígeno do SIR tem como alvo o BCMA e o SIR opcionalmente expressa um códon otimizado variante de K13-vFLIP (K13-opt). Em modalidades exemplares, as sequências de fragmentos de ácido nucleico isolados que alvejam BCMA são estabelecidas em SEQ ID NOs: 12890-12893, 12943-12946, 12996-12999, 13049-13052 e 12837-12840. Em modalidades exemplares, as sequências polipeptídicas isoladas direcionadas a BCMA e, opcionalmente, coexpressando K13-vFLIP são conforme estabelecidas em SEQ ID NOs: 14634-14637, 14687-14690, 14740-14743, 14793-14796, e 14581-14584. Em algumas modalidades, os fragmentos vL e vH direcionados a BCMA são descritos na Tabela 3 e apresentados nas SEQ ID Nos (DNA): 12670 e 12701, 12669 e 12700, 12671- 12702, 12657 e 12688, 12654 e 12685 e SEQ ID Nos (PRT): 14414 e 14445, 14413 e 14444, 14415 e 14446, 14398 e 14429, e 14401 and 14432. Também são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados por ácidos nucleicos que codificam SIR e, opcionalmente, codificam K13-vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo BCMA. São fornecidos ainda neste documento vetores que codificam ácidos nucleicos que codificam SIR e K13-vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno

15 / 308 tem como alvo BCMA. Em modalidades exemplares, os vetores que codificam um SIR direcionado a BCMA são fornecidos na SEQ ID NO: 14378 e 14385. Também são fornecidas neste documento células geneticamente modificadas (como células T, células NKT) compreendendo vetores que codificam ácidos nucleicos que codificam SIR e K13-vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo o BCMA. Também são fornecidos métodos para o tratamento e prevenção de uma doença em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam BCMA.

[0026] Em uma modalidade, é fornecido aqui um ácido nucleico isolado que codifica um SIR, em que o domínio de ligação ao antígeno do SIR tem como alvo o MSLN e o SIR opcionalmente expressa um códon otimizado variante de K13-vFLIP (K13-opt). Em modalidades exemplares, as sequências de fragmentos de ácido nucleico isolados que alvejam MSLN são estabelecidas em SEQ ID NOs: 14268-14269, 14321-14322, e 14374-14375. Em modalidades exemplares, as sequências polipeptídicas isoladas direcionadas a MSLN e, opcionalmente, coexpressando K13-vFLIP são conforme estabelecidas em SEQ ID NOs: 16012-16013, 16065-16066 e 16118-16119. Em algumas modalidades, os fragmentos vL e vH direcionados a MSLN são descritos na Tabela 3 e apresentados nas SEQ ID Nos (DNA): 12668 e 12699, 12667 and 12698, and 12666-12697 e SEQ ID Nos (PRT): 14412 e 14443, 14411 e 14442, e 14410 e 14441. Também são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados por ácidos nucleicos que codificam SIR e, opcionalmente, codificam K13-vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo MSLN. São fornecidos ainda neste documento vetores que codificam ácidos nucleicos que codificam SIR e K13- vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo MSLN. Em modalidades exemplares, os vetores que codificam um SIR direcionado a MSLN são fornecidos na SEQ ID NO: 14381 e 14383. Também são fornecidas neste documento células geneticamente modificadas (como

16 / 308 células T, células NKT) compreendendo vetores que codificam ácidos nucleicos que codificam SIR e K13-vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo o MSLN. Também são fornecidos métodos para o tratamento e prevenção de uma doença em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam MSLN.

[0027] Em uma modalidade, é fornecido aqui um ácido nucleico isolado que codifica um SIR, em que o domínio de ligação ao antígeno do SIR tem como alvo o CD22 e o SIR opcionalmente expressa um códon otimizado variante de K13-vFLIP (K13-opt). Em modalidades exemplares, as sequências de fragmentos de ácido nucleico isolados que alvejam CD22 são estabelecidas em SEQ ID NOs: 13314-13317, 13420-13423, 13473-13476 e 14215-14218. Em modalidades exemplares, as sequências polipeptídicas isoladas direcionadas a CD22 e, opcionalmente, coexpressando K13-vFLIP são conforme estabelecidas em SEQ ID NOs: 15058-15061, 15164-15167, 15217- 15220 e 15959 -15962. Em algumas modalidades, os fragmentos vL e vH direcionados a CD22 são descritos na Tabela 3 e apresentados nas SEQ ID Nos (DNA): 12663 e 12694, 12655 e 12686, 12643 e 12674, 12652 e 12683 e SEQ ID Nos (PRT) : 14407 e 14438, 14 399 e 14430, 14387 e 14418, 14396 e 14427. Também são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados por ácidos nucleicos que codificam SIR e, opcionalmente, codificam K13-vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo CD22. São fornecidos ainda neste documento vetores que codificam ácidos nucleicos que codificam SIR e K13-vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo CD22. Em modalidades exemplares, um vetor que codifica um SIR direcionado a CD22 é fornecido na SEQ ID NO: 12640. Também são fornecidas neste documento células geneticamente modificadas (como células T, células NKT) compreendendo vetores que codificam ácidos nucleicos que codificam SIR e K13-vFLIP, em que o domínio do SIR que é específico para o antígeno tem como alvo o CD22. Também são fornecidos

17 / 308 métodos para o tratamento e prevenção de uma doença em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam CD22.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] A Figura 1 descreve uma representação esquemática de diferentes zSIRs. CD3z-ECD, CD3z-TM, CD3z-CP referem-se aos domínios extracelular, transmembranar e citoplasmático de CD3z. 4-1BB e CD28 referem-se aos domínios co-estimuladores citoplasmáticos de 4-1BB e CD28.

[0029] A Figura 2 A-B representa a indução de IFNγ após a co-cultura de células CAR-T da divulgação com células RAJI (Figura 2A) e células Nalm6 (Figura 2B).

[0030] A Figura 3 representa a eficácia in vivo de células CAR-T da divulgação em um modelo de xenoenxerto de células RAJI, conforme medido usando imagem de bioluminescência.

[0031] A Figura 4 representa a eficácia in vivo de células CAR-T da divulgação em um modelo de xenoenxerto de células Nalm6 conforme medido usando imagem de bioluminescência.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0032] Como usado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “um” e “o” incluem referentes plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “uma célula” inclui uma pluralidade de tais células e a referência a “o polinucleotídeo” inclui referência a um ou mais polinucleotídeos e assim por diante.

[0033] Além disso, o uso de “ou” significa “e/ou”, salvo indicação contrária. Da mesma forma, “compreender”, “compreende”, “que compreende”, “incluir”, “inclui” e “que inclui” são intercambiáveis e não pretendem ser limitantes.

[0034] Entender-se-á ainda que quando as descrições de várias modalidades usam o termo “que compreende”, os versados na técnica

18 / 308 compreenderão que em alguns casos específicos, uma modalidade pode ser descrita alternativamente usando uma linguagem “consistindo essencialmente de” ou “que consiste em”.

[0035] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence.

[0036] O termo “cerca de” quando se refere a um valor mensurável, como uma quantidade, uma duração temporal e similares, pretende abranger variações de ± 20% ou, em alguns casos, ± 10%, ou em alguns casos ± 5%, ou em alguns casos ± 1%, ou em alguns casos ± 0,1% do valor especificado, como tais variações são apropriadas para realizar os métodos revelados ou descrever as composições no presente documento.

[0037] O termo "Ab-TCR" ou " AbTCR " refere-se a uma plataforma CAR de próxima geração, conforme descrito em WO 2017/070608 A1, que é aqui incorporado por referência. Em uma modalidade, um Ab-TCR compreende uma fração de anticorpo que se liga especificamente a um antígeno alvo fundido a um módulo de TCR capaz de recrutar pelo menos um módulo de sinalização de TCR. Módulos de TCR exemplares que podem ser usados na construção de Ab-TCR são fornecidos em SEQ ID NO: 959-964 (Tabela 6D) de WO2019067805 e em WO 2017/070608 A1 que são aqui incorporados por referência. Ab-TCRs exemplares direcionados a BCMA e co-expressando um módulo acessório que codifica NEMO-K277A são fornecidos na SEQ ID NO: 4382-4383 (Tabela 6). No entanto, a codificação do módulo acessório NEMO- K277A é opcional. Ab-TCR com os domínios de ligação ao antígeno (isto é, fragmentos vL e vH, ligantes e receptores etc.) descritos nesta divulgação podem ser construídos sem NEMO-K277A. Como tal, este módulo acessório junto com a sequência superior Furine-SGSG-F2A pode ser excluído do Ab- TCR. Alternativamente, o módulo acessório que codifica NEMO-K277A pode ser substituído por módulos acessórios que codificam outras proteínas, como

19 / 308 hNEMO-K277A-deltaV249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E- S181E, ou IKK1-S176E-S180E, e MyD88 –L265P, FKBPx2-NEMO, NEMO- L600-FKBPx2 etc. Além disso, os módulos TCR presentes no Ab-TCR podem ser substituídos por outros módulos TCR descritos no WO 2017/070608 A1.

[0038] O termo "módulo acessório" refere-se a um elemento que é co- expresso com um CAR (incluindo CAR de próxima geração, como SIR, zSIR, Ab-TCR, Tri-TAC, TFP etc.) e / ou rTCR para aumentar, diminuir, regular ou modificar a expressão ou atividade de células que expressam CAR / rTCR ou CAR / rTCR. Módulos acessórios exemplares incluem qualquer um ou mais de 41BBL, CD40L, HIV1-Vif, vFLIP K13, MC159, cFLIP-L / MRITα, cFLIP- p22, Taxa HTLV1, Taxa HTLV2, HTLV2 Tax-RS mutante, FKBPx2-K13, FKBPx2- HTLV2-Tax, FKBPx2-HTLV2-Tax-RS, IL6R-304-vHH-Alb8- vHH, IL12f, PD1-4H1 scFV, PD1-5C4 scFV, PD1-4H1-Alb8-vHH, PD1-5C4- Alb8-vHH, CTLA4-Ipilimumabe-scFv, CTLA4-Ipilimumabe-Alb8-vHH, IL6- 19A-scFV, IL6-19A-scFV-Alb8-vHH, sHVEM, sHVEM-Alb8-vHH, hTERT, Fx06, hNEMO-K277A, shRNA direcionado combinação dos mesmos. O módulo acessório pode ser co-expresso com o CAR / rTCR e semelhantes usando um único vetor ou usando dois ou mais vetores diferentes. Em algumas modalidades, os módulos acessórios reduzem ou evitam a toxicidade associada a CARs e / de TCRs e semelhantes. Em algumas modalidades, o módulo acessório melhora a eficiência da transferência de genes mediada por lentivírus.

[0039] O termo "anticorpo", como aqui utilizado, refere-se a uma proteína ou sequência de polipéptido derivado de uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente com um antigénio. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais, de cadeia única ou múltipla, ou imunoglobulinas intactas e podem ser derivados de fontes naturais ou de fontes recombinantes. Os anticorpos podem ser tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina. O anticorpo pode ser 'humanizado', 'quimérico' ou não humano.

20 / 308

[0040] O termo “fragmento de anticorpo” se refere a pelo menos uma porção de um anticorpo, que retém a capacidade de interagir especificamente com (por exemplo, por ligação, impedimento estérico, estabilização/desestabilização, distribuição espacial) um epítopo de um antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, Fab, Fab’, F (fragmentos Fh, abv, fragmentos de anticorpo scFv, Fvs ligados por dissulfureto (sdFv), um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CHl, anticorpos lineares, anticorpos de domínio único, como sdAb (vL ou vH), domínios de vHH de cameleo, anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo, como um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região de dobradiça e uma CDR isolada ou outros fragmentos de ligação ao epítopo de um anticorpo. Um fragmento de ligação ao antígeno também pode ser incorporado em anticorpos de domínio simples, maxicorpos, minicorpos, nanocorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv (consulte, por exemplo, Hollinger e Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005). Os fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser enxertados em esqueletos baseados em polipeptídeos, como uma fibronectina do tipo III (Fn3) (consulte a Patente nº US 6.703.199, que descreve mini-corpos de polipeptídeos de fibronectina).

[0041] O termo "anticorpo de cadeia pesada", refere-se ao maior dos dois tipos de cadeias de polipeptídeo presente em moléculas de anticorpo nas suas conformações que ocorrem naturalmente, e que normalmente determina a classe à qual pertence o anticorpo.

[0042] O termo "cadeia leve de anticorpo," refere-se ao menor dos dois tipos de cadeias de polipeptídeo presente em moléculas de anticorpo nas suas conformações naturais. As cadeias leves kappa (κ) e lambda (λ) referem-se aos dois principais isotipos de cadeia leve do anticorpo.

[0043] O termo "efeito anticâncer" ou "efeito antitumoral" refere-se a

21 / 308 um efeito biológico que pode ser manifestado por vários meios, incluindo, mas não se limitando a, uma diminuição no volume do tumor, uma diminuição no número de células cancerosas, uma diminuição no número de metástases, um aumento na expectativa de vida, diminuição na proliferação de células cancerosas, diminuição na sobrevivência de células cancerosas ou melhora de vários sintomas fisiológicos associados à condição cancerosa. Um "efeito anticâncer" também pode ser manifestado pela capacidade de um CAR, SIR, TFP, Ab-TCR, Tri-Tac, zSIR e semelhantes na prevenção da ocorrência de câncer em primeiro lugar.

[0044] "Agente anticâncer" refere-se a agentes que inibem a divisão e crescimento celular aberrante, inibem a migração de células neoplásicas, inibem a invasividade ou evitam o crescimento e metástase do câncer.

[0045] O termo "antigénio" ou "Ag" refere-se a uma molécula que provoca uma resposta imune.

[0046] O termo "célula de apresentação de antígeno " ou " APC" se refere a qualquer célula que expressa em sua superfície um antígeno que pode ser reconhecido por uma célula imune ou anticorpo que se liga a uma célula imune. Por exemplo, um linfócito B que expressa CD19 pode servir como uma célula de apresentação de antígeno para uma célula T que expressa um CAR direcionado contra CD19. Um APC pode apresentar um antígeno independente de uma molécula de MHC ou no contexto de uma molécula de MHC. O APC pode apresentar o antígeno em complexo com os principais complexos de histocompatibilidade (MHC). As células T podem reconhecer esses complexos MHC-antígeno usando seus receptores de células T (TCRs). Em uma modalidade alternativa, um APCs pode apresentar um antígeno em sua superfície que é reconhecido por um natural (por exemplo, CD28 ou 41BB) ou um sintético (por exemplo, CAR, SIR, zSIR, Ab-TCR, Tri-Tac ou TFP etc.) receptor expresso em células T independentes de MHC.

[0047] O termo "substrato de apresentação de antígeno" ou "APS"

22 / 308 refere-se a qualquer substrato, como uma esfera, uma micropérola, uma placa ou qualquer matriz que exibe um antígeno estranho em sua superfície. Em uma modalidade, um APS pode apresentar um antígeno em sua superfície que é reconhecido por um receptor natural (por exemplo, CD28 ou 41BB) ou um receptor sintético (por exemplo, um CAR convencional, um SIR, um zSIR, um Ab-TCR, um TFP) que é expresso em células T. Em uma modalidade exemplar, contas revestidos em sua superfície com o domínio extracelular de CD19 podem servir como APS para células T que expressam um CAR, SIR, zSIR, Ab-TCR ou TFP convencional que é direcionado para CD19.

[0048] O termo "efeito anti-infecção" refere-se a um efeito biológico que pode ser manifestado por vários meios, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, diminuição no título do agente infeccioso, uma diminuição nas contagens de colônias do agente infeccioso agente, melhora de vários sintomas fisiológicos associados à condição infecciosa. Um "efeito anti-infeccioso" também pode ser manifestado pela capacidade dos peptídeos, polinucleotídeos, células e anticorpos na prevenção da ocorrência de infecção em primeiro lugar.

[0049] Como usado no presente documento, afinidade pretende descrever uma medida da força de ligação. A afinidade, em alguns casos, depende da proximidade do ajuste estereoquímico entre um agente de ligação e seu alvo (por exemplo, entre um anticorpo e um antígeno incluindo epítopos específicos para o domínio de ligação), o tamanho da área de contato entre eles e a distribuição de grupos carregados e hidrofóbicos. A afinidade geralmente se refere à “capacidade” do agente de ligação de vincular seu alvo. Existem inúmeras formas utilizadas na técnica para medir a “afinidade”. Por exemplo, os métodos para calcular a afinidade de um anticorpo para um antígeno são conhecidos na técnica, incluindo a utilização de experiências de ligação para calcular a afinidade. A afinidade de ligação pode ser determinada com o uso de vias técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, ressonância plasmônica de superfície, interferometria de bio-camada, interferometria de polarização dupla,

23 / 308 dispersão estática de luz, dispersão dinâmica de luz, calorimetria de titulação isotérmica, ELISA, ultracentrifugação analítica e citometria de fluxo. Um método exemplificador para determinar a afinidade de ligação emprega ressonância plasmônica de superfície. A ressonância plasmônica de superfície é um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real pela detecção de alterações na concentração de proteínas em uma matriz biossensora, por exemplo, usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ).

[0050] Um “domínio de ligação ao antígeno” ou “módulo de ligação ao antígeno” ou “segmento de ligação ao antígeno” se refere a um polipeptídeo ou peptídeo que devido a sua sequência primária, secundária ou terciária e/ou modificações pós-traducionais e/ou carga se liga a um antígeno alto grau de especificidade. O domínio de ligação ao antígeno pode ser derivado de diferentes fontes, por exemplo, um anticorpo, uma proteína de ligação não imunoglobulina, um ligante ou um receptor.

[0051] "Avidez" refere-se à força da interação entre um agente de ligação e seu alvo (por exemplo, a força da interação entre um anticorpo e seu antígeno alvo, um receptor e seu cognato e semelhantes). Anticorpos e afinidades podem ser fenotipicamente caracterizados e comparados usando ensaios funcionais (por exemplo, ensaio de citometria de fluxo e ensaio de Topanga).

[0052] O termo "constante de associação (K a)" é definido como a constante de equilíbrio da associação de um receptor e ligante ou anticorpo e antígeno.

[0053] O termo "autoantígeno" refere-se a um antígeno endógeno que estimula a produção de uma resposta autoimune, como a produção de autoanticorpos. Exemplos de autoantígenos incluem, mas não estão limitados a, desmogleína 1, desmogleína 3 e seus fragmentos.

[0054] Conforme usado neste documento, o termo "estrutura principal"

24 / 308 se refere à combinação específica de CARs (Tabela 1) e módulos acessórios, conforme descrito na Tabela 2. Em modalidades exemplares, combinações específicas de CARs e módulos acessórios que compreendem vários estrutura principais são descritas na Tabela 2. Em uma modalidade, o CAR e o módulo acessório são codificados por uma única molécula de ácido nucleico. Em outra modalidade, o CAR é codificado pela primeira molécula de ácido nucleico e o módulo acessório é codificado por uma segunda molécula de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o módulo acessório é codificado por mais de uma molécula de ácido nucleico, dependendo do número de componentes nos módulos acessórios.

[0055] Conforme usado neste documento, "resultados benéficos" podem incluir, mas não estão limitados a, diminuir ou aliviar a gravidade da condição da doença, prevenir o agravamento da condição da doença, curar a condição da doença, prevenir o desenvolvimento da condição da doença, diminuir as chances de um paciente desenvolver a condição da doença e prolongar a vida ou a expectativa de vida de um paciente.

[0056] Tal como aqui utilizado, o termo "domínio de ligação" ou "molécula de anticorpo" refere-se a uma proteína, por exemplo, uma cadeia de imunoglobulina ou fragmento desta, compreendendo pelo menos um domínio, por exemplo, sequência de domínio variável de imunoglobulina que pode se ligar a um alvo com afinidade maior do que um domínio não específico. O termo abrange anticorpos e fragmentos de anticorpos.

[0057] "Liga o mesmo epítopo que" significa a capacidade de um anticorpo, scFv ou outro domínio de ligação ao antígeno para se ligar a um antígeno alvo e ter o mesmo epítopo que o anticorpo, scFv ou outro domínio de ligação ao antígeno exemplificado. Como exemplo, os epítopos do anticorpo, scFv ou outro agente de ligação e outros anticorpos exemplificados podem ser determinados usando técnicas de mapeamento de epítopos padrão. O epítopo ligado ao domínio de ligação ao antígeno de um CAR convencional ou um CAR

25 / 308 de próxima geração (por exemplo, SIR, zSIR, TFP, Tri-Tac ou Ab-TCR) também pode ser determinado pelo ensaio de classificação de epítopos.

O binning de epítopos é um imunoensaio competitivo usado para caracterizar e então classificar uma biblioteca de anticorpos monoclonais contra uma proteína-alvo.

Os anticorpos contra um alvo semelhante são testados contra todos os outros anticorpos na biblioteca em pares para ver se os anticorpos bloqueiam a ligação um do outro ao epítopo de um antígeno.

Após cada anticorpo ter um perfil criado contra todos os outros anticorpos na biblioteca, um perfil de bloqueio competitivo é criado para cada anticorpo em relação aos outros na biblioteca.

Perfis de binning intimamente relacionados indicam que os anticorpos têm o mesmo epítopo ou um epítopo intimamente relacionado e são "binning" juntos.

Da mesma forma, os epítopos conformacionais são prontamente identificados pela determinação da conformação espacial dos aminoácidos, como por exemplo, troca de hidrogênio / deutério, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional.

Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.

As regiões antigênicas das proteínas também podem ser identificadas usando gráficos de antigenicidade e hidropatia padrão, como aqueles calculados usando, por exemplo, o programa de software Omiga versão 1.0 disponível no Oxford Molecular Group.

Este programa de computador emprega o método Hopp / Woods, Hopp et al., (1981) Proc.

Natl.

Acad.

Sci USA 78: 3824-3828; para determinar perfis de antigenicidade e a técnica de Kyte- Dolittle, Kyte et al., (1982) J.Mol.

Biol. 157: 1 05-132; para gráficos de hidropatia.

Para determinar se os anticorpos monoclonais selecionados contra um alvo (por exemplo, CD19) se ligam a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado usando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, Ill.). Os estudos de competição usando anticorpos monoclonais não marcados e anticorpos monoclonais biotinilados podem ser realizados usando placas de ELISA revestidas com o domínio extracelular de CD19. A ligação de mAb biotinilado pode ser detectada com

26 / 308 uma sonda de fosfatase alcalina-avidina-estreptococos.

[0058] Como usado no presente documento, o termo “CDR” ou “região determinante de complementaridade” pretende significar os sítios de combinação de antígeno não contíguos encontrados dentro da região variável de polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Essas regiões particulares foram descritas por Kabat et al., J. Biol.Chem. 252: 6609-6616 (1977); Kabat et al., Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991); Chothia et al., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987); e MacCallum et al., J. Mol.Biol. 25 262: 732-745 (1996), em que as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados um contra o outro. No entanto, a aplicação de qualquer definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou anticorpos enxertados ou suas variantes pretende estar dentro do escopo do termo como definido e aqui usado. Como usado no presente documento, as diferentes CDRs de um anticorpo podem também ser definidas por uma combinação das diferentes definições. Por exemplo, vHCDR1 pode ser definido com base em Kabat e VHCDR2 pode ser definido com base em Chothia. Os resíduos de aminoácidos que abrangem as CDRs, como definido por cada uma das referências citadas acima, são as seguintes: Definições de CDR Kabat Chothia MacCallum VHCDR1 31-35 26 a 32 30 a 35 VHCDR2 50-65 53-55 47-58 VHCDR3 95-102 96-10 193-101 VLCDR1 24-34 26 a 32 30 a 36 VLCDR2 50-56 50-52 46-55 VLCDR3 89-97 91-96 89-96 (Números de Resíduos correspondem à referência identificada).

[0059] O termo "região de estrutura" refere-se às porções reconhecidas na técnica de uma região variável de anticorpo que existe entre as CDRs mais divergentes (isto é, ipervariáveis).

[0060] Modificações na sequência de aminoácidos das moléculas de

27 / 308 ligação aqui descritas são contempladas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e / ou outras propriedades biológicas dos fragmentos vL e / ou vH de um CAR convencional ou um CAR de próxima geração (por exemplo, SIR, zSIR e semelhantes). Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e / ou inserções e / ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos das moléculas de ligação. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar os processos pós-tradução das moléculas de ligação, como a alteração do número ou posição dos locais de glicosilação. De preferência, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos podem ser substituídos em um CDR, enquanto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 25 aminoácidos podem ser substituídos nas regiões estruturais (FRs). As substituições são preferencialmente substituições conservativas, conforme descrito neste documento. Adicionalmente, ou alternativamente, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos podem ser inseridos ou deletados em cada um dos CDRs (claro, dependendo de seu comprimento), enquanto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 25 aminoácidos podem ser inseridos ou deletados em cada um dos FRs.

[0061] De preferência, as inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino-terminal e / ou carboxil-terminal variando em comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Uma variante de inserção da molécula de ligação inclui a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima ou uma fusão a um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.

[0062] Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes têm preferencialmente pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos na molécula de ligação substituídos por

28 / 308 um resíduo diferente. Os locais de maior interesse para mutagênese substitucional incluem os CDRs da cadeia pesada e / ou leve, em particular as regiões hipervariáveis, mas alterações de FR na cadeia pesada e / ou leve também são contempladas.

[0063] Por exemplo, se uma sequência CDR engloba 6 aminoácidos, considera-se que um, dois ou três destes aminoácidos são substituídos. Do mesmo modo, se uma sequência CDR abranger 15 aminoácidos, considera-se que um, dois, três, quatro, cinco ou seis destes aminoácidos são substituídos.

[0064] Geralmente, se os aminoácidos são substituídos em um ou mais ou todos os CDRs da cadeia pesada e / ou leve, é preferível que a sequência "substituída" então obtida seja de pelo menos 60%, mais preferencialmente 65%, ainda mais preferencialmente 70%, particularmente preferencialmente 75%, mais particularmente preferencialmente 80% idêntica à sequência CDR "original". Isso significa que é dependente do comprimento do CDR em que grau é idêntico à sequência "substituída". Por exemplo, um CDR com 5 aminoácidos é de preferência 80% idêntico à sua sequência substituída para ter pelo menos um aminoácido substituído. Consequentemente, os CDRs da molécula de ligação podem ter diferentes graus de identidade com suas sequências substituídas, por exemplo, CDRL1 pode ter 80%, enquanto CDRL3 pode ter 90%.

[0065] As substituições preferidas (ou substituições) são substituições conservativas. No entanto, qualquer substituição (incluindo substituição não conservativa ou uma ou mais das "substituições exemplares" listadas aqui abaixo) é considerada, desde que a molécula de ligação retenha sua capacidade de se ligar ao antígeno alvo e / ou seus CDRs tenham uma identidade com a sequência então substituída (pelo menos 60%, mais de 65%, mais de 70%, normalmente mais de 75% ou mais de 80% idêntica à sequência CDR "original").

[0066] As substituições não conservadoras implicarão a troca de um

29 / 308 membro de uma por outra classe. Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada da molécula de ligação pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir a reticulação aberrante. Por outro lado, ligações de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo, como um fragmento Fv).

[0067] Os SEQ IDs dos CDRs dos segmentos vL e vH exemplares que podem ser usados para constituir os domínios de ligação ao antígeno de um CAR (por exemplo, um CAR de 2ª geração, um SIR, um zSIR, um Ab-TCR, Tri -Tac ou um TFP) da divulgação visando diferentes antígenos são fornecidos na Tabela 4.

[0068] Em algumas modalidades, a referência a um módulo de ligação ao antígeno (como um módulo de ligação ao antígeno tipo Fab ou Fv) que se liga especificamente a um antígeno-alvo significa que o módulo de ligação ao antígeno se liga ao antígeno-alvo com (a) uma afinidade que é pelo menos cerca de 10 (por exemplo, cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 ou mais) vezes a sua afinidade de ligação para outras moléculas; ou (b) um K d não mais que cerca de 1/10 (por exemplo, 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1175, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000 ou menos) vezes o seu K d para ligação a outras moléculas. A afinidade de ligação pode ser determinada por modos conhecidos na técnica, como ELISA, anise de triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) ou ensaios de radioimunoprecipitação (RIA). Kd pode ser determinado por métodos conhecidos na técnica, como ensaio de ressonância plasmônica de superfície (SPR), com o uso de, por exemplo, instrumentos de Biacore, ou ensaio de exclusão cinética (KinExA) com o uso de, por exemplo, instrumentos Sapidyne.

[0069] “Câncer” e “canceroso” se referem ou descrevem a condição

30 / 308 fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a linfomas de células B (linfomas de Hodgkin e/ou linfomas não Hodgkins), câncer testicular, câncer de pulmão e leucemia. Outros cânceres e distúrbios proliferativos celulares serão facilmente reconhecidos na técnica. Os termos “tumor” e “câncer” são aqui usados indistintamente, por exemplo, ambos os termos abrangem tumores sólidos e líquidos, por exemplo, difusos ou circulantes. Como usado no presente documento, o termo “câncer” ou “tumor” inclui tumores e tumores pré-malignos, bem como malignos.

[0070] "Agentes quimioterápicos" são compostos que são conhecidos por serem úteis em quimioterapia para câncer.

[0071] "Receptores de antígenos quiméricos" (CAR) são receptores de células T artificiais contemplados para uso como uma terapia para o câncer, usando uma técnica chamada transferência de células adotivas. CARs são construídos especificamente para estimular a ativação e proliferação de células T em resposta a um antígeno específico ao qual o CAR se liga. O termo "receptor de antígeno quimérico" ou, alternativamente, um "CAR" refere-se a um conjunto de polipeptídeos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, que quando expressos em uma célula imune efetora, fornece à célula especificidade para uma célula alvo, tipicamente uma célula cancerosa, e com geração de sinal intracelular. Em algumas modalidades, um CAR compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno extracelular, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização citoplasmática (também referido neste documento como "um domínio de sinalização intracelular") compreendendo um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimuladora e/ou molécula costimulatória. Em alguns aspectos, o conjunto de polipeptídeos é contíguo entre si. Em um aspecto, a molécula estimuladora é a cadeia zeta associada ao complexo receptor de células T. Em um aspecto, o domínio de sinalização citoplasmática compreende ainda um ou

31 / 308 mais domínios de sinalização funcionais derivados de pelo menos uma molécula coestimuladora conforme definido abaixo.

Em um aspecto, a molécula coestimuladora é escolhida a partir das moléculas coestimulatórias aqui descritas, por exemplo, 4-lBB (isto é, CD137), CD27 e / ou CD28. Em um aspecto, o CAR compreende uma sequência líder opcional no terminal amino (N- ter) da proteína de fusão do CAR.

Em um aspecto, o CAR compreende ainda uma sequência líder no terminal N do domínio de ligação ao antígeno extracelular, em que a sequência líder é opcionalmente clivada do domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um scFv) durante o processamento celular e localização do CAR em a membrana celular.

Normalmente, são usadas "células CAR-T", que se referem a células T que foram projetadas para conter um receptor de antígeno quimérico.

Assim, os linfócitos T portadores de tais CARs são geralmente referidos como linfócitos CAR-T.

Um CAR de segunda geração direcionado a CD19 e compreendendo um peptídeo sinal de CD8, um domínio de ligação ao antígeno baseado em CD19-AM1 scFv, uma dobradiça CD8 e um domínio transmembranar, um domínio coestimulatório 4-1BB e um domínio estimulador CD3z é representado por SEQ ID NO: 799. Um CAR no qual o domínio coestimulador 4-1BB é substituído por um domínio coestimulador diferente (por exemplo, CD28 ou CD27) também é referido como um CAR convencional.

Para superar a limitação de CARs convencionais, vários projetos alternativos ou CARs de próxima geração foram descritos, incluindo proteínas de fusão de receptor de TCR ou TFP (WO 2016/187349 A1), TCR de anticorpo ou AbTCRs (PCT / US2016 / 058305). Tri-TAC (WO 2015/117229 A1) e receptores imunes sintéticos ou SIR (US 62 / 429.597 e PCT / US17 / 64379). Conforme usado neste documento, o termo "CAR" ou "CARs" também abrange abordagens mais recentes (ou seja, TFP, AbTCR, Tri-Tac, SIR e zSIR etc.) para conferir especificidade de antígeno às células.

A presente divulgação fornece vários novos domínios de ligação ao antígeno que podem ser usados para a geração de CARs.

Embora não explicitamente descrito, prevê-se que esses

32 / 308 domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv, vL, vH ou vHH etc.) possam ser usados para gerar os CARs convencionais de primeira e segunda geração, bem como abordagens mais recentes (ou seja, TFP, AbTCR, Tri-Tac, SIR e zSIR etc.) para conferir especificidade de antígeno às células. Assim, os fragmentos vL e vH de um determinado domínio de ligação ao antígeno podem ser usados para gerar um SIR de cadeia dupla, um Ab-TCR de cadeia dupla ou um zSIR de cadeia dupla quando esses fragmentos são fundidos às duas cadeias constantes (por exemplo, TCRa / b ou TCRg / d) compreendendo um SIR, Ab- TCR ou zSIR. O fragmento vL e vH do mesmo domínio de ligação ao antígeno pode ser unido por meio de um ligante flexível para gerar um scFv que, por sua vez, pode ser usado para gerar um primeiro ou segundo CAR de generaiton convencional, um TFP ou um Tri-TAC usando métodos conhecidos no arte.

[0072] "Otimização de códon" ou "controle de enviesamento de códon de espécie" refere-se ao uso de códon preferido de uma célula hospedeira particular

[0073] Conforme usado neste documento, "coexpressar" refere-se à expressão de dois ou mais genes. Os genes podem ser ácidos nucleicos que codificam, por exemplo, uma única proteína ou uma proteína quimérica como uma única cadeia polipeptídica. Por exemplo, o zSIR aqui descrito pode ser codificado por uma única cadeia polinucleotídica e sintetizado como uma única cadeia polipeptídica, que é subsequentemente clivada em diferentes polipeptídeos, cada um representando uma unidade funcional diferente. Em algumas modalidades, onde z SIR consiste em duas ou mais unidades polipeptídicas funcionais, as diferentes unidades funcionais são coexpressas usando uma ou mais cadeias polinucleotídicas. Em outra modalidade, as diferentes cadeias polinucleotídicas são ligadas por sequências de ácido nucleico que codificam para ligantes cliváveis (por exemplo, T2A, F2A, P2A, E2A etc.). Em outra modalidade, um motivo Ser- Gly -Ser- Gly (SGSG) (SEQ ID NO: 86-87 e 4085-86) é também adicionado a montante das sequências de

33 / 308 ligação cliváveis para aumentar a eficiência da clivagem. Uma desvantagem potencial dos ligantes cliváveis é a possibilidade de que a pequena marca 2A deixada no final da proteína N-terminal pode afetar a função da proteína ou contribuir para a antigenicidade das proteínas. Para ultrapassar isto, em algumas modalidades, um sítio de clivagem de furina (RAKR) (SEQ ID NO: 88-90 e 4087-4089) é adicionado a montante dos motivos SGSG para facilitar a clivagem do peptídeo 2A residual após a tradução. Os polinucleotídeos que codificam as diferentes unidades de um zSIR podem ser ligados por sequências IRES (Local de entrada ribossômica interna). Alternativamente, as diferentes unidades funcionais de um zSIR são codificadas por dois polinucleotídeos diferentes que não estão ligados por meio de um ligante, mas são codificados por, por exemplo, dois vetores diferentes. As sequências de ácido nucleico de ligantes cliváveis são fornecidas em SEQ ID NO: 80 a SEQ ID NO: 85.

[0074] Será reconhecido que as proteínas podem ter a identidade ou homologia com uma outra e reter s imilar ou funções idênticas. Por exemplo, a divulgação inclui cadeias de CD3z que têm 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98,5%, 99% ou 99,9% de identidade com qualquer uma das sequências aqui descritas, enquanto retêm a atividade biológica.

[0075] O termo uma “molécula coestimulatória” se refere a um parceiro de ligação cognato na célula At que se liga especificamente a um ligante coestimulatório, mediando assim uma resposta coestimulatória pela célula T, como, sem limitação, proliferação.As moléculas coestimulatórias são moléculas da superfície celular que não os receptores de antígeno ou seus ligantes que contribuem para uma resposta imune eficiente. As moléculas costimulatórias incluem, sem limitação uma molécula de MHC de classe I, BTLA e um receptor de ligante do tipo Toll, bem como OX40, CD27, CD28, CD8, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) e 4-1BB (CD137). Outros exemplos de tais moléculas coestimulatórias incluem CD8, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44,

34 / 308 NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8a, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDIld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDLLa, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDllc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (tátil), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CdlOO (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IP0-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a e um ligante que se liga especificamente ao CD83. Um domínio de sinalização intracelular coestimulatório pode ser a porção intracelular de uma molécula costimulatória. Uma molécula costimulatória pode ser representada nas seguintes famílias de proteínas: proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a imunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas sinalizadoras de ativação linfocítica (proteínas SLAM) e ativação de receptores de células NK. Exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, antígeno 1 associado a função linfocitária (LFA-1), CD2, CD8 CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3 e um ligante que se liga especificamente a CD83 e similares. O domínio de sinalização intracelular pode compreender toda a porção intracelular, ou todo o domínio de sinalização intracelular nativa, da molécula da qual deriva, ou um fragmento do mesmo funcional ou derivado.

[0076] O termo "antígeno específico da doença" ou "antígeno associado à doença" ou "antígeno causador da doença" refere-se a um antígeno expresso nas células que contribuem para o desenvolvimento de uma doença.

[0077] O termo “células causadora de doença” ou “células associados a doença” refere-se a uma célula que contribuem para o desenvolvimento de uma doença. Células causadoras de doenças exemplares incluem células

35 / 308 cancerosas e células infectadas por vírus. Células não cancerosas, como os linfócitos B e T, têm sido associadas à patogênese de doenças imunológicas, alérgicas, degenerativas e infecciosas e também são consideradas células causadoras de doenças.

[0078] O termo "antígeno de suporte de doença" se refere a um antígeno expresso em células que suportam a sobrevivência, proliferação, persistência ou atividade de células causadoras de doença. Em algumas modalidades, o antígeno que suporta a doença é um antígeno presente nas células do estroma. Sem desejar ser limitado pela teoria, em algumas modalidades, as células que expressam CAR destroem as células de suporte da doença, bloqueando indiretamente o crescimento ou a sobrevivência das células causadoras da doença. Antígenos de células estromais exemplares incluem antígeno de células estromais de medula óssea 2 (BST2), proteína de ativação de fibroblastos (FAP) e tenascina.

[0079] O termo "doenças degenerativas" refere-se a uma doença que é o resultado de um processo contínuo baseado em alterações celulares degenerativas, afetando tecidos ou órgãos, que se deterioram cada vez mais com o tempo, seja devido ao desgaste normal do corpo ou escolhas de estilo de vida, como exercícios ou hábitos alimentares. Doenças degenerativas exemplares incluem doença de Alzheimer, doença de Charcot-Marie-Tooth, doença de Creutzfeldt-Jakob, ataxia de Friedreich, diabetes mellitus (tipo II) e aterosclerose.

[0080] “Derivado de” como o termo é usado aqui, indica uma relação entre uma primeira e uma segunda molécula. Geralmente se refere à semelhança estrutural entre a primeira molécula e uma segunda molécula e não conota ou inclui um processo ou limitação de fonte sobre uma primeira molécula que é derivada de uma segunda molécula. Por exemplo, no caso de um domínio de ligação ao antígeno que derivado de uma molécula de anticorpo, o domínio de ligação ao antígeno retém uma estrutura de anticorpo suficiente

36 / 308 de modo que tem a função requerida, a saber, a capacidade de se ligar a um antígeno.

[0081] A frase "doença associada à expressão de um antígeno alvo" ou "antígeno associado à doença" inclui, mas não está limitada a, uma doença associada à expressão de um antígeno alvo, conforme descrito neste documento ou uma condição associada a células que expressam um antígeno alvo, conforme descrito neste documento, incluindo, por exemplo, doenças proliferativas, como um câncer ou malignidade ou uma condição pré- cancerosa, como uma mielodisplasia, uma síndrome mielodisplásica ou uma pré-leucemia; ou uma indicação não relacionada ao câncer associada a células que expressam um antígeno alvo, como aqui descrito. Em um aspecto, um câncer associado à expressão de um antígeno tumoral, conforme descrito neste documento, é um câncer hematológico. Em um aspecto, um câncer associado à expressão de um antígeno tumoral, conforme descrito neste documento, é um câncer sólido. Outras doenças associadas à expressão de um antígeno tumoral aqui descrito incluem, mas não estão limitadas a, cânceres atípicos e / ou não clássicos, doenças malignas, condições pré-cancerosas ou doenças proliferativas associadas à expressão de um antígeno tumoral como aqui descrito. As indicações não relacionadas ao câncer associadas à expressão de um antígeno alvo, conforme descrito neste documento, incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, doença autoimune (por exemplo, lúpus), distúrbios inflamatórios (alergia e asma) e transplante. Em algumas modalidades, as células que expressam o antígeno alvo expressam, ou em qualquer momento expresso, o mRNA que codifica o antígeno alvo. Em outra modalidade, as células que expressam o antígeno alvo produzem a proteína do antígeno alvo (por exemplo, tipo selvagem ou mutante), e a proteína do antígeno alvo pode estar presente em níveis normais ou níveis reduzidos. Em outra modalidade, as células que expressam o antígeno alvo produziram níveis detectáveis de uma proteína do antígeno alvo em um ponto e, subsequentemente, não produziram

37 / 308 nenhuma proteína do antígeno alvo detectável.

[0082] “Doença alvejada por células geneticamente modificadas”, como usado no presente documento, abrange o direcionamento de qualquer célula envolvida de qualquer maneira em qualquer doença por células geneticamente modificadas que alisam à doença ou a um tecido ou tipo de célula-alvo, independentemente se as células geneticamente modificadas forem alvo células doentes ou células saudáveis para efetuar um resultado terapeuticamente benéfico.

[0083] O termo “constante de dissociação (Kd)” é definido como a constante de equilíbrio da dissociação de uma interação receptor-ligante.

[0084] O termo "que codifica para" refere-se à propriedade inerente de sequências específicas de nucleótidos num polinucleótido, tal como um gene, um ADNc ou um ARNm, que servem como moldes para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em biológicos processos que têm tanto uma sequência definida de nucleotídeos (por exemplo, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas delas resultantes. Assim, um gene, cDNA ou RNA, codifica uma proteína se a transcrição e tradução do mRNA correspondente a esse gene produz a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a codificação de cadeia, o nucleótido sequência do qual é idêntico ao do ARNm de sequência e é geralmente fornecida na sequência de listagens, e a cadeia não codificante, utilizada como modelo para a transcrição de um gene ou ADNc, pode ser referido como codificando a proteína ou outro produto desse gene ou cDNA.

[0085] A menos que especificado de outra forma, uma "sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos" inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. A frase sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou um RNA também pode incluir em trans na medida em que a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína

38 / 308 pode em alguma versão conter um íntron (s).

[0086] O termo "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" são usados indistintamente aqui e referem-se a uma quantidade de um composto, formulação, material ou composição, conforme descrito neste documento, eficaz para atingir um resultado biológico particular.

[0087] O termo "endógeno", "nativo" ou "de ocorrência natural" refere- se a qualquer material proveniente ou produzido dentro de um organismo, célula, tecido ou sistema. Também se refere a um gene, proteína, ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA, etc.) ou fragmento do mesmo que é nativo de uma célula ou é naturalmente expresso em uma célula.

[0088] O termo "exógena" refere-se a qualquer material introduzido a partir ou produzidos fora do organismo, cula, tecido ou sistema.

[0089] O termo "expressão" refere se para a transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleótidos particular, accionado por um promotor e / ou outros elementos reguladores.

[0090] O termo “vetor de transferência” se refere a uma composição de matéria que compreende um ácido nucleico isolado e que pode ser usado para distribuir o ácido nucleico isolado no interior de uma célula. Assim, o termo “vetor de transferência” inclui um plasmídeo de replicação autônoma ou um vírus. O termo também deve ser entendido para incluir ainda compostos não plasmídicos e não virais que facilitem a transferência de ácido nucleico para as células, como, por exemplo, um composto poli-lisina, lipossoma e similares. Exemplos de vetores de transferência viral incluem, sem limitação, a vetores adenovirais, vetores virais adeno-associados, vetores retrovirais, vetores lentivirais e similares.

[0091] Os vectores de expressão incluem todos os conhecidos na arte, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e os vírus (por exemplo, lentivus, retrovus, adenovus, e adeno vírus associados) que incorporam o recombinante polinucleótido.

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[0092] Como usado aqui, um "epítopo" é definido como a porção de um antígeno capaz de induzir uma resposta imune, ou a porção de um antígeno que se liga a um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Os epítopos podem ser uma sequência ou subsequência de proteína.

[0093] O termo "vector de expressão" refere-se a um vector que compreende um polinucleótido recombinante compreendendo sequências de controlo de expressão operativamente ligadas a uma sequência de nucleótidos a ser expressa. Os vetores de expressão incluem todos aqueles conhecidos na técnica, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

[0094] O termo "unidade polipeptídica funcional (FPU)" de, por exemplo, um zSIR, refere-se a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de sinal do terminal amino funcionalmente ligada a um domínio de ligação ao antígeno e, por exemplo, uma cadeia CD3z. Por exemplo, o domínio de ligação ao antígeno está localizado entre a sequência de sinal e a cadeia CD3z.

[0095] O termo "porção funcional" quando usado em referência a, por exemplo, um zSIR refere-se a qualquer parte ou fragmento de um polipeptídeo, por exemplo, o zSIR, cuja parte ou fragmento retém a atividade biológica da molécula desejada, por exemplo, do zSIR, do qual faz parte (por exemplo, o zSIR pai). Por exemplo, as porções funcionais englobam aquelas partes de um zSIR que retêm a capacidade de reconhecer células alvo, ou detectar, tratar ou prevenir uma doença, em uma extensão semelhante, na mesma ou em maior extensão, como o zSIR pai. Em referência ao zSIR pai, a porção funcional pode compreender, por exemplo, cerca de 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% ou mais, do zSIR pai.

[0096] "Células geneticamente modificadas", "células redirecionadas", "células geneticamente modificadas" ou "células modificadas", conforme usado neste documento, referem-se a células que foram modificadas para

40 / 308 expressar um CAR (por exemplo, um CAR convencional de 2ª geração, TFP, AbTCR, SIR, Tri-Tac e zSIR) ou um TCR recombinante. Por exemplo, um linfócito T geneticamente modificado que expressa um CAR ou um zSIR é uma célula geneticamente modificada.

[0097] O termo "distúrbio imune" refere-se a uma doença caracterizada por uma disfunção do sistema imunológico. Uma doença autoimune é uma condição decorrente de uma resposta imune anormal a uma parte normal do corpo. Existem pelo menos 80 tipos de doenças autoimunes.

[0098] "Célula imune efetora", como esse termo é usado neste documento, refere-se a uma célula que está envolvida em uma resposta imune, por exemplo, na promoção de uma resposta imune efetora. Exemplos de células efetoras imunológicas incluem células T, por exemplo, células T alfa / beta e células T gama / delta, células B e células T assassinas naturais (NKT).

[0099] "Célula que expressa o receptor imune", como o termo é usado neste documento, refere-se a uma célula que está envolvida em uma resposta imune, por exemplo, na promoção de uma resposta imune efetora e na expressão de um ou mais receptores imunes, como um TCR endógeno, um TCR recombinante ou um CAR. Exemplos de células que expressam receptores imunes incluem células T, por exemplo, células T alfa / beta e células T gama / delta e células NKT.

[00100] "Função imune efetora ou resposta imune efetora", tal como o termo é usado neste documento, refere-se à função ou resposta, por exemplo, de uma célula imune efetora, que aumenta ou promove um ataque imunológico de uma célula alvo, por exemplo, um função efetora ou resposta refere-se a uma propriedade de uma célula T ou NK que promove a morte ou a inibição do crescimento ou proliferação de uma célula alvo. No caso de uma célula T, a estimulação primária e a coestimulação são exemplos de função ou resposta imune efetora.

[00101] Um "domínio de sinalização intracelular", como o termo é

41 / 308 usado neste documento, refere-se a uma porção de sinalização intracelular de uma molécula. O domínio de sinalização intracelular gera um sinal que promove, por exemplo, uma função efetora imune das células que contêm o CAR (por exemplo, CAR de 2ª geração, TFP, AbTCR, SIR, Tri-TAC e / ou zSIR). Exemplos de função efetora imune incluem atividade citolítica e atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas. As cadeias TCRα / β / γ / δ não têm um domínio de sinalização intracelular próprio, mas transmitem um sinal por associação com outras cadeias do complexo de sinalização de TCR (por exemplo, CD3z, CD3e, CD3d e CD3g) que possuem um domínio de sinalização. Em outra modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio de sinalização intracelular primário. Domínios de sinalização intracelular primários exemplares incluem aqueles derivados das moléculas responsáveis pela estimulação primária ou simulação dependente de antígeno. Em outra modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio intracelular coestimulatório. Domínios de sinalização intracelular coestimulatório exemplares incluem aqueles derivados de moléculas responsáveis por sinais coestimulatório ou estimulação independente de antígeno. Por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário pode compreender uma sequência citoplasmática de CD3z, e um domínio de sinalização intracelular co-estimulador pode compreender uma sequência citoplasmática de co-receptor ou molécula co-estimuladora, como CD28 ou 41BB.

[00102] Um domínio de sinalização intracelular primário pode compreender um motivo de sinalização que é conhecido como um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptor ou ITAM. Exemplos de ITAM contendo sequências de sinalização citoplasmática primárias incluem, mas não estão limitados a, aquelas derivadas de CD3 zeta, FeR gama comum (FCER1G), Fe gama RIIa, FeR beta (Fe Épsilon R1b), CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAPl0 e DAP12.

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[00103] Conforme usado neste documento, o termo "ligante" (também "domínio ligante" ou "região ligante") se refere a um oligo ou polipeptídeo que une dois ou mais domínios ou regiões de um CAR (por exemplo, CAR de 2ª geração, TFP, AbTCR, SIR e zSIR) divulgados aqui. O ligante pode ter de 1 a 500 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o "ligante" é clivável ou não clivável. A menos que especificado de outra forma, o termo "ligante" aqui utilizado significa um ligante não clivável. Os ligantes não cliváveis podem ser compostos por resíduos flexíveis que permitem a liberdade de movimento das doaminas de proteínas adjacentes umas em relação às outras. Exemplos não limitativos de tais resíduos incluem glicina e serina. Em algumas modalidades, os ligantes incluem resíduos não flexíveis. Modalidades exemplares de ligantes com ligantes não flexíveis são EAAAK (SEQ ID NO: 4011), E-coil (SEQ ID NO: 4009), K-coil (SEQ ID NO: 4010) ou PG4SP (SEQ ID NO: 4007). Em outras modalidades, o ligante que se junta ao domínio de ligação ao antígeno e as cadeias CD3z de um zSIR compartilham comprimento semelhante. Em outras modalidades, o ligante que se junta ao domínio de ligação ao antígeno e as cadeias CD3z de um zSIR diferem em comprimento por não mais do que 20 aminoácidos, tipicamente por não mais do que 10 aminoácidos, preferencialmente por não mais do que 5 aminoácidos, mais preferencialmente por não mais do que 2 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante que se junta ao domínio de ligação ao antígeno e as cadeias CD3z de um zSIR têm a composição de aminoácidos idêntica ou semelhante. Ligantes exemplares com composição idêntica são PG4SP (SEQ ID NO: 4007) e PG4SP-v2 (SEQ ID NO: 4008). Em algumas modalidades, os ligantes que se unem ao domínio de ligação ao antígeno e às cadeias de CD3z de um zSIR são PG4SP (DNA SEQ ID NO: 8; PRT SEQ ID NO: 4007) e PG4SP-v2 (DNA SEQ ID NO: 9; PRT SEQ ID NO: 4008).

[00104] Em algumas modalidades, os ligantes que unem os domínios de ligação ao antígeno e as cadeias CD3z de um zSIR são derivados de anticorpos.

43 / 308 Em uma modalidade, o ligante que une uma região vL e uma cadeia CD3z de um zSIR é IgCL (DNA SEQ ID NO: 28; PRT SEQ ID NO: 4027) e o ligante que se junta a uma região vH e uma cadeia CD3z de um zSIR é IgG1-CH1 (DNA SEQ ID NO: 29 e PRT SEQ ID NO: 4028). Em algumas modalidades, o ligante que se junta ao respectivo domínio de ligação ao antígeno e à cadeia CD3z de um zSIR são IgCL (DNA SEQ ID NO: 28; PRT SEQ ID NO: 4027) e IgG2-0C-CH1 (DNA SEQ ID NO: 30; PRT SEQ ID NO: 4029). Em algumas modalidades, o ligante pode compreender uma etiqueta de epítopo. Em algumas modalidades, o epítopo tag é selecionado do grupo que consiste em um tag MYC, um tag V5, um tag AcV5, um StreptagII, um tag FLAG ou HA. Em algumas modalidades, o ligante não clivável tem um comprimento suficiente para garantir que dois domínios adjacentes não interfiram estericamente um com o outro. Em uma modalidade da divulgação, três resíduos de aminoácidos (Gly-Ser-Gly) são adicionados ao terminal carboxi dos ligantes (por exemplo, etiqueta Myc ou etiqueta V5) que estão localizados entre o domínio de ligação ao antígeno e as cadeias CD3z de o zSIR. Em certas modalidades, os ligantes podem transportar sequências adicionais, como locais de enzimas de restrição.

[00105] O termo "ligante polipeptídico flexível", conforme usado em refere-se a um ligante peptídico que consiste em aminoácidos, tais como, por exemplo, glicina e / ou resíduos de serina usados isoladamente ou em combinação, para ligar cadeias polipeptídicas entre si (por exemplo, variáveis regiões de cadeia pesada e variável leve juntas). Em uma modalidade, o ligante polipeptídico flexível é um ligante Gly/Ser e compreende a sequência de aminoácidos (Gly - Gly - Gly -Ser)n, onde n é um número inteiro positivo igual ou superior a 1. Por exemplo, n = 1, n = 2, n = 3. n = 4, n = 5 e n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 e n = 10. Em uma modalidade, os ligantes polipeptídicos flexíveis incluem, mas não estão limitados a, (Gly4Ser)4 ou (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 5). Em outra modalidade, os ligantes incluem múltiplas repetições de (Gly2 Ser), (GlySer) ou (Gly3 Ser). Também incluídos no escopo da divulgação estão os

44 / 308 ligantes descritos em WO2012/138475 (incorporados neste documento por referência).

[00106] O termo "lentivírus" se refere a um gênero da família Retroviridae. HIV, SIV e FIV são exemplos de vírus lenti.

[00107] O termo "vetor lentiviral" refere-se a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de lentivírus, incluindo especialmente um vetor lentiviral auto-inativador, conforme fornecido em Milone et al., Mol. Ther. 17 (8): 1453-1464 (2009). Outros exemplos de vetores de lentivírus que podem ser usados na clínica incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, a tecnologia de entrega de genes LENTIVECTOR® da Oxford BioMedica, o sistema de vetores LENTIMAX ™ da Lentigen e semelhantes. Outros exemplos de vetores de lentivírus são pLENTI-EF1α (SEQ ID NO: 129), pLENTI-EF1α-DWPRE (SEQ ID NO: 130) e pCCLc-MNDU3 (SEQ ID NO: 12639).

[00108] Conforme usado neste documento, um "domínio de ligação ao antígeno TCR de ocorrência não natural" refere-se a um domínio de ligação operacionalmente ligado a uma região constante de TCR ou uma cadeia CD3z que é quimérica e de ocorrência não natural em relação a um TCR presente na natureza. Dito de outra forma, o domínio de ligação ao antígeno TCR de ocorrência não natural é "projetado" usando técnicas de biologia molecular recombinante para ser operacionalmente ligado a uma cadeia constante de TCR ou uma cadeia CD3z e, além disso, que o domínio de ligação ao antígeno é obtido ou derivado de uma molécula que é diferente de um TCR encontrado na natureza. Um domínio de ligação de antígeno que é distinto de um TCR na natureza inclui fragmentos de anticorpo vH e vL, fragmentos de anticorpo humanizado, fragmentos de anticorpo quiméricos, ligantes de receptor e semelhantes.

[00109] O termo "operacionalmente ligado" refere-se à ligação ou associação funcional entre um primeiro componente e um segundo componente

45 / 308 de modo que cada componente possa ser funcional. Por exemplo, operativamente ligado inclui a associação entre uma sequência reguladora e uma sequência de ácido nucleico heteróloga resultando na expressão desta última. Por exemplo, uma primeira sequência de ácido nucleico está operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. No contexto de dois polipeptídeos que estão operacionalmente ligados, um primeiro polipeptídeo funciona da maneira que seria independente de qualquer ligação e o segundo polipeptídeo funciona como seria na ausência de uma ligação entre os dois.

[00110] A “identidade percentual” no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, se refere a duas ou mais sequências que são as mesmas. Duas sequências são “substancialmente idênticas” se duas sequências tiverem uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que sejam iguais (por exemplo, 60% de identidade, opcionalmente 70%, 71%.72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade sobre uma região específica ou, quando não especificado, em toda a sequência), quando comparado e alinhado para correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou região designada como medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Opcionalmente, a identidade existe em uma região que tem pelo menos cerca de 50 nucleotídeos (ou 10 aminoácidos) em comprimento, ou com mais preferência em uma região que é 100 a 500 ou 1.000 ou mais nucleotídeos (ou 20, 50, 200 ou mais aminoácidos) de comprimento.

[00111] O termo "polinucleotídeo", "ácido nucleico" ou "ácido nucleico recombinante" refere-se a polímeros de nucleotídeos, tais como ácido desoxirribonucleico (DNA) e, quando apropriado, ácido ribonucleico (RNA).

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[00112] Uma "proteína" ou "polipeptídeo", cujos termos são usados indistintamente aqui, compreende uma ou mais cadeias de blocos de construção químicos chamados aminoácidos que estão ligados entre si por ligações químicas chamadas ligações peptídicas para formar um polímero de aminoácidos.

[00113] "Refratário", como aqui utilizado, refere-se a uma doença, por exemplo, câncer, que não responde a um tratamento. Em modalidades, um câncer refratário pode ser resistente a um tratamento antes ou no início do tratamento. Em outras modalidades, o câncer refratário pode se tornar resistente durante um tratamento. Um câncer refratário também é chamado de câncer resistente.

[00114] "Recaída", conforme usado neste documento, refere-se ao retorno de uma doença (por exemplo, câncer) ou aos sinais e sintomas de uma doença, como câncer após um período de melhora, por exemplo, após o tratamento anterior de uma terapia, por exemplo, câncer terapia

[00115] Intervalos: ao longo desta divulgação, vários aspectos da invenção podem ser apresentados em um formato de intervalo. Deve ser entendido que a descrição em formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção.

[00116] O termo "vetor de retrovírus" ou "vetor retroviral" refere-se a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de retrovírus. Exemplos de retrovirus incluem vector de MSCVneo, MSCV-pac (ou MSCV- puro), MSCV-higro como disponível a partir de Addgene ou Clontech. Outro exemplo de um vetor de retrovírus é MSCV-Bgl2-AvrII-Bam-EcoR1-Xho- BstB1-Mlu-Sal-ClaI.I03 (SEQ ID NO: 131).

[00117] O termo "Transposon da Bela Adormecida" ou "Vetor de Transposon da Bela Adormecida" refere-se a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma do Transposon da Bela Adormecida. Um exemplo

47 / 308 de um vetor de transposão da bela adormecida é o pSBbi-Pur (SEQ ID NO: 133). Outros exemplos de Vetores Transposon da Bela Adormecida que codificam um SIR são fornecidos na SEQ ID NO: 134 e na SEQ ID NO: 135.

[00118] O termo " scFv " refere-se a uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia leve e pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia pesada, em que as regiões variáveis da cadeia leve e pesada estão ligados de forma contígua, por exemplo, por meio de um ligante sintético, por exemplo, um ligante polipeptídico curto e flexível, e capazes de serem expressos como um polipeptídeo de cadeia simples, e em que o scFv retém a especificidade do anticorpo intacto do qual é derivado. A menos que especificado, tal como aqui utilizado, um scFv pode ter as regiões variáveis vL e vH em qualquer ordem, por exemplo, em relação às extremidades N-terminal e C-terminal do polipeptídeo, o scFv pode compreender vL-linker-vH ou pode compreender vH-linker-vL. Nesta divulgação, um scFv também é descrito como vL-Gly-Ser-Linker-vH. Por exemplo, FMC63-vL-Gly-Ser-Linker-FMC63-vH refere-se a um scFv contendo os fragmentos vL e vH do anticorpo monoclonal FMC63 ligado por meio de um ligante que consiste em resíduos Gly e Ser. Alternativamente, um scFv também é descrito como (vL + vH). Por exemplo, FMC6- (vL + vH) refere-se a um scFv contendo os fragmentos vL e vH do anticorpo FMC63 ligados por meio de um ligante no qual o fragmento vL está localizado no N- terminal.

[00119] O termo "domínio de sinalização" refere-se à região funcional de uma proteína que transmite informações dentro da célula para regular a atividade celular através de vias de sinalização definidas, gerando segundos mensageiros ou funcionando como efetores respondendo a tais mensageiros.

[00120] O termo "receptor imunológico sintético" ou, alternativamente, um "SIR" refere-se a um polipeptídeo, tipicamente dois polipeptídeos (por

48 / 308 exemplo, um hetero ou homo-dímero) em algumas modalidades, que quando expresso em uma célula efetora, fornece a célula com especificidade para uma célula alvo, normalmente uma célula cancerosa, e com geração de sinal intracelular.

SIR foram descritos em PCT / US17 / 64379. Em uma modalidade típica, um SIR compreende um ou mais domínios de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, um ligante ou um receptor) que se ligam a antígenos ou ligante cognato como aqui descrito, e são unidos a um ou mais receptores de células T cadeias constantes ou regiões por meio de um ligante opcional.

Em algumas modalidades, o conjunto de polipeptídeos é contíguo entre si.

Em algumas modalidades, um SIR compreende dois ou mais conjuntos de dois ou mais polipeptídeos.

Os polipeptídeos de cada conjunto de SIR são contíguos entre si (unidade polipeptídica funcional 1), mas não são contíguos com os polipeptídeos do outro conjunto (unidade polipeptídica funcional 2). Em alguns aspectos, as cadeias constantes do receptor de células T (ou regiões) do SIR são escolhidas a partir da cadeia constante do receptor alfa de células T humanas (TCR-alfa ou TCRα ou TCRa ou hTCR-alfa ou hTCRα ou hTCRa ou Cα), receptor beta1 de células T humanas (TCR-beta1 ou TCRβ1 ou TCRb1 ou hTCR-beta1 ou hTCRβ1 ou hTCRb1 ou Cβ1), receptor beta 2 de células T humanas (TCR-beta2 ou TCRβ2 ou TCRb2 ou hTCR-beta2 ou hTCRβ2 ou hTCRb2 ou Cβ2 também designado TCR-beta, TCRβ ou TCRb ou Cβ), receptor alfa de células pré-T humanas ((preTCR-alfa ou preTCRα ou preTCRa ou preCα), receptor gama de células T humanas (TCR-gama ou TCRγ ou TCRg ou ou hTCR-gama ou hTCRγ ou hTCRg ou hTCRγ1 ou hTCRgamma1 ou Cγ), ou receptor delta de células T humanas (TCR-delta ou TCRd ou TCRδ ou hTCR-delta ou hTCRd ou hTCRδ ou Cδ). Em algumas modalidades, a constante de TCR cadeias de SIR são codificadas por suas sequências de nucleotídeos de tipo selvagem, enquanto em outros aspectos as cadeias constantes de TCR de SIR são codificadas pelas sequências de nucleotídeos que não são de tipo selvagem.

Em algumas modalidades, As

49 / 308 cadeias constantes de TCR de SIR são codificadas por suas sequências otimizadas por códons.

Em algumas modalidades, as cadeias constantes de TCR de SIR codificam para as sequências polipeptídicas de tipo selvagem, enquanto em outras modalidades as cadeias constantes de TCR de SIR codificam para polipeptídeos que carregam uma ou mais mutações.

Em algumas modalidades, as cadeias constantes de TCR de SIR são codificadas por suas sequências otimizadas de códons que carregam uma ou mais mutações.

Um SIR que compreende um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um scFv ou vHH) que tem como alvo um antígeno tumoral específico "X", tal como aqueles descritos neste documento, também é referido como X-SIR ou XSIR.

Por exemplo, um SIR que compreende um domínio de ligação ao antígeno que tem como alvo CD19 é referido como CD19-SIR ou CD19SIR.

O domínio / cadeia constante de TCR de um SIR pode ser derivado da mesma espécie em que o SIR será usado.

Por exemplo, para uso em humanos, pode ser benéfico para a cadeia constante de TCR do SIR ser derivada de ou composta por cadeias constantes de TCR humana.

No entanto, em alguns casos, é benéfico para a cadeia constante de TCR ser derivada da mesma espécie em que o SIR será finalmente usado, mas modificado para transportar substituições de aminoácidos que aumentam a expressão das cadeias constantes de TCR.

Por exemplo, para uso em humanos, pode ser benéfico para a cadeia constante de TCR do SIR ser derivada de ou composta por cadeias constantes de TCR humano, mas em que certos aminoácidos são substituídos pelos aminoácidos correspondentes das cadeias constantes de TCR murino.

Essas cadeias constantes de TCR "murinizadas" fornecem expressão aumentada do SIR.

As sequências de ácido nucleico de cadeias constantes de TCR exemplares são fornecidas em SEQ ID NO: 39-64 (Tabela 5). As sequências de aminoácidos de cadeias constantes de TCR exemplares são fornecidas na SEQ ID NO: 4038- 4063 (Tabela 5). O SIR ou porção funcional do mesmo pode incluir aminoácidos adicionais no terminal amino ou carboxi, ou em ambos os

50 / 308 terminais, aminoácidos adicionais que não são encontrados na sequência de aminoácidos do TCR ou domínio de ligação ao antígeno que constitui o SIR. Desejavelmente, os aminoácidos adicionais não interferem com a função biológica do SIR ou porção funcional, por exemplo, reconhecer células alvo, detectar câncer, tratar ou prevenir câncer, etc. Mais desejavelmente, os aminoácidos adicionais aumentam a atividade biológica, em comparação à atividade biológica do SIR pai.

[00121] O termo "estimulação" refere-se a uma resposta primária induzida pela ligação de uma molécula estimuladora (por exemplo, um complexo TCR / CD3 ou SIR) com seu ligante cognato (ou antígeno alvo no caso de um SIR) mediando assim um evento de transdução de sinal, como, mas não limitado a, transdução de sinal por meio do TCR / CD3. A estimulação pode mediar a expressão alterada de certas moléculas.

[00122] O termo " proteínas de fusão do receptor de TCR ou TFP " refere-se a uma plataforma de CAR de próxima geração, conforme descrito em WO 2016/187349 A1, que é aqui incorporado por referência. Em uma modalidade, um TFP compreende uma fração de anticorpo que se liga especificamente a um antígeno alvo fundido a uma cadeia de TCR, como CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα ou TCRβ. Cadeias de TCR exemplares que podem ser usadas na construção de TFP são fornecidas em WO 2017/070608 A1, que é aqui incorporado por referência. Uma TFP incorporando cadeia CD3ε é referida como CD3ε TFP. Uma TFP que incorpora a cadeia CD3γ é referida como uma TFP CD3γ. Uma TFP que incorpora a cadeia CD3δ é referida como uma TFP CD3δ. A TFP que incorpora as cadeias CD3ε, CD3γ ou CD3δ são denominadas coletivamente como TFP CD3ε/γ/δ. TFPs exemplares incorporando o domínio de ligação ao antígeno BCMA-Am06-HL direcionando BCMA descrito nesta divulgação e co-expressando um módulo acessório que codifica NEMO-K277A são fornecidos em SEQ ID NO: 4384- 4387 (Tabela 6). TFPs exemplificativas que incorporam diferente do domínio

51 / 308 de ligação ao antigénio s descritos na presente memória descritiva e que co- expressam um módulo acessório que codifica nemo-K277A são fornecidos na Tabela 7. Os SEQ ID Nos, domínios de ligação ao antígeno e antígenos alvo desses TFPs podem ser determinados por referência à Tabela 6, pois a ordem dos diferentes construtos (ou seja, classe CAR) listados na Tabela 7 é a mesma que a ordem dos construtos (ou seja, Classe CAR) listada na Tabela 6. A codificação do módulo acessório NEMO-K277A é opcional. O TFP com os domínios de ligação ao antígeno (ou seja, fragmentos vL e vH, ligantes e receptores, etc.) descritos nesta divulgação podem ser construídos sem NEMO- K277A. Como tal, este módulo acessório, juntamente com a sequência a montante Furine-SGSG-F2A, pode ser excluído dos TFPs representados por SEQ ID NO: 1900-3123. Alternativamente, o módulo acessório que codifica NEMO-K277A pode ser substituído por módulos acessórios que codificam outras proteínas de sinalização, como hNEMO-K277A-deltaV249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E ou IKK1-S176E-S180E e MyD88 –L265P, FKBPx2-NEMO, NEMO-L600-FKBPx2 e CMV-141 etc.

[00123] O termo "molécula estimuladora" refere-se a uma molécula expressa por uma célula imune (por exemplo, célula T, célula NK, célula B) que fornece a (s) sequência (s) de sinalização citoplasmática que regulam a ativação da célula imune em um estimulador caminho para pelo menos algum aspecto da via de sinalização de células imunes.

[00124] O termo "sujeito" se destina a incluir organismos vivos nos quais uma resposta imune pode ser induzida (por exemplo, quaisquer mamíferos domesticados ou um ser humano).

[00125] Os termos "célula T" e "linfócito T" são intercambiáveis e usados como sinônimos neste documento. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a células T virgens ("progenitores de linfócitos"), células T de memória central, células T de memória efetoras, células T de memória-tronco (Tscm), células T residentes em tecido, α / β T células, γ / δ T células, células

52 / 308 T derivadas de iPSC, células T sintéticas ou suas combinações.

[00126] O termo "efeito terapêutico" refere-se a um efeito biológico que pode ser manifestado por vários meios, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, diminuição no volume do tumor, uma diminuição no número de células cancerosas, uma diminuição nas contagens de colônias de o agente infeccioso, melhora de vários sintomas fisiológicos associados a uma condição de doença, prevenção da ocorrência de doença em primeiro lugar ou na prevenção de recaída da doença.

[00127] "Tratamento" e "tratando", conforme usados neste documento, referem-se tanto ao tratamento terapêutico quanto a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já têm a doença, bem como aqueles propensos a ter a doença ou aqueles nos quais a condição deve ser evitada.

[00128] O termo "zeta" (ou definido pelo símbolo grego "ζ") ou alternativamente "cadeia zeta", "CD3-zeta" ou "TCR-zeta" é definido como a proteína fornecida como GenBank No. de Acesso BAG36664. 1, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, macaco e semelhantes, e um "domínio estimulador zeta" ou, alternativamente, um "domínio estimulador CD3-zeta" ou um "estimulador TCR-zeta domínio "é definido como os resíduos de aminoácidos do domínio citoplasmático da cadeia zeta, ou seus derivados funcionais, que são suficientes para transmitir funcionalmente um sinal inicial necessário para a ativação das células T. Em um aspecto, o domínio citoplasmático de zeta compreende os resíduos 52 a 164 do Nº de Acesso GenBank BAG36664.1 ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, macaco e semelhantes, que são ortólogos funcionais dos mesmos. Em um aspecto, o "domínio estimulador zeta" ou um "domínio estimulador CD3- zeta" é a sequência fornecida como DNA SEQ ID NO: 101 e PRT SEQ ID NO:

4100.

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[00129] São fornecidas aqui composições que compreendem um CAR e um ou mais módulos acessórios opcionais e método de uso dos mesmos para tratar doenças, incluindo câncer. Conforme descrito neste documento, as combinações específicas de CARs (Tabela 1) e módulos acessórios, conforme descrito na Tabela 2, definem um "estrutura principal" (Tabela 2).

[00130] Tabela 1: arquiteturas CAR. CARs de primeira geração (CAR1 convencional ou CAR I) têm um domínio específico do antígeno (ASD), um domínio de sinalização intracelular (ISD) (por exemplo, CD3z) e nenhum domínio co-estimulador. As proteínas de fusão de TCR (TFP) são CARs de próxima geração que são descritos em WO 2016/187349 A1, mas se assemelham a CAR1 convencional por terem um domínio específico de antígeno (ASD) e um domínio de sinalização intracelular. CARs de segunda geração (CAR 2 convencional ou CAR II) têm um domínio específico do antígeno (ASD), um domínio coestimulador (por exemplo, 41BB ou CD28) e um domínio de sinalização intracelular (ISD) (por exemplo, CD3z). CARs de terceira geração (CAR 3 convencional ou CAR III) têm um domínio específico do antígeno (ASD), dois domínios co-estimuladores (por exemplo, 41BB e CD28) e um domínio de sinalização intracelular (ISD) (por exemplo, CD3z). AbTCRs são receptores de cadeia dupla e foram descritos em PCT / US2016 /

058305. Os cTCRs são receptores de cadeia simples, uma e meia ou de cadeia dupla que consistem em um domínio de ligação ao antígeno derivado de um fragmento vL e vH que são fundidos a uma cadeia constante de TCR e resultam na ativação da sinalização de células T. Receptores imunes sintéticos são cTCR de próxima geração e são descritos em US 62 / 429,597 e PCT / US017 /

064379. Os SIRs podem ser receptores de cadeia simples, uma e meia ou dupla, consistindo em um ou mais domínios de ligação ao antígeno que são fundidos a uma ou mais cadeias constantes de TCR e resultam na ativação da sinalização de células T após a ligação ao ligante. zSIRs são descritos neste aplicativo.

[00131] Os zSIRs são uma nova plataforma de receptores imunes

54 / 308 sintéticos (SIRs) contendo duas cadeias CD3-zeta (CD3z). As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos das cadeias de CD3z que podem ser usadas na construção de zSIR são fornecidas nas SEQ ID Nos: 67 e 71 e PRT SEQ ID Nos: 4066 e 4072. A divulgação fornece que o fragmento vL de um o anticorpo pode ser unido a uma das duas cadeias CD3z e o fragmento vH pode ser unido à outra cadeia CD3z. Quando as duas dessas cadeias (por exemplo, vL-CD3z e vH-CD3z) são coexpressas na mesma célula, os fragmentos vL e vH podem se associar, reconhecer seu antígeno cognato ou parceiro de ligação e transmitir um sinal de célula T. Em particular, as células T que expressam tal zSIR quando expostas a uma linha celular que expressa o antígeno alvo podem ativar a sinalização de NFAT, induzir a produção de IL2 e exercer citotoxicidade. A expressão e a atividade do zSIR podem ser ainda aumentadas pela incorporação de um ligante entre os fragmentos vL / vH e CD3z. Em particular, os domínios IgCL e IgCH derivados de anticorpos servem como ligantes úteis entre os fragmentos vL / vH e CD3z. Ligantes exemplares que podem ser usados na construção de zSIRs são fornecidos em SEQ ID NOs: 4004 a 4037 (Tabela 5). Fornecidos na Figura 1 são exemplos esquemáticos de zSIRs contemplados pela divulgação.

[00132] Por exemplo, zSIR1, o fragmento vL de um scFV é unido a um CD3z-ECD-TM-CP (domínio extracelular, transmembranar e citoplasmático) e o fragmento vH unido a um segundo CD3zECDTMCP. Um exemplo de zSIR1 é fornecido na SEQ ID NO: 425. No zSIR2, um ASD (por exemplo, fragmento scFV) é unido a um CD3zECDTMCP (domínio extracelular, transmembranar e citoplasmático) e o segundo ASD é unido a um segundo CD3zECDTMCP. Um exemplo de zIR2 é fornecido na SEQ ID NO: 3961. Os dois ASD podem ter como alvo o mesmo antígeno ou antígenos diferentes ou epítopos diferentes do mesmo antígeno. Um zSIR2 exemplar no qual os dois ASD visam dois antígenos diferentes é fornecido na SEQ ID NO: 3962. Um zSIR2 exemplar no qual os dois ASD visam dois epítopos dos mesmos

55 / 308 antígenos é fornecido na SEQ ID NO: 3961. No zSIR3, o vL fragmento de um scFV é unido a um CD3zECDTMCP (domínio extracelular, transmembranar e citoplasmático) através do ligante cL (SEQ ID NOs: 28 e 4027) derivado de uma imunoglobulina e o fragmento vH unido a um segundo CD3zECDTMCP através de um ligante CH1 (SEQ ID NOs: 29 e 4028). Um exemplo de zSIR3 é CD8-hCD19-EUK5-13-vL-IgCL-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe- SP-Bst-hCD19-EUK5-13-vH-IgG1-CH1-KPN-CD3zECDTMCP-opt2- F- F2A-Xba-PAC (SEQ ID NO: 3955). Outros linkers que podem ser usados na construção de um zSIR estão listados na Tabela 5.

[00133] Em outra modalidade, um domínio coestimulatório também é incorporado na (s) cadeia (s) CD3z de um zSIR. Domínios coestimulatório exemplares incluem domínios coestimulatório de 41BB (SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 4068) e CD28 (SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO; 4067). Cadeias de CD3z contendo 41BB (BB) (ver, esquemático "C", acima) e CD28 (ver, esquemático "D", acima) domínios coestimulatório são apresentados em SEQ ID NO (DNA): 76-79 e SEQ ID NO:(PRT): 4075-4078. Um exemplo de zSIR com CD3z contendo domínios coestimulatório de CD28 é apresentado por CD8SP- BCMA-Am06-HL-vL-[CD3zECDTM-28z-opt]-F-P2A-SP-BCMA-Am06- HL-vH- [CD3zECDTM-28z-opt2] (SEQ ID NO (DNA): 3971 e (SEQ ID NO (PRT): 7971). Um zSIR exemplar com CD3z contendo domínios coestimulatório 41BB é apresentado por CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL- [CD3zECDTM-BBz-opt]-F-P2A-SP-BCMA-Am06-HL-vH-[CD3zECDTM- BBz-opt2] (SEQ ID NO (DNA): 3972 e (SEQ ID NO (PRT): 7972). zSIRs 4-9 se assemelham a zSIRs 1-3, exceto a substituição de CD3zECDTMCP com CD3zECDTM-BBz ou com domínios CD3zECDTM-28z. Tabela 1 Tabela 1 CARs exemplars CAR 1 CAR 1 ou ASD RH TMD ISD

CAR I (incluindo TFP) CAR 2 SAC 2 (CAR ASD RH TMD CSD ISD

56 / 308 II) CAR 3 SAC 3 (CAR ASD RH TMD CSD- CSD-II ISD III) I CAR 4 AbTCR vL-cL TCRD (1) 2A vH- TCRD (II) CH1 CAR 5 Cadeia dupla vL TCR-C (1) 2A vH TCR-C (II) cTCR / SIR CAR 6 Uma e meia TCR-C (1) 2A ASD TCR-C (II) cadeia cTCR /

SIR CAR 7 zSIR 1 vL CD3zECDTMCP 2A vH CD3zECDTMCP CAR 8 zSIR 2 ASD CD3zECDTMCP 2A ASD CD3zECDTMCP CAR 9 zSIR 3 vL-cL CD3zECDTMCP 2A vH- CD3zECDTMCP CH1 CAR 10 zSIR 4 vL CD3zECDTM- 2A vH CD3zECDTM- BBz BBz CAR 11 zSIR 5 vL CD3zECDTM- 2A vH CD3zECDTM- 28z 28z CAR 12 zSIR 6 ASD CD3zECDTM- 2A ASD CD3zECDTM- BBz BBz CAR 13 zSIR 7 ASD CD3zECDTM- 2A ASD CD3zECDTM- 28z 28z CAR 14 zSIR 8 vL-cL CD3zECDTM- 2A vH- CD3zECDTM- BBz CH1 BBz CAR 15 zSIR 9 vL-cL CD3zECDTM- 2A vH- CD3zECDTM- 28z CH1 28z Tabela 2: Estrutura exemplar Espinha dorsal Componente CAR Módulo Acessório

NOME SEQ ID SEQ ID (DNA) (PRT) Estrutura principal CAR I K13-vFLIP 108 4107 1 Estrutura principal CAR I FKBPX2-K13 113 4112 2 Estrutura principal CAR I tBCMA 97 4096 3 Estrutura principal CAR I HIV-1 Vif 118 4117 4 Estrutura principal CAR II K13-vFLIP 108 4107 5 Estrutura principal CAR II FKBPX2-K13 113 4112 6 Estrutura principal CAR II tBCMA 97 4096 7 Estrutura principal CAR II HIV-1 Vif 118 4117 8 Estrutura principal CAR III K13-vFLIP 108 4107 9 Estrutura principal CAR III FKBPX2-K13 113 4112 10 Estrutura principal CAR III tBCMA 97 4096 11 Estrutura principal CAR III HIV-1 Vif 118 4117 12 Estrutura principal AbTCR K13-vFLIP 108 4107 13

57 / 308 Estrutura principal AbTCR FKBPX2-K13 113 4112 14 Estrutura principal AbTCR tBCMA 97 4096 15 Estrutura principal AbTCR HIV-1 Vif 118 4117 16 Estrutura principal DC- cTCR / SIR K13-vFLIP 108 4107 17 Estrutura principal DC- cTCR / SIR FKBPX2-K13 113 4112 18 Estrutura principal DC- cTCR / SIR tBCMA 97 4096 19 Estrutura principal DC- cTCR / SIR HIV-1 Vif 118 4117 20 Estrutura principal OHC- cTCR / SIR K13-vFLIP 108 4107 21 Estrutura principal OHC- cTCR / SIR FKBPX2-K13 113 4112 22 Estrutura principal OHC- cTCR / SIR tBCMA 97 4096 23 Estrutura principal OHC- cTCR / SIR HIV-1 Vif 118 4117 24 Estrutura principal zSIR1 K13-vFLIP 108 4107 25 Estrutura principal zSIR1 FKBPX2-K13 113 4112 26 Estrutura principal zSIR1 tBCMA 97 4096 27 Estrutura principal zSIR1 HIV-1 Vif 118 4117 28 Estrutura principal zSIR2 K13-vFLIP 108 4107 29 Estrutura principal zSIR2 FKBPX2-K13 113 4112 30 Estrutura principal zSIR2 tBCMA 97 4096 31 Estrutura principal zSIR2 HIV-1 Vif 118 4117 32 Estrutura principal zSIR3 K13-vFLIP 108 4107 33 Estrutura principal zSIR3 FKBPX2-K13 113 4112 34 Estrutura principal zSIR3 tBCMA 97 4096 35 Estrutura principal zSIR3 HIV-1 Vif 118 4117 36 Estrutura principal zSIR4 K13-vFLIP 108 4107 37 Estrutura principal zSIR4 FKBPX2-K13 113 4112 38 Estrutura principal zSIR4 tBCMA 97 4096 39 Estrutura principal zSIR4 HIV-1 Vif 118 4117 40 Estrutura principal zSIR5 K13-vFLIP 108 4107 41 Estrutura principal zSIR5 FKBPX2-K13 113 4112 42 Estrutura principal zSIR5 tBCMA 97 4096 43

58 / 308 Estrutura principal zSIR5 HIV-1 Vif 118 4117 44 Estrutura principal zSIR6 K13-vFLIP 108 4107 45 Estrutura principal zSIR6 FKBPX2-K13 113 4112 46 Estrutura principal zSIR6 tBCMA 97 4096 47 Estrutura principal zSIR6 HIV-1 Vif 118 4117 48 Estrutura principal zSIR7 K13-vFLIP 108 4107 49 Estrutura principal zSIR7 FKBPX2-K13 113 4112 50 Estrutura principal zSIR7 tBCMA 97 4096 51 Estrutura principal zSIR7 HIV-1 Vif 118 4117 52 Estrutura principal zSIR8 K13-vFLIP 108 4107 53 Estrutura principal zSIR8 FKBPX2-K13 113 4112 54 Estrutura principal zSIR8 tBCMA 97 4096 55 Estrutura principal zSIR8 HIV-1 Vif 118 4117 56 Estrutura principal zSIR9 K13-vFLIP 108 4107 57 Estrutura principal zSIR9 FKBPX2-K13 113 4112 58 Estrutura principal zSIR9 tBCMA 97 4096 59 Estrutura principal zSIR9 HIV-1 Vif 118 4117 60

TABELA 3: Listagem de sequências de fragmentos vL, vH e scFv direcionados a diferentes antígenos que são usados na construção de CARs vL vH scFv Antígeno Domínio de DNA PRT DNA PRT DNA PRT Alvo ligação ao SEQ SEQ SEQ ID SEQ SEQ ID SEQ ID antígeno ID ID ID BCMA BCMA-Am14-HL 155 4118 229 4192 303 4266 BCMA BCMA-Am08-HL 156 4119 230 4193 304 4267 BCMA BCMA-Am06-HL 157 4120 231 4194 305 4268 CD19 hu-CAT18-1-HL 158 4121 232 4195 306 4269 CD19 CAT17-HL 159 4122 233 4196 307 4270 CD22 hu-HA22-1 160 4123 234 4197 308 4271 CD19 CD19-DART1 161 4124 235 4198 309 4272 CD20 hu-Ubli-1-v4 162 4125 236 4199 310 4273 Integrin B7 Hu-IntB7- 163 4126 237 4200 311 4274 MMG49 BCMA BCMA-BB- 164 4127 238 4201 312 4275 CAR02 Her2 Her2-169 165 4128 239 4202 313 4276 Her2 Her2-XMT-1520 166 4129 240 4203 314 4277

59 / 308 vL vH scFv Antígeno Domínio de DNA PRT DNA PRT DNA PRT Alvo ligação ao SEQ SEQ SEQ ID SEQ SEQ ID SEQ ID antígeno ID ID ID Her2 Her2-XMT-1518 167 4130 241 4204 315 4278 Her2 Her2-huMab4D5- 168 4131 242 4205 316 4279 D98W TSHR TSHR-hu-3BD10 169 4132 243 4206 317 4280 PSMA PSMA-83A12- 170 4133 244 4207 318 4281 HL-AM PSMA PSMA-76-HL- 171 4134 245 4208 319 4282

AM PSMA hu106mPSMA-4- 172 4135 246 4209 320 4283

HL MSLN MSLN-3-HL-AM 173 4136 247 4210 321 4284 MSLN MSLN-5-HL 174 4137 248 4211 322 4285 EGFRviii EGFRviii-2-AM- 175 4138 249 4212 323 4286

HL EGFRviii EGFRviii- 176 4139 250 4213 324 4287 H2M1863N2-HL EGFRviii EGFRviii- 177 4140 251 4214 325 4288 H2M1915N-HL EGFRviii EGFRviii-131-2 178 4141 252 4215 326 4289 DLL3 DLL3-AM6-HL 179 4142 253 4216 327 4290 DLL3 DLL3-AM14-HL 180 4143 254 4217 328 4291 Nectin4 Nectin4-66-HL 181 4144 255 4218 329 4292 MSLN MSLN-237-HL 182 4145 256 4219 330 4293 MSLN MSLN-HuAM15 183 4146 257 4220 331 4294 MSLN MSLN76923-HL 184 4147 258 4221 332 4295 Receptor de PRLR-CN 185 4148 259 4222 333 4296 Prolactina Muc17 Muc17-11-CN 186 4149 260 4223 334 4297 CD19 CD19-AM1 187 4150 261 4224 335 4298 CD19 CD19-9B7 188 4151 262 4225 336 4299 CD20 CD20-HL 189 4152 263 4226 337 4300 CD70 CD70-HL-AM13 190 4153 264 4227 338 4301 CDH19 CDH19-USC1- 191 4154 265 4228 339 4302 HLv4 CDH19 CDH19-USC2- 192 4155 266 4229 340 4303

HL CD16ORF54 C16ORF54- 193 4156 267 4230 341 4304 USC1-v4 VISTA huVISTA-USC1- 194 4157 268 4231 342 4305 v4 VISTA huVISTA-JJ- 195 4158 269 4232 343 4306 USC2-v4 GPC3 GPC3-USC1-HL- 196 4159 270 4233 344 4307 V4 GPC3 GPC3-USC2-HL- 197 4160 271 4234 345 4308 V4 PRLR PRLR-USC2-HL- 198 4161 272 4235 346 4309 V4 Muc5Ac Muc5Ac-USC1- 199 4162 273 4236 347 4310

60 / 308 vL vH scFv Antígeno Domínio de DNA PRT DNA PRT DNA PRT Alvo ligação ao SEQ SEQ SEQ ID SEQ SEQ ID SEQ ID antígeno ID ID ID HL-V4 FCRH5 FCRH5-USC1- 200 4163 274 4237 348 4311 HL-V4 LYPD1 LYPD1-HL-V4 201 4164 275 4238 349 4312 EMR2 EMR2-USC1-V4 202 4165 276 4239 350 4313 EMR2 EMR2-USC2-V4 203 4166 277 4240 351 4314 EMR2 mEMR2-USC3- 204 4167 278 4241 352 4315 V4 gpNMB m-gPNMB- 205 4168 279 4242 353 4316 USC1-HL-v4 RNF43 RNF43-USC1- 206 4169 280 4243 354 4317 HL4 RNF43 RNF43-USC2- 207 4170 281 4244 355 4318 HL4 CD44v6 CD44v6-USC1- 208 4171 282 4245 356 4319 HL4 Robo4 Robo4-USC1 209 4172 283 4246 357 4320 CEA CEA-USC1-HL4 210 4173 284 4247 358 4321 Her3 Her3-USC1-HL4 211 4174 285 4248 359 4322 FOLR1 FOLR1-USC1- 212 4175 286 4249 360 4323 HL4 FOLR1 FOLR1-USC2- 213 4176 287 4250 361 4324 HL4 CLDN6 CLDN6-USC1- 214 4177 288 4251 362 4325 LH4 CLDN6 CLDN6-USC2- 215 4178 289 4252 363 4326 LH4 MMP16 hMMP16-USC-1- 216 4179 290 4253 364 4327 LH4 UPK1B hUPK1B-USC1- 217 4180 291 4254 365 4328 LH4 UPK1B hUPK1B-USC2- 218 4181 292 4255 366 4329 LH4 BMPR1B hBMPR1B- 219 4182 293 4256 367 4330 USC1-LH4 BMPR1B hBMPR1B- 220 4183 294 4257 368 4331 USC2-LH4 Ly6E Ly6E-USC1-HL4 221 4184 295 4258 369 4332 STEAP1 STEAP1-USC1- 222 4185 296 4259 370 4333 HL4 CD79b CD79b-USC1- 223 4186 297 4260 371 4334 LH4 WISP1 hu-UISP1-USC1- 224 4187 298 4261 372 4335 LH4 WISP1 hu-UISP1-USC2- 225 4188 299 4262 373 4336 LH4 SLC34A2 huMX35-LH4 226 4189 300 4263 374 4337 CD19 hu-CD19-USC1- 227 4190 301 4264 375 4338 LH4 CD22 CD22-HA22 8000 9631 8031 9662 8062 9693 STEAP1 STEAP1-hu120 8001 9632 8032 9663 8063 9694 Liv1 hLiv1-mAb2 8002 9633 8033 9664 8064 9695

61 / 308 vL vH scFv Antígeno Domínio de DNA PRT DNA PRT DNA PRT Alvo ligação ao SEQ SEQ SEQ ID SEQ SEQ ID SEQ ID antígeno ID ID ID Nectin4 hu-Nectin4-mAb1 8003 9634 8034 9665 8065 9696 Cripto hu-Cripto-L1H2 8004 9635 8035 9666 8066 9697 gpA33 hu-gpA33 8005 9636 8036 9667 8067 9698 ROR1 ROR1-DART4 8006 9637 8037 9668 8068 9699 BCMA BCMA-FS 8007 9638 8038 9669 8069 9700 BCMA BCMA-PC 8008 9639 8039 9670 8070 9701 BCMA BCMA-AJ 8009 9640 8040 9671 8071 9702 BCMA BCMA-NM 8010 9641 8041 9672 8072 9703 BCMA BCMA-TS 8011 9642 8042 9673 8073 9704 BCMA BCMA-PP 8012 9643 8043 9674 8074 9705 BCMA BCMA-RD 8013 9644 8044 9675 8075 9706 BCMA BCMA-BB- 8014 9645 8045 9676 8076 9707 CAR02 CLL1 CLL1-24C8 8015 9646 8046 9677 8077 9708 CLL1 CLL1-24C1 8016 9647 8047 9678 8078 9709 FLT3 FLT3-10E3 8017 9648 8048 9679 8079 9710 FLT3 FLT3-8B5 8018 9649 8049 9680 8080 9711 IL1RAP IL1RAP-IAPB57 8019 9650 8050 9681 8081 9712 IL1RAP IL1RAP-IAPB63 8020 9651 8051 9682 8082 9713 IL1RAP hu-IL1RAP- 8021 9652 8052 9683 8083 9714 CANO4 MSLN MSLN-7D9-v3 8022 9653 8053 9684 8084 9715 MSLN MSLN-hu22A10 8023 9654 8054 9685 8085 9716 CD19 hu-Bu13 8024 9655 8055 9686 8086 9717 BST1 hu-BST1-A1 8025 9656 8056 9687 8087 9718 BST1 hu-BST1-A2 8026 9657 8057 9688 8088 9719 BST1 hu-BST1-A3 8027 9658 8058 9689 8089 9720 Her2 Her2-XMT-1519 8028 9659 8059 9690 8090 9721 Her2 Her2-XMT-1517 8029 9660 8060 9691 8091 9722 CD133 CD133-RW03 11300 11460 11304 11464 11308 11468 CD133 CD133- 11301 11461 11305 11465 11309 11469 W6B3H10 CD133 CD133- 11302 11462 11306 11466 11310 11470 293AC1C3B9 IL113Ra2 hu-IL13Ra2- 12642 14386 12673 14417 12704 14448 mAb47 CD22 CD22-INO 12643 14387 12674 14418 12705 14449 CD22 CD22-CELL4 12644 14388 12675 14419 12706 14450 CD22 CD22-CELL13 12645 14389 12676 14420 12707 14451 CD22 CD22-CELL7 12646 14390 12677 14421 12708 14452 CD22 CD22-VM1011 12647 14391 12678 14422 12709 14453 CD22 CD22-RAB-4120 12648 14392 12679 14423 12710 14454 CD22 CD22-Med-12C5- 12649 14393 12680 14424 12711 14455

HL CD22 CD22-Med-19A3 12650 14394 12681 14425 12712 14456

62 / 308 vL vH scFv Antígeno Domínio de DNA PRT DNA PRT DNA PRT Alvo ligação ao SEQ SEQ SEQ ID SEQ SEQ ID SEQ ID antígeno ID ID ID CD22 CD22-Med-16F7 12651 14395 12682 14426 12713 14457 CD22 hu-RFB4 12652 14396 12683 14427 12714 14458 BCMA BCMA-mJ22-9 12653 14397 12684 14428 12715 14459 BCMA BCMA-huJ22-10 12654 14398 12685 14429 12716 14460 CD22 CD22-hu-HA22-2 12655 14399 12686 14430 12717 14461 CD19 huCD19-USC3 12656 14400 12687 14431 12718 14462 CD22 BCMA-hu72 12657 14401 12688 14432 12719 14463 MPL hu-161-3 12658 14402 12689 14433 12720 14464 BAFF-R hu-BAFFR- 12659 14403 12690 14434 12721 14465 USC90 BAFF-R hu-BAFFR- 12660 14404 12691 14435 12722 14466 USC55 BAFF-R hu-BAFFR- 12661 14405 12692 14436 12723 14467 MOR6654 CD19 CD19-hu- 12662 14406 12693 14437 12724 14468 mROO5-1 CD22 CD22-h10F4v2 12663 14407 12694 14438 12725 14469 CD22 CD22-HA22 12664 14408 12695 14439 12726 14470 MPL hu-161-2 12665 14409 12696 14440 12727 14471 MSLN MSLN-hu22A10 12666 14410 12697 14441 12728 14472 MSLN MSLN-7D9-HL 12667 14411 12698 14442 12729 14473 MSLN MSLN-5 12668 14412 12699 14443 12730 14474 BCMA BCMA-huC13- 12669 14413 12700 14444 12731 14475 F12 BCMA BCMA-huC12A3- 12670 14414 12701 14445 12732 14476 L3H3 BCMA BCMA-J6M0 12671 14415 12702 14446 12733 14477 TABELA 4: LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DE VÁRIOS CDRs de REGIÕES vL e vH PERTENCENTES A DIFERENTES ANTÍGENOS COM

LIGAÇÃO DE DOMÍNIOS COM DESTINOS Antígeno Domínio de ligação ao vL- vL- vL- vH- vH- vH- Alvo antígeno CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 BCMA BCMA-Am14-HL 11961 12068 12175 12282 12389 12497 BCMA BCMA-Am08-HL 11962 12069 12176 12283 12390 12498 BCMA BCMA-Am06-HL 11963 12070 12177 12284 12391 12499 CD19 hu-CAT18-1-HL 11964 12071 12178 12285 12392 12.500 CD19 CAT17-HL 11965 12072 12179 12286 12393 12501 CD22 hu-HA22-1 11966 12073 12180 12287 12394 12502 CD19 CD19-DART1 11967 12074 12181 12288 12395 12503 CD20 hu-Ubli-1-v4 11968 12075 12182 12289 12396 12504 Integrin B7 Hu-IntB7-MMG49 11969 12076 12183 12290 12397 12505 BCMA BCMA-BB-CAR02 11970 12077 12184 12291 12398 12506 Her2 Her2-169 11971 12078 12185 12292 12399 12507 Her2 Her2-XMT-1520 11972 12079 12186 12293 12400 12508

63 / 308 Her2 Her2-XMT-1518 11973 12080 12187 12294 12401 12509 Her2 Her2-huMab4D5- 11974 12081 12188 12295 12402 12510 D98W TSHR TSHR-hu-3BD10 11975 12082 12189 12296 12403 12511 PSMA PSMA-83A12-HL-AM 11976 12083 12190 12297 12404 12512 PSMA PSMA-76-HL-AM 11977 12084 12191 12298 12405 12513 PSMA hu106mPSMA-4-HL 11978 12085 12192 12299 12406 12514 MSLN MSLN-3-HL-AM 11979 12086 12193 12300 12407 12515 MSLN MSLN-5-HL 11980 12087 12194 12301 12408 12516 EGFRviii EGFRviii-2-AM-HL 11981 12088 12195 12302 12409 12517 EGFRviii EGFRviii- 11982 12089 12196 12303 12410 12518 H2M1863N2-HL EGFRviii EGFRviii-H2M1915N- 11983 12090 12197 12304 12411 12519

HL EGFRviii EGFRviii-131-2 11984 12091 12198 12305 12412 12520 DLL3 DLL3-AM6-HL 11985 12092 12199 12306 12413 12521 DLL3 DLL3-AM14-HL 11986 12093 12200 12307 12414 12522 Nectin4 Nectin4-66-HL 11987 12094 12201 12308 12415 12523 MSLN MSLN-237-HL 11988 12095 12202 12309 12416 12524 MSLN MSLN-HuAM15 11989 12096 12203 12310 12417 12525 MSLN MSLN76923-HL 11990 12097 12204 12311 12418 12526 Receptor de PRLR-CN 11991 12098 12205 12312 12419 12527 Prolactina Muc17 Muc17-11-CN 11992 12099 12206 12313 12420 12528 CD19 CD19-AM1 11993 12100 12207 12314 12421 12529 CD19 CD19-9B7 11994 12101 12208 12315 12422 12530 CD20 CD20-HL 11995 12102 12209 12316 12423 12531 CD70 CD70-HL-AM13 11996 12103 12210 12317 12424 12532 CDH19 CDH19-USC1-HLv4 11997 12104 12211 12318 12425 12533 CDH19 CDH19-USC2-HL 11998 12105 12212 12319 12426 12534 CD16ORF54 C16ORF54-USC1-v4 11999 12106 12213 12320 12427 12535 VISTA huVISTA-USC1-v4 12.000 12107 12214 12321 12428 12536 VISTA huVISTA-JJ-USC2-v4 12001 12108 12215 12322 12429 12537 GPC3 GPC3-USC1-HL-V4 12002 12109 12216 12323 12430 12538 GPC3 GPC3-USC2-HL-V4 12003 12110 12217 12324 12431 12539 PRLR PRLR-USC2-HL-V4 12004 12111 12218 12325 12432 12540 Muc5Ac Muc5Ac-USC1-HL-V4 12005 12112 12219 12326 12433 12541 FCRH5 FCRH5-USC1-HL-V4 12006 12113 12220 12327 12434 12542 LYPD1 LYPD1-HL-V4 12007 12114 12221 12328 12435 12543 EMR2 EMR2-USC1-V4 12008 12115 12222 12329 12436 12544 EMR2 EMR2-USC2-V4 12009 12116 12223 12330 12437 12545 EMR2 mEMR2-USC3-V4 12010 12117 12224 12331 12438 12546 gpNMB m-gPNMB-USC1-HL- 12011 12118 12225 12332 12439 12547 v4 RNF43 RNF43-USC1-HL4 12012 12119 12226 12333 12440 12548 RNF43 RNF43-USC2-HL4 12013 12120 12227 12334 12441 12549 CD44v6 CD44v6-USC1-HL4 12014 12121 12228 12335 12442 12550 Robo4 Robo4-USC1 12015 12122 12229 12336 12443 12551

64 / 308 CEA CEA-USC1-HL4 12016 12123 12230 12337 12444 12552 Her3 Her3-USC1-HL4 12017 12124 12231 12338 12445 12553 FOLR1 FOLR1-USC1-HL4 12018 12125 12232 12339 12446 12554 FOLR1 FOLR1-USC2-HL4 12019 12126 12233 12340 12447 12555 CLDN6 CLDN6-USC1-LH4 12020 12127 12234 12341 12448 12556 CLDN6 CLDN6-USC2-LH4 12021 12128 12235 12342 12449 12557 MMP16 hMMP16-USC-1-LH4 12022 12129 12236 12343 12450 12558 UPK1B hUPK1B-USC1-LH4 12023 12130 12237 12344 12451 12559 UPK1B hUPK1B-USC2-LH4 12024 12131 12238 12345 12452 12560 BMPR1B hBMPR1B-USC1-LH4 12025 12132 12239 12346 12453 12561 BMPR1B hBMPR1B-USC2-LH4 12026 12133 12240 12347 12454 12562 Ly6E Ly6E-USC1-HL4 12027 12134 12241 12348 12455 12563 STEAP1 STEAP1-USC1-HL4 12028 12135 12242 12349 12456 12564 CD79b CD79b-USC1-LH4 12029 12136 12243 12350 12457 12565 WISP1 hu-UISP1-USC1-LH4 12030 12137 12244 12351 12458 12566 WISP1 hu-UISP1-USC2-LH4 12031 12138 12245 12352 12459 12567 SLC34A2 huMX35-LH4 12032 12139 12246 12353 12460 12568 CD19 hu-CD19-USC1-LH4 12033 12140 12247 12354 12461 12569 CD22 CD22-HA22 12034 12141 12248 12355 12462 12570 STEAP1 STEAP1-hu120 12035 12142 12249 12356 12463 12571 Liv1 hLiv1-mAb2 12036 12143 12250 12357 12464 12572 Nectin4 hu-Nectin4-mAb1 12037 12144 12251 12358 12465 12573 Cripto hu-Cripto-L1H2 12038 12145 12252 12359 12466 12574 gpA33 hu-gpA33 12039 12146 12253 12360 12467 12575 ROR1 ROR1-DART4 12040 12147 12254 12361 12468 12576 BCMA BCMA-FS 12041 12148 12255 12362 12469 12577 BCMA BCMA-PC 12042 12149 12256 12363 12470 12578 BCMA BCMA-AJ 12043 12150 12257 12364 12471 12579 BCMA BCMA-NM 12044 12151 12258 12365 12472 12580 BCMA BCMA-TS 12045 12152 12259 12366 12473 12581 BCMA BCMA-PP 12046 12153 12260 12367 12474 12582 BCMA BCMA-RD 12047 12154 12261 12368 12475 12583 BCMA BCMA-BB-CAR02 12048 12155 12262 12369 12476 12584 CLL1 CLL1-24C8 12049 12156 12263 12370 12477 12585 CLL1 CLL1-24C1 12050 12157 12264 12371 12478 12586 FLT3 FLT3-10E3 12051 12158 12265 12372 12479 12587 FLT3 FLT3-8B5 12052 12159 12266 12373 12480 12588 IL1RAP IL1RAP-IAPB57 12053 12160 12267 12374 12481 12589 IL1RAP IL1RAP-IAPB63 12054 12161 12268 12375 12482 12590 IL1RAP hu-IL1RAP-CANO4 12055 12162 12269 12376 12483 12591 MSLN MSLN-7D9-v3 12056 12163 12270 12377 12484 12592 MSLN MSLN-hu22A10 12057 12164 12271 12378 12485 12593 CD19 hu-Bu13 12058 12165 12272 12379 12486 12594 BST1 hu-BST1-A1 12059 12166 12273 12380 12487 12595 BST1 hu-BST1-A2 12060 12167 12274 12381 12488 12596 BST1 hu-BST1-A3 12061 12168 12275 12382 12489 12597

65 / 308 Her2 Her2-XMT-1519 12062 12169 12276 12383 12490 12598 Her2 Her2-XMT-1517 12063 12170 12277 12384 12491 12599 CD133 CD133-RW03 12064 12171 12278 12385 12492 12600 CD133 CD133-W6B3H10 12065 12172 12279 12386 12493 12601 CD133 CD133-293AC1C3B9 12066 12173 12280 12387 12494 12602 IL113Ra2 hu-IL13Ra2-mAb47 16126 16157 16188 16219 16250 16281 CD22 CD22-INO 16127 16158 16189 16220 16251 16282 CD22 CD22-CELL4 16128 16159 16190 16221 16252 16283 CD22 CD22-CELL13 16129 16160 16191 16222 16253 16284 CD22 CD22-CELL7 16130 16161 16192 16223 16254 16285 CD22 CD22-VM1011 16131 16162 16193 16224 16255 16286 CD22 CD22-RAB-4120 16132 16163 16194 16225 16256 16287 CD22 CD22-Med-12C5-HL 16133 16164 16195 16226 16257 16288 CD22 CD22-Med-19A3 16134 16165 16196 16227 16258 16289 CD22 CD22-Med-16F7 16135 16166 16197 16228 16259 16290 CD22 hu-RFB4 16136 16167 16198 16229 16260 16291 BCMA BCMA-mJ22-9 16137 16168 16199 16230 16261 16292 BCMA BCMA-huJ22-10 16138 16169 16200 16231 16262 16293 CD22 CD22-hu-HA22-2 16139 16170 16201 16232 16263 16294 CD19 huCD19-USC3 16140 16171 16202 16233 16264 16295 CD22 BCMA-hu72 16141 16172 16203 16234 16265 16296 MPL hu-161-3 16142 16173 16204 16235 16266 16297 BAFF-R hu-BAFFR-USC90 16143 16174 16205 16236 16267 16298 BAFF-R hu-BAFFR-USC55 16144 16175 16206 16237 16268 16299 BAFF-R hu-BAFFR-MOR6654 16145 16176 16207 16238 16269 16300 CD19 CD19-hu-mROO5-1 16146 16177 16208 16239 16270 16301 CD22 CD22-h10F4v2 16147 16178 16209 16240 16271 16302 CD22 CD22-HA22 16148 16179 16210 16241 16272 16303 MPL hu-161-2 16149 16180 16211 16242 16273 16304 MSLN MSLN-hu22A10 16150 16181 16212 16243 16274 16305 MSLN MSLN-7D9-HL 16151 16182 16213 16244 16275 16306 MSLN MSLN-5 16152 16183 16214 16245 16276 16307 BCMA BCMA-huC13-F12 16153 16184 16215 16246 16277 16308 BCMA BCMA-huC12A3- 16154 16185 16216 16247 16278 16309 L3H3 BCMA BCMA-J6M0 16155 16186 16217 16248 16279 16310 TABELA 5

COMPONENTE DO CAR DNA SEQ ID PRT SEQ ID CD8_ Peptídeo_Sinal 1 4000 CD8_Peptídeo_Sinal 2 4001 IgH_Peptídeo_Sinal 3 4002 IgH_Peptídeo_Sinal 4 4003 (GGGGS) x3_LINKER 5 4004 DDAKK_linker 6 4005 GGGSG-Streptagx2-Tag 7 4006

66 / 308 PG4SP-linker 8 4007 PG4SP-v2-linker 9 4008 E-coil-linker 10 4009 K-coil-linker 11 4010 EAAAK-linker 12 4011 EAAAK-v2-linker 13 4012 Myc - (P) -TAG 14 4013 Myc -TAG 15 4014 MYC-TAG 16 4015 MYC2-TAG 17 4016 MYC4-TAG 18 4017 V5-TAG 19 4018 HA-TAG 20 4019 HIS-TAG 21 4020 AVI-TAG-delta-GSG 22 4021 G4Sx2-TAG 23 4022 G4Sx2-TAG 24 4023 StrepTagII 25 4024 StrepTagII 26 4025 FLAG-TAG 27 4026 IgCL 28 4027 IgG1-CH1 29 4028 IgG2-0C-CHI 30 4029 IgG2-IC-CHI 31 4030 IgG3-CHI 32 4031 IgG4-CHI 33 4032 IgAI -CHI 34 4033 IgA2-CHI 35 4034 IgD -CHI 36 4035 IgE -CHI 37 4036 IgM-CHI 38 4037 hTCR-alpha-constant_X02883.1 39 4038 hTCRa -WT 40 4039 hTCRa -CSDVP 41 4040 hTCRa-opt2 42 4041 hTCRa-T48C-opt 43 4042 hTCRa-T48C-opt1 44 4043 hTCRa -SDVP 45 4044 hTCRa-S61R 46 4045 hTCRa -SDVPR 47 4046 hTCRaECD-CD3zECDTMCP-opt2 48 4047 hTCR-b1-constant-region_X00437.1 49 4048 hTCR-b2-constant region_L34740 50 4049 hTCRb -WT 51 4050 hTCRb-S57C-opt1 52 4051 hTCRb -KACIAH 53 4052

67 / 308 hTCRb-opt2 54 4053 hTCRb -KAIAH 55 4054 hTCRb-R79G 56 4055 hTCRbECD-CD3zECDTMCP-opt 57 4056 preTCRa_gb_U38996.1 58 4057 preTCRa 59 4058 preTCRa-del48 60 4059 hTCR-gamma_M27331.1 61 4060 hTCR -Gamma- Opt 62 4061 hTCR -Delta 63 4062 hTCR -Delta- Opt 64 4063 CD3zECDTM-opt 65 4064 CD3zCP-opt 66 4065 CD3zECDTMCP-opt 67 4066 CD28-CP-opt 68 4067 41BB-CP-opt 69 4068 CD3e-CP-opt 70 4069 CD3zECDTM-opt2 71 4070 CD3zCP-opt2 72 4071 CD3zECDTMCP-opt2 73 4072 CD28-CP-opt2 74 4073 41BB-CP-opt2 75 4074 CD3zECDTM-28z-opt 76 4075 CD3zECDTM-BBz-opt 77 4076 CD3zECDTM-28z-opt2 78 4077 CD3zECDTM-BBz-opt2 79 4078 F2A 80 4079 T2A 81 4080 T2A 82 4081 P2A 83 4082 Variante P2a 84 4083 E2A 85 4084 SGSG 86 4085 SGSG 87 4086 FURINE-CLEAVAGE-SITE 88 4087 FURINE-CLEAVAGE-SITE 89 4088 FURINE-CLEAVAGE-SITE 90 4089 PuroR_Variant - (PAC) 91 4090 BlastR 92 4091 CNB30 93 4092 GMCSF-SP- tEGFR 94 4093 tEGFRviii 95 4094 tCD19 96 4095 tBCMA 97 4096 hCD8-Hinge-TM 98 4097 hCD8-Hinge-TM-BBz 99 4098

68 / 308 hCD8TM-Hinge-BB 100 4099 Domínio citosólico de CD3z 101 4100 Domínio citosólico de CD3z 102 4101 CD28-Hinge-TM-domínio citosólico 103 4102 Myr-MYD88-CD40-Fv'-Fv 104 4103 IL12F 105 4104 41BB-L 106 4105 CD40L 107 4106 K13 108 4107 MC159 109 4108 cFLIP-L / MRIT-alpha 110 4109 cFLIP-p22 111 4110 FKBP-K13 112 4111 FKBPX2-K13 113 4112 HTLV1-TAX 114 4113 HTLV2-TAX 115 4114 HTLV2-TAX-RS 116 4115 icaspase-9 117 4116 HIV-1 Vif 118 4117

TABELA 6: LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DE classes de CAR diferente baseados no domínio de ligação ao antigénio BCMA-Am06-HL.

O tipo de CAR e o (s) módulo (s) acessório (s) também são mostrados.

CAR classes 16 e 17 representam uma cadeia de uma SIR de cadeia dupla e mostram atividade biológica apenas quando coexpressa com sua cadeia complementar (ou seja, CAR classes 18 e 19, respectivamente). As classes CAR 13-15 (SIR de cadeia simples) mostram apenas atividade fraca.

Classe SEQ ID SEQ ID NOME TIPO DE Módulo CAR (DNA) (PRT) CAR Acessório

CAR 377 4340 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-V5- SIR de PAC Classe [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA- corrente 1 Am06-HL-vH-Myc- [hTCRa-CSDVP] -F- dupla F2A-PAC CAR 378 4341 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-V5- SIR de PAC Classe [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA- corrente 2 Am06-HL-vH-Myc- [preTCRa-Del48] -F- dupla F2A-PAC CAR 379 4342 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A- SIR de PAC Classe CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-Gly-Ser- uma 3 Linker-BCMA-Am06-HL-vH-Myc- corrente e [hTCRa-CSDVP] -F-F2A- PAC meia

69 / 308 CAR 380 4343 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A- SIR de PAC Classe CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-Gly-Ser- uma 4 Linker-BCMA-Am06-HL-vH-Myc4- corrente e [preTCRa-Del48] -F-F2A- PAC meia CAR 381 4344 CD8SP-MYC- [hTCRa-T48C-opt1] -F- SIR de PAC Classe F2A-SP-BCMA-Am06-HL-vL-Gly-Ser- corrente 5 Linker-BCMA-Am06-HL-vH-V5- dupla [hTCRb-S57C-opt1] - F-P2A-PAC CAR 382 4345 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-V5- SIR de PAC Classe [hTCRb-S57C-opt] -F-P2A-SP-BCMA- corrente 6 Am06-HL-vH-Myc- [hTCRa-T48C-opt] - dupla F-F2A-PAC CAR 383 4346 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL- [hTCRb- SIR de PAC Classe opt2] -F-P2A-SP-BCMA-Am06-HL-vH- corrente 7 [hTCRa-opt2] -F-F2A-PAC dupla

CAR 384 4347 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL- [hTCRb- SIR de PAC Classe opt2] -F-P2A-SP-BCMA-Am06-HL-vH- corrente 8 Myc- [preTCRa-Del48] -F-F2A-PAC dupla

CAR 385 4348 CD8SP- [hTCRb-opt2] -F-P2A-CD8SP- SIR de PAC Classe BCMA-Am06-HL-vL-Gly-Ser-Linker- uma 9 BCMA-Am06-HL-vH-Myc4- [preTCRa- corrente e Del48] -F-F2A-PAC meia CAR 386 4349 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-V5- SIR de PAC Classe [hTCRg1-opt] -F-P2A-SP-BCMA-Am06- corrente 10 HL-vH-Myc- [hTCRd-opt] -F-F2A-PAC dupla

CAR 387 4350 CD8SP-V5- [hTCRg1-opt] -F-P2A- SIR de PAC Classe CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-Gly-Ser- uma 11 Linker-BCMA-Am06-HL-vH-Myc- corrente e [hTCRd-opt] -F-F2A- PAC meia CAR 388 4351 CD8SP-G4Sx2- [hTCRa-S61R-opt] -F- SIR de PAC Classe F2A-SP-BCMA-Am06-HL-vL-Gly-Ser- uma 12 Linker-BCMA-Am06-HL-vH-G4Sx2- corrente e [hTCRb-R79G-opt] - F-P2A-PAC meia CAR 389 4352 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-Gly-Ser- SIR de PAC Classe Linker-BCMA-Am06-HL-vH- [hTCRa- Cadeia 13 SDVP] -F-F2A-PAC Única

CAR 390 4353 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-Gly-Ser- SIR de PAC Classe Linker-BCMA-Am06-HL-vH- [hTCRb- Cadeia 14 KAIAH] -F-P2A-PAC Única

CAR 391 4354 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-Gly-Ser- SIR de PAC Classe Linker-BCMA-Am06-HL-vH-Myc4- Cadeia 15 [preTCRa-Del48] -F-F2A-PAC Única

CAR 392 4355 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-V5- Uma PAC Classe [hTCRb-S57C-opt] -F-P2A-PAC corrente 16 de um SIR de corrente dupla CAR 393 4356 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-V5- Uma Classe [hTCRb-S57C-opt] corrente 17 de um SIR de corrente dupla

70 / 308 CAR 394 4357 IgHSP-BCMA-Am06-HL-vH-Myc- Uma Classe [hTCRa-T48C-opt] -F-F2A-BlastR corrente 18 de um SIR de corrente dupla CAR 395 4358 IgHSP-BCMA-Am06-HL-vH-Myc- Uma Classe [hTCRa-T48C-opt] corrente 19 de um SIR de corrente dupla CAR 396 4359 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-Gly-Ser- CAR II Classe Linker-BCMA-Am06-HL-vH-Myc- 20 CD8TM-BBz CAR 397 4360 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vH-Gly-Ser- CAR II Classe Linker-vL-Myc-CD8TM-BBz 21 CAR 398 4361 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-Gly-Ser- SAC 1 K13 e Classe Linker-BCMA-Am06-HL-vH-Myc- PAC 22 CD8TM-z-P2A-K13-FLAG-T2A-PAC

CAR 399 4362 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL- [hTCRa- SIR de PAC Classe CSDVP] -F-F2A-SP-BCMA-Am06-HL- corrente 23 vH- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-Xba-PAC dupla

CAR 400 4363 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-PG4SP-v2- SIR de PAC Classe [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA- corrente 24 Am06-HL-vH-PG4SP- [hTCRa-CSDVP] - dupla F-F2A-PAC CAR 401 4364 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-E-Coil- SIR de PAC Classe [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA- corrente 25 Am06-HL-vH-K-Coil- [hTCRa-CSDVP] - dupla F-F2A-PAC CAR 402 4365 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-EAAAK- SIR de PAC Classe [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA- corrente 26 Am06-HL-vH-EAAAK-v2- [hTCRa- dupla CSDVP] -F-F2A-PAC CAR 403 4366 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-V5- SIR de PAC Classe [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA- corrente 27 Am06-HL-vH-Myc4- [hTCRa-CSDVP] - dupla F-F2A-PAC CAR 404 4367 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-Myc2- SIR de PAC Classe [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA- corrente 28 Am06-HL-vH-Myc4- [hTCRa-CSDVP] - dupla F-F2A-PAC CAR 405 4368 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL- [hTCRb- SIR de PAC Classe KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA-Am06-HL- corrente 29 vH- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC dupla

CAR 406 4369 CD8-BCMA-Am06-HL-vL-IgCL- zSIR PAC Classe CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP-Bst- 30 BCMA-Am06-HL-vH-IgG1-CH1- CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC

CAR 407 4370 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL- zSIR Classe [hTCRbECD-Bam-CD3zECDTMCP-opt] 31 -F-P2A-SP-BCMA-Am06-HL-vH- [hTCRaECD-Kpn-CD3zECDTMCP-opt2]

71 / 308 CAR 408 4371 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL- [hTCRb- SENHOR Classe KAC-ECD-Bam-CD3zECDTMCP-opt] - 32 F-P2A-SP-BCMA-Am06-HL-vH- [hTCRa-CSDVP-ECD-Kpn- CD3zECDTMCP-opt2 ] CAR 409 4372 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-V5- SENHOR PAC Classe [hTCRbECD-Bam-CD3zECDTMCP-opt] 33 -F-P2A-SP-BCMA-Am06-HL-vH-Myc- [hTCRaECD-Kpn-CD3zECDTM-28z- opt2] CAR 410 4373 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-V5- SENHOR Classe [hTCRbECD-Bam-CD3zECDTM-28z- 34 opt] -F-P2A-SP-BCMA-Am06-HL-vH- Myc- [hTCRaECD-Kpn-CD3zECDTM- 28z-opt2 ] CAR 411 4374 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-V5- SENHOR Classe [hTCRbECD-Bam-CD3zECDTMCP-opt] 35 -F-P2A-SP-BCMA-Am06-HL-vH-Myc4- [hTCRaECD-Kpn-CD3zECDTM-BBz- opt2] CAR 412 4375 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-V5- SENHOR Classe [hTCRbECD-Bam-CD3zECDTM-BBz- 36 opt] -F-P2A-SP-BCMA-Am06-HL-vH- Myc4- [hTCRaECD-Kpn-CD3zECDTM- BBz-opt2 ] CAR 413 4376 CD8-BCMA-Am06-HL-vL-IgCL-Xho- zSIR Classe CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP-Bst- 37 BCMA-Am06-HL-vH-IgG1-CH1-Mlu- CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A- PAC- DeltaWPRE CAR 414 4377 CD8SP-BCMA-Am06-HL- ( vL-vH) - CAR I hNEMO- Classe Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A- K277A- 38 PAC Flag e

PAC CAR 415 4378 CD8SP-BCMA-Am06-HL- (vL-vH) - TFP hNEMO- Classe CD3e-ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- K277A- 39 K277A-Flag-T2A-PAC Flag e

PAC CAR 416 4379 CD8SP-BCMA-Am06-HL- (vL-vH) - TFP hNEMO- Classe CD3d-ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- K277A- 40 K277A-Flag-T2A-PAC Flag e

PAC CAR 417 4380 CD8SP-BCMA-Am06-HL- (vL-vH) - TFP hNEMO- Classe CD3g-ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- K277A- 41 K277A-Flag-T2A-PAC Flag e

PAC CAR 418 4381 CD8SP-BCMA-Am06-HL- (vL-vH) - TFP hNEMO- Classe CD3z-ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- K277A- 42 K277A-Flag-T2A-PAC Flag e

PAC CAR 419 4382 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL- [IgCL- Ab-TCR hNEMO- Classe TCRg-6MD] -F-P2A-SP-BCMA-Am06- K277A- 43 HL-vH- [IgG1-CH1-TCRd-6MD] -F-F2A- Flag hNEMO-K277A

72 / 308 CAR 420 4383 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL- [IgCL- Ab-TCR hNEMO- Classe TCRb-IAH-6MD] -F-P2A-SP-BCMA- K277A- 44 Am06-HL-vH- [IgG1-CH1-TCRa-SDVP- Flag 6MD] -F-F2A- hNEMO-K277A CAR 421 4384 CD8SP-BCMA-Am06-HL- (vH-vL) - TFP hNEMO- Classe CD3e-ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- K277A- 45 K277A-Flag-T2A-PAC Flag e

PAC CAR 422 4385 CD8SP-BCMA-Am06-HL- (vH-vL) - TFP hNEMO- Classe CD3d-ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- K277A- 46 K277A-Flag-T2A-PAC Flag e

PAC CAR 423 4386 CD8SP-BCMA-Am06-HL- (vH-vL) - TFP hNEMO- Classe CD3g-ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- K277A- 47 K277A-Flag-T2A-PAC Flag e

PAC CAR 424 4387 CD8SP-BCMA-Am06-HL- (vH-vL) - TFP hNEMO- Classe CD3z-ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- K277A- 48 K277A-Flag-T2A-PAC Flag e

PAC CAR 425 4388 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-Xho- zSIR PAC Classe CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP- 49 BCMA-Am06-HL-vH-Mlu- CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC CAR 12784 14528 CD8SP-BCMA-Am06-vL- [hTCRb-S57C] SIR de Classe -F-P2A-SP-BCMA-Am06-vH- [hTCRa- corrente 50 T48C] dupla CAR 12785 14529 CD8SP-BCMA-Am06-vL- [hTCRb-S57C] SIR de K13- Classe -F-P2A-SP-BCMA-Am06-vH- [hTCRa- corrente vFLIP 51 T48C] -F-F2A-K13-opt dupla CAR 12786 14530 CD8SP-BCMA-Am06-vL- [hTCRa-T48C] SIR de Classe -F-P2A-SP-BCMA-Am06-vH- [hTCRa- corrente 52 S57C] dupla CAR 12787 14531 CD8SP-BCMA-Am06-vL- [hTCRa-T48C] SIR de K13- Classe -F-P2A-SP-BCMA-Am06-vH- [hTCRa- corrente vFLIP 53 S57C] -F-P2A-K13-opt dupla TABELA 7: LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DE VÁRIOS CONSTRUÇÕES

DE CAR CONTENDO DIFERENTES DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS. A ORDEM DE CONSTRUÇÕES DE VEÍCULOS DIFERENTES É COMO MOSTRADO NA TABELA 6 PARA CAR BASEADOS EM BCMA-Am06-HL. CARs

73 / 308 Antígeno Alvo Domínio de ligação ao antígeno SEQ ID NO (DNA) SEQ ID NO (PRT) 1 BCMA BCMA-Am14-HL 475-523 4438-4486 2 BCMA BCMA-Am08-HL 426-474 4389-4437 3 BCMA BCMA-Am06-HL 377-425 ; 12784- 4340-4388 ; 12787 14528-14531 4 CD19 hu-CAT18-1-HL 867-915 4830-4871 5 CD19 CAT17-HL 818-866 4781-4829 6 CD22 hu-HA22-1 1112-1160 5068-5115 7 CD19 CD19-DART1 916-964 4872-4920 8 CD20 hu-Ubli-1-v4 1063-1111 5019-5067 9 Hu Hu-IntB7-MMG49 2533-2581 6489-6537 10 BCMA BCMA-BB-CAR02 524-572 4487-4535 11 Her2 Her2-169 2288-2336 6244-6292 12 Her2 Her2-XMT-1520 2435-2483 6391-6439 13 Her2 Her2-XMT-1518 2386-2434 6342-6390 14 Her2 Her2-huMab4D5-D98W 2337-2385 6293-6341 15 TSHR TSHR-hu-3BD10 3611-3659 7567-7615 16 PSMA PSMA-83A12-HL-AM 3317-3365 7273-7321 17 PSMA PSMA-76-HL-AM 3268-3316 7224-7272 18 PSMA hu106mPSMA-4-HL 3219-3267 7175-7223 19 MSLN MSLN-3-HL-AM 2729-2777 6685-6733 20 MSLN MSLN-5-HL 2778-2826 6734-6782 21 EGFRviii EGFRviii-2-AM-HL 1651-1699 5607-5655 22 EGFRviii EGFRviii-H2M1863N2-HL 1749-1797 5705-5753 23 EGFRviii EGFRviii-H2M1915N-HL 1798-1846 5754-5802 24 EGFRviii EGFRviii-131-2 1700-1748 5656-5704 25 DLL3 DLL3-AM6-HL 1553-1601 5509-5557 26 DLL3 DLL3-AM14-HL 1602-1650 5558-5606 27 Nectina 4 Nectin4-66-HL 3072-3120 7028-7076 28 MSLN MSLN-237-HL 2827-2875 6783-6831 29 MSLN MSLN-HuAM15 2925-2973 6881-6929 30 MSLN MSLN76923-HL 2876-2924 6832-6880 31 PRLR PRLR-CN 3121-3169 7077-7125 32 Muc17 Muc17-11-CN 3023-3071 6979-7027 33 CD19 CD19-AM1 769-817 4732-4780 34 CD19 CD19-9B7 720-768 4683-4731 35 CD20 CD20-HL 1014-1062 4970-5018 36 CD70 CD70-HL-AM13 1210-1258 5166-5214 37 CDH19 CDH19-USC1-HLv4 1308-1356 5264-5312 38 CDH19 CDH19-USC2-HL 1357-1405 5313-5361 39 C16ORF54 C16ORF54-USC1-v4 671-719 4634-4682 40 VISTA huVISTA-USC1-v4 3807-3855 7763-7811 41 VISTA huVISTA-JJ-USC2-v4 3758-3806 7714-7762 42 GPC3 GPC3-USC1-HL-V4 2141-2189 6097-6145 43 GPC3 GPC3-USC2-HL-V4 2190-2238 6146-6194 44 PRLR PRLR-USC2-HL-V4 3170-3218 7126-7174

74 / 308 45 Muc5Ac Muc5Ac-USC1-HL-V4 2974-3022 6930-6978 46 FCRH5 FCRH5-USC1-HL-V4 1994-2042 5950-5998 47 LYPD1 LYPD1-HL-V4 2631-2679 6587-6635 48 EMR2 EMR2-USC1-V4 1847-1895 5803-5851 49 EMR2 EMR2-USC2-V4 1896-1944 5852-5900 50 EMR2 mEMR2-USC3-V4 1945-1993 5901-5949 51 gPNMB m-gPNMB-USC1-HL-v4 2239-2287 6195-6243 52 RNF43 RNF43-USC1-HL4 3366-3414 7322-7370 53 RNF43 RNF43-USC2-HL4 3415-3463 7371-7419 54 CD44v6 CD44v6-USC1-HL4 1161-1209 5117-5165 55 Robo4 Robo4-USC1 3464-3512 7420-7468 56 CEA CEA-USC1-HL4 1406-1454 5362-5410 57 Her3 Her3-USC1-HL4 2484-2532 6440-6488 58 FOLR1 FOLR1-USC1-HL4 2043-2091 5999-6047 59 FOLR1 FOLR1-USC2-HL4 2092-2140 6048-6096 60 CLDN6 CLDN6-USC1-LH4 1455-1503 5411-5459 61 CLDN6 CLDN6-USC2-LH4 1504-1552 5460-5508 62 MMP16 hMMP16-USC-1-LH4 2680-2728 6636-6684 63 UPK1B hUPK1B-USC1-LH4 3660-3708 7616-7664 64 UPK1B hUPK1B-USC2-LH4 3709-3757 7665-7713 65 BMPR1B hBMPR1B-USC1-LH4 573-621 4536-4584 66 BMPR1B hBMPR1B-USC2-LH4 622-670 4585-4633 67 Ly6E Ly6E-USC1-HL4 2582-2630 6538-6586 68 STEAP1 STEAP1-USC1-HL4 3513-3561 7469-7517 69 CD79b CD79b-USC1-LH4 1259-1307 5215-5263 70 WISP1 hu-UISP1-USC1-LH4 3856-3904 7812-7860 71 WISP1 hu-UISP1-USC2-LH4 3905-3953 7861-7909 72 SLC34A2 huMX35-LH4 3562-3610 7518-7566 73 CD19 hu-CD19-USC1-LH4 965-1013 4921-4969 74 CD22 CD22-HA22 8730-8778 10361-10409 75 STEAP1 STEAP1-hu120 9563-9611 11194-11242 76 Liv1 hLiv1-mAb2 9318-9366 10949-10997 77 Nectina 4 hu-Nectin4-mAb1 9465-9513 11096-11144 78 Cripto hu-Cripto-L1H2 8877-8925 10508-10556 79 gpA33 hu-gpA33 9024-9072 10655-10703 80 ROR1 ROR1-DART4 9514-9562 11145-11193 81 BCMA BCMA-FS 8191-8239 9822-9870 82 BCMA BCMA-PC 8289-8337 9920-9968 83 BCMA BCMA-AJ 8093-8141 9724-9772 84 BCMA BCMA-NM 8240-8288 9871-9919 85 BCMA BCMA-TS 8436-8484 10067-10115 86 BCMA BCMA-PP 8338-8386 9969-10017 87 BCMA BCMA-RD 8387-8435 10018-10066 88 BCMA BCMA-BB-CAR02 8142-8190 9773-9821 89 CLL1 CLL1-24C8 8828-8876 10459-10507 90 CLL1 CLL1-24C1 8779-8827 10410-10458

75 / 308 91 FLT3 FLT3-10E3 8975-9023 10606-10654 92 FLT3 FLT3-8B5 8926-8974 10557-10605 93 IL1RAP IL1RAP-IAPB57 9171-9219 10802-10850 94 IL1RAP IL1RAP-IAPB63 9220-9268 10851-10899 95 IL1RAP hu-IL1RAP-CANO4 9269-9317 10900-10948 96 MSLN MSLN-7D9-v3 9367-9415 10998-11046 97 MSLN MSLN-hu22A10 9416-9464 11047-11095 98 CD19 hu-Bu13 8632-8680 10263-10311 99 BST1 hu-BST1-A1 8485-8533 10116-10164 100 BST1 hu-BST1-A2 8534-8582 10165-10212 101 BST1 hu-BST1-A3 8583-8631 10213-10262 102 Her2 Her2-XMT-1519 9122-9170 10753-10801 103 Her2 Her2-XMT-1517 9073-9121 10704-10752 104 CD133 CD133-RW03 11312-11360 11472-11520 105 CD133 CD133-W6B3H10 11361-11409 11521-11569 106 CD133 CD133-293AC1C3B9 11410-11458 11570-11618 107 IL113Ra2 hu-IL13Ra2-mAb47 14113-14165 15857-15909 108 CD22 CD22-INO 13424-13476 15168-15220 109 CD22 CD22-CELL4 13106-13158 14850-14902 110 CD22 CD22-CELL13 13212-13264 14956-15008 111 CD22 CD22-CELL7 13159-13211 14903-14955 112 CD22 CD22-VM1011 13689-13741 15433-15485 113 CD22 CD22-RAB-4120 13636-13688 15380-15432 114 CD22 CD22-Med-12C5-HL 13477-13529 15221-15273 115 CD22 CD22-Med-19A3 13583-13635 15327-15379 116 CD22 CD22-Med-16F7 13530-13582 15274-15326 117 CD22 hu-RFB4 14166-14218 15910-15962 118 BCMA BCMA-mJ22-9 13053-13105 14797-14849 119 BCMA BCMA-huJ22-10 12947-12999 14691-14743 120 CD22 CD22-hu-HA22-2 13371-13423 15115-15167 121 CD19 huCD19-USC3 14060-14112 15804-15856 122 CD22 BCMA-hu72 12788-12840 14532-14584 123 MPL hu-161-3 13795-13847 15539-15591 124 BAFF-R hu-BAFFR-USC90 13954-14006 15698-15750 125 BAFF-R hu-BAFFR-USC55 13901-13953 15645-15697 126 BAFF-R hu-BAFFR-MOR6654 13848-13900 15592-15644 127 CD19 CD19-hu-mROO5-1 14007-14059 15751-15803 128 CD22 CD22-h10F4v2 13265-13317 15009-15061 129 CD22 CD22-HA22 13318-13370 15062-15114 130 MPL hu-161-2 13742-13794 15486-15538 131 MSLN MSLN-hu22A10 14325-14377 16069-16021 132 MSLN MSLN-7D9-HL 14272-14324 16016-16068 133 MSLN MSLN-5 14219-14271 15963-16015 134 BCMA BCMA-huC13-F12 12894-12946 14638-14690 135 BCMA BCMA-huC12A3-L3H3 12841-12893 14585-14637 136 BCMA BCMA-J6M0 13000-13052 14744-14796

76 / 308 Tabela 8. Exemplos de zSIR, SIR e construtos diversos

SEQ ID SEQ ID NOME (DNA) (PRT) 3955 7955 CD8SP-hCD19-EUK5-13-vL-IgCL-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP- Bst-hCD19-EUK5-13-vH-IgG1-CH1-KPN-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-

PAC 3956 7956 CD8-hCD19-EUK5-13-vL-IgCL-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP- Bst-hCD19-EUK5-13-vH-IgG1-CH1-Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-

PAC 3957 7957 CD8SP-hCD19-EUK5-13-vL-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP- hCD19-EUK5-13-vH-Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC 3958 7958 3959 7959 CD8SP-FMC63-vL-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP-FMC63-vH- Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC 3960 7960 hCD19-Bu12-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Pac 3961 7961 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP-CD19MM- scFv-Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC 3962 7962 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP-CD123- DART2-scFv-Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC 3963 7963 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP-CD20-2F2- scFv-Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC 3964 7964 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP-AFP-61- scFv-Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC 3965 7965 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP-CD22- h10F4v2-scFv-Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC 3966 7966 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP-hSC22-10- HL-scFv-Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC 3967 7967 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP-CD123- DART1-scFv-Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC 3968 7968 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP-WT1-Ab5- scFv-Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC 3969 7969 CD8SP-CD19-USC2-vL- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-CD19-USC2-vH- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC 3971 7971 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL- [CD3zECDTM-28z-opt] -F-P2A-SP-BCMA- Am06-HL-vH- [CD3zECDTM-28z-opt2] 3972 7972 CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL- [CD3zECDTM-BBz-opt] -F-P2A-SP-BCMA- Am06-HL-vH- [CD3zECDTM-BBz-opt2] 16311 16335 CD8SP-FMC63-BBz 16312 16336 CD8SP-MSLN-hu22A10-BBz 16313 16337 CD8SP-MSLN-7D9-HL-BBz 16314 16338 CD8SP-MSLN-5-HL-BBz 16315 16339 CD8SP-MPL-hu-161-2-BBz 16316 16340 CD8SP-BCMA-huC13-F12-BBz 16317 16341 CD8SP-huCD19-mROO5-1-BBz 16318 16342 CD8SP-huCD19-mROO5-1-vL- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-huCD19- mROO5-1-vH- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-K13-opt

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SEQ ID SEQ ID NOME (DNA) (PRT) 16319 16343 CD8SP-CD22-INO-vL- [hTCRb-S57C] -F-P2A-SP-CD22-INO-vH- [hTCRa- T48C] -F-F2A-PAC 16320 16344 CD8SP-CD22-hu-HA22-2-vL- [hTCRa-T48C] -F-P2A-SP-CD22-hu-HA22- 2-vH- [hTCRa-S57C] -F-F2A-Pac 16321 16345 CD8SP-CD22-Med-12C5-HL-vH- [hTCRb-S57C] -F-P2A-SP-CD22-Med- 12C5-HL-vL- [hTCRa-T48C] -F-F2A-PAC 16322 16346 CD8SP-hu-RFB4-vL- [hTCRb-S57C] -F-P2A-SP-hu-RFB4-vH- [hTCRa- T48C] -F-F2A-PAC 16323 16347 CD8SP-CD22-CELL7-vH- [hTCRb-S57C] -F-P2A-SP-CD22-CELL7-vL- [hTCRa-T48C] -F-F2A-PAC 16324 16348 CD8SP-CD22-HA22-vL- [hTCRb-S57C] -F-P2A-SP-CD22-HA22-vH- [hTCRa-T48C] -F-F2A-PAC 16325 16349 CD8SP-MSLN-7D9-HL-vH- [hTCRa-T48C] -F-P2A-SP-MSLN-7D9-HL-vL- [hTCRa-S57C] 16326 16350 CD8SP-MSLN-7D9-HL-vH- [hTCRb-S57C] -F-P2A-SP-MSLN-7D9-HL-vL- [hTCRa-T48C] 16328 16351 CD8SP-huCD19-mROO5-1- ( vL-vH) -CD3e-ECDTMCP-opt2-T2A-PAC 16329 16352 CD8SP-huCD19-mROO5-1- ( vL-vH) -CD3d-ECDTMCP-opt2-T2A-PAC 16330 16353 CD8SP-huCD19-mROO5-1-vL- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-huCD19- mROO5-1-vH- [hTCRa-CSDVP] 16331 16354 CD8SP-MSLN-hu22A10-vL- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-MSLN- hu22A10-vH- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-K13-Opt 16332 16355 CD8SP-MSLN-hu22A10-vL- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-MSLN- hu22A10-vH- [hTCRa-CSDVP] 16333 16356 CD8SP-MSLN-7D9-HL-vH- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-MSLN-7D9- HL-vL- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-K13-opt 16334 16357 CD8SP-MSLN-7D9-HL-vH- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-MSLN-7D9- HL-vL- [hTCRa-CSDVP] 16361 16358 CD8SP-MSLN-5-HL-vH- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-SP-MSLN-5-HL-vL- [hTCRb-KACIAH] 16362 16359 CD8SP-MSLN-7D9-HL-vH- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-SP-MSLN-7D9-HL- vL- [hTCRb-KACIAH] 16363 16360 CD8SP-MSLN-hu22A10-vL- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-SP-MSLN- hu22A10-vH- [hTCRb-KACIAH] Tabela 9: Construtos Vif exemplificativos

SEQ ID SEQ ID NOME (DNA) (PRT) 11243 11270 HIV1-Vif 11244 11271 CD8SP-FMC63- ( vL-vH) -Myc-BBz-T2A-PAC 11245 11272 CD8SP-FMC63- ( vL-vH) -Myc-BBz-F-P2A-Vif-F-P2A-PAC 11246 11273 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vL-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-hu- CD19-USC1-LH4-vH-Myc- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-Vif 11247 11274 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vL-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-hu- CD19-USC1-LH4-vH-Myc- [preTCRa-Del48] -F-F2A-Vif

78 / 308

SEQ ID SEQ ID NOME (DNA) (PRT) 11248 11275 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vL- Gly-Ser-Linker-hu-CD19-USC1-LH4-vH-Myc- [hTCRa-CSDVP] - F-F2A- Vif 11249 11276 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vL-V5- [hTCRg1-opt] -F-P2A-SP-hu-CD19- USC1-LH4-vH-Myc- [hTCRd-opt] -F-F2A-Vif 11250 11277 CD8SP-V5- [hTCRg1-opt] -F-P2A-CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vL-Gly- Ser-Linker-hu-CD19-USC1-LH4-vH-Myc- [hTCRd-opt] - F-F2A-Vif 11251 11278 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vL-Gly-Ser-Linker-hu-CD19-USC1-LH4- vH-Myc-CD8TM-z-P2A-K13-FLAG-T2A-Vif 11252 11279 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vL- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-SP-hu-CD19- USC1-LH4-vH- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-Vif 11253 11280 CD8-hu-CD19-USC1-LH4-vL-IgCL-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A- Spe-SP-Bst-hu-CD19-USC1-LH4-vH-IgG1-CH1-KPN-CD3zECDTMCP- opt2- F-F2A-Xba-Vif 11254 11281 CD8-hu-CD19-USC1-LH4-vL-IgCL-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A- Spe-SP-Bst-hu-CD19-USC1-LH4-vH-IgG1-CH1-Mlu-CD3zECDTMCP- opt2- F-F2A-Vif 11255 11282 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4- (vL-vH) -Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag- T2A-Vif 11256 11283 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4- (vL-vH) -CD3e-ECDTMCP-opt2-P2A- hNEMO-K277A-Flag-T2A-Vif 11257 11284 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4- (vL-vH) -CD3d-ECDTMCP-opt2-P2A- hNEMO-K277A-Flag-T2A-Vif 11258 11285 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4- (vL-vH) -CD3g-ECDTMCP-opt2-P2A- hNEMO-K277A-Flag-T2A-Vif 11259 11286 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4- (vL-vH) -CD3z-ECDTMCP-opt2-P2A- hNEMO-K277A-Flag-T2A-Vif 11260 11287 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vL- [IgCL-TCRg-6MD] -F-P2A-SP-hu- CD19-USC1-LH4-vH- [IgG1-CH1-TCRd-6MD] -F-F2A- Vif 11261 11288 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vL- [IgCL-TCRb-IAH-6MD] -F-P2A-SP-hu- CD19-USC1-LH4-vH- [IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD] - F-F2A-Vif 11262 11289 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4- ( vH-vL) -CD3e-ECDTMCP-opt2-P2A-Vif 11263 11290 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4- (vH-vL) -CD3d-ECDTMCP-opt2-P2A- hNEMO-K277A-Flag-T2A-Vif 11264 11291 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4- (vH-vL) -CD3g-ECDTMCP-opt2-P2A- hNEMO-K277A-Flag-T2A-Vif 11265 11292 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4- (vH-vL) -CD3z-ECDTMCP-opt2-P2A- hNEMO-K277A-Flag-T2A-Vif 11266 11293 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vL-Xho-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe- SP-hu-CD19-USC1-LH4-vH-Mlu-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-Vif 11267 11294 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vH-Gly-Ser-Linker-vL-Myc-CD8TM-BBz- 2A-Vif 11268 pLenti-EF1a-CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vH-Gly-Ser-Linker-vL-Myc- CD8TM-BBz-2A-Vif 11269 pCDNA3-Vif

79 / 308

Tabela 10. Anticorpos biespecíficos exemplares direcionados a diferentes antígenos Ag x CD3 Ag x CD28 Ag x 41BB Antígeno Domínio de SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID (Ag) ligação ao NO NO (PRT) NO NO NO NO antígeno (DNA) (DNA) (PRT) (DNA) (PRT) CD19 FMC63 11620 11790 11676 11846 11732 11902 CD19 huFMC63-11 11621 11791 11677 11847 11733 11903 CD19 huFMC63-11- 11622 11792 11678 11848 11734 11904 N203Q CD19 CD19Bu12 11623 11793 11679 11849 11735 11905 CD19 CD19MM 11624 11794 11680 11850 11736 11906 CD19 Ritx-CD19- 11625 11795 11681 11851 11737 11907 MOR0028 CD19 CD19-hu- 11626 11796 11682 11852 11738 11908 mROO5-1 BCMA BCMA-J6M0 11627 11797 11683 11853 11739 11909 BCMA BCMA- 11628 11798 11684 11854 11740 11910 huC12A3-L3H3

BCMA BCMA- 11629 11799 11685 11855 11741 11911 huC11.D5.3L1H3

BCMA BCMA-huC13- 11630 11800 11686 11856 11742 11912 F12 CD20 CD20-2F2 11631 11801 11687 11857 11743 11913 CD20 CD20-GA101 11632 11802 11688 11858 11744 11914 CD20 CD20-2H7 11633 11803 11689 11859 11745 11915 CD20 CD20-Ubli-v4 11634 11804 11690 11860 11746 11916 CD20 CD20-2H7 11635 11805 11691 11861 11747 11917 CD20 CD20-7D8 11636 11806 11692 11862 11748 11918 CD22 CD22-h10F4v2 11637 11807 11693 11863 11749 11919 CD22 CD22- 11638 11808 11694 11864 11750 11920 H22Rhov2A CD22 CD22-m971-HL 11639 11809 11695 11865 11751 11921

CD22 CD22-5-HL 11640 11810 11696 11866 11752 11922 CD22 CD22-10-HL 11641 11811 11697 11867 11753 11923 CD22 CD22-HA22 11642 11812 11698 11868 11754 11924 CD30 CD30-5F11 11643 11813 11699 11869 11755 11925 CD30 CD30-Ac10 11644 11814 11700 11870 11756 11926 CD32 CD32-Med9 11645 11815 11701 11871 11757 11927 CD33 CD33-AF5 11646 11816 11702 11872 11758 11928 CD33 CD33-huMyc9 11647 11817 11703 11873 11759 11929 CD33 CD33-Him3-4 11648 11818 11704 11874 11760 11930

80 / 308 Ag x CD3 Ag x CD28 Ag x 41BB CD33 CD33- 11649 11819 11705 11875 11761 11931 SGNh2H12 CD33 CD33-15G15-33 11650 11820 11706 11876 11762 11932

CD33 CD33-33H4 11651 11821 11707 11877 11763 11933 CD123 CD123-CSL362 11652 11822 11708 11878 11764 11934

CD123 CD123-1172 11653 11823 11709 11879 11765 11935 CD123 CD123-DART-1 11654 11824 11710 11880 11766 11936

CD123 CD123-DART-2 11655 11825 11711 11881 11767 11937

CD123 CD123-9D7 11656 11826 11712 11882 11768 11938 CD123 CD123-3B10 11657 11827 11713 11883 11769 11939 CD138 CD138 11658 11828 11714 11884 11770 11940 CS1 CS1-HuLuc64 11659 11829 11715 11885 11771 11941

CS1 CS1-huLuc90 11660 11830 11716 11886 11772 11942 FLT3 FLT3-NC7 11661 11831 11717 11887 11773 11943 MPL MPL-175 11662 11832 11718 11888 11774 11944 MPL MPL-161 11663 11833 11719 11889 11775 11945 MPL MPL-111 11664 11834 11720 11890 11776 11946 MPL Hu-161-2 11665 11835 11721 11891 11777 11947 MPL MPL-hu-175-2 11666 11836 11722 11892 11778 11948 MPL MPL-hu-111-2 11667 11837 11723 11893 11779 11949 Lym1 Lym1 11668 11838 11724 11894 11780 11950 Lym2 Lym2 11669 11839 11725 11895 11781 11951 CD70 CD70-h1F6 11670 11840 11726 11896 11782 11952 CD79b CD79b-2F2 11671 11841 11727 11897 11783 11953 CD179b CD179b 11672 11842 11728 11898 11784 11954 GPRC5D GPRC5D-ET150- 11673 11843 11729 11899 11785 11955 5 GPRC5D GPRC5D-ET150- 11674 11844 11730 11900 11786 11956 18

Tabela 11: CAR “X” DOENÇA EXEMPLAR DESTINADA A CAR (ou seja, CARs convencionais e ALVO CARs de próxima geração.

Por exemplo, SIR, Ab-TCR, TFP e zSIR) CD19 ALL, CLL, linfoma, crise blástica linfóide de CML, mieloma múltiplo, distúrbios imunológicos ALK Câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), ALCL (linfoma anaplásico de células grandes), IMT (tumor miofibroblástico inflamatório) ou neuroblastoma CD45 Cânceres de sangue BCMA Mieloma, PEL, leucemia de células plasmáticas, macroglobinemia de Waldenstrom CD5 Câncer de sangue, leucemia de células T, linfoma de células T BAFF-R Câncer de sangue, leucemia linfocítica crônica, B-ALL CD20 Câncer de sangue, leucemia, ALL, CLL, linfoma, distúrbios imunológicos

81 / 308 CAR “X” DOENÇA EXEMPLAR DESTINADA A CAR (ou seja, CARs convencionais e ALVO CARs de próxima geração. Por exemplo, SIR, Ab-TCR, TFP e zSIR) CD22 Câncer de sangue, leucemia, LLA, CLL, linfoma, crise blástica linfóide de CML, distúrbios imunológicos CD23 Câncer de sangue, leucemia, ALL, CLL, linfoma, doenças autoimunes CD30 Linfoma de Hodgkins, linfoma cutâneo de células T CD32 Tumores sólidos CD33 Câncer de sangue, AML, MDS CD34 Câncer de sangue, AML, MDS CD44v6 Câncer de sangue, AML, MDS CD70 Câncer de sangue, linfoma, mieloma, macroglobulinemia de Waldenstrom CD79b Câncer de sangue, LLA, Linfoma CD123 Câncer de sangue, AML, MDS CD138 Câncer de sangue, mieloma, PEL, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de Waldenstrom CD179b Câncer de sangue, LLA, Linfoma CD276 / B7- Sarcoma de Ewing, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de ovário, colorretal H3 e de pulmão CD324 Tumores sólidos, câncer de esôfago, próstata, colorretal, mama, pulmão CDH6 Tumores sólidos, câncer renal, ovário, tireoide CDH17 Adenocarciniomas, câncer gastrointestinal, pulmão, ovário, endometrial CDH19 Tumor sólido, melanoma EGFR Câncer de cólon, câncer de pulmão CLEC5A Câncer de sangue, leucemia, AML GR / LHR Câncer de próstata, câncer de ovário ou câncer de mama CLL1 Câncer de sangue, leucemia CMVpp65 Infecção por CMV, colite por CMV, pneumonite por CMV CS1 Câncer de sangue, mieloma, PEL, leucemia de células plasmáticas CSF2RA AML, CML, MDS CD123 Câncer de sangue, AML, MDS DLL3 Melanoma, câncer de pulmão ou câncer de ovário EBNA3c / Infecção pelo vírus Epstein Barr e doenças relacionadas, incluindo câncer

MHC I EBV-gp350 Infecção pelo vírus Epstein Barr e doenças relacionadas EGFR Tumores sólidos, câncer de cólon, câncer de pulmão EGFRvIII Tumores sólidos, glioblastoma EpCam1 Câncer gastrointestinal FLT3 Câncer de sangue, AML, MDS, ALL Receptor de Câncer de ovário, NSCLC, câncer endometrial, câncer renal ou outros tumores folato alfa sólidos (FR1 ou FOLR1) FSHR Câncer de próstata, câncer de ovário ou câncer de mama GD2 Neuroblastoma GD3 Melanoma GFRa4 Câncer, câncer medular da tireoide Fucosil-GM1 Câncer de pulmão de pequenas células (GM1) GPRC5D Mieloma, PEL, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de Waldenstrom

82 / 308 CAR “X” DOENÇA EXEMPLAR DESTINADA A CAR (ou seja, CARs convencionais e ALVO CARs de próxima geração. Por exemplo, SIR, Ab-TCR, TFP e zSIR) GP100 Melanoma GPC3 Tumores sólidos, câncer de pulmão gpNMB Melanoma, tumores cerebrais, câncer gástrico GRP78 Mieloma Her2 Tumores sólidos, câncer de mama, câncer de estômago Her3 Colorretal, câncer de mama HMW-MAA Melanoma HTLV1- Doenças associadas à infecção por HTLV1, leucemia-linfoma de células T do TAX / MHC adulto

I IL11Ra Câncer de sangue, AML, ALL, CML, MDS, sarcomas IL6Ra Tumores sólidos, câncer de fígado IL13Ra2 Glioblastomas KSHV-K8.1 Sarcoma de Kaposi, PEL, doença multicêntrica de Castleman LAMP1 Câncer de sangue, AML, ALL, MDS, CLL, CML LewisY Cânceres L1CAM Tumores sólidos, câncer de ovário, mama, endométrio, melanoma LHR Câncer de próstata, câncer de ovário ou câncer de mama Lym1 Câncer de sangue, leucemia, linfoma Lym2 Câncer de sangue, leucemia, linfoma CD79b Câncer de sangue, linfoma MART1 / Melanoma

MHC I Mesotelina Mesotelioma, câncer ovariano, câncer pancreático Muc1 / MHC Câncer de mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de pulmão ou outros I tumores sólidos Muc16 cancro do ovário NKG2D Leucemia, linfoma ou mieloma NYBR1 Câncer de mama PSCA Câncer de próstata PR1 / MHC I Câncer de sangue, leucemia Receptor de Câncer de mama, câncer de células renais cromofóbicas Prolactina PSMA Câncer de próstata PTK7 Melanoma, câncer de pulmão ou câncer de ovário ROR1 Câncer de sangue, malignidade de células B, linfoma, CLL SLea Câncer pancreático, câncer de cólon SSEA4 Câncer de pâncreas Tirosinase / Melanoma

MHC I TCRB1 Leucemias e linfomas de células T, doenças autoimunes TCRB2 Leucemias e linfomas de células T, doenças autoimunes TCRgd Leucemias e linfomas de células T, doenças autoimunes hTERT Tumores sólidos, cânceres do sangue TGFBR2 Tumores sólidos, queloide TIM1 / Câncer de rim, câncer de fígado HAVCR1 TROP2 Tumores sólidos, câncer de mama, câncer de próstata

83 / 308 CAR “X” DOENÇA EXEMPLAR DESTINADA A CAR (ou seja, CARs convencionais e ALVO CARs de próxima geração. Por exemplo, SIR, Ab-TCR, TFP e zSIR) TSHR Câncer de tireoide, leucemia de células T, linfoma de células T TSLPR Câncer de sangue, leucemias, AML, MDS Tirosinase / Melanoma

MHC I VEGFR3 Tumores sólidos WT1 / MHC Câncer de sangue, AML

I Receptor de AML, mieloma folato β B7H4 Câncer de mama ou câncer de ovário CD23 Câncer de sangue, leucemias, CLL GCC Câncer gastrointestinal CD200R Câncer de sangue, AML, MDS AFP / MHC I Tumores sólidos, câncer de fígado CD99 Câncer de fígado GPRC5D Mieloma, macroglobinemia de Waldenstrom HPV16-E7 / Cânceres associados ao HPV16, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço

MHC I Fator de Tumores sólidos tecido 1 (TF1) Tn-Muc1 Tumores sólidos e cânceres do sangue Igk - Mieloma, leucemia de células plasmáticas Corrente leve Ras G12V / Tumores sólidos e cânceres do sangue

MHC I CLD18A2 Câncer gástrico, pancreático, esofágico, ovariano ou de pulmão (Claudin

18.2) CD43 Câncer de sangue, AML NY-ESO-1 / Mieloma

MHC I MPL / TPO- Câncer de sangue, AML, MDS, CML, ALL

R Glicoproteína Câncer renal, câncer de fígado, mieloma P (MDR1) CD179a Câncer de sangue, leucemia aguda, CLL, ALL, linfoma STEAP1 Câncer gástrico ou de próstata, ou linfoma Liv1 Câncer de mama ou próstata (SLC39A6) Nectina4 Câncer de bexiga, renal, cervical, pulmonar, cabeça e pescoço ou mama (PVRL4) Cripto Câncer colorretal, endometrial ou ovariano (TDGF1) gpA33 Câncer colorretal, endometrial ou ovariano FLT3 Câncer de sangue, AML, ALL, MDS BST1 / Câncer de sangue, AML, MDS CD157 IL1RAP Câncer de fígado, colo-retal, colo do útero, pulmão ou ovário Canal de Glioma cloreto

84 / 308 CAR “X” DOENÇA EXEMPLAR DESTINADA A CAR (ou seja, CARs convencionais e ALVO CARs de próxima geração. Por exemplo, SIR, Ab-TCR, TFP e zSIR) IgE Alergia HLA-A2 Doença do enxerto vs hospedeiro, rejeição de tecido (SIR expresso em células T reguladoras) Amilóide Amiloidoses, doença de Alzheimer HIV1-env HIVI / AIDS e condições relacionadas HIV1-gag HIV1 / AIDS e condições relacionadas Influenza A Infecção por influenza A

HA Integrin B7 Neoplasias de células plasmáticas, linfoma de efusão primária Muc17 Câncer pancreático, câncer de cólon CD16ORF54 Cânceres de sangue VISTA Cânceres de sangue Muc5Ac Câncer de pâncreas, câncer de estômago, câncer de cólon FCRH5 Neoplasia de células plasmáticas LYPD1 Câncer de ovário, câncer endometrial, melanoma EMR2 Leucemia aguda, linfoma, câncer de mama, câncer de colon gpNMB Melanoma, câncer cerebral, câncer de mama, tumores sólidos RNF43 Câncer colorretal, câncer de mama, câncer endometrial CD44v6 Cânceres epiteliais Robo4 Renal, cólon, câncer de mama, tumores sólidos GPC3 Câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de mama FOLR1 Câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de rim, tumores sólidos CLDN6 Câncer de ovário, câncer de fígado MMP16 Melanoma, câncer cerebral, câncer de pulmão pequeno, neuroblastoma BMPR1B Câncer de próstata, câncer de mama, câncer de ovário Ly6E Mama, ovário, pâncreas, pulmão WISP1 Glioblastoma, câncer de mama SLC34A2 Câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer endometrial CD133 Câncer de pulmão, câncer de cérebro Tabela 12: Ag x CD3 Ag x CD28 Ag x 41BB Antígeno Domínio de SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID (Ag) ligação ao NO NO (PRT) NO NO NO NO antígeno (DNA) (DNA) (PRT) (DNA) (PRT) CD19 FMC63 11620 11790 11676 11846 11732 11902 CD19 huFMC63-11 11621 11791 11677 11847 11733 11903 CD19 huFMC63-11- 11622 11792 11678 11848 11734 11904 N203Q CD19 CD19Bu12 11623 11793 11679 11849 11735 11905 CD19 CD19MM 11624 11794 11680 11850 11736 11906 CD19 Ritx-CD19- 11625 11795 11681 11851 11737 11907 MOR0028 CD19 CD19-hu- 11626 11796 11682 11852 11738 11908 mROO5-1

85 / 308 BCMA BCMA-J6M0 11627 11797 11683 11853 11739 11909 BCMA BCMA- 11628 11798 11684 11854 11740 11910 huC12A3-L3H3

BCMA BCMA- 11629 11799 11685 11855 11741 11911 huC11.D5.3L1H3

CD22 CD22-5-HL 11640 11810 11696 11866 11752 11922 CD22 CD22-10-HL 11641 11811 11697 11867 11753 11923 CD22 CD22-HA22 11642 11812 11698 11868 11754 11924 CD30 CD30-5F11 11643 11813 11699 11869 11755 11925 CD30 CD30-Ac10 11644 11814 11700 11870 11756 11926 CD32 CD32-Med9 11645 11815 11701 11871 11757 11927 CD33 CD33-AF5 11646 11816 11702 11872 11758 11928 CD33 CD33-huMyc9 11647 11817 11703 11873 11759 11929 CD33 CD33-Him3-4 11648 11818 11704 11874 11760 11930 CD33 CD33- 11649 11819 11705 11875 11761 11931 SGNh2H12 CD33 CD33-15G15-33 11650 11820 11706 11876 11762 11932

CD123 CD123-DART-2 11655 11825 11711 11881 11767 11937

CD123 CD123-9D7 11656 11826 11712 11882 11768 11938 CD123 CD123-3B10 11657 11827 11713 11883 11769 11939 CD138 CD138 11658 11828 11714 11884 11770 11940 CS1 CS1-HuLuc64 11659 11829 11715 11885 11771 11941 CS1 CS1-huLuc90 11660 11830 11716 11886 11772 11942 FLT3 FLT3-NC7 11661 11831 11717 11887 11773 11943

86 / 308 MPL MPL-175 11662 11832 11718 11888 11774 11944 MPL MPL-161 11663 11833 11719 11889 11775 11945 MPL MPL-111 11664 11834 11720 11890 11776 11946 MPL Hu-161-2 11665 11835 11721 11891 11777 11947 MPL MPL-hu-175-2 11666 11836 11722 11892 11778 11948 MPL MPL-hu-111-2 11667 11837 11723 11893 11779 11949 Lym1 Lym1 11668 11838 11724 11894 11780 11950 Lym2 Lym2 11669 11839 11725 11895 11781 11951 CD70 CD70-h1F6 11670 11840 11726 11896 11782 11952 CD79b CD79b-2F2 11671 11841 11727 11897 11783 11953 CD179b CD179b 11672 11842 11728 11898 11784 11954 GPRC5D GPRC5D-ET150- 11673 11843 11729 11899 11785 11955 5 GPRC5D GPRC5D-ET150- 11674 11844 11730 11900 11786 11956 18 Tabela 13: cadeias de TCR úteis em várias modalidades:

SEQ ID NO TCR CADEIA (PRT) 4038 hTCR-alpha-constant_X02883.1 4039 hTCRa -WT 4040 hTCRa -CSDVP 4041 hTCRa-opt2 4042 hTCRa-T48C-opt 4043 hTCRa-T48C-opt1 4044 hTCRa -SDVP 4045 hTCRa-S61R 4046 hTCRa -SDVPR 4047 hTCRaECD-CD3zECDTMCP-opt2 4048 hTCR-b1-constant-region_X00437.1 4049 constante hTCR-b2 4050 hTCRb -WT 4051 hTCRb-S57C-opt1 4052 hTCRb -KACIAH 4053 hTCRb-opt2 4054 hTCRb -KAIAH 4055 hTCRb-R79G 4056 hTCRbECD-CD3zECDTMCP-opt 4057 preTCRa_gb_U38996.1 4058 preTCRa 4059 preTCRa-del48 4060 hTCR-gamma_M27331.1 4061 hTCR -Gamma- Opt 4062 hTCR -Delta 4063 hTCR -Delta- Opt 12602 Domínio transmembranar TCRa 12603 Domínio transmembranar TCRb

87 / 308 12604 Domínio transmembrana TCRd 12605 Domínio transmembranar TCRg 12606 Peptídeo de conexão TCRa 12607 Peptídeo de conexão TCRb 12608 Peptídeo de conexão TCRd 12609 Peptídeo de conexão TCRy 12610 Peptídeo de conexão TCRa MD 12611 Peptídeo de conexão TCRb MD 12612 Peptídeo de conexão TCRd MD 12613 Peptídeo de conexão TCRy MD 12614 Domínio intracelular TCRb 12615 Domínio intracelular TCRy 12616 TCRD alfa 12617 TCRD beta 12618 TCRD alpha MD 12619 TCRD beta MD 12620 Delta TCRD 12621 Gama TCRD 12622 TCRD delta MD 12623 TCRD gamma MD 12624 CD3e-ECDTMCP 12625 CD3e-ECD 12626 CD3e-TM 12627 CD3e-CP 12628 CD3d-ECDTMCP 12629 CD3d-ECD 12630 CD3d-TM 12631 CD3d-CP 12632 CD3g-ECDTMCP 12633 CD3g-ECD 12634 CD3g-TM 12635 CD3g-CP 12636 CD3zECDTMCP 12637 CD3z-TM 12638 CD3z-CP

[00134] Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam CARs 1-15 (Tabela 1), em que o domínio do CAR que é específico para o antígeno tem como alvo um ou mais antígenos específicos, conforme descrito nas Tabelas 3 ou Tabelas 5-6 em PCT / US2017 / 064379, que são aqui incorporados por referência. Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam qualquer um ou mais dos estrutura principais 1-60 (Tabela 2), onde o domínio do CAR

88 / 308 codificado que é específico para o antígeno tem como alvo um ou mais antígenos específicos, conforme descrito neste documento e na Tabela 3 ou Tabelas 5-6 em PCT / US2017 / 064379. Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam a espinha dorsal-1, em que o domínio do CAR na espinha dorsal-1 que é específico para o antígeno tem como alvo um ou mais antígenos específicos do câncer, como aqui descrito e na Tabela 3 ou Tabelas 5-6 no PCT / US2017 / 064379. Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam a espinha dorsal-8, em que o domínio do CAR na espinha dorsal-1 que é específico para o antígeno tem como alvo um ou mais antígenos que são específicos para o câncer, conforme descrito neste documento e na Tabela 3 ou Tabelas 5- 6 em PCT / US2017 / 064379.

[00135] Em várias modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os componentes do CAR das estruturas aqui descritas, codificam um, dois, três ou mais domínios específicos do antígeno (ASD).

[00136] Em várias modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os componentes CAR dos estrutura principais descritos neste documento, codificam zero, um, dois, três ou mais domínios coestimulatório.

[00137] Em várias modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os componentes CAR dos estrutura principais descritos neste documento, codificam zero, um, dois, três ou mais domínios de sinalização intracelular.

[00138] Em várias modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam o CAR e os estrutura principais aqui descritos, codificam zero, um, dois, três ou mais módulos acessórios.

[00139] As sequências de ácido nucleico que codificam para os componentes desejados dos CARs e módulos acessórios descritos neste documento podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos na técnica. Alternativamente, o ácido nucleico de interesse pode ser produzido

89 / 308 sinteticamente, em vez de clonado.

[00140] Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas aqui descritas que expressam os CARs e componentes acessórios aqui descritos também expressam agentes que reduzem a toxicidade dos CARs.

[00141] Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas aqui descritas que expressam os CARs e componentes acessórios aqui descritos também expressam agentes que aumentam a atividade dos CARs.

[00142] Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas aqui descritas que expressam os CARs e componentes acessórios descritos neste documento também expressam agentes que aumentam a persistência dos CARs.

[00143] Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas aqui descritas que expressam os CARs e componentes acessórios aqui descritos também expressam agentes que evitam o esgotamento dos CARs.

[00144] As composições compreendendo vários estrutura principais, conforme descrito neste documento, compreendem CARs que compreendem um ou mais ASD que se ligam especificamente a um antígeno associado ao câncer, conforme descrito neste documento. As sequências do ASD são contíguas com e no mesmo quadro de leitura que uma sequência de ácido nucleico que codifica o restante de uma ou mais cadeias de CAR.

[00145] Os polinucleotídeos, polipeptídeos, construtos de expressão, células modificadas de forma recombinante que expressam CARs compreendendo os domínios de ligação ao antígeno da divulgação, bem como o método de produção e uso de tais polipeptídeos, polinucleotídeos e células são descritos em métodos conhecidos na técnica e métodos descritos em PCT / US2017 / 024843, WO 2014/160030 A2, WO 2016/187349 A1, PCT / US2016 / 058305, WO 2015/117229 A1 e PCT / US17 / 64379, que são incorporados

90 / 308 neste documento por referência em sua totalidade.

[00146] A divulgação fornece vários domínios de ligação ao antígeno que podem ser usados na geração de CARs (por exemplo, CAR 1-15 e estrutura principais 1-60) para aplicações em terapia celular adotiva. Em algumas modalidades, esses domínios de ligação ao antígeno são derivados de anticorpos e antígenos alvo que são expressos em câncer, distúrbios proliferativos não cancerosos (por exemplo, endometrioses) e / ou distúrbios imunológicos. Os antígenos alvo, SEQ IDs (DNA) e SEQ IDs (PRT) de fragmentos vL, vH e scFv desses domínios de ligação ao antígeno são mostrados na Tabela 3. Os CDRs dos fragmentos vL e vH dos domínios de ligação ao antígeno direcionados a diferentes antígenos são mostrado na Tabela

4.

[00147] Em algumas modalidades, o (s) domínio (s) de ligação ao antígeno codificado (s) do polipeptídeo CARs direcionado a um antígeno específico compreende qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve (vL ou VL) de SEQ ID NO 4118 a 4190, 9631 a 9660 e 11460 a 11462, 14386 a 14415 direcionando esse antígeno conforme listado na Tabela 3 em que até 9 resíduos de aminoácidos, mas não mais de 10 aminoácidos, são substituídos por quaisquer outros resíduos de aminoácidos, ou sequências com 80-100% de identidade com sequências de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NO 4118 a 4190, 9631 a 9660, ou 11460 a 11462 e 14386 a 14415, ou sequências com 85- 100% de identidade com as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de qualquer um dos SEQ ID NO SEQ ID NO 4118 a 4190, 9631 a 9660, ou 11460 a 11462 e 14386 a 14415. O CDR1, CDR2 e CDR3 de fragmentos de vL com a SEQ ID NO: 4118 a 4190, 9631 a 9660, ou 11460 a 11462 são representados por SEQ ID NOs: 11961 a 12066, 12068 a 12173, 12175 a 12280, respectivamente (Tabela 4).

[00148] Em algumas modalidades, o polipeptídeo codificado de um ou

91 / 308 mais domínios de ligação ao antígeno dos CARs (CARs convencionais e CARs de próxima geração, por exemplo, SIRs, zSIRs, Ab-TCRs, Tri-Tac e TFP) compreende qualquer um ou mais dos domínios variáveis de cadeia pesada (vH ou VH) sequências de aminoácidos de SEQ ID NO 4192 a 4264, 9662 a 9691, 11464 a 11466 e 14417 a 14446 direcionando esse antígeno conforme listado na Tabela 3 em que até 9 resíduos de aminoácidos, mas não mais que 10 aminoácidos são substituído por quaisquer outros resíduos de aminoácidos ou sequências com 80-100% de identidade com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO 4192 a 4264, 9662 a 9691, 11464 a 11466 e 14417 a 14446 ou sequências com 85-100% de identidade com a complementaridade determinar regiões (CDRs) de qualquer uma das SEQ ID NO 4192 a 4264, 9662 a 9691, 11464 a 11466 e 14417 a 14446. O CDR1, CDR2 e CDR3 de fragmentos de vH com a SEQ ID NO: 4192 a 4264, 9662 a 9691, 11464 a 11466 e 14417 a 14446 são representados por SEQ ID NOs: 12282 a 12387, 12389 a 12494, 12497 a 12602, 16219-16310, respectivamente (Tabela 4).

[00149] Em algumas modalidades, o codificado um ou mais domínios de ligação de antígeno dos CARs 1-15 e polipeptídeo de estrutura principais 1- 60 compreendem qualquer um ou mais sequências de aminoácidos de fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) de SEQ ID NO 4266 a 4338, 9693 a 9722, 11468 a 11470 e 14448-14477 em que até 9 resíduos de aminoácidos, mas não mais de 10 aminoácidos, são substituídos por quaisquer outros resíduos de aminoácidos ou sequências com 80-100% de identidade com sequências de aminoácidos de SEQ ID NO 4266 a 4338, 9693 a 9722, 11468 a 11470 e 14448-14477 ou sequências com 85-100% de identidade com as regiões determinantes de complementaridade (CDR's) de SEQ ID NO 4266 a 4338, 9693 a 9722, 11468 a 11470 e 14448 -14477. O CDR1, CDR2 e CDR3 das regiões vL dos fragmentos scFv com a SEQ ID NO: 4266 a 4338, 9693 a 9722, 11468 a 11470, e 14448-14477 são representados por SEQ ID NOs: 11961 a 12066, 12068 a 12173, 12175 a 12280, 16126-16217 respectivamente

92 / 308 (Tabela 4). O CDR1, CDR2 e CDR3 das regiões vH dos fragmentos scFv com a SEQ ID NO: 4266 a 4338, 9693 a 9722, 11468 a 11470 e 14448-14477 são representados por SEQ ID NOs: 12282 a 12387, 12389 a 12494 e 12497 a 12602 e 16219-16310, respectivamente (Tabela 4).

[00150] Deve ser entendido que a ordem dos fragmentos vL e vH em um fragmento scFv pode ser vL-vH ou vH-vL. Assim, embora os fragmentos scFv exemplares mostrados na Tabela 3 representem a orientação vL-vH ou vH-vL, os fragmentos scFv com a orientação complementar (isto é, vH-vL e vL-vH) também podem ser usados nos métodos ou composições da divulgação.

[00151] O DNA e PRT SEQ IDs de elementos exemplares que podem ser usados na construção de diferentes CARs 1-15 e estrutura principais 1-60 estão listados na Tabela 5. Os ácidos nucleicos e aminoácidos SEQ IDs de CARs convencionais exemplares (por exemplo, CARs de 2ª geração contendo domínios coestimuladores 41BB) e CARs de próxima geração (por exemplo, SIRs, zSIRs, Ab-TCRs e TFP) com base nos fragmentos vL e vH derivados de BCMA-AM06-HL scFv são fornecidos nas Tabelas 6. O nucleico SEQ IDs de ácido e aminoácido de CARs convencionais exemplares (por exemplo, CARs de 2ª geração contendo domínios co-estimuladores de 41BB) e CARs de próxima geração (por exemplo, SIRs, zSIRs, Ab-TCRs e TFP) com base nos fragmentos vL e vH derivados de outro scFv fragmentos podem ser derivados substituindo os fragmentos vL e vH de BCMA-AM06-HL scFv pelos fragmentos vL e vH de fragmentos scFv listados na Tabela 3. A sequência de construtos CAR exemplares contendo diferentes domínios de ligação ao antígeno são referenciados na Tabela 7. A ordem dos diferentes construtos CAR na Tabela 7 é como mostrado na Tabela 6 para CARs baseados em BCMA-Am06-HL. Assim, o construto CAR representado pela SEQ ID NO: 475 se assemelha ao construto CAR representado pela SEQ ID NO: 377, com a exceção de que os fragmentos vL e vH correspondentes ao domínio de ligação ao antígeno BCMA-Am06-HL são substituídos pelo vL e vH fragmentos

93 / 308 correspondentes ao domínio de ligação ao antígeno BCMA-Am14-HL. Da mesma forma, o construto CAR representado pela SEQ ID NO: 476 se assemelha ao construto CAR representado pela SEQ ID NO: 378, com a exceção de que os fragmentos vL e vH correspondentes ao domínio de ligação ao antígeno BCMA-Am06-HL são substituídos pelo vL e vH fragmentos correspondentes ao domínio de ligação ao antígeno BCMA-Am14-HL.

[00152] Em várias modalidades, os domínios de ligação ao antígeno da divulgação mostram propriedades in vitro e in vivo superiores, como afinidade de ligação aos antígenos alvo, secreção de citocinas, proliferação, citotoxicidade, exaustão e persistência de longo prazo, quando usado no construção de CARs (isto é, CARs convencionais e CARs de próxima geração). Em várias modalidades, esses domínios de ligação ao antígeno mostram diversas propriedades in vitro e in vivo, como afinidade de ligação aos antígenos alvo, secreção de citocinas, proliferação, citotoxicidade, exaustão e persistência de longo prazo, quando usados na construção de CARs (ou seja, convencionais CARs e CARs de próxima geração). Em várias modalidades, os CARs contendo esses antígenos alvo podem ser usados para gerar uma resposta imune diversa.

[00153] A divulgação contempla ainda CARs que têm como alvo o mesmo antígeno, mas com diferentes domínios de ligação ao antígeno e podem possuir diversas propriedades biológicas, dependendo em parte do epítopo do antígeno direcionado por eles. Assim, os dois grupos de CARs direcionados a Her2 representados por SEQ ID NOs: 2435-2483 e SEQ ID NOs: 2386-2434, ver linhas 12-13 da Tabela 7, mostram diferentes propriedades biológicas, como ativação de células T, secreção de citocinas e citotoxicidade.

[00154] Em algumas modalidades, o domínio específico do antígeno da molécula CAR codificada compreende um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um scFv, um Fv, um Fab, um (Fab ') 2, um anticorpo de domínio único (SDAB), um VH ou domínio VL, ou um domínio VHH de camelídeo.

94 / 308 Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno do CAR é um fragmento de anticorpo scFv que é humanizado em comparação com a sequência murina do scFv do qual é derivado.

[00155] Em alguns casos, os scFvs podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242: 423-426 e Huston et al., (1988) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). As moléculas de ScFv podem ser produzidas ligando as regiões VH e VL usando ligantes polipeptídicos flexíveis. As moléculas de scFv compreendem um ligante (por exemplo, um ligante Ser-Gly) com um comprimento otimizado e / ou composição de aminoácidos. O comprimento do linker pode afetar muito como as regiões variáveis de um scFv se dobram e interagem. Por exemplo, se um ligante polipeptídico curto for empregado (por exemplo, entre 5-10 aminoácidos), o dobramento intracadeia é evitado. O dobramento intercadeia pode ser útil para reunir as duas regiões variáveis para formar um local de ligação de epítopo funcional. Para exemplos de orientação e tamanho do ligante, consulte, por exemplo, Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-6448, Publicação de Pedido de Patente U.S. Nos. 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, e Publicação PCT Nos. WO2006 / 020258 e WO2007 / 024715, cuja divulgação é aqui incorporada por referência.

[00156] Um scFv pode compreender um ligante de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais resíduos de aminoácidos entre suas regiões VL e VH. A sequência de ligação pode compreender qualquer aminoácido de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a sequência de ligação compreende os aminoácidos glicina e serina. Em outra modalidade, a sequência de ligante compreende conjuntos de repetições de glicina e serina, como (Gly4Ser) n, onde n é um número inteiro positivo igual ou superior a 1. Em uma modalidade, o ligante pode ser (Gly4Ser) 3 ou (Gly4Ser) 3 ou vinculador Whitlow. A variação no

95 / 308 comprimento do ligante pode reter ou aumentar a atividade, dando origem a uma eficácia superior em estudos de atividade.

[00157] Em uma modalidade, o domínio específico do antígeno de um CAR direcionado a um antígeno específico compreende um, dois ou todos os três vH (cadeia pesada) CDRs (isto é, vH-CDRl, vH-CDR2 e vH-CDR3) de uma ligação ao antígeno domínio listado aqui (Tabela 4), e / ou um, dois ou todos os três vL (cadeia leve) CDRs (isto é, vL-CDRl, vL-CDR2 e vL-CDR3) de um domínio de ligação ao antígeno listado aqui (Tabela 4).

[00158] Em outra modalidade, o domínio específico do antígeno compreende um anticorpo humanizado ou um fragmento de anticorpo.

[00159] Em algumas modalidades, o domínio específico do antígeno do CAR descrito aqui é um fragmento de anticorpo scFv. Em outras modalidades, o fragmento de anticorpo tem uma afinidade de ligação inferior ao antígeno em comparação com o anticorpo do qual é derivado, mas é funcional na medida em que oferece uma resposta biológica aplicada aqui. Em uma modalidade, uma molécula de CAR compreende um fragmento de anticorpo que tem uma afinidade de ligação KD de 10-4 M a 10-8 M, 10-5 M a 110-7 M, 10-6 M ou 10-8 M, para o antígeno alvo.

[00160] Em algumas modalidades, o domínio específico do antígeno CAR descrito aqui se liga a um peptídeo apresentado pelo MHC. Obtiveram-se anticorpos semelhantes a TCR direcionados a peptídeos derivados de antígenos virais ou tumorais no contexto do antígeno leucocitário humano (HLA) -A 1 ou HLA-A2. Por exemplo, o anticorpo do tipo TCR pode ser identificado a partir da triagem de uma biblioteca, como uma biblioteca exibida no fago scFv humano.

[00161] Em algumas modalidades, quando os CARs que compreendem fragmentos funcionais de anticorpos (incluindo fragmentos scFv), como aqui descritos, ligam o antígeno alvo, uma resposta biológica é induzida, tal como ativação de uma resposta imune, produção de citocinas, citotoxicidade e como,

96 / 308 como será entendido por um especialista na técnica.

[00162] Em algumas modalidades, os antígenos específicos para doenças que podem ser direcionados por CARs convencionais (por exemplo, CARs de segunda geração), CARs de próxima geração (por exemplo, zSIR, SIR, Ab-TCR, Tri-TAC, TFP etc.) e rTCR quando expresso sozinho ou com os módulos acessórios, como aqui descrito, incluem, mas não estão limitados a, qualquer um ou mais de CD5, CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (também referido como CD2 subconjunto 1, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24); BAFF-R, molécula-1 tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; MPL; variante III do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliósido G2 (GD2); gangliósido GD3 (aNeu5Ac (2-8) aNeu5Ac (2-3) bDGalp (1- 4) bDGlcp (l-l) Cer); Maturação de células B do membro da família de receptores de TNF (BCMA); Antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα-Ser / Thr)); antígeno de membrana específico da próstata (PSMA); Receptor receptor órfão 1 do tipo tirosina quinase (ROR1); FmsLike tirosina quinase 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expresso em leucemia aguda ou linfoma, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, Antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão de células epiteliais (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 do receptor da interleucina-13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-llRa); antígeno de células-tronco da próstata (PSCA); Protease Serine 21 (Testisin ou PRSS21); receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno embrionário específico de estágio 4 (SSEA-4); CD20; Receptor alfa de folato; Receptor tirosina-proteína quinase ERBB2 (Her2 / neu); Mucina 1, associada à superfície celular (MUC1); receptor do fator de crescimento epidérmico

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(EGFR); molécula de adesão de células neurais (NCAM); Prostase; fosfatase ácida prostática (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Ephrin B2; proteína alfa de ativação de fibroblastos (FAP); receptor do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (receptor IGF-I), anidrase carbônica IX (CAlX); Subunidade de Proteassoma (Prosome, Macropaina), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gpl00); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de agrupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo de oncogene viral de leucemia murina Abelson 1 (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor 2 de efrina tipo A (EphA2); Fucosyl GM1; molécula de adesão sialil Lewis (sLe); gangliósido GM3 (aNeu5Ac (2-3) bDClalp (1- 4) bDGlcp (1- 1) Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); gangliósido o-acetil-GD2 (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1 / CD248); marcador endotelial tumoral relacionado a 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor do hormônio estimulador da tireóide (TSHR); Receptor de classe C acoplado à proteína G, grupo 5, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberto do cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásico (ALK); Ácido polissiálico; específico da placenta 1 (PLAC1); porção hexassacárida da glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação da glândula mamária (NY-BR-1); uroplacina 2 (UPK2); Receptor celular 1 do vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, locus K 9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína da estrutura de leitura alternativa gama TCR (TARP); Proteína de tumor de Wilms (WT1); Antígeno 1 de câncer / testículo (NY-ES0-1); Antígeno 2 de câncer / testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 do esperma (SPA17); Família de Antígeno X, Membro IA (XAGEl); receptor 2 da superfície celular de ligação à angiopoietina (Tie 2);

98 / 308 antígeno-1 de testículo de câncer de melanoma (MAD-CT-1); antígeno-2 de testículo de câncer de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado com Fos; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; prosteína; sobrevivendo; telomerase; antígeno-1 de tumor de carcinoma da próstata (PCT A-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido por células T 1 (MelanA ou MARTI); Sarcoma de rato (Ras) mutante; transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT); pontos de corte de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, serina 2 (TMPRSS2) gene de fusão ETS); N-acetil glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa emparelhada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Cyclin Bl; v-myc mielocitomatose virai oncogene neuroblastoma homólogo derivado de neuroblastoma (MYCN); Membro da Família Ras Homolog C (RhoC); Proteína 2 relacionada com a tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1); ; CCCTC-Binding Factor (Zinc Finger Protein) -Like (BORIS ou Brother of the Regulator oflmprinted Sites), Antígeno de Carcinoma de Célula Escamosa Reconhecido por Células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína de ligação à proacrosina sp32 (OY- TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); renal ubíquo 1 (RUl); renal ubíquo 2 (RU2); legumain; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc do receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 da subfamília A do receptor semelhante a imunoglobulina de leucócitos (LILRA2); Membro da família f do tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A da família de domínio de lectina de tipo C 12 (CLEC12A); antígeno 2 de células estromais da medula óssea (BST2); O módulo do tipo EGF contendo o

99 / 308 receptor da hormona do tipo mucina 2 (EMR2); antígeno linfocitário 75 (LY75); Glypican-3 (GPC3); Semelhante ao receptor Fc 5 (FCRL5); e polipeptídeo tipo lambda de imunoglobulina 1 (IGLLl), MPL, Biotina, epítopo Tag c-MYC, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalpha4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialil Lewis) Fucosyl- GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276 / B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, ALK TCRgamma-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), CSPG4- HMW-MAA, Tim1- / HRAA -CSFR-alfa), TGFbetaR2, VEGFR2 / KDR, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR-beta2, cadeia TCR-gama, cadeia TCR-delta, FITC, receptor do hormônio de leutenização (LHR), receptor do hormônio folículo estimulante (FSHR), Receptor de hormônio de gonadotrofina coriônica (CGHR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, hemaglutinina (HA) de influenza A, GAD, PDL1, Guanylyl ciclase C (GHCC) Proteína -K8.1, proteína KSHV-gH, autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), autoanticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA- DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, fator de tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, claudin18.2 (CLD18A2 OR CLDN18A.2), P-glycoprotein, STEAP1, LIV1, NECTIN-4, CRIPTO, MPL, GPA33, BST1 / CD157, canal de cloreto de baixa condutância, Integrin B7, Muc17, C16ORF54, VISTA, Muc5Ac, FCRH5, CLDN6, MMP16, UPK1B, BMPR1B, Ly6E, WISP1 e SLC34A2.

[00163] Em algumas modalidades, os antígenos associados ou específicos para uma doença que pode ser direcionada pelos CARs, quando expressos sozinhos ou com os módulos acessórios aqui descritos, incluem, mas não estão limitados a, qualquer um ou mais de 4 -1BB, 5T4, antígeno de adenocarcinoma, alfa-fetoproteína, BAFF, célula de linfoma B, antígeno C242, CA-125, anidrase carbônica 9 (CA-IX), C-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 ( receptor de IgE), CD28, CD30 (TNFRSF8),

100 / 308 CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CD123, CEA, CNTO888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, fibronectina extra domínio-B, receptor de folato 1, GD2, gangliósido GD3, glicoproteína 75, GPNMB, HER2 / neu, HGF, receptor quinase do receptor do fator de dispersão humano, receptor IGF-1, IGF-I, IgG1, L1- CAM, IL-13, IL-6, receptor do fator de crescimento semelhante à insulina I, integrina α5β1, integrina αvβ3, LAMP1, MORAb-009, MS4A1, MUC1, mucina CanAg, ácido N-glicolilneuramínico, NPC-1C, PDGF-R α, PDL192, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, RANK L, RON, ROR1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, tenascina C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígeno tumoral CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina e combinações dos mesmos. Outros antígenos específicos para o câncer serão evidentes para aqueles versados na técnica e podem ser usados em conexão com modalidades alternativas da divulgação.

[00164] Em algumas modalidades, os antígenos associados ou específicos para o câncer que podem ser direcionados pelos CARs, quando expressos sozinhos ou com os módulos acessórios aqui descritos, incluem, mas não estão limitados a, qualquer um ou mais de BCMA, FLT3, CD19, CD20 ( MS4A1), CD22, STEAP1, CD79b, Integrina B7, Her2, Her3, Liv1, TSHR (receptor de hormônio estimulador da tireóide), PSMA, MSLN (mesotelina), EGFRviii, nectina 4, receptor de prolactina (PRLR), Muc17, Muc5Ac, CD70, CD179b, CDH19, CD16ORF54, VISTA (receptor imunorregulador V-set ou VSIR), GPC3 (glypican 3), DLL3 (delta como ligante Notch canônico 3), PTK7, FCRH5 (receptor Fc como 5), LYPD1 (Domínio LY6 / PLAUR contendo 1), EMR2 (receptor acoplado à proteína G de adesão E2 ou ADGRE2), gpNMB (glicoproteína nmb), proteína de dedo anelar 43 (RNF43), Robo4, CEA, Her3, receptor de folato 1 (FOLR1), CLDN6 (Claudin 6), MMP16 (matriz metalopeptidase 16), uroplakin 1B (UPK1B), receptor de proteína morfogenética óssea tipo 1B (BMPR1B), Ly6E, WISP1, SLC34A2,

101 / 308 Cripto, gpA33, ROR1, CLL1, IL1RAP, BST1, CD133 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os domínios específicos do antígeno dos CARs são específicos para BCMA, FLT3, CD19, CD20 ( MS4A1), CD22, STEAP1, CD79b, Integrina B7, Her2, Her3, Liv1, TSHR (receptor de hormônio estimulador da tireoide), PSMA, MSLN (Mesotelina), EGFRviii, Nectina 4, Receptor de Prolactina (PRLR), Muc17, Muc5Ac, CD70, CD179b, CDH19, CD16ORF54, VISTA (receptor imunorregulador V-set ou VSIR), GPC3 (glypican 3), DLL3 (delta like canonical Ligante Notch 3), PTK7, FCRH5 (receptor Fc como 5), LYPD1 (domínio LY6 / PLAUR contendo 1), EMR2 (receptor acoplado à proteína G de adesão E2 ou ADGRE2), gpNMB (glicoproteína nmb), proteína de dedo anelar 43 (RNF43), Robo4, CEA, Her3, receptor de folato 1 (FOLR1), CLDN6 (Claudin 6), MMP16 (metalopeptidase de matriz 16), uroplacina 1B (UPK1B), receptor de proteína morfogenética óssea tipo 1B (BMPR1B), Ly6E, WISP1, SLC34A2, Cripto, gpA33, ROR1, CLL1, IL1RAP, BST1 e CD133. Em algumas modalidades, os domínios específicos do antígeno dos CARs compreendem sequências de scFv cujas SEQ IDs são apresentadas na Tabela 3. Em algumas modalidades, os domínios específicos do antígeno dos CARs compreendem sequências de CDR cujas SEQ ID s são apresentadas na Tabela 4.

[00165] Em várias modalidades, as células imunes que expressam CARs, tanto CARs convencionais quanto de próxima geração (por exemplo, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), compreendendo esses domínios de ligação ao antígeno podem ser geradas e usadas para terapia com células adotivas para câncer, doenças infecciosas e imunológicas usando métodos conhecidos na técnica e métodos descritos em PCT / US2017 / 024843, WO 2014/160030 A2, WO 2016/187349 A1, PCT / US2016 / 058305 e PCT / US17 / 64379, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[00166] Um CAR (por exemplo, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, Tri-TAC, TFP e semelhantes) quando usado sozinho ou com módulos acessórios, como

102 / 308 aqui descrito, pode compreender um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) que se liga a um antígeno de suporte de doença (por exemplo, um antígeno de suporte de doença como aqui descrito). Em algumas modalidades, o antígeno de suporte de doença é um antígeno presente em células que suportam a sobrevivência e proliferação de células causadoras de doenças. Em algumas modalidades, o antígeno de suporte da doença é um antígeno presente em uma célula estromal ou uma célula supressora derivada de mieloide (MDSC). As células do estroma podem secretar fatores de crescimento e citocinas para promover a proliferação celular no microambiente. As células MDSC podem bloquear a proliferação e ativação de células T. Sem desejar ser limitado pela teoria, em algumas modalidades, as células expressando CAR (por exemplo, CARII, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) destroem as células de suporte da doença, bloqueando indiretamente o crescimento ou a sobrevivência da doença causadora células.

[00167] Em algumas modalidades, o antígeno de células do estroma é selecionado de um ou mais dos seguintes: antígeno de células do estroma da medula óssea 2 (BST2), proteína de ativação de fibroblastos (FAP) e tenascina. Nas modalidades, o antígeno MDSC é selecionado de um ou mais dentre: CD33, CDllb, C14, CD15 e CD66b. Por conseguinte, em algumas modalidades, o antígeno de suporte da doença é selecionado a partir de um ou mais dos seguintes: antígeno de células estromais da medula óssea 2 (BST2), proteína de ativação de fibroblastos (FAP) ou tenascina, CD33, CDllb, C14, CD15 e CD66b.

[00168] Em outra modalidade, a região do CAR (por exemplo, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que é específica para cada antígeno pode compreender um fragmento variável de cadeia única divalente (ou bivalente) (di-scFvs, bi-scFvs). Em algumas modalidades, CARs (por exemplo, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreendendo pelo menos duas regiões de direcionamento específicas do antígeno expressariam dois

103 / 308 scFvs específicos para cada um dos dois antígenos. O ASD resultante é unido ao domínio co-estimulador e ao domínio de sinalização intracelular por meio de uma região de dobradiça e um domínio transmembranar. Um CAR exemplar (um zSIR) direcionado a dois antígenos é representado por SEQ ID NO: 3962 e tem como alvo CD19 e CD123.

[00169] Em uma modalidade adicional, cada ASD do CAR compreende um diabody.

[00170] Em algumas modalidades, o CAR ASD (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreende fragmentos de VL cujas SEQ IDs e antígenos alvo estão listados na Tabela 3.

[00171] Em algumas modalidades, o CAR ASD (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreende fragmentos VH cujas SEQ IDs e antígenos alvo estão listados na Tabela 3.

[00172] Em algumas modalidades, o CAR ASD (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreende scFvs cujos SEQ IDs e antígenos alvo estão listados na Tabela 3.

[00173] Em uma modalidade, um domínio de antígeno específico do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno, por exemplo, CDRs, de fragmentos vL e vH direcionados a este antígeno cujas SEQ IDs estão listadas na Tabela 4.

[00174] Em uma modalidade, um domínio específico do antígeno CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno, por exemplo, por exemplo, CDRs, a partir dos fragmentos scFvs vL e vH direcionados a este antígeno cujas SEQ IDs estão listadas nas Tabelas 4.

[00175] Em algumas modalidades, o CAR ASD (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreende fragmentos VHH (nanocorpos).

104 / 308

[00176] Em uma modalidade, um domínio de antígeno específico de um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno de um andaime que não é baseado em uma imunoglobulina direcionada a este antígeno.

[00177] Em uma modalidade, um domínio específico do antígeno CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno de um receptor para ligação a este antígeno alvo.

[00178] Em uma modalidade, um domínio de ligação ao antígeno CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno de um ligante conhecido por se ligar a este antígeno alvo.

[00179] A divulgação demonstra que os CARs direcionados ao mesmo antígeno podem ter diferentes propriedades biológicas, dependendo do epítopo particular do antígeno ao qual se ligam. Assim, dois CARs direcionados a CD19 (por exemplo, SEQ ID NO: 916 e 818) podem ter diferentes propriedades biológicas (por exemplo, citotoxicidade, proliferação ou secreção de citocinas, etc.), dependendo dos diferentes epítopos de CD19 aos quais se ligam. Em uma modalidade, a divulgação fornece CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que se ligam ao mesmo epítopo nos diferentes alvos listados nas Tabelas 3 como qualquer um dos CARs da divulgação (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que têm a capacidade de concorrência cruzada para vincular a diferentes alvos com qualquer um dos CARs da divulgação. Em algumas modalidades, os domínios específicos do antígeno desses CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) podem ser derivados de fragmentos vL, fragmentos vH ou fragmentos de anticorpo scFv. Em algumas modalidades, os anticorpos de referência para estudos de competição cruzada para determinar o epítopo alvo reconhecido por um CAR (por exemplo,

105 / 308 CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são scFvs que têm como alvo aqueles antígenos e tendo sequências como mostrado em SEQ ID NOs: 4266-4338, 9693-9722 e 11468-11470 (Tabela 3). Em uma modalidade exemplar, o scFv BCMA-Am14-HL de referência representado pela SEQ ID NO: 4266 pode ser usado em estudos de competição cruzada para determinar o epítopo alvo reconhecido por CARs baseados em BCMA-Am14- HL e espinha dorsal da divulgação. Em algumas modalidades, os CARs de referência para estudos de competição cruzada contra diferentes alvos são CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) cujas SEQ IDs são mostradas na Tabela 7.

[00180] Em uma modalidade exemplar, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de CD19 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são scFvs tendo sequências conforme mostrado em SEQ ID NOs: 4269-4270, 4272, 4298, 4299, 4338, 14462 (Tabela 3).

[00181] Em uma modalidade exemplar, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a CD19 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são CARs tendo sequências como mostrado em SEQ ID NOs: 4830-4871, 4781-4829, 4872-4920, 4732-4780, 4683-4731, 4970-5018 e 4921-4969 (Tabela 7).

[00182] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de CD20 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são scFvs direcionados a CD20 e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 3.

[00183] Em uma modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos

106 / 308 CARs-alvo de CD20 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são CARs que visam CD20 e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 7.

[00184] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de CD22 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são scFvs direcionados a CD20 e tendo SEQ IDs 14449-14458, 14460, 14469-70 conforme listado na Tabela 3.

[00185] Em uma modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a CD22 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são CARs direcionados a CD22 e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 7.

[00186] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de BAFF-R (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e o semelhante) da divulgação são scFvs direcionados a BAFF- R e tendo SEQ IDs: 14465-14467 conforme listado na Tabela 3.

[00187] Em uma modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de BAFF-R (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e o semelhante) da divulgação são CARs direcionados a BAFF- R e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 7.

[00188] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada contra CARs direcionados a DLL3 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são scFvs direcionados a DLL3 e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 3.

[00189] Em uma modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada contra CARs direcionados a DLL3 (por exemplo, CAR I,

107 / 308 CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são CARs direcionados a DLL3 e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 7.

[00190] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada contra CARs direcionados a PTK7 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são scFvs direcionados a PTK7 e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 3.

[00191] Em uma modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada contra CARs direcionados a PTK7 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são CARs direcionados a PTK7 e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 7.

[00192] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos por CARs de direcionamento MSLN (mesotelina) (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e o como) da divulgação são scFvs direcionados a MSLN e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 3.

[00193] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de MSLN (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 4284-4285, 4293-4295, 9715 e 9716.

[00194] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados ao MSLN (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são CARs visando MSLN e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 7.

[00195] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos por CARs direcionados a Her2 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) de a divulgação são scFvs direcionados a Her2 e tendo SEQ IDs

108 / 308 conforme listado na Tabela 3.

[00196] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a Her2 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 4276-

4279.

[00197] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a Her2 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são Her2-CARs com SEQ ID NOs: 6244- 6292, 6391-6439, 6342-6390 e 6293-6341 (Tabela 7).

[00198] Em uma modalidade, o scFv de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos por CARs direcionados a TSHR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) de a divulgação é scFv direcionado para TSHR e tendo SEQ ID: 4280 conforme listado na Tabela 3.

[00199] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de TSHR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são TSHR-CARs com SEQ ID NOs: 7567-7615 (Tabela 7).

[00200] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos por CARs de direcionamento a EGFRviii (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) de a divulgação são scFvs direcionados a EGFRviii e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 3.

[00201] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento EGFRviii (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR,

109 / 308 Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são EGFRviii-CARs com SEQ ID NOs: 5607-5655, 5705-5753, 5754-5802 e 5656-5704.

[00202] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos por PRLR (Receptor de Prolactina) - CARs de direcionamento (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são scFvs direcionados a PRLR (receptor de prolactina) e tendo SEQ IDs conforme listado na Tabela 3. Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a PRLR ( por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 4296 e 4309.

[00203] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de PRLR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são PRLR CARs com SEQ ID Nos: 7077-7125 e 7126-7174 conforme listado na Tabela 7.

[00204] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento PSMA (Antígeno de Membrana Específico da Próstata) (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 7273-7321, 7224- 7272 e 7175-7223) são os scFvs direcionados ao PSMA listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4281-4283). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos- alvo reconhecidos pelos CARs de PSMA (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 4281-4283.

[00205] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de

110 / 308 competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de PSMA (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são PSMA CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 7273-7321, 7224-7272 e 7175-7223).

[00206] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a DLL3 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são os scFvs direcionados a DLL3 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4290-4291).

[00207] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento do FOLR1 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 5999- 6047 e 6048-6096) são os scFvs direcionados ao FOLR1 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4323-4324). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos- alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de FOLR1 da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 5999-6047 e 6048-6096).

[00208] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de GPC3 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 6097- 6145 e 6146-6194) são os scFvs direcionados a GPC3 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4307-4308). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos- alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de GPC3 da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 6097-6145 e 6146-6194).

[00209] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos

111 / 308 CARs de direcionamento WISP1 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 7812- 7860 e 7861-7909) são os scFvs direcionados a WISP1 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4335 e 4336). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos- alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de WISP1 da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 7812-7860 e 7861-7909.

[00210] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de EMR2 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 5803- 5851, 5852-5900 e 5901-5949) são os scFvs direcionados a EMR2 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4313, 4314 e 4315). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de EMR2 da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 4803-5851, 585-5900, 5901- 5949

[00211] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento UPK1B (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 7616- 7664, 7665-7713) são os scFvs direcionados a UPK1B listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4328 e 4329). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos- alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a UPK1B da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 7616-7664, 7665-7713.

[00212] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de BMPR1B (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR,

112 / 308 zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 4536-4584, 4585-4633) são os scFvs direcionados a BMPR1B listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4330 e 4331). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de BMPR1B da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 4536-4584, 4585-4633.

[00213] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de BMPR1B (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são os CARs BMPR1B listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4536-4584, 4585-4633).

[00214] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a CDH19 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 5264- 5312, 5313-5361) são os scFvs direcionados a CDH19 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4302 e 4303). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos- alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a CDH19 da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 5264-5312, 5313-5361.

[00215] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a CDH19 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são os CARs CDH19 listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 5264-5312, 5313-5361).

[00216] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de segmentação VISTA da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 7763-7811, 7714-7762) são os VISTA- direcionamento de scFvs listados na

113 / 308 Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4305 e 4306). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a VISTA (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 7763-7811, 7714-7762.

[00217] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a VISTA (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são VISTA CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 7763-7811, 7714-7762).

[00218] Em outra modalidade, o scFv de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a IL13Ra2 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são IL13Ra2 scFv listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NO: 14448).

[00219] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a IL13Ra2 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são IL13Ra2 CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NO: 15857-15909).

[00220] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de FLT3 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 10606-10654, 10557-10605) são os scFvs direcionados a FLT3 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 9710 e 9711). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de FLT3 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da

114 / 308 divulgação são representados por SEQ ID NOs: 10557-10605, 10606-10654.

[00221] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a FLT3 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são FLT3 CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 10557-10605, 10606-10654).

[00222] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento CLDN6 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 5411- 5459, 5460-5508) são os scFvs direcionados a CLDN6 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4325 e 4326). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos- alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de CLDN6 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 5411-5459, 5460-5508.

[00223] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de segmentação CLDN6 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são CLDN6 CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 5411-5459, 5460-5508).

[00224] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento ROBO4 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 7420- 7468) são os scFvs direcionados a ROBO4 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4320). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a ROBO4 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-

115 / 308 TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 7420-7468.

[00225] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a ROBO4 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são ROBO4 CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 7420-7468).

[00226] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados de IL1RAP (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 10802- 10850, 10851-10899, 10900-10948) são os scFvs direcionados a IL1RAP listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 9712, 9713 e 9714). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a IL1RAP (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 10802-10850, 10851-10899, 10900-10948.

[00227] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a IL1RAP (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são IL1RAP CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 10802-10850, 10851-10899, 10900-10948).

[00241] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados de CD22 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 5068- 5115, 10361-10409) são os scFvs direcionados a CD22 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4271, 9693, 12502). Em uma modalidade, os

116 / 308 scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de CD22 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 5068-5115, 10361-10409.

[00228] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a CD22 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são CD22 CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 5068-5115, 10361-10409).

[00229] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de CLL1 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 10459-10507, 10410-10458) são os scFvs direcionados a CLL1 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 9708 e 9703). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de CLL1 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 10410-10458, 10459-10507.

[00230] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a CLL1 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são CLL1 CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 10410-10458, 10459-10507).

[00231] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de BST1 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 10116-10164, 10165-10212, 10213-10262) são os scFvs direcionados a BST1

117 / 308 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 9718, 9719 e 9720). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de BST1 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 10116-10164, 10165- 10212, 10213-10262.

[00232] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de BST1 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são BST1 CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 10116-10164, 10165-10212, 10213-10262).

[00233] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados de NECTIN-4 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e o semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 7028-7076, 11096-11242) são os scFvs direcionados a NECTIN-4 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 4292, 9696). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a NECTIN-4 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) de a divulgação é representada por SEQ ID NOs: 7028-7076, 11096-11242.

[00234] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a NECTIN-4 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e o como) da divulgação são os CARs NECTIN-4 listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 7028-7076, 11096-11242).

[00235] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a GPA33 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-

118 / 308 TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 10655- 10703) são os scFvs direcionados a GPA33 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 9698). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a GPA33 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 10655-10703.

[00236] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a GPA33 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são os CARs GPA33 listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 10655-10703).

[00237] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de ROR1 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 11145-11193) são os scFvs direcionados a ROR1 listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 9699). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento de ROR1 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 11145-11193.

[00238] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a ROR1 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são ROR1 CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 11145-11193).

[00239] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos

119 / 308 CARs de direcionamento CRIPTO (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação (por exemplo, SEQ ID NOs: 10508-10556) são os scFvs direcionados a CRIPTO listados na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 9697). Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento CRIPTO (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são representados por SEQ ID NOs: 10508-10556.

[00240] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs de direcionamento CRIPTO (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação são CRIPTO CARs listados na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 10508-10556).

[00241] Em algumas modalidades, dois ou mais domínios funcionais dos CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), conforme descrito neste documento, são separados por um ou mais ligantes. Ligantes são oligo- ou polipeptídeos de região de cerca de 1 a 100 aminoácidos de comprimento, que ligam qualquer um dos domínios / regiões do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação. Em algumas modalidades, os ligantes podem ter, por exemplo, 5-12 aminoácidos de comprimento, 5-15 aminoácidos de comprimento ou 5-20 aminoácidos de comprimento (ou qualquer número inteiro entre eles). Os ligantes podem ser compostos de resíduos flexíveis como glicina e serina, de modo que os domínios de proteína adjacentes sejam livres para se mover um em relação ao outro. Ligantes mais longos, por exemplo aqueles com mais de 100 aminoácidos, podem ser usados em conexão com modalidades alternativas da divulgação e podem ser selecionados para, por exemplo, garantir que dois domínios adjacentes não interfiram estericamente um com o outro. As SEQ ID Nos de vários ligantes exemplares estão listadas

120 / 308 na Tabela 5 (ver, por exemplo, SEQ ID Nos: 4007 a 4012).

[00242] Em algumas modalidades, os CARs (que fazem parte dos estrutura principais) aqui descritos compreendem uma região de dobradiça entre o domínio específico do antígeno e o domínio transmembrana. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende qualquer um ou mais de CD8α humano ou um fragmento Fc de um anticorpo ou um equivalente funcional, fragmento ou derivado do mesmo, uma região de dobradiça de CD8α humano ou um anticorpo ou um equivalente funcional, fragmento ou derivado do mesmo, uma região CH2 de um anticorpo, uma região CH3 de um anticorpo, uma sequência espaçadora artificial e suas combinações. Em modalidades exemplares, a região de dobradiça compreende qualquer um ou mais de (i) uma dobradiça, região CH2 e CH3 de IgG4, (ii) uma região de dobradiça de IgG4, (iii) uma dobradiça e região de CH2 de IgG4, (iv) a região dobradiça de CD8α, (v) uma dobradiça, região CH2 e CH3 de IgG1, (vi) uma região dobradiça de IgG1, (vi) uma dobradiça e região CH2 de IgG1, ou (vii) combinações das mesmas.

[00243] Conforme descrito neste documento, os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) (que fazem parte dos estrutura principais) descritos neste documento compreendem um domínio transmembrana. O domínio transmembranar pode compreender a sequência transmembranar de qualquer proteína que tenha um domínio transmembranar, incluindo qualquer proteína transmembranar do tipo I, tipo II ou tipo III. O domínio transmembrana do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação também pode compreender uma sequência hidrofóbica artificial. Os domínios transmembranares dos CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) aqui descritos podem ser selecionados de modo que o domínio transmembrana não dimerize. Em algumas modalidades, o CAR codificado por TMD (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreendendo

121 / 308 qualquer um dos estrutura principais aqui descritos compreende um domínio transmembrana selecionado a partir do domínio transmembrana de um alfa, cadeia beta ou zeta de um receptor de células T, CD3ε, CD3ζ, CD3γ, CD3δ, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp 46, NKG2D e / ou NKG2C.

[00244] Um domínio transmembrana pode incluir um ou mais aminoácidos adicionais adjacentes à região transmembrana, por exemplo, um ou mais aminoácidos associados com a região extracelular da proteína da qual a transmembrana foi derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 até 15 aminoácidos da região extracelular) e / ou um ou mais aminoácidos adicionais associados à região intracelular da proteína da qual a proteína transmembrana é derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 até 15 aminoácidos da região intracelular). Em um aspecto, o domínio transmembrana é contíguo com um dos outros domínios do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes). Em uma modalidade, o domínio transmembranar pode ser da mesma proteína da qual o domínio de sinalização, domínio coestimulador ou domínio de dobradiça é derivado. Em outro aspecto, o domínio transmembrana não é derivado da mesma proteína que qualquer outro domínio do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e

122 / 308 semelhantes) é derivado.

[00245] Conforme descrito neste documento, os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) (que fazem parte dos estrutura principais) descritos neste documento compreendem um domínio de sinalização intracelular. Este domínio pode ser citoplasmático e pode transduzir o sinal da função efetora e direcionar a célula para realizar sua função especializada. Exemplos de domínios de sinalização intracelular incluem, mas não estão limitados a, cadeia ζ do receptor de células T ou qualquer um de seus homólogos (por exemplo, cadeia η, cadeias FceRlv e β, cadeia MB1 (Iga), cadeia B29 (IgP), etc..), Polipeptídeos CD3 (Δ, δ e ε), tirosina quinases da família syk (Syk, ZAP 70, etc.), tirosina quinases da família src (Lck, Fyn, Lyn, etc.) e outras moléculas envolvidas na transdução de células T, como CD2, CD5 e CD28. O domínio de sinalização intracelular pode ser cadeia zeta de CD3 humana, FcyRIII, FcsRI, caudas citoplasmáticas de receptores Fc, motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptor (ITAM) contendo receptores citoplasmáticos ou combinações dos mesmos. Domínios de sinalização intracelular adicionais serão evidentes para aqueles versados na técnica e podem ser usados em conexão com modalidades alternativas da divulgação. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização de um ou mais de uma cadeia zeta CD3 humana, FcgRIII, FceRI, uma cauda citoplasmática de um receptor Fc, um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptor (ITAM) contendo receptores citoplasmáticos, e combinações dos mesmos.

[00246] Conforme descrito neste documento, os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) (que fazem parte dos estrutura principais) descritos neste documento compreendem um domínio coestimulador. Em modalidades exemplares, o domínio co-estimulador compreende um domínio de sinalização de qualquer um ou mais dentre CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1,

123 / 308 Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 e combinações dos mesmos.

[00247] Ligantes cliváveis, conforme descrito neste documento, incluem ligantes 2A (por exemplo T2A), ligantes tipo 2A ou equivalentes funcionais dos mesmos e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os ligantes incluem o ligante picornaviral do tipo 2A, sequências CHYSEL de teschovírus porcino (P2A), vírus Thosea asigna (T2A) ou combinações, variantes e equivalentes funcionais dos mesmos. Em outras modalidades, as sequências de ligante podem compreender motivo Asp-Val / Ile-Glu-X-Asn- Pro-Gly (2A) -Pro (2B), que resulta na clivagem entre a glicina 2A e a prolina 2B. As sequências nucleicas de vários ligantes cliváveis exemplares são fornecidas em SEQ ID NO: 80 a SEQ ID NO: 85 e as sequências de aminoácidos de vários ligantes exemplares são fornecidas em SEQ ID NO: 4079 a SEQ ID NO: 4084. Outros ligantes serão aparentes para aqueles versados na técnica e podem ser usados em conexão com modalidades alternativas da divulgação. Em uma modalidade, um motivo Ser-Gly-Ser-Gly (SGSG) (SEQ ID NOs: 931-932 e SEQ ID NO: 4844-4845) também é adicionado a montante das sequências ligantes cliváveis para aumentar a eficiência da clivagem. Uma desvantagem potencial dos ligantes cliváveis é a possibilidade de que a pequena marca 2A deixada no final da proteína N- terminal pode afetar a função da proteína ou contribuir para a antigenicidade das proteínas. Para superar esta limitação, em algumas modalidades, um local de clivagem de furina (RAKR) (SEQ ID NO: 88-90 e 4087-4089) é adicionado a montante dos motivos SGSG para facilitar a clivagem do peptídeo 2A residual após a tradução. Em uma modalidade, ligantes cliváveis são colocados entre o polipeptídeo que codifica o CAR e o polipeptídeo que codifica os módulos acessórios. A clivagem no local do ligante clivável resulta na separação dos dois polipeptídeos.

[00248] "Módulos acessórios", conforme usado neste documento, referem-se a agentes que aumentam, reduzem ou modificam a atividade de

124 / 308 células T que expressam os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) ou reduzir a toxicidade associada aos CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) para que a resposta terapêutica dos CARs seja aprimorada. Um módulo acessório também pode aumentar a transferência de genes para e / ou a expressão do cassete que codifica CAR nas células alvo, por exemplo, uma célula imune efetora.

[00249] Em algumas modalidades, vetores que compreendem polinucleotídeos que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) podem compreender ainda polinucleotídeos que codificam proteínas de sinalização viral e celular que (i) estendem o vida útil das células T que expressam os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), (ii) estimular a proliferação de células T e / ou (iii) proteger as células T que expressam os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) de apoptose; (iv) aumentar o empacotamento, a transferência de genes e / ou a expressão de construtos CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes). Em modalidades exemplares, tais proteínas incluem, mas não estão limitadas a vFLIP-K13 (SEQ ID NO (DNA): 108; SEQ ID NO (PRT): 4107) do vírus do herpes associado ao sarcoma de Kaposi e HIV-1 Vif (SEQ ID NO: 118 e 4117).

[00250] Em uma modalidade, os vetores que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) codificam ainda mais vFLIP-K13. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos vFLIP-K13 é otimizada por códons. Um CAR exemplar (isto é, SIR) que coexpressa vFLIP K13 com códon otimizado é representado por SEQ ID NO:

14057. Em uma modalidade, os vetores que codificam CARs codificam ainda Vif do HIV-1. Em uma modalidade alternativa, os vetores que codificam CARs codificam ainda vFLIP K13 e HIV-1 Vif.

[00251] Em algumas modalidades, as moléculas acessórias são

125 / 308 codificadas por vetores que são distintos dos vetores que codificam pelos CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) aqui descritos. Em algumas modalidades, as células efetoras compreendendo vetores que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) também compreendem vetores que codificam moléculas acessórias. Em algumas modalidades, as moléculas acessórias são codificadas pela modificação do locus genômico que codifica a proteína endógena correspondente.

[00252] Em algumas modalidades, os vetores que compreendem polinucleotídeos que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreendem ainda polinucleotídeos que codificam siRNA ou scFv específico para citocinas. Em modalidades exemplares, as citocinas são qualquer um ou mais de IL-10, IL-6, IFN ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) são co-expressos com um fragmento de anticorpo biespecífico secretado que se liga ao receptor de IL6 α e albumina de soro humano. Em algumas modalidades, os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) são co- expressos com um fragmento scFv secretado que se liga a IL6. Em algumas modalidades, os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) são coexpressos com o peptídeo FX06 de modo a mitigar vazamento capilar associado à terapia CAR.

[00253] Em outras modalidades, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreendem ainda polinucleotídeos que codificam siRNA ou uma nuclease que visa o TCR-α endógeno, TCR -β, TCR- γ, TCR-delta, CD3gama, CD3zeta, CD3épsilon, CD3-delta. Em outras modalidades, os polinucleotídeos que codificam siRNA ou uma nuclease direcionada ao TCR-α, TCR-β, TCR-γ, TCR-delta, CD3gamma, CD3zeta,

126 / 308 CD3épsilon, CD3-delta são codificados por vetores outros que não os que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes).

[00254] Em outras modalidades, os vetores que compreendem polinucleotídeos que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreendem ainda polinucleotídeos que codificam um marcador selecionável. Em uma modalidade exemplar, o marcador selecionável pode codificar um gene de resistência a drogas, como o gene que confere resistência a inibidores de puromicina ou calcineurina (por exemplo, CNB30). Em algumas modalidades, o marcador selecionável pode codificar para domínios extracelulares e transmembranares de CD30, CD20, CD19 humano (SEQ ID NO: 96 e 4095), BCMA (SEQ ID NO: 97 e 4096), EGFR (SEQ ID NO: 95 e 4094), CD34, ou qualquer proteína ou fragmento de proteína que é expresso na superfície celular e pode ser reconhecido por um anticorpo que pode ser usado para eliminar células que expressam seu antígeno alvo. Em uma modalidade exemplar, cetuximabe, um monoclonal anti-EGFR é usado para eliminar células que expressam CAR da divulgação que coexpressam um EGFR truncado. Os marcadores selecionáveis podem ser usados para enriquecer células que expressam o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), para selecionar células que expressam altos níveis de CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) e / ou para reduzir a diversidade clonal das células que expressam o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes). Em outras modalidades, os polinucleotídeos que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) podem codificar para tags de epítopo (por exemplo, tag Myc) que são expressos no domínio extracelular dos CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) e pode ser usado para enriquecer para células que expressam o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR,

127 / 308 Ab-TCR, TFP e semelhantes), para selecionar células que expressam altos níveis de CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) e / ou para reduzir a diversidade clonal das células que expressam o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes). A redução da diversidade clonal de células T alogênicas que expressam os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), por sua vez, levará à redução da incidência de Doença de Enxerto contra Hospedeiro (GVHD), desse modo permitindo o uso de células T alogênicas para terapia com células CAR-T.

[00255] Deve-se notar que os módulos acessórios são opcionais para a atividade de um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes). O polipeptídeo e polinucleotídeos de uma série de CAR exemplares (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) construtos (ou seja, estrutura principais) na Tabela 6 e na Tabela 7 contêm módulos acessórios, como PAC, K13 e / ou hNEMO-K277A-Flag. Em modalidades alternativas da divulgação, esses construtos CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) podem ser usados sem a presença dos módulos acessórios e do liner clivável interveniente (por exemplo, P2A ou F2A ou T2A).

[00256] Em certas modalidades, a divulgação fornece uma nova plataforma de receptores imunes sintéticos, designados zSIRs, contendo duas cadeias de CD3z. As sequências de ácido nucleico das cadeias CD3z que podem ser usadas na construção de zSIR são fornecidas em SEQ ID NO: 67 e

71. As sequências de aminoácidos correspondentes são fornecidas em SEQ ID NO: 4066 e 4070, respectivamente. A divulgação prevê que o fragmento vL de um anticorpo pode ser unido a uma das duas cadeias CD3z e o fragmento vH pode ser unido à outra cadeia CD3z. Quando as duas dessas cadeias (por exemplo, vL-CD3z e vH-CD3z) são co-expressas na mesma célula, os fragmentos vL e vH podem ligar seu antígeno cognato e transmitir um sinal de

128 / 308 célula T. Em particular, as células T que expressam tal zSIR quando expostas a uma linha celular que expressa o antígeno alvo cognato podem ativar a sinalização de NFAT, induzir a produção de IL2, promover a proliferação de células T, promover a ativação de células T e exercer citotoxicidade. A expressão e a atividade do zSIR podem ser ainda aumentadas pela incorporação de um ligante entre os fragmentos vL / vH e CD3z. Em particular, os domínios IgCL (SEQ ID NO (DNA): 28 e SEQ ID NO (PRT): 4027) e IgCH (SEQ ID NO (DNA): 29 e SEQ ID NO (PRT): 4028) derivados de anticorpos servem como ligantes úteis entre os fragmentos vL / vH e CD3z.

[00257] Em outra modalidade, um domínio coestimulador também é incorporado na (s) cadeia (s) CD3z de zSIR. Domínios coestimulatório exemplares incluem domínios coestimulatório de 41BB e CD28. As cadeias de CD3z contendo domínios coestimulatório de 41BB e CD28 são apresentadas em SEQ ID NO: 4076, 4078 e 4075, 4077, respectivamente (Tabela 5). Coletivamente, os resultados acima fornecem uma nova plataforma para terapia celular adotiva que supera algumas das limitações de design de SIR e também fornece uma abordagem complementar para SIRs.

[00258] As duas cadeias de zSIRs aqui descritas podem ser codificadas por uma única cadeia polinucleotídica e traduzidas em uma única cadeia polipeptídica, que é subsequentemente clivada em proteínas diferentes. As duas cadeias de zSIRs aqui descritas podem ser expressas usando dois promotores distintos e codificadas por duas cadeias polinucleotídicas separadas. As duas cadeias de zSIRs aqui descritas podem ser codificadas por um único vetor. As duas cadeias de zSIRs aqui descritas podem ser codificadas por dois vetores diferentes. A molécula de ácido nucleico que codifica um zSIR pode compreender uma ou mais sequências líder (também conhecido como um peptídeo sinal). Em uma modalidade, cada unidade funcional (por exemplo, um domínio de ligação de antígeno unido a uma cadeia de CD3z mais um ligante clivável de Furina-SGSG) de um zSIR pode ser precedido por uma sequência

129 / 308 líder que direciona o zSIR para a superfície da célula como uma transmembrana tipo I proteína. Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno de zSIR está voltado para o extracelular. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende a sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 4 e as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 4000 a SEQ ID NO:

4003. Em algumas modalidades, as sequências curtas de ácido nucleico (3- 9 ácidos nucleicos) compreendendo locais de enzimas de restrição estão localizados entre as diferentes subunidades de um zSIR, por exemplo, entre uma sequência de sinal e o domínio de ligação ao antígeno do zSIR ou entre a ligação ao antígeno e a cadeia CD3z.

[00259] São fornecidos aqui um ou mais polipeptídeos codificados por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam CARs 1 a 15 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) (Tabela 1) ou qualquer um ou mais dos estrutura principais 1-60 aqui descritos (Tabela 2).

[00260] Em algumas modalidades, o domínio específico do antígeno dos CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) é específico para um, dois, três ou mais antígenos no alvo células, como células cancerosas. Conforme descrito neste documento, em algumas modalidades, cada componente do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) é contíguo e no mesmo quadro de leitura com os outros componentes do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes). Em algumas modalidades, se o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreendendo a estrutura principal compreende mais de um domínio específico do antígeno, cada um dos domínios específicos do antígeno são contíguos e no mesmo quadro de leitura que os outros domínios específicos do antígeno no mesmo CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes).

[00261] Também são fornecidos aqui um ou mais polipeptídeos codificados por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a

130 / 308 espinha dorsal-1 compreendendo CAR I e K13-vFLIP, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, o domínio específico do antígeno do CAR que compreende a espinha dorsal-1 é específico para um, dois, três ou mais antígenos em células alvo, como células cancerosas. Conforme descrito neste documento, em algumas modalidades, cada componente do CAR é contíguo e no mesmo quadro de leitura com os outros componentes do CAR que compreende o estrutura principal-1. Em algumas modalidades, o CAR que compreende a espinha dorsal-1 compreende mais de um domínio específico do antígeno, cada um dos domínios específicos do antígeno são contíguos e no mesmo quadro de leitura que os outros domínios específicos do antígeno no mesmo CAR.

[00262] Também são fornecidos neste documento um ou mais polipeptídeos codificados por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a espinha dorsal-8, que compreende CAR II (CAR 2) e HIV-1 Vif, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, o domínio específico do antígeno do CAR que compreende a espinha dorsal-8 é específico para um, dois, três ou mais antígenos em células alvo, como células cancerosas. Conforme descrito neste documento, cada componente do CAR é contíguo e está no mesmo quadro de leitura com os outros componentes do CAR. Em algumas modalidades, no CAR que compreende o estrutura principal-8 compreende mais de um domínio específico do antígeno, cada um dos domínios específicos do antígeno são contíguos e no mesmo quadro de leitura que os outros domínios específicos do antígeno no mesmo CAR.

[00263] Em várias modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, Tabela 1) ou parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, compreendem dois, três ou mais domínios específicos

131 / 308 de antígeno.

[00264] Em várias modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, Tabela 1) ou parte dos estrutura principais aqui descritos, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, compreendem dois, três ou mais domínios co-estimuladores.

[00265] Em várias modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, Tabela 1) ou parte dos estrutura principais aqui descritos, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, compreendem zero, um, dois, três ou mais domínios de sinalização intracelular.

[00266] Em várias modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, compreendem uma, duas, três ou mais proteínas de sinalização virais e / ou celulares.

[00267] As sequências de ácido nucleico que codificam para os componentes desejados dos CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) aqui descritas podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, rastreando bibliotecas de células que expressam a molécula de ácido nucleico, derivando a molécula de ácido nucleico de um vetor conhecido por incluir o mesmo, ou isolando diretamente de células e tecidos contendo o mesmo, usando técnicas padrão. Alternativamente, o ácido nucleico de interesse pode ser produzido sinteticamente, em vez de clonado.

132 / 308

[00268] Em algumas modalidades, são fornecidos aqui polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que fazem parte dos CARs 1 a 15 (consulte a Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que o domínio específico do antígeno dos CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) é específico para o alvo, conforme descrito na Tabela 3.

[00269] Em uma modalidade, um domínio específico do antígeno de um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno, por exemplo, CDRs, de fragmentos vL e vH direcionados a este antígeno cuja SEQ ID é mostrada nas Tabelas 3 e 4.

[00270] Em uma modalidade, um domínio específico do antígeno de um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno, por exemplo, CDRs, de fragmentos de vHH direcionados a este antígeno.

[00271] Em uma modalidade, um domínio específico do antígeno de um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno de uma não- imunoglobulina cadafalso visando este antígeno.

[00272] Em uma modalidade, um domínio específico do antígeno de um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno de um receptor conhecido por ligar este antígeno alvo.

[00273] Em uma modalidade, um domínio específico de ligação ao antígeno de um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno

133 / 308 de um ligante conhecido para ligar este antígeno alvo.

[00274] Em uma modalidade, um domínio específico do antígeno de um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno, por exemplo, CDRs, de fragmentos vL e vH de um scFV direcionado a este antígeno cuja SEQ ID é mostrada na Tabela 3. As SEQ ID NOs dos CDRs são mostradas na Tabela 4.

[00275] Em algumas modalidades, são fornecidos aqui polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, a Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que os domínios específicos do antígeno dos CARs são específicos para os alvos mostrados em Tabela 3.

[00276] Em algumas modalidades, são fornecidos aqui polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, a Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que os domínios específicos do antígeno dos CARs são específicos para CD19.

[00277] Em algumas modalidades, são fornecidos aqui polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, a Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que os domínios específicos do antígeno dos CARs são específicos para CD20.

134 / 308

[00278] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para CD22.

[00279] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para BCMA.

[00280] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para Integrina B7.

[00281] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para Her2.

[00282] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas

135 / 308 moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para TSHR.

[00283] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para PSMA.

[00284] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para MSLN.

[00285] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para EGFR viii.

[00286] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR

136 / 308 II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para DLL3.

[00287] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para Nectina-4.

[00288] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para o receptor de prolactina (PRLR)

[00289] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para Muc17.

[00290] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR

137 / 308 II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para CD70.

[00291] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para CDH19.

[00292] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para CD16ORF54.

[00293] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para VISTA.

[00294] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15

138 / 308 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para GPC3.

[00295] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para Muc5Ac.

[00296] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para FCRH5.

[00297] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para LYPD1.

[00298] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos

139 / 308 neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para EMR2.

[00299] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para gpNMB.

[00300] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para RNF43.

[00301] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para CD44v6.

[00302] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2,

140 / 308 estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para Robo4.

[00303] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para CEA.

[00304] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para Her3.

[00305] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para FOLR1.

[00306] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os

141 / 308 domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para CLDN6.

[00307] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para MMP16.

[00308] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para UPK1B.

[00309] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para BMPR1B.

[00310] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para Ly6E.

142 / 308

[00311] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para CD79b.

[00312] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para WISP1.

[00313] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para SLC34A2.

[00314] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para Liv1.

[00315] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas

143 / 308 moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para Cripto.

[00316] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para gpA33.

[00317] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para ROR1.

[00318] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para CLL1.

[00319] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR

144 / 308 II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para FLT3.

[00320] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para IL1RAP.

[00321] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para BST1.

[00322] Em algumas modalidades, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), que fazem parte dos CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, são fornecidos onde os domínios específicos do antígeno do CAR são específicos para CD133.

[00323] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios

145 / 308 específicos do antígeno são específicos para CD200R.

[00324] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para CD276.

[00325] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para CD324.

[00326] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para CS1.

[00327] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para ALK1.

[00328] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para ROR1.

[00329] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para CDH6

[00330] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para CDH16.

146 / 308

[00331] Em algumas modalidades, são fornecidos aqui polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que são parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CDH17.

[00332] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para o receptor de folato beta.

[00333] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para CLEC5A.

[00334] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para NY-ESO / MHC classe I complexo.

[00335] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para WT1 / MHC classe I complexo.

[00336] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para AFP / MHC de classe I complexo.

[00337] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para HPV16-E7 / MHC classe I

147 / 308 complexo.

[00338] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para gp100 / MHC classe I complexo.

[00339] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para hTERT / MHC de classe I complexo.

[00340] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para MART1 / MHC classe I complexo.

[00341] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para HTLV1-Tax / MHC classe I complexo.

[00342] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para PR1 / MHC classe I complexo.

[00343] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para HIV1-gag / MHC classe I complexo.

[00344] Em algumas formas de realização, são aqui proporcionados

148 / 308 poliptidos codificados pelos nucleicos As moléculas de ácido que codificam zSIRs que fazem parte de CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos para o antigénio são específicos para HIV-1-envelope gp120.

[00345] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para PTK7.

[00346] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para TROP2.

[00347] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para BAFF-R.

[00348] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para LAMP1.

[00349] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para Tim1.

[00350] Em algumas modalidades, são fornecidos aqui polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que são parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para TCR gama-delta.

[00351] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas

149 / 308 moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para a cadeia constante beta1 de TCR.

[00352] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para a cadeia constante beta2 de TCR.

[00353] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para GCC.

[00354] Em algumas modalidades, são fornecidos aqui polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que são parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para B7H4.

[00355] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para LHR.

[00356] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para Tn-Muc1.

[00357] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para TSLPR.

[00358] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs

150 / 308 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para o Fator de Tecido.

[00359] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para SSEA-4.

[00360] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para SLea.

[00361] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para Muc1 / MHC classe I complexo.

[00362] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para Muc16.

[00363] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para NYBR-1.

[00364] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para IL13Ra2.

[00365] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios

151 / 308 específicos do antígeno são específicos para IL11Ra.

[00366] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para L1CAM.

[00367] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para EpCAM1.

[00368] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para gpNMB.

[00369] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para GRP78.

[00370] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para GPC3.

[00371] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para GRPC5D.

[00372] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para GFRa4.

152 / 308

[00373] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para FITC.

[00374] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para CD79b.

[00375] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para Lym1.

[00376] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para Lym2.

[00377] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para CLD18A2.

[00378] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para o epítopo CD43 expresso na leucemia células.

[00379] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 são fornecidos aqui (ver, por exemplo, a Tabela 1), onde os domínios específicos do antígeno são específicos para CD179a.

153 / 308

[00380] Em algumas modalidades, os polipeptídeos são fornecidos neste documento que são codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1-6 (ver, por exemplo, a Tabela 1) ou fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como o estrutura principal-1, estrutura principal -2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60, onde o domínio de antígeno específico é conforme descrito na Tabela 3.

[00381] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) e / ou moléculas acessórias aqui descritas são fornecidas como um transcrito de RNA mensageiro (mRNA). Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico que codifica os CARs e / ou moléculas acessórias aqui descritas é fornecida como um construto de DNA.

[00382] Também são fornecidos vetores compreendendo os polinucleotídeos aqui descritos. Em algumas modalidades, os vetores são vetores virais. Exemplos de vetores virais incluem, mas não estão limitados a retrovírus, um adenovírus, um vírus adeno-associado, um lentivírus, um vírus da varíola, um vetor de vírus de herpes ou um vetor de transposon de beleza adormecida. Em várias modalidades, a divulgação inclui construtos de vetor retroviral e lentiviral que expressam o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) e as moléculas acessórias que podem ser transduzidas diretamente em uma célula.

[00383] A divulgação também inclui uma construção de RNA que pode ser transfectada diretamente para uma célula. Um método para gerar mRNA para uso em transfecção envolve a transcrição in vitro (IVT) de um modelo com primers especialmente concebidos, seguido pela adição de poliA, para produzir uma construção contendo a sequência não traduzida 3 'e 5' ("UTR") (por exemplo, um 3 'e / ou 5' UTR aqui descrito), um limite 5 '(por exemplo, um limite 5' aqui descrito) e / ou Local de entrada do ribossomo interno (IRES) (por exemplo, um IRES descrito aqui), o ácido nucleico a ser expressa, e uma

154 / 308 cauda poliA, tipicamente 50-2000 bases de comprimento. O RNA assim produzido pode transfectar com eficiência diferentes tipos de células. Em uma modalidade, o modelo inclui sequências para o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes). Em uma modalidade, um RNA CAR ou vetor CAR de próxima geração é transduzido em uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, por eletroporação. Em outra modalidade, um RNA CAR ou vetor CAR de próxima geração é transduzido em uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, causando perturbações transitórias na membrana celular usando um dispositivo de microfluido, conforme descrito no pedido de patente WO 2013/059343 A1 (PCT / US2012 / 060646). As sequências polinucleotídicas que codificam para as moléculas desejadas podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos na técnica, por exemplo, rastreando bibliotecas de células que expressam o gene, derivando o gene de um vetor conhecido por incluir o mesmo ou isolando-se diretamente das células e tecidos contendo o mesmo, usando técnicas padrão. Alternativamente, o gene de interesse pode ser produzido sinteticamente, em vez de clonado.

[00384] A divulgação também fornece vetores nos quais um DNA que codifica os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação é inserido. Os vetores derivados de retrovírus, como o lentivírus, são ferramentas adequadas para alcançar a transferência de genes de longo prazo, uma vez que permitem a integração estável e de longo prazo de um transgene e sua propagação em células-filhas. Os vetores lentivirais têm a vantagem adicional sobre os vetores derivados de onco- retrovírus, como os vírus da leucemia murina, em que podem transduzir células não proliferantes, como os hepatócitos. Vetores lentivirais exemplares são fornecidos nas SEQ ID NOs: 129-130 e 12639. Um vetor retroviral também pode ser, por exemplo, um vetor gama-retroviral. Um vetor gama-retroviral pode incluir, por exemplo, um promotor, um sinal de empacotamento (ψ), um

155 / 308 sítio de ligação do primer (PBS), uma ou mais (por exemplo, duas) repetições terminais longas (LTR) e um transgene de interesse, por exemplo, um gene que codifica um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes). Os vetores gammaretrovirais exemplares incluem Vírus da Leucemia Murina (MLV), Vírus Formador do Foco do Baço (SFFV) e Vírus do Sarcoma Mieloproliferativo (MPSV), e vetores derivados deles. Em outra modalidade, o vetor que compreende o ácido nucleico que codifica o CAR desejado (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação é um vetor adenoviral (A5 / 35).

[00385] A expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) é tipicamente alcançada ligando operacionalmente um ácido nucleico que codifica o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) polipeptídeo ou suas porções a um promotor e incorporar o construto em um vetor de expressão. O vetor lentiviral exemplar que codifica o CAR da divulgação é fornecido nas SEQ ID Nos: 12640-41 e 14378, 14380-85. Os vetores podem ser adequados para replicação e integração em eucariotos. Os vetores de clonagem típicos contêm terminadores de transcrição e tradução, sequências de iniciação e promotores úteis para a regulação da expressão da sequência de ácido nucleico desejada. O vetor pode conter um único promotor ou mais de um promotor. Em algumas modalidades, as duas ou mais unidades funcionais de um CAR (por exemplo, nucleotídeos que codificam duas unidades polipeptídicas funcionais de um SIR ou um zSIR ou um Ab-TCR) estão sob o controle de promotores separados. As construções de expressão da divulgação também podem ser usadas para imunização de ácido nucleico e terapia gênica, usando protocolos de entrega de genes padrão. Os métodos para entrega de genes são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466, incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

156 / 308

[00386] Métodos de clonagem e expressão serão evidentes para uma pessoa versada na técnica.

[00387] Métodos físicos para a introdução de polinucleotídeos em células hospedeiras, como transfecção de fosfato de cálcio e semelhantes, são bem conhecidos na técnica e serão evidentes para um versado na técnica. Em outra modalidade, um vetor CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) é transduzido em uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, causando perturbações transitórias em membrana celular usando um dispositivo de microfluido conforme descrito no pedido de patente WO 2013/059343 A1 (PCT / US2012 / 060646) e em Ding X et al., Nat. Biomédico. Eng. 1, 0039 (2017), os conteúdos de cada um dos quais são incorporados neste documento por referência em sua totalidade como se estabelecido neste documento.

[00388] Em várias modalidades, as células para modificações com CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) aqui descritas, incluindo células T ou células NK podem ser obtidas de um sujeito desejando terapia. As células T podem ser obtidas de uma série de fontes, incluindo células mononucleares de sangue periférico, medula óssea, tecido de nódulos linfáticos, sangue do cordão umbilical, placenta, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascite, derrame pleural, tecido do baço e tumores. As células T podem ser células T gama-delta residentes no tecido, que podem ser cultivadas e expandidas in vitro antes da expressão do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes).

[00389] Em um aspecto, a divulgação fornece uma série de CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreendendo um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, TCR ou fragmento de TCR) projetado para ligação específica a um antígeno associado a uma doença, por exemplo, um antígeno tumoral aqui descrito. Em um aspecto, a divulgação fornece uma célula

157 / 308 imunoefetora (por exemplo, célula T, célula NKT) projetada para expressar um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), em que o a célula imune efetora projetada exibe uma propriedade terapêutica. Em um aspecto, a divulgação fornece uma célula imunoefetora (por exemplo, célula T, célula NKT) projetada para expressar um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), em que o a célula imune efetora projetada exibe uma propriedade anticâncer. Em uma modalidade, uma célula é transformada com o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) e o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab -TCR, TFP e semelhantes) é expresso na superfície da célula. Em algumas modalidades, a célula (por exemplo, célula T, célula NKT) é transduzida com um vetor viral que codifica um CAR (por exemplo, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes). Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor retroviral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor lentiviral. Em algumas de tais modalidades, a célula pode expressar estavelmente o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes). Em outra modalidade, a célula (por exemplo, célula T, célula NKT) é transfectada com um ácido nucleico, por exemplo, mRNA, cDNA, DNA, que codifica um CAR ou CAR de próxima geração (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes). Em algumas de tais modalidades, a célula pode expressar transitoriamente o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes).

[00390] A divulgação fornece células efetoras imunológicas (por exemplo, células T, NKT ou células NK) que são projetadas para conter um ou mais CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que direcionam as células efetoras imunes para células doentes ou células associadas a doenças, como células cancerosas. Isto é conseguido através de um domínio de ligação ao antígeno no CAR (por exemplo, SIR, zSIR, Ab-TCR, Tri-Tac, TFP e semelhantes) que é específico para um antígeno

158 / 308 associado ao câncer. Existem duas classes de antígenos associados ao câncer (antígenos tumorais) que podem ser direcionados pelos CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, Tri-Tac, TFP e semelhantes) da divulgação: ( 1) antígenos associados ao câncer que são expressos na superfície das células cancerosas; e (2) antígenos associados ao câncer que por si só é intracelular, entretanto, um fragmento desse antígeno (peptídeo) é apresentado na superfície das células cancerosas por MHC (complexo principal de histocompatibilidade).

[00391] Além disso, a divulgação fornece células expressando CAR- (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) e seu uso em medicamentos ou métodos para tratar, entre outras doenças, o câncer ou qualquer doença maligna ou autoimune ou doença infecciosa ou doença degenerativa ou doença alérgica envolvendo células ou tecidos que expressam um antígeno tumoral ou antígeno associado a doença como aqui descrito.

[00392] Em um aspecto, a divulgação fornece uma célula efetora imune (por exemplo, célula T, NKT ou célula NK) projetada para expressar um CAR ou CAR de próxima geração (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes), em que a célula imune efetora projetada exibe uma propriedade anti-doença, tal como propriedade antitumoral. Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno associado ao câncer (isto é, antígeno tumoral) aqui descrito. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreende um fragmento de anticorpo parcialmente humanizado. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) compreende um scFv parcialmente humanizado. Por conseguinte, a divulgação fornece CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que compreende um domínio de ligação ao antígeno humanizado e é projetado em uma célula, por exemplo, uma célula T ou um NK celular e métodos de seu uso para terapia

159 / 308 adotiva.

[00393] São ainda fornecidas neste documento células geneticamente modificadas, compreendendo os polinucleotídeos e / ou o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) aqui descritos. Em algumas modalidades, a célula é um linfócito T (célula T). Em algumas modalidades, a célula é uma célula T naïve, uma célula T de memória central, uma célula T de memória efetora, uma célula T reguladora (Treg) ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a célula é uma célula assassina natural (NK), uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula- tronco embrionária ou uma célula-tronco pluripotente. As células geneticamente modificadas que podem compreender e expressar os CARs da divulgação incluem, mas não estão limitados a, linfócitos T (células T), células T virgens (TN), células T de memória (por exemplo, células T de memória central (TCM), células efetoras de memória (TEM)), células assassinas naturais, células-tronco hematopoiéticas e / ou células-tronco embrionárias / induzidas pluripotentes capazes de dar origem a uma progênie terapeuticamente relevante. Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas são células autólogas. Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas são células alogênicas. A título de exemplo, as células T individuais da divulgação podem ser CD4 + / CD8-, CD4- / CD8 +, CD4- / CD8- ou CD4 + / CD8 +. As células T podem ser uma população mista de células CD4 + / CD8- e CD4- / CD8 + ou uma população de um único clone. As células T CD4 + da divulgação podem produzir IL-2, IFN, TNF e outras citocinas efetoras de células T quando co-cultivadas in vitro com células que expressam os antígenos alvo (por exemplo, células tumorais CD20 + e / ou CD19 +). As células T CD8 + da divulgação podem lisar células alvo específicas do antígeno quando co-cultivadas in vitro com as células alvo. Em algumas modalidades, as células T podem ser qualquer uma ou mais das células naïve CD45RA + CD62L +, células de memória central CD45RO + CD62L +,

160 / 308 células de memória efetoras CD62L- ou uma combinação das mesmas (Berger et al., Transferência adotiva de T específico para vírus e tumor-específico imunidade celular, Curr Opin Immunol, 2009, 21 (2) 224-232). As células geneticamente modificadas podem ser produzidas por células de transfecção estável com DNA que codifica o CAR (por exemplo, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação.

[00394] As células geneticamente modificadas podem ser projetadas para eliminar a expressão das cadeias de TCR endógenas, por exemplo, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ ou cadeias pré-TCRα. O knock-out das cadeias endógenas de TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ ou pré-TCRα pode ser alcançado usando uma série de técnicas conhecidas na técnica, como o uso de nucleases CRISP / Cas9 e dedo de Zn. Em uma modalidade exemplar, gRNAs direcionados a loci TCRα e TCRβ podem ser introduzidos em células T ou iPSC ou células-tronco juntamente com mRNA Cas9 para nocautear a expressão de cadeias TCRα e TCRβ endógenas. Tais células knock-out de TCRα / β podem ser usadas para introduzir os CARs da divulgação. A célula T sem um TCR endógeno funcional pode ser projetada de modo que não expresse qualquer TCR endógeno funcional em sua superfície, por exemplo, projetada de modo que não expresse uma ou mais subunidades (por exemplo, cadeias constantes de TCRα endógeno, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ ou pré-TCRα) que compreendem um TCR endógeno funcional ou projetado de modo que produza muito pouco TCR endógeno funcional em sua superfície. Alternativamente, a célula T pode expressar um TCR endógeno substancialmente prejudicado, por exemplo, por expressão de formas mutadas ou truncadas de uma ou mais das subunidades do TCR. O termo "TCR substancialmente prejudicado" significa que este TCR não provocará uma reação imunológica adversa em um hospedeiro. Em uma modalidade, a célula T alogênica ou célula NKT alogênica carece de expressão ou tem baixa expressão de um TCR funcional e / ou um HLA funcional.

[00395] Vários métodos produzem transfectantes estáveis que

161 / 308 expressam os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação. Em uma modalidade, um método de transfecção e redirecionamento de células de forma estável é por eletroporação usando DNA nu. Usando DNA nu, o tempo necessário para produzir células redirecionadas pode ser significativamente reduzido. Métodos adicionais para manipular geneticamente células usando DNA nu que codifica o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação incluem, mas não estão limitados a, métodos de transformação química (por exemplo, usando fosfato de cálcio, dendrímeros, lipossomas e / ou polímeros catiônicos), métodos de transformação não química (por exemplo, eletroporação, transformação óptica, eletrotransferência de gene, perturbação transitória em membranas celulares e / ou entrega hidrodinâmica) e / ou métodos baseados em partículas ( por exemplo, impalefecção, usando uma arma genética e / ou magnetofecção). As células transfectadas que demonstram a presença de um único vetor não rearranjado integrado e a expressão do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) podem ser expandidas ex vivo. Em uma modalidade, as células selecionadas para expansão ex vivo são CD8 + e demonstram a capacidade de reconhecer e lisar especificamente células alvo específicas do antígeno.

[00396] Os métodos de transdução viral também podem ser usados para gerar células redirecionadas que expressam o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação. Os tipos de células que podem ser usados para gerar células geneticamente modificadas que expressam o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação incluem, mas não estão limitados a linfócitos T (T -células), células assassinas naturais, células-tronco hematopoiéticas e / ou células-tronco embrionárias / induzidas pluripotentes capazes de dar origem a uma progênie terapeuticamente relevante.

[00397] A estimulação das células T por um antígeno em condições

162 / 308 adequadas resulta na proliferação (expansão) das células e / ou produção de IL-

2. As células que compreendem o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) da divulgação irão se expandir em número em resposta à ligação de um ou mais antígenos ao direcionamento específico do antígeno regiões do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes). A divulgação também fornece um método de produção e expansão de células que expressam um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes). O método compreende a transfecção ou transdução das células com o vetor que expressa o CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) e estimular as células com células que expressam os antígenos alvo, antígenos alvo recombinantes, ou um anticorpo para o receptor para fazer com que as células proliferem, de modo a produzir e expandir as células T. Em uma modalidade, as células podem ser qualquer um ou mais dos linfócitos T (células T), células T assassinas naturais (NK), células-tronco hematopoiéticas (HSCs) ou células- tronco embrionárias / induzidas pluripotentes capazes de dar origem a terapeuticamente relevante progênie.

[00398] Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas aqui descritas expressam os vários estrutura principais aqui descritos, em que o componente CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) do estrutura principal determina o alvo especificidade com base no domínio específico do antígeno do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes).

[00399] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, a Tabela 1) que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que o domínio específico do antígeno dos CARs é específico para um antígeno alvo na Tabela 3 e / ou 7 e

163 / 308 compreende as sequências de domínio de ligação ao antígeno estabelecidas na Tabela 3 e / ou 7.

[00400] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para MPL.

[00401] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15, que fazem parte das estruturas aqui descritas, como a estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para MPL.

[00402] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CD19.

[00403] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam CARs 1 a 15 que fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para CD19.

[00404] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CD20.

[00405] [00419] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam CARs 1 a 15 que fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para CD20.

164 / 308

[00406] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para BCMA.

[00407] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal- 60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para BCMA.

[00408] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CD22.

[00409] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15, que fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para CD22.

[00410] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para BAFF-R.

[00411] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15, que fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para BAFF-R.

[00412] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que

165 / 308 fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal- 60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para Integrin B7.

[00413] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para Nectin 4.

[00414] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15, que fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para o receptor de prolactina.

[00415] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para Muc17.

[00416] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CD70.

[00417] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura

166 / 308 principal-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para CD70.

[00418] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para VISTA.

[00419] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para GPC3.

[00420] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam CARs 1 a 15 que fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para GPC3.

[00421] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para EMR2.

[00422] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15, que fazem parte das estruturas aqui descritas, como a estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para EMR2.

[00423] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios

167 / 308 específicos do antígeno são específicos para gpNMB.

[00424] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15, que fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para RNF43.

[00425] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para STEAP1.

[00426] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15, que fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para Robo4.

[00427] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CLDN6.

[00428] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CD44v6.

[00429] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-

168 / 308 60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para MMP16.

[00430] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15, que fazem parte das estruturas aqui descritas, como a estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para UPK1B.

[00431] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal- 60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para BMPR1B.

[00432] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal- 60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para Ly6E.

[00433] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CD79b.

[00434] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal- 60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para CD79b.

[00435] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam CARs 1 a 15 que

169 / 308 fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para WISP1.

[00436] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam CARs 1 a 15 que fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para Cripto.

[00437] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para gpA33.

[00438] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para IL1RAP.

[00439] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para BST1.

[00440] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-

170 / 308 60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para CD133.

[00441] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CD123.

[00442] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15, que fazem parte das estruturas aqui descritas, como a estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para CD123.

[00443] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CD138.

[00444] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15, que fazem parte das estruturas aqui descritas, tais como estrutura-1, estrutura-2, estrutura-32 ou estrutura-60, em que o antígeno -domínio específico dos CARs é específico para CD138.

[00445] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CLL1.

[00446] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 15 que fazem parte dos estrutura principais descritos neste documento, tais como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60, em que o antígeno O domínio específico dos CARs é específico para CLL1.

171 / 308

[00447] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para a cadeia constante TCR-beta1.

[00448] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para a cadeia constante de TCR-beta2.

[00449] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para ALK.

[00450] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para PTK7.

[00451] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para DLL3.

[00452] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para TROP2.

[00453] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para Tim1.

[00454] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas

172 / 308 compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para LAMP1.

[00455] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CS1.

[00456] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para Lym1.

[00457] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para Lym2.

[00458] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para TSHR.

[00459] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para NY-ESO / MHC classe I complexo.

[00460] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para o complexo WT1 / MHC de classe I.

173 / 308

[00461] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para o complexo Ras / MHC de classe I.

[00462] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CD179a.

[00463] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para CLD18A2.

[00464] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para o epítopo CD43 expresso em células de leucemia.

[00465] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para a glicoproteína gp120 do envelope de HIV1.

[00466] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam zSIRs que fazem parte dos CARs 7-15 (ver, por exemplo, Tabela 1), em que os domínios específicos do antígeno são específicos para a região Fc de uma imunoglobulina.

[00467] Em uma modalidade, a célula efetora que expressa CAR aqui

174 / 308 descrita pode compreender ainda um segundo CAR que pode incluir um domínio de ligação de antígeno diferente para o mesmo ou um alvo diferente. Em algumas modalidades, o segundo CAR pode ter como alvo o mesmo ou um tipo de célula diferente do primeiro CAR. Em algumas modalidades, o segundo CAR pode ser da mesma classe (isto é, CAR 1 a CAR 15) que o primeiro CAR. Em algumas modalidades, o segundo CAR é de uma classe diferente do primeiro CAR. Em algumas modalidades, o segundo CAR tem o mesmo estrutura principal que o primeiro CAR. Em algumas modalidades, o segundo CAR tem um estrutura principal diferente do primeiro CAR.

[00468] Em uma modalidade, a célula efetora expressando CAR (por exemplo, um CAR 7-15) aqui descrita pode compreender ainda um CAR de uma classe diferente (por exemplo, CAR 1 ou CAR 2, etc.) com o mesmo ou um diferente domínio de ligação ao antígeno, opcionalmente o mesmo ou um alvo diferente. Em algumas modalidades, o segundo CAR (por exemplo, um CAR 1, CAR 2, etc.) pode ter como alvo o mesmo ou um tipo de célula diferente do primeiro CAR (por exemplo, um CAR 7-15). Em uma modalidade, o CAR inclui um domínio de ligação ao antígeno a um alvo expresso no mesmo tipo de célula de doença (por exemplo, câncer) que o antígeno associado à doença. Em uma modalidade, o CAR (por exemplo, um CAR 7-15, por exemplo, um zSIR) que expressa a célula compreende um CAR que tem como alvo um primeiro antígeno e um segundo receptor específico do antígeno (por exemplo, um CAR) que tem como alvo um segundo, diferente, antígeno e inclui um domínio de sinalização intracelular sem domínio de sinalização primário, mas um domínio de sinalização coestimulador. Embora não desejando estar limitado pela teoria, a colocação de um domínio de sinalização coestimulador, por exemplo, 4-1BB, CD28, CD27 ou OX-40, em um receptor específico de antígeno, pode modular o CAR (por exemplo, um CAR 7-15, por exemplo, uma atividade zSIR) em células onde ambos os alvos são expressos. Em uma modalidade, o CAR (por exemplo, um CAR 7-15, por exemplo, um zSIR) que

175 / 308 expressa a célula compreende i) um primeiro CAR de antígeno associado à doença que inclui um ou mais domínios de ligação ao antígeno que se ligam a um antígeno alvo aqui descrito, e ii) um CAR que tem como alvo um antígeno alvo diferente (por exemplo, um antígeno expresso na mesma doença associada (por exemplo, câncer) tipo de célula como o primeiro antígeno alvo) e inclui um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização primário e um domínio coestimulatório.

As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos de um construto exemplar com esta configuração são apresentadas em SEQ ID NO: 14380 e SEQ ID NO: 16124, respectivamente.

Os domínios de ligação ao antígeno do SIR neste construto são compostos pelos fragmentos vL e vH derivados do anticorpo monoclonal BCMAAm06 que tem como alvo o BCMA, enquanto o domínio de ligação ao antígeno do CAR é composto pelo domínio extracelular de PD1. O domínio de sinalização primário do CAR neste construto compreende o domínio citosólico CD3z, enquanto o domínio coestimulatório compreende o domínio citosólico 4-1BB.

Em outra modalidade, o CAR (por exemplo, um CAR 7-15, por exemplo, um zSIR) que expressa a célula compreende i) um primeiro CAR de antígeno associado à doença que inclui um ou mais domínios de ligação ao antígeno que se ligam a um antígeno alvo aqui descrito, e ii) um CAR que tem como alvo um antígeno alvo diferente (por exemplo, um antígeno expresso na mesma doença associada (por exemplo, câncer) tipo de célula como o primeiro antígeno alvo) e inclui um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio coestimulador, mas sem uma sinalização primária ou domínio de ativação.

As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos de um construto exemplar com esta configuração são apresentadas em SEQ ID NO: 14379 e SEQ ID NO: 16123, respectivamente.

Esta construção é semelhante à construção mostrada na SEQ ID NO: 14380, com a exceção de que o CAR não possui o domínio CD3z.

Em ainda outra modalidade, o CAR (por exemplo, um CAR 7-15, por exemplo, um zSIR) que expressa a célula

176 / 308 compreende i) um primeiro CAR de antígeno associado a doença que inclui um ou mais domínios de ligação ao antígeno que se ligam a um antígeno alvo aqui descrito, e ii) um CAR que tem como alvo um antígeno alvo diferente (por exemplo, um antígeno expresso na mesma doença associada (por exemplo, câncer) tipo de célula como o primeiro antígeno alvo) e inclui um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização primário, mas sem um domínio coestimulatório.

[00469] Em uma modalidade, o CAR compreende o domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular (tal como, mas não limitado a um ou mais domínios de sinalização intracelular de 41BB, CD27, OX40, CD28, Dap10, CD2, CD5, ICAM-1, LFA- 1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 ou combinações dos mesmos) e / ou um domínio de sinalização primário (tal como, mas não limitado a um domínio de sinalização zeta de CD3). SIRs exemplares que co-expressam um CAR são apresentados em SEQ ID NO: 3217 a 3219 e SEQ ID NO: 3221 e

3222.

[00470] Células efetoras imunes, tais como células T e células NK compreendendo CARs conforme descrito neste documento, podem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos como descrito, por exemplo, nas Patentes US 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358;

6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843;

5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; e Publicação do Pedido de Patente US Nº 20060121005.

[00471] São fornecidos aqui métodos para o tratamento de uma doença associada à expressão de um antígeno associado à doença ou um antígeno associado ao câncer.

[00472] Em uma modalidade, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de uma doença em um sujeito em necessidade, administrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de células geneticamente

177 / 308 modificadas aqui descritas (tais como células T, células NK) que são projetadas para expressar um CAR específico do antígeno (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) sozinho ou um CAR específico do antígeno (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) e uma molécula acessória, em que o antígeno é um antígeno específico da doença, conforme descrito neste documento, e em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam o referido antígeno específico da doença.

[00473] Em uma modalidade, são fornecidos aqui métodos para tratar o câncer em um sujeito em necessidade, administrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de células geneticamente modificadas aqui descritas (tais como células T, células NK) que são projetadas para expressar um CAR específico do antígeno (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Tri-Tac, Ab- TCR, TFP e semelhantes) sozinho ou um CAR específico do antígeno (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab -TCR, TFP e semelhantes) e uma molécula acessória, em que o antígeno é um antígeno específico do câncer, conforme descrito neste documento, e em que as células cancerosas expressam o referido antígeno tumoral.

[00474] Em uma modalidade, o antígeno específico do câncer é expresso em células normais e células cancerosas, mas é expresso em níveis mais baixos nas células normais. Em uma modalidade, o método compreende ainda selecionar um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) que se liga ao antígeno específico do câncer de interesse com uma afinidade que permite o CAR específico do antígeno para ligar e matar as células cancerosas. Em algumas modalidades, o CAR específico do antígeno (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) mata as células cancerosas, mas mata menos de 30%, 25%, 20%, 15%, 10 %, 5% ou menos das células normais que expressam o antígeno de câncer. Em modalidades exemplares, a porcentagem de células mortas pelos CARs

178 / 308 específicos do antígeno pode ser determinada usando os ensaios de morte celular (por exemplo, ensaio de Matador) aqui descritos.

[00475] Em algumas modalidades, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer em um sujeito em necessidade, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz das células geneticamente modificadas (por exemplo, células T, células NK) que são projetadas para expressar CARs convencionais 1 a 15, em que o ASD dos CARs é específico para o antígeno que é expresso nas células cancerosas (por exemplo, o antígeno é expresso em níveis mais baixos nas células normais em relação às células cancerosas) e cuja SEQ ID NO está listada na Tabela 3..

[00476] Em alguma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer em um sujeito em necessidade, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz das células geneticamente modificadas (por exemplo, células T, células NK) que são projetadas para expressar o esqueleto -1 compreendendo os CARs I convencionais e o módulo acessório K13-vFLIP, em que o ASD dos CARs é específico para o antígeno que é expresso nas células cancerosas (por exemplo, o antígeno é expresso em níveis mais baixos nas células normais em relação às células cancerosas) e cuja SEQ ID NO está listada na Tabela 3.

[00477] [00491] Em algumas modalidades, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer em um sujeito em necessidade, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz das células geneticamente modificadas (por exemplo, células T, células NK) que são projetadas para conter a estrutura 12 compreendendo os CARs II convencionais e o módulo acessório HIV1-Vif, em que o ASD dos CARs é específico para o antígeno que é expresso em células causadoras de doenças ou associadas a doenças (por exemplo, o antígeno é expresso em níveis mais baixos em células normais em relação às células cancerosas).

179 / 308

[00478] Em algumas modalidades, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer em um sujeito em necessidade, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz das células geneticamente modificadas (por exemplo, células T, células NK) que são projetadas para conter a estrutura 32 compreendendo o CAR II convencional e o módulo acessório K13-vFLIP, em que o ASD dos CARs é específico para o antígeno que é expresso em células cancerosas (por exemplo, o antígeno é expresso em níveis mais baixos em células normais em relação às células cancerosas)

[00479] Em modalidades exemplares, os antígenos que podem ser direcionados para os métodos terapêuticos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a qualquer um, dois, três, quatro ou mais de: CD19; CD5, CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (também referido como CD2 subconjunto 1, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24); Molécula 1 semelhante a lectina do tipo C (CLL-1 ou CLECL1); BAFF-R; CD33; variante III do receptor do fator de crescimento epidérmico ( EGFRviii); gangliósido G2 (GD2); gangliósido GD3 (aNeu5Ac (2-8) aNeu5Ac (2-3) bDGalp ( 1- 4) bDGlcp (ll) Cer); Maturação de células B do membro da família de receptores de TNF (BCMA); Antígeno Tn ((Tn Ag) ou ( GalNAc α-Ser / Thr)); antígeno de membrana específico da próstata (PSMA); Receptor receptor órfão 1 do tipo tirosina quinase (ROR1); Fms como tirosina quinase 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expresso em leucemia aguda ou linfoma, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, Antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão de células epiteliais (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 do receptor da interleucina-13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL- llRa); antígeno de células-tronco da próstata (PSCA); Protease Serine 21 ( Testisin ou PRSS21); receptor 2 do fator de

180 / 308 crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno embrionário específico de estágio 4 (SSEA-4); CD20; Receptor alfa de folato ( FRa ou FR1); Receptor beta de folato ( FRb); Receptor tirosina- proteína quinase ERBB2 (Her2 / neu); Mucina 1, associada à superfície celular (MUC1); receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de células neurais (NCAM); Prostase ; fosfatase ácida prostática (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Ephrin B2; proteína alfa de ativação de fibroblastos (FAP); receptor do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (receptor IGF-I), anidrase carbônica IX ( CAlX); Subunidade de Proteassoma (Prosome, Macropaina), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gpl00); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de agrupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo de oncogene viral de leucemia murina Abelson 1 ( Abl) ( bcr-abl); tirosinase; receptor 2 de efrina tipo A (EphA2); molécula de adesão sialil Lewis ( sLe); gangliósido GM3 (aNeu5Ac (2-3) bDClalp (l- 4) bDGlcp (l-1) Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); gangliósido o- acetil-GD2 (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1 / CD248); marcador endotelial tumoral relacionado a 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor do hormônio estimulador da tireóide (TSHR); Receptor de classe C acoplado à proteína G, grupo 5, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberto do cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásico (ALK); Ácido polissiálico ; específico da placenta 1 (PLAC1); porção hexassacárida da glicoceramida globoH ( GloboH); antígeno de diferenciação da glândula mamária (NY-BR-1); uroplacina 2 (UPK2); Receptor celular 1 do vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, locus K 9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína da estrutura de leitura alternativa gama TCR (TARP);

181 / 308

Proteína de tumor de Wilms (WT1); Antígeno 1 de câncer / testículo (NY-ES0- 1); Antígeno 2 de câncer / testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 do esperma (SPA17); X Antígeno família, os lA ( XAGEl); receptor 2 da superfície celular de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno-1 de testículo de câncer de melanoma (MAD- CT-1); antígeno-2 de testículo de câncer de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado com Fos ; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; prosteína ; survivin ; telomerase; antígeno-1 de tumor de carcinoma da próstata (PCT A-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido por células T 1 ( MelanA ou MARTI); Sarcoma de rato (Ras) mutante; transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT); pontos de corte de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, serina 2 (TMPRSS2) gene de fusão ETS); N-acetil glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa emparelhada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Cyclin Bl; v- myc mielocitomatose aviária oncogene neuroblastoma homólogo derivado de neuroblastoma (MYCN); Membro da Família Ras Homolog C ( RhoC); Proteína 2 relacionada com a tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 ( CYPlB 1); CCCTC-Binding Factor (Zinc Finger Protein) -Like (BORIS ou Brother of the Regulator oflmprinted Sites), Antígeno de Carcinoma de Célula Escamosa Reconhecido por Células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proacrosin ligação SP32 proteína (OY- TESL); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); renal ubíquo 1 ( RUl); renal ubíquo 2 (RU2); legumain; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos ( LAIRl);

182 / 308 Fragmento Fc do receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 da subfamília A do receptor semelhante a imunoglobulina de leucócitos (LILRA2); Membro da família f do tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A da família de domínio de lectina de tipo C 12 (CLEC12A); antígeno 2 de células estromais da medula óssea (BST2); O módulo do tipo EGF contendo o receptor da hormona do tipo mucina 2 (EMR2); antígeno linfocitário 75 (LY75); Glypican- 3 (GPC3); Semelhante ao receptor Fc 5 (FCRL5); e polipeptídeo semelhante a lambda de imunoglobulina 1 ( IGLLl), MPL, Biotina, epítopo Tag c-MYC, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalpha4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialyl Lewis); Fucosyl-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276 / B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b- IGLl1, TCRgamma -delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1- / CSVRA1, Tnag -alpha), TGFbetaR2,, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR-beta2, cadeia TCR-gama, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio folículo estimulante (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina (CGHR ou GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína do envelope HIV1, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV- EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV- gH, hemaglutinina (HA) da influenza A, GAD, PDL1, Guanylyl ciclase C (GCC), auto-anticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), auto-anticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, Fator Tissue 1 (TF1), AFP, GPRC5D, Claudin18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A.2), CLDN6, P-glicoproteína, STEAP1, Liv1, Nectina-4, Cripto, MPL, gpA33, BST1 / CD157, canal de cloreto de baixa condutância e o antígeno reconhecido pelo anticorpo TNT.

[00480] Em algumas modalidades, os domínios específicos do antígeno dos CARs compreendem sequências de scFv cuja SEQ ID é apresentada na Tabela 3.

[00481] Em modalidades exemplares, os antígenos que podem ser

183 / 308 direcionados para os métodos terapêuticos descritos neste documento incluem, mas não estão limitados a qualquer um, dois, três, quatro ou mais dos alvos descritos na Tabela 3.

[00482] A divulgação também fornece um método que compreende a administração de uma molécula CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), uma célula que expressa um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) molécula ou uma célula compreendendo um ácido nucleico que codifica um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) molécula para um sujeito. Em uma modalidade, o sujeito tem um distúrbio aqui descrito, por exemplo, o sujeito tem câncer, doença infecciosa, doença alérgica, doença degenerativa ou doença autoimune, que expressa um antígeno alvo aqui descrito. Em ainda uma modalidade, o sujeito tem risco aumentado de um distúrbio aqui descrito, por exemplo, o sujeito tem risco aumentado de câncer, doença infecciosa, doença alérgica, doença degenerativa ou doença autoimune, que expressa um antígeno alvo aqui descrito. Em uma modalidade, o sujeito é um humano. Em outra modalidade, o sujeito é um animal. Em ainda outra modalidade, o sujeito é um animal de companhia, como um cachorro.

[00483] A divulgação fornece métodos para tratar ou prevenir uma doença associada à expressão de um antígeno associado à doença aqui descrito.

[00484] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento ou prevenção de uma doença, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T) ou células-tronco que podem dar origem a células efetoras imunes que são projetadas para expressar um X- CAR, em que X representa um antígeno associado à doença como aqui descrito, e em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam o referido antígeno X. Tabe 11 fornece uma lista de diferentes antígenos e as doenças exemplares que podem ser prevenidas, inibidas ou tratadas usando células efetoras imunes que expressam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II,

184 / 308 SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) visando estes antígenos.

[00485] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, doença autoimune ou alérgica, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para diferentes antígenos mostrados na Tabela 3, em que o ASD dos CARs é composta por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID Nos estão listadas na Tabela 3.

[00486] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, doença auto-imune ou alérgica, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (Ver, por exemplo, Tabela 2) específico para CD19, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam CD19 e em que o ASD de CD19-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, malignidade de células B, não Hodgkins linfoma, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de células do manto ou mieloma múltiplo. Em uma modalidade, a doença a ser tratada é uma doença imune (por exemplo, lúpus, SLE, ITP, etc.) ou alérgica.

[00487] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, doença autoimune ou alérgica, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2,

185 / 308 estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específico para CD20, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam CD20 e em que o ASD de CD20-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, malignidade de células B, não Hodgkins linfoma, linfoma difuso de grandes células B ou linfoma de células do manto. Em uma modalidade, a doença a ser tratada é uma doença imune (por exemplo, lúpus, SLE, ITP, etc.) ou alérgica.

[00488] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, doenças autoimunes ou alérgicas, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específico para CD22, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam CD22 e em que o ASD de CD22-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, malignidade de células B, não Hodgkins linfoma, linfoma difuso de grandes células B ou linfoma de células do manto. Em uma modalidade, a doença a ser tratada é uma doença imune (por exemplo, lúpus, SLE, ITP, etc.) ou alérgica.

[00489] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, doença autoimune ou alérgica, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2)

186 / 308 específico para BCMA, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam BCMA e em que o ASD de BCMA-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer ou doença imune ou alérgica. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é uma malignidade de células plasmáticas ou mieloma múltiplo ou linfoma de efusão primária ou linfoma difuso de grandes células. Em uma modalidade, a doença a ser tratada é uma doença imune (por exemplo, lúpus, SLE, ITP, etc.) ou alérgica.

[00490] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, doença autoimune ou alérgica, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específico para MPL, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam MPL e em que o ASD de MPL-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, síndrome mielodisplásica.

[00491] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, doença autoimune ou alérgica, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específico para BAFF - R, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam BAFF-R e em que o ASD de BAFF-R- CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela

187 / 308

3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é leucemia linfocítica crônica, linfoma de células do manto, linfoma de células B e leucemia aguda.

[00492] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, doenças autoimunes ou alérgicas, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específico para IL13Ra2, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam IL13Ra2 e em que o ASD de IL13Ra2-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é um tumor cerebral.

[00493] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, doença autoimune ou alérgica, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células T NK) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específico para CD79b, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam CD79b e em que o ASD de CD79b -CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de células do manto, síndrome mielodisplásica ou mieloma múltiplo. Em uma modalidade, a doença a ser tratada é uma doença imune (por exemplo, lúpus, SLE, ITP, etc.) ou alergia.

[00494] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, doenças auto-imunes ou alérgicas, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células T NK)

188 / 308 que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1x ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal- 2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específico para Her2, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam Her2 e em que o ASD de Her2- CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer de besta ou câncer gástrico.

[00495] Numa forma de realização, a divulgação provi des métodos de tratamento do cancro por proporcionar ao sujeito em necessidade dos mesmos células efectoras imunes (por exemplo, células T, NK T células) que são modificadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específico para mesotelina (MSLN), em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam MSLN e em que o ASD de MSLN-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela

3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é mesotelioma, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer gastrointestinal ou câncer de ovário.

[00496] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para TSHR, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam TSHR e em que o ASD de TSHR-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer de tireoide ou leucemia / linfoma de células T.

[00497] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de

189 / 308 tratamento do câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para o Receptor de Prolactina (PRLR), em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam PRLR e em que o ASD de PRLR-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer de mama ou carcinoma de células renais cromófobo.

[00498] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para o Receptor de Folato 1 (FOLR1), em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam FOLR1 e em que o ASD de FOLR1-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de endométrio ou outros tumores sólidos.

[00499] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 (ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para PTK7, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam PTK7 e em que o ASD de PTK7-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ

190 / 308 ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é melanoma, câncer de pulmão ou câncer de ovário.

[00500] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para DLL3, em que as células causadoras de doença ou associadas à doença expressam DLL3 e em que o ASD de DLL3-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é melanoma, câncer de pulmão ou câncer de ovário.

[00501] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para EGFRviii, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam EGFRviii e em que o ASD de EGFRviii -CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer de cérebro ou câncer de pulmão ou outros tumores sólidos.

[00502] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para

191 / 308 expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para PSMA, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam PSMA e em que o ASD de PSMA-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é o câncer de próstata.

[00503] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para UPK1B, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam UPK1B e em que o ASD de UPK1B-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é o câncer de bexiga.

[00504] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específico para WISP1, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam WISP1. Em uma modalidade, o ASD de WISP1-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma

192 / 308 modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é glioblasatoma ou câncer de mama.

[00505] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para MMP16, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam MMP16. Em uma modalidade, o ASD de MMP16-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é glioblasatoma, melanoma, câncer de pulmão de células pequenas ou neuroblastoma.

[00506] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para BMPR1B, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam BMPR1B. Em uma modalidade, o ASD de BMPR1B-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela

3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer de próstata, câncer de mama ou câncer de ovário.

[00507] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para

193 / 308 expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para SLC34A2, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam SLC34A2. Em uma modalidade, o ASD de SLC34A2-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela

3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer de pulmão, câncer de ovário ou câncer endometrial.

[00508] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para gpA33, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam gpA33 e em que o ASD de gpA33 -CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer colorretal, câncer de ovário ou câncer endometrial.

[00509] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para BST1, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam BST1 e em que o ASD de BST1-CAR é composto por fragmentos

194 / 308 vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é o câncer do sangue.

[00510] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para CD133, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam CD133 e em que o ASD de CD133- CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer de pulmão ou câncer cerebral.

[00511] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para EMR2, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam EMR2 e em que o ASD de EMR2-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é leucemia aguda, linfoma, câncer de mama e câncer de cólon.

[00512] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras

195 / 308 imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para GPC3, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam GPC3 e em que o ASD de GPC3- CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer de fígado, câncer de mama e câncer de pulmão.

[00513] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para gpNMB, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam gpNMB e em que o ASD de gpNMB - CAR é composto de fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é melanoma, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de pulmão e outros tumores sólidos.

[00514] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para IL1RAP, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença

196 / 308 expressam IL1RAP e em que o ASD de IL1RAP-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer ou endometriose. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer de fígado, câncer cervical, câncer de cólon, câncer de ovário e outros tumores sólidos.

[00515] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para Nectin-4, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam Nectina-4 e em que o ASD de Nectin-4-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer ou endometriose. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer de bexiga, câncer renal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de pulmão e outros tumores sólidos.

[00516] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento do câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para Cripto, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam Cripto e em que o ASD de Cripto -CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer colorretal, câncer de ovário, câncer

197 / 308 endometrial e outros tumores sólidos.

[00517] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para RNF43, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam RNF43 e em que o ASD de RNF43-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer colorretal, câncer de mama, câncer endometrial e outros tumores sólidos.

[00518] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para ROR1, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam ROR1 e em que o ASD de ROR1-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer de sangue, CLL e linfoma.

[00519] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento do câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-

198 / 308 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para FLT3, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam FLT3 e em que o ASD de FLT3- CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é o câncer do sangue.

[00520] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento do câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para CLL-1, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam CLL-1 e em que o ASD de CLL-1- CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é o câncer do sangue.

[00521] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para Robo4, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam Robo4. Em uma modalidade, o ASD de Robo4-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer renal, câncer de cólon, câncer de mama ou outro tumor sólido.

199 / 308

[00522] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para CLDN6, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam CLDN6. Em uma modalidade, o ASD de CLDN6-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer de ovário, câncer de fígado ou outro tumor sólido.

[00523] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para Muc5Ac, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam Muc5Ac. Em uma modalidade, o ASD de Muc5Ac - CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela

3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer pancreático, câncer de estômago, câncer de cólon ou outro tumor sólido.

[00524] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-

200 / 308 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para Muc17, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam Muc17. Em uma modalidade, o ASD de Muc17-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer pancreático, câncer de estômago, câncer de cólon ou outro tumor sólido.

[00525] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específico para Ly6E, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam Ly6E. Em uma modalidade, o ASD de Ly6E-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer pancreático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer pancreático ou outro tumor sólido.

[00526] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para Integrina B7, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam Integrina B7. Em uma modalidade, o ASD de Integrina B7- CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela

3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em

201 / 308 uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é neoplasia de células plasmáticas ou linfoma de efusão primária.

[00527] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para STEAP1, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam STEAP1. Em uma modalidade, o ASD de STEAP1-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela

3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer gástrico, câncer de próstata ou linfoma.

[00528] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento de câncer, fornecendo ao sujeito em necessidade células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são projetadas para expressar CARs 1 a 15 ( ver, por exemplo, Tabela 1) ou estrutura principais (por exemplo, estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal- 32 ou estrutura principal-60) (ver, por exemplo, Tabela 2) específicos para Liv1, em que as células causadoras da doença ou associadas à doença expressam Liv1. Em uma modalidade, o ASD de Liv1-CAR é composto por fragmentos vL e vH cujas SEQ ID NOs estão listadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a doença a ser tratada ou prevenida é um câncer. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado ou prevenido é câncer de mama, câncer de próstata ou tumor sólido.

[00529] Cânceres exemplares cujo crescimento pode ser inibido incluem cânceres tipicamente responsivos à imunoterapia. Exemplos não limitativos de cânceres para tratamento incluem melanoma (por exemplo, melanoma maligno

202 / 308 metastático), câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônios), câncer de mama, câncer de cólon e câncer de pulmão ( por exemplo, não pequeno câncer de pulmão de células). Além disso, doenças malignas refratárias ou recorrentes podem ser tratadas usando as moléculas aqui descritas. Finalmente, doenças não malignas, como endometriose, podem ser tratadas usando os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) aqui descritos.

[00530] Em modalidades exemplares, os cânceres tratados pelos métodos descritos neste documento incluem tumores sólidos, como sarcomas, adenocarcinomas e carcinomas, de vários sistemas de órgãos, como aqueles que afetam o fígado, pulmão, mama, linfoide, gastrointestinal (por exemplo, cólon), trato geniturinário (por exemplo, células renais, uroteliais), próstata e faringe. Os adenocarcinomas incluem doenças malignas, como a maioria dos cânceres de cólon, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer de fígado, carcinoma de células não pequenas do pulmão, câncer do intestino delgado e câncer de esôfago. Em uma modalidade, o câncer é um melanoma, por exemplo, um melanoma em estágio avançado. Lesões metastáticas dos cânceres acima mencionados também podem ser tratadas ou prevenidas usando os métodos e composições da divulgação.

[00531] Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados incluem câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, estômago câncer, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles,

203 / 308 câncer da uretra, câncer do pênis, leucemias crônicas ou agudas, incluindo leucemia mielóide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, tumores sólidos da infância, linfoma linfocítico, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma do ren pelve, neoplasia do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário do SNC, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, câncer epidermóide, câncer de células escamosas, linfoma de células T, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo aqueles induzidos por amianto e combinações dos referidos cânceres. O tratamento de cânceres metastáticos, por exemplo, cânceres metastáticos que expressam PD-L1 (Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17: 133-144) pode ser efetuado usando as moléculas CAR aqui descritas. Além disso, uma doença associada a um antígeno associado ao câncer, conforme descrito neste documento, a expressão inclui, mas não se limitando a, por exemplo, cânceres atípicos e / ou não clássicos, doenças malignas, condições pré-cancerosas ou doenças proliferativas associadas à expressão de um antígeno associado ao câncer, conforme descrito neste documento. Finalmente, doenças não malignas, como endometriose, podem ser tratadas usando os CARs aqui descritos. Em algumas formas de realização, uma célula T que expressam o CAR ou NK T célula, tal como aqui descrito reduz a quantidade, o número, a quantidade ou percentagem de células e / ou as células cancerosas de pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, em pelo menos 50%, pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em um sujeito com câncer hematológico ou outro câncer associado a um antígeno associado ao câncer como aqui descrito, expressando células em relação a um controle negativo. Em uma modalidade, o sujeito é um humano.

[00532] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um método de inibir o crescimento de uma doença (por exemplo, câncer, doença autoimune, doença infecciosa ou doença alérgica ou uma doença degenerativa), compreendendo o

204 / 308 contato da célula causadora da doença ou associada à doença com uma célula geneticamente células modificada da divulgação que expressa um CAR (por exemplo, um veículo I, II CAR, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) ou um CAR com módulos de acessórios (por exemplo, estrutura principais de 1- 60 ; ver Tabela 2) de tal modo que o CAR-T é ativado em resposta ao antígeno e tem como alvo a célula causadora da doença ou associada à doença, em que o crescimento da célula causadora da doença ou associada à doença é inibido. Em um aspecto, a divulgação refere-se a um método de prevenção de uma doença, compreendendo a administração a um paciente em risco de doença um CAR- ou CAR- de próxima geração (por exemplo, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) expressando célula ou uma célula que é capaz de gerar uma célula que expressa CAR da divulgação de modo que o CAR-T seja ativado em resposta ao antígeno e tenha como alvo a célula causadora da doença ou associada à doença, em que o crescimento da célula causadora da doença ou associada à doença é impedido. Em um aspecto, a doença é um câncer, uma doença infecciosa, uma doença imune, uma doença alérgica ou uma doença degenerativa.

[00533] Em um aspecto, a doença é uma doença autoimune. Em uma modalidade, a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que consiste em Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (AIDS), alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídeo, doença de Addison autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune do ouvido interno (AIED), síndrome linfoproliferativa (ALPS), púrpura trombocitopênica autoimune (ATP), doença de Behçet, cardiomiopatia, dermatite celíaca-dermatite hepetiforme ; síndrome da disfunção imunológica por fadiga crônica (CFIDS), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIPD), penfigóide cicatricial, doença da aglutinina fria, síndrome da crista, doença de Crohn, doença de Degos, dermatomia osite-juvenil, lúpus discoide, crioglobulinemia mista essencial,

205 / 308 fibromialgia- fibromiosite. Doença de Graves, síndrome de Guiiiain -Barre, tireoidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, trombocitopenia idiopática ura (Γ Ρ), nefropatia por IgA, diabetes mellitus insulino-dependente, artrite crônica juvenil (doença de Still), artrite reumatóide juvenil, doença de Meniere, mista doença do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, miastenia gravis, anemia pernaciosa, poliarterite nodosa, policondrite, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomvosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, fenômeno da psoríase, síndrome reumática reumática, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomvosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, fenômeno da psoríase, síndrome reumatóide de Rayna artrite, sarcoidose, esclerodermia (esclerose sistêmica progressiva (PSS), também conhecida como esclerose sistêmica (SS)), síndrome de Sjögren, síndrome do homem rígido, lúpus eritematoso sistêmico (LES), arterite de Takayasu, arterite temporal / arterite de células gigantes, colite ulcerativa, uveíte, vitiligo, granulomatose de Wegener e qualquer combinação de ereof.

[00534] As modalidades da divulgação incluem um tipo de terapia celular em que células efetoras (como células T e células NK) ou células-tronco que podem dar origem a células efetoras são geneticamente modificadas para expressar um CAR como descrito neste documento e o CAR - ou CAR de próxima geração - (por exemplo, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) - expressando célula T ou célula T NK é infundida em um receptor em necessidade. A célula infundida é capaz de matar células tumorais no receptor. Em vários aspectos, as células imunes efectoras (por exemplo, células T, NK T células) administradas ao paciente, ou a sua descendência, persistem no paciente durante pelo menos quatro meses, de cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, treze meses, quatorze meses, quinze meses, dezesseis meses, dezessete meses, dezoito meses, dezenove meses, vinte meses, vinte e um meses, vinte e dois

206 / 308 meses, vinte e três meses, dois anos, três anos, quatro anos ou cinco anos após a administração da célula T ou célula NK ao paciente.

[00535] A divulgação também inclui um tipo de terapia celular onde células efetoras imunológicas (por exemplo, células T, células NK) são modificadas, por exemplo, por RNA transcrito in vitro, para expressar transitoriamente um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) ou um CAR com módulos acessórios (por exemplo, estrutura principais 1-6 0). As células T ou NK T células são infundidos a um receptor com necessidade do mesmo. As células infundidas são capazes de matar células associadas a doenças (por exemplo, células tumorais ou células infectadas por vírus) no receptor. Assim, em vários aspectos, o CAR ou as células efetoras imunes que expressam o CAR de próxima geração (por exemplo, células T, células NKT) persistem por menos de um mês, por exemplo, três semanas, duas semanas, uma semana, após a administração do T célula ou célula NK para o paciente.

[00536] A divulgação também inclui um tipo de terapia celular em que células-tronco (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas ou células-tronco linfóides ou células-tronco embrionárias, ou células-tronco pluripotentes induzidas) que são capazes de dar origem a células efetoras imunes (por exemplo, T células ou células NK) são modificados para expressar um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) ou um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab -TCR, TFP e semelhantes) com módulos acessórios (por exemplo, estrutura principais 1-60; ver Tabela 2) e são administrados a um destinatário com necessidade dos mesmos. As células-tronco administradas dão origem a células imunes efetoras (por exemplo, células T ou células NKT) após o transplante para o receptor, que (ou seja, as células imunes efetoras) são capazes de matar células associadas a doenças no receptor. Assim, em vários aspectos, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) que são produzidas no paciente após a

207 / 308 administração de CAR ou células-tronco expressando CAR de próxima geração persistem no paciente por pelo menos uma semana, 2 semanas , 3 semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, treze meses, quatorze meses, quinze meses, dezesseis meses, dezessete meses, dezoito meses, dezenove meses, vinte meses, vinte e um meses, vinte e dois meses, vinte e três meses, dois anos, três anos, quatro anos, cinco anos, dez anos ou vinte anos após a administração do geneticamente células-tronco modificadas para o paciente. A divulgação também inclui um tipo de terapia celular em que as células-tronco que são capazes de dar origem a células efetoras imunológicas (por exemplo, células T ou células NKT) são modificadas para expressar um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) ou um CAR com módulos acessórios (por exemplo, estrutura principais 1-60; ver Tabela 2) e são diferenciados in vitro para gerar células efetoras imunes que são infundidas em um receptor em necessidade. As células efetoras imunes infundidas (por exemplo, células T ou células NKT) após a infusão no receptor são capazes de matar células associadas à doença no receptor. Assim, em vários aspectos, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são administradas ao paciente persistem no paciente por pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, uma semana, 2 semanas, 3 semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, treze meses, quatorze meses , quinze meses, dezesseis meses, dezessete meses, dezoito meses, dezenove meses, vinte meses, vinte e um meses, vinte e dois meses, vinte e três meses, dois anos, três anos, quatro anos, cinco anos, dez anos ou vinte anos .

[00537] A divulgação também inclui um tipo de terapia celular em que células efetoras imunes regulatórias (por exemplo, células TREG ou CD25 + T) são modificadas para expressar um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) ou um CAR com módulos acessórios (por

208 / 308 exemplo, estrutura principais 1-6 0) visando um antígeno específico. Tais CAR-TREG são administrados a um paciente para suprimir a resposta imune contra o antígeno específico. O CAR-TREG pode ser usado para prevenir e tratar doenças autoimunes e para aumentar a tolerância imunológica.

[00538] A resposta de imunidade antitumoral induzida pelas células efetoras imunes modificadas por CAR ou CAR de próxima geração (por exemplo, células T, células NKT) pode ser uma resposta imune ativa ou passiva ou, alternativamente, pode ser devido a uma resposta imune direta vs resposta imune indireta. Em um aspecto, as células efetoras imunes transduzidas por CAR ou CAR de próxima geração (por exemplo, células T, células NK) exibem secreção de citocinas pró-inflamatórias específicas e atividade citolítica potente em resposta a células humanas doentes (por exemplo, câncer ou células infectadas) expressar o antígeno associado à doença como aqui descrito, resistir ao antígeno associado à doença solúvel como aqui descrito, mediar a morte de espectador e mediar a regressão de uma doença humana estabelecida, incluindo câncer.

[00539] A divulgação também inclui um tipo de terapia celular onde células imunes efetoras (por exemplo, células T e células NKT) ou células- tronco que são capazes de dar origem a células imunes efetoras (por exemplo, células T ou células NK) são modificadas para expressar um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) ou um CAR com módulos acessórios (por exemplo, estrutura principais 1-60) e são usados ex vivo para purgar a medula óssea ou células-tronco hematopoéticas do sangue periférico de células associadas a doenças (por exemplo, células cancerosas). Como exemplo, as células T que expressam um CAR específico de CD19 (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) são co- cultivadas com medula óssea ou amostra de células-tronco de sangue periférico retirada de um paciente com leucemia linfocítica aguda ou linfoma não- Hodgkin de modo a matar quaisquer células de leucemia ou linfoma presentes

209 / 308 na medula óssea ou na preparação de células-tronco do sangue periférico. Após uma duração adequada de cultura in vitro (ex vivo), que pode variar de 6 horas a vários dias, a medula óssea purgada e a amostra de sangue periférico são utilizadas para transplante autólogo no paciente.

[00540] A expansão ex vivo de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras foi descrita na Patente U.S. No. 5.199.942, e é aqui incorporada por referência e pode ser aplicada às células da divulgação. No entanto, a divulgação não está limitada a qualquer método particular de expansão ex vivo das células e outros métodos adequados conhecidos na técnica podem ser utilizados. Resumidamente, a cultura ex vivo e expansão de células-tronco hematopoiéticas compreende: (1) coleta de células-tronco hematopoiéticas CD34 + e células progenitoras de um mamífero a partir de colheita de sangue periférico ou explantes de medula óssea; e (2) expandir tais células ex vivo. Além dos fatores de crescimento celular descritos na Pat. No. 5.199.942, outros fatores como flt3-L, IL-1, IL-3 e ligante c-kit, podem ser usados para a cultura e expansão das células.

[00541] Além de usar uma vacina baseada em células em termos de imunização ex vivo, a divulgação também fornece composições e métodos para imunização in vivo para eliciar uma resposta imune dirigida contra um antígeno em um paciente.

[00542] Em algumas modalidades, o CAR totalmente humano ou as células geneticamente modificadas do CAR de próxima geração (como células T, células NKT) da divulgação podem ser um tipo de vacina para imunização ex vivo e / ou terapia in vivo em um mamífero (por exemplo, humano). No que diz respeito à imunização ex vivo, pelo menos um dos seguintes ocorre in vitro antes da administração da célula em um mamífero: i) expansão das células, ii) introdução de um ácido nucleico que codifica um CAR para as células ou iii) criopreservação do células. Os procedimentos ex vivo são bem conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S. No. 5.199.942, aqui

210 / 308 incorporada por referência.

[00543] Além de usar uma vacina baseada em células em termos de imunização ex vivo, a divulgação também fornece composições e métodos para imunização in vivo para eliciar uma resposta imune dirigida contra um antígeno em um paciente.

[00544] Ainda são descritos aqui métodos para controlar a atividade de células CAR-T quando administradas aos pacientes. Em algumas modalidades, esses métodos podem ser usados para controlar os efeitos colaterais das células CAR-T, como a síndrome de liberação de citocinas, síndrome de vazamento capilar e complicações neurológicas. Em algumas modalidades, o método envolve a administração de inibidores de tirosina quinases, particularmente quinase da família Scr e, em particular, quinase Lck. Em uma modalidade, o método envolve a administração de Dasatinib, um inibidor de molécula pequena oral de Abl e Src família tirosina quinases (SFK), incluindo p56Lck (Lck) (Lee KC et al, Leukemia (2010) 24, 896-900). Em uma modalidade, o inibidor de Src quinase é administrado ao paciente após a administração de células que expressam CAR para controlar ou encerrar a atividade de células que expressam CAR. Em uma modalidade, um inibidor de Lck é administrado ao paciente após a administração de células que expressam CAR para controlar ou encerrar a atividade das células que expressam CAR. Em uma modalidade, o inibidor de Lck é A-770041.

[00545] Em uma modalidade, dasatinib é administrado ao paciente após a administração de células que expressam CAR para controlar ou encerrar a atividade das células que expressam CAR. Em uma modalidade, dasatinib é administrado por via oral em uma dose de pelo menos 10 mg/dia, 20 mg/dia, 40 mg/dia, 60 mg/dia, 70 mg/dia, 90 mg/dia, 100 mg/dia, 140 mg/dia, 180 mg/dia, 210mg/dia, 250mg/dia ou 280mg/dia.

[00546] Em uma modalidade, o ponatinib é administrado ao paciente após a administração de células que expressam CAR para controlar ou encerrar

211 / 308 a atividade das células que expressam CAR. Em uma modalidade, o ponatinib é administrado por via oral em uma dose de pelo menos 15 mg/dia, 30 mg/dia, 45 mg/dia, 60 mg/dia.

[00547] Os linfócitos T têm um tempo de vida replicativo limitado até atingirem o estado diferenciado terminal e, em seguida, entrar em uma fase de senescência replicativa devido à perda progressiva de telômeros com a idade. Os linfócitos T humanos exibem um tempo de vida limitado de cerca de 30-50 duplicações populacionais quando cultivados in vitro.

[00548] Ainda são contemplados neste documento métodos para promover a sobrevivência e proliferação de células mononucleares do sangue periférico e células T e prevenir sua senescência replicativa para estender o tempo de vida de células imunes (por exemplo, linfócitos e células NK) para o propósito de terapia de células adotivas. O método envolve a expressão ectópica de proteínas virais e / ou celulares que promovem a sobrevivência e a proliferação e bloqueiam a morte celular induzida por ativação. Uma proteína exemplar adequada para este propósito inclui a proteína inibidora de FLICE s viral (vFLIP) K13 codificada pelo herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (também conhecido como herpesvírus humano 8). Em algumas modalidades, as proteínas virais e celulares acima são expressas nas células imunes (por exemplo, células T e células NK) em seu estado nativo ou carregando pequenos marcadores de epítopo e são funcionalmente ativas de uma maneira constitutiva. Em outras modalidades, as proteínas virais e celulares acima são expressas nas células imunes (por exemplo, células T e células NK) em fusão com uma ou mais cópias de um domínio de troca (ou um domínio de dimerização), como FKBP e FKBPx2. Em outra modalidade, o domínio FKBP ou FKBP-x2 pode transportar adicionalmente uma sequência de mirisotilação N-terminal (Myr) para ancorar as proteínas de fusão à membrana celular. As proteínas de fusão que transportam os domínios de troca são funcionalmente inativas em seu estado basal, mas são ativadas após a adição de um agente

212 / 308 dimerizador, tal como AP20187 como descrito em PCT / US2017 / 024843, que é incorporado por referência em sua totalidade neste documento.

[00549] Ainda são contemplados neste documento métodos para promover a transdução mediada por lentivírus e / ou expressão de um gene estranho e / ou cDNA. O método envolve a expressão da proteína HIV1-Vif. Em algumas modalidades, a proteína Vif é codificada no mesmo vetor que o gene estranho e / ou cDNA. Em algumas modalidades, a proteína Vif é codificada em um vetor diferente como o gene / cDNA estranho. Exemplo de gene / cDNA estrangeiro cuja transferência e / ou expressão pode ser aumentada pela coexpressão da proteína Vif de HIV1 incluem CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR), TCR recombinanat, globina e adenosina desaminase, etc. Em algumas modalidades, a co-expressão da proteína Vif de HIV1 pode ser usada para promover a transdução mediada por lentivírus e / ou expressão de qualquer gene / cDNA ou fragmento de ácido nucleico codificado. Em algumas modalidades, a proteína HIV1 Vif é codificada no mesmo vetor que o gene / cDNA de interesse. Um exemplo de vetor que codifica um CAR e coexpressa a proteína HIV1 Vif é apresentado em SEQ ID NO: 11268. Exemplos de cassetes de ácido nucleico que codificam CARs e HIV Vif são apresentados em SEQ ID NOs: 11244-11267. Em algumas modalidades, a proteína HIV1 Vif é codificada em um vetor diferente como o gene / cDNA de interesse. A proteína HIV1 Vif pode ser usada para aumentar a transferência / expressão de genes em qualquer célula de mamífero. Em algumas modalidades, a proteína HIV1 Vif é usada para aumentar a transferência / expressão de genes em células mononucleares do sangue periférico, células T, células NK, células NKT, células B, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco pluripotentes induzidas, células do fígado, células cerebrais ou pele células. A proteína HIV1 Vif pode ser usada para aumentar a transferência / expressão de genes em

[00550] Em uma modalidade, uma célula imune efetora, por exemplo,

213 / 308 uma célula T, expressa ectopicamente um ou mais de uma proteína de sinalização viral ou celular selecionada do grupo de K13-vFLIP (SEQ ID NO: 4107), MC159 (SEQ ID NO: 4108), cFLIP-L / MRIT-alfa (SEQ ID NO: 4109), cFLIP-p22 (SEQ ID NO: 4110), HIV1-Vif (SEQ ID NO: 4117), HTLV1-TAX (SEQ ID NO : 4113), HTLV2-TAX (SEQ ID NO: 4114), HTLV2-TAX-RS (SEQ ID NO: 4115) ou uma proteína com 70-99% de identidade com sequências de aminoácidos das proteínas acima.

[00551] Em uma modalidade, uma célula imune efetora, por exemplo, uma célula T, expressa ectopicamente uma proteína de fusão contendo um ou mais domínios de troca, por exemplo, FKBP, FKBPx2 ou Myr-FKBP, e uma ou mais proteínas virais ou celulares sinalização selecionada do grupo K13- vFLIP (SEQ ID NO: 4107), MC159 (SEQ ID NO: 4108), cFLIP-L / MRIT- alpha (SEQ ID NO: 4109), cFLIP-p22 (SEQ ID NO: 4110) , HIV1-Vif (SEQ ID NO: 4117), HTLV1-TAX (SEQ ID NO: 4113), HTLV2-TAX (SEQ ID NO: 4114), HTLV2-TAX-RS (SEQ ID NO: 4115).

[00552] Em alguns aspectos, esta divulgação fornece um método de produção de uma célula imune efetora adequada para terapia celular adotiva, compreendendo o contato da célula com um ácido nucleico que codifica parcialmente ou completamente um ou mais de uma proteína de sinalização viral ou celular selecionada a partir de grupo de K13-vFLIP (SEQ ID NO: 4107), MC159 (SEQ ID NO: 4108), cFLIP-L / MRIT-alfa (SEQ ID NO: 4109), cFLIP-p22 (SEQ ID NO: 4110), HIV1- Vif (SEQ ID NO: 4117), HTLV1-TAX (SEQ ID NO: 4113), HTLV2-TAX (SEQ ID NO: 4114), HTLV2-TAX-RS (SEQ ID NO: 4115) ou proteínas com 70-99% identidade com as sequências de aminoácidos das proteínas acima.

[00553] Em alguns aspectos, esta divulgação fornece um método de produção de uma célula imune efetora adequada para terapia celular adotiva, compreendendo o contato da célula com um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão contendo um ou mais domínios de troca, por exemplo, FKBP,

214 / 308 FKBPx2 ou Myr-FKBP e uma ou mais proteínas de sinalização viral ou celular são selecionadas do grupo de K13-vFLIP (SEQ ID NO: 4107), MC159 (SEQ ID NO: 4108), cFLIP-L / MRIT-alfa (SEQ ID NO : 4109), cFLIP-p22 (SEQ ID NO: 4110), HIV1-Vif (SEQ ID NO: 4117), HTLV1-TAX (SEQ ID NO: 4113), HTLV2-TAX (SEQ ID NO: 4114), HTLV2- TAX-RS (SEQ ID NO: 4115) ou proteínas com 70-99% de identidade com as sequências de aminoácidos das proteínas acima.

[00554] Em uma modalidade, a célula adequada para terapia celular adotiva expressa um receptor imune natural ou sintético. Exemplos de tais receptores imunes incluem um receptor de antígeno quimérico (CAR), um receptor de célula T (TCR), um receptor de célula T quimérico (cTCR), um receptor de célula T sintético, uma proteína de fusão de TCR (TFP), um Ab- TCR e um receptor de entalhe sintético. Em uma modalidade, a célula pode ser colocada em contato com o ácido nucleico que codifica proteínas de sinalização viral e celular antes, simultaneamente ou depois de ser contatada com um construto que codifica um receptor imune natural ou sintético. Em uma modalidade, a célula pode ser colocada em contato com o ácido nucleico que codifica proteínas de sinalização viral e celular contendo um domínio de troca ou dimerização antes, simultaneamente ou após ser contatado com um construto que codifica um receptor imune natural ou sintético.

[00555] Em um aspecto, a divulgação apresenta um método para fazer uma população de células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK). Em uma modalidade, o método compreende: fornecer uma população de células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK), contatar a população de células efetoras imunes com um ácido nucleico que codifica um receptor imune (por exemplo, CAR, TCR, Sintético TCR) e o contato da população de células imunes efetoras com um ácido nucleico que codifica uma proteína de sinalização viral ou celular, em condições que permitem a coexpressão do receptor imune e da proteína de sinalização viral ou celular.

215 / 308

[00556] Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica a proteína de sinalização viral ou celular é o DNA. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica a proteína de sinalização viral ou celular contém um promotor capaz de dirigir a expressão das proteínas de sinalização viral e celular. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica a proteína de sinalização viral ou celular e o ácido nucleico que codifica o receptor imune é expresso a partir do mesmo vetor. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica a proteína de sinalização viral ou celular e o ácido nucleico que codifica o receptor imune é expresso a partir de vetores separados. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica a proteína de sinalização viral ou celular (subunidade 1) e o ácido nucleico que codifica o receptor imune (subunidade 2) é expresso a partir do mesmo fragmento de polinucleotídeo contendo um local de entrada ribossomal interno (IRES) que permite a tradução da segunda subunidade. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica a proteína de sinalização viral ou celular (subunidade 1) e o ácido nucleico que codifica o receptor imune (subunidade 2) é expresso a partir de um único fragmento de polinucleotídeo que codifica e as diferentes subunidades são separadas por um ligante clivável.

[00557] Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica a proteína de sinalização viral ou celular é um RNA transcrito in vitro. Em uma modalidade, a proteína de sinalização viral ou celular (subunidade 1) e o receptor imune (subunidade 2) são expressos a partir do mesmo RNA contendo um sítio de entrada ribossomal interno (IRES) que permite a tradução da segunda subunidade. Em uma modalidade, a proteína de sinalização viral ou celular (subunidade 1) e o receptor imune (subunidade 2) são expressos a partir de um único RNA e as diferentes subunidades são separadas por ligantes cliváveis.

[00558] Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica a proteína de sinalização celular é a cópia genômica da referida proteína que foi ativada pela ativação de seu promotor por meios genéticos ou químicos.

216 / 308

[00559] [00573] Os métodos terapêuticos descritos neste documento compreendem o uso de composições compreendendo células geneticamente modificadas compreendendo ácidos nucleicos que codificam CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) aqui descritos. Em várias modalidades, os métodos terapêuticos aqui descritos podem ser combinados com terapias e agentes existentes. As composições terapêuticas aqui descritas, compreendendo células geneticamente modificadas compreendendo ácidos nucleicos que codificam os CARs (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) aqui descritas, são administradas ao sujeito com pelo menos um terapia adicional conhecida ou agente terapêutico. Em algumas modalidades, as composições aqui descritas e a terapia adicional ou agentes terapêuticos são administrados sequencialmente. Em algumas modalidades, as composições aqui descritas e a terapia adicional ou agentes terapêuticos são administrados simultaneamente. A ordem ótima de administração das composições aqui descritas e das terapias existentes será evidente para um especialista na técnica, como um médico.

[00560] Um CAR ou célula que expressa o CAR de próxima geração aqui descritos e o pelo menos um agente terapêutico adicional podem ser administrados simultaneamente, na mesma ou em composições separadas, ou sequencialmente. Para administração sequencial, a célula que expressa CAR aqui descrita pode ser administrada primeiro e o agente adicional pode ser administrado em segundo lugar, ou a ordem de administração pode ser invertida.

[00561] As terapias de combinação podem ser administradas ao sujeito ao longo da duração da doença. A duração da doença inclui desde o diagnóstico até a conclusão do tratamento, em que o tratamento resulta na redução dos sintomas e / ou na eliminação dos sintomas. Em várias modalidades, o efeito dos dois tratamentos pode ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo ou maior do que o aditivo. A entrega pode ser tal que um efeito do primeiro tratamento

217 / 308 administrado ainda seja detectável quando o segundo é administrado.

[00562] A terapia CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- TCR, TFP e semelhantes) e / ou outros agentes terapêuticos, procedimentos ou modalidades podem ser administrados durante períodos de distúrbio ativo, ou durante um período de remissão ou doença menos ativa. A terapia CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) pode ser administrada antes do outro tratamento, simultaneamente com o tratamento, pós-tratamento ou durante a remissão do distúrbio.

[00563] Quando administrado em combinação, a terapia CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) e o agente adicional (por exemplo, segundo ou terceiro agente), ou todos, podem ser administrado em uma quantidade ou dose que é maior, menor ou igual à quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em certas modalidades, a quantidade administrada ou dosagem do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) terapia, o agente adicional (por exemplo, segundo ou terceiro agente), ou todos , é inferior (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50%) do que a quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em outras modalidades, a quantidade ou dosagem do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) terapia, o agente adicional (por exemplo, segundo ou terceiro agente), ou todos, que resulta em um efeito desejado (por exemplo, tratamento de câncer) é menor (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% menor) do que a quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente , por exemplo, como uma monoterapia, necessária para atingir o mesmo efeito terapêutico.

[00564] Outros aspectos do método referem-se à administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma célula, por exemplo, uma célula imune

218 / 308 efetora ou uma população desta, cada célula compreendendo um CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab- Molécula de TCR, TFP e semelhantes), opcionalmente em combinação com um agente que aumenta a eficácia e / ou segurança da célula imune. Em outros aspectos, o agente que aumenta a eficácia e / ou segurança da célula imune é um ou mais dentre: (i) um inibidor de proteína fosfatase; (ii) um inibidor da quinase; (iii) uma citocina; (iv) um inibidor de uma molécula imune inibitória; ou (v) um agente que diminui o nível ou atividade de uma célula TREG; vi) um agente que aumenta a proliferação e / ou persistência de células modificadas por CAR vii) uma quimiocina viii) um agente que aumenta a expressão de CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) ix) um agente que permite a regulação da expressão ou atividade do CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes), x) um agente que permite o controle sobre a sobrevivência e / ou persistência de células modificadas com CAR, xi) um agente que controla os efeitos colaterais das células modificadas com CAR, xii) um inibidor de Brd4 xiii) um agente que administra um agente terapêutico (por exemplo, sHVEM) ou profilático no local do doença, xiv) um agente que aumenta a expressão do antígeno alvo contra o qual CAR (por exemplo, CAR I, CAR II, SIR, zSIR, Ab-TCR, TFP e semelhantes) é direcionado; xv) um antagonista do receptor de adenosina A2a; xvi) um agente que esgota monócitos e / ou macrófagos; xvii) Etoposídeo

[00565] Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas aqui descritas podem ser utilizadas em um regime de tratamento em combinação com cirurgia, quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, tais como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato e FK506, anticorpos ou outros agentes imunoablativos, tais como CAMPATH, anticorpos anti-CD3 ou outras terapias de anticorpos, citocina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteróides, FR901228, citocinas e irradiação, vacina de peptídeo, tal como descrito em

219 / 308 Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108: 963-971. Em uma modalidade, uma célula que expressa CAR- aqui descrita pode ser usada em combinação com um agente quimioterápico. Agentes quimioterápicos exemplares incluem uma antraciclina (por exemplo, doxorrubicina (por exemplo, doxorrubicina lipossomal)), um alcalóide vinca (por exemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), um agente alquilante (por exemplo, ciclofosfamida, decarbozomfalano, melamfalano) um anticorpo de célula imune (por exemplo, alemtuzamabe, gemtuzumabe, rituximabe, ofatumumabe, tositumomabe, brentuximabe), um antimetabólito (incluindo, por exemplo, antagonistas do ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores de adenosina desaminase (por exemplo, fludarabina), um mTOR , um agonista da proteína relacionada ao TNFR induzida por glucocorticóide TNFR (GITR), um inibidor de proteassoma (por exemplo, aclacinomicina A, gliotoxina ou bortezomibe), um imunomodulador, como talidomida ou um derivado da talidomida (por exemplo, lenalidomida).

[00566] Em algumas modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com ciclofosfamida e fludarabina.

[00567] Em algumas modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito que foi anteriormente administrado com quimioterapia mieloablativa e linfodepletora. Os regimes de condicionamento mieloablativo e linfodeletizador exemplares incluem FCE (Fludarabina 25 mg/ m2/dia, dias -7 a -3; ciclofosfamida 200 mg/m2/dia, dias -7 a -3; e etoposídeo 250 mg/m2/dia, dias −4 a −3), FCIE (Fludarabina 25 mg/m2/dia, dias −7 a −3; ciclofosfamida 200 mg/m2/dia, dias −7 a −3; idarrubicina 12 mg/m2/dia, dias −7 a −5 e etoposídeo 250 mg/m2/dia, dias −4 a −3), FluCyE ( fludarabina 30 mg/m2/dia, citarabina 1,5 g/m2/dia administrada após fludarabina e etoposídeo 100 mg/m2/dia com cada uma das drogas administradas nos dias -6 a -1), ou FE ( fludarabina 30 mg/m2/dia e etoposídeo 100 mg/m2/dia nos dias -5 ao dia -1).

220 / 308 Em algumas modalidades, as células que expressam CAR são administradas ao sujeito entre 1 dia a 5 dias após a última dose de quimioterapia.

[00568] Em algumas modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito a quem foi administrado etoposídeo anteriormente. Em algumas modalidades, o etoposido é administrado por via intravenosa em uma dose de 50 mg/m2/dia a 250 mg/m2/dia por 1-5 dias. Em algumas modalidades, o etoposídeo é administrado em doses de 5 mg / kg por dose entre 1 a 5 dose. Em algumas modalidades, células que expressam CAR são administradas ao sujeito entre 1 dia a 5 dias após a última dose de etoposídeo.

[00569] Em modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com bendamustina e rituximabe.

[00570] Em algumas modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com rituximabe, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e / ou um corticosteroide (por exemplo, prednisona). Em modalidades, um CAR ou célula que expressa o CAR de próxima geração aqui descrito é administrado a um sujeito em combinação com rituximabe, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona (R-CHOP). Em modalidades, o sujeito tem linfoma difuso de grandes células B (DLBCL).

[00571] Em algumas modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com etoposídeo, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorrubicina e / ou rituximabe. Em modalidades, um CAR ou célula que expressa o CAR de próxima geração aqui descrito é administrado a um sujeito em combinação com etoposídeo, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorrubicina e rituximabe (EPOCH- R). Em modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com EPOCH-R de dose ajustada (DA-EPOCH-R). Em modalidades, o sujeito tem um linfoma de células B, por

221 / 308 exemplo, um linfoma de células B agressivo rearranjado por Myc.

[00572] Em algumas modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com brentuximab. Brentuximab é um conjugado anticorpo-droga de anticorpo anti-CD30 e monometil auristatina E. Em algumas modalidades, o sujeito tem linfoma de Hodgkin (HL), por exemplo, HL recidivante ou refratário. Em algumas modalidades, o sujeito compreende CD30 + HL. Nas modalidades, o sujeito foi submetido a um transplante autólogo de células-tronco (ASCT).

[00573] Em algumas modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de CD20, por exemplo, um anticorpo anti-CD20 (por exemplo, um anticorpo mono ou biespecífico anti-CD20) ou um fragmento do mesmo .

[00574] Em uma modalidade, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR aqui descrito, por exemplo, um rapalog, como everolimus. Em uma modalidade, o inibidor de mTOR é administrado antes da administração de células que expressam CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o inibidor de mTOR pode ser administrado antes da aférese das células. Em uma modalidade, o sujeito tem CLL.

[00575] Em uma modalidade, uma célula que expressa CAR aqui descrita pode ser usada em combinação com um inibidor de quinase. Em uma modalidade, o inibidor de quinase é um inibidor de CDK4, por exemplo, um inibidor de CDK4 aqui descrito, por exemplo, um inibidor de CD4 / 6, tal como, por exemplo, palbociclib ou PD0332991. Em uma modalidade, o inibidor de quinase é um inibidor de BTK, por exemplo, um inibidor de BTK aqui descrito, tal como, por exemplo, ibrutinib. Em algumas modalidades, o ibrutinib é administrado em uma dosagem de cerca de 300-600 mg / dia (por exemplo, cerca de 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550 ou 550-600 mg / dia, por exemplo, cerca de 420 mg / dia ou cerca de 560 mg / dia), por exemplo, por

222 / 308 via oral. Nas modalidades, o ibrutinib é administrado em uma dose de cerca de 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (por exemplo, 250 mg, 420 mg ou 560 mg) diariamente por um período de tempo, por exemplo, diariamente por um ciclo de 21 dias ou diariamente por um ciclo de 28 dias. Em uma modalidade, são administrados 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de ibrutinib.

[00576] Em uma modalidade, o inibidor de quinase é um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR aqui descrito, tal como, por exemplo, rapamicina, um análogo de rapamicina, OSI-027. Em uma modalidade, o inibidor de quinase é um PI3K duplo / inibidor de mTOR aqui descrito, tal como, por exemplo, PF-04695102.

[00577] Em uma modalidade, o inibidor da quinase é um inibidor da quinase Src. Em uma modalidade, o inibidor da quinase é Dasatinib. Em uma modalidade, o inibidor de Src quinase é administrado ao paciente após a administração de células que expressam CAR para controlar ou encerrar a atividade de células que expressam CAR. Em uma modalidade, dasatinib é administrado ao paciente após a administração de células que expressam CAR para controlar ou encerrar a atividade das células que expressam CAR. Em uma modalidade, dasatinib é administrado por via oral em uma dose de pelo menos 10 mg/dia, 20 mg/dia, 40 mg/dia, 60 mg/dia, 70 mg/dia, 90 mg/dia, 100 mg/dia, 140 mg/dia, 180 mg/dia ou 210 mg/dia.

[00578] Em modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de linfoma quinase anaplásico (ALK).

[00579] Drogas que inibem a fosfatase calcineurina dependente de cálcio (ciclosporina e FK506) ou inibem a quinase p70S6 que é importante para a sinalização induzida pelo fator de crescimento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73: 316-321, 1991; Bierer et al.,

223 / 308 Curr. Opin. Immun. 5: 763-773, 1993) pode também ser usado. Em um aspecto adicional, as composições de células da divulgação podem ser administradas a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) transplante de medula óssea, terapia ablativa de células T usando agentes quimioterápicos, tais como fludarabina, radioterapia de feixe externo (XRT), ciclofosfamida e / ou anticorpos como OKT3 ou CAMPATH. Em um aspecto, as composições de células da divulgação são administradas após terapia ablativa de células B, como agentes que reagem com CD20, por exemplo, Rituxan. Por exemplo, em uma modalidade, os indivíduos podem ser submetidos a tratamento padrão com quimioterapia de alta dose seguida por transplante de células-tronco do sangue periférico. Em certas modalidades, após o transplante, os sujeitos recebem uma infusão das células imunes expandidas da divulgação. Em uma modalidade adicional, as células expandidas são administradas antes ou após a cirurgia.

[00580] Em modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com um transplante de células- tronco autólogo, um transplante de células-tronco alogênico, um transplante de medula óssea autólogo ou um transplante de medula óssea alogênico.

[00581] Em modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com microtransplante ou terapia celular alogênica incompatível com HLA (Guo M et al, J Clin Oncol. 20 de novembro de 2012; 30 (33): 4084-90 )

[00582] Em modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de indoleamina 2,3- dioxigenase (IDO).

[00583] Em modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com um modulador de células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs).

[00584] Em modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é

224 / 308 administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de Brd4 ou BET (bromodomínio e motivo extra-terminal). Inibidores de Brd4 exemplares que podem ser administrados em combinação com células que expressam CAR incluem, mas não estão limitados a, JQ1, MS417, OTXO15, LY 303511 e inibidor de Brd4 conforme descrito em US 20140256706 A1 e quaisquer análogos dos mesmos.

[00585] Em algumas modalidades, uma célula que expressa CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com um polipeptídeo de interleucina-15 (IL-15), um polipeptídeo de receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra) ou uma combinação de um polipeptídeo IL-15 e um polipeptídeo IL- 15Ra, por exemplo, hetiL-15 (Admune Therapeutics, LLC). Em algumas modalidades, o het-IL-15 é administrado por via subcutânea.

[00586] Em uma modalidade, o sujeito pode ser administrado com um agente que reduz ou melhora um efeito colateral associado à administração de uma célula que expressa CAR. Os efeitos colaterais associados à administração de uma célula que expressa CAR incluem, mas não estão limitados a CRS e linfo-histiocitose hemofagocítica (HLH), também denominada Síndrome de Ativação Macrófago (MAS).

[00587] Por conseguinte, os métodos descritos neste documento podem compreender a administração de uma célula que expressa CAR aqui descrita a um sujeito e ainda administrar um ou mais agentes para gerenciar níveis elevados de um fator solúvel resultante do tratamento com uma célula que expressa CAR. Em uma modalidade, o fator solúvel elevado no sujeito é um ou mais dentre IFN-y, TNFa, IL-2 e IL-6. Em uma modalidade, o fator elevado no sujeito é um ou mais dentre IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 e fraktalkine. Portanto, um agente administrado para tratar este efeito colateral pode ser um agente que neutraliza um ou mais desses fatores solúveis. Em uma modalidade, o agente que neutraliza uma ou mais dessas formas solúveis é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Exemplos de tais agentes incluem,

225 / 308 mas não estão limitados a um esteróide (por exemplo, corticosteroide), inibidores de Src (por exemplo, Dasatinib), um inibidor de TNFa e um inibidor de IL-6. Um exemplo de um inibidor de TNFa é uma molécula de anticorpo anti-TNFa, como infliximabe, adalimumabe, certolizumabe pegol e golimumabe. Outro exemplo de um inibidor de TNFa é uma proteína de fusão como o entanercepte. Um exemplo de um inibidor de IL-6 é uma molécula de anticorpo anti-IL-6 ou uma molécula de anticorpo anti-receptor de IL-6, como tocilizumabe (dedo do pé), sarilumabe, elsilimomabe, CNTO 328, ALD518 / BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301 e FM101. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-receptor de IL-6 é tocilizumabe. Em uma modalidade, o inibidor de IL-6 é um anticorpo biespecífico de camelídeo que se liga a IL6R e albumina de soro humano (por exemplo, IL6R-304-Alb8) (SEQ ID NO: 2649). Um exemplo de um inibidor baseado em IL-lR é anakinra. Em uma modalidade, um agente administrado para tratar os efeitos colaterais de células que expressam CAR é um inibidor de Src (por exemplo, Dasatinib). Em uma modalidade, um agente administrado para tratar os efeitos colaterais de células que expressam CAR é o inibidor de Src Dasatinib. Nas modalidades, dasatinib é administrado em uma dose de cerca de 10 mg / dia a 240 mg / dia (por exemplo, 10 mg / dia, 20 mg / dia, 40 mg / dia, 50 mg / dia, 70 mg / dia, 80 mg / dia, 100 mg / dia, 110 mg / dia, 120 mg / dia, 140 mg / dia, 180 mg / dia, 210 mg / dia, 240 mg / dia ou 300 mg / dia).

[00588] Em uma modalidade, o sujeito pode ser administrado com um agente que aumenta a atividade de uma célula que expressa CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agente pode ser um agente que inibe uma molécula inibidora. As moléculas inibidoras, por exemplo, Morte Programada 1 (PD-1), podem, em algumas modalidades, diminuir a capacidade de uma célula que expressa CAR para montar uma resposta imune efetora. Exemplos de moléculas inibidoras incluem PD-1, PDLl, CTLA-4, TIM-3, CEACAM (por

226 / 308 exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e / ou CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIRl, CD160, 2B4 e TGFR beta. A inibição de uma molécula inibidora, por exemplo, por inibição no nível de DNA, RNA ou proteína, pode otimizar o desempenho de uma célula que expressa CAR. Em modalidades, um ácido nucleico inibitório, por exemplo, um ácido nucleico inibitório, por exemplo, um dsRNA, por exemplo, um siRNA ou shRNA, um agrupamento de repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas (CRISPR), um ativador de transcrição como nuclease efetora (TALEN), ou uma endonuclease de dedo de zinco (ZFN), por exemplo, como aqui descrito, pode ser usada para inibir a expressão de uma molécula inibidora na célula que expressa CAR. Em uma modalidade, o inibidor é um shRNA. Em uma modalidade, a molécula inibidora é inibida dentro de uma célula que expressa CAR. Nessas modalidades, uma molécula de dsRNA que inibe a expressão da molécula inibidora está ligada ao ácido nucleico que codifica um componente, por exemplo, todos os componentes do CAR. Em uma modalidade, o inibidor de um sinal inibidor pode ser, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a uma molécula inibidora. Por exemplo, o agente pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a PD-1, PD-L1, PD-L2 ou CTLA4. Em uma modalidade, o agente é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a TIM3. Em uma modalidade, o agente é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 e / ou CEACAM-5). Em uma modalidade, o agente é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a LAG3.

[00589] Anticorpos, fragmentos de anticorpos e outros inibidores de PD- 1, PD-L1 e PD-L2 estão disponíveis na técnica e podem ser usados em combinação com um CAR da divulgação aqui descrita. O pembrolizumabe é um anticorpo monoclonal IgG4 humanizado que se liga ao PD-1. Em outras modalidades, o agente que aumenta a atividade de uma célula que expressa CAR é um inibidor CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e / ou

227 / 308 inibidor CEACAM-5).

[00590] Em uma modalidade, o agente que aumenta a atividade de um CAR aqui descrito é outro agente que aumenta a expressão do antígeno alvo contra o qual o CAR é direcionado. Os agentes que podem ser administrados ao sujeito que recebe uma célula que expressa CAR aqui descritos incluem: Trióxido de arsênio, ATRA (ácido trans-retinóico), compostos 27, 40, 49 de (Du et al, Sangue; Pré-publicado online em 12 de outubro, 2016), inibidores de IDH2 (por exemplo, AG-221) ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, os agentes são administrados antes, simultaneamente ou após a administração de células que expressam CAR. Em modalidades preferidas, esses agentes são administrados antes da administração de células que expressam CAR. Na modalidade preferida, as células que expressam CAR que são administradas com os agentes acima têm como alvo um antígeno de células B (por exemplo, CD19, CD20 ou CD22, etc.).

[00591] Em uma modalidade, o agente que aumenta a atividade de um CAR ou CAR de próxima geração aqui descrito é um receptor solúvel. O receptor solúvel que pode ser administrado ao sujeito que recebe uma célula que expressa CAR aqui descrito inclui: sHVEM (SEQ ID NO:2664), proteína de fusão sHVEM-Alb8-vHH (SEQ ID NO:2665) ou uma combinação dos mesmos. O receptor solúvel pode ser administrado uma vez ao dia ou mais de uma vez ao dia, por exemplo, duas vezes ao dia, três vezes ao dia ou quatro vezes ao dia. O receptor solúvel pode ser administrado por mais de um dia, por exemplo, o receptor solúvel é administrado por 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas ou 4 semanas. Por exemplo, o receptor solúvel é administrado uma vez por dia durante 7 dias.

[00592] Em uma modalidade, o sujeito pode ser administrado com um agente que protege contra a toxicidade de uma célula que expressa CAR em tecidos normais. Uma das limitações da terapia com células CAR-T pode ser a toxicidade no tecido normal. Por exemplo, CAR ou CAR de próxima geração

228 / 308 visando CD19 pode levar à depleção de longo prazo de células B normais, que também expressam o antígeno CD19. Em uma modalidade, a terapia com células CD19 CAR-T pode ser combinada com knock-out ou mutação de CD19 endógeno em células-tronco hematopoiéticas normais.

Em uma modalidade, o nocaute ou mutação do CD19 endógeno é alcançado usando CRIPS / Cas9, Talons ou outros métodos de edição de genes adequados que são conhecidos na técnica.

O epítopo de CD19 ligado pelas células CD19 CAR-T no uso clínico atual foi mapeado para o exon 2-4. Em uma modalidade, mutações sem sentido ou sem sentido são geradas no exon 2 (ou outros exons / regiões adequados que são reconhecidos por células T CAR direcionadas a CD19) de células-tronco hematopoiéticas autólogas ou alogênicas usando CRISP / Cas9, nucleases de dedo Zn, Talons ou outros métodos conhecidos na técnica.

Em uma modalidade, o sujeito recebe uma infusão de células CD19 CAR - T para controlar sua doença e um transplante de células-tronco autólogas ou alogênicas usando células-tronco hematopoiéticas excluídas / mutadas de CD19. Como as células B que se originaram das células-tronco modificadas não serão direcionadas pelas células CD19-CAR-T, o paciente escapará da aplasia de células B, que é um efeito colateral comum das células CD19 CAR- T.

Em outra modalidade, a terapia com células MPL CAR-T é combinada com nocaute ou mutação de MPL endógeno em células-tronco hematopoiéticas normais.

Em outra modalidade, a terapia com células T CD123 CAR é combinada com nocaute ou mutação de CD123 endógeno em células-tronco hematopoiéticas normais.

Em outra modalidade, a terapia com células CD33 CAR-T é combinada com nocaute ou mutação de CD33 endógeno em células- tronco hematopoiéticas normais.

Em outra modalidade, a terapia com células CD20 CAR-T é combinada com nocaute ou mutação de CD20 endógeno em células-tronco hematopoiéticas normais.

Em outra modalidade, a terapia de células CD22 CAR-T é combinada com nocaute ou mutação de CD22 endógeno em células-tronco hematopoiéticas normais.

Em outra modalidade, a

229 / 308 terapia com células CS1 CAR-T é combinada com nocaute ou mutação de CS1 endógeno em células-tronco hematopoiéticas normais. Em outra modalidade, a terapia com células BCMA CAR-T é combinada com knock-out ou mutação de BCMA endógeno em células-tronco hematopoiéticas normais. Em outra modalidade, a terapia com células CD45 CAR-T é combinada com nocaute ou mutação de CD45 endógeno em células-tronco hematopoiéticas normais ou células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK). Essencialmente, uma abordagem semelhante poderia ser usada para mitigar a toxicidade das células CAR-T contra o tecido normal, onde o antígeno direcionado pelo CAR ou CAR de próxima geração também é expresso em células-tronco hematopoiéticas normais ou uma de suas progênies.

[00593] Em outra modalidade, a terapia com células CAR-T é combinada com nocaute ou mutação do gene endógeno ou proteína dirigida pelo CAR ou CAR de próxima geração na célula imune efetora (por exemplo, células T ou células NK) ou tronco -células que dão origem às células efetoras do sistema imunológico. Por exemplo, uma vez que o CD45 é expresso em todas as células hematopoiéticas, as células CAR-T direcionadas a CD45 seriam difíceis de gerar, pois seriam mortas pelas células vizinhas CD45- CART. No entanto, tais células podem ser geradas se a expressão de CD45 CAR em células T for combinada com knock-down ou deleção de CD45 endógeno nas células T em que CD45 CAR ou CAR de próxima geração está sendo expresso. Essencialmente, uma abordagem semelhante pode ser usada para gerar CAR ou CAR de próxima geração visando outros antígenos que são expressos em células efetoras imunes. Exemplos de tais antígenos incluem, mas não estão limitados a, CD5, TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, preTCR α e vários receptores expressos em células NK.

[00594] As citocinas que podem ser administradas ao sujeito que recebe uma célula que expressa CAR aqui descritas incluem: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18, LIGHT e IL- 21, ou uma combinação dos mesmos. Em

230 / 308 modalidades preferidas, a citocina administrada é IL-7, IL-15 ou IL-21, IL12F ou uma combinação dos mesmos. A citocina pode ser administrada uma vez ao dia ou mais de uma vez ao dia, por exemplo, duas vezes ao dia, três vezes ao dia ou quatro vezes ao dia. A citocina pode ser administrada por mais de um dia, por exemplo, a citocina é administrada por 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas ou 4 semanas. Por exemplo, a citocina é administrada uma vez por dia durante 7 dias. Em uma modalidade preferida, a citocina administrada após a administração de células que expressam CAR é IL-7.

[00595] Em uma modalidade, o agente que aumenta a atividade de uma célula que expressa CAR aqui descrita é um inibidor de Brd4 ou um siRNA ou um shRNA direcionado a BRD4 conforme descrito em (Tolani, B et al., Oncogene, 29; 33 (22): 2928-37. PMID: 23792448) (Tolani, Gopalakrishnan, Punj, Matta e Chaudhary, 2014).

[00596] Também são fornecidas aqui composições farmacêuticas que compreendem qualquer um ou mais dos receptores de antígenos quiméricos, os polinucleotídeos, os polipeptídeos, os vetores, os vírus e / ou as células geneticamente modificadas e / ou compostos químicos e um transportador farmaceuticamente aceitável. Essas composições podem compreender tampões, tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e semelhantes; carboidratos como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos ou aminoácidos, tais como glicina; antioxidantes; agentes quelantes como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições da divulgação são em um aspecto formuladas para administração intravenosa.

[00597] As composições farmacêuticas da divulgação podem ser administradas de uma maneira apropriada para a doença a ser tratada. A quantidade e frequência da administração serão determinadas por fatores como a condição do paciente e o tipo e gravidade da doença do paciente, embora as

231 / 308 dosagens apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos.

[00598] Quando uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é indicada, a quantidade precisa das composições da divulgação a serem administradas pode ser determinada por um médico levando em consideração as diferenças individuais de idade, peso, tamanho do tumor, extensão da infecção ou metástase, e condição do paciente (sujeito). Pode-se geralmente afirmar que uma composição farmacêutica compreendendo as células geneticamente modificadas (células T, células NK) aqui descritas pode ser administrada em uma dosagem de 104 a 109 células/kg de peso corporal, em alguns casos 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro dessas faixas. As composições de células T também podem ser administradas várias vezes nessas dosagens. As células podem ser administradas usando técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia (ver, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988).

[00599] Em algumas modalidades, pode ser desejado administrar células geneticamente modificadas ativadas (células T, células NK) a um sujeito e, em seguida, redesenhar o sangue (ou realizar uma aférese), ativar as células geneticamente modificadas e reinfundir o paciente com essas células geneticamente modificadas ativadas e expandidas. Este processo pode ser realizado várias vezes a cada poucas semanas. Em certos aspectos, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) podem ser ativadas a partir de coletas de sangue de 10 cc a 400 cc. Em certos aspectos, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) são ativadas a partir de amostras de sangue de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc ou 100 cc.

[00600] "Excipiente farmaceuticamente aceitável" significa um excipiente que é útil na preparação de uma composição farmacêutica que é geralmente segura, não tóxica e desejável e inclui excipientes que são aceitáveis para uso veterinário, bem como para uso farmacêutico humano. Esses

232 / 308 excipientes podem ser sólidos, líquidos, semissólidos ou, no caso de uma composição de aerossol, gasosos.

[00601] Em várias modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a divulgação podem ser formuladas para entrega por meio de qualquer via de administração. "Via de administração" pode referir-se a qualquer via de administração conhecida na técnica, incluindo, mas não se limitando a aerossol, nasal, oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, inalação, transmucosa, transdérmica, parenteral, bomba implantável, infusão contínua, aplicação tópica, cápsulas e / ou injeções.

[00602] As composições farmacêuticas de acordo com a divulgação também podem conter qualquer veículo farmaceuticamente aceitável. "Carreador farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utilizado, refere-se a um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável que está envolvido no transporte ou transporte de um composto de interesse de um tecido, órgão ou porção do corpo para outro tecido, órgão ou porção de o corpo. Por exemplo, o transportador pode ser um enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente, solvente ou material encapsulante ou uma combinação dos mesmos. Cada componente do transportador deve ser "farmaceuticamente aceitável" no sentido de que deve ser compatível com os outros ingredientes da formulação. Também deve ser adequado para uso em contato com quaisquer tecidos ou órgãos com os quais possa entrar em contato, o que significa que não deve apresentar risco de toxicidade, irritação, resposta alérgica, imunogenicidade ou qualquer outra complicação que supere excessivamente seus benefícios terapêuticos.

[00603] As composições farmacêuticas de acordo com a divulgação também podem ser encapsuladas, comprimidas ou preparadas em uma emulsão ou xarope para administração oral. Veículos sólidos ou líquidos farmaceuticamente aceitáveis podem ser adicionados para melhorar ou estabilizar a composição, ou para facilitar a preparação da composição. Os

233 / 308 transportadores líquidos incluem xarope, óleo de amendoim, azeite, glicerina, solução salina, álcoois e água. Os transportadores sólidos incluem amido, lactose, sulfato de cálcio, di-hidrato, terra alba, estearato de magnésio ou ácido esteárico, talco, pectina, acácia, ágar ou gelatina. O transportador também pode incluir um material de liberação sustentada, como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila, sozinho ou com uma cera.

[00604] As preparações farmacêuticas são feitas de acordo com as técnicas convencionais de farmácia envolvendo moagem, mistura, granulação e compressão, quando necessário, para formas de comprimidos; ou moagem, mistura e enchimento para formas de cápsulas de gelatina dura. Quando um veículo líquido é usado, a preparação estará na forma de xarope, elixir, emulsão ou uma suspensão aquosa ou não aquosa. Tal formulação líquida pode ser administrada diretamente por via oral ou introduzida em uma cápsula de gelatina mole.

[00605] As composições farmacêuticas de acordo com a divulgação podem ser entregues em uma quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade terapeuticamente eficaz precisa é aquela quantidade da composição que produzirá os resultados mais eficazes em termos de eficácia do tratamento em um determinado sujeito. Esta quantidade irá variar dependendo de uma variedade de fatores, incluindo, mas não se limitando às características do composto terapêutico (incluindo atividade, farmacocinética, farmacodinâmica e biodisponibilidade), a condição fisiológica do sujeito (incluindo idade, sexo, tipo de doença e estágio, condição física geral, capacidade de resposta a uma dada dosagem e tipo de medicamento), a natureza do transportador ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis na formulação e a via de administração. Um especialista nas técnicas clínicas e farmacológicas será capaz de determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz através de experimentação de rotina, por exemplo, monitorando a resposta de um sujeito à administração de um composto e ajustando a dosagem em conformidade. Para

234 / 308 obter orientação adicional, consulte Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro ed. 20ª edição, Williams & Wilkins PA, EUA) (2000).

[00606] A administração das composições em questão pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, incluindo por inalação de aerossol, injeção, transfusão, implantação ou transplante. As composições aqui descritas podem ser administradas a um paciente por via trans-arterial, subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por injeção intravenosa ( iv) ou intraperitoneal. Em um aspecto, as composições de células T da divulgação são administradas a um paciente por injeção intradérmica ou subcutânea. Em um aspecto, as composições de células T da divulgação são administradas por i. v. injeção. As composições de células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) podem ser injetadas diretamente em um tumor, nódulo linfático ou local de infecção.

[00607] Em um aspecto exemplar particular, os indivíduos podem sofrer leucaferese, em que os leucócitos são coletados, enriquecidos ou esgotados ex vivo para selecionar e / ou isolar as células de interesse, por exemplo, células T. Estes isolados de células T podem ser expandidos por métodos conhecidos na técnica e tratados de modo que um ou mais CAR ou construtos de CAR de próxima geração da divulgação possam ser introduzidos, criando assim uma célula CAR - T da divulgação. Os indivíduos com necessidade podem subsequentemente ser submetidos a tratamento padrão com quimioterapia de alta dose seguida de transplante de células-tronco do sangue periférico. Em certos aspectos, após ou simultaneamente com o transplante, os sujeitos recebem uma infusão das células CAR - T expandidas da divulgação. Em um aspecto adicional, as células expandidas são administradas antes ou após a cirurgia.

[00608] Em uma modalidade, o CAR é introduzido em células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT), por exemplo, usando a transcrição in vitro, e o sujeito (por exemplo, humano) recebe uma

235 / 308 administração inicial de CAR ou CAR de próxima geração células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NKT) da divulgação, e uma ou mais administrações subsequentes do CAR ou células efetoras imunes do CAR de próxima geração (por exemplo, células T, células NK) da divulgação, em que um ou mais as administrações subsequentes são administradas menos de 15 dias, por exemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 dias após a administração anterior.

Em uma modalidade, mais de uma administração do CAR ou células efetoras imunes do CAR de próxima geração (por exemplo, células T, células NK) da divulgação são administradas ao sujeito (por exemplo, humano) por semana, por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações do CAR ou células efetoras imunes do CAR de próxima geração (por exemplo, células T, células NK) da divulgação são administradas por semana.

Em uma modalidade, o sujeito (por exemplo, sujeito humano) recebe mais de uma administração das células efetoras imunes CAR (por exemplo, células T, células NK) por semana (por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações por semana) (também referido como aqui como um ciclo), seguido por uma semana sem CAR ou de administração de células efetoras imunes CAR de próxima geração (por exemplo, células T, células NK) e, em seguida, uma ou mais administrações adicionais do CAR ou células efetoras imunes CAR de próxima geração (por exemplo , Células T, células NK) (por exemplo, mais de uma administração do CAR ou células efetoras imunes do CAR de próxima geração (por exemplo, células T, células NK) por semana) é administrada ao sujeito.

Em outra modalidade, o sujeito (por exemplo, sujeito humano) recebe mais de um ciclo de CAR ou células efetoras imunes do CAR de próxima geração (por exemplo, células T, células NK) e o tempo entre cada ciclo é inferior a 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3 dias.

Em uma modalidade, o CAR ou as células efetoras imunes do CAR de próxima geração (por exemplo, células T, células NK) são administradas a cada dois dias durante 3 administrações por semana.

Em uma modalidade, as células efetoras imunes CAR (por exemplo, células T, células

236 / 308 NK) da divulgação são administradas por pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais semanas.

[00609] Um problema potencial que pode surgir em pacientes sendo tratados usando CAR expressando transitoriamente ou células efetoras imunes do CAR de próxima geração (por exemplo, células T, células NK) (particularmente com scFv murino com CAR-Ts) é a anafilaxia após múltiplos tratamentos.

[00610] Sem estar limitado por esta teoria, acredita-se que tal resposta anafilática pode ser causada por um paciente que desenvolve resposta anti-CAR humoral, isto é, anticorpos anti-CAR tendo um isotipo anti-IgE. Pensa-se que as células produtoras de anticorpos de um paciente passam por uma mudança de classe do isótipo IgG (que não causa anafilaxia) para o isótipo IgE quando há uma pausa de dez a quatorze dias na exposição ao antígeno.

[00611] Se um paciente está em alto risco de desenvolver uma resposta anafilática ao CAR ou terapia CAR de próxima geração ou gerar uma resposta de anticorpo do tipo CAR de IgE durante o curso do CAR ou terapia CAR de próxima geração, então omalizumabe (Xolair) pode ser administrado antes ou durante o CAR ou terapia CAR de próxima geração.

[00612] Se um paciente está em alto risco de gerar uma resposta de anticorpo anti-CAR durante o curso de CAR transitório ou terapia de CAR de próxima geração (como aquelas geradas por transduções de RNA), as interrupções de infusão de CAR-T não devem durar mais de dez a quatorze dias.

[00613] Kits para praticar a divulgação também são fornecidos. Por exemplo, kits para tratar um câncer em um sujeito ou fazer uma célula CAR-T que expressa um ou mais dos CARs ou CARs de próxima geração divulgados neste documento. Os kits podem incluir uma molécula de ácido nucleico ou uma molécula de polipeptídeo que codifica um CAR ou CAR de próxima geração ou um vetor que codifica um CAR ou CAR de próxima geração,

237 / 308 juntamente com um método para introduzir o ácido nucleico nas células efetoras imunes. O kit pode incluir um vírus que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR ou CAR de próxima geração e produtos químicos, como polibreno, para aumentar a transdução do vírus. O kit pode conter componentes para isolamento de células T para expressar um CAR ou CAR de próxima geração. Alternativamente, o kit pode conter células efetoras imunológicas (por exemplo, células T ou células NK) ou células-tronco que expressam um CAR ou CAR de próxima geração. Mais de um dos CAR divulgados podem ser incluídos no kit. O kit pode incluir um recipiente e um rótulo ou folheto informativo no recipiente ou associado a ele.

[00614] Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente normalmente contém uma composição incluindo uma ou mais das moléculas de ácido nucleico, vírus, vetores, células T que expressam um CAR ou CAR de próxima geração. Em várias modalidades, o recipiente pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Um rótulo ou folheto informativo indica que a composição é usada para tratar a condição particular. O rótulo ou bula tipicamente incluirá ainda instruções para o uso de moléculas de ácido nucleico divulgadas, CARs ou CARs de próxima geração ou células T que expressam um CAR ou CAR de próxima geração, por exemplo, em um método de tratamento ou prevenção de um tumor ou de produção um CAR - célula T. A bula normalmente inclui instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contra- indicações e / ou advertências relacionadas ao uso de tais produtos terapêuticos. Os materiais de instrução podem ser escritos em formato eletrônico (como um disquete de computador ou disco compacto) ou podem ser visuais (como

238 / 308 arquivos de vídeo). Os kits também podem incluir componentes adicionais para facilitar a aplicação específica para a qual o kit foi projetado. Assim, por exemplo, o kit pode conter adicionalmente meios para medir a expressão do CAR ou CAR de próxima geração em células T ou para determinar o número ou porcentagem de células que expressam o CAR ou para determinar a funcionalidade das células CAR-T. Os kits podem incluir adicionalmente tampões e outros reagentes usados rotineiramente para a prática de um método particular. Esses kits e conteúdos apropriados são bem conhecidos dos versados na técnica.

[00615] Modelos animais também podem ser usados para medir a atividade do CAR. Por exemplo, pode ser usado o modelo de xenoenxerto + usando antígeno associado ao câncer humano aqui descrito células T CAR específicas para tratar uma LLA pré-B humana primária em camundongos imunodeficientes. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17 (S): 1453-1464 (2009).

[00616] A resposta ao tratamento CAR dependente da dose pode ser avaliada. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17 (S): 1453- 1464 (2009).

[00617] A avaliação da proliferação celular e da produção de citocinas foi descrita anteriormente, por exemplo, em Milone et al., Molecular Therapy 17 (S): 1453-1464 (2009).

[00618] A citotoxicidade pode ser avaliada por ensaio de matador ou usando um padrão de 51 ensaio de Cr de libertação. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular T herapy 17 (8): 1453-1464 (2009).

[00619] As tecnologias de imagem podem ser usadas para avaliar o tráfego específico e a proliferação de zSIRs em modelos animais com tumor. Tais ensaios foram descritos, por exemplo, em Barrett et al., Human Gene Therapy 22: 1575-1586 (2011).

[00620] Outros ensaios, incluindo aqueles descritos na seção Exemplo

239 / 308 deste documento, bem como aqueles que são conhecidos na técnica, também podem ser usados para avaliar o CAR aqui descrito.

EXEMPLOS

[00621] A atividade de um CAR pode ser testada por vários ensaios in vitro e in vivo descritos aqui e abaixo. Um esquema geral para gerar, selecionar e usar CARs adequados é fornecido abaixo:

[00622] Identificação de alvo para geração de CAR. Um alvo adequado contra o qual o CAR é projetado é selecionado com base na pesquisa da literatura ou com base na pesquisa de bancos de dados de expressão de genes. Em geral, um alvo adequado para um CAR mostra uma expressão mais elevada nas células causadoras da doença ou associadas à doença em comparação com as células saudáveis normais.

[00623] Geração de CAR. Uma vez que um antígeno alvo candidato para CAR é identificado, o domínio de ligação ao antígeno do CAR é projetado com base nas informações disponíveis na literatura. Em geral, o domínio de ligação ao antígeno do CAR é tipicamente baseado em um anticorpo, fragmentos de anticorpo, scFV ou domínios vHH de camelídeo. As sequências das cadeias variáveis de cadeias pesadas (vH) e leves (vL) de anticorpos, os domínios vHH de camelídeo e vários receptores e ligantes podem ser obtidas por sequenciamento ou por bancos de dados disponíveis publicamente e podem ser usados para a síntese de um CAR usando o métodos descritos neste documento como mostrado em diferentes exemplos. As sequências que compreendem os domínios de ligação ao antígeno de CAR são otimizadas por códons e sintetizadas artificialmente usando software disponível publicamente (por exemplo, ThermoFisher ou IDT) e fornecedores comerciais (por exemplo, IDT). Os fragmentos resultantes são amplificados por PCR e clonados em diferentes vetores contendo os diferentes estrutura principais CAR usando técnicas de Biologia Molecular padrão. As diferentes estruturas CAR são descritas em WO 2016/187349 A1, PCT / US2016 / 058305, US 62 / 429.597,

240 / 308 PCT / US17 / 64379 e PCT / US2017 / 024843, que são incorporados inteiramente neste documento por referência. Em geral, os construtos CAR são tipicamente clonados em um vetor lentiviral. As sequências dos construtos são confirmadas usando sequenciamento automatizado.

[00624] Outro construto exemplar que codifica um zSIR é pLenti-EF1α- CD8SP-BCMA-Am06-HL-vL-IgCL-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe- SP-Bst-BCMA-Am06-HL-vH- IgG1-CH1-KPN-CD3zECDTMCP-opt2-F- F2A-Xba-PAC-DWPRE (SEQ ID NO: 154). Este construto tem muitos locais de restrição convenientes de modo que os fragmentos do domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, domínios vL e vH) possam ser cortados e substituídos pelos fragmentos do domínio de ligação ao antígeno direcionados a outros antígenos. O vetor carrega um sítio Nhe I a montante do peptídeo sinal CD8 (CD8SP), que também pode ser usado junto com o sítio Xho I para clonar em um novo fragmento vL carregando um peptídeo sinal 5 '. Os locais BstB I e Mlu I podem ser usados para substituir o fragmento vH. Os sites Xho I e Spe I podem ser usados para substituir o módulo que codifica IgCL- [IgCL-Bam- CD3zECDTMCP-opt-F-P2A por um módulo diferente. Da mesma forma, os locais MluI e Xba podem ser usados para substituir o módulo contendo IgG1- CH1-KPN-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A. O módulo acessório que codifica PAC pode ser substituído usando os locais de restrição Xba I (ou Nde I) e SalI. Assim, uma pessoa com habilidades oridinárias na técnica pode usar este vetor e a sequência do domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, domínios vL e vH de um anticorpo) para gerar zSIRs direcionados a qualquer outro novo antígeno.

[00625] Geração de antígeno secretor-proteínas de fusão NLuc e domínio de ligação ao antígeno (ABD)-proteínas de fusão NLuc. (Etapa opcional).

[00626] Antígeno secretor - proteínas de fusão NLuc e domínio de ligação ao antígeno (ABD) - proteínas de fusão NLuc foram geradas e

241 / 308 utilizadas conforme descrito em PCT / US2017 / 025602, que é incorporado neste documento em sua totalidade por referência. Um painel de linhas de células é testado quanto à ligação à proteína de fusão ABD-NLuc para identificar linhas de células que expressam alto nível de alvo CAR e, portanto, podem ser usadas para testar a atividade de CAR. A Tabela A fornece uma lista exemplar de linhas celulares que expressam diferentes alvos de antígeno que podem ser usados para testar a atividade de um CAR desta divulgação. As linhas celulares que expressam o alvo de CAR também podem ser identificadas usando métodos alternativos, como pesquisa de literatura, imunocoloração com anticorpos disponíveis comercialmente ou por pesquisa de bancos de dados de expressão de genes disponíveis publicamente.

[00627] As células imunes efetoras que expressam CAR são testadas nos seguintes ensaios para identificar o CAR funcional.

[00628] (A) Ensaio de Topanga ( ensaio de ligação de NLuc) : Jurkat- NFAT-GFP ou células T que expressam um vetor de controle e o CAR são coradas com a proteína de fusão Antígeno-Nluc alvo (como descrito acima) e sua capacidade de se ligar ao antígeno alvo é avaliada medindo a atividade Nluc. Por exemplo, as células Jurkat-NFAT-GFP que expressam CAR baseado em FMC63 que tem como alvo CD19 mostram ligação aumentada à proteína de fusão CD19-NLuc em comparação com células Jurkat-NFAT-GFP parentais ou células Jurkat-NFAT-GFP que expressam um vetor de controle.

[00629] (B) Indução da expressão de GFP conduzida pelo promotor NFAT. As células Jurkat-NFAT-GFP que expressam o vetor de controle e o CAR são co-cultivadas por 4-24 horas com a linha celular que expressa o antígeno alvo (descrito acima) e sua capacidade de se ligar ao antígeno alvo é testada medindo a indução da expressão de GFP usando citometria de fluxo. O sobrenadante celular é coletado e testado quanto à indução de citocinas (por exemplo, IL2).

[00630] (C) Ensaio para a produção de citocinas : O vetor de controlo e

242 / 308 CAR-expressing Jurkat células -NFAT-GFP ou T são co-cultivadas com as linhas de células alvo para 4-96 horas e o sobrenadante examinado para a indução de citoquinas (por exemplo, IL-2, IFNγ, TNFα etc.) expresson usando ELISA.

[00631] (D) Ensaio de atividade citotóxica in vitro e in vivo : As células T não infectadas ou aquelas que expressam um vetor de controle ou CAR são co-cultivadas com as linhas de células alvo que expressam uma forma não secretória de uma luciferase (como GLuc, NLuc, Turboluc 16 etc.) por 4-96 horas e indução de lise celular examinado medindo a atividade da luciferase como descrito em PCT / US17 / 52344. Métodos alternativos para medição da 51 atividade citotóxica (por exemplo, ensaio de liberação de Cr ou ensaio de liberação de LDH) também podem ser usados. A atividade das células T que expressam um CAR também pode ser avaliada in vivo usando modelos de xenoenxerto apropriados em camundongos imunodeficientes.

[00632] Com base nos métodos acima, uma pessoa versada na técnica pode facilmente projetar, construir, testar e selecionar o CAR funcionando apropriado ou conjunto de CARs contra qualquer antígeno. O CAR ou um pool de CARs pode ser usado para ensaios clínicos em humanos e uso clínico para a prevenção e tratamento de várias doenças. A Tabela 9 fornece uma lista exemplar de condições de doenças humanas que podem ser tratadas usando os CARs da divulgação.

[00633] É possível que diferentes CARs ou subconjuntos de CARs sejam idealmente adequados para diferentes condições de doença, dependendo de vários fatores, incluindo, mas não se limitando a, a prevalência e o nível de expressão do antígeno alvo em células causadoras de doenças e associadas à doença, carga da doença e taxa de progressão da doença. Diferentes CARs podem ser perfeitamente adequados até mesmo para uma única doença em diferentes pacientes, dependendo de sua eficácia e perfil de toxicidade e da condição do paciente. A divulgação fornece uma solução para os obstáculos

243 / 308 técnicos e logísticos significativos para gerar uma resposta imune adotiva diversa.

[00634] A diversidade normal de TCR é produzida por rearranjo gênico. Rigorosos processos de seleção positiva e negativa no timo garantem que apenas as células T que expressam o TCR αβ que são restritas ao reconhecimento de autopeptídeos / MHC dentro de uma faixa de baixa afinidade possam povoar a periferia. Assim, o ambiente tímico permite a geração de um pool de células T αβ que são autorrestritas, mas não autorreativas.

[00635] Que gera um conjunto diversificado de CAR s de diferentes domínios de ligação de antigénio é limitado pelos obstáculos técnicos e financeiros de gerar e testar vários domínios de ligação de antigénio. Mais importante, como cada um dos antigénio de domínios de ligação (por exemplo, VL e VH de fragmentos de um anticorpo) tem um potencial de se ligar a outros Antiges e causando fora do alvo toxicidade, um conjunto diversificado de CAR s baseadas apenas em uma pluralidade de domios de ligao de antigio potencialmente tem um risco aumentado de toxicidade. Portanto, a diversidade potencial de tal pool teria que ser limitada para reduzir a toxicidade fora do alvo. A divulgação atual supera esse problema ao gerar um conjunto diversificado de CARs de um único ou alguns domínios de ligação ao antígeno, anexando-os a diferentes variantes de cadeias de TCR. A diversidade do pool do CAR é ainda maior com o uso de diferentes vinculadores. A diversidade de células T que expressam o pool pode ser aumentada ainda mais pelo uso de diferentes módulos acessórios e controles terapêuticos descritos na divulgação.

[00636] Este conjunto diversificado de CARs pode ser usado para fornecer uma resposta imune diversa contra células causadoras de doenças ou associadas a doenças que expressam o referido antígeno. Alternativamente, o conjunto diversificado de CARs pode ser opcionalmente codificado em barras de DNA (SEQ ID NO: 123-128) usando técnicas conhecidas na técnica e

244 / 308 subsequentemente usadas para selecionar um único ou um subgrupo de CARs com características biológicas e clínicas ideais. Estas características podem incluir, mas não estão limitadas a, desempenho nos ensaios biológicos in vitro (por exemplo, citotoxicidade, secreção de citocinas, afinidade de ligação, expressão da superfície celular, efeitos fora do alvo, proliferação de células T, expressão de marcadores de exaustão e diferenciação terminal, etc.), desempenho nos ensaios in vivo (por exemplo, sobrevivência, redução do tumor, persistência de células T, expansão de células T etc.) e experiência clínica (por exemplo, remissão da doença, taxa de recaída, toxicidades, etc.). Os CARs da divulgação podem ser usados isoladamente ou em combinação com outros receptores imunes naturais e sintéticos conhecidos na técnica para gerar um conjunto diversificado de células efetoras imunes para a prevenção e tratamento de várias condições de doença causadas por ou associadas a células que expressam seus antígenos alvo.

[00637] Fragmentos de genes que codificam os diferentes peptídeos de sinal, domínios de ligação de anticorpos, ligantes, cadeias constantes de TCR, ligantes cliváveis e marcadores de seleção (por exemplo, PAC, EGFP, CNB30 etc.) foram sintetizados artificialmente em fragmentos únicos ou múltiplos usando um fornecedor comercial ( IDT) e usados como modelos em reações de PCR com iniciadores contendo enzimas de restrição apropriadas. Os fragmentos amplificados foram digeridos com enzimas de restrição apropriadas e depois clonados no pLENTI-EF1α (SEQ ID NO: 129), pLENTI-EF1α- DWPRE (SEQ ID NO: 130), pCCLc-MNDU3-WPRE (SEQ ID NO: 12639) ou vetores MSCV-Bgl2-AvrII-Bam-EcoR1-Xho-BstB1-Mlu-Sal-ClaI.I03 (SEQ ID NO: 131) usando técnicas de biologia molecular padrão. Os fragmentos CAR foram clonados entre os locais Nhe I e Sal I no pLENTI-EF1α (SEQ ID NO: 129), pLENTI-EF1α-DWPRE (SEQ ID NO: 130), pCCLc-MNDU3- WPRE (SEQ ID NO: 12639) vetores. O fragmento resultante pode então ser usado como um molde na reação de PCR com iniciadores contendo enzimas de

245 / 308 restrição apropriadas. O fragmento amplificado pode ser digerido com enzimas de restrição apropriadas e então clonado no vetor apropriado usando técnicas de biologia molecular padrão.

[00638] Linhas celulares projetadas para expressar luciferases (por exemplo, GLuc ou NLuc) para medir a citotoxicidade de diferentes construtos alvejando diferentes superfícies celulares e antígenos intracelulares são fornecidos na Tabela A. As linhas celulares usadas nestes experimentos, antígenos alvo nas linhas celulares e seus os meios de crescimento são mostrados na seguinte Tabela A. As células foram cultivadas a 37 °C, em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. As linhas de células foram obtidas da ATCC, NIH AIDS reagent program ou estavam disponíveis no laboratório. Tabela A: Linha celular Condições de Cultura Antígenos alvo CAR exemplares expressos BC-1 RPMI, 20% FCS BCMA, GPRC, CD138 BC-3 RPMI, 20% FCS BCMA, GPRC, CD138 BCBL-1 RPMI, 20% FCS GPRC, CD138 JSC-1 RPMI, 20% FCS GPRC, CD138 MM1S RPMI, 10% FCS CD38, GPRC, CD44, CD200R U266 RPMI, 10% FCS BCMA, WT1 / HLA-A2 +, CS1, CLL1, CD138, c- MET, IL6R, CD179b, NY-ESO / HLA-A2, NYBR, LAMP1 L363 RPMI, 10% FCS BCMA, GPRC, WT1 / HLA-A2 +, CS1, CLL1, CD138, NY-ESO / HLA-A2, NYBR, LAMP1 K562 RPMI, 10% FCS CD33, IL1Ra, TnAg BV173 RPMI, 10% FCS CD123, CD179b, IL1Ra, WT1 / HLA-A2 +, CXCR4, FLT3, CD179a Nalm6 RPMI, 10% FCS CD19, CD20, CD22, CD179b, CD179a HL60 RPMI, 10% FCS CD33, CD34, CLL1, IL6R, CD32, CD179 U937 RPMI, 10% FCS CD4, CLL1 RS4: 11 RPMI, 20% FCS CD19, receptor de folato beta ( FRbeta), TGFbeta, CD179b, NKG2D, FLT3, CD179a, CD133 MV 4; 11 RPMI, 10% FCS FLT3, CD123, FRbeta Raji RPMI, 10% FCS CD19, CD20, CD22, BCMA, CD38, CD70, CD79, receptor de folato beta, CLL1 HEL-92.1.7 RPMI, 10% FCS MPL, CD33, CD32, CD200R, Cripto (HEL) Jurkat RPMI, 10% FCS TnAg, TSLRP, TSHR, CD4, CD38 Daudi RPMI, 10% FCS BCMA, FRbeta REC-1 RPMI, 10% FCS NKG2D, ROR1, CD19, FCRH5, BAFF-R KG-1 RPMI, 20% FCS CD33, CD34, CD123, TSLRP, EMR2, VISTA, BST1 CEM RPMI, 10% FCS CD5, CD43 U937 RPMI, 10% FCS CD4, CLL1 LAMA5 RPMI, 10% FCS WT1 / HLA-A2 A549 DMEM, 10% FCS ROR1, CD22, TIM1, CDH17 HT29 DMEM, 10% FCS EGFR, SLEA, c-MET Molm-13 RPMI, 20% FCS FLT3, IL6R, LAMP1, TSLRP, CD4, CSF2RA,

246 / 308 Linha celular Condições de Cultura Antígenos alvo CAR exemplares expressos CXCR4, IL6R, CSF2RA, GPC3, EMR2, BST1 A431 DMEM, 10% FCS EGFR, receptor alfa de folato (FOLR1), Her3 P19 DMEM, 10% FCS SSEA THP-1 RPMI, 10% FCS CD32, CD33, CXCR4, CD123, CD44, IL6R, receptor de folato beta, CD70, LAMP1, FLT3, CSF2RA, IL1RAP U87MG DMEM, 10% FCS CD276, gpNMB, IL13RA2, MMP16 LoVo DMEM, 10% FCS Fator de tecido, CDH17, EGFR, CEA, RNF43 SKOV-3 DMEM, 10% FCS Receptor de folato alfa (FR1), FSHR, Her2, Her3, LHR, MSLN, TIM1, EPCAM NCI-H1993 DMEM, 10% FCS EGFR Kasumi-1 RPMI, 20% FCS CLEC5A, PR1 / HLA-A2, TGFbeta, Jeko-1 RPMI, 20% FCS BCMA, ROR1, BAFF-R PC-3 DMEM, 10% FCS CGH, TROP2, PSCA, PSMA. EPCAM, FSHR, CLD18A2 (CLDN18.2), STEAP1 HeLa DMEM, 10% FCS EGFR, FR1, MSLN, TSHR LNCaP DMEM, 10% FCS EGFR, FSHR, PSCA, PSMA, CD22, Her3, LHR, CLD18A2 (CLDN18.2), STEAP1, BMPR1B OVCAR-3 DMEM, 10% FCS B7H4, CDH6, DLL3, FR1, FSH, LHR, MSLN, PTK7, TnAg, TSHR, L1CAM, LYPD1, CLDN6, UPK1B, CD133, SLC34A2 MEL-624 DMEM, 10% FCS CDH19, GD2, GD3, gp100 / HLA-A2, gpNMB, HMWMAA, NYESO / HLA-A2, MART1 / HLA-A2 LS174-T DMEM, 10% FCS CEA MEL-526 DMEM, 10% FCS GD2 MDA-MB231 DMEM, 10% FCS CD324, Muc1 MDA-MB- DMEM, 10% FCS Nectin-4,; WISP1 453 L1236 RPMI, 20% FCS CD30, CD23, PDL1 L428 RPMI, 20% FCS CD30, CD123, CCR4, PDL1 L540 RPMI, 20% FCS CD30, CCR4, PDL1 Molt-16 RPMI, 20% FCS IL1ra, NKG2D CEM RPMI, 10% FCS CD5 MG-63 DMEM, 10% FCS IL13RA2 Karpass-299 RPMI, 20% FCS Alk, GPRC, PDL1 MCF7 DMEM, 10% FCS B7D4, CD276, TROP2, Her3, Muc1, LewisY, LHR, Receptor de Prolactina (PRLR), Liv-1 AA-2 RPMI, 10% FCS Glicoproteína HIV1 env (gp120) HL2 / 3 DMEM, 10% FCS Glicoproteína HIV1 env (gp120) TF228.1.16 DMEM, 10% FCS Glicoproteína HIV1 env (gp120), CCR4 TT DMEM, 10% FCS TGF-Beta, TSHR, GFRalpha4 DMS79 RPMI, 10% FCS Fucosyl-GM1, Slea (CA19.9; Antígeno Sialyl Lewis) LAN-5 DMEM, 10% FCS ALK, DLL3, GFRalpha4, FUCOSYL-GM1 PEER1 RPMI, 10% FCS TSHR SK-MEL-37 DMEM, 10% FCS DLL3, GD2 F9 DMEM, 10% FCS SSEA HepG2 DMEM, 10% FBS GPC3, AFP / HLA-A2, CLDN6

[00639] A linha celular Jurkat (clone E6-1) projetada com um gene repórter GFP dependente de NFAT foi um presente do Dr. Arthur Weiss da UCSF. As células Jurkat foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, penicilina e estreptomicina.

[00640] Geração de Lentivírus e retrovírus. Os lentivírus foram gerados

247 / 308 por transfecção à base de fosfato de cálcio em células 293FT essencialmente como descrito anteriormente (Matta, Hozayev, Tomar, Chugh, & Chaudhary, 2003). As células 293FT foram cultivadas em DMEM com 10% FCS, 4 mM L-Glutamina, 0,1 mM de Aminoácidos não essenciais MEM e 1 mM de piruvato de sódio MEM (aqui referido como DMEM-10). Para a geração de lentivírus, as células 293FT foram semeadas em 10 ml de meio DMEM-10 sem antibióticos em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm de modo que estivessem aproximadamente 80 % confluentes no dia da transfecção. No dia seguinte, as células foram transfectadas pelo método de transfecção de fosfato de cálcio usando 10 μg de plasmídeo de expressão lentiviral que codifica diferentes genes, 7,5 μg de plasmídeo PSPAX2 e 2 μg de plasmídeo PLP / VSVG. Em algumas experiências, a mistura de transfecção também continha entre 2,5 a 5 µg de um plasmídeo que codifica HIV1 Vif (SEQ ID NO: 11269). Aproximadamente 15-16 horas após a transfecção, 9 ml de meio foram removidos e substituídos por 5 ml de meio fresco. Aproximadamente, 48 horas após a transfecção, 5 ml do sobrenadante foram coletados (primeira coleta) e substituídos por 5 ml de meio fresco. Aproximadamente 72 horas após a transfecção, todos os meios foram coletados (segunda coleta, geralmente em torno de 6 ml). Os sobrenadantes recolhidos foram reunidos e centrifugados a 1000 rpm durante 1 minuto para remover quaisquer detritos celulares e células não aderentes. O sobrenadante livre de células foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,45 μm. Em alguns casos, o sobrenadante foi posteriormente concentrado por ultra-centrifugação a 18500 rpm por 2 horas a 4 o C. O pellet viral foi ressuspenso em 1/10 do volume inicial em meio XVIVO. O vírus foi usado fresco para infectar as células alvo ou armazenado congelado em alíquotas a -80 ° C.

[00641] Infecção de células T e PBMC. As células buffy coat foram obtidas de dadores adultos saudáveis não identificados do Blood Bank at Children Hospital of Los Angeles e usadas para isolar células mononucleares

248 / 308 de sangue periférico (PBMC) por centrifugação em gradiente de Ficoll- Hypaque.

PBMC foram usados como tal ou usados para isolar células T usando microcontas magnéticas CD3 (Miltenyi Biotech) e seguindo as instruções do fabricante.

PBMC ou células T isoladas foram ressuspensas em meio XVIVO (Lonza) suplantado com 10 ng / ml de anticorpo CD3, 10 ng / ml de anticorpo CD28 e 100 UI de IL2 humana recombinante.

Alternativamente, foram utilizadas contas de CD3/CD28 e 100 UI de IL2 humana recombinante.

As células foram cultivadas a 37 ° C, em 5% de CO 2 incubadora humidificada.

As células foram ativadas no meio acima por 1 dia antes da infecção com vetores lentivirais.

Em geral, as células primárias (por exemplo, células T) foram infectadas pela manhã usando spin-infecção (1800 rpm por 90 minutos a 37 o C com 300μl de vírus concentrado que havia sido ressuspenso em meio XVIVO na presença de 8 μg / ml de Polybrene® (Sigma, Catálogo no.

H9268). O meio foi trocado à noite e a infecção foi repetida por mais dois dias para um total de 3 infecções.

Após a 3ª infecção, as células foram sedimentadas e ressuspensas em Meio XVIVO contendo 10 ng / ml de anticorpo CD3, 10 ng / ml de anticorpo CD28 e 100 IU de IL2 humana recombinante e suplementado com os respectivos antibióticos (se indicado) e coloque d no frasco de cultura de células para seleção, a menos que indicado de outra forma.

Alternativamente, foram utilizadas contas de CD3/CD28 e 100 IU de IL2 humana recombinante.

As células foram cultivadas no meio acima durante 10-15 dias se nenhuma seleção de droga foi usada e por 20-30 dias se a seleção de droga foi usada.

Nos casos em que as células foram infectadas com um lentivírus que expressa EGFP, elas foram expandidas sem seleção de drogas ou separadas por citometria de fluxo para enriquecer as células que expressam EGFP.

Para infecção de linhas de células cancerosas, aproximadamente 500.000 células foram infectadas com 2 ml do sobrenadante viral não concentrado em um volume total de 3 ml com Polybrene® (Sigma, Catálogo no.

H9268). Então, na manhã seguinte, as células foram sedimentadas e ressuspensas no meio com os respectivos antibióticos e

249 / 308 colocadas no frasco de cultura de células para seleção.

[00642] Essencialmente, um procedimento semelhante ao descrito acima para a produção de vetores de lentivírus foi usado para a geração de vetores retrovirais com a exceção de que as células 293FT foram geralmente transfectadas em placas de cultura de tecidos de 10 cm em 10 ml de meio DMEM-10 usando 10 μg de construção retroviral, 4μg de pKAT e 2μg de plasmídeo VSVG. A coleta de vírus e infecção de células alvo foi realizada essencialmente como descrito acima para vetores lentivirais.

[00643] Anticorpos e drogas. A digitonina foi adquirida da Sigma (Cat. No D141) e uma solução estoque de 100 mg / ml foi feita em DMSO. Um estoque diluído de 1 mg / ml foi feito em PBS. A concentração final de digitonina usada para lise celular foi de 30 μg / ml, salvo indicação em contrário. Fabricação e administração de CAR-T de grau clínico

[00644] Para fabricação de CAR-T de grau clínico, lentivírus de grau cGMP que codificam os CARs são gerados usando fontes comerciais (por exemplo, Lentigen, Lonza etc.). As células T são coletadas de doadores (autólogos ou alogênicos) usando leucaferese. As células CAR-T são fabricadas usando sistema fechado automatizado CLINIMAC Prodigy ( Miltenyi Biotech), conforme descrito (Zhu F, Shah N et al, Cytotherapy, 2017) e seguindo as instruções do fabricante. A multiplicidade de infecção (MOI) entre 5 a 10 é usada. Métodos alternativos para fabricação de CAR-T de grau clínico, como Cocoon (Lonza) e sistemas abertos manuais, são conhecidos na técnica e podem ser usados em modalidades alternativas da invenção. As células CAR-T são administradas ao paciente após quimioterapia de depleção linfática em doses crescentes começando em aproximadamente 1 x 106 células CD3 CAR-T / kg.

[00645] ELISA IL2. IL2, IFNγ, IL6 e TNFα humanos foram medidos na cultura de células sobrenadantes de células efetoras Jurkat-NFAT-GFP ou

250 / 308 células T que expressam o CAR e que foram co-cultivadas com as linhas de células alvo específicas por 24 a 96 horas usando ELISA kits de sistemas de P&D (Minneapolis, MN) e seguindo as recomendações do fabricante.

[00646] Análise FACS. Ratinho anti-humano c - Myc APC - anticorpo monoclonal conjugado (Catálogo # IC3696A) era de R&D Systems (Minneapolis, MN). A proteína L biotinilada foi adquirida a GeneScript (Piscataway, NJ), reconstituída em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 1 mg / ml e armazenada a 4°C. A estreptavidina-APC (SA1005) foi adquirida na ThermoFisher Scientific.

[00647] Para a detecção de CARs usando coloração Myc, 1 × 106 células foram colhidas e lavadas três vezes com 3 ml de tampão de lavagem 1 × PBS gelado contendo 4% de albumina de soro bovino (BSA). Após a lavagem, as células foram ressuspensas em 0,1 ml do tampão de lavagem gelado contendo 10 μl de anticorpo Myc conjugado com APC e incubadas no escuro por 1 hora seguido por duas lavagens com tampão de lavagem gelado.

[00648] Para a detecção de CARs usando coloração com Proteína L, 1 × 106 células foram colhidas e lavadas três vezes com 3 ml de tampão de lavagem 1 × PBS gelado contendo 4% de albumina de soro bovino (BSA). Após a lavagem, as células foram ressuspensas em 0,1 ml do tampão de lavagem gelado contendo 1 μg de proteína L a 4 °C por 1 hora. As células foram lavadas três vezes com tampão de lavagem gelado e, em seguida, incubadas (no escuro) com 10μl de estreptavidina conjugada com APC em 0,1 ml do tampão de lavagem por 30 minutos seguido por duas lavagens com tampão de lavagem gelado. O FACS foi feito usando o analisador FACSVerse da BD Biosciences.

[00649] Ensaio de morte celular. Para medir a morte celular, um novo ensaio com base na expressão citosólica ectópica de Gluc ou NLuc foi utilizado conforme descrito em PCT / US17 / 52344 "Um ensaio de citotoxicidade não radioativa".

[00650] Desenvolvimento de um ensaio para detectar a expressão de

251 / 308 CAR e seus antígenos. Para detectar a expressão de CAR e seus antígenos alvo, um ensaio repórter baseado em luciferase, designado Ensaio Matador, foi utilizado conforme descrito em PCT / US2017 / 025602 "Um ensaio repórter baseado em luciferase altamente sensível e específico para detecção de antígeno".

[00651] Ensaio Jurkat NFAT-GFP para CARs. As células Jurkat- NFAT-GFP são projetadas de tal forma que o promotor IL-2, que carrega locais de ligação de NFAT, é clonado a montante do gene GFP. Essas células têm sido usadas para estudar a sinalização via TCR e CAR. Os diferentes CARs foram expressos de forma estável em células Jurkat NFAT-GFP por transferência de genes mediada por lentivírus, seguida por seleção com puromicina. As células Jurkat-NFAT-GFP que expressam CAR foram co-cultivadas com as células alvo na razão E: T de aproximadamente 1: 2 por aproximadamente 4 horas a 18 horas. Quando a interação entre CARs e seu antígeno alvo resulta na ativação da via NFAT, a expressão de GFP é induzida. Assim, as células Jurkat-NFAT- GFP que expressam CAR mostram níveis aumentados de expressão de GFP quando interagem com linhas de células alvo que expressam o receptor para o CAR.

[00652] A indução da expressão de GFP por cocultura de células Jurkat- NFAT-GFP que expressam diferentes construtos CAR e as diferentes células alvo foi estudada essencialmente como descrito anteriormente (Wu, Roybal, Puchner, Onuffer, & Lim, 2015). A expressão de GFP foi monitorada por análise FACS. As células Jurkat-NFAT-GFP (parentais) foram utilizadas como controle. Os resultados com diferentes CARs estão resumidos na seguinte Tabela de resumo 14. Os nomes de diferentes CARs, suas SEQ ID NOs, domínios de ligação de antígeno de componente e cadeias de TCR podem ser determinados por referência às Tabelas 14. Um CAR é considerado positivo no ensaio no caso de células Jurkat-NFAT-GFP que expressam o CAR mostrarem maior% de células positivas para GFP quando cultivadas com a linha celular

252 / 308 alvo em comparação com as células Parentais Jurkat-NFAT-GFP.

Assim, as células Jurkat-NFAT-GFP que expressam o BCMA CAR representado pela SEQ ID NO: 495 mostraram maior indução da expressão de GFP quando co- cultivadas com as células L363 e U266 em comparação com as células parentais Jurkat-NFAT-GFP.

Os sinais +/-, +, 2+, etc. após o nome das linhas celulares indicam o grau relativo de positividade no ensaio Jurkat-NFAT-GFP, medido pela% de células positivas para GFP após a cultura do Jurkat-NFAT - GFP as células que expressam o CAR com essa linha celular.

Os resultados também demonstram que CARs diferentes contendo o domínio de ligação derivado do mesmo anticorpo mostram grande diversidade em sua capacidade de ativar a sinalização de NFAT usando este ensaio quando expostos à linha celular idêntica dependendo do tipo de CAR.

Além disso, grande diversidade de resposta contra a mesma linha celular alvo é observada com células Jurkat expressando CARs contendo diferentes domínios de ligação ao antígeno direcionados ao mesmo antígeno (por exemplo, CARs tendo domínios de ligação ao antígeno derivados de diferentes anticorpos BCMA), mesmo quando os CARs compartilham os mesmos Arquitetura CAR (por exemplo, BBz CAR ou SIR). Finalmente, as células Jurkat que expressam CARs direcionados a diferentes antígenos (por exemplo, CD19 vs CD20) mostram uma diversidade de resposta quando expostas à mesma linha celular alvo.

Assim, uma resposta imune diversa pode ser gerada contra uma única célula alvo combinando CARs com diferentes cadeias de TCR, ligantes, domínios de ligação ao antígeno e especificidade de alvo.

A Tabela 14 também resume os resultados do ensaio de citotoxicidade de células T baseado em GLuc (Ensaio Matador) observados com diferentes CARs quando expostos às suas linhas de células alvo.

Os sinais +/-, + e 2+ etc indicam o grau de citotoxicidade observada usando o ensaio de citotoxicidade Gluc após 4-96 horas de co-cultura da linha celular alvo com células T expressando CAR em comparação com células T de controle, ou seja, Células T expressando em CAR ou um CAR irrelevante (por exemplo, um CAR

253 / 308 que visa um antígeno não expresso na linha de células alvo particular), quando o ensaio é realizado sob condições semelhantes. Novamente, semelhante aos resultados obtidos com células Jurkat-NFAT-GFP, as células T que expressam diferentes CARs mostram grande diversidade em sua capacidade de exercer citotoxicidade quando expostas às células que expressam seu antígeno alvo, dependendo de suas cadeias de TCR, ligantes, domínios de ligação ao antígeno, alvo especificidade e a linha celular alvo. Uma diversidade semelhante na capacidade de induzir a produção de citocinas (por exemplo, IL2, TNFα e IFNγ) é observada entre as células T que expressam CARs diferentes, dependendo de suas cadeias de TCR, ligantes, domínios de ligação ao antígeno, especificidade do alvo e a linha celular alvo quando foram expostas a a linha celular alvo em condições comparáveis. Com base nos resultados desta análise, diferentes domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv), ligantes, tipo e classe de CAR e cadeias de TCR e suas configurações que foram positivas no ensaio NFAT-GFP e no ensaio de citotoxicidade de células T foram selecionados para mais estudos. TABELA 14 ENSAIO Ensaio de NFAT-GFP citotoxicidade de CÉLULAS

T Alvo SEQ ID Nome de construções Linhas de Linha celular NO células positivas positiva BCMA 446 CD8SP-BCMA-Am08-HL-vH-Gly-Ser-Linker-vL- L363 (2+), Myc-CD8TM-BBz U266 (2+) BCMA 543 CD8SP-BCMA-BB-CAR02-vL-Gly-Ser-Linker- L363 (+), BCMA-BB-CAR02-vH-Myc-CD8TM-BBz U266 (+) BCMA 545 CD8SP-BCMA-BB-CAR02-vL-Gly-Ser-Linker- L363 (+), BCMA-BB-CAR02-vH-Myc-CD8TM-z-P2A-K13- U266 (+) FLAG-T2A-PAC BCMA 495 CD8SP-BCMA-Am14-HL-vH-Gly-Ser-Linker-vL- L363 (2+), L363 (+), Myc-CD8TM-BBz U266 (2+) U266 (+) BST1 8506 CD8SP-hu-BST1-A1-vL-Gly-Ser-Linker-hu- Kasumi (+/-) HL60 (+) BST1-A1-vH-Myc-CD8TM-z-P2A-K13-FLAG- T2A-PAC BST1 8604 CD8SP-hu-BST1-A3-vL-Gly-Ser-Linker-hu- Kasumi (+/-), HL60 (+) BST1-A3-vH-Myc-CD8TM-z-P2A-K13-FLAG- MOLM13 (+/-) T2A-PAC

254 / 308 BST1 8553 CD8SP-hu-BST1-A2-vL-Gly-Ser-Linker-hu- HL60 (+/-) BST1-A2-vH-Myc-CD8TM-BBz BST1 8602 CD8SP-hu-BST1-A3-vL-Gly-Ser-Linker-hu- Kasumi (2+), BST1-A3-vH-Myc-CD8TM-BBz MOLM13 (+/-), HL60 (+/-)

CD19 791 CD8SP-CD19-AM1-vL- [hTCRa-CSDVP] -F- RAJI (2+), F2A-SP-CD19-AM1-vH- [hTCRb-KACIAH] -F- Nalm6 (+), REH P2A-Xba-PAC (+/-)

CD19 984 CD8SP-hu-CD19-USC1-LH4-vL-Gly-Ser-Linker- RAJI (2+), hu-CD19-USC1-LH4-vH-Myc-CD8TM-BBz Nalm6 (+), REH (+)

CD19 742 CD8SP-CD19-9B7-vL- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A- RAJI (+), SP-CD19-9B7-vH- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A- Nalm6 (+/-), Xba-PAC REH (+/-)

CD19 937 CD8SP-CD19-DART1-vL-Gly-Ser-Linker-CD19- RAJI (2+), RAJI (+), DART1-vH-Myc-CD8TM-z-P2A-K13-FLAG- Nalm6 (2+) Nalm6 (+) T2A-PAC

CD19 935 CD8SP-CD19-DART1-vL-Gly-Ser-Linker-CD19- RAJI (2+), DART1-vH-Myc-CD8TM-BBz Nalm6 (2+) CD19 788 CD8SP-CD19-AM1-vL-Gly-Ser-Linker-CD19- RAJI (2+), AM1-vH-Myc-CD8TM-BBz Nalm6 (2+) CD19 739 CD8SP-CD19-9B7-vL-Gly-Ser-Linker-CD19-9B7- RAJI (2+), vH-Myc-CD8TM-BBz Nalm6 (2+) CD19 887 CD8SP-hu-CAT18-1-HL-vH-Gly-Ser-Linker-vL- RAJI (3+), Myc-CD8TM-BBz Nalm6 (3+) CD19 838 CD8SP-hCD19-CAT17-HL-vH-Gly-Ser-Linker- RAJI (4+), RAJI (+) vL-Myc-CD8TM-BBz Nalm6 (3+) CD19 3956 CD8-hCD19-EUK5-13-vL-IgCL-Xho- RAJI (2+), CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP-Bst-hCD19- NALM6 (2+) EUK5-13-vH-IgG1-CH1-Mlu-CD3zECDTMCP- opt2-F-F2A- PAC

CD19 8663 CD8SP-hu-Bu13-vL- [hTCRb-KAC-ECD-Bam- RAJI (+), CD3zECDTMCP-opt] -F-P2A-SP-hu-Bu13-vH- Nalm6 (+) [hTCRa-CSDVP-ECD-Kpn-CD3zECDTMCP- opt2]

CD19 8651 CD8SP-hu-Bu13-vL-Gly-Ser-Linker-hu-Bu13-vH- RAJI (2+), RAJI (+/-), Myc-CD8TM-BBz Nalm6 (+) Nalm6 (+) CD19 8655 CD8SP-hu-Bu13-vL-PG4SP-v2- [hTCRb- RAJI (2+), KACIAH] -F-P2A-SP-hu-Bu13-vH-PG4SP- Nalm6 (2+) [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC

CD19 8654 CD8SP-hu-Bu13-vL- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A- RAJI (3+), RAJI (+), SP-hu-Bu13-vH- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-Xba- Nalm6 (3+) Nalm6 (+), PAC Bv173 (+)

CD19 8634 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP- RAJI (+) RAJI (+), hu-Bu13-vL-Gly-Ser-Linker-hu-Bu13-vH-Myc- NALM6 (+/-) Nalm6 (+), [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC Bv173 (+)

255 / 308 CD19 3955 CD8-hCD19-EUK5-13-vL-IgCL-Bam- RAJI (3+) CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP-Bst-hCD19- NALM6 (2+) EUK5-13-vH-IgG1-CH1-KPN-CD3zECDTMCP- opt2-F-F2A- Xba-PAC CD19 3961 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP- RAJI (2+), opt-F-P2A-SP-CD19MM-scFv-Mlu- NALM6 (2+) CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC CD19- 3964 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP- RAJI (2+), AFP opt-F-P2A-SP-AFP-61-scFv-Mlu- NALM6 (+) CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC CD19- 3963 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP- RAJI (+), CD20 opt-F-P2A-SP-CD20-2F2-scFv-Mlu- NALM6 (+) CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC CD19- 3966 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP- RAJI (+), CD22 opt-F-P2A-SP-hSC22-10-HL-scFv-Mlu- NALM6 (+) CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC CD19- 3965 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP- RAJI (+), CD22 opt-F-P2A-SP-CD22-h10F4v2-scFv-Mlu- NALM6 (+) CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC CD19- 3967 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP- RAJI (+), CD123 opt-F-P2A-SP-CD123-DART1-scFv-Mlu- NALM6 (+), CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC L428 (+) CD19- 3962 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP- RAJI (+), CD123 opt-F-P2A-SP-CD123-DART2-scFv-Mlu- NALM6 (+), CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC L428 (2+) CD19- 3968 CD8SP-CD19Bu12-scFv-Xho-CD3zECDTMCP- RAJI (+), WT1 opt-F-P2A-SP-WT1-Ab5-scFv-Mlu- Nalm6 (+) CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC CD20 1084 CD8SP-hu-Ubli-1-v4-vL-Gly-Ser-Linker-hu-Ubli- RAJI (2+) RAJI (+) 1-v4-vH-Myc-CD8TM-z-P2A-K13-FLAG-T2A-

PAC CD20 1082 CD8SP-hu-Ubli-1-v4-vL-Gly-Ser-Linker-hu-Ubli- RAJI (2+) RAJI (+) 1-v4-vH-Myc-CD8TM-BBz CD20 1034 CD8SP-CD20-HL-vH-Gly-Ser-Linker-vL-Myc- RAJI (2+) CD8TM-BBz CD22 1131 CD8SP-hCD19-hu-HA22-1-vL-Gly-Ser-Linker- RAJI (2+), hCD19-hu-HA22-1-vH-Myc-CD8TM-BBz Nalm6 (+/-) CD44v6 1181 CD8SP-CD44v6-USC1-HL4-vH-Gly-Ser-Linker- L363 (+/-) U266 vL-Myc-CD8TM-BBz (+/-) CLDN6 1526 CD8SP-CLDN6-USC2-LH4-vL- [hTCRa-CSDVP] HepG2 (+/-), -F-F2A-SP-CLDN6-USC2-LH4-vH- [hTCRb- OVCAR3 (+/- KACIAH] -F-P2A-PAC ) CLDN6 1523 CD8SP-CLDN6-USC2-LH4-vL-Gly-Ser-Linker- HepG2 (+), CLDN6-USC2-LH4-vH-Myc-CD8TM-BBz OVCAR (+) CLDN6 1476 CD8SP-CLDN6-USC1-LH4-vL-Gly-Ser-Linker- HepG2 (+/-), CLDN6-USC1-LH4-vH-Myc-CD8TM-z-P2A- OVCAR3 (+/-) K13-FLAG-T2A-PAC

256 / 308 CRIPTO 8879 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP- HEL (+) hu-Cripto-L1H2-vL-Gly-Ser-Linker-hu-Cripto- L1H2-vH-Myc- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A- PAC

DLL3 1575 CD8SP-DLL3-AM6-HL-vL- [hTCRa-CSDVP] -F- SKMEL 37 (+/- F2A-SP-DLL3-AM6-HL-vH- [hTCRb-KACIAH] - ) F-P2A-PAC

DLL3 1622 CD8SP-DLL3-AM14-HL-vH-Gly-Ser-Linker-vL- LAN5 (+), SKMEL 37 Myc-CD8TM-BBz SKMEL 37 (+/- (+) )

DLL3 1573 CD8SP-DLL3-AM6-HL-vH-Gly-Ser-Linker-vL- LAN5 (+/-), Myc-CD8TM-BBz SKMEL 37 (+/- )

EGFRvIII 1771 CD8SP-EGFRviii-H2M1863N2-HL-vL- [hTCRa- HeLa (+), CSDVP] -F-F2A-SP-EGFRviii-H2M1863N2-HL- HeLa vH- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-Xba-PAC EGFRvIII (+)

EGFRvIII 1769 CD8SP-EGFRviii-H2M1863N2-HL-vH-Gly-Ser- Hela (+/-), HeLa Linker-vL-Myc-CD8TM-BBz EGFR (+/-), LoVo (+/-), A431 (4+)

EMR2 1915 CD8SP-EMR2-USC2-V4-vL-Gly-Ser-Linker- MOLM13 (+), EMR2-USC2-V4-vH-Myc-CD8TM-BBz HL60 (+/-) FOLR1 2064 CD8SP-FOLR1-USC1-HL4-vL-Gly-Ser-Linker- Hela (2+), A431 FOLR1-USC1-HL4-vH-Myc-CD8TM-z-P2A-K13- (+/-) FLAG-T2A-PAC gpA33 9026 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP- MOLM13 (+) hu-gpA33-vL-Gly-Ser-Linker-hu-gpA33-vH-Myc- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC

GPC3 2210 CD8SP-GPC3-USC2-HL-V4-vH-Gly-Ser-Linker- HepG (3+) vL-Myc-CD8TM-BBz MOLM13 (+/-) GPC3 2161 CD8SP-GPC3-USC1-HL-V4-vH-Gly-Ser-Linker- HepG (3+) vL-Myc-CD8TM-BBz MOLM13 (+/-) Her2 2309 CD8SP-Her2-169-vL-Gly-Ser-Linker-Her2-169- MCF7 (+/-) vH-Myc-CD8TM-z-P2A-K13-FLAG-T2A-PAC Her2 2457 CD8SP-Her2-XMT-1520-vL- [hTCRa-CSDVP] -F- MCF7 (2+) F2A-SP-Her2-XMT-1520-vH- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-Xba-PAC

Her2 2408 CD8SP-Her2-XMT-1518-vL- [hTCRa-CSDVP] -F- MCF7 (+) F2A-SP-Her2-XMT-1518-vH- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-Xba-PAC

Her2 2405 CD8SP-Her2-XMT-1518-vL-Gly-Ser-Linker- MCF7 (+) Her2-XMT-1518-vH-Myc-CD8TM-BBz Her2 2454 CD8SP-Her2-XMT-1520-vL-Gly-Ser-Linker- MCF7 (2+) Her2-XMT-1520-vH-Myc-CD8TM-BBz Her2 2456 CD8SP-Her2-XMT-1520-vL-Gly-Ser-Linker- MCF7 (+/-) Her2-XMT-1520-vH-Myc-CD8TM-z-P2A-K13- FLAG-T2A-PAC

Her2 2405 CD8SP-Her2-XMT-1518-vL-Gly-Ser-Linker- MCF7 (2+) Her2-XMT-1518-vH-Myc-CD8TM-BBz

257 / 308 Her2 2356 CD8SP-Her2-huMab4D5-D98W-vL-Gly-Ser- MCF7 (+/-) Linker-Her2-huMab4D5-D98W-vH-Myc-CD8TM- BBz IL1RAP 9242 CD8SP-IL1RAP-IAPB63-vL- [hTCRa-CSDVP] - MOLM13 (+/-) MOLM13 (+) F-F2A-SP-IL1RAP-IAPB63-vH- [hTCRb- KACIAH] -F-F-Xba-PAC P2A IL1RAP 9222 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP- MOLM13 (+) IL1RAP-IAPB63-vL-Gly-Ser-Linker-IL1RAP- IAPB63-vH-Myc- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC Integrin 2552 CD8SP-Hu-IntB7-MMG49-vL-Gly-Ser-Linker- L363 (+), B7 Hu-IntB7-MMG49-vH-Myc-CD8TM-BBz U266 (+) LYPD1 2650 CD8SP-LYPD1-HL-V4-vL-Gly-Ser-Linker- OVCAR3 (2+) LYPD1-HL-V4-vH-Myc-CD8TM-BBz MSLN 2849 CD8SP-MSLN-237-HL-vL- [hTCRa-CSDVP] -F- SKOV3 (+) SKOV3 (7 +) F2A-SP-MSLN-237-HL-vH- [hTCRb-KACIAH] - F-P2A-Xba-PAC MSLN 2800 CD8SP-MSLN-5-HL-vL- [hTCRa-CSDVP] -F- SKOV3 (+) SKOV3 (5+) F2A-SP-MSLN-5-HL-vH- [hTCRb-KACIAH] -F- P2A-Xba-PAC MSLN 2944 CD8SP-MSLN-HuAM15-vL-Gly-Ser-Linker- SKOV3 (+) MSLN-HuAM15-vH-Myc-CD8TM-BBz MSLN 2749 CD8SP-MSLN-3-HL-AM-vH-Gly-Ser-Linker-vL- SKOV3 (+) Myc-CD8TM-BBz MSLN 2798 CD8SP-MSLN-5-HL-vH-Gly-Ser-Linker-vL-Myc- SKOV3 (+/-) CD8TM-BBz MSLN 9435 CD8SP-MSLN-hu22A10-vL-Gly-Ser-Linker- SKOV3 (2+) MSLN-hu22A10-vH-Myc-CD8TM-BBz MSLN 9387 CD8SP-MSLN-7D9-v3-vH-Gly-Ser-Linker-vL- SKOV3 (3+) Myc-CD8TM-BBz MSLN 9389 CD8SP-MSLN-7D9-v3-vL- [hTCRa-CSDVP] -F- SKOV3 (2+) F2A-SP-MSLN-7D9-v3-vH- [hTCRb-KACIAH] - F-P2A-Xba-PAC MSLN 9398 CD8SP-MSLN-7D9-v3-vL- [hTCRb-KAC-ECD- SKOV3 (+) Bam-CD3zECDTMCP-opt] -F-P2A-SP-MSLN- 7D9-v3-vH- [hTCRa-CSDVP-ECD-Kpn- CD3zECDTMCP-opt2 ] MSLN 9439 CD8SP-MSLN-hu22A10-vL-PG4SP-v2- [hTCRb- SKOV3 (2+) SKOV3 (+) KACIAH] -F-P2A-SP-MSLN-hu22A10-vH- PG4SP- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC MSLN 9447 CD8SP-MSLN-hu22A10-vL- [hTCRb-KAC-ECD- SKOV3 (+) Bam-CD3zECDTMCP-opt] -F-P2A-SP-MSLN- hu22A10-vH- [hTCRa-CSDVP-ECD-Kpn- CD3zECDTMCP-opt2] MSLN 9419 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP- SKOV3 (+/-) SKOV3 (+) MSLN-hu22A10-vL-Gly-Ser-Linker-MSLN- hu22A10-vH-Myc4- [preTCRa-Del48] -F-F2A-

PAC

258 / 308 MSLN 2898 CD8SP-MSLN76923-HL-vL- [hTCRa-CSDVP] - SKOV3 (+/-) F-F2A-SP-MSLN76923-HL-vH- [hTCRb- KACIAH] -F-P2A-PAC

MSLN 9369 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP- SKOV3 (+) SKOV3 (+) MSLN-7D9-v3-vL-Gly-Ser-Linker-MSLN-7D9- v3-vH-Myc- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A- PAC

Muc17 3045 CD8SP-Muc17-11-CN-vL- [hTCRa-CSDVP] -F- SKOV3 (+) F2A-SP-Muc17-11-CN-vH- [hTCRb-KACIAH] - F-P2A-Xba-PAC

SLC34A2 3581 CD8SP-huMX35-LH4-vL-Gly-Ser-Linker- OVCAR3 (3+) huMX35-LH4-vH-Myc-CD8TM-BBz Nectina-4 3092 CD8SP-Nectin4-66-HL-vH-Gly-Ser-Linker-vL- MDAMB231 MDAMB231 Myc-CD8TM-BBz (+/-), MCF7 (+), MCF7 (+) (2+)

PRLR 3143 CD8SP-PRLR-CN-vL- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A- MCF7 (+) SP-PRLR-CN-vH- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A- Xba-PAC

PRLR 3191 CD8SP-PRLR-USC2-HL-V4-vL-Gly-Ser-Linker- MCF7 (2+) MCF7 (+/-) PRLR-USC2-HL-V4-vH-Myc-CD8TM-z-P2A- K13-FLAG-T2A-PAC

PRLR 3140 CD8SP-PRLR-CN-vL-Gly-Ser-Linker-PRLR-CN- MCF7 (2+) vH-Myc-CD8TM-BBz PSMA 3241 CD8SP-hu106mPSMA-4-HL-vL- [hTCRa- PC3 (+), CSDVP] -F-F2A-SP-hu106mPSMA-4-HL-vH- LNCAP (+) [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-Xba-PAC

PSMA 3290 CD8SP-PSMA-76-HL-AM-vL- [hTCRa-CSDVP] - PC3 (+/-) F-F2A-SP-PSMA-76-HL-AM-vH- [hTCRb- KACIAH] -F-P2A-Xba-PAC

PSMA 3239 CD8SP-hu106mPSMA-4-HL-vH-Gly-Ser-Linker- PC3 (+/-) vL-Myc-CD8TM-BBz PSMA 3337 CD8SP-PSMA-83A12-HL-AM-vH-Gly-Ser- PC3 (+/-) Linker-vL-Myc-CD8TM-BBz RNF43 3386 CD8SP-RNF43-USC1-HL4-vH-Gly-Ser-Linker- LoVo (+/-) LoVo (+/-) vL-Myc-CD8TM-BBz ROR1 9516 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP- Jeko1 (+) ROR1-DART4-vL-Gly-Ser-Linker-ROR1- DART4-vH-Myc- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC

STEAP 3534 CD8SP-STEAP1-USC1-HL4-vL-Gly-Ser-Linker- PC3 (+) STEAP1-USC1-HL4-vH-Myc-CD8TM-z-P2A- LNCAP (+/-) K13-FLAG-T2A-PAC

STEAP 9565 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP- PC3 (+) STEAP1-hu120-vL-Gly-Ser-Linker-STEAP1- LNCAP (+) hu120-vH-Myc- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC

TSHR 3630 CD8SP-TSHR-hu-3BD10-vL-Gly-Ser-Linker- MOLM13 TSHR-hu-3BD10-vH-Myc-CD8TM-BBz (1,5+)

259 / 308 UISP1 3924 CD8SP-hu-UISP1-USC2-LH4-vL-Gly-Ser-Linker- MDAMB231 hu-UISP1-USC2-LH4-vH-Myc-CD8TM-BBz (+/-)

UPK1B 3730 CD8SP-hUPK1B-USC2-LH4-vL-Gly-Ser-Linker- OVCAR3 (2+) hUPK1B-USC2-LH4-vH-Myc-CD8TM-z-P2A- Sudhl1 (+) K13-FLAG-T2A-PAC

UPK1B 3681 CD8SP-hUPK1B-USC1-LH4-vL-Gly-Ser-Linker- Sudhl-1 (+) hUPK1B-USC1-LH4-vH-Myc-CD8TM-z-P2A- K13-FLAG-T2A-PAC

UPK1B 3682 CD8SP-hUPK1B-USC1-LH4-vL- [hTCRa- OVCAR3 (2+) OVCAR (2+), CSDVP] -F-F2A-SP-hUPK1B-USC1-LH4-vH- Sudhl1 (+) Sudhl1 (1,5+) [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-Xba-PAC

VISTA 3780 CD8SP-huVISTA-JJ-USC2-v4-vL- [hTCRa- KG1 (+/-) CSDVP] -F-F2A-SP-huVISTA-JJ-USC2-v4-vH- MOLM13 (+/-) [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-Xba-PAC HL60 (+/-)

VISTA 3826 CD8SP-huVISTA-USC1-v4-vL-Gly-Ser-Linker- MOLM13 (+) huVISTA-USC1-v4-vH-Myc-CD8TM-BBz BCMA 12755 CD8SP-BCMA-Am06-HL-Mlu-MYC-CD8TM- L363 (+), U266 BBZ-XS-T2A-Pac (+) BCMA 12894 CD8SP-BCMA-huC13-F12-vL-V5- [hTCRb- L363 (2+), KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA-huC13-F12-vH- U266 (2+) Myc- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC

BCMA 546 CD8SP-BCMA-BB-CAR02-vL- [hTCRa-CSDVP] L363 (2+), -F-F2A-SP-BCMA-BB-CAR02-vH- [hTCRb- U266 (+) KACIAH] -F-P2A-PAC

BCMA 497 CD8SP-BCMA-Am14-HL-vL- [hTCRa-CSDVP] - L363 (2+), F-F2A-SP-BCMA-Am14-HL-vH- [hTCRb- U266 (+) KACIAH] -F-P2A-PAC

BCMA 12921 BCMA-huC13-F12vL-Myc2- [hTCRb-KACIAH] - L363 (+), U266 L363 (+), F-P2A-BCMA-huC13-F12vH-MYC4- [hTCRa- (+) U266 (+) CSDVP] -F-F2A-PAC

BCMA 449 CD8SP-BCMA-Am08-HL-vL-PG4SP-v2- L363 (+), U266 [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA-Am08-HL- (+) vH-PG4SP- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC

BCMA 16316 CD8SP-BCMA-huC13-F12-BBz L363 (2+), L363 (+), U266 (+) U266 (+). Raji (+), Nalm6 (+)

BCMA 13028 CD8SP-BCMA-J6M0-vL- [hTCRβ-KACIAH] -F- L363 (+/-) P2A-SP-BCMA-J6M0-vH-Mlu-huTCRα-CSDVP

BCMA 12922 CD8SP-BCMA-huC13-F12-vL- [hTCRb- L363 (+), U266 L363 (+), KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA-huC13-F12-vH- (+) U266 (+) [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC

BCMA 12944 CD8SP-BCMA-huC13-F12-vL- [hTCRb-S57C] -F- L363 (3+), P2A-SP-BCMA-huC13-F12-vH- [hTCRa-T48C] - U266 (3+) F-F2A-K13-opt

260 / 308 BCMA BCMA-HuC12A3-L3H3-BBZ L363 (1,5+), L363 (+), U266 (+) U266 (+). Raji (+), Nalm6 (+)

BCMA 12890 CD8SP-BCMA-huC12A3-L3H3-vL- [hTCRb- L363 (+), S57C] -F-P2A-SP-BCMA-huC12A3-L3H3-vH- U266 (+). Raji [hTCRa-T48C] (+), Nalm6 (+)

BCMA 12943 CD8SP-BCMA-huC13-F12-vL- [hTCRb-S57C] -F- L363 (+), P2A-SP-BCMA-huC13-F12-vH- [hTCRa-T48C] U266 (+). Raji (+), Nalm6 (+)

BCMA 13102 CD8SP-BCMA-mJ22-9-vL- [hTCRb-S57C] -F- L363 (+), U266 L363 (+), P2A-SP-BCMA-mJ22-9-vH- [hTCRa-T48C] (+). Raji (+), U266 (+) Nalm6 (+/-), Daudi (+)

BCMA 12996 CD8SP-BCMA-huJ22-10-vL- [hTCRb-S57C] -F- L363 (+), U266 L363 (+), P2A-SP-BCMA-huJ22-10-vH- [hTCRa-T48C] (+). Raji (+), U266 (+) Nalm6 (+/-), Daudi (+)

BCMA 12807 CD8SP-BCMA-hu72-vL-Gly-Ser-Linker-BCMA- RAJI (2,5+), hu72-vH-Myc-CD8TM-BBz L363 (2,5+), U266 (3+)

BCMA 12837 CD8SP-BCMA-hu72-vL- [hTCRb-S57C] -F-P2A- RAJI (3+), L363 SP-BCMA-hu72-vH- [hTCRa-T48C] (4+), U266 (4+)

BCMA 12839 CD8SP-BCMA-hu72-vL- [hTCRa-T48C] -F-P2A- RAJI (3+), L363 SP-BCMA-hu72-vH- [hTCRa-S57C] (4+), U266 (2,5+)

CD19 895 CD8SP-hu-CAT18-1-HL-vL- [hTCRb-KACIAH] - RAJI (2+), RAJI (+), F-P2A-SP-hu-CAT18-1-HL-vH- [hTCRa-CSDVP] Nalm6 (2+) Nalm6 (+) -F-F2A-PAC

CD19 846 CD8SP-hCD19-CAT17-HL-vL- [hTCRb- RAJI (2+), RAJI (+), KACIAH] -F-P2A-SP-hCD19-CAT17-HL-vH- Nalm6 (2+) Nalm6 (+) [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC

CD19 16328 CD8SP-huCD19-mROO5-1- ( vL-vH) -CD3e- RAJI (2+), ECDTMCP-opt2-T2A-PAC NALM6 (2+) CD19 16239 CD8SP-huCD19-mROO5-1- ( vL-vH) -CD3d- RAJI (+), ECDTMCP-opt2-T2A-PAC NALM6 (+) CD19 16317 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-Mlu-CD8TM-BBZ RAJI (1,5+), RAJI (+), NALM6 (1,5+) Nalm 6 (+) CD19 14057 CD8SP-huCD19-mROO5-1-vL- [hTCRb-S57C] - RAJI (2+), RAJI (+), F-P2A-SP-huCD19-mROO5-1-vH- [hTCRa-T48C] NALM6 (4+) Nalm6 (+) -F-F2A-K13-opt

CD19 14056 CD8SP-huCD19-mROO5-1-vL- [hTCRb-S57C] - RAJI (2+), RAJI (+), F-P2A-SP-huCD19-mROO5-1-vH- [hTCRa-T48C] NALM6 (3+) Nalm6 (+)

261 / 308 CD19 16318 CD8SP-huCD19-mROO5-1-vL- [hTCRb- RAJI (+), RAJI (+), KACIAH] -F-P2A-SP-huCD19-mROO5-1-vH- NALM6 (2+) Nalm 6 (+) [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-K13-opt

CD19 16311 CD8SP-FMC63-BBz RAJI (+), Nalm 6 (+) CD19 14035 CD8SP-huCD19-mROO5-1-vL- [hTCRb- RAJI (+), KACIAH] -F-P2A-SP-huCD19-mROO5-1-vH- NALM6 (+) [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC

CD19 16317 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-Mlu-CD8TM-BBZ RAJI (+), NALM6 (+), Bv173 (+), Rec1 (+)

CD19 16311 CD8SP-FMC63-BBz RAJI (+), NALM6 (+), Bv173 (+), Rec1 (+)

CD19 8651 CD8SP-hu-Bu13-vL-Gly-Ser-Linker-hu-Bu13-vH- RAJI (+), Myc-CD8TM-BBz NALM6 (+), Bv173 (+), Rec1 (+)

CD19-Nemo CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-Mlu-CD8TM-Asc- RAJI (+), hCD3z-xba-P2A-Bam-hNEMO-D23V-K277A NALM6 (+), Bv173 (+), Rec1 (+)

CD19- 16318 CD8SP-huCD19-mROO5-1-vL- [hTCRb- RAJI (+), K13 KACIAH] -F-P2A-SP-huCD19-mROO5-1-vH- NALM6 (+) [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-K13-opt

CD19-MC159L CD8SP-huCD19-mROO5-1-vL- [hTCRb- RAJI (+), KACIAH] -F-P2A-SP-huCD19-mROO5-1-vH- Nalm6 (+) [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-MC159

CD19 14035 CD8SP-huCD19-mROO5-1-vL- [hTCRb- RAJI (+), KACIAH] -F-P2A-SP-huCD19-mROO5-1-vH- Nalm6 (+) [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC

CD19 16318 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho- [hTCRb- RAJI (+), KACIAH] -F-P2A-SP-Bst-CD19-hu-mROO5-1- Nalm 6 (+) vH-Mlu- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A- Xba-Bam- SynthK13

CD19 14109 CD8SP-huCD19-USC3-vL- [hTCRb-S57C] -F- Raji (2,5+), P2A-SP-huCD19-USC3-vH- [hTCRa-T48C] Nalm6 (2,5+), Daudi (2,5+)

CD22 13284 CD8SP-CD22-h10F4v2-vL-Gly-Ser-Linker-CD22- RAJI (5+), h10F4v2-vH-MYC-CD8TM-BBZ-T2A-PA Nalm6 (3+)

CD22 13293 CD8SP-CD22-h10F4v2-vL- [hTCRb-KACIAH] - RAJI (6+), F-P2A-SP-CD22-h10F4v2-vH- [hTCRa-CSDVP] - Nalm6 (5+) F-F2A-PAC

262 / 308 CD22 13349 CD8SP-CD22-HA22-vL- [hTCRb-KAC-ECD- RAJI (2+), Bam-CD3zECDTMCP-opt] -F-P2A-SP-CD22- Nalm6 (+/-) HA22-vH- [hTCRa-CSDVP-ECD-Kpn- CD3zECDTMCP-opt2] CD22 13314 CD8SP-CD22-h10F4v2-vL- [hTCRb-S57C] -F- RAJI (4,5+), P2A-SP-CD22-h10F4v2-vH- [hTCRa-T48C] Nalm6 (+/-) CD22 13320 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP- RAJI (+) CD22-HA22-vL-Gly-Ser-Linker-CD22-HA22-vH- Myc- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC CD22 13321 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP- RAJI (+/-) CD22-HA22-vL-Gly-Ser-Linker-CD22-HA22-vH- Myc4- [preTCRa-Del48] -F-F2A-PAC CD22 CD8SP-SC22-HA22-Mlu-CD8TM-BBZ RAJI (+), Nalm6 (+) CD22 13346 CD8SP-CD22-HA22-vL- [hTCRb-KACIAH] -F- RAJI (+), P2A-SP-CD22-HA22-vH- [hTCRa-CSDVP] -F- Nalm6 (+) F2A-PAC CD22 13369 CD8SP-CD22-HA22-vL- [hTCRa-T48C] -F-P2A- RAJI (+), SP-CD22-HA22-vH- [hTCRa-S57C] Daudi (+) CD22 CD22-h10F4v2-Mlu-CD8TM-BBZ RAJI (+), Daudi (+) CD22 13316 CD8SP-CD22-h10F4v2-vL- [hTCRa-T48C] -F- RAJI (+), P2A-SP-CD22-h10F4v2-vH- [hTCRa-S57C] Daudi (+) CD22 14215 CD8SP-hu-RFB4-vL- [hTCRb-S57C] -F-P2A-SP- Raji (1,5+), Raji (+) hu-RFB4-vH- [hTCRa-T48C] Nalm6 (+), Daudi (2+) CD22 13343 CD8SP-CD22-INO-vL-Gly-Ser-Linker-CD22- Raji (+) INO-vH-Myc-CD8TM-BBz CD22 16319 CD8SP-CD22-INO-vL- [hTCRb-S57C] -F-P2A- Raji (+), Nalm6 SP-CD22-INO-vH- [hTCRa-T48C] -F-F2A-PAC (+), Daudi (+) CD22 16320 CD8SP-CD22-hu-HA22-2-vL- [hTCRa-T48C] -F- Raji (2+), P2A-SP-CD22-hu-HA22-2-vH- [hTCRa-S57C] -F- Nalm6 (+), F2A-Pac Daudi (2,5+) CD22 16321 CD8SP-CD22-Med-12C5-HL-vH- [hTCRb-S57C] Raji (+), Nalm6 -F-P2A-SP-CD22-Med-12C5-HL-vL- [hTCRa- (+/-), Daudi T48C] -F-F2A-PAC (1,5+) CD22 16322 CD8SP-huRFB4-vL-Xho- [hTCRβ-S57C] -F-P2A- RAJI (2+), SP-Bst-huRFB4-vH-Mlu- [hTCRα-T48C-opt] -F- NALM6 (+), F2A-Xba-PAC Daudi (3+) CD22 16323 CD8SP-CD22-CELL7-vL- [hTCRb-S57C] -F-P2A- RAJI (+/-) SP-CD22-CELL7-vH- [hTCRa-T48C] -F-F2A-

PAC CD22 16324 CD8SP-CD22-HA22-vL- [hTCRb-S57C] -F-P2A- RAJI (+), SP-CD22-HA22-vH- [hTCRa-T48C] -F-F2A-PAC NALM6 (+/-), Daudi (1,5+) CLDN6 1526 CD8SP-CLDN6-USC2-LH4-vL- [hTCRa-CSDVP] HepG2 (3+), -F-F2A-SP-CLDN6-USC2-LH4-vH- [hTCRb- OVCAR3 (+) KACIAH] -F-P2A-Xba-PAC

263 / 308 DLL3 1622 CD8SP-DLL3-AM14-HL-vH-Gly-Ser-Linker-vL- LAN5 (+), Myc-CD8TM-BBz SKMEL 37 (+/- ) Her3 2506 CD8SP-Her3-USC1-HL4-vL- [hTCRa-CSDVP] - MCF7 (2+) F-F2A-SP-Her3-USC1-HL4-vH- [hTCRb- KACIAH] -F-P2A-Xba-PAC MPL CD8SP-MPL-161- ( vL-vH) -Mlu-CD8TM-BBZ- HEL (+) ter-Sal-WPRE-G02 MPL 16315 CD8SP-MPL-hu-161-2-BBz HEL (+) HEL (+) MPL 13764 CD8SP-hu-161-2-vL- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A- HEL (+) SP-hu-161-2-vH- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-Xba-

PAC MPL 13791 CD8SP-hu-161-2-vL- [hTCRb-S57C] -F-P2A-SP- HEL (3+) HEL (+) hu-161-2-vH- [hTCRa-T48C] MPL CD8SP-161-vL- [hTCRb-S57C] -F-P2A-IgHSP- HEL (+) Bst-161-vH- [hTCRa-T48C-opt] - MSLN 2749 CD8SP-MSLN-3-HL-AM-vH-Gly-Ser-Linker-vL- SKOV3 (+) Myc-CD8TM-BBz MSLN 2847 CD8SP-MSLN-237-HL-vH-Gly-Ser-Linker-vL- SKOV3 (+) Myc-CD8TM-BBz MSLN 9444 CD8SP-MSLN-hu22A10-vL- [hTCRb-KACIAH] - SKOV3 (+) SKOV3 (+) F-P2A-SP-MSLN-hu22A10-vH- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC MSLN 9395 CD8SP-MSLN-7D9-v3-vL- [hTCRb-KACIAH] -F- SKOV3 (+) SKOV3 (+) P2A-SP-MSLN-7D9-v3-vH- [hTCRa-CSDVP] -F- F2A-PAC MSLN 14321 CD8SP-MSLN-7D9-HL-vH- [hTCRb-S57C] -F- SKOV3 (+/-) SKOV3 (+) P2A-SP-MSLN-7D9-HL-vL- [hTCRa-T48C] MSLN CD8SP-MSLN-hu22A10-vL-Xho- [hTCRβ- SKOV3 (+) SKOV3 (+) KACIAH] -F-P2A-SP-Bst-MSLN-hu22A10-vH- Mlu- [hTCRα-CSDVP] -F-F2A-Xba-Bam- SynthK13 MSLN CD8SP-MSLN-7D9-vH-Xho- [hTCRβ-KACIAH] - SKOV3 (+) SKOV3 (+) F-P2A-SP-Bst-MSLN-7D9-vL-Mlu- [hTCRα- CSDVP] -F-F2A-Xba-Bam-SynthK13 MSLN 14294 CD8SP-MSLN-7D9-HL-vH- [hTCRa-CSDVP] -F- SKOV3 (+/-) SKOV3 (+) F2A-SP-MSLN-7D9-HL-vL- [hTCRb-KACIAH] - F-P2A-Xba-PAC MSLN 14241 CD8SP-MSLN-5-HL-vH- [hTCRa-CSDVP] -F- SKOV3 (+) SKOV3 (+) F2A-SP-MSLN-5-HL-vL- [hTCRb-KACIAH] -F- P2A-Xba-PAC MSLN CD8SP-MSLN-hu22A10-vL-Xho- [hTCRa- SKOV3 (+) CSDVP] -F-F2A-IgHSP-Bst-MSLN-hu22A10-vH- Mlu- [hTCRb-KACIAH] - MSLN 2847 MSLN-237-BBZ SKOV3 (+) MSLN 16312 CD8SP-MSLN-hu22A10-BBz SKOV-3 +/- SKOV3 (+)

264 / 308 MSLN 16313 CD8SP-MSLN-7D9-HL-BBz SKOV-3 +/- SKOV3 (+) MSLN 16314 CD8SP-MSLN-5-HL-BBz SKOV-3 + SKOV3 (+) MSLN 2849 CD8SP-MSLN-237-HL-vL- [hTCRa-CSDVP] -F- SKOV3 (+) F2A-SP-MSLN-237-HL-vH- [hTCRb-KACIAH] - F-P2A-Xba-PAC MSLN 14348 CD8SP-MSLN-hu22A10-vL-PG4SP-v2- [hTCRb- SKOV-3 +/- KACIAH] -F-P2A-SP-MSLN-hu22A10-vH- PG4SP- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC MSLN 14295 CD8SP-MSLN-7D9-HL-vH-PG4SP-v2- [hTCRb- SKOV-3 + KACIAH] -F-P2A-SP-MSLN-7D9-HL-vL-PG4SP- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC MSLN 14268 CD8SP-MSLN-5-HL-vH- [hTCRb-S57C] -F-P2A- SKOV-3 + SKOV3 (+) SP-MSLN-5-HL-vL- [hTCRa-T48C] MSLN 14274 CD8SP-V5- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-CD8SP- SKOV-3 + MSLN-7D9-HL-vH-Gly-Ser-Linker-MSLN-7D9- HL-vL-Myc- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A- PAC SLC34A2 3584 CD8SP-huMX35-LH4-vL- [hTCRa-CSDVP] -F- OVCAR3 (3+) F2A-SP-huMX35-LH4-vH- [hTCRb-KACIAH] -F- P2A-Xba-PAC Análise comparativa de CD19 CARs com diferentes domínios de ligação ao antígeno

[00653] As células T são infectadas com CARs contendo diferentes domínios de ligação ao antígeno, mas tendo estrutura semelhante. Células T expressando os CARs no estrutura principal CAR de 2ª geração (por exemplo, SEQ ID NO: 16317) e no estrutura principal SIR de cadeia dupla (por exemplo, SEQ ID NO: 14056 e 14109) e contendo os domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos vL e vH, vL-CDR1-3 e vH-CDR-1-3) derivados de huCD19-mROO5-1 (SEQ ID NO: 14406 e 14437) e huCD19-USC3 (SEQ ID NO: 14400 e 14431), respectivamente, mostram-se superiores em citotoxicidade vitro e secreção de citocinas em comparação com células T que expressam o CAR correspondente contendo os domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos vL e vH) derivados de hu-CD19-USC1-LH4 (SEQ ID NO: 4190 e 4264), CD19-9B7 ( SEQ ID NO: 4151 e 4225) e hu-Bu-13 (SEQ ID NO: 9655 e 9686). Portanto, os domínios de ligação ao antígeno derivados de hu-CD19-USC1-LH4, CD19-9B7 e hu-Bu-13 não foram selecionados para a construção de CARs (por exemplo, CARs de 2ª geração, SIR, Ab-TCR, TFP,

265 / 308 etc.). Estudos in vitro e in vivo com células CD19 CAR-T

[00654] Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos de CD3 foram infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 16311, 16317 e 16318) visando CD19. As sequências de aminoácidos desses CARs são representadas por SEQ ID NO: 16335, 16341 e 16342, respectivamente. O CAR representado por SEQ ID NO; 16311 é um CAR de segunda geração com domínio de ligação ao antígeno derivado do anticorpo FMC63 e contém um domínio coestimulador 41BB e um domínio de ativação CD3z. O CAR representado pela SEQ ID NO: 16317 é um CAR de segunda geração com domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo anti-CD19 humanizado de baixa afinidade e contém um domínio coestimulador 41BB e um domínio de ativação CD3z. Em contraste, o CAR representado pela SEQ ID NO: 16318 é um SIR de cadeia dupla contendo o domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo anti-CD19 humanizado de baixa afinidade. Esta construção SIR também expressou um módulo acessório que codifica uma versão otimizada de códons de vFLIP-K13 (SEQ ID NO: 12734). Todas as construções CAR foram clonadas no vetor pCCLc-MNDU3-WPRE (SEQ ID NO: 12639). As células CAR-T foram expandidas in vitro por 21 dias em meio XVIVO suplementado com IL2 recombinante e contas CD3 / CD28. A coloração com Proteína L conjugada com APC seguida por citometria de fluxo no dia 5 após a infecção revelou forte expressão de construtos CAR SEQ ID NO: 16311 e SEQ ID NO: 16317 na superfície celular com aproximadamente 45-50% das células apresentando coloração com Proteína L. Em contraste, muito pouca expressão de superfície celular de CAR representado por SEQ ID NO: 16318 foi observada com menos de 2% das células mostrando coloração de superfície com Proteína L. Após 3 semanas em cultura, as células RAJI e NALM expressando GLuc de forma estável foram co-cultivadas com T células que expressam os diferentes CARs

266 / 308 em uma razão efetor: alvo (E: T) de 1: 1 por 48 horas. O sobrenadante foi coletado e usado para medição de IFNγ por ELISA. A Figura 2A mostra um aumento significativo na produção de IFNγ quando todas as células CAR-T são co-cultivadas com células RAJI que expressam alto nível de CD19. A Figura 2B mostra que CAR-T que expressa o construto SEQ ID NO: 16318 mostra maior indução de IFNγ em comparação com CAR-T que expressa o construto SEQ ID NO: 16311 quando co-cultivado com células Nalm6 que expressam níveis modestos de CD19. Resultados essencialmente semelhantes foram obtidos quando a experiência é repetida para medir a produção de TNFα. Para testar a eficácia in vivo das diferentes células CAR-T, camundongos NSG foram injetados através da veia da cauda com 0,5 x 106 células RAJI expressando estavelmente luciferase de pirilampo (RAJI-Luc) e três dias depois injetados com 4 x 106 células T expressando o CAR construtos (SEQ ID NO: 16311, 16317 e 16318). Os animais foram fotografados semanalmente por imagem de bioluminescência após a injeção de D-luciferina. A Figura 3 mostra que houve um crescimento significativo do tumor em animais que não receberam células T ou células T de controle e todos morreram no dia 23. Os animais que receberam células T que expressam SEQ ID NO: 16311 e 16317 inicialmente limparam a doença, mas mostraram recidiva da doença após o dia 28 Em contraste, animais que receberam células T expressando CAR com SEQ ID NO; 16318 permaneceu livre de doença até o dia 51. Camundongos que receberam células T que expressam CAR com SEQ ID NO; 16318 mostrou sobrevivência melhorada em comparação com camundongos que não receberam células T, ou camundongos que receberam células T de controle ou células T que expressam CAR com SEQ ID NO: 16311. Camundongos que receberam células T que expressam SEQ ID NO: 16317 mostraram sobrevivência intermediária. Estudos in vitro e in vivo com células CD19 CAR-T

[00655] Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas

267 / 308 magnéticas de CD3 foram infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 16311 e 14056) que alvejam CD19. O CAR representado pela SEQ ID NO: 16311 foi descrito.

Em contraste, o CAR representado pela SEQ ID NO: 14056 é um SIR de cadeia dupla contendo o domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo humanizado de baixa afinidade.

A sequência de aminoácidos desta construção é representada por SEQ ID NO: 15800. Ambas as construções CAR foram clonadas no vetor pCCLc-MNDU3-WPRE (SEQ ID NO: 12639). A sequência de ácido nucleico do vetor pCCLc-MNDU3-WPRE que codifica o CAR com SEQ ID NO: 14056 é representada por SEQ ID NO: 12641. As células CAR-T foram expandidas in vitro.

A coloração com APC-Proteína L seguida por citometria de fluxo no dia 6 após a infecção revelou forte expressão da construção CAR com SEQ ID NO: 16311 na superfície celular com aproximadamente 71,07% das células apresentando coloração com Proteína L.

Em contraste, menos expressão da superfície celular de CAR representado por SEQ ID NO: 14056 foi observada com 22,04% das células mostrando coloração de superfície com Proteína L.

Após aproximadamente 1 semana de expansão, as células RAJI e NALM expressando GLuc de forma estável foram cocultivadas com células T que expressam o CARs diferentes em uma razão E: T de 1: 1 por 48 horas.

O sobrenadante foi coletado e usado para medição de IFNγ, TNFα e IL2 por ELISA.

As células T que expressam o CAR de próxima geração (isto é, SIR de cadeia dupla) representado por SEQ ID NO: 14056 mostraram uma produção robusta de IFNγ, TNFα e IL2 quando co-cultivadas com células RAJI enquanto as células T expressam o CAR FMC63-BBz (SEQ ID NO: 16311) mostrou indução fraca dessas citocinas.

A experiência foi repetida após 4 semanas de expansão das células CAR-T em cultura em meio XVIVO na presença de anticorpos IL2 e CD3 e CD28. Foi observado que as células T que expressam o CAR representado pela SEQ ID NO: 14056 continuam a mostrar uma produção robusta de IFNγ, TNFα e IL2 quando co-cultivadas com células RAJI

268 / 308 enquanto as células T expressam o FMC63-BBz CAR (SEQ ID NO: 16311) mostraram indução muito baixa a negligenciável dessas citocinas, sugerindo evidências de exaustão funcional. Para testar a eficácia in vivo das diferentes células CAR-T, camundongos NSG foram injetados na veia da cauda com 0,5 x 106 células NALM6 (leucemia linfocítica aguda de células B) expressando estavelmente luciferase de pirilampo (NALM6-Luc) e três dias depois injetados com 3 x 106 células T que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 16311 e 14056) que foram expandidos in vitro por 2-3 semanas. Os animais foram fotografados semanalmente por imagem de bioluminescência após a injeção de D-luciferina. A Figura 4 mostra que houve um crescimento significativo do tumor em animais que não receberam células T ou que receberam células T de controle e todos morreram no dia 29. Os animais que receberam células T que expressam SEQ ID NO: 16311 inicialmente limparam a doença, mas apresentaram recidiva de doença após o dia 29. Em contraste, os animais que receberam células T que expressam CAR com SEQ ID NO: 14056 permaneceram livres da doença até o dia 36. Os camundongos que receberam células T que expressam CAR com SEQ ID NO: 14056 melhoraram sua sobrevivência em comparação com os camundongos que o fizeram não recebeu células T, ou recebeu células T de controle ou células T que expressaram CAR representado por SEQ ID NO: 16311. Resultados essencialmente semelhantes são obtidos quando células T que expressam SIR (SEQ ID NO: 16330) são administer adas a camundongos NSG xenoenxertados com células Nalm6. Comparação de mascaramento de antígeno por CAR, SIR e TFP direcionados de CD19

[00656] Recentemente, foi demonstrado que a inserção acidental de um CAR CD19 convencional de 2ª geração em uma única célula de leucemia linfocítica aguda de células B levou à recaída da doença devido ao mascaramento de CD19 expresso em células de leucemia pelo polipeptídeo CAR expresso em células de leucemia (Ruella M et al, Nat Med. Out. 2018; 24

269 / 308 (10): 1499-1503). Isso impediu as células CAR-T de reconhecer e matar as células leucêmicas que expressam o CAR, levando à proliferação clonal, recorrência da doença e morte do paciente. Para testar se o CAR de próxima geração também é suscetível a este problema, lentivírus que codificam CARs de segunda geração (SEQ ID NO: 16311, 16317), SIRs (SEQ ID NO: 14035, 14056, 14065, 14109 e 16330) e TFP (SEQ ID NO: 16328 e 14098) são expressos de forma estável em células RAJI e Nalm6 que expressam CD19. As células que expressam CAR são subsequentemente coradas com anticorpo CD19 conjugado com PE (por exemplo, FMC63-PE). Observa-se que a expressão de CARs de segunda geração (SEQ ID NO: 16311, 16317) e TFP (SEQ ID NO: 16328 e 14098) resulta no mascaramento de CD19 em células RAJI e Nalm6, conforme revelado pela diminuição na superfície celular coloração para CD19 conforme determinado pela ligação ao anticorpo CD19- PE e citometria de fluxo. Em contraste, a expressão de SIRs (SEQ ID NO: 14035, 14056, 14065, 14109 e 16330) não tem efeito significativo na expressão de CD19 em células RAJI e Nalm6. Além disso, as células RAJI expressando CARs de segunda geração (SEQ ID NO: 16311, 16317) e TFP (SEQ ID NO: 16328 e 14098) mostram morte reduzida por células T que expressam o CAR e TFP correspondentes, enquanto as células RAJI que expressam os SIRs (SEQ ID NO: 14035, 14056, 14065, 14109 e 16330) retêm sua susceptibilidade à morte por células T que expressam o SIR correspondente. Comparação de CARs usando modelo de síndrome de liberação de citocinas (CRS)

[00657] A capacidade de diferentes construtos de CD19 CAR para induzir CRS foi testada usando um modelo de camundongo recentemente descrito (Giavridis T et al, Nature Medicine, 2018). Resumidamente, camundongos SCID-Biege foram injetados i.p (intraperitoneal) com 3 milhões de células Raji-pLenti-Luc no dia1. 30 milhões de CAR-Ts que expressam o CAR (SEQ ID NO: 16315 e 16330) foram injetados no dia 21 (intraperitoneal).

270 / 308 Semelhante ao estudo publicado (Giavridis T et al, Nature Medicine), um terço dos animais que receberam o CAR de segunda geração (SEQ ID NO: 16315) morreram após a injeção de células CAR-T. Nenhum dos animais que receberam SIR (SEQ ID NO: 16330) morreu. Essencialmente, resultados semelhantes são obtidos quando a experiência é repetida usando células T que expressam o SIR (SEQ ID NO: 14056). Análise comparativa de MPL CARs com diferentes domínios de ligação ao antígeno

[00658] As células T são infectadas com CARs contendo diferentes domínios de ligação ao antígeno, mas tendo estrutura semelhante. Células T que expressam os MPL CARs em diferentes estrutura principais CAR (por exemplo, SEQ ID NO: 16315, 13761-13770, 13780-13794) e contendo os domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos vL e vH, vL-CDR1- 3 e vH-CDR -1-3) derivado de hu-161-2 (SEQ ID NO: 14409 e 14440) e hu- 161-3 (SEQ ID NO: 14402 e 14433), respectivamente, mostram citotoxicidade in vitro superior e secreção de citocina em comparação com Células T que expressam o CAR correspondente contendo os domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos vL e vH) derivados de MPL-178, MPL-12E10 e MPL-AB317 que são descritos em WO2019067805. Portanto, os domínios de ligação ao antígeno derivados de MPL-178, MPL-12E10 e MPL-AB317 não foram selecionados para a construção de CARs direcionados a MPL (por exemplo, CARs de 2ª geração, SIR, Ab-TCR, TFP etc.). Em vez disso, os domínios de ligação ao antígeno derivados da forma hu-161-2 (SEQ ID NO: 14409 e 14440) e hu-161-3 (SEQ ID NO: 14402 e 14433) e vL e vH contendo suas regiões CDR correspondentes foram selecionados para MPL CARs direcionados (por exemplo, CARs de 2ª geração, SIR, Ab-TCR, TFP etc.). Os CARs com SEQ ID NO: 13791 e 13793 são comparados e CAR com SEQ ID NO: 13791 é mostrado para exibir citotoxicidade in vitro superior e produção de citocina em comparação com CAR com SEQ ID NO; 13793. Os CARs com

271 / 308 SEQ ID NO: 13791 também são superiores ao CAR correspondente na mesma estrutura, mas contendo o domínio de ligação ao antígeno derivado de MPL- 161 murino, conforme descrito em WO2019067805. Estudos in vitro e in vivo com células MPL CAR-T

[00659] Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 foram infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 16315 e 13791) visando MPL humano (receptor de trombopoietina). O CAR (CD8SP-MPL-hu-161-2-BBz) representado pela SEQ ID NO; 16315 é um CAR de segunda geração com domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo MPL humanizado e contém um domínio coestimulador 41BB e um domínio de ativação CD3z. Em contraste, o CAR representado pela SEQ ID NO: 13791 é um SIR de cadeia dupla contendo o domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo MPL humanizado. Ambas as construções CAR foram clonadas no vetor pCCLc-MNDU3-WPRE (SEQ ID NO: 12639). As células CAR-T foram expandidas in vitro por até 2- 4 semanas. As células HEL.92.1.7 expressando GLuc de forma estável foram co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 1: 1 por 48 horas. A morte celular foi medida usando o ensaio Matador. As células T que expressam o CAR de próxima geração (isto é, SIR de cadeia dupla) representado por SEQ ID NO: 13791 mostraram indução robusta de morte de células alvo e produção de citocinas, enquanto as células T expressam o CAR MPL-hu-161-2-BBz (SEQ ID NO: 16315) mostrou indução fraca de morte de células alvo e produção de citocinas. Para testar a eficácia in vivo das diferentes células CAR-T, camundongos NSG foram injetados através da veia da cauda com 0,5 x 106 células HEL.92.1.7 (Leucemia Mielóide Aguda) expressando estavelmente luciferase de pirilampo (HEL-Luc) e três dias depois injetados com 3 x 106 células T expressando os construtos CAR (SEQ ID NO: 16315 e 13791) que foram expandidos in vitro por 2-3 semanas. Camundongos que receberam células T que expressam CAR com SEQ ID NO; 13791

272 / 308 melhorou a sobrevivência em comparação com camundongos que não receberam células T, ou camundongos que receberam células T de controle ou células T que expressam SEQ ID NO: 16315. Comparação de mascaramento de antígeno por MPL direcionado CAR, SIR e

TFP

[00660] As células HEL.92.1.7 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 16315, 13780 e 13791) visando MPL humano. O efeito da expressão de CAR no mascaramento de MPL é determinado por coloração de imunofluorescência com anticorpo MPL (1.6.1) e análise FACS. Alternativamente, a expressão de MPL não ligado é determinada pela ligação com uma proteína de fusão 161-scFv-Nluc (SEQ ID NO: 2245 como descrito em WO2017173403, que é incorporado aqui na sua totalidade por referência). A proteína de fusão 161-scFv-Nluc contém o domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo direcionado a MPL (1.6.1) fundido a NLuc. A expressão de CAR com SEQ ID NO: 16315 e 13780 em células HEL.92.1.7 resulta em mascaramento de antígeno, enquanto a expressão de CAR com SEQ ID NO: 13791 não resulta em mascaramento significativo de MPL. Análise comparativa de BCMA CARs com diferentes domínios de ligação ao antígeno

[00661] As células T são infectadas com CARs contendo diferentes domínios de ligação ao antígeno, mas tendo estrutura semelhante. Células T expressando os BCMA CARs em diferentes estrutura principais CAR (por exemplo, SEQ ID NO: 12913, 12916-12946) e contendo os domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos vL e vH, vL-CDR1-3 e vH-CDR-1-3 ) derivado de BCMA-huC13-F12 (SEQ ID NO: 14413 e 14444), BCMA- huC12A3-L3H3 (SEQ ID NO: 14414 e 14445), BCMA-J6M0 (SEQ ID NO: 14415 e 14446), BCMA-huJ22- 10 (SEQ ID NO: 14398 e 14229) e BCMA- hu72 (SEQ ID NO: 14401 14432) respectivamente, mostram citotoxicidade in

273 / 308 vitro superior e secreção de citocina. Portanto, os domínios de ligação ao antígeno derivados dos domínios de ligação ao antígeno acima e vL e vH contendo suas regiões CDR correspondentes foram selecionados para CARs direcionados a BCMA (por exemplo, CARs de 2ª geração, SIR, Ab-TCR, TFP etc.). Estudos in vitro e in vivo com células BCMA CAR-T

[00662] Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 foram infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO (DNA): 16316 e 12890, 12943) visando BCMA humano. As sequências de aminoácidos correspondentes destas construções são representadas por SEQ ID NO; 16340, 14634 e 14687). O CAR representado por SEQ ID NO; 16316 é um CAR de segunda geração com domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo MPL humanizado e contém um domínio coestimulador 41BB e um domínio de ativação CD3z. Em contraste, o CAR representado por SEQ ID NO: 12890 e 12943 são SIRs de cadeia dupla. Ambas as construções CAR foram clonadas no vetor pCCLc- MNDU3-WPRE (SEQ ID NO: 12639). A sequência de ácido nucleico completa do vetor lentiviral que codifica os CARs SEQ ID NO: 12890 e 12943 é representada por SEQ ID NO: 14378-14385, respectivamente. As células CAR-T foram expandidas in vitro por até 2-4 semanas. As células L363 que expressam GLuc de forma estável foram co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 1: 1 por 48 horas. A morte celular foi medida usando o ensaio Matador. Todas as células CAR-T apresentaram indução modesta de morte de células alvo e produção de citocinas (IFNγ e TNFα). Para testar a eficácia in vivo das diferentes células CAR-T, camundongos NSG foram injetados via veia da cauda com 0,5 x 106 L363 (leucemia de células plasmáticas) expressando estavelmente luciferase de vagalume (L363-Luc) e dois dias depois injetados com 2 x 106 T células que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 16316 e 12890, 12943) que foram

274 / 308 expandidos in vitro por 2-3 semanas. Os camundongos que receberam células T que expressam CARs com SEQ ID NO: 16316 e 12890, 12943 melhoraram a sobrevivência em comparação com os camundongos que receberam células T de controle. Resultados essencialmente semelhantes são obtidos usando células T que expressam os CARs representados por SEQ ID NO: 13049, 12996 e 12837.

[00663] A capacidade de diferentes construtos CAR para mascarar o antígeno BCMA é testada expressando de forma estável os construtos CAR com SEQ ID NO (DNA): 16316 e 12890, 12943 nas linhas celulares L363 e U266. Observa-se que a expressão estável de CAR 16316 resulta em mascaramento de antígeno de BCMA, enquanto nenhum mascaramento de antígeno significativo é observado após a expressão estável de construtos com SEQ ID NO: 12890, 12943. Similarmente, CARs com SEQ ID NO: 13049, 12996 e 12837 não resultam em mascaramento de antígeno quando expressos em células L363 ou U266 expressando BCMA. Análise comparativa de CARs de mesotelina (MSLN) com diferentes domínios de ligação ao antígeno

[00664] As células T são infectadas com CARs contendo diferentes domínios de ligação ao antígeno, mas tendo estrutura semelhante. Células T expressando os CARs MSLN em diferentes estrutura principais CAR (por exemplo, SEQ ID NO: 14291-14323) e contendo os domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos vL e vH, vL-CDR1-3 e vH-CDR-1-3) derivados de MSLN-3-HL-AM (SEQ ID NO: 4136 e 4210), MSLN-5 (SEQ ID NO: 14412 e 14443), MSLN-7D9-HL (SEQ ID NO: 14411 e 14442) e MSLN- hu22A10 (SEQ ID NO: 14410 e 14441), respectivamente, mostram citotoxicidade in vitro e secreção de citocina superiores em comparação com dormainas de ligação a antígeno derivadas de MSLN-HuAM15 e MSLN76923- HL. Portanto, os domínios de ligação ao antígeno derivados da forma MSLN- 3-HL-AM (SEQ ID NO: 4136 e 4210), MSLN-5 (SEQ ID NO: 14412 e 14443),

275 / 308 MSLN-7D9-HL (SEQ ID NO: 14411 e 14442 ), e MSLN-hu22A10 (SEQ ID NO: 14410 e 14441) e vL e vH contendo suas regiões CDR correspondentes foram selecionados para CARs direcionados MSLN (por exemplo, CARs de 2ª geração, SIR, Ab-TCR, TFP, etc.). Análise comparativa de CARs de mesotelina (MSLN) com diferentes domínios de ligação ao antígeno e estruturas

[00665] As células T que expressam os CARs MSLN contendo diferentes domínios de ligação ao antígeno e em estruturas CAR diferentes (SEQ ID NO: 16312-16314; 16361-16363) foram geradas usando transferência de genes envolvendo o vetor pCCLc-MNDU3-WPRE (SEQ ID NO: 12639). As células T que expressam CAR foram testadas contra células SKOV3 quanto à citotoxicidade usando o ensaio Matador e para a produção de citocinas. Todas as células CAR-T apresentaram citotoxicidade leve a modesta e níveis variáveis de produção de citocinas após a co-cultura com células SKOV3. Em seguida, as células CAR-T foram testadas em um modelo de xenoenxerto SKOV3 em camundongos NSG. Para este fim, 1 x 106 células SKOV3-Luc foram injetadas por via subcutânea, seguido uma semana depois pela injeção de injeção intravenosa de 3 x 106 células T que expressam CAR. O crescimento do tumor foi monitorado por imagem de bioluminescência e medição do volume do tumor. Uma inibição leve a modesta do crescimento do tumor foi observada em camundongos que receberam células T que expressam CARs com SEQ ID NO: 16312-16314 e 16361-16362.

[00666] Em seguida, as células T que expressam os CARs MSLN contendo diferentes domínios de ligação ao antígeno e em diferentes estruturas CAR (SEQ ID NO: 16313-16314; 16331-16334; 14268-14269; 14321 e 14374) foram geradas usando a transferência de genes envolvendo o vetor pCCLc- MNDU3-WPRE (SEQ ID NO: 12639). A sequência de aminoácidos dessas construções CAR são representadas por SEQ ID NO: 16337-16338; 16354- 16357; 16012-16013, 16065 e 16118, respectivamente. A sequência de ácido

276 / 308 nucleico completa do vetor lentiviral que codifica os CARs SEQ ID NO: 14374, 14321 e 14268 é representada por SEQ ID NO: 14381-14383, respectivamente. As células T que expressam CAR foram testadas contra células SKOV3 quanto à citotoxicidade usando o ensaio Matador e para a produção de citocinas. Todas as células CAR-T mostraram citotoxicidade modesta e níveis variáveis de produção de citocinas após 72 horas de co-cultura com células SKOV3 em uma razão E: T de 1: 1. As células T que expressam os CARs mostraram alta produção de linha de base de IFNγ e TNFα que estava ausente em células T que expressam os CARs 16331-16334; 14268-14269; 14321 e 14374. Em seguida, as células CAR-T foram testadas em um modelo de xenoenxerto SKOV3 em camundongos NSG. Para este fim, 1 x 106 células SKOV3-Luc foram injetadas por via subcutânea, seguido uma semana depois pela injeção de injeção intravenosa de 3 x 106 células T que expressam CAR. O crescimento do tumor foi monitorado por imagem de bioluminescência e medição do volume do tumor. Enquanto camundongos que receberam células T que expressam CARs com SEQ ID NO: 16313-16314 não conseguiram controlar o tumor, camundongos que receberam CARs com SEQ ID NO: 16331-16334; 14268- 14269; 14321 e 14374 erradicaram completamente o tumor após o dia 18 e nenhum tumor mensurável foi observado nesses animais até o dia 67. Os resultados foram confirmados usando imagens de bioluminescência. Isso resultou em melhora significativa na sobrevivência em animais que receberam CARs com SEQ ID NO: 16331-16334; 14268-14269; 14321 e 14374. Análise comparativa de CD22 CARs com diferentes domínios de ligação ao antígeno

[00667] As células T são infectadas com CARs contendo diferentes domínios de ligação ao antígeno, mas tendo estrutura semelhante. Células T que expressam os CARs CD22 no estrutura principal CAR de 2ª geração (por exemplo, SEQ ID NO: 13443, 13390, 13284 e 14185) e estrutura principal SIR de cadeia dupla (por exemplo, SEQ ID NO: 13473, 13420, 13314 e 14215) e

277 / 308 contendo o antígeno domínios de ligação (por exemplo, fragmentos vL e vH, vL-CDR1-3 e vH-CDR-1-3) derivados de CD22-INO (SEQ ID NO: 14387 e 14418), CD22-hu-HA22-2 (SEQ ID NO : 14399 e 14430) CD22-h10F4v2 (SEQ ID NO: 14407 e 14438) e CD22-hu-RFB4 (SEQ ID NO: 14396 e 14427), respectivamente, mostram citotoxicidade in vitro superior e secreção de citocina em comparação com células T que expressam o CAR correspondente contendo os domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos vL e vH) derivados de hu-HA22-1 (SEQ ID NO: 4123 e 4197) e CD22-CELL7 (SEQ ID NO: 14390 e 14421). Portanto, os domínios de ligação ao antígeno derivados de hu-HA22-1 e CD22-CELL7 não foram selecionados para a construção de CARs direcionados a CD22 (por exemplo, CARs de 2ª geração, SIR, Ab-TCR, TFP, etc.). Em vez disso, os domínios de ligação ao antígeno derivados de CD22-INO (SEQ ID NO: 14387 e 14418), CD22-hu-HA22-2 (SEQ ID NO: 14399 e 14430) CD22-h10F4v2 (SEQ ID NO: 14407 e 14438) e CD22-hu-RFB4 (SEQ ID NO: 14396 e 14427) e vL e vH contendo suas regiões CDR correspondentes foram selecionados para CARs direcionados a CD22.

[00668] Células T que expressam CARs do receptor de folato 1 (FR1 ou FOLR1) induzem citotoxicidade em células SKOV3 que expressam FR1. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 2062-2102; 2111-2140) visando FR1. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células SKOV3 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00669] As células T que expressam BAFF-R CARs induzem citotoxicidade em células Jeko-1 e REC-1 que expressam BAFF-R. Células T

278 / 308 de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os diferentes construtos CAR (por exemplo, SEQ ID NO: 13922-13953; 13848-13858, 13869-13900, 13954- 13964; 13975-14006) visando BAFF-R . As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células Jeko-1 e REC-1 expressando de forma estável hGLuc são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A produção de IFNγ e TNFα é determinada por ELISA. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto Jeko-1 em camundongos NSG. As células T que expressam os CARs (por exemplo, SEQ ID NO: 13897, 13950, 14003 etc) são mostradas para ativar a sinalização de células T quando expostas a células que são positivas para BAFF-R.

[00670] Células T que expressam mesotelina (MSLN) CARs induzem citotoxicidade em células SKOV3 que expressam MSLN. As células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os diferentes construtos CAR (SEQ ID NO: 2748-2777; 2797-2826; 2846-2875; 2895-2924; 2944-2973; 9386- 9415; 9435- 9464) visando MSLN. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células SKOV3 que expressam hGLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00671] Células T que expressam Her2 CARs induzem citotoxicidade em células MCF7 que expressam Her2. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 2346, 2356-2385; 2395, 2405-

279 / 308 2434; 2444, 2454-2483; 9092-9121; 9141-9170) como alvo Her2. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células MCF7 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00672] As células T que expressam o EGFRvIII CARs induzir citotoxicidade em EGFRvIII - expressando U87MG células. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 1660, 1670-1699, 1709, 1719-1748, 1758, 1768-1797, 1807, 1817-1846) visando EGFRviii. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células U87MG-EGFRviii expressando GLuc de forma estável são co- cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00673] Células T que expressam EMR2 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam EMR2. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 1856, 1866-1895, 1905, 1915- 1944, 1954, 1964-1993) visando EMR2. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células Molm13 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de

280 / 308 GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00674] Células T que expressam DLL3 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam DLL3. As células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 1553-1650) que têm como alvo DLL3. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células SK-MEL-37 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00675] Células T que expressam CD19 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam CD19. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 769-817, 720-768, 867-915, 965- 1013, 818- 866, 8632-8680) visando CD19. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. Células RAJI ou NALM6 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 4 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00676] Células T que expressam CD20 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam CD20. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 1063-1111, 1014-1062) que têm como alvo o CD20. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias.

281 / 308 Células RAJI ou NALM6 que expressam GLuc de forma estável são co- cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 4 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00677] Células T que expressam BCMA CARs induzem citotoxicidade em células que expressam BCMA. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 377-572, 8093-8484) direcionados a BCMA. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células U266 e L363 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00678] Células T que expressam FLT3 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam FLT3. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 8926-9023) visando FLT3. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células RS4; 11 e MV4; 11 expressando GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00679] Células T que expressam CLL1 CARs induzem citotoxicidade

282 / 308 em células que expressam CLL1. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 8779-8876) direcionados a CLL1. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células RAJI e U937 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00680] Células T que expressam BST1 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam BST1. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 8485-8631) direcionados a BST1. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células KG1 expressando GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00681] Células T que expressam IL1RAP CARs induzem citotoxicidade em células que expressam IL1RAP. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 9171-9317) direcionados a IL1RAP. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células THP-1 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é

283 / 308 testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00682] Células T que expressam gpA33 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam gpA33. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 9024-9072) direcionados a gpA33. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células Molm-13 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00683] Células T que expressam GPC3 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam GPC3. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 9024-9072) direcionados a GPC3. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células HepG2 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00684] Células T que expressam CLDN6 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam CLDN6. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 1455-1552) visando

284 / 308 CLDN6. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células HepG2 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00685] Células T que expressam UPK1B CARs induzem citotoxicidade em células que expressam UPK1B. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 1455-1552) direcionados a UPK1B. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células OVCAR-3 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00686] Células T que expressam BMPR1B CARs induzem citotoxicidade em células que expressam BMPR1B. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 573-670) direcionados a BMPR1B. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células LNCaP e COV434 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

285 / 308

[00687] Células T que expressam WISP1 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam WISP1. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 3856-3953) direcionados a WISP1. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células MDA-MB-453 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00688] Células T que expressam CD133 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam CD133. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 11312-11458) que têm como alvo CD133. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células Reh e RS4; 11 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00689] Células T que expressam CARs do receptor de prolactina (PRLR) induzem citotoxicidade em células que expressam PRLR. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 3121-3218) direcionados a PRLR. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células MCF7 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão

286 / 308 E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00690] Células T que expressam IL13Ra2 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam IL13Ra2. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 14132-14165) visando IL13Ra2. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células U87MG que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00691] Células T que expressam Nectin-4 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam Nectina-4. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 3072-3120, 9465- 9513) visando Nectina-4. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células MCF7 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00692] Células T que expressam PSMA CARs induzem citotoxicidade em células que expressam PSMA. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que

287 / 308 expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 3219-3365) visando PSMA. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células PC3 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00693] Células T que expressam CARs de TSHR (receptor de hormônio estimulante da tireóide) induzem citotoxicidade em células que expressam TSHR. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 3611-3659) visando TSHR. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células TT que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00694] Células T que expressam CDH19 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam CDH19. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 1308-1405) direcionados a CDH19. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células MEL-624 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos

288 / 308 NSG.

[00695] Células T que expressam VISTA CARs induzem citotoxicidade em células que expressam VISTA. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 3758-3855) visando VISTA. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células MOLM-13 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 4 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00696] Células T que expressam ROR1 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam ROR1. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 9514-9562) direcionados a ROR1. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células JEKO-1 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 4 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00697] Células T que expressam Liv1 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam Liv1. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 9514-9562) visando Liv1. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células MCF7 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que

289 / 308 expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 4 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00698] Células T que expressam Integrina B7 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam Integrina B7. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 2533-2581) direcionados à Integrina B7. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10- 14 dias. As células U266 que expressam GLuc de forma estável são co- cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 4 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00699] Células T que expressam SLC34A2 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam SLC34A2. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 3562-3610) direcionados a SLC34A2. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células OVCAR-3 e OVCAR-4 expressando GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00700] As células T que expressam LY6E CARs induzem citotoxicidade em células que expressam LY6E. Células T do sangue periférico

290 / 308 humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 2582-2630) direcionados a LY6E. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células Molm13 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 4 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00701] Células T que expressam LYPD1 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam LYPD1. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 2631-2679) direcionados a LYPD1. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células OVCAR-3 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00702] Células T que expressam STEAP1 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam STEAP1. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 3513-3561, 9563-9611) direcionados a STEAP1. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células PC3 e LNCaP que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de

291 / 308 GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00703] Células T que expressam Muc17 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam Muc17. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 3023-3071) direcionados a Muc17. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células SW1463 e SW403 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00704] Células T que expressam RNF43 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam RNF43. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 3366-3463) direcionados a RNF43. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células Lovo que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00705] Células T que expressam Robo4 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam Robo4. Células T do sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 3464-3512) direcionados a Robo4. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células ME-1 que

292 / 308 expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00706] Células T que expressam gPNMB CARs induzem citotoxicidade em células que expressam gPNMB. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 2239-2287) direcionados a gPNMB. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células U87MG que expressam GLuc de forma estável são co- cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00707] Células T que expressam FCRH5 CARs induzem citotoxicidade em células que expressam FCRH5. Células T de sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticas de CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CAR (SEQ ID NO: 1994-2042) direcionados a FCRH5. As células CAR-T são expandidas in vitro por 10-14 dias. As células REC-1 que expressam GLuc de forma estável são co-cultivadas com células T que expressam os diferentes CARs em uma razão E: T de 10: 1 por 48 horas. A indução de lise de células alvo mediada por células CAR-T é testada usando o ensaio Matador por medição da atividade de GLuc. A atividade in vivo dos CARs é demonstrada usando um modelo de xenoenxerto em camundongos NSG.

[00708] Eficácia in vivo de CARs direcionados a CD19. As células T do

293 / 308 sangue periférico humano isoladas usando contas magnéticos CD3 são infectadas com lentivírus que expressam os construtos CD19 CAR (por exemplo, SEQ ID NO: 8633-8680). Camundongos NSG (Jackson Lab) são irradiados subletalmente com uma dose de 175 cGy. Aproximadamente 24 horas após a irradiação (dia 2), os camundongos são injetados com 2,5 x 104 células RAJI através da veia da cauda. No dia 3, os camundongos (n = 5 para cada grupo) são tratados com 5 milhões de células CD19 CAR-T. Camundongos controle (n = 5) não receberam células T ou receberam células T não infectadas. Os camundongos receberam IL2 humana (400 UI intraperitonealmente) em dias alternados até a morte de todos os camundongos no grupo de controle. Os camundongos que recebem células CD19 CAR-T sobrevivem mais do que os camundongos de controle. Essencialmente, uma abordagem semelhante é usada para testar a eficácia in vivo de outras células T CAR da divulgação usando xenoenxertos de linhas celulares que expressam seus antígenos alvo, como mostrado na Tabela A ou usando informações disponíveis na literatura.

[00709] Uso de células CAR-T para terapia celular adotiva. As células CAR-T da divulgação podem ser usadas para terapia celular adotiva. Por exemplo, pacientes com leucemia linfocítica aguda recorrente (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC) ou linfomas de células B de alto risco de grau intermediário podem receber imunoterapia com células CAR-T direcionadas de forma adotiva para CD19. Um produto de leucaferese coletado de cada paciente é submetido à seleção de linfócitos T CD3 positivos usando o Miltenyi Biotec CliniMACS Prodigy® System e seguindo as recomendações do fabricante. As células são transduzidas com vírus CD19-CAR de grau clínico (por exemplo, SEQ ID NO: 14056, SEQ ID NO: 14109, SEQ ID NO: 16330; SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 791] e então, seleção e a expansão das células CAR-T ocorre em um sistema fechado. Depois que os produtos celulares resultantes são submetidos a testes de controle de qualidade (incluindo esterilidade e testes de

294 / 308 citotoxicidade específica para tumor), eles são criopreservados. Enquanto isso, após a leucoforese, os participantes do estudo começam com quimioterapia linfodepletiva (30 mg/m2/dia de fludarabina mais 500 mg/m2/dia de ciclofosfamida x 3 dias). Um dia após a conclusão do regime de linfodepleção, o produto de células CAR-T previamente armazenado é transportado ao lado da cama do paciente, descongelado e infundido. O participante do estudo recebe linfócitos transduzidos com CAR por infusão intravenosa, seguido por uma alta dose (720.000 UI / kg) de IL-2 (Aldesleukin; Prometheus, San Diego, CA) a cada 8 horas até a tolerância. A dose do produto CAR-T varia de 1 x 104 células CAR + ve CD3 / kg a 5 x 109 células CAR + ve CD3 / kg de acordo com o protocolo do estudo. O produto CAR-T pode ser administrado como uma única infusão ou em infusões divididas. Os participantes da pesquisa podem ser pré- medicados pelo menos 30 minutos antes da infusão de células T com 15 mg/kg de acetaminofeno PO (máx. 650 mg) e difenidramina 0,5-1 mg / kg IV (dose máxima de 50 mg). O participante do estudo pode receber opcionalmente injeções diárias de IL-2 humana. Os estudos de acompanhamento clínico e laboratorial correlativos podem ser realizados a critério do médico e podem incluir estudos quantitativos de RT-PCR para a presença de células LLA / linfoma que expressam CD19 e / ou células T transferidas adotivamente; FDG- PET e / ou tomografias; exame da medula óssea para avaliação patológica específica da doença; biópsia de linfonodo; e / ou acompanhamento de longo prazo de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Consultivo de Modificadores de Resposta Biológica da FDA que se aplicam a estudos de transferência de genes. Essencialmente, uma abordagem semelhante pode ser usada para tratar outras doenças usando células imunes (por exemplo, células T) que foram projetadas para expressar o CAR da divulgação, onde o CAR tem como alvo um antígeno ou antígenos expressos nas células causadoras da doença ou associadas a doença.

[00710] Uso de células CAR-T direcionadas a vários antígenos para

295 / 308 terapia celular adotiva.

Pacientes com muitos cânceres são inscritos em um ensaio clínico de fase I aprovado pelo IRB para imunoterapia com células CAR-T transferidas de forma adotiva, visando diferentes antígenos causadores de doenças ou associados a doenças.

CARs para diferentes doenças são selecionados com base na expressão conhecida de seu antígeno alvo nas células causadoras da doença ou associadas à doença.

Sempre que possível, a expressão do alvo CAR em células causadoras de doenças ou associadas a doenças é confirmada pela ligação à proteína de fusão ABD-GGS-NLuc na qual o domínio de ligação ao antígeno CAR (ABD) é fundido à forma não secretora da proteína NLuc através de um ligante flexível.

Alternativamente, a imunohistoquímica ou citometria de fluxo usando anticorpos disponíveis comercialmente é usada para confirmar a expressão do alvo CAR em células causadoras de doenças ou associadas a doenças.

As células T são coletadas do sujeito usando leucoforese, transduzidas com o vetor de lentivírus que codifica CAR apropriado e expandidas ex vivo usando contas de CD3 / CD28 em um sistema fechado.

Após os produtos celulares resultantes serem submetidos a testes de controle de qualidade (incluindo testes de esterilidade e citotoxicidade específica para tumor), eles são criopreservados.

Enquanto isso, os participantes do estudo começam com quimioterapia linfodepletiva (30 mg/m2/dia de fludarabina mais 500 mg/m2/dia de ciclofosfamida x 3 dias). Um dia após a conclusão de seu regime de linfodepleção, o participante do estudo recebe linfócitos CAR infundidos por via intravenosa, seguido por uma alta dose (720,000 UI / kg) de IL-2 (Aldesleukin; Prometheus, San Diego, CA) a cada 8 horas até a tolerância.

O produto de células CAR-T previamente armazenado é transportado para a cabeceira do paciente, descongelado e infundido.

A dose do produto CAR-T varia de 1 x 104 células CAR + ve CD3/kg a 5 x 109 células CAR +ve CD3/kg de acordo com o protocolo do estudo.

O produto CAR-T pode ser administrado como uma única infusão ou em infusões divididas.

Os participantes da pesquisa podem ser pré-medicados pelo menos

296 / 308 30 minutos antes da infusão de células T com 15 mg / kg de acetaminofeno PO (máx. 650 mg) e difenidramina 0,5-1 mg / kg IV (dose máxima de 50 mg). O participante do estudo pode receber opcionalmente injeções diárias de IL-2 humana. Os estudos de acompanhamento clínico e laboratorial podem então ser realizados a critério do médico. A utilização de ambos m yeloablative e lymphodepleting quimioterapia antes da terapia celular adoptiva

[00711] Essencialmente, um protocolo semelhante ao descrito no exemplo anterior é usado, com a exceção de que o participante do estudo recebe regime de quimioterapia mieloablativa e linfodepleção. Regimes de condicionamento mieloablativo exemplares incluem FCE (Fludarabina 25 mg/m2/dia, dias -7 a -3; ciclofosfamida 200 mg/m2/dia, dias -7 a -3; e etoposídeo 250 mg/m2/dia, dias - 4 a −3), FCIE (Fludarabina 25 mg/m2/dia, dias −7 a −3; ciclofosfamida 200 mg/m2/dia, dias −7 a −3; idarrubicina 12 mg/m2/dia, dias −7 a −5 e etoposídeo 250 mg/m2/dia, dias −4 a −3), FluCyE ( fludarabina 30 mg/m2/dia, citarabina 1,5 g/m2/dia administrada após fludarabina e etoposídeo 100 mg/m2/dia com cada uma das drogas administradas nos dias -6 a -1), ou FE ( fludarabina 30 mg/m2/dia e etoposídeo 100 mg/m2/dia nos dias -5 ao dia -1) ou etoposido ( 50-100 mg/m2/dia no dia - 5 e dia -1). O sujeito recebe produtos de células CAR-T 24-72 horas após a conclusão da quimioterapia. A incidência e gravidade da síndrome de liberação de citocinas e neurotoxicidade são reduzidas em pacientes que recebem quimioterapia mieloablativa e linfodepletora antes da administração de células CAR-T.

[00712] Uso de um inibidor de mTOR RAD001 em combinação com células CAR-T. O estudo é conduzido conforme descrito nos exemplos anteriores, com a exceção de que a partir de 1 dia após a infusão de células CAR-T, os participantes do estudo recebem um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, em uma dosagem que

297 / 308 fornece um nível mínimo alvo 0,1 a 3 ng / ml, em que o nível mínimo "se refere à concentração de um fármaco no plasma imediatamente antes da próxima dose, ou a concentração mínima do fármaco entre duas doses.

[00713] Uso de ibrutinibe em combinação com células CAR-T. O estudo é conduzido tal como descrito nos exemplos anteriores com a excepção de que a partir de 1 dia após a infusão de car- células T, os participantes do estudo são administrados por via oral Ibrutinib na dose de 140 mg/d e 420 mg/d. Observa- se que o participante do estudo que recebeu ibrutinibe tem menos incidência de síndrome de liberação de citocina grave em comparação com os participantes que receberam células CAR-T sem ibrutinibe.

[00714] Uso de células CAR-T alogênicas para terapia com células adotivas. Pacientes com mieloma recorrente e linfoma de efusão primária podem receber imunoterapia com células CAR-T alogênicas transferidas de maneira adotiva. Um produto de leucaferese coletado de um doador compatível com HLA é submetido à seleção de linfócitos T CD3 positivos usando o Miltenyi Biotec CliniMACS Prodigy® System e seguindo as recomendações do fabricante. O CAR específico de BCMA (SEQ ID NO: 12837, 12890, 12943 ou 13049) tem como alvo o locus TRAC em células T essencialmente como descrito no estudo de Eyquem J et al (Nature, 543 (7643): 113-117). As células são expandidas por 9-12 dias em sistema fechado. Após os produtos celulares resultantes serem submetidos a testes de controle de qualidade (incluindo testes de esterilidade e citotoxicidade específica do tumor), eles são criopreservados. Enquanto isso, os participantes do estudo começam com quimioterapia linfodepletiva (30 mg/m2 /dia de fludarabina mais 500 mg/m2 /dia de ciclofosfamida x 3 dias). Um dia após completar seu regime de linfodepleção, o participante do estudo recebe linfócitos transduzidos por infusão intravenosa, seguido por uma alta dose (720,000 UI / kg) de IL-2 (Aldesleucina; Prometheus, San Diego, CA) a cada 8 horas até a tolerância. O produto de células CAR-T é transportado para a cabeceira do paciente, descongelado e

298 / 308 infundido. A dose do produto CAR-T pode variar de 1 x 104 células CAR + ve CD3 / kg a 5 x 109 células CAR + ve CD3 / kg de acordo com o protocolo do estudo. O produto CAR pode ser administrado como uma infusão única ou em infusões divididas. Os participantes da pesquisa podem ser pré-medicados pelo menos 30 minutos antes da infusão de células CAR-T com 15 mg / kg de acetaminofeno PO (máx. 650 mg) e difenidramina 0,5-1 mg / kg IV (dose máxima de 50 mg). O uso de imunossupressores também fica a critério do médico. Essencialmente, uma abordagem semelhante pode ser usada para tratar outras doenças usando células imunes alogênicas (por exemplo, células T) que expressam o CAR da divulgação, onde o CAR tem como alvo um antígeno ou antígenos expressos nas células causadoras da doença ou associadas à doença.

[00715] Infusão arterial hepática de células CAR-T. Além da infusão intravenosa, as células CAR-T podem ser infundidas intra-arterialmente para fornecer uma alta concentração de células CAR-T em uma área local ou órgão envolvido com uma doença. No exemplo abaixo, essa abordagem é usada no caso de uma paciente com metástases hepáticas de câncer de ovário que expressa mesotelina (MSLN). Essencialmente, uma abordagem semelhante pode ser usada para infusão intra-arterial de células CAR-T visando outros antígenos tumorais.

[00716] Um angiograma de mapeamento é realizado usando uma abordagem da artéria femoral comum direita na linha de base. As artérias gastroduodenal e gástrica direita, além de outras fontes potenciais de perfusão extra-hepática, são embolizadas com microêmbolos. O mesmo procedimento para acesso arterial é realizado para a administração de células T que expressam os CARs MSLN sozinhos ou em combinação (SEQ ID NO: 16331-16334; 14268-14269; 14321 ou 14374). As células T são coletadas do paciente no dia 0 e são infectadas com lentivírus que codificam CAR individualmente ou em combinação e expandidas conforme descrito nos exemplos anteriores. As células CAR-T serão administradas em uma dose crescente no dia 14 (108

299 / 308 células CAR-T), dia 28 (109 células CAR-T) e dia 44 (1010 células CAR-T). As células CAR-T são injetadas manualmente usando uma seringa de 60 cc a uma taxa de <2 cc / segundo. O volume total de infusão é de aproximadamente 100 cc. A angiografia de taxa de contraste calibrada é realizada após a primeira infusão de 50 cc e na conclusão da infusão de CAR-T para confirmar o fluxo arterial preservado. As infusões são administradas na artéria hepática apropriada, quando possível. Certos pacientes têm anatomia arterial hepática aberrante, na qual a artéria hepática direita ou esquerda não se origina da artéria hepática apropriada. Nesses casos, a dose de células CAR-T é dividida com base em cálculos de volume lobar. Nestes casos, as doses divididas são administradas separadamente nas artérias hepáticas direita e esquerda para garantir a administração de CAR-T proporcional a ambos os lobos hepáticos. As avaliações clínicas são realizadas no início do estudo, nos dias da infusão e 1, 2, 4 e 7 dias após a infusão.

[00717] Administração intraperitoneal de células CAR-T. As células CAR-T também podem ser administradas por via intraperitoneal, essencialmente conforme descrito em Koneru M et al (Journal of Translational Medicine; 2015; 13: 102). No exemplo a seguir, esta abordagem é usada no caso de pacientes com envolvimento peritoneal com câncer de ovário que expressa o receptor alfa de folato (FR1 ou FOLR1). Essencialmente, uma abordagem semelhante pode ser usada para infusão intra-peritoneal de células CAR-T direcionadas a outros antígenos tumorais.

[00718] Um consentimento informado de triagem será oferecido a pacientes com câncer de ovário seroso recorrente de alto grau para testar seu câncer quanto à expressão de FR1 (FOLR1). Caso a expressão de FR1 seja confirmada por imunohistoquímica, os pacientes terão um produto de leucaferese obtido de sangue periférico. Na fase de tratamento do estudo, o produto de leucaferese será descongelado e lavado. Posteriormente, as células T CD3 + serão isoladas do produto de leucaferese descongelado por separação

300 / 308 magnética usando contas CD3/CD28. As células T ativadas serão transduzidas por lentivírus com um FOLR1 CAR [SEQ ID NO: 2120 ou 2121] e posteriormente expandidas usando protocolo de expansão contas de CD3/CD28.

[00719] Essas células T autólogas serão geneticamente modificadas para expressar o FOLR1 CAR [SEQ ID NO: 2120 ou 2121]. Pacientes com carcinoma seroso recorrente de alto grau do ovário, carcinoma peritoneal primário ou da trompa de Falópio que expressam antígeno FR1 confirmado por análise imunohistoquímica (IHC) de tumor armazenado (incluído em parafina) ou recém-biopsiado serão potencialmente elegíveis para o estudo.

[00720] Coortes de 3-6 pacientes serão infundidos com doses crescentes de células T modificadas para estabelecer a dose máxima tolerada (MTD). Existem quatro níveis de dose planejados: 3 × 105, 1 × 106, 3 × 106 e 1 × 107 células FOLR1 CAR-T / kg. As coortes I e II serão tratadas com 3 × 105 FOLR1 [SEQ ID NO: 2120 ou 2121] células CAR-T / kg, mas os pacientes na coorte II também receberão ciclofosfamida linfodepletora. As coortes II-V receberão doses crescentes das células T modificadas após o pré-tratamento com ciclofosfamida. A ciclofosfamida linfodepletora dosada a 750 mg/m2 será administrada 2–4 dias antes da infusão inicial de células T. Um esquema padrão de escalonamento de dose 3 + 3 será seguido. Se o primeiro nível de dose exceder o MTD, uma coorte subsequente de 3-6 pacientes será tratada com o nível de dose -1 de 1 × 105 células FOLR1 CAR-T/kg sem a adição de ciclofosfamida linfodepletora (coorte -I).

[00721] Um cateter IP será colocado antes da infusão de células T. O cateter será colocado quando as células T modificadas estiverem prontas para administração. Os pacientes serão internados na unidade de internação do hospital antes da primeira infusão de células CAR T e permanecerão hospitalizados até pelo menos 3 dias após a segunda infusão de células CAR T. A primeira coorte de pacientes a ser tratada e o primeiro paciente tratado em

301 / 308 cada coorte subsequente serão admitidos na unidade de terapia intensiva (UTI); os pacientes subsequentes podem ser admitidos no serviço de internação de oncologia médica (sujeito ao julgamento clínico do médico assistente).

[00722] Os pacientes receberão uma dose única de quimioterapia com ciclofosfamida linfodepletora (750 mg/m2 IV) 2 a 4 dias antes de iniciar o tratamento com células T modificadas com CAR. As células T transduzidas serão testadas quanto à qualidade em número, pureza, viabilidade e esterilidade antes da infusão. Todos os pacientes receberão 50% da dose de células T geneticamente modificadas por via intravenosa. Os pacientes serão monitorados de perto quanto a toxicidades. Um a 3 dias depois, a dose restante de células T será administrada como uma infusão IP.

[00723] Amostras de sangue serão obtidas de todos os pacientes antes e após o tratamento para avaliar a toxicidade, os efeitos terapêuticos e a sobrevivência das células T geneticamente modificadas.

[00724] Uso de células CAR-T para injeção intratumoral. As células CAR-T também podem ser administradas intratumoralmente, essencialmente como descrito em Brown CE, et al, Clin Cancer Res. 15 de setembro de 2015; 21 (18): 4062–4072. No exemplo a seguir, essa abordagem é usada no caso de pacientes com glioblastoma recorrente (GBM) que expressa EGFRviii. Essencialmente, uma abordagem semelhante pode ser usada para injeção intratumoral de células CAR-T direcionadas a outros antígenos tumorais.

[00725] Um estudo piloto de segurança e viabilidade será realizado para testar células T que expressam CAR (SEQ ID NO: 1699 ou 1700) em GBM recorrente. Todos os pacientes participantes deverão fornecer consentimento informado por escrito. Os pacientes elegíveis incluirão adultos (18-70 anos) com glioma supratentorial de grau III ou IV unifocal recorrente ou refratário cujos tumores não mostram comunicação com as vias ventriculares / LCR e são passíveis de ressecção. Os pacientes serão inscritos após o diagnóstico inicial de glioma de alto grau (OMS grau III ou IV), momento em que serão

302 / 308 submetidos à leucaferese para coleta de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Estas células serão usadas para manipular células T para expressar o EGFRviii CAR (SEQ ID NO: 1699 ou 1700) após a infecção com o vetor lentiviral correspondente, conforme descrito nos exemplos anteriores.

Alternativamente, as células CAR-T podem ser geradas após a infecção com um vetor retroviral ou usando o transposon da bela adormecida ou por transfecção de mRNA IVT.

Posteriormente, as células CAR-T terapêuticas testadas para liberação serão criopreservadas e armazenadas para uso posterior.

No momento da primeira recorrência do tumor, o participante da pesquisa será submetido à ressecção do tumor junto com a colocação de um reservatório / cateter de Rickham.

Ao mesmo tempo, as células CAR-T terapêuticas serão descongeladas e novamente expandidas in vitro usando o protocolo de expansão rápida baseado em contas de CD3/CD28. Após a recuperação da cirurgia e pós-RM da linha de base, as células CAR-T serão administradas diretamente na cavidade de ressecção por meio do cateter permanente, essencialmente conforme descrito (Brown et al., Clin Cancer Res. 2015, 15 de setembro; 21 (18): 4062–4072). As células serão injetadas manualmente no reservatório de Rickham usando uma agulha borboleta de calibre 21 para fornecer um volume de 2 mL durante 5-10 minutos, seguido por 2 mL de enxágue com solução salina normal sem conservantes por 5 minutos.

O plano de tratamento do protocolo irá especificar um cronograma de escalonamento de dose intra-paciente com uma meta de 12 doses de células CAR-T administradas por via intracraniana ao longo de um período de 5 semanas composto por ciclos de tratamento semanais.

Durante os ciclos 1, 2, 4 e 5, as infusões de células T serão realizadas nos dias 1, 3 e 5 da semana do ciclo, e a semana 3 será um ciclo de descanso.

Por segurança, no ciclo 1, utilizaremos uma estratégia de escalonamento de dose intrapaciente, com doses de células T CAR de 107, 5 × 107 e 108 células por infusão administradas nos dias 1, 3 e 5, respectivamente, e isso será seguido por 9 CAR adicionais -Infusões de células

303 / 308 T de 108 células ao longo de 4 semanas. Imagens para avaliar a resposta serão realizadas durante o ciclo de descanso da 3ª semana e após a 5ª semana. As diretrizes fornecidas no NCI Common Toxicity Criteria versão 2.0 (https://ctep.ifo.nih.gov/l) serão seguidas para o monitoramento de toxicidade e notificação de eventos adversos.

[00726] Uso de células CAR-T para purga ex vivo da medula óssea ou preparação de células-tronco de sangue periférico antes do transplante. As células CAR-T podem ser usadas para purgar a medula óssea ou preparações de células-tronco do sangue periférico de células cancerosas antes do transplante de células-tronco. No exemplo a seguir, as células CAR-T que expressam BCMA são usadas para purgar a medula óssea ou para purgar células-tronco do sangue periférico obtidas de um paciente com mieloma múltiplo antes do transplante de células-tronco autólogas (ou medula óssea). Essencialmente, uma abordagem semelhante pode ser usada para purgar medula óssea ou preparações de células-tronco de sangue periférico usando células CAR-T que têm como alvo outros antígenos adequados que são expressos em células cancerosas e têm expressão nenhuma ou insignificante nas células-tronco hematopoiéticas normais.

[00727] O paciente será submetido a leucoforese para coletar células mononucleares do sangue periférico (PBMC). As células T serão purificadas usando esferas CD3. Estas células serão usadas para manipular células T para expressar o BCMA CAR CD8SP-BCMA-BB-CAR02-vL- [hTCRa-CSDVP] - F-F2A-SP-BCMA-BB-CAR02-vH- [hTCRb-KACIAH] - F-P2A-Xba-PAC [SEQ ID NO: 546] contendo o gene resistano de puromicina (PAC) após infecção com o vetor lentiviral correspondente, conforme descrito nos exemplos anteriores. Este CAR tem como alvo BCMA, um antígeno expresso em células de mieloma. CAR-T que expressa o CAR CD8SP-BCMA-BB- CAR02-vL- [hTCRb-KACIAH] -F-P2A-SP-BCMA-BB-CAR02-vH- [hTCRa-CSDVP] -F-F2A-PAC [SEQ ID NO: 552] ou CD8SP-BCMA-BB-

304 / 308

CAR02-vL-IgCL-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP-Bst-BCMA-BB- CAR02-vH-IgG1-CH1-KPN-CD3zECDTMCP-opt2 -F-F2A-Xba-PAC [SEQ ID NO: 553] será usado como alternativas ou em combinação com as células CAR-T acima direcionadas a CS1. Alternativamente, as células CAR-T podem ser geradas após a infecção com um vetor retroviral ou usando o transposon da bela adormecida ou por transfecção de mRNA de IVT.

Posteriormente, as células CAR-T terapêuticas testadas para liberação serão criopreservadas e armazenadas para uso posterior ou usadas frescas.

Células da medula óssea e produtos de células progenitoras do sangue periférico serão coletados de um paciente com mieloma múltiplo seguindo procedimentos padrão.

Para a mobilização das células-tronco do sangue periférico, os pacientes receberão ciclofosfamida, 3 gm/m2 seguida de G-CSF, 10 μg/kg por via subcutânea a cada dia começando 24 h após a ciclofosfamida até a férese ser concluída.

As células-tronco do sangue periférico serão coletadas assim que a contagem de células CD34 + no sangue periférico for de 15 células/μl.

A meta da coleta será processar três volumes de sangue por dia até que um mínimo de 2,0 vezes 106 células CD34+/kg sejam atingidos após o processamento.

Os produtos de medula óssea e células-tronco de sangue periférico serão opcionalmente esgotados de glóbulos vermelhos e / ou enriquecidos para células que expressam CD34 usando o sistema CliniMACS Prodigy® da Miltenyi Biotec e seguindo as recomendações do fabricante.

Os produtos serão usados frescos para purga ex vivo ou criopreservados.

Para a purga, medula óssea ou produtos de células-tronco de sangue periférico serão co-cultivados com células CAR-T descongeladas em uma razão efetor-alvo variando de 5: 1 a 30: 1 por 4 a 24 horas em meio XVIVO (Lonza) suplementado com 100-IU recombinante-IL2 humana.

As células serão cultivadas a 37 °C, em incubadora umidificada com 5% de CO2. No final do período de co-cultura, uma alíquota das células será removida para teste de esterilidade e qualidade (incluindo medição de CFU- GM e citometria de fluxo para células CD34 e CD138 positivas). A amostra

305 / 308 restante será administrada por via intravenosa ao paciente que recebeu anteriormente quimioterapia mieloablativa (por exemplo, alta dose de melfalan em duas doses divididas de 70 mg/m2 para uma dose total de 140 mg/m2).

[00728] Uso de seleção in vitro e vivo para selecionar CARs com as propriedades desejadas. Um pool de CARs direcionado a CD19 listado nas Tabelas 7 é direcionado ao locus TRAC em células T usando TRAC gRNA e técnicas conhecidas na técnica. O vetor de direcionamento também carrega códigos de barras de DNA localizados a jusante do códon de parada das inserções CAR. As células T podem ser derivadas do sangue periférico. Em uma modalidade alternativa, as células T são derivadas de um único clone de iPSC ou células-tronco hematopoiéticas usando técnicas conhecidas na técnica. As células T que expressam o pool de CARs são co-cultivadas com células RAJI in vitro por 1 a 21 dias. As alíquotas dos pools de células CAR-T são coletadas antes da cultura com as células alvo e em dias diferentes após a co- cultura. As amostras são submetidas ao sequenciamento de próxima geração para determinar a frequência relativa de diferentes CARs após a exposição às células alvo. As análises de bioinformática são usadas para determinar os CARs que estão associados a uma melhor resposta proliferativa após a cocultura com as células alvo. Essencialmente, uma abordagem semelhante é usada para determinar os CARs que conferem maior potencial proliferativo nas células T in vivo e / ou persistem a longo prazo in vivo e / ou estão presentes em maior frequência quando normalizados para sua frequência na população de células T iniciais em animais sobreviventes em comparação com os animais que sucumbem ao desafio do tumor. Em uma modalidade alternativa da divulgação, essencialmente uma abordagem semelhante é usada em amostras clínicas humanas para identificar CARs que estão associados a diferentes propriedades e / ou resultados, incluindo, mas não se limitando a, melhor sobrevida em longo prazo, menor incidência de síndrome de liberação de citocina, menor neurotoxicidade e / ou maior persistência a longo prazo. Esses CARs podem

306 / 308 ser subsequentemente usados, isoladamente ou em várias combinações, para desenvolver diferentes subconjuntos de CAR, contendo CARs direcionados aos mesmos ou diferentes domínios de ligação ao antígeno, com diversas propriedades para o tratamento de diferentes condições de doença e diferentes pacientes. Em outras habilitações, as células CAR-T são expostas à sua linha celular alvo e, em seguida, classificadas em diferentes conjuntos com base no grau de IFNγ intracelular conforme determinado por citometria de fluxo. A frequência de diferentes CARs na população de IFNγ baixo vs alto é determinada pelo sequenciamento de próxima geração e normalizada para sua frequência na população de células CAR-T de controle, ou seja, células CAR- T que não foram expostas à linha de células alvo ou estão exposto a uma linha celular que não expressa a tarja de CARs. A partir desta análise, os CARs que estão associados a diferentes níveis de produção de IFNγ podem ser determinados. Uma abordagem semelhante é usada para rastrear e selecionar CARs com qualquer uma ou uma combinação de propriedades ou atributos desejados incluindo, mas não se limitando a, produção de TNFα inferior, expressão inferior de marcadores de exaustão, expressão inferior de marcadores de diferenciação terminal e / ou expressão superior de marcadores de citotoxicidade.

[00729] A proteína Vif do HIV-1 aumenta a transdução e a expressão do gene mediada por lentivírus.

[00730] Células 293FT foram semeadas em 10 ml de meio DMEM-10 sem antibióticos em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm de modo que elas estarão aproximadamente 80% confluentes no dia da transfecção. No dia seguinte, as células foram transfectadas pelo método de transfecção de fosfato de cálcio usando 10 μg de plasmídeo de expressão lentiviral que codifica uma SEQ ID NO: 11244) ou um CAR de 2ª geração que visa CD19 e coexpressa a proteína Vif do HIV-1 (SEQ ID NO: 11245) e plasmídeos de empacotamento (7,5 μg de plasmídeo PSPAX2 e 2 μg de PLP / VSVG). Aproximadamente 15-

307 / 308 16 horas após a transfecção, 9 ml de meio são removidos e substituídos por 5 ml de meio fresco. Aproximadamente, 48 horas após a transfecção, 5 ml de sobrenadante são coletados (primeira coleta) e substituídos por 5 ml de meio fresco. Aproximadamente 72 horas após a transfecção, todos os meios foram coletados (segunda coleta, geralmente em torno de 6 ml). Os sobrenadantes recolhidos são reunidos e centrifugados a 1000 rpm durante 1 minuto para remover quaisquer resíduos celulares e células não aderentes. O sobrenadante livre de células é filtrado através de um filtro de seringa de 0,45 μm. O título dos lentivírus é medido usando ELISA p24. As células buffy coat são obtidas de dadores adultos saudáveis não identificados do banco de sangue e usadas para isolar células mononucleares de sangue periférico (PBMC) por centrifugação em gradiente Ficoll-Hypaque. PBMC são usados para isolar células T usando microesferas magnéticas CD3 (Miltenyi Biotech) e seguindo as instruções do fabricante. As células T são ressuspensas em meio XVIVO (Lonza) suplantado com 10 ng / ml de anticorpo CD3, 10 ng / ml de anticorpo CD28 e 100 UI de IL2 humana recombinante. As células T purificadas são infectadas com quantidades iguais de vetor de lentivírus que codifica o CAR de 2ª geração direcionado a CD19 (SEQ ID NO: 11244) ou um CAR de 2ª geração direcionado a CD19 e coexpressando a proteína Vif de HIV-1 (SEQ ID NO: 11245). Ambas as construções CAR também carregam uma etiqueta de epítopo MYC. A expressão de CAR nas células T é examinada por imunocoloração com um anticorpo MYC conjugado com APC e análise FACS 48 horas após a infecção. Verificou-se que uma porcentagem significativamente maior de células T está infectada com o construto CAR que coexpressa Vif em comparação com o construto CAR sem expressão de Vif.

[00731] A análise de FACS é repetida 3 dias após a infecção. Novamente, uma porcentagem significativamente maior de células T foi encontrada para ser infectada com o construto CAR que coexpressa Vif em comparação com o construto CAR sem expressão de Vif.

308 / 308

[00732] A experiência também é repetida na linha celular BC-1. Novamente, uma porcentagem significativamente maior de células BC-1 foi encontrada infectada com o construto CAR que coexpressa Vif em comparação com o construto CAR sem expressão de Vif.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante caracterizado pelo fato de que codifica pelo menos um receptor de antígeno quimérico de primeira ou próxima geração (CAR), o pelo menos um polinucleotídeo recombinante compreendendo: (a) um primeiro domínio de ácido nucleico que codifica um domínio transmembrana e / ou citoplasmático parcial ou completo e, opcionalmente, o domínio extracelular de uma proteína endógena, onde a proteína endógena é expressa na superfície dos linfócitos e desencadeia a ativação e / ou proliferação de linfócitos; (b) opcionalmente um polinucleotídeo ligante; e (c) um segundo domínio de ácido nucleico operacionalmente ligado ao primeiro domínio de ácido nucleico, em que o segundo domínio de ácido nucleico codifica um ou mais domínios de ligação ao antígeno TCR não natural em que o domínio de ligação é selecionado a partir de um domínio de ligação estabelecido na Tabela 3; (d) um terceiro domínio de ácido nucleico opcional que codifica um domínio coestimulatório; e um domínio de ácido nucleico adicional opcional que codifica um módulo acessório.

2. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro ácido nucleico codifica parcialmente ou totalmente pelo menos uma cadeia de receptor de células T (TCR), conforme estabelecido na Tabela 13.

3. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro ácido nucleico codifica pelo menos um domínio transmembranar na Tabela 13 operacionalmente ligado ao domínio citoplasmático semelhante a TCR.

4. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um

CAR, em que o CAR compreende: (i) uma cadeia constante de receptor de célula T (TCR) parcial ou total tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 75% de identidade de sequência com uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 4038 a 4063, 12602-12638, e que pode compreender um módulo coestimulatório opcional; (ii) um linker opcional; e (iii) um ou mais domínios de ligação ao antígeno de TCR não naturais ligados a (i) selecionados a partir de um domínio de ligação estabelecido na Tabela 3; (iv) um módulo acessador opcional; e (v) um dímero de um polipeptídeo compreendendo (i) - (iii).

5. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo recombinante compreende uma sequência que codifica qualquer uma das sequências na Tabela 2.

6. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o módulo acessório compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 4103-4117 e 4090-4096.

7. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que o CAR codificado compreende (1) qualquer um dos CARs 1-16 da Tabela 1 e / ou (2) um estrutura principal da Tabela 2; e (3) um domínio de ligação da Tabela 3.

8. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que (i) é uma cadeia constante de TCR CD3z.

9. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que codifica dois receptores de antígenos quiméricos de primeira geração ou de próxima geração.

10. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que codifica um dímero de cadeias constantes de CD3z.

11. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante caracterizado pelo fato de que codifica pelo menos um receptor de antígeno quimérico de próxima geração (CAR), o pelo menos um polinucleotídeo recombinante compreendendo: (a) um primeiro domínio de ácido nucleico que codifica um domínio transmembrana e/ou citoplásmico parcial ou inteiro e opcionalmente o domínio extracelular de uma proteína CD3z endógena Tendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4064 -4066, 4070 -4072, e 4075 -4078, em que a proteína endógena é expressa na superfície de linfócitos e aciona a ativação e/ou proliferação do linfócito; (b) opcionalmente um polinucleotídeo ligante; e (c) um segundo domínio de ácido nucleico operacionalmente ligado ao primeiro domínio de ácido nucleico, em que o segundo domínio de ácido nucleico codifica um ou mais domínios de ligação ao antígeno TCR não naturais, em que o domínio de ligação é selecionado a partir de um domínio de ligação estabelecido em Tabela 3; e (d) um terceiro domínio de ácido nucleico opcional que codifica um módulo coestimulador; e um ácido nucleico adicional opcional que codifica um módulo acessório.

12. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as sequências de ácido nucleico que codificam a proteína CD3z endógena são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 67 e 71.

13. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos um CAR de próxima geração compreende dois CARs, cada CAR compreendendo uma cadeia CD3z.

14. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que um fragmento vL de um anticorpo está operacionalmente ligado a uma das duas cadeias CD3z e um fragmento vH do anticorpo está operacionalmente ligado à outra cadeia CD3z.

15. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as cadeias vL e vH são selecionadas a partir de pares na Tabela 3 e 4 para um antígeno alvo específico.

16. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que um ligante é fornecido entre as cadeias vL / vH e / ou CD3z.

17. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que um ligante codificado é selecionado a partir do grupo que consiste em IgCL (SEQ ID NO (DNA): 28 e SEQ ID NO (PRT): 4027) e domínios IgCH (SEQ ID NO (DNA): 29 e SEQ ID NO (PRT): 4028).

18. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o terceiro domínio de ácido nucleico que codifica um módulo coestimulador.

19. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o módulo constimulatório compreende uma proteína 41BB ou CD28.

20. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o módulo coestimulador compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4067 e 4068.

21. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o módulo consitmulatório compreende um domínio de sinalização de qualquer um ou mais de CD134 (OX40), Dap 10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 e combinações dos mesmos.

22. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o módulo acessório, em que o módulo acessório compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 4103-4117 e 4090-4096.

23. Célula recombinante caracterizada pelo fato de que expressa um homo- ou heterodímero de um receptor de antígeno quimérico (CAR) de primeira geração ou de próxima geração, o homo- ou heterodímero compreendendo: (a) um primeiro domínio de ácido nucleico que codifica um domínio transmembrana e / ou citoplasmático parcial ou completo e, opcionalmente, o domínio extracelular de uma proteína endógena, onde a proteína endógena é expressa na superfície dos linfócitos e desencadeia a ativação e / ou proliferação de linfócitos; (b) opcionalmente, um ligante peptídico; e (c) um segundo domínio operacionalmente ligado ao primeiro domínio, em que o segundo domínio compreende um ou mais domínios de ligação ao antígeno TCR não natural (s), em que o domínio de ligação é selecionado a partir de um domínio de ligação estabelecido na Tabela 3; e (d) um terceiro domínio opcional que codifica um módulo coestimulatório, e em que a célula opcionalmente compreende um módulo acessório, em que o homo-ou heterodimero se associe na superfície da célula recombinante.

24. Célula recombinante de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a célula é transformada com pelo menos um polinucleotídeo recombinante de qualquer uma das reivindicações 1-22.

25. Célula recombinante da cláusula 23 ou 24, caracterizada pelo fato de que a célula é um linfócito T (célula T).

26. Célula recombinante de acordo com a cláusula 25, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula T naive, uma célula T de memória central, uma célula T de memória efetora, Treg ou uma combinação das mesmas.

27. Célula recombinante de acordo com a cláusula 23, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula natural killer (NK), uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula-tronco embrionária ou uma célula-tronco pluripotente.

28. Célula recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-27, caracterizada pelo fato de que o módulo acessório compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 4103-4117 e 4090-4096.

29. Receptor de antígeno quimérico (CAR), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro domínio de ácido nucleico que codifica um domínio transmembrana e / ou citoplasmático parcial ou completo e, opcionalmente, o domínio extracelular de uma proteína endógena, onde a proteína endógena é expressa na superfície dos linfócitos e desencadeia a ativação e / ou proliferação de linfócitos; (b) opcionalmente, um ligante peptídico; e (c) um segundo domínio operacionalmente ligado ao primeiro domínio, em que o segundo domínio compreende um ou mais domínios de ligação ao antígeno TCR não natural (s), em que o domínio de ligação é selecionado a partir de um domínio de ligação estabelecido na Tabela 3; e (d) um terceiro domínio opcional que codifica um módulo co- estimulador.

30. Receptor de antígeno quimérico de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a proteína endógena compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4064-4066, 4070-4072, 4075-4078 e 12637.

31. Pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o primeiro ácido nucleico codifica parcialmente ou totalmente pelo menos uma cadeia de receptor de células T (TCR), conforme estabelecido na Tabela 13.

32. Receptor de antígeno quimérico de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o primeiro compreende um domínio transmembranar na Tabela 13 operacionalmente ligado ao domínio citoplasmático de um tipo de TCR correspondente.

33. Receptor de antígeno quimérico de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende: (i) uma cadeia constante de receptor de célula T (TCR) parcial ou total tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 75% de identidade de sequência com uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 4038 a 4063, 12602-12638, e que pode compreender um módulo coestimulatório opcional.

34. Polinucleotídeo que codifica o receptor de antígeno quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-33.

35. Vetor caracterizado pelo fato deque compreende o polinucleotídeo da cláusula 34.

36. Vírus caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo da cláusula 35.

37. Vírus da cláusula 36, caracterizado pelo fato de que o vírus é um retrovírus, um adenovírus, um vírus adeno-associado, um lentivírus, um poxvírus ou um vírus herpes.

38. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: qualquer um ou mais dos pelo menos um polinucleotídeos das reivindicações 1-22, a célula recombinante das reivindicações 23-28, o CAR da reivindicação 29-33, o vetor da reivindicação 35 ou o vírus da reivindicação 36

39. Método para tratar câncer, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a composição de acordo com a reivindicação 38, ou uma célula recombinante de acordo com a reivindicação 23; e administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição ou célula ao sujeito de modo a tratar o câncer.

40. Método da cláusula 39, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer do sangue.

41. Método da cláusula 40, caracterizado pelo fato de que o câncer de sangue é qualquer um ou mais dentre leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, síndrome mielodisplásica, linfoma, mieloma múltiplo e leucemia linfocítica aguda.

42. Pelo menos uma célula recombinante de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo recombinante compreende uma sequência que codifica HIV-1- vif.

43. Célula recombinante de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a célula compreende ainda HIV-1-vif.