BR112021006182A2

BR112021006182A2 - composições e métodos relativos a células t¿d,d engenheiradas e não engenheiradas para tratamento de tumores hematológicos

Info

Publication number: BR112021006182A2
Application number: BR112021006182-7A
Authority: BR
Inventors: Marissa Ann Herrman; Daulet Kadyl Satpayev; Jason Michael Romero; Yifeng Frank Jing; Zili An; Aya Jakobovits
Original assignee: Adicet Bio, Inc.
Priority date: 2018-10-01
Filing date: 2019-10-01
Publication date: 2021-06-29
Also published as: SG11202103235PA; EA202190926A1; IL281922A; US20210388100A1; EP3860645A1; CA3115139A1; KR20210070330A; AU2019354391A1; WO2020072536A1; JP2022501074A; MX2021003745A; WO2020072536A9; CN113056283A

Abstract

Aspectos da invenção incluem composições e métodos para tratamento de tumores hematológicos com células T ¿d,d engenheiradas ou não engenheiradas. Em algumas modalidades, as células T ¿d,d compreendem um construto de receptor de antígeno quimérico (CAR). O construto de CAR pode conter um domínio de ligação anti-CD20 ou domínio de ligação de antígeno de maturação anti-célula B (BCMA), um domínio de dobradiça CD8 e transmembrana, um domínio coestimulatório, um domínio de sinalização CD3 ¿, uma combinação dos mesmos ou todos dos mesmos. O construto de CAR pode conter um domínio codificando para uma citocina de cadeia gama comum secretada, tal como um domínio sIL15.

Description

“COMPOSIÇÕES E MÉTODOS RELATIVOS A CÉLULAS T γδ

ENGENHEIRADAS E NÃO ENGENHEIRADAS PARA TRATAMENTO DE TUMORES HEMATOLÓGICOS”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório US 62/739.822, depositado em 1 de outubro de 2018, cujo conteúdo é incorporado na íntegra para todos os fins.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apre- sentada eletronicamente em formato ASCII e é, por meio deste, incorporada por refe- rência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 17 de dezembro de 2019, é denominada ADC-0005-PCT_SL.txt e é de 147.616 bytes de tamanho.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Terapia celular adotiva sofreu iteração quase constante por mais de trinta (30) anos desde os primeiros dias com foco em ativação de linfocina básica e/ou infiltração de tumor até estratégias mais recentes engenheirando essas células imu- nes para expressar receptores de antígenos geneticamente engenheirados, tal como receptores de antígenos quiméricos (CARs)s. Embora tenha havido algumas dicas e indicações do potencial curativo dessas abordagens ao longo do caminho, ainda há muito a ser feito. Em particular, erradicação de tumor bem-sucedida por linfócitos CAR-T depende de persistência de célula CAR-T e função efetora, mas um excesso de qualquer um pode disparar efeitos de enxerto versus hospedeiro no paciente.

Como tal, a técnica está testando uma miríade de estratégias de coestimulação tanto em células T quanto NK, e em células T αβ em particular, com um objetivo de equilibrar eficácia com segurança. Notavelmente, a tradução prática de qualquer dessas várias abordagens para células T γδ aloênicas é, na melhor das hipóteses incerta, dada a atual falta de compreensão em torno dos requisitos de coestimulação de células T γδ em comparação com células T αβ. Ver, por exemplo, Ribot et al., “Searching for “signal 2”: costimulation requirements of γδ T cells”, Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68:2345-2355.

Consequentemente, estratégias melhoradas ainda são necessárias para melhorar a especificidade ou seletividade das células, para melhorar segurança das células, por exemplo, reduzindo ou evitando efeitos de enxerto verus hospedeiro (GVH), para melhorar eficácia das células, por exemplo, evitando supressão de fun- ções efetoras e para melhorar a atividade e/ou sobrevivência das células mediante administração a sujeitos. São fornecidos métodos, células, composições, kits e siste- mas que atendem a essas necessidades.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Aspectos da invenção incluem uma sequência de ácido nucleico isolada codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação que liga especificamente a um antígeno associado a tumor (TAA) expresso em uma superfície de uma célula de tumor hematológica; um, por exemplo, CD8α, domínio de dobradiça; um, por exemplo, CD8α, domínio transmem- brana; uma região de sinalização coestimulatória, opcionalmente em que a região de sinalização coestimuladora é selecionada de uma região de sinalização coestimulató- ria 4-1BB (CD137) e uma região de sinalização coestimuladora CD27; e um domínio de sinalização CD3ζ.

Aspectos da invenção incluem ainda uma célula T γδ não engenheirada como aqui descrito, bem como uma célula T γδ compreendendo um ácido nucleico codificando um construto CAR como descrito neste documento, em que a célula T γδ expressa funcionalmente o CAR codificado de ácido nucleico na superfície da célula T γδ. Aspectos da invenção incluem ainda uma pluralidade de células T γδ engenhei- radas ou não engenheiradas, conforme descrito neste documento. Aspectos da inven- ção incluem ainda um método para fazer uma célula T γδ ou pluralidade de células T γδ aqui descritas, em que o método compreende transfectar células T γδ com um construto aqui descrito. Aspectos da invenção incluem ainda uma composição farma- cêutica compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável e uma célula T γδ ou pluralidade de células T γδ conforme descrito neste documento. Aspectos da invenção incluem ainda contatar a célula de tumor hematológica com uma quantidade eficaz de matança de células de tumor de uma célula T γδ como aqui descrito. Em um aspecto, a presente invenção fornece uma sequência de ácido nucleico isolada codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende (a) um domínio de ligação que liga especificamente a um antígeno asso- ciado a tumor (TAA) expresso em uma superfície de uma célula de tumor hematoló- gica; (b) um domínio de dobradiça, tal como um domínio de dobradiça CD8α; (c) um domínio transmembrana, tal como um domínio transmembrana CD8α; (d) uma região de sinalização coestimulatória ou uma combinação de regiões de sinalização coesti- mulatórias, opcionalmente em que a região de sinalização coestimulatória é selecio- nada de uma região de sinalização coestimulatória 4-1BB (CD137) e uma região de sinalização coestimuladora CD27; e (e) um domínio de sinalização, tal como um do- mínio de sinalização CD3ζ. Em algumas modalidades, os elementos anteriores (a)-(e) são codificados na fita sense do ácido nucleico isolado na ordem 5' para 3'.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga especificamente a CD20. Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga seletivamente a um epí- topo dentro de CD20 ligado por, ou compete por ligação com, um anticorpo anti-CD20 selecionado do grupo que consiste em 3B9, 3H7, 2B7 e 9C11, preferencialmente 3H7.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação compreende as regiões determinan- tes de complementaridade de um anticorpo anti-CD20 selecionado do grupo que con- siste em 3B9, 3H7, 2B7 e 9C11, de preferência 3H7.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica uma se- quência de região variável de cadeia pesada (HCVR) e uma sequência de região va- riável de cadeia leve (LCVR), por exemplo: em que as sequências HCVR e LCVR são

SEQ ID NO:99 e 107, respectivamente; uma sequência 1, 2 e 3 de região determinante de complementaridade de SEQ ID NOs: 101, 103 e 105, respectivamente, e uma se- quência 1, 2 e 3 de região determinante de complementaridade de SEQ ID NOs: 109, 111 e 113 respectivamente; uma região determinante de complementaridade de ca- deia pesada 3 (HCDR3) e uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3), em que HCDR3 e LCDR3 são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO:345 e 353; 201 e 209; e 249 e 257; uma sequência de região variável de cadeia pesada (HCVR) e uma se- quência de região variável de cadeia leve (LCVR), em que as sequências HCVR e LCVR são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 339 e 347; 195 e 203; e 243 e 251; e/ou um domínio da região determinante de complementaridade de ca- deia pesada 3 (HCDR3) e um domínio CDR3 de cadeia leve (LCDR3), em que o do- mínio HCDR3 compreende uma sequência de aminoácido da fórmula X1—X2—X3— X4—X5—X6—X7—X8—X9—X10—X11—X12—X13—X14—X15—X16—X17— X18—X19, em que X1=A, V ou T; X2═K; X3=D; X4═P, F ou G; X5═S ou H; X6═Y; X7=G; X8═S ou H; X9=G ou F; X10═S ou Y; X11═Y, N ou S; X12═Y, G ou H; X13=G, L ou S; X14═Y, M ou D; X15═Y, D ou V; X16 =G, V ou ausente; X17=M ou ausente; X18=D ou ausente; X19═V ou ausente (SEQ ID NO: 369); e o domínio LCDR3 com- preende uma sequência de aminoácido de fórmula X1—X2—X3—X4—X5—X6— X7—X8—X9, em que X1=Q; X2=Q; X3═R ou S; X4═N, Y ou F; X5═N, D, ou Y; X6═W; X7═P; X8=L; X9=T (SEQ ID NO: 370).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação que liga especificamente a CD19 ou BCMA. Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga especificamente a BCMA. Em algumas modalidades, o domí- nio de ligação liga seletivamente a um epítopo dentro de BCMA ligado por, ou compete por ligação com, uma região de ligação anti-BCMA tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27 e 28; SEQ ID NO: 29 e 30; e SEQ ID NO: e 31 e 32. Em algumas modalidades, b. o domínio de ligação compreende as regiões determinantes de complementaridade de uma região de ligação anti-BCMA tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27 e 28; SEQ ID NO: 29 e 30; e SEQ ID NO: e 31 e 32.

Em algumas modalidades de qualquer uma das anteriores, ou conforme descrito neste documento, o CAR compreende: um domínio de dobradiça CD8α com- preendendo SEQ ID NO:1 (PTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY); ou SEQ ID NO:2 (TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLR PEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY). Em algumas modalidades de qualquer uma das anteriores, ou conforme descrito neste documento, o CAR compreende um domínio transmembrana CD8α compreendendo SEQ ID NO:3 (IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC).

Em algumas modalidades de qualquer uma das anteriores, ou como aqui descrito, o CAR compreende um domínio de sinalização CD3ζ compreendendo: SEQ ID NO:4 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRK

NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR) or SEQ ID NO:5 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM

GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD TYDALHMQALPPR).

Em algumas modalidades de qualquer uma das anteriores, ou conforme descrito neste documento, o CAR compreende uma região de sinalização coestimu- ladora de 4-1BB compreendendo SEQ ID NO:6 (KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL); ou uma região de sinalização coestimuladora de CD27 compreendendo SEQ ID NO: 7.

(QRRKYRSNKGESPVEPAEPCH YSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP). Em algu- mas modalidades de qualquer uma das anteriores, ou conforme descrito neste documento, o ácido nucleico isolado codifica a região de sinalização coestimuladora de 4-1BB compreendendo SEQ ID NO:6 e a região de sinalização coestimuladora de CD27 compreendendo SEQ ID NO:7.

Em algumas modalidades de qualquer uma das anteriores, ou conforme descrito neste documento, o ácido nucleico isolado codifica ainda uma citocina secre- tada; ou uma interleucina de cadeia gama comum secretada; ou uma interleucina de cadeia gama comum secretada, tal como IL-15, de preferência em que a interleucina de cadeia gama comum secretada, tal como IL-15, compreende uma sequência poli- peptídica de interleucina operavelmente ligada a uma sequência sinal de secreção (por exemplo, um sinal de secreção de SEQ ID NO: 33 ou 49). Em algumas modali- dades, o ácido nucleico isolado codifica uma IL-15 secretada, de preferência em que a IL-15 compreende a sequência de SEQ ID NO:34, mais preferencialmente em que a IL-15 compreende a sequência de 34 operavelmente ligada a uma sequência de sinal de secreção de SEQ ID NO:33, ou em que a IL-15 compreende a sequência da SEQ ID NO:34 operavelmente ligada a uma sequência de sinal de secreção de SEQ ID NO: 49. Em alguns casos, a citocina secretada, interleucina de cadeia gama co- mum e/ou IL-15 são codificadas no terminal carbóxi para a região de ligação, domínios de dobradiça e transmembrana, domínio de sinalização e/ou endodomínio de coesti- mulação. Em alguns casos, a citocina secretada, interleucina de cadeia gama comum e/ou IL-15 são codificados na fita sense 3' da região codificando a região de ligação, domínios de dobradiça e transmembrana, domínio de sinalização e/ou endodomínio de coestimulação.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica uma região de li- gante multicistrônica configurada para facilitar tradução do CAR e da citocina secre- tada, citocina de cadeia gama comum ou IL-15 como polipeptídeos separados. Em algumas modalidades, a região de ligante multicistrônica codifica uma autoclivagem e/ou uma sequência polipeptídica de clivagem. Em alguns casos, a sequência de autoclivagem é uma sequência de autoclivagem P2A, F2A, T2A ou E2A. Em alguns casos, a sequência de clivagem é uma sequência de clivagem de furina. Em alguns casos, a sequência de clivagem (por exemplo, sequência de clivagem de furina) é amino terminal para uma sequência de auto clivagem. Em algumas modalidades, a região de ligante multicistrônica codifica um sítio de entrada de ribossomo interno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um amino terminal de região de li- gante multicistrônica para a interleucina ou citocina ou sinal de secreção de interleu- cina ou citocina, de preferência em que a região de ligante multicistrônica compreende uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 43-45, 47, ou 52-55 ou uma com- binação das mesmas, ou codifica um sítio de entrada de ribossomo interno, por exem- plo, SEQ ID NO: 56 ou 60.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga especificamente a CD20 e o ácido nucleico codifica SEQ ID NO:8, 9, 10, 11, 12, 46, 48 ou 57 e 58. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende a sequência de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 50, 51 ou 59. Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga especificamente a BCMA e o ácido nucleico codifica SEQ ID NO: 35, 36, 37 ou 38. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende a sequência de SEQ ID NO: 39, 40, 41 ou 42. Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou uma pluralidade de polipeptídeos codificados por qualquer um dos ácidos nucleicos isolados anteriores ou conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma célula T, tal como uma célula T γδ que compreende qualquer um dos polipeptídeos anteriores ou uma pluralidade de polipeptídeos. Em algumas modalidades, a célula T expressa um domínio de ligação funcional conforme descrito neste documento na superfície da célula T. Em algumas modalidades, a cé- lula T secreta uma citocina, tal como uma interleucina de cadeia gama comum, por exemplo, IL-15.

Em algumas modalidades, a célula T exibe atividade de matança de cé- lula in vitro e/ou in vivo contra uma célula de tumor hematológica que exibe expressão de superfície de célula de um antígeno associado a tumor (TAA). Em algumas moda- lidades, a atividade de matança de célula de tumor hematológica da referida, por exemplo, célula T γδ, é maior que um nível inato de atividade de matança de célula de tumor hematológica in vitro e/ou in vivo em um controle, por exemplo, célula T γδ, que não compreende um construto CAR. Em algumas modalidades, a, por exemplo, célula T γδ exibe a elevada atividade de matança de célula de tumor hematológica contra células de tumor hematológicas HLA classe I+. Em algumas modalidades, a atividade de matança de célula de tumor hematológica ou elevada atividade de ma- tança de célula de tumor hematológica persiste, por cerca de, por pelo menos, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias após o primeiro contato com a célula de tumor hematológica.

Em algumas modalidades, a, por exemplo, célula T γδ prolifera em res- posta a contato com uma célula de tumor hematológica que exibe expressão de su- perfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA). Em algumas modalidades, a, por exemplo, célula T γδ, exibe elevada proliferação em resposta a contato com uma célula de tumor hematológica que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA) em comparação com um controle, por exemplo, céljula T γδ, que não expressa funcionalmente o CAR codificado de ácido nucleico na superfície da, por exemplo, célula T γδ. Em algumas modalidades, a, por exemplo, célula T γδ prolifera em um organismo hospedeiro que compreende a célula de tumor hematoló- gica que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA).

Em algumas modalidades, a, por exemplo, proliferação de célula T γδ ou elevada, por exemplo, proliferação de célula T γδ persiste, por cerca de, por pelo menos, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias após o primeiro contato a célula de tumor hematológica. Em algumas modalidades, a, por exemplo, céula T γδ ex- pressa citocina pró-inflamatórias, tal como fator de necrose tumoral alfa e/ou interferon gama após contato com a célula de tumor hematológica. Em algumas modalidades, a, por exemplo, célula T γδ expressa citocina pró-inflamatória, tal como fator de ne- crose tumoral alfa e/ou interferon gama após contato com a célula de tumor hemato- lógica, em uma quantidade maior que uma célula T de controle que não expressa funcionalmente o CAR codificado de ácido nucleico na superfície da célula.

Em algumas modalidades, a, por exemplo, célula T γδ exibe reduzida, substancialmente reduzida, essencialmente nenhuma ou nenhuma resposta de en- xerto versus hospedeiro quando introduzida em um hospedeiro alogênico em compa- ração com uma resposta de enxerto versus hospedeiro exibida por uma célula T αβ administrada a um hospedeiro alogênico. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T γ. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T δ. Em algumas moda- lidades, a célula T é uma célula T γδ. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T δ1, δ2, δ3 ou δ4, de preferência uma célula T δ2- δ, mais preferencialmente uma célula T δ1 δ. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T γδ δ1, uma δ2, uma δ3 ou uma δ4, de preferência uma célula T δ2- γδ, mais preferencialmente uma célula T δ1 γδ.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma pluralidade de qual- quer uma das anteriores, por exemplo, células T γδ, ou uma pluralidade de, por exem- plo, células T γδ como aqui descrito. Em algumas modalidades, a pluralidade compre- ende pelo menos cerca de 108, por exemplo, células T γδ, de preferência de cerca de 108, por exemplo, células T γδ a cerca de 1011, por exemplo, células T γδ. Em algumas modalidades, a pluralidade compreende uma composição que é pelo menos 60%, 80%, ou cerca de 60%, ou 80% a cerca de 90%, ou 95% de células T γδ δ1, δ2, δ3 ou δ4, de preferência células T γδ δ1 ou δ2, mais preferencialmente células T γδ δ2-, mais preferencialmente células T γδ δ1.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de produção de, por exemplo, células T γδ, como descrito neste documento, ou uma plu- ralidade de, por exemplo, células T γδ, como descrito neste documento, em que o método compreende transfectar as células T com um construto compreendendo uma sequência de ácido nucleico isolada como aqui descrito. Em alguns casos, o método compreende, por exemplo, transdução gama, retroviral. Em alguns casos, o método compreende expansão ex vivo da(s) célula(s) T γδ, em que a expansão ex vivo é realizada antes da transfecção e/ou após transfecção da sequência de ácido nucleico isolada. Em alguns casos, o método compreende expansão ex vivo da(s) célula(s) T, em que a expansão ex vivo é realizada antes da transfecção e após transfecção da sequência de ácido nucleico isolada. Em alguns casos, o método compreende expan- são ex vivo da(s) célula(s) T, em que a expansão ex vivo é realizada após transfecção da sequência de ácido nucleico isolada. Em algumas modalidades, o método compre- ende produzir de cerca de 108, por exemplo, células T γδ, a cerca de 1011, por exem- plo, células T γδ, que expressam funcionalmente um CAR aqui descrito dentro de cerca de 30 dias de transfecção. Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farma- cêutica compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável e uma, por exem- plo, célula T γδ aqui descrita.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para matar uma célula de tumor hematológica, o método compreendendo contatar a célula de tumor hematológica com uma quantidade eficaz de matança de célula de tumor de uma, por exemplo, célula T γδ, pluralidade de tais células, e/ou composição farma- cêutica compreendendo tais células como aqui descrito. Em algumas modalidades, o método compreende introduzir uma quantidade terapeuticamente eficaz da(s), por exemplo, célula(s) T γδ ou da composição farmacêutica em um organismo hospedeiro compreendendo a célula de tumor hematológica. Em algumas modalidades, o método compreende introduzir em um organismo hospedeiro compreendendo a célula de tu- mor hematológica uma quantidade terapeuticamente eficaz da(s), por exemplo, cé- lula(s) T γδ ou da composição farmacêutica e simultaneamente ou sequencialmente administrar um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum.

Em algumas modalidades, a administração de um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreende administrar simultaneamente com a introdução da(s), por exemplo, célula(s) T γδ ou sequencialmente uma quanti- dade de citocina(s) de cadeia gama comum eficaz para elevar proliferação, atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s), por exemplo, célula(s) T γδ introduzida(s), preferencialmente em que o método compreende administrar IL-2, mais preferencialmente em que o método compreende administrar IL-15. Em algumas modalidades, os um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreendem administrar uma quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum efi- caz para elevar proliferação, atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T introduzida(s) antes e/ou após introdução da(s) célula(s) T.

Em algumas modalidades, os um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreendem linfodepleção antes de introduzir a(s) célula(s) T. Em algumas modalidades, os um ou mais métodos para elevar cito- cina(s) de cadeia gama comum compreendem secreção de uma ou mais citocinas de cadeia gama comum das células T introduzidas. Em algumas modalidades, o método reduz a carga de tumor in vivo no organismo hospedeiro e/ou aumenta o tempode sobrevivência médio do organismo hospedeiro em comparação com um organismo controle, em que o organismo controle não é tratado com a(s) célula(s) T ou a com- posição farmacêutica. Em algumas modalidades, o método é um método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, a pre- sente invenção fornece uma, por exemplo, célula T γδ, pluralidade de, por exemplo, células T γδ, ou uma composição farmacêutica aqui descrita para uso em tratamento de uma célula de tumor hematológica em um sujeito em necessidade do mesmo.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar câncer administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T γδ, em que o câncer compreende células de tumor hematológicas que exibem expressão de superfície de célula de CD20; ou administrando uma quantidade terapeuticamente efi- caz de células T γδ, em que o câncer compreende células de tumor hematológicas que exibem expressão de superfície de célula de BCMA. Em algumas modalidades, o método compreende simultaneamente com a administração de células T γδ ou se- quencialmente, administrar um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum. Em algumas modalidades, o método compreende realizar uma plurali- dade de administrações das células T γδ, em que o intervalo entre a pluralidade de administrações é de pelo menos cerca de uma semana, de preferência pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 12 semanas e/ou no máximo uma vez a cada 6 ou 12 meses. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma composição far- macêutica para uso em qualquer um dos métodos de tratamento anteriores.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento por referência na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse es- pecificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG. 1 é uma ilustração esquemática de uma modalidade de um receptor de antígeno quimérico (CAR) contendo um endodomínio de sinalização coestimulador (à esquerda) ou dois endodomínios de sinalização coestimuladores (à direita). Como aqui utilizado, endodomínios de sinalização coestimuladores também são referidos como endodomínios de coestimulação ou endodomínios coestimuladores. Endodomí- nios de sinalização coestimuladores exemplares úteis em CARs exemplares incluem,

sem limitação, CD28; CD137 (41BB); CD278 (ICOS); CD27; CD134 (OX40); TLR2 e combinações dos mesmos.

FIG. 2 ilustra sequências de domínios de ligação que ligam especifica- mente a um epítopo dentro de CD20. Figura 2 divulga SEQ ID NOS 335-363, 99, 364, 107 e 365-368, respectivamente, em ordem de aparecimento. FIG. 3 ilustra indução de células B normais expressando CD20 de apo- ptose por células Vδ1 não transduzidas e células Vδ1 transduzidas com vários cons- trutos CAR específicos de CD20.

FIG. 4 ilustra atividade citotóxica potente de células T γδ CAR específi- cas de CD20 contra linhagens de células de linfoma FIG. 5 ilustra citotoxicidade de células T γδ CAR engenheiradas aqui descritas contra células Raji. Topo: Domínios de ligação contendo CDRs de 3B9, 2B7, 3H7 e 9C11 são testados em um construto CAR codificando um endodomínio de co- estimulação 4-1BB e domínio de sinalização CD3ζ.

FIG. 6 ilustra citotoxicidade de células T γδ CAR engenheiradas aqui descritas contra células Raji. Topo: Domínios de ligação contendo CDRs de 3H7 são testados. Inferior: citotoxicidade contra células Raji de células T γδ expressando um CAR contendo um domínio de ligação 3H7, um domínio de sinalização de CD3ζ e vários endodomínios de coestimulação como indicado um é demonstrado. O 3H7- CD27z CAR tem um domínio de ligação 3H7, dobradiça CD8α e domínio transmem- brana, endodomínio de coestimulação CD27 e domínio de sinalização CD3ζ. 3H7-5.1 tem um domínio de ligação 3H7, uma dobradiça CD8α e um domínio transmembrana, um endodomínio de coestimulação 4-1BB e um domínio de sinalização CD3ζ.

FIG. 7 ilustra resultados de um ensaio de citotoxicidade com re-desafio das células T γδ indicadas. As setas indicam tempo de readministração.

FIG. 8 ilustra eficácia in vivo de células T γδ aqui descritas em um mo- delo de camundongo NOD scid gama (NSG) de célula Raji subcutâneo.

FIG. 9 ilustra enumeração de células CAR-T γδ específicas de CD20 intratumorais in vivo indicando expansão in vivo de células CAR-T γδ e depuração de tumor.

FIG. 10 ilustra proliferação in vivo de células CAR-T γδ específicas de CD20 em tumor de linfoma CD20+ e outros órgãos. FIG. 11 ilustra eficácia in vivo de células T γδ aqui descritas em um mo- delo de camundongo NOD scid gama (NSG) de célula Raji disseminado.

FIG. 12 ilustra tratamento eficaz de um tumor Raji disseminado com cé- lulas CAR-T γδ específicas de CD20 no modelo de camundongo SRG-15 que ex- pressa IL-15 humana, sem indução de uma resposta de Enxerto versus Hospedeiro (GVH). Em contraste, células CAR-T αβ específicas de CD20 induzem uma resposta GVH letal.

FIG. 13 ilustra um processo de fabricação para produção de células CAR-T γδ engenheiradas e células CAR-T γδ não engenheiradas.

FIG. 14 ilustra eficácia terapêutica e persistência de células T CD20 CAR Vδ1 expressando sIL15 em camundongos NSG implantados subcutaneamente com células Raji e subsequentemente redesafiados (Dia 62) com células Raji em um sítio de implantação diferente. FIG. 15 ilustra eficiência de transdução de células Vδ1 com construtos scFv CAR de antígeno de maturação anti-célula B (BCMA) indicado. BCMA também é conhecido como membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 17 (TNFRSF17).

FIG. 16 ilustra atividade citotóxica de células T Vδ1 transduzidas com vários construtos CAR anti-BCMA contra um painel de linhagens de células BCMA+ de mieloma múltiplo. A linhagem de célula SCABER-Luc é uma linhagem de célula de controle que é BCMA-negativa.

FIG. 17 ilustra atividade citotóxica de células T Vδ1 transduzidas com vários construtos CAR anti-BCMA contra um painel de linhagens de células BCMA+ de mieloma múltiplo e linfoma de Burkitt.

FIG. 18 ilustra eficácia terapêutica in vivo de células T CAR Vδ1 anti- BCMA contra células NCI-H929 implantadas subcutaneamente.

DESCRIÇÃODETALHADA Definições: Para fins de interpretar este relatório descritivo, as seguintes definições se aplicarão e, sempre que apropriado, termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa. No caso de qualquer definição estabelecida conflitar com qual- quer documento incorporado neste documento por referência, a definição estabele- cida abaixo prevalecerá. A menos que definidos de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como com- preendido geralmente por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence.

"Cerca de", conforme usado neste documento se referindo a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, se des- tina a abranger variações de ±20% ou ±10%, mais preferencialmente ±5%, ainda mais preferencialmente ±1%, e ainda mais preferencialmente ±0,1% do valor especificado, uma vez que tais variações sejam apropriadas para realizar os métodos divulgados. O termo "células T γδ (células T gama delta)", como aqui utilizado, se refere a um subconjunto de células T que expressam um receptor de célula T distinto (TCR), ou seja, γδTCR, em sua superfície, composto por uma cadeia γ e uma cadeia δ. O termo "células T γδ" inclui especificamente todos os subconjuntos de células T γδ incluindo, sem limitação, células T γδ Vδ1 e Vδ2, Vδ3, bem como células T γδ naïve, de memória efetora, memória central e diferenciadas terminalmente. Como ou- tro exemplo, o termo "células T γδ" inclui células T γδ Vδ4, Vδ5, Vδ7 e Vδ8, bem como células T γδ Vγ2, Vγ3, Vγ5, Vγ8, Vγ9, Vγ10 e Vγ11. Em algumas modalidades, as células T γδ são Vδ1-, Vδ2-, ou Vδ1- e Vδ2-. Composições e métodos para fazer e usar células T γδ engenheiradas e não engenheiradas e/ou subtipos das mesmas incluem, sem limitação, aqueles descritos em US 2016/0175358; WO 2017/197347; US 9499788; US 2018/0169147; US 9907820; US 2018/0125889 e US 2017/0196910, o conteúdo de cada um dos quais é incorporado por referência para todos os fins, inclu- indo as referidas composições e métodos para fazer e usar células T γδ engenheira- das e não engenheiradas e/ou subtipos das mesmas. O presente pedido contempla ainda células T, ou outros leucócitos ou linfócitos engenheirados, que expressam uma cadeia γ ou uma cadeia δ, opcionalmente em combinação com um segundo polipep- tídeo para formar um TCR funcional. Esses leucócitos ou linfócitos engenheirados, que expressam uma cadeia γ ou uma cadeia δ, podem ser usados nos métodos ou estar presentes nas composições aqui descritas.

Conforme usado neste documento, o termo "linfócito T" ou "célula T" se refere a uma célula imune que expressa ou expressou CD3 (CD3+) e um Receptor de Célula T (TCR+). Células T desempenham um papel central em imunidade mediada por célula. Uma célula T que “expressou” CD3 e um TCR foi engenheirado para elimi- nar expressão de superfície de célula CD3 e/ou TCR. Como aqui utilizado, o termo "TCR" ou "receptor de célula T" se refere a uma proteína de sinalização de superfície de célula heteróloga dimérica formando um receptor alfa-beta ou gama-delta ou combinações dos mesmos. αβTCRs reconhecem um antígeno apresentado por uma molécula MHC, ao passo que γδTCR pode reco- nhecer um antígeno independentemente de apresentação de MHC.

O termo "MHC" (complexo de histocompatibilidade principal) se refere a um subconjunto de genes que codificam proteínas apresentadoras de antígeno de superfície de célula. Em humanos, esses genes são chamados de genes de antígeno de leucócito humano (HLA). Aqui, as abreviações MHC ou HLA são usadas intercam- biavelmente.

"Ativação", como aqui utilizado, se refere ao estado de uma célula T que foi suficientemente estimulada para induzir a proliferação celular detectável. Ativação também pode estar associada à produção de citocina induzida e funções efetoras de- tectáveis. O termo "células T ativadas" se refere a, dentre outras coisas, células T que estão sofrendo divisão celular.

O termo "anticorpo", como aqui utilizado, se refere a uma molécula de imunoglobulina que liga especificamente a um antígeno. Anticorpos podem ser imu- noglobulinas intactas derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes e po- dem ser porções imunorreativas de imunoglobulinas intactas. Anticorpos são tipica- mente tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina. Os anticorpos na presente inven- ção podem existir em uma variedade de formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, Fv, Fab e F(ab)2, bem como anticorpos de cadeia simples e anticorpos humanizados (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Labo- ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Anti- bodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). O termo "fragmento de anticorpo" se refere a uma porção de um anti- corpo intacto e se refere às regiões variáveis determinantes antigênicas de um anti- corpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, Fab, Fab′, F(ab′)2 e fragmentos Fv, anticorpos lineares, anticorpos scFv e anticor- pos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos.

Uma "cadeia pesada de anticorpo", conforme usado neste documento, se refere ao maior dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes em moléculas de anticorpo em suas conformações ocorrendo naturalmente.

Uma "cadeia leve de anticorpo", como aqui utilizado, se refere ao menor dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes em moléculas de anticorpos em suas conformações ocorrendo naturalmente. As cadeias leves κ e λ se referem aos dois principais isotipos de cadeia leve de anticorpo.

Pelo termo "anticorpo sintético", como aqui utilizado, queremos dizer um anticorpo que é gerado usando tecnologia de DNA recombinante, tal como, por exem- plo, um anticorpo expresso por um bacteriófago como aqui descrito. O termo também deve ser interpretado como significando um anticorpo que foi gerado pela síntese de uma molécula de DNA codificando o anticorpo e cuja molécula de DNA expressa uma proteína de anticorpo, ou uma sequência de aminoácido especificando o anticorpo, em que o DNA ou a sequência de aminoácido foi obtida usando DNA sintético ou tecnologia de sequência de aminoácido que está disponível e é bem conhecida na técnica.

O termo "antígeno" ou "Ag", conforme usado neste documento, é defi- nido como uma molécula que provoca uma resposta imune. Essa resposta imune pode envolver qualquer de produção de anticorpo ou da ativação de células imunolo- gicamente competentes específicas, ou ambas. O versado na técnica entenderá que qualquer macromolécula, incluindo proteínas ou peptídeos, pode servir como um an- tígeno. Além disso, antígenos podem ser derivados de DNA recombinante ou genô- mico. Um versado na técnica entenderá que qualquer DNA que compreende uma se- quência de nucleotídeo ou uma sequência de nucleotídeo parcial codificando uma proteína que elicita uma resposta imune, portanto, codifica um "antígeno" como esse termo é usado neste documento. Além disso, um especialista na técnica entenderá que um antígeno não precisa ser codificado apenas por uma sequência de nucleotídeo de comprimento total de um gene. É prontamente evidente que a presente invenção inclui, mas não está limitada, ao uso de sequências de nucleotídeos parciais de mais de um gene e que essas sequências de nucleotídeos são arranjadas em várias com- binações para elicitar a resposta imune desejada. Além disso, um versado na técnica entenderá que um antígeno não precisa ser codificado por um "gene" de forma al- guma. É prontamente evidente que um antígeno pode ser gerado, sintetizado ou pode ser derivado de uma amostra biológica. Tal amostra biológica pode incluir, mas não está limitada a uma amostra de tecido, uma amostra de tumor, uma célula ou um fluido biológico.

O termo "epítopo" inclui qualquer determinante de proteína, determi- nante de lipídio ou de carboidrato capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Determinantes epitópicos geralmente consistem em agrupa- mentos de superfície ativa de moléculas, tal como aminoácidos, lipídios ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm características estruturais tridimensionais espe- cíficas, bem como características de carga específicas. Diz-se que um anticorpo liga especificamente um antígeno quando a constante de dissociação de equilíbrio (KD) está na faixa de 10-6 – 10-12M.

Anticorpos 3B9, 9C11, 3H7, 2B7 e 10F2 representam modalidades exemplares de anticorpos que reconhecem especificamente CD20. Esses anticorpos, fragmentos dos mesmos e suas regiões determinantes de complementaridade, tam- bém são descritos em US 2009/0035322, onde são referidos como 3B9-10, 9C11-14, 3H7-6, 2B7-7 e 10F2-13, respectivamente. Conforme descrito neste documento, es- ses anticorpos, fragmentos dos mesmos e suas regiões determinantes complementa- res, são úteis na geração de construtos de receptor de antígeno quimérico (CAR) anti- CD20 e na engenharia e no uso de células CAR-T para tratar tumores hematológicos que expressam CD20.

Domínios de ligação 21587N, 16747P, 16711P e 16716P representam modalidades exemplares de domínios de ligação que reconhecem especificamente BCMA. Esses anticorpos, fragmentos dos mesmos e suas regiões determinantes de complementaridade, também são descritos em US 16/516.028, depositado em 18 de julho de 2019, cujo conteúdo é incorporado por referência na totalidade e para todos os fins e em particular para os domínios de ligação, anticorpos, fragmentos de anti- corpos, regiões determinantes de complementaridade, polipeptídeos contendo as re- feridas regiões determinantes de complementaridade, ácidos nucleicos codificando para as referidas regiões determinantes de complementaridade e especificidades de epítopo e ensaios para determinar especificidade de epítopo nos mesmos. Em alguns casos, 21587N, 16747P, 16711P e 16716P são referidos como H2aM21587N, H1H16747P, H1H16711P, H1H16716P, respectivamente. Conforme descrito neste documento, esses anticorpos, fragmentos dos mesmos e suas regiões determinantes complementares, são úteis na geração de construtos de receptor de antígeno quimé- rico (CAR) anti-BCMA e na engenharia e no uso de células CAR-T para tratar tumores hematológicos que expressam BCMA.

O termo "receptores de antígenos quiméricos (CARs)," como aqui utili- zado, pode se referir a receptores de células T artificiais, T-bodies, imunorreceptores de cadeia simples, receptores de células T quiméricos ou imunorreceptores quiméri- cos, por exemplo, e abranger receptores engenheirados que enxertam uma especifi- cidade artificial em uma célula efetora imune particular. CARs podem ser empregados para transmitir a especificidade de um anticorpo monoclonal a uma célula T, desse modo permitindo que um grande número de células T específicas seja gerado, por exemplo, para uso em terapia de célula adotiva. Em modalidades específicas, CARs dirigem especificidade da célula para um antígeno associado a tumor, por exemplo.

Em algumas modalidades, CARs compreendem um domínio de ativação intracelular (permitindo que a célula T ative mediante engate da fração de direcionamento com a célula alvo, tal como uma célula de tumor alvo), um domínio transmembrana e um domínio extracelular que pode variar em comprimento e compreende uma região de ligação de antígeno de tumor, por exemplo, associada a doença ou distúrbio. Em as- pectos particulares, CARs compreendem fusões de fragmentos variáveis de cadeia simples (scFv) derivados de anticorpos monoclonais, fundidos a CD3-zeta um domínio transmembrana e endodomínio. A especificidade de outros desenhos de CAR pode ser derivada de ligandos de receptores (por exemplo, peptídeos) ou de receptores de reconhecimento de padrão, tal como as Dectins. Em certos casos, o espaçamento do domínio de reconhecimento de antígeno pode ser modificado para reduzir morte de célula induzida por ativação. Em certos casos, CARs compreendem domínios para sinalização coestimulatória adicional, tal como CD3ζ, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP 10/12 e/ou OX40, ICOS, TLRs (por exemplo, TLR2), etc. Em alguns casos, moléculas podem ser coexpressas com o CAR, incluindo moléculas coestimulatórias, genes re- pórter para imageamento (por exemplo, para tomografia por emissão de pósitrons), produtos de gene que ablacionam condicionalmente as células T mediante adição de uma pró-droga, receptores homing, quimiocinas, receptores de quimiocinas, citocinas e receptores de citocinas. Além disso, um especialista na técnica entenderá que um domínio coestimulatório não precisa ser codificado apenas por uma sequência de nu- cleotídeo de comprimento total de um gene. É prontamente evidente que a presente invenção inclui, mas não está limitada, ao uso de sequências de nucleotídeos parciais de mais de um gene e que essas sequências de nucleotídeos são arranjadas em vá- rias combinações para elicitar a resposta imune desejada.

O termo "efeito antitumor", como aqui utilizado, se refere a um efeito biológico que pode ser manifestado por uma diminuição em volume de tumor, uma diminuição no número de células de tumor, uma diminuição no número de metástases, um aumento na expectativa de vida, ou melhora de vários sintomas fisiológicos asso- ciados à condição cancerosa. Um "efeito antitumor" também pode ser manifestado pela capacidade dos peptídeos, polinucleotídeos, células e anticorpos da invenção na prevenção da ocorrência de tumor em primeiro lugar.

O termo "autoantígeno" significa, de acordo com a presente invenção, qualquer autoantígeno que seja erroneamente reconhecido pelo sistema imune como sendo estranho. Autoantígenos compreendem, mas não estão limitados a, proteínas celulares, fosfoproteínas, proteínas de superfície celular, lipídios celulares, ácidos nu- cleicos, glicoproteínas, incluindo receptores de superfície de célula.

Conforme usado neste documento, o termo "autólogo" se refere a qualquer material derivado de um indivíduo que mais tarde será reintroduzido no mesmo indivíduo.

Conforme usado neste documento, o termo "alogênico" se refere a ma- terial derivado de um animal que é posteriormente introduzido em um animal diferente da mesma espécie. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere à quantidade de uma composição que elicitará uma resposta biológica ou médica de um tecido, sis- tema ou sujeito que está sendo procurada pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" inclui aquela quantidade de uma composição que, quando administrada, é suficiente para prevenir desenvolvi- mento de, ou aliviar até certo ponto, um ou mais dos sinais ou sintomas do distúrbio ou da doença (por exemplo, câncer hematológico) sendo tratada. A quantidade tera- peuticamente eficaz variará dependendo da composição, da doença e de sua severi- dade e da idade, do peso, etc., do sujeito a ser tratado.

Para "tratar" uma doença como o termo é usado neste documento, sig- nifica reduzir a frequência ou severidade de pelo menos um sinal ou sintoma de uma doença ou um distúrbio experimentado por um sujeito. A administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) e sequencial em qualquer ordem.

O termo "farmaceuticamente aceitável", como aqui utilizado, se refere a um material incluindo, mas não se limitando, a um sal, transportador ou diluente, que não anula a atividade biológica ou as propriedades do composto e é relativamente não tóxica, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de maneira deletéria com qualquer dos compo- nentes da composição na qual ele está contido.

"Codificação" se refere à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, tal como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir como modelos para síntese de outros polímeros e macromolé- culas em processos biológicos tendo ou uma sequência definida de nucleotídeos (isto é, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as proprieda- des biológicas resultantes dos mesmos. Assim, um gene codifica uma proteína se transcrição e tradução do mRNA correspondente a esse gene produzir a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a fita codificadora, cuja sequência de nucleotídeos é idêntica à sequência de mRNA e é geralmente fornecida em listagens de sequências, quanto a fita não codificadora, usada como o modelo para transcrição de um gene ou cDNA, podem ser referidas como codificando a proteína ou outro pro- duto desse gene ou cDNA.

“Isolado” significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não é "isolado", mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcialmente ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é "isolado". Um ácido nu- cleico ou uma proteína isolada pode existir em forma substancialmente purificada ou pode existir em um ambiente não nativo, tal como, por exemplo, uma célula hospe- deira. A menos que especificado de outra forma, uma "sequência de nucleotí- deo codificando uma sequência de aminoácido" inclui todas as sequências de nucle- otídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácido. Sequências de nucleotídeos que codificam proteínas e RNA podem incluir íntrons.

Os termos "paciente", "sujeito", "indivíduo" e semelhantes são usados intercambiavelmente neste documento e se referem a qualquer animal, suscetível aos métodos descritos neste documento. Em certas modalidades não limitativas, o paci- ente, sujeito ou indivíduo é um humano.

Pelo termo "liga especificamente", como aqui utilizado com respeito a um anticorpo, entende-se um anticorpo que reconhece um antígeno específico, mas não reconhece ou liga substancialmente a outras moléculas em uma amostra. Por exemplo, um anticorpo que liga especificamente a um antígeno de uma espécie tam- bém pode ligar a esse antígeno de uma ou mais espécies. Porém, essa reatividade de espécies cruzadas não altera por si só a classificação de um anticorpo como es- pecífico. Em outro exemplo, um anticorpo que liga especificamente a um antígeno também pode ligar a diferentes formas alélicas do antígeno. No entanto, essa reativi- dade cruzada por si só não altera a classificação de um anticorpo como específico.

Em alguns casos, os termos "ligando especificamente" ou "ligando especificamente" podem ser usados em referência à interação de um anticorpo, uma proteína ou um peptídeo com uma segunda espécie química, para significar que a interação é depen- dente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigê- nico ou epítopo) na espécie química; por exemplo, um anticorpo reconhece e liga a uma estrutura de proteína específica em vez de às proteínas em geral. Se um anti- corpo é específico para o epítopo "A", a presença de uma molécula contendo epítopo A (ou livre, A não marcado), em uma reação contendo "A" marcado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo. Em algumas modalidades, ligação específica pode ser caracterizada por uma constante de dissociação de equilíbrio de pelo menos cerca de 1x10-8 M ou me- nos(por exemplo, uma KD menor indica uma ligação mais estreita). Os métodos para determinar se duas moléculas ligam especificamente são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância de plásmon de superfície e semelhantes. Além disso, anticorpos multiespecíficos que ligam a um primeiro antí- geno e um ou mais antígenos adicionais ou um anticorpo biespecífico que liga a duas regiões diferentes de um antígeno são, no entanto, considerados anticorpos que "li- gam especificamente", como aqui utilizado.

Cânceres hematológicos são cânceres se originando no sangue ou na medula óssea. Exemplos de cânceres hematológicos (ou hematogênicos) incluem leu- cemias, incluindo leucemias agudas (tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielogênica aguda e mieloblástica, promielocítica, mielo- monocítica, monocítica e eritroleucemia), leucemias crônicas (tal como leucemia mi- elocítica (granulocítica) crônica, leucemia mielógena crônica e leucemia linfocítica crô- nica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin (formas in- dolentes e de alto grau), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, do- ença de cadeia pesada, síndrome de mielodisplasia, leucemia de célula pilosa e mi- elodisplasia. Em uma modalidade preferida, o câncer hematológico expressa, ou su- perexpressa, CD20. Em uma modalidade preferida, o câncer hematológico expressa, ou superexpressa, antígeno de maturação de célula B (BCMA), também conhecido como membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 17 (TNFRSF17).

"Cassete de expressão" se refere a um ácido nucleico compreendendo sequências de controle de expressão operativamente ligadas a um ácido nucleico co- dificando um transcrito ou polipeptídeo a ser expresso. Uma cassete de expressão compreende elementos de cis-ação suficientes para expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Cassetes de expressão podem ser um componente de um vetor, tal como um cosmídeo, um plasmídeo (por exemplo, nu ou contido em um lipossoma) ou um vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociado).

Um cassete de expressão pode estar em uma célula hospedeira, tal como uma célula T γδ.

Faixas: em toda esta divulgação, vários aspectos da invenção podem ser apresentados em um formato de faixa. Deve ser entendido que a descrição em formato de faixa é meramente para conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Consequente- mente, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo divulgado especi- ficamente todas as possíveis subfaixas, bem como valores numéricos individuais nessa faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa, tal como de 1 a 6, deve ser con- siderada como tendo divulgado especificamente subfaixas tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 e 6. Isto se aplica independentemente da amplitude da faixa.

Construtos de Receptor de Antígeno Quimérico: Aspectos da invenção incluem ácidos nucleicos codificando CARs e construtos e vetores contendo tais ácidos nucleicos. Em alguns casos, o ácido nu- cleico é um, por exemplo, componente heterólogo de um cassete de expressão. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é, por exemplo, um componente heterólogo de um vetor retroviral. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é, por exemplo, um componente heterólogo de uma célula T αβ ou  e, de preferência, uma célula T .

Em algumas modalidades, o ácido nucleico é, por exemplo, um componente heteró- logo de uma célula γ+ T e/ou uma célula T δ+. Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico é, por exemplo, um componente heterólogo de célula α- T e/ou uma célula β- T.

São descritos aqui ácidos nucleicos codificando um domínio de ligação CAR que liga especificamente a um antígeno associado a tumor (TAA) expresso em uma superfície de uma célula de tumor hematológica; TAAs exemplares incluem CD19, CD20 e BCMA. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é um domínio de ligação CD19, tal como um domínio de ligação CD19 descrito na Patente US

9.540.445, cujo conteúdo é incorporado por referência na totalidade e para todos os fins e em particular para os domínios de ligação, anticorpos, fragmentos de anticorpos, regiões determinantes de complementaridade, polipeptídeos contendo as referidas re- giões determinantes de complementaridade, ácidos nucleicos codificando para as referidas regiões determinantes de complementaridade e especificidades de epítopo e ensaios para determinar especificidade de epítopo descritos na mesma. Em algu- mas modalidades, o domínio de ligação é um domínio de ligação CD20, tal como um domínio de ligação CD20 descrito no Pedido de Patente US 2009/0035322, cujo con- teúdo é incorporado por referência na totalidade e para todos os fins e em particular para os domínios de ligação, anticorpos, fragmentos de anticorpos, regiões determi- nantes de complementaridade, polipeptídeos contendo as referidas regiões determi- nantes de complementaridade, ácidos nucleicos codificando para as referidas regiões determinantes de complementaridade e especificidades de epítopo e ensaios para determinar especificidade de epítopo descritos no mesmo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é um domínio de ligação BCMA, tal como um domínio de ligação BCMA descrito em WO 2018/133877, ou um domínio de ligação BCMA descrito em US 16/516.028, depositado em 18 de julho de 2019, o conteúdo de cada um dos quais é incorporado por referência na totalidade e para todos os fins e em particular para os domínios de ligação, anticorpos, fragmentos de anticorpos, regiões determinantes de complementaridade, polipeptídeos contendo as referidas regiões determinantes de complementaridade, ácidos nucleicos codificando para as referidas regiões determi- nantes de complementaridade e especificidades de epítopo e ensaios para determinar especificidade de epítopo descritos nos mesmos. Tipicamente, a região codificando o domínio de ligação é 5' de uma região de ligante (por exemplo, uma região codificando um domínio de dobradiça CD8α).

Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga ao antígeno con- forme expresso em um polipeptídeo funcional de comprimento total na superfície de uma célula. Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga ao antígeno conforme apresentado em um complexo MHC:antígeno. Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga ao antígeno de uma maneira restrita a HLA. Domínios de ligação exi- bindo especificidade para complexos MHC:antígeno são descritos, por exemplo, em

WO/2016/199140 e WO/2016/199141, o conteúdo de cada um dos quais é incorpo- rado por referência na totalidade e para todos os fins e em particular para os domínios de ligação, anticorpos, fragmentos de anticorpos, regiões determinantes de comple- mentaridade, polipeptídeos contendo as referidas regiões determinantes de comple- mentaridade, ácidos nucleicos codificando para as referidas regiões determinantes de complementaridade e especificidades de epítopo e ensaios para determinar especifi- cidade de epítopo descritos nos mesmos.

Domínios de ligação CD20 exemplares incluem, mas não estão limita- dos a, domínios de ligação que ligam seletivamente a um epítopo dentro de CD20 ligado por, ou que compete por ligação com, 3B9, 3H7, 2B7, 9C11 ou 10F2; ou 3B9, 3H7, 2B7 ou 9C11; ou 3H7. Adicionalmente ou alternativamente, o domínio de ligação CD20 pode compreender as regiões determinantes de complementaridade de um an- ticorpo anti-CD20 selecionado do grupo que consiste em 3B9, 3H7, 2B7, 9C11 e 10F2; selecionado do grupo que consiste em 3B9, 3H7, 2B7 e 9C11; ou compreende as regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo anti-CD20 selecionado do grupo que consiste em 3H7. A presente divulgação também contempla domínios de ligação CD20, CD19 e BCMA que competem por ligação com uma sequência for- necida nos mesmos. Pode-se determinar se um domínio de ligação CD20 liga ao mesmo epí- topo que, ou compete por ligação com, um anticorpo de referência ou domínio de ligação usando métodos conhecidos. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste liga ao mesmo epítopo que um domínio de ligação de referência, pode-se permitir que o domínio de ligação de referência seja deixado ligar a CD20 em condi- ções de saturação. Em seguida, a capacidade de um domínio de ligação de teste para ligar à molécula CD20 pode ser avaliada. Se o domínio de ligação de teste é capaz de ligar a CD20 após ligação de saturação com o domínio de ligação de referência, pode-se concluir que o domínio de ligação de teste liga a um epítopo diferente do domínio de ligação de referência. Por outro lado, se o domínio de ligação de teste não for capaz de ligar a CD20 em seguida a ligação de saturação com o domínio de ligação de referência, então, o domínio de ligação de teste pode ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo domínio de ligação de referência.

Para determinar se um domínio de ligação compete por ligação com um domínio de ligação de referência, a metodologia de ligação acima descrita é realizada em duas orientações: Em uma primeira orientação, o domínio de ligação de referência é deixado ligar CD20 em condições de saturação seguido por avaliação de ligação do domínio de ligação de teste à molécula CD20. Em uma segunda orientação, o domínio de ligação de teste é deixado ligar a uma molécula CD20 em condições de saturação, seguido de avaliação de ligação do domínio de ligação de referência à molécula CD20.

Se, em ambas as orientações, apenas o primeiro domínio de ligação (saturação) é capaz de ligar à molécula CD20, então, conclui-se que o domínio de ligação de teste e o domínio de ligação de referência competem por ligação a CD20. Como será apre- ciado por uma pessoa versada na técnica, um domínio de ligação que compete por ligação com um domínio de ligação de referência pode não necessariamente ligar ao epítopo idêntico como o domínio de ligação de referência, mas pode bloquear esteri- camente a ligação do domínio de ligação de referência ligando um epítopo sobreposto ou adjacente. Os métodos descritos acima para determinar competição e ligação de epítopo com um domínio de ligação anti-CD20 podem da mesma forma ser aplicados a domínios de ligação anti-CD19 e domínios de ligação anti-BCMA.

Dois domínios de ligação ligam ao mesmo epítopo ou epítopo sobre- posto se cada um inibir competitivamente (bloquear) a ligação do outro ao antígeno.

Isto é, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um domínio de ligação inibe ligação do outro em pelo menos 50%, por exemplo, 75%, 90% ou mesmo 99%, conforme medido em um ensaio de ligação competitiva (ver, por exemplo, Junghans et al., Can- cer Res. 1990 50:1495-1502). Alternativamente, dois domínios de ligação têm o mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam ligação de um domínio de ligação reduzirem ou eliminarem ligação do outro. Dois domínios de ligação têm epítopos sobrepostos se algumas mu- tações de aminoácidos que reduzem ou eliminam ligação de um domínio de ligação reduzirem ou eliminarem ligação do outro. Experimentação de rotina adicional (por exemplo, mutação de peptídeo e análises de ligação) pode, então, ser realizada para confirmar se a ausência obser- vada de ligação do domínio de ligação de teste é, de fato, devida à ligação ao mesmo epítopo que o domínio de ligação de referência ou se bloqueio estérico (ou outro fe- nômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Experimentos deste tipo po- dem ser realizados utilizando ELISA, RIA, ressonância de plásmon de superfície, ci- tometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação quantitativo ou qualitativo dispo- nível na técnica.

A presente divulgação fornece anticorpos e CARs com "identidade subs- tancial" ou "similaridade substancial" para as sequências fornecidas neste documento nas regiões CDR ou framework. O termo "identidade substancial" ou "substancial- mente idêntico", quando se referindo a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo, indica que, quando alinhado de forma otimizada com outro ácido nucleico (ou a fita de complementaridade do outro ácido nucleico), há identidade de sequência de nucleotí- deo em %, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou 100% das bases de nucleotídeos, conforme medido por qualquer algoritmo bem conhecido de identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou GAP, conforme discutido abaixo. Uma molécula de ácido nucleico com identidade substancial para uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em certos casos, codificar um polipep- tídeo tendo a mesma ou substancialmente semelhante sequência de aminoácido que o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.

Conforme aplicado a polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou "substancialmente semilar" significa que duas sequências de peptídeos, quando alinhadas de forma otimizada, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de gap padrão, compartilham pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou 100% de identidade de sequência. Em alguns aspectos, posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativas. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em ge- ral, uma substituição de aminoácido conservativa não mudará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a percen- tagem ou o grau de semilaridade podem ser ajustados para cima para corrigir a natu- reza conservativa da substituição. Meios para realizar este ajuste são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol.

24: 307-331, que está aqui incorporado por referência. Exemplos de grupos de ami- noácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais de hidroxila alifática: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais acídicas: aspartato e glutamato e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e me- tionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservativos preferidos são: valina- leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-as- partato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer mudança tendo um valor positivo na matriz de probabilidade log PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45, aqui incorporado por refe- rência. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer mudança tendo um valor não negativo na matriz de probabilidade log PAM250.

Identidade e/ou similaridade de sequência para polipeptídeos é tipica- mente medida usando software de análise de sequência. Software de análise de pro- teína combina sequências semelhantes usando medidas de semilaridade atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de ami- noácidos conservativas. Por exemplo, software GCG contém programas, tal como GAP e BESTFIT que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar ho- mologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tal como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organis- mos ou entre uma proteína tipo selvagem e uma muteína da mesma. Ver, por exem- plo, GCG Versão 6.1. Sequências de polipeptídeo também podem ser comparadas usando FASTA com parâmetros padrão ou recomendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e per- centagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson (2000) supra). Sequências também po- dem ser comparadas usando o algoritmo de pesquisa de homologia Smith-Waterman usando uma pesquisa de gap affine com uma penalidade de abertura de gap de 12 e uma penalidade de extensão de gap de 2, matriz BLOSUM de 62. Outro algoritmo preferido quando comparando uma sequência divulgada aqui com uma base de dados contendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros pa- drão. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e (1997) Nu- cleic Acids Res. 25:3389-3402, cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

São fornecidos aqui CARs anti-CD20, anti-BCMA ou anti-CD19 compre- endendo variantes de qualquer das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas). Por exemplo, a presente divulgação inclui CARs anti- CD20 tendo sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 20 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos, ou 1 substituição de aminoácido em relação a qualquer das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR (por exemplo, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3) divulgadas neste documento. Por exemplo, um CAR anti- CD20 pode compreender 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituição de amonioácidos (por exemplo, substituições de aminoácidos con- servativas) em relação a qualquer das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR (por exemplo, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3) aqui divul- gadas.

Da mesma forma, a presente divulgação inclui CARs anti-BCMA tendo sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 20 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos ou 1 substituição de aminoácido em relação a qualquer das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR (por exemplo, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou

LCDR3) divulgadas neste documento. Por exemplo, um CAR anti-BCMA pode com- preender 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituição de amonioácidos (por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas) em rela- ção a qualquer das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR (por exemplo, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3) aqui divulgadas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação anti-CD20 tendo uma região determinante de complementaridade 3 de ca- deia pesada (HCDR3) e uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3), em que HCDR3 e LCDR3 são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO:345 (AKDPSYGSGSYHSYYGMDV) and 353 (QQRFNWPLT); 201 (VKDFHYGSGSNYGMDV) e 209 (QQSNDWPLT); e 249 (TKDGSYGHFYSGLDV) e 257 (QQRYYWPLT).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação anti-CD20 tendo uma sequência de região variável de cadeia pesada (HCVR) e uma sequência de região variável de cadeia leve (LCVR), em que as se- quências HCVR e LCVR são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 339 (EEQLVESGGDLVQPGRSLRLSCAASGFTFHDYTMH

WVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAED TALYYCAKDPSYGSGSYHSYYGMDVWGQGTTVTVSS) e 347 (EIVLTQSPATLSLSPGE

RATLSCWASQSISRYLVWYQQKCGQAPRLLIYEASKRATGIPVRFSGSGSGTDFTL TISSLESEDFAVYYCQQRFNWPLTFGGGTKVEIK); 195 (EVQLAESGGDLVQSGRSLRLSCAAS

GITFHDYAMHWVRQPPGKGLEWVSGISWNSDYIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYL QMNSLRPDDTALYYCVKDFHYGSGSNYGMDVWGQGTTVTVSP) e 203 (EIVMTQSPATL

SMSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQKVGQAPRLLISGASTRATGIPARFSGSG

SGTEFTLTINSLQSEDFAVYYCQQSNDWPLTFGQGTRLEIK); e 243 (EVQLVESGGGLVQPGR

SLRLSCAASGFTFYDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSDTIGYADSVKGRFTIS RDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDGSYGHFYSGLDVWGQGTTVTVSS) e 251 (EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYVASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPDDFAVYYCQQRYYWPLTFGGGTKVEIK).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação anti-CD20 tendo uma região determinante de complementaridade de ca- deia pesada 3 (HCDR3) e um domínio de CDR3 de cadeia leve (LCDR3), em que o domínio de HCDR3 compreende uma sequência de aminoácido da fórmula X1—X2— X3—X4—X5—X6—X7—X8—X9—X10—X11—X12—X13—X14—X15—X16— X17—X18—X19, em que X1=A, V ou T; X2═K; X3=D; X4═P, F ou G; X5═S ou H; X6═Y; X7=G; X8═S ou H; X9=G ou F; X10═S ou Y; X11═Y, N ou S; X12═Y, G ou H; X13=G, L ou S; X14═Y, M ou D; X15═Y, D ou V; X16 =G, V ou ausente; X17 = M ou ausente; X18 = D ou ausente; X19═V ou ausente (SEQ ID NO: 369); e o domínio de LCDR3 compreende uma sequência de aminoácido da fórmula X1—X2—X3—X4— X5—X6—X7—X8—X9, em que X1=Q; X2=Q; X3═R ou S; X4═N, Y ou F; X5═N, D, ou Y; X6═W; X7═P; X8=L; X9=T (SEQ ID NO: 370).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação anti-CD20 tendo uma sequência de região variável de cadeia pesada (HCVR) e uma sequência de região variável de cadeia leve (LCVR), em que as se- quências HCVR e LCVR são SEQ ID NO: 99 (EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFYDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISW

NSGYIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDNSYGKFYYGL DVWGQGTTVTVSS) e 107 (EIVMTQSPATLSVSPGERTTLSCRASQSVSSNLAWYLQKPGQAPR

LLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFILTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPITFGQGTR LEIK).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação anti-CD20 que liga ao mesmo epítopo que, compete com ou é um domínio de ligação anti-CD20 tendo regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) e regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR), em que as sequências HCDR e LCDR são as sequências HCDR de SEQ ID NO: 99 e as sequências LCDR de SEQ ID NO: 107, respectivamente.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domí- nio de ligação anti-CD20 que liga ao mesmo epítopo que, compete com ou é um do- mínio de ligação anti-CD20 tendo uma HCDR1 que é ou compreende SEQ ID NO: 101 (GFTFYDYA), uma HCDR2 que é ou compreende SEQ ID NO: 103 (ISWNSGYI) e/ou uma HCDR3 que é ou compreende SEQ ID NO: 105 (AKDNSYGKFYYGLDV). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação anti- CD20 que liga ao mesmo epítopo que, compete com, ou é um domínio de ligação anti- CD20 tendo uma LCDR1 que é ou compreende SEQ ID NO: 109 (QSVSSN), uma LCDR2 que é ou compreende SEQ ID NO: 111 (GAS) e/ou uma LCDR3 que é ou compreende SEQ ID NO: 113 (QQYNNWPIT). Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico isolado codifica um domínio de ligação anti-CD20 que liga ao mesmo epítopo que, compete com ou é um domínio de ligação anti-CD20 tendo uma HCDR1 que é ou compreende SEQ ID NO: 101, uma HCDR2 que é ou compreende SEQ ID NO: 103, uma HCDR3 que é ou compreende SEQ ID NO: 105, uma LCDR1 que é ou compreende SEQ ID NO: 109, uma LCDR2 que é ou compreende SEQ ID NO: 111 e uma LCDR3 que é ou compreende SEQ ID NO: 113. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação anti-CD20 tendo uma HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 101, uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 103, uma HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 105, uma LCDR1 compreendendo SEQ ID

NO: 109, uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 111 e uma LCDR3 compreen- dendo SEQ ID NO: 113.

Domínios de ligação BCMA exemplares incluem, mas não estão limita- dos a, domínios de ligação que ligam seletivamente a um epítopo dentro de BCMA ligado por, ou que compete por ligação com um domínio de ligação de BCMA descrito em WO 2018/133877, ou um domínio de ligação BCMA descrito em US 16/516.028, depositado em 18 de julho de 2019. Adicionalmente ou alternativamente, o domínio de ligação BCMA pode compreender as regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo anti-BCMA selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti- BCMA ou receptor de antígeno quimérico descrito em WO 2018/133877 e um anti- corpo anti-BCMA ou receptor de antígeno quimérico descrito em US 16/516.028, de- positado em 18 de julho de 2019.

Domínios de ligação BMCA exemplares incluem, mas não estão limita- dos a, domínios de ligação que ligam seletivamente a um epítopo dentro de BCMA ligado por, ou que compete por ligação com, anti-BCMA-CAR 16716P, anti-BCMA- CAR 16747P e/ou anti-BCMA -CAR 21587N. Adicionalmente ou alternativamente, o domínio de ligação BCMA pode compreender as regiões determinantes de comple- mentaridade de um anti-BCMA CAR selecionado do grupo que consiste em anti- BCMA-CAR 16716P, anti-BCMA-CAR 16747P e anti-BCMA-CAR 21587N.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domí- nio de ligação anti-BCMA tendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (HCDR3) de cadeia pesada e uma CDR3 (LCDR3) de cadeia leve, em que HCDR3 e LCDR3 são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO : 21 (RAGDNWNWFDP) e SEQ ID NO: 22 (QQAKSVPFT); SEQ ID NO: 23 (EGGNYGMDV) e SEQ ID NO: 24 (QQANSFPPT); e SEQ ID NO: 25 (FAEYCGGNICYYYGMDV) e SEQ ID NO: 26 (QQCGGSPWT).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação anti-BCMA tendo uma sequência de região variável de cadeia pe- sada (HCVR) e uma sequência de região variável de cadeia leve (LCVR), em que as sequências HCVR e LCVR são selecionadas do grupo que consiste em HCVR de domínio de ligação 16716P SEQ ID NO: 27 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYVMS

WVRQAPGKGLEWVSAIIGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCAKRAGDNWNWFDPWGQGTLVTV) e LCVR de domínio de ligação 16716P SEQ ID NO: 28 (DIQMTQSPSSVSASLGDRVTITCRASQGISSWLAWYQRKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGADFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSVPFTFGPGTKVDIK); HCVR de domínio de ligação 16747P SEQ ID NO: 29 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCQVQLVESGGGLV

KPGGSLRLSCAASGFTFSDYYISWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSSIKYADSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGNYGMDVWGQGTTVTV) e LCVR de domínio de ligação 16747P SEQ ID NO: 30 (DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGINNW

LVWYQQKPGKAPKLLIYAATSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QANSFPPTFGQGTKLEIK); e HCVR de domínio de ligação 21587N SEQ ID NO: 31 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINYYYWN

WIRQPPGKGLEWIGYISYSGNTNYNPSLKSRVTISVATSRNQFSLTLSSVTAADTAV YYCARFAEYCGGNICYYYGMDVWGQGTTVTV) e LCVR de domínio de ligação 21587N SEQ ID NO: 32 (EIVLTQSPGTLSLSPGERATFSCRASQSVGSSFLAWYQQKPGQAPRRLMYGASNR ATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQCGGSPWTFGQGTKVEIK).

São fornecidos aqui CARs anti-BCMA compreendendo variantes de qualquer das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas). Por exemplo, a presente divulgação inclui CARs anti-BCMA tendo se- quências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 20 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos, ou 1 substituição de aminoácido em relação a qualquer das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR (por exemplo, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3) divulgadas neste documento. Por exemplo, um CAR anti-BCMA pode com- preender 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituição de amonioácidos (por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas) em rela- ção a qualquer das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR (por exemplo, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3) aqui divulgadas.

Domínios de ligação exemplares aqui descritos compreendem tipica- mente, na ordem do terminal amino ao carbóxi, uma região de cadeia pesada seguida por uma região de cadeia leve (VH-VL). Quando uma certa ordem de região VH e VL no domínio de ligação é explicitamente ou implicitamente descrita, a presente divul- gação também é entendida para descrever a modalidade alternativa na qual a ordem de regiões VH e VL é invertida, por exemplo, em um scFV ou um CAR compreendendo um domínio de ligação scFv. Assim, a descrição de uma ordem VH-VL também des- creve a ordem VL-VH alternativa, por exemplo, em um scFV ou um CAR compreen- dendo um domínio de ligação de scFv. Além disso, a descrição de uma ordem VL-VH também descreve a ordem VH-VL alternativa, por exemplo, em um scFV ou um CAR compreendendo um domínio de ligação de scFv.

Geralmente, ácidos nucleicos codificando CAR aqui descritos incluem uma porção de ligante extracelular que codifica um ligante de peptídeo que liga o do- mínio de ligação a um domínio transmembrana. Porções de ligante exemplares in- cluem, sem limitação, uma porção de ligante que codifica o domínio de dobradiça

CD8α, por exemplo, SEQ ID NO:1 (PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY) ou SEQ ID NO:2 (TTTPAPRP PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY). Tipica- mente, a região codificando o ligante peptídico (por exemplo, domínio de dobradiça CD8α) é 3' da região codificando o domínio de ligação e 5' de uma região codificando um domínio transmembrana. Os ácidos nucleicos codificando CAR aqui descritos incluem um domí- nio transmembrana. O domínio transmembrana pode ligar um domínio de ligação a antígeno extracelular, por exemplo, e dobradiça, a um ou mais componentes de sina- lização intracelular. Por exemplo, o domínio transmembrana pode ligar um domínio de ligação a antígeno, por exemplo, e dobradiça, a um domínio de sinalização de CD3ζ e, opcionalmente, com um ou dois endodomínios de coestimulação. Domínios trans- membranar exemplares incluem, sem limitação, um domínio transmembrana CD8α, por exemplo, SEQ ID NO: 3 (IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC). Tipicamente, a região codificando o domínio transmembrana (por exemplo, domínio transmembrana CD8α) está a 3' da região codificando o ligante peptídico (por exemplo, domínio de dobradiça CD8α) e 5' de uma região codificando um ou mais domínios citoplasmáticos.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica uma região citoplasmática contendo um ou mais domínios citoplasmáticos. A região codificando a região citoplasmática está tipicamente 3' da região codificando o domínio transmem- brana. Os domínios citoplasmáticos são tipicamente domínios de sinalização que for- necem um sinal de ativação para proliferação de célula T γδ, atividade citotóxica e/ou expressão de citocina pró-inflamatória (por exemplo, TNF-α ou IFNγ). Um domínio citoplasmático exemplar é um domínio de sinalização CD3ζ. Em algumas modalida- des, o domínio de sinalização CD3ζ é ou compreende SEQ ID NO: 4 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGR

REEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERR

RGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR). Em algumas modalidades, o domí- nio de sinalização CD3ζ é ou compreende a SEQ ID NO: 5 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDV

LDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR). Em algumas modalidades, a região citoplas- mática contém múltiplos (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) domínios de sinalização, tal como múltiplos (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) domínios de sinalização CD3ζ, por exem- plo, cada selecionado independentemente de SEQ ID NO: 4 e 5. Em algumas moda- lidades, a região citoplasmática contém múltiplos (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) domí- nios de sinalização não CD3ζ e um domínio de sinalização CD3ζ. Em algumas moda- lidades, a região citoplasmática contém um domínio de sinalização não CD3ζ e múlti- plos (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) domínios de sinalização CD3ζ.

A região citoplasmática pode conter um ou mais endodomínios de co- estimulação. Uma região codificando um ou mais endodomínios de coestimulação pode estar a 5' ou 3' de uma região codificando um domínio de sinalização. Em algu- mas modalidades, a região codificando um ou mais endodomínios de coestimulação está a 5' da região codificando um domínio de sinalização. Em algumas modalidades, uma região codificando um ou mais endodomínios de coestimulação está a 5' de um domínio de sinalização e uma região adicional codificando um ou mais endodomínios de coestimulação está a 3' do domínio de sinalização. Endodomínios de coestimula- ção exemplares incluem, sem limitação, CD28; CD137 (4-1BB); CD278 (ICOS); CD27; CD134 (OX40); Dap10; Dap12; DNAm-1; 2B4; um domínio SLAM; e endodomínios de coestimulação TLR2 e combinações dos mesmos.

Em algumas modalidades, o construto codifica pelo menos um endodo- mínio de coestimulação 4-1BB e, opcionalmente, um segundo endodomínio de coes- timulação selecionado de um endodomínio de coestimulação 4-1BB, 2B4, ICOS, CD28 e CD27. Em algumas modalidades, o construto codifica pelo menos dois endodomínios de coestimulação 4-1BB ou dois endodomínios de coestimulação 4- 1BB em combinação com um, dois, três ou quatro ou mais endodomínios de coesti- mulação selecionados de um 4-1BB, ICOS, CD28 e CD27. Em algumas modalidades, o endodomínio de coestimulação 4-1BB compreende SEQ ID NO: 6 (KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCEL). Em algumas modalidades, o construto codifica um endodomínio de co- estimulação CD27 e, opcionalmente, um segundo endodomínio de coestimulação se- lecionado de um endodomínio de coestimulação 4-1BB, ICOS, CD28 e CD27. Em algumas modalidades, o construto codifica um endodomínio de coestimulação de CD27 e um endodomínio de coestimulação 4-1BB. Em algumas modalidades, o cons- truto codifica dois endodomínios de coestimulação CD27. Em algumas modalidades, o endodomínio de coestimulação CD27 compreende SEQ ID NO: 7 (QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQED YRKPEPACSP).

Em algumas modalidades, o construto codifica um sinal de secreção, por exemplo, SEQ ID NO: 33 (MALPVTALLLPLALLLHAARP) operavelmente ligado para facilitar secreção de um polipeptídeo C-terminal, tal como uma citocina que su- porta a ativação, citotoxicidade e/ou persistência de uma célula T (por exemplo, célula CAR-T). Em algumas modalidades, o construto codifica um sinal de secreção, por exemplo, SEQ ID NO: 33 operavelmente ligado para facilitar secreção de uma citocina de cadeia gama comum, tal como IL-15 ou um fragmento ativo da mesma, por exem- plo, SEQ ID NO: 34 (NWVNVISDLKKIED

LIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSL SSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS). Citocinas de cadeia gama comuns exemplares incluem IL-2 e IL-15. Em algumas modalidades, a citocina de cadeia gama comum é selecionada de IL-2, IL-7 e IL-15. Em algumas modalidades, a citocina de cadeia gama comum é IL-15. Sequências de IL-15, incluindo sequências de ácido nucleico códon otimizadas codificando sIL15 são divulgadas aqui e em WO

2007/037780.

Em algumas modalidades, o construto codifica uma ou mais regiões ligantes multicistrônicas, por exemplo, entre um domínio de sinalização e/ou endodo- mínio de coestimulação e um sinal de secreção operavelmente ligado para facilitar secreção de uma citocina. Uma região ligante multicistrônica é uma região de sequên- cia polipeptídica ou sequência de RNA que facilita a produção de múltiplos polipeptí- deos discretos de um único produto de transcrição. Em algumas modalidades, a re- gião ligante multicistrônica codifica uma sequência de clivagem. Sequências de cliva- gem adequadas incluem sequências de autoclivagem, tal como uma sequência de clivagem P2A, F2A, E2A ou T2A e/ou sequências que são clivadas por uma protease endógena, tal como furina.

Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é uma sequência de clivagem P2A. Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é uma sequên- cia de clivagem de furina. Em algumas modalidades, as sequências de clivagem são uma sequência de clivagem P2A e uma de furina. Em algumas modalidades, a se- quência de clivagem é a sequência de clivagem P2A de SEQ ID NO: 43 (SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP). Em algumas modalidades, a sequência de cli- vagem é uma sequência de clivagem de furina de SEQ ID NO: 44 (RAKR). Em algu- mas modalidades, a sequência de clivagem é uma sequência de clivagem P2A+furina de SEQ ID NO: 45 (RAKRSGSGATNFSLLKQAG DVEENPGP).

Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é ou compreende uma sequência de clivagem P2A de SEQ ID NO: 52 (ATNFSLLKQAGDVEENPGP).

Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é ou compreende uma sequência de clivagem F2A de SEQ ID NO: 53 (VKQTLNNFDLLKLAGDVESNPGP). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é ou compreende uma sequência de clivagem E2A de SEQ ID NO: 54 (QCTNYALLKLAGDVESNPGP). Em algumas modalidades, a sequência de clivagem é ou compreende uma sequência de clivagem T2A de SEQ ID

NO: 55 (EGRSLLTCGDVEENPGP). Em certos aspectos, múltiplas sequências de au- toclivagem podem ser codificadas no carbóxi terminal para um domínio de sinalização e/ou coestimulatório e amino-terminal para uma citocina secretada codificada (por exemplo, citocina de cadeia gama comum, tal como IL-15), de preferência em que as múltiplas sequências de autoclivagem são independentemente selecionadas do grupo consistindo em uma sequência de clivagem P2A, uma sequência de clivagem T2A, uma sequência de clivagem E2A e uma sequência de clivagem F2A. Em certos as- pectos, uma ou mais sequências de autoclivagem e uma ou mais sequências clivadas por uma protease endógena são codificadas em um construto aqui descrito. Em certas modalidades, um sítio de reconhecimento de protease endógena é codificado amino terminal para uma sequência de autoclivagem.

Em algumas modalidades, a região de ligante multicistrônica codifica um sítio de entrada de ribossomo interno. Um sítio de entrada de ribossomo interno exemplar é codificado por SEQ ID NO: 56 (CTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTAT

ATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCT GGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGA ATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGA AGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGG CGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGG CGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAAT GGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCC CATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAG TCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTT TGAAAAACACGATGATA).

Outro sítio de entrada de ribossomo interno exemplar é codificado por SEQ ID NO: 60

(AGCAGGTTTCCCCAACTGACACAAAACGTGCAACTTGAAACTCCGCCTGGTCTT TCCAGGTCTAGAGGGGTAACACTTTGTACTGCGTTTGGCTCCACGCTCGATCCA CTGGCGAGTGTTAGTAACAGCACTGTTGCTTCGTAGCGGAGCATGACGGCCGT GGGAACTCCTCCTTGGTAACAAGGACCCACGGGGCCAAAAGCCACGCCCACAC GGGCCCGTCATGTGTGCAACCCCAGCACGGCGACTTTACTGCGAAACCCACTT TAAAGTGACATTGAAACTGGTACCCACACACTGGTGACAGGCTAAGGATGCCCT TCAGGTACCCCGAGGTAACACGCGACACTCGGGATCTGAGAAGGGGACTGGG GCTTCTATAAAAGCGCTCGGTTTAAAAAGCTTCTATGCCTGAATAGGTGACCGG AGGTCGGCACCTTTCCTTTGCAATTACTGACCAC).

Outros sítios de entrada de ribossomo internos adequados incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em Nucleic Acids Res. 2010 Jan;38(Da- tabase issue):D131-6. doi: 10.1093/nar/gkp981. Epub 2009, 16 de novembro, aqueles descritos em iresite.org, aqueles descritos em WO 2018/215787, a sequência descrita em Nº de acessão GenBank KP019382.1, e o elemento IRES divulgado no No. de acessão GenBank LT727339.1. Regiões ligantes multicistrônicas adicionais, incluindo autoclivagem de clivagem e elementos IRES, são divulgadas em US 2018/0360992 e US 8.865.467.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO:8 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEIVMTQSPATLSVSPGERTTLSCRASQSVSSNLAWY

LQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFILTISSLQSEDFAVYYCQQYNN WPITFGQGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASG FTFYDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGYIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTALYYCAKDNSYGKFYYGLDVWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTI ASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCQRR KYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPRVKFSRSADAP AYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQK

DKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR), um poli- peptídeo 3H7 – CD8 – CD27z compreendendo os seguintes domínios em ordem: um domínio de ligação 3H7, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um en- dodomínio de coestimulação CD27 e um domínio de sinalização CD3ζ.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 9 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAW

YQQKPGQAPRLLIYGTSTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYN NWPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVAS GFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSVISWNSDSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLY LQMHSLRAEDTALYYCAKDNHYGSGSYYYYQYGMDVWGQGTTVTVSSTTTPAPR PPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVI TLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA

PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQ KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR), um po- lipeptídeo 3B9-CD8-BBz compreendendo os seguintes domínios em ordem: um do- mínio de ligação 3B9, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um endodo- mínio de coestimulação 4-1BB e um domínio de sinalização CD3ζ. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 10 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEIVMTQSPATLSVSPGERTTLSCRASQSVSSNLAWY

LQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFILTISSLQSEDFAVYYCQQYNN WPITFGQGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASG FTFYDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGYIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTALYYCAKDNSYGKFYYGLDVWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTI ASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRG RKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQG

QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAE AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR), um polipeptídeo 3H7-CD8-BBz compreendendo os seguintes domínios em ordem: um domínio de li- gação 3H7, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um endodomínio de coestimulação 4-1BB e um domínio de sinalização CD3ζ. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 11 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEIVLTQSPATLSLSPGERAALSCRASQSVSNYLAWY

QQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN WPLTFGGGTKVEIRGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAAS GFTFRDYTMHWVRQGPGKGLEWVSGISWNSDYIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRVEDTALYYCAKLSGTYRDYFYGVDVWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPA PTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCK RGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQ

QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDK MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR), um polipep- tídeo 2B7-CD8-BBz compreendendo os seguintes domínios em ordem: um domínio de ligação 2B7, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um endodomínio de coestimulação 4-1BB e um domínio de sinalização CD3ζ.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 12 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEIVVTQSPATLSLSPGERATLSCRTSQTTTSYLAWY

RQKPGQAPRLLIYDASNRAAGIPARFSGSGSGTDFTLTINSLEPEDFAVYYCQLRTN WITFGQGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGQVQLVESGGDSVKPGGSLRLSCAASGF TFSDSYMTWIRQAPGKGLEWVSFISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNVKKSLYLQMN RLRAEDTAVYYCAREEPGNYVYYGMDVWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIAS QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRK KLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQN

QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR), um polipeptídeo 9C11-CD8-BBz compreendendo os seguintes domínios em ordem: um domínio de li- gação 9C11, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um endodomínio de coestimulação 4-1BB e um domínio de sinalização CD3ζ. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 20 (M S V P T Q V L G L L L L W L T D A R C E I V M T Q S P A T L S V S P G

ERTTLSCRASQSVSSNLAWYLQKPGQAPRLLIYGASTRAT GIPARFSGSGSGTEFILTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPIT FGQGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPG RSLRLSCAASGFTFYDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWN SGYIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALY YCAKDNSYGKFYYGLDVWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPA PTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLA GTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNEL NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNEL

QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY D A L H M Q A L P P R), um polipeptídeo 3H7-CD3z compreendendo os seguintes domínios em ordem: um domínio de ligação 3H7, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana e um domínio de sinalização de CD3ζ.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo 3H7-CD8-27z compreende a sequência de SEQ ID NO:13 (ATGTCCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACG

CCAGATGCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAG GGGAAAGAACCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTA GCCTGGTACCTTCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGC ATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGA CAGAGTTCATTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTA CTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGGCTGG AGATTAAAGGTGGAGGTGGATCTGGAGGAGGAGGATCCGGTGGAGGAGGTGA AGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGA GACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTTATGATTATGCCATGCACTGGGT CCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATA GTGGTTACATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAG ACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACA CGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATAACAGCTATGGAAAGTTCTACTACGGTTT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCA GCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCC TGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGG GGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGT GGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCAACGACGCAAGTAC CGCTCCAATAAAGGAGAGTCACCAGTAGAACCCGCCGAACCTTGTCACTATTCA TGTCCACGCGAAGAGGAGGGTTCAACGATCCCTATTCAGGAAGATTACAGAAAG CCGGAACCTGCTTGTAGCCCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGACGCCCC TGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGC GGGAGGAATACGACGTGCTGGACAAGCGCAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGG CGGCAAGCCCCAGAGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTG CAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGC GGCGACGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCAC CAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCCCGTTAG).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo 3H7-CD8-BBz compreende a sequência de SEQ ID NO:14 (ATGTCCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACG

CCAGATGCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAG GGGAAAGAACCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTA GCCTGGTACCTTCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGC ATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGA CAGAGTTCATTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTA CTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGGCTGG AGATTAAAGGTGGAGGTGGATCTGGAGGAGGAGGATCCGGTGGAGGAGGTGA AGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGA GACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTTATGATTATGCCATGCACTGGGT CCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATA GTGGTTACATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAG ACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACA CGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATAACAGCTATGGAAAGTTCTACTACGGTTT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCA GCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCC TGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGG GGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGT GGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAG AAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAG AGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAA CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCC AGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAG GAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCA CGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo 3B9-CD8-BBz compreende a sequência de SEQ ID NO:15 (ATGAGCGTTCCAACCCAAGTTCTGGGACTGCTTCTGCTCTGGTTGACTGACGC

TAGGTGCGAAATAGTAATGACCCAATCCCCAGCCACTCTCTCCGTTAGCCCAGG TGAAAGAGCCACTCTTAGTTGCAGGGCTAGTCAATCCGTATCTAGCAACCTGGC CTGGTACCAGCAAAAGCCCGGACAAGCGCCGCGGTTGTTGATCTATGGGACGA GCACACGAGCTACGGGTATTCCGGCCAGGTTCTCAGGGTCTGGCTCCGGAACC GAATTTACATTGACGATCAGTAGTCTGCAATCAGAGGATTTCGCCGTTTACTATT GCCAACAGTACAATAATTGGCCGCTCACATTCGGGGGAGGAACCAAGGTCGAG ATTAAGGGAGGTGGGGGTAGTGGGGGCGGGGGGTCAGGAGGTGGAGGAGAG GTACAGTTGGTAGAAAGCGGCGGGGGGTTGGTTCAACCTGGACGGAGTCTGAG ATTGTCTTGCGTGGCTTCCGGCTTTACTTTCAATGATTACGCCATGCACTGGGTA CGCCAGGCGCCTGGAAAGGGTCTGGAGTGGGTTTCCGTGATATCCTGGAATAG TGATAGTATAGGCTATGCCGATAGTGTAAAAGGAAGGTTTACAATCTCTAGGGAT AACGCTAAGAACAGCCTGTACCTTCAAATGCATAGTCTCCGGGCTGAGGACACA GCCTTGTACTATTGTGCTAAGGACAATCATTATGGAAGCGGGTCATATTATTACT ATCAATATGGGATGGATGTGTGGGGTCAGGGAACGACCGTTACGGTATCCTCAA CCACCACCCCTGCACCAAGGCCCCCGACTCCCGCGCCCACCATCGCGTCACAG CCTCTTAGCCTGCGACCGGAAGCATGCAGACCAGCTGCCGGGGGGGCCGTGC ATACGAGAGGTTTGGACTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCC GGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGG GGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAA CTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGA GGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCA GCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGT ACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCC GCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATA AGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGG CAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCT ACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo 2B7-CD8-BBz compreende a sequência de SEQ ID NO:16 (ATGTCCGTACCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACG

CCAGATGCGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAG GGGAAAGAGCCGCCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAACTACTTA GCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGC ATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGA CAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTA CTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGG AGATCAGAGGTGGAGGTGGATCTGGAGGAGGAGGATCCGGTGGAGGAGGTGA AGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTG CGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTCGAGATTATACCATGCACTGG GTCCGGCAAGGTCCAGGGAAGGGCCTGGAATGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAA TAGTGATTACATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAG AGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGTTGAGGA CACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAGCTCAGTGGGACCTACAGGGACTACTTCTA CGGAGTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAACCACCA CCCCTGCACCAAGGCCCCCGACTCCCGCGCCCACCATCGCGTCACAGCCTCTT AGCCTGCGACCGGAAGCATGCAGACCAGCTGCCGGGGGGGCCGTGCATACGA GAGGTTTGGACTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACT TGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGA AAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTC AAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGT GAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGG GCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGAT GTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGA GAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATG GCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGG

GGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGAC GCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo 9C11-CD8-BBz compreende a sequência de SEQ ID NO:17 (ATGTCCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACG

CCAGATGCGAAATTGTGGTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAG GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGACCAGTCAGACTACTACCAGCTACTTA GCCTGGTACCGACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGC ATCCAACAGGGCCGCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGA CAGACTTCACTCTCACCATCAACAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTA CTGTCAGCTGCGTACCAACTGGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGA TTAAAGGTGGAGGTGGATCTGGAGGAGGAGGATCCGGTGGAGGAGGTCAGGT GCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTCGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTCCTACATGACTTGGATC CGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATTCATTAGTAGTAGTGG AAGTACCATATATTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCAGGGA CAACGTCAAGAAGTCATTGTATCTGCAGATGAACAGACTGAGAGCCGAGGACAC GGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAAGAACCAGGAAACTACGTCTATTACGGTAT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAACCACCACCCCTG CACCAAGGCCCCCGACTCCCGCGCCCACCATCGCGTCACAGCCTCTTAGCCTG CGACCGGAAGCATGCAGACCAGCTGCCGGGGGGGCCGTGCATACGAGAGGTT TGGACTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGG GTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAA CTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGG AAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGA ACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGG ACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAA GAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGG CCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGA TGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCA CATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência otimizada por códon codificando uma região de dobradiça CD8α. Sequên- cias de ácido nucleico de região de dobradiça CD8α otimizada por códon incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 18 (ACCACCACCCCTGCACCAAGGCCCCCGACTCCCGCGCCCACCATCGCGTCA

CAGCCTCTTAGCCTGCGACCGGAAGCATGCAGACCAGCTGCCGGGGGGGCCG TGCATACGAGAGGTTTGGACTTCGCCTGCGAT). Em algumas modalidades, a re- gião de dobradiça CD8α é codificada pela seguinte sequência de SEQ ID NO:19 (ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGC

AGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAG TGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domí- nio de ligação 3B9 e compreende a seguinte sequência codificando um domínio de dobradiça CD8α SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação 2B7 e compreende a seguinte sequência codificando um domínio de dobradiça CD8α SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação 9C11 e compreende a seguinte se- quência codificando um domínio de dobradiça CD8α SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um domínio de ligação 3H7 e compre- ende a seguinte sequência codificando um domínio de dobradiça CD8α SEQ ID NO:19.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 35 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYVMS

WVRQAPGKGLEWVSAIIGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCAKRAGDNWNWFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGDIQMTQSPS SVSASLGDRVTITCRASQGISSWLAWYQRKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGS GSGADFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSVPFTFGPGTKVDIKTTTPAPRPPTPAPTIA SQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQ

NQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR), um polipeptídeo anti-BCMA-CAR compreendendo os seguintes domínios em ordem: um domínio de ligação 16716P, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um endodomínio de coestimulação 4-1BB e um domínio de sinalização CD3ζ. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 36 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYIS

WIRQAPGKGLEWVSYISSSGSSIKYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCAREGGNYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGDIQMTQSPSSVS ASVGDRVTITCRASQGINNWLVWYQQKPGKAPKLLIYAATSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQP LSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLL YIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLY NELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI

GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR), um polipeptídeo anti- BCMA-CAR compreendendo os seguintes domínios em ordem: um domínio de ligação 16747P, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um endodomínio de co- estimulação 4-1BB e um domínio de sinalização CD3ζ.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 37 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINYYYWN

WIRQPPGKGLEWIGYISYSGNTNYNPSLKSRVTISVATSRNQFSLTLSSVTAADTAV YYCARFAEYCGGNICYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQS PGTLSLSPGERATFSCRASQSVGSSFLAWYQQKPGQAPRRLMYGASNRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQCGGSPWTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPT PAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY CKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPA

YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQK DKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR), um poli- peptídeo anti-BCMA-CAR compreendendo os seguintes domínios em ordem: um do- mínio de ligação 21587N, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um en- dodomínio de coestimulação 4-1BB e um domínio de sinalização CD3ζ. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 38 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYIS

WIRQAPGKGLEWVSYISSSGSSIKYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCAREGGNYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGDIQMTQSPSSVS ASVGDRVTITCRASQGINNWLVWYQQKPGKAPKLLIYAATSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQP LSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLL YIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLY NELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRSGSGATNFSLLK QAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLY

TESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESG CKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS*), um polipeptídeo anti-BCMA-CAR com- preendendo os seguintes domínios em ordem: um domínio de ligação 16747P, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um endodomínio de coestimulação 4- 1BB, um domínio de sinalização de CD3ζ, um domínio de clivagem de furina+P2A, um sinal de secreção e um domínio sIL15.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo anti-BCMA CAR 16716P compreende a sequência de SEQ ID NO: 39 (ATGAGCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGACTGCTGCTGCTGTGGCTGACAGACG

CAAGGTGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGG AGGATCCCTGAGGCTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTAGCTCCTACG TGATGTCCTGGGTGCGCCAGGCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGTCTGC CATCATCGGCTCTGGCGGCAGCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGT TCACCATCTCCAGAGATAACTCTAAGAATACACTGTATCTGCAGATGAACAGCCT GAGGGCAGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAAGAGAGCCGGCGACAAC TGGAATTGGTTTGATCCATGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGG AGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGCGGCGGAGGAGGCGACATCCAGATG ACACAGTCCCCATCCTCTGTGAGCGCCTCCCTGGGCGATAGGGTGACCATCAC ATGTCGCGCCTCTCAGGGCATCAGCTCCTGGCTGGCATGGTACCAGAGGAAGC CAGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCAGCATCTAGCCTGCAGAGCGGA GTGCCTTCCCGGTTCTCTGGAAGCGGATCCGGAGCAGACTTTACCCTGACAATC TCCTCTCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGTCAGCAGGCCAAGTCC GTGCCATTCACCTTTGGCCCCGGCACAAAGGTGGATATCAAGACCACCACCCCT GCACCAAGGCCCCCGACTCCCGCGCCCACCATCGCGTCACAGCCTCTTAGCCT GCGACCGGAAGCATGCAGACCAGCTGCCGGGGGGGCCGTGCATACGAGAGGT TTGGACTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGG GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAA ACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAG GAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACT GAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTG GACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGA AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAG GCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACG ATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTC ACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo anti-BCMA CAR 16747P compreende a sequência de SEQ ID NO: 40 (ATGAGCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGACTGCTGCTGCTGTGGCTGACAGACG

CAAGGTGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGG AGGAAGCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCTGGCTTCACCTTTAGCGACTACT ATATCTCCTGGATCAGGCAGGCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGTCCTAC ATCAGCTCCTCTGGCAGCTCCATCAAGTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTC ACCATCTCCAGAGATAACGCCAAGAATTCTCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTG CGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGAGAGGGCGGCAATTATG GCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCTAGCGGCGGCGG CGGCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGCGGAGGAGGCGACATCCAGATGACACAG AGCCCATCCAGCGTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACATGTCG CGCCTCCCAGGGCATCAACAATTGGCTGGTGTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCA AGGCCCCCAAGCTGCTGATCTATGCAGCCACCTCCCTGCAGTCTGGAGTGCCT AGCCGGTTCTCCGGATCTGGAAGCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCAGCTC CCTGCAGCCAGAGGATTTTGCCACATACTATTGTCAGCAGGCCAACTCCTTCCC CCCTACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCACCACCCCTGCAC CAAGGCCCCCGACTCCCGCGCCCACCATCGCGTCACAGCCTCTTAGCCTGCGA CCGGAAGCATGCAGACCAGCTGCCGGTGGGGCGGTGCATACGAGAGGTTTGG ACTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTC CTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTC CTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAG ATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGA GTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACC AGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACA AGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAA CCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCT ACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGG

CCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACAT GCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo anti-BCMA CAR 21587N compreende a sequência de SEQ ID NO: 41 (ATGAGCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGACTGCTGCTGCTGTGGCTGACAGACG

CAAGGTGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGAAGCCATC CGAGACCCTGTCTCTGACCTGCACAGTGAGCGGCGGCTCCATCAATTACTATTA CTGGAACTGGATCAGGCAGCCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGATCGGCTACA TCAGCTATTCCGGCAACACCAATTACAACCCTTCTCTGAAGAGCAGGGTGACCA TCAGCGTGGCCACATCCCGCAATCAGTTCAGCCTGACACTGAGCTCCGTGACC GCAGCAGACACAGCCGTGTATTACTGCGCAAGGTTTGCAGAGTACTGCGGAGG CAACATCTGTTATTACTATGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACAGTGA CCGTGTCTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAG GAGAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCAGGCACACTGTCTCTGAGCCCTGGAGAG AGGGCCACATTCTCTTGTCGCGCCTCCCAGTCTGTGGGCTCCTCTTTTCTGGCC TGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCACGGAGACTGATGTATGGAGCATC CAATAGGGCAACCGGAATCCCAGACAGATTCAGCGGCTCCGGCTCTGGCACAG ACTTCACCCTGACAATCAGCAGACTGGAGCCAGAGGACTTCGCCGTGTACTATT GCCAGCAGTGTGGAGGATCCCCATGGACCTTTGGCCAGGGAACAAAGGTGGAG ATCAAGACCACCACCCCTGCACCAAGGCCCCCGACTCCCGCGCCCACCATCGC GTCACAGCCTCTTAGCCTGCGACCGGAAGCATGCAGACCAGCTGCCGGGGGG GCCGTGCATACGAGAGGTTTGGACTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCGCC CTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTG CAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCA GTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAA GAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCG CGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGA GAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGG GAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAG AAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG

GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAG GACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo anti-BCMA CAR 16747P+sIL15 compreende a sequência de SEQ ID NO: 42 (ATGAGCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGACTGCTGCTGCTGTGGCTGACAGACG

CAAGGTGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGG AGGAAGCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCTGGCTTCACCTTTAGCGACTACT ATATCTCCTGGATCAGGCAGGCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGTCCTAC ATCAGCTCCTCTGGCAGCTCCATCAAGTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTC ACCATCTCCAGAGATAACGCCAAGAATTCTCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTG CGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGAGAGGGCGGCAATTATG GCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCTAGCGGCGGCGG CGGCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGCGGAGGAGGCGACATCCAGATGACACAG AGCCCATCCAGCGTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACATGTCG CGCCTCCCAGGGCATCAACAATTGGCTGGTGTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCA AGGCCCCCAAGCTGCTGATCTATGCAGCCACCTCCCTGCAGTCTGGAGTGCCT AGCCGGTTCTCCGGATCTGGAAGCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCAGCTC CCTGCAGCCAGAGGATTTTGCCACATACTATTGTCAGCAGGCCAACTCCTTCCC CCCTACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCACCACCCCTGCAC CAAGGCCCCCGACTCCCGCGCCCACCATCGCGTCACAGCCTCTTAGCCTGCGA CCGGAAGCATGCAGACCAGCTGCCGGTGGGGCGGTGCATACGAGAGGTTTGG ACTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTC CTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTC CTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAG ATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGA GTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACC AGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACA AGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAA CCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCT ACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGG CCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACAT GCAGGCCCTGCCCCCTCGCCGCGCGAAGCGATCAGGCAGCGGGGCGACAAAT TTCAGCCTTCTGAAACAAGCAGGCGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCAATGGC CTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCA GGCCGAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCA ATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGC AAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGT CCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAA CAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGA ACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAA TGTTCATCAACACTTCTTGA).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 46 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEIVMTQSPATLSVSPGERTTLSCRASQSVSSNLAWY

LQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFILTISSLQSEDFAVYYCQQYNN WPITFGQGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASG FTFYDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGYIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTALYYCAKDNSYGKFYYGLDVWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTI ASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRG RKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQG QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAE AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQ AGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYT

ESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGC KECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS*), um polipeptídeo anti-CD20-CAR compre- endendo os seguintes domínios em ordem: um domínio de ligação 3H7, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um endodomínio de coestimulação 4-1BB, um domínio de sinalização CD3ζ, um domínio de clivagem P2A (GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP, SEQ ID NO: 47), um sinal de secreção e um do- mínio sIL15.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 48 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEIVMTQSPATLSVSPGERTTLSCRASQSVSSNLAWY

LQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFILTISSLQSEDFAVYYCQQYNN WPITFGQGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASG FTFYDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGYIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTALYYCAKDNSYGKFYYGLDVWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTI ASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRG RKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQG QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAE AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQ AGDVEENPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEAN

WVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIH DTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS*), um polipeptídeo anti-CD20-CAR compreendendo os seguintes domínios em ordem: um domínio de ligação 3H7, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um en- dodomínio de coestimulação 4-1BB, um domínio de sinalização CD3ζ, um domínio de clivagem P2A de SEQ ID NO: 47, um sinal de secreção de SEQ ID NO: 49 (MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAG IHVFILGCFSAGLPKTEA) e um domínio sIL15. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo anti-CD20 CAR + sIL15 compreende a sequência de SEQ ID NO: 50 (ATGTCCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACG

CCAGATGCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAG GGGAAAGAACCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTA GCCTGGTACCTTCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGC ATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGA CAGAGTTCATTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTA CTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGGCTGG AGATTAAAGGTGGAGGTGGATCTGGAGGAGGAGGATCCGGTGGAGGAGGTGA AGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGA GACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTTATGATTATGCCATGCACTGGGT CCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATA GTGGTTACATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAG ACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACA CGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATAACAGCTATGGAAAGTTCTACTACGGTTT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCA GCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCC TGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGG GGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGT GGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAG AAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAG AGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAA CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCC AGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAG GAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCA CGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGTAGCGGGGCTACGAACTTCTCCCTT CTTAAACAAGCGGGAGACGTGGAAGAAAATCCCGGACCTATGGCCTTACCAGT GACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGAACT GGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCAT ATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAG CAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGC AAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCT TCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAA AAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAA CACTTCTTGA).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo anti-CD20 CAR + sIL15 compreende a sequência de SEQ ID NO: 51 (ATGTCCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACG

CCAGATGCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAG GGGAAAGAACCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTA GCCTGGTACCTTCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGC ATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGA CAGAGTTCATTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTA CTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGGCTGG AGATTAAAGGTGGAGGTGGATCTGGAGGAGGAGGATCCGGTGGAGGAGGTGA AGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGA GACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTTATGATTATGCCATGCACTGGGT CCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATA GTGGTTACATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAG ACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACA CGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATAACAGCTATGGAAAGTTCTACTACGGTTT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCA GCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCC TGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGG GGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGT GGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAG AAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAG AGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAA CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCC AGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAG GAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCA CGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGTAGCGGGGCTACGAACTTCTCCCTT CTTAAACAAGCGGGAGACGTGGAAGAAAATCCCGGACCTATGAGAATTTCGAAA CCACATTTGAGAAGTATTTCCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTTCTAAACAGTC ATTTTCTAACTGAAGCTGGCATTCATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGG GCTTCCTAAAACAGAAGCCAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATT GAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGT TCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTT ATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCA TCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAA AGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTA CATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGA).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica SEQ ID NO: 57 (MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEIVMTQSPATLSVSPGERTTLSCRASQSVSSNLAWY

QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAE AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*), um polipeptídeo anti-CD20-CAR compreendendo os seguintes domínios em ordem: um domínio de ligação a 3H7, um domínio de dobradiça CD8α e transmembrana, um endodomínio de coestimulação 4-1BB e um domínio de sinalização CD3ζ; e, via um sítio de entrada de ribossomo interno (por exemplo, codificado por SEQ ID NO: 56) 3' da região codi- ficando SEQ ID NO: 57, os ácidos nucleicos isolados codificam ainda SEQ ID NO: 58 (MALPVTALLLPLALLLHAARPNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHP

SCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEEL EEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS*), uma secreção sinal de SEQ ID NO: 33 e um domí- nio sIL15.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado codificando um po- lipeptídeo anti-CD20 CAR + sIL15 compreende a sequência de SEQ ID NO: 59 (ATGTCCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACG

CCAGATGCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAG GGGAAAGAACCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTA GCCTGGTACCTTCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGC ATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGA CAGAGTTCATTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTA CTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGGCTGG AGATTAAAGGTGGAGGTGGATCTGGAGGAGGAGGATCCGGTGGAGGAGGTGA AGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGA GACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTTATGATTATGCCATGCACTGGGT CCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATA GTGGTTACATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAG ACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACA CGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATAACAGCTATGGAAAGTTCTACTACGGTTT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCA GCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCC TGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGG GGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGT GGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAG AAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAG AGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAA CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCC AGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAG GAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCA CGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAGAGTACTGCGGCCGCTACGTAAATTC CGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATA AGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGC AATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGG TCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGC AGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAG GCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGT GTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTG GATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCT GAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGT GCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGA ACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATATTAATTAAGCCACC GCCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCA CGCCGCCAGGCCGAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGA TCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACC CCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTC ACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTA GCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAAT GTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATAT TGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGA).

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado é um ácido nucleico linear. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado é um ácido nucleico circular.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado é um vetor, tal como um vetor de plasmídeo, um vetor adenoviral, um vetor viral adenoassociado, um vetor viral, um vetor retroviral ou um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, o ácido nucleico iso- lado, ou, por exemplo, uma porção contígua do mesmo contendo o domínio de ligação domínio transmembrana e um ou mais endodomínios de sinalização e/ou coestimula- ção é integrado no genoma de uma célula hospedeira, tal como um hospedeiro de célula T γδ. Em uma modalidade exemplar, o ácido nucleico isolado é vetor retroviral.

Células T γδ: Aspectos da invenção incluem células T γδ que expressam funcional- mente um ácido nucleico isolado aqui descrito e, desse modo, expressam um CAR na superfície da célula T γδ. Aspectos da invenção podem, adicionalmente ou alternativamente, in- cluir células T γδ com atividade citotóxica in vitro ou in vivo contra uma célula tumoral hematológica que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA). Em alguns casos, a atividade citotóxica é atividade inata. Em alguns casos, a citotoxicidade é pelo menos em parte significativamente (> cerca de 25%), ou inteiramente, devido à presença de um construto CAR tendo um domínio de ligação que liga especificamente ao TAA expresso na superfície da célula de tumor hemato- lógica. Em alguns casos, as células T γδ exibem atividade de matança de célula de tumor hematológica da referida célula T γδ é maior do que um nível inato de atividade in vitro e/ou in vivo de atividade de matança de célula de tumor hematológica em uma célula T γδ de controle. Em alguns casos, a célula T γδ de controle não compreende um construto CAR. Em alguns casos, a célula T γδ de controle compreende um construto CAR carecendo de um domínio de ligação aqui descrito, uma região de do- bradiça aqui descrita, um domínio transmembrana aqui descrito, um domínio de sina- lização aqui descrito e/ou um endodomínio de coestimulação aqui descrito.

Em alguns casos, a citotoxicidade é pelo menos em parte significativa- mente (> cerca de 25%), ou inteiramente, devida à presença de um construto CAR tendo um domínio de ligação que liga especificamente CD20 ou um epítopo dentro de CD20. Em alguns casos, as células T γδ expressam funcionalmente um CAR especí- fico de CD20 codificado por um ácido nucleico isolado aqui descrito.

Em algumas modalidades, células T γδ aqui descritas podem exibir ci- totoxicidade restrita a HLA (por exemplo, restrita a HLA classe I). Em outras modali- dades, a maioria (> 50%), substancialmente toda (> 90%) ou toda a atividade citotó- xica não é restrita por HLA (por exemplo, HLA classe I restrita). Atividade citotóxica restrita por HLA pode ser avaliada comparando citotoxicidade in vitro contra uma li- nhagem de célula de tumor HLA (por exemplo, HLA classe I) (nula) versus citotoxici- dade in vitro contra uma linhagem de célula de tumor HLA + (por exemplo, HLA classe I+). Em algumas modalidades, a atividade citotóxica restrita pr HLA é pelo menos em parte significativamente (> 25%), ou inteiramente, fornecida pelo uso de um domínio de ligação tipo Receptor de células T. Domínios de ligação tipo receptor de célula T são domínios de ligação que reconhecem especificamente o antígeno quando apre- sentado na superfície de uma célula em complexo com uma molécula de MHC. Do- mínios de ligação tipo Receptor de célula T são descritos adicionalmente, por exem- plo, em WO 2016/199141.

Células T γδ aqui descritas podem exibir atividade de matança de cé- lula de tumor hematológica robusta e/ou persistente. Em alguns casos, a atividade de matança de célula de tumor hematológica pode persistir por pelo menos cerca de 6 dias a 120 dias, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias, desde o primeiro contato com uma célula de tumo hematológica. Em alguns casos, a atividade de matança de célula de tumor hematológica de uma célula T γδ aqui descrita, ou uma progênie da mesma, pode persistir por pelo menos cerca de 6 dias a 120 dias, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias, desde o primeiro contato com uma célula de tumor hematológica, ou da administração da célula T γδ aqui descrita. Esta atividade de matança de célula de tumor hematológica persistente pode ser exibida in vitro, in vivo, ou in vitro e in vivo. Aspectos da invenção podem adicionalmente ou alternativamente, in- cluir células T γδ que proliferam em resposta a contato com células que exibem ex- pressão de superfície de célula, ou superexpressão, do antígeno associado a tumor (TAA). As células que exibem expressão de superfície celular do antígeno associado a tumor (TAA) podem ser células hematológicas normais, tal como células B normais.

As células que exibem expressão de superfície de célula, ou superexpressão, do an- tígeno associado a tumor (TAA) podem ser células de tumor hematológicas. Em al- guns casos, a proliferação é uma atividade inata. Em alguns casos, a proliferação é pelo menos em parte significativamente (> cerca de 20% ou > cerca de 25%), ou in- teiramente, devido à presença de um construto CAR tendo um domínio de ligação que liga especificamente ao TAA expresso na superfície da célula hematológica ou célula de tumor hematológica. Em alguns casos, as células T γδ exibem um nível maior de proliferação in vitro e/ou in vivo em comparação com uma célula T γδ de controle. Em alguns casos, a célula T γδ de controle não compreende um construto CAR. Em al- guns casos, a célula T γδ de controle compreende um construto CAR carecendo de um domínio de ligação aqui descrito, uma região de dobradiça aqui descrita, um do- mínio transmembrana aqui descrito, um domínio de sinalização aqui descrito e/ou um endodomínio de coestimulação aqui descrito.

Em alguns casos, a proliferação é pelo menos em parte significativa- mente (> cerca de 20% ou > cerca de 25%), ou inteiramente, devida à presença de um construto CAR tendo um domínio de ligação que liga especificamente CD20 ou um epítopo dentro de CD20. Em alguns casos, células T γδ exibindo proliferação em resposta a contato com uma célula hematológica ou célula de tumor hematológica que exibe expressão de superfície de célula de CD20 expressam funcionalmente um CAR específico de CD20 codificado por um ácido nucleico isolado aqui descrito.

As células T γδ aqui descritas podem exibir proliferação robusta e /ou persistente em um organismo hospedeiro que compreende a célula hematológica ou célula de tumor hematológica que exibe expressão de superfície de célula, ou supe- rexpressão, do antígeno associado a tumor (TAA). Em alguns casos, a proliferação pode persistir por pelo menos cerca de 6 dias a 120 dias, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias, desde o primeiro contato com uma célula de tumor hematológica ou de uma data de administração da célula T γδ ao organismo hospedeiro. Em alguns casos, a proliferação de uma célula T γδ aqui descrita, ou uma progênie da mesma, no organismo hospedeiro que compreende a célula hematológica ou célula de tumor hematológica que exibe expressão de superfície de célula, ou superexpressão, do antígeno associado a tumor (TAA) pode persistir por pelo menos cerca de 6 dias a 120 dias, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias, do primeiro contato com uma célula hematológica ou célula de tumor hematológica ou da data da primeira adminis- tração da célula T γδ ao organismo hospedeiro. Em alguns casos, a proliferação no organismo hospedeiro é pelo menos em parte significativamente (> cerca de 20% ou > cerca de 25%), ou inteiramente, devida à presença de um construto CAR tendo um domínio de ligação que liga especificamente CD20 ou um epítopo dentro de CD20.

Em alguns casos, células T γδ exibindo proliferação no organismo hospedeiro com- preendendo uma célula hematológica ou célula de tumor hematológica que exibe ex- pressão de superfície de célula de CD20 expressam funcionalmente um CAR especí- fico de CD20 codificado por um ácido nucleico isolado aqui descrito.

Em algumas modalidades, as células T γδ aqui descritas expressam, ou expressam persistentemente, citocinas pró-inflamatórias, tal como fator de necrose tumoral alfa ou interferon gama após contato com a célula hematológica ou célula de tumor hematológica.

Em algumas modalidades, as células T γδ aqui descritas, ou pro-

gênie da mesma, expressam ou expressam persistentemente citocinas pró-inflamató-

rias, tal como fator de necrose tumoral alfa ou interferon gama após contato com a célula hematológica ou célula de tumor hematológica, por exemplo,em um organismo hospedeiro compreendendo a célula hematológica ou célula de tumor hematológica.

Em algumas modalidades, a célula T γδ, ou uma composição farma-

cêutica contendo a célula T γδ, exibe essencialmente nenhuma ou nenhuma resposta enxerto versus hospedeiro quando introduzida em um hospedeiro alogênico.

Em al-

gumas modalidades, a célula T γδ, ou uma composição farmacêutica contendo a cé-

lula T γδ, exibe um nível clinicamente aceitável de resposta de enxerto versus hospe-

deiro quando introduzida em um hospedeiro alogênico.

Em algumas modalidades, um nível clinicamente aceitável é uma quantidade de resposta enxerto versus hospedeiro que não requer cessação de um tratamento de célula T γδ para atingir um tratamento terapeuticamente eficaz.

Em algumas modalidades, um nível clinicamente aceitável de resposta enxerto versus hospedeiro (GvHD) é uma resposta aguda que é menos severa que o Grau C de acordo com uma escala de graduação IBMTR aplicável.

A gravidade de resposta aguda enxerto versus hospedeiro é determinada por uma ava-

liação do grau de envolvimento da pele, do fígado e do trato gastrointestinal.

Os está-

gios de envolvimento de órgãos individuais são combinados para produzir um grau geral, que tem significância prognóstica.

GvHD Grau I(A) é caracterizado como do-

ença suave, GvHD grau II(B) como moderad, grau III(C) como severa e grau IV(D)

com risco de vida.

O sistema de graduação IBMTR define a severidade de GvHD aguda da seguinte forma (Rowlings et al., Br J Haematol 1997; 97:855):

● Grau A - Estágio 1 apenas envolvimento de pele (erupção maculopapular acima de <25 por cento do corpo) sem envolvimento do fígado ou gastrointestinal

● Grau B - Estágioa 2 envolvimento de pele; Estágio 1 a 2 envolvimento de intestino ou fígado ● Grau C - Estágio 3 envolvimento de qualquer sistema de órgão (eritrodermia generalizada; bilirrubina 6,1 a 15,0 mg/dL; diarreia 1.500 a 2.000 mL/dia) ● Grau D - Estágio 4 envolvimento de qualquer sistema de órgão (eritrodermia generalizada com formação bolhosa; bilirrubina >15 mg/dL; diarreia >2.000 mL/dia OU dor OU íleo).

Ver também, Schoemans et al., Bone Marrow Transplantation volume 53, pá- ginas 1401–1415 (2018), por exemplo, nas Tabelas 1 e 2, que divulga critérios para avaliar e graduar GvHD aguda.

Em algumas modalidades, a célula T γδ, ou uma composição farma- cêutica contendo a célula T γδ, exibe resposta enxerto versus hospedeiro reduzida ou substancialmente reduzida quando introduzida em um hospedeiro alogênico em com- paração com uma resposta enxerto versus hospedeiro exibida por células T αβ de controle, ou uma composição farmacêutica de controle compreendendo as células T αβ de controle, administradas a um hospedeiro alogênico. Em alguns casos, a célula T αβ de controle é uma célula T αβ de controle não engenheirada alogênica. Em al- guns casos, a célula T αβ de controle não compreende um CAR ou não compreende o mesmo CAR que uma célula T γδ de referência. As células T γδ aqui descritas podem ser células T γδ δ1, δ2, δ3 ou δ4, ou combinações das mesmas. Em alguns casos, as células T γδ são principalmente (>50%), substancialmente (>90%), essencialmente todas ou inteiramente células T γδ δ2-. Em alguns casos, as células T γδ são principalmente (>50%), substancialmente (>90%), essencialmente todas ou inteiramente células T γδ δ1.

As células T γδ podem ser obtidas de um doador alogênico ou autó- logo. As células T γδ podem ser, parcialmente ou totalmente purificadas, ou não puri- ficadas, e expandidas ex vivo. Métodos e composições para expansão ex vivo in- cluem, sem limitação, aqueles descritos em WO 2017/197347. A expansão pode ser realizada antes ou depois, ou antes e depois, de um construto CAR ser introduzido na(s) célula(s) T γδ.

As células T γδ descritas neste documento podem ser armazenadas, por exemplo, criopreservadas, para uso na transferência de célula adotiva.

Métodos para Inibir ou Matar Células de Tumor Uma ou múltiplas populações de células T γδ não engenheiradas, po- pulações de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas, tendo atividade citotóxica contra uma célula de tumor hematológica, podem ser administradas a um sujeito em qualquer ordem ou simultaneamente. Se simultaneamente, as múltiplas populações de células T γδ, não engenheiradas, populações de células T γδ enge- nheiradas e/ou misturas das mesmas, da invenção podem ser fornecidas em uma forma única unificada, tal como uma injeção intravenosa, ou em múltiplas formas, por exemplo, como múltiplas infusões intravenosas, s.c., injeções ou pílulas. A população de células T γδ não engenheiradas, a população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas da invenção podem ser empacotadas juntas ou separada- mente, em um único pacote ou em uma pluralidade de pacotes. Uma ou todas as populações de células T γδ não engenheiradas, populações de células T γδ engenhei- radas e/ou misturas das mesmas da invenção podem ser dadas em doses múltiplas.

Se não simultânea, a temporização entre as doses múltiplas pode variar até cerca de uma semana, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis me- ses ou cerca de um ano. Em alguns casos, uma população de células T γδ não enge- nheiradas enriquecidas, população de células T γδ enriquecidas e/ou misturas das mesmas da invenção podem proliferar dentro do corpo de um sujeito, in vivo, após a administração a um sujeito. Uma ou mais populações de células T γδ não engenhei- radas, uma ou mais populações de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas, podem ser congeladas para fornecer células para tratamentos múltiplos com a mesma preparação de células. Uma ou mais populações de células T γδ não engenheiradas, uma ou mais populações de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas, da divulgação e composições farmacêuticas compreendendo as mes- mas, podem ser empacotadas como um kit. Um kit pode incluir instruções (por exem- plo, instruções escritas) sobre o uso da população de células T γδ não engenheiradas, da população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas e composi- ções compreendendo as mesmas. Em alguns casos, um método para tratar um câncer hematológico com- preende administrar a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de células T γδ não engenheiradas, uma população de células T γδ enge- nheiradas e/ou misturas das mesmas, em que a administração trata o câncer hema- tológico. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz da popula- ção de células T γδ não engenheiradas, da população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas é administrada por pelo menos cerca de 10 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, δ horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, δ dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses ou 1 ano. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz da população de células T γδ não engenheiradas, da população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas é administrada por pelo menos uma semana. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz da população de células T γδ não engenheira- das, da população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas é admi- nistrada por pelo menos duas semanas.

Uma população de células T γδ não engenheiradas, uma população de células T γδ engenheiradas e/ou misturas das mesmas, aqui descritas, podem ser administradas antes, durante ou após a ocorrência de uma doença ou condição e a temporização de administração de uma composição farmacêutica contendo a popula- ção de células T γδ pode variar. Por exemplo, a população de células T γδ pode ser usada como um profilático e pode ser administrada continuamente a sujeitos com uma propensão a condições ou doenças, a fim de diminuir a probabilidade da ocorrência da doença ou condição. A administração inicial pode ser via qualquer rota prática, tal como por qualquer rota aqui descrita usando qualquer formulação aqui descrita. Em alguns exemplos, a administração de uma população de células T γδ da divulgação é uma administração intravenosa. Uma ou múltiplas dosagens da população de células T γδ podem ser administradas assim que for praticável após o início de um câncer hematológico e por um período de tempo necessário para o tratamento da doença imune, tal como, por exemplo, cerca de 24 horas a cerca de 48 horas, de cerca de 48 horas a cerca de 1 semana, de cerca de 1 semana a cerca de 2 semanas, de cerca de 2 semanas a cerca de 1 mês, de cerca de 1 mês a cerca de 3 meses. Em algumas modalidades, uma ou múltiplas dosagens da população de células T γδ podem ser administradas anos após o início do câncer e antes ou depois de outros tratamentos.

Em algumas modalidades, a população de células T γδ é administrada simultaneamente ou sequencialmente com um ou mais métodos para elevar cito- cina(s) de cadeia gama comum(ns). Como aqui utilizado, "um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum(s): se refere a um método, ou combinação de métodos, que altera o estado fisiológico de um sujeito, de modo que pelo menos um nível de citocina de cadeia gama comum seja elevado no sujeito. Em algumas modalidades, o método eleva o nível de uma ou mais citocinas de cadeia gama co- muns selecionadas do grupo que consiste em IL-2, IL-7 e IL-15, de preferência em que o método eleva o nível de IL-15 no sujeito. Em algumas modalidades, o método compreende linfodepleção. Em algumas modalidades, o método compreende admi- nistrar uma ou mais citocinas de cadeia gama comuns ao sujeito. Em alguns casos, IL-2, IL-7 e/ou IL-15, preferencialmente IL-15, são administradas. Em algumas moda- lidades, o método compreende secreção de citocinas de cadeia gama comuns de uma célula T administrada, por exemplo, célula T γδ. Em alguns casos, IL-2, IL-7 e/ou IL-

15, de preferência IL-15, são secretadas.

Em algumas modalidades, a administração de um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum(ns) compreende linfodepleção antes de introduzir a(s) célula(s) T γδ. Em algumas modalidades, a administração de um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreende administrar simultaneamente com a introdução da(s) célula(s) T γδ ou sequencialmente uma quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum eficaz para elevar proliferação, ati- vidade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T γδ in- troduzida(s), preferencialmente em que o método compreende administrar IL-2 ou um ou mai miméticos da mesma, mais preferencialmente em que o método compreende administrar IL-15 ou um ou mais miméticos da mesma. A quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum(ns) pode ser uma quantidade eficaz para elevar proliferação, atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T γδ introduzida(s) antes e/ou após introdução da(s) célula(s) T γδ. Quantidades exempla- res de IL-15 incluem, sem limitação, entre 0,01 - 10 µg/kg/dose a cada 24 horas para IL-15. Quantidades exemplares de IL-2 incluem, sem limitação, entre cerca de 3x106 e cerca de 22x106 unidades a cada 8 - 48 horas. Por exemplo, o regime de dosagem para IL2 em RCC é de 600.000 Unidades Internacionais/kg (0,037 mg/kg) IV q8h in- fundido durante 15 minutos por um máximo de 14 doses.

Em algumas modalidades, a administração de um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum(ns) compreende linfodepleção antes de administrar a(s) célula(s) T γδ e administração simultaneamente com a introdução de célula(s) T γδ ou sequencialmente uma quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum(ns) eficazes para aumentar a proliferação, atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T γδ introduzidas.

EXEMPLOS Exemplo 1

PBMCs humanas a 1x106/mL foram ativadas em um meio de cultura de célula modificado em anticorpo anti-Vδ1 pré-revestido D1-08 ou D1-35 (ver WO 2017/197347) por 5 dias na presença de IL-2 (100 U/mL) em placas de 24 poços (Costar). No dia 5, culturas de células foram transduzidas com construtos γ-retrovirais codificando receptores de antígenos quiméricos (2B7-5.1, SEQ ID NO:11; 3B9-5.1, SEQ ID NO:9; 3H7-5.1, SEQ ID NO:10; 9C11-5.1, SEQ ID NO:12) na presença de retronectina. No dia 6, células foram devolvidas ao meio de cultura de célula modifi- cado e posteriormente expandidas com alimentação e substituição de IL-2 conforme necessário. Nos dias 17, 18 ou 19, as células foram colhidas e células T αβ restantes foram depletadas usando o kit AutoMACS® (Miltenyi Biotec). A pureza da população de células γδ e a eficiência de transdução foram avaliadas por FACS. Paralelamente, culturas de células não transduzidas foram expandidas da mesma maneira, sem adi- cionar o sobrenadante retroviral. Conforme mostrado na FIG. 3, as células Vδ1 ex- pandidas não transduzidas de múltiplos doadores não são citotóxicas para células B normais de um doador alogênico. Introdução de CAR CD20 em células Vδ1 conferiu citotoxicidade robusta a essas células contra células B normais. A citotoxicidade foi medida como % de células de Anexina V+ por citometria de fluxo em ensaio de 4 h. Exemplo 2 As células Vδ1 foram ativadas, transduzidas e expandidas da mesma maneira como descrito acima. Construto CAR 3H7 SEQ ID NO: 10 foi usado para demonstrar citotoxicidade contra duas linhagens de células CD20+ - Daudi e Raji.

Conforme mostrado na FIG. 4, introdução da citotoxicidade inata potenciada por CAR de células Vδ1 não engenheiradas.

Exemplo 3 As células Vδ1 foram ativadas, transduzidas e expandidas da mesma maneira como descrito acima. Quatro construtos diferentes (SEQ ID NOs:9, 10, 11, 12) foram introduzidos em células Vδ1 durante expansão e testados contra células

Raji-Luc. Citotoxicidade foi determinada por medição de luminescência total após adi- cionar substrato luminescente D-Luciferina (Perkin Elmer) após 18 h de coincubação em razões E/T variadas. Conforme mostrado na FIG. 5, células CAR anti-CD20 com- preendendo um endodomínio de coestimulação 4-1BB aqui descrito exibiram ativi- dade robusta de matança de célula contra células Raji. Exemplo 4 Construtos de CARs foram feitos com vários domínios diferentes e do- mínios de ligação CD20 (3H7-CD3z, SEQ ID NO:20; 3H7-5.1, SEQ ID NO:10; e 3H7- CD27z, SEQ ID NO:8). Construtos CAR foram introduzidos conforme descrito acima e citotoxicidade foi testada contra células Raji-Luc, conforme descrito no exemplo an- terior (citotoxicidade de 18 h em razões E/T variadas). FIG. 6 ilustra atividade robusta de matança de célula contra células Raji com endodomínio(s) de sinalização e/ou co- estimulação diferente.

Exemplo 5 Vários construtos de CAR foram introduzidos em células Vδ1 expandi- das e testados em ensaio de citotoxicidade de longo prazo com re-desafio de célula alvo (Serial Killing) usando instrumento IncuCyte®. Resumidamente, células Raji fo- ram marcadas com reagente NucRed e fluorescência total de células foi registrada ao longo do tempo. Células foram coincubadas na razão E/T de 3 por 72 horas em meio de crescimento sem qualquer adição de citocina. No final de 72 h, culturas foram re- desafiadas com outra dose de células Raji e monitoradas quanto à matança. Este procedimento foi repetido com culturas onde células Raji foram depuradas por 144 h.

FIG. 7 3H7-ICOSz é um construto no qual endodomínio de coestimulação 4-1BB é substituído por um endodomínio ICOS (WLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL (SEQ ID NO: 354)).

Exemplo 6 Células Raji foram implantadas subcutaneamente em camundongos

NSG (Jackson Labs). Quando tumores atingiram cerca de 100 mm3 de tamanho, os animais foram tratados com 5x106 células Vδ1 CD20 CAR+ para comparar eficácia de vários endodomínios de coestimulação ("co-stim" ou "costim") in vivo. Os animais fo- ram dosados concomitantemente com IL-2 (60.000 U/dose) 3 vezes por semana ao longo do estudo. Conforme mostrado na FIG. 8, os construtos testados exibiram efi- cácia robusta in vivo em tratamento de tumores hematológicos em camundongos NSG. Sem desejar ser limitado pela teoria, é hipotetizado que os construtos de CAR otimizados de 3H7-5.1, 3H7-CD3z e 3H7-CD27z exibem controle de tumor in vivo, proliferação, ativação, persistência e/ou citotoxicidade superiores em comparação com construtos de CAR não otimizados.

Exemplo 7 Células Raji foram implantadas subcutaneamente em camundongos NSG (Jackson Labs). Quando os tumores atingiram cerca de 100 mm3, os animais foram tratados com 5x106 células Vδ1 CD20 CAR+ que foram pré-marcadas com Cell- Trace Violet. No Dia 2 e no Dia 6 tumores e vários outros órgãos foram extraídos, digeridos e a suspensão de células resultante analisada para (A) presença de células T γδ e células Raji (FIG. 9) e (B) proliferação de células γδ como evidenciado por diluição de corante CellTrace Violet (FIG. 10). Os animais receberam IL-2 concomi- tante (60.000 U/dose) 3 vezes por semana até o Dia 6. Conforme mostrado na FIG.

9, as células T γδ introduzidas aumentaram de forma robusta no meio intratumoral e facilitaram uma diminuição significativa na razão de células de tumor para células T γδ do dia 2 ao dia 6. Como mostrado na Fig. 10, células T γδ proliferaram robusta- mente e preferencialmente no espaço intratumoral.

Exemplo 8 Camundongos NSG foram inoculados com células Raji-Luc (0,5 ml/ani- mal). No Dia 4, animais foram tratados com 8,7x106 células Vδ1 CAR+ (SEQ ID NO: 10) ou 6,8x105 células T αβ transduzidas com o mesmo construto. Sobrevivência de animais foi monitorada durante o período de 140 dias. Todos os animais receberam 3 doses de IL-2 (60.000/animal) no Dia 0, Dia 1 e Dia 2. FIG. 11. Conforme mostrado na FIG. 11, a administração de células T γδ aqui descritas aumentou a sobrevivência de sujeitos tendo câncer hematológico.

Exemplo 9 Camundongos SRG-15 (Herndler-Brandstetter et al., PNAS, 2017) ex- pressando IL-15 humana foram inoculados com células Raji-Luc (0,5x106/animal). No Dia 4, os animais foram tratados com 20,2x106 de células Vδ1 CAR+ (SEQ ID NO: 10) ou 1,9x106 de células T αβ transduzidas com o mesmo construto. Sobrevivência de animais foi monitorada durante o período de 70 dias. FIG. 12. Conforme mostrado na FIG. 12, as células T γδ introduzidas não eliciaram uma resposta GvHD. Em contraste, células T αβ introduzidas produziram uma resposta GvHD.

Exemplo 10 Camundongos NSG foram inoculados com células Raji (1 x 106) sub- cutaneamente no flanco traseiro direito. Quando volumes de tumor atingiram ~100 mm3 os camundongos foram randomizados e tratados com 5 x 106 células T Vδ1 CAR codificando CD20 CAR ou CD20 CAR e IL-15 solúvel. Animais foram dosados conco- mitantemente com IL-2 (60.000 U/dose, Peprotech, 3x semana) ao longo do estudo.

Quatro animais do grupo CD20 + sIL15 CAR T que não tinham tumor mensurável no Dia 62 foram redesafiados com 1 x 106 células Raji subcutaneamente no flanco oposto (esquerdo). Um grupo de animais de controle também foi incluído para demonstrar cinética de crescimento de tumor. Resultados são ilustrados na FIG. 14 Conforme mostrado na FIG. 14, a administração de células T γδ CAR tendo um construto de ácido nucleico que codifica uma IL-15 solúvel heteróloga produziu um efeito antitumor persistente que durou além de 60 dias (por exemplo, de 60 a 110 dias).

Exemplo 11 PBMCs humanas a 1 x 106/mL em meio de crescimento foram ativadas em uma placa de 24 poços (Costar) pré-revestida com anticorpo anti-Vδ1 D1-08 ou D1-35 por 5 dias na presença de IL-2 (100 U/mL). No dia 5, culturas de células foram transduzidas com construtos γ-retrovirais codificando receptor de antígeno quimérico BCMA (SEQ ID NOs: 35-38) na presença de retronectina. No dia 6, células foram devolvidas ao meio de cultura e posteriormente expandidas com alimentação e subs- tituição de IL-2 conforme necessário. Nos dias 17, 18 ou 19, as células foram colhidas e células T αβ restantes foram depletadas usando o kit AutoMACS® (Miltenyi Biotec).

A pureza da população de células γδ e a eficiência de transdução foram avaliadas por FACS (FIG. 15). Resumidamente, as células T CAR foram coradas incubando as cé- lulas com 1 µg/mL de BCMA biotinilado recombinante solúvel (Acro Biosystems). De- tecção de ligação foi realizada usando estreptavidina-BV421 na diluição sugerida pelo fabricante de 1:500. Paralelamente, culturas de células não transduzidas foram ex- pandidas da mesma maneira, sem adicionar o sobrenadante retroviral. Células expan- didas foram testadas no ensaio de citotoxicidade in vitro em linhagenss de células positivas para BCMA. Conforme mostrado na FIG. 16 e FIG. 17, células Vδ1 expandi- das não transduzidas eliciaram algum grau de citotoxicidade contra mieloma múltiplo e linhagens de células de linfoma de Burkitt que são conhecidas por expressarem BCMA em vários graus. Essa citotoxicidade foi potencializada por introdução de cons- trutos BCMA CAR. Citotoxicidade foi determinada por medição de luminescência total em placas de 96 poços adicionando substrato luminescente D-Luciferina (Perkin El- mer) após 18 h de coincubação em razões E/T indicadas. Uma linhagem de células SCABER negativa para BCMA foi usada como controle.

Exemplo 12 Células de mieloma múltiplo NCI-H929 (1 x 106/animal) foram implan- tadas subcutaneamente em camundongos NSG (Jackson Labs). Quando tumores atingiram cerca de 200 mm3 de tamanho, os animais foram tratados com 5 x 106 cé- lulas Vδ1 BCMA CAR+ para comparar a eficácia dos construtos CAR derivados de scFv 16716P e 16747P in vivo. Os animais foram dosados concomitantemente com IL-2 (13.000 UI/dose, Proleukin®) 3 vezes por semana ao longo do estudo. Resultados são ilustrados na FIG. 18. Conforme mostrado na FIG. 19, células anti-BCMA CAR+ exibiram um controle robusto da carga de tumor in vivo.

* * * O precedente ilustra meramente os princípios da invenção. Será apre- ciado que aqueles versados na técnica serão capazes de conceber várias disposições que, embora não explicitamente descritas ou mostradas aqui, incorporem os princípios da invenção e estejam incluídas dentro de seu espírito e escopo. Além disso, todos os exemplos e a linguagem condicional citados aqui destinam-se principalmente a ajudar o leitor a entender os princípios da invenção e os conceitos contribuídos pelos inventores para promover a técnica, e devem ser interpretados como sendo sem limi- tação a tais exemplos e condições especificamente recitados. Além disso, todas as declarações aqui recitando princípios e aspectos da invenção, bem como exemplos específicos da mesma, se destinam a abranger equivalentes tanto estruturais quanto funcionais dos mesmos. Além disso, pretende-se que tais equivalentes incluam equi- valentes atualmente conhecidos e equivalentes desenvolvidos no futuro, ou seja, quaisquer elementos desenvolvidos que executem a mesma função, independente- mente da estrutura. O escopo da presente invenção, portanto, não se destina a ser limitado aos aspectos exemplares mostrados e descritos aqui. Pelo contrário, o es- copo e o espírito da presente invenção são concretizados pelas reivindicações ane- xas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Sequência de ácido nucleico isolada codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), CARACTERIZADA pelo fato de que o CAR compreende a. um domínio de ligação que liga especificamente a um antígeno associado a tumor (TAA) expresso em uma superfície de uma célula de tumor hematológica; b. um domínio de dobradiça CD8α; c. um domínio transmembrana CD8α; d. uma região de sinalização coestimulatória, opcionalmente em que a região de sinalização coestimuladora é selecionada de uma região de sinalização coestimulatória 4-1BB (CD137) e uma região de sinalização coestimuladora CD27; e e. um domínio de sinalização CD3ζ.

2. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que (a) - (e) estão na ordem 5' para 3'.

3. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação liga especificamente a CD20.

4. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a. o domínio de ligação liga seletivamente a um epítopo dentro de CD20 ligado por, ou compete por ligação com, um anticorpo anti-CD20 selecionado do grupo que consiste em 3B9, 3H7, 2B7 e 9C11, preferencialmente 3H7; e/ou b. o domínio de ligação compreende as regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo anti-CD20 selecionado do grupo que consiste em 3B9, 3H7, 2B7 e 9C11, de preferência 3H7.

5. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação codifica: a. uma sequência de região variável de cadeia pesada (HCVR) e uma sequência de região variável de cadeia leve (LCVR), em que as sequências de HCVR e LCVR são SEQ ID NO:99 e 107, respectivamente; b. uma sequência de região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1, 2 e 3 de SEQ ID NOs: 101, 103 e 105, respectivamente, e uma sequência de região determinante de complementaridade de cadeia leve 1, 2 e 3 de SEQ ID NOs: 109, 111 e 113 respectivamente; c. uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (HCDR3) e uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3), em que HCDR3 e LCDR3 são selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO:345 e 353; 201 e 209; e 249 e 257; d. uma sequência de região variável de cadeia pesada (HCVR) e uma sequência de região variável de cadeia leve (LCVR), em que as sequências de HCVR e LCVR são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 339 e 347; 195 e 203; e 243 e 251; e/ou e. um domínio de região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (HCDR3) e um domínio de CDR3 de cadeia leve (LCDR3), em que o domínio de HCDR3 compreende uma sequência de aminoácido da fórmula X1—X2—X3— X4—X5—X6—X7—X8—X9—X10—X11—X12—X13—X14—X15—X16—X17— X18—X19, em que X1=A, V ou T; X2═K; X3=D; X4═P, F ou G; X5═S ou H; X6═Y; X7=G; X8═S ou H; X9=G ou F; X10═S ou Y; X11═Y, N ou S; X12═Y, G ou H; X13=G, L ou S; X14═Y, M ou D; X15═Y, D ou V; X16 =G, V ou ausente; X17 = M ou ausente; X18 = D ou ausente; X19═V ou ausente (SEQ ID NO: 369); e o domínio de LCDR3 compreende uma sequência de aminoácido da fórmula X1—X2—X3—X4—X5—X6— X7—X8—X9, em que X1=Q; X2=Q; X3═R ou S; X4═N, Y ou F; X5═N, D, ou Y; X6═W; X7═P; X8=L; X9=T (SEQ ID NO: 370).

6. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação liga especificamente a CD19 ou BCMA.

7. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação liga especificamente a BCMA.

8. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que a. o domínio de ligação liga seletivamente a um epítopo dentro de BCMA ligado por, ou compete por ligação com, uma região de ligação anti-BCMA tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27 e 28; SEQ ID NO: 29 e 30; e SEQ ID NO: e 31 e 32; e/ou b. o domínio de ligação compreende as regiões determinantes de complementaridade de uma região de ligação anti-BCMA tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27 e 28; SEQ ID NO: 29 e 30; e SEQ ID NO: e 31 e 32.

9. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o CAR compreende: a. um domínio de dobradiça CD8α compreendendo SEQ ID NO:1 (PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY) or SEQ ID NO:2 (TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY); b. um domínio transmembrana CD8α compreendendo SEQ ID NO:3 (IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC); e/ou c. um domínio de sinalização de CD3ζ compreendendo: (i) SEQ ID NO:4 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRK

NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR); ou (ii) SEQ ID NO:5 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN

PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR).

10. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o CAR compreende: a. uma região de sinalização coestimuladora 4-1BB compreendendo SEQ ID NO:6 (KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL); ou b. uma região de sinalização coestimuladora de CD27 compreendendo SEQ ID NO:7. (QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP), ou em que o ácido nucleico isolado codifica a região de sinalização coestimulatória de 4-1BB compreendendo SEQ ID NO:6 e a região de sinalização coestimuladora de CD27 compreendendo SEQ ID NO:7.

11. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido nucleico ainda codifica: a. uma citocina secretada; ou b. uma interleucina de cadeia gama comum secretada; ou c. uma IL-15 secretada, de preferência em que a IL-15 compreende a sequência de SEQ ID NO:34, mais preferencialmente em que a IL-15 compreende a sequência de SEQ ID NO:34 operavelmente ligada a uma sequência de sinal de secreção de SEQ ID NO:33, ou em que a IL-15 compreende a sequência da SEQ ID NO:34 operavelmente ligada a uma sequência de sinal de secreção de SEQ ID NO: 49; ou d. uma interleucina de cadeia gama comum secretada, de preferência IL- 15, e um terminal amino de região de ligante multicistrônico para a interleucina ou o sinal de secreção de interleucina, de preferência em que a região de ligante multicistrônico compreende uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 43-45,

47 ou 52-55 ou uma combinação dos mesmos, ou codifica um sítio de entrada de ribossomo interno, por exemplo, SEQ ID NO: 56 ou 60.

12. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 9 a 10 ou 11, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação liga especificamente a CD20 e o ácido nucleico codifica SEQ ID NO:8, 9, 10, 11, 12, 20, 46, 48 ou 57 e 58.

13. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido nucleico compreende a sequência de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 50, 51 ou 59.

14. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, 6 a 10 ou 11, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação liga especificamente a BCMA e o ácido nucleico codifica SEQ ID NO: 35, 36, 37 ou 38.

15. Sequência de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido nucleico compreende a sequência de SEQ ID NO: 39, 40, 41 ou 42.

16. Polipeptídeo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um receptor de antígeno quimérico compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por qualquer um dos ácidos nucleicos isolados anteriores das reivindicações 1 a 15.

17. Célula T γδ, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um polipeptídeo da reivindicação 16 ou que compreende um ácido nucleico codificando um construto CAR de qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que a célula T γδ expressa funcionalmente um domínio de ligação do polipeptídeo ou do CAR codificado por ácido nucleico na superfície da célula T γδ.

18. Célula T γδ, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ exibe atividade de matança de célula in vitro e/ou in vivo contra uma célula de tumor hematológica que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA).

19. Célula T γδ, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade de matança de célula de tumor hematológica da referida célula T γδ é maior que um nível inato de atividade de matança de célula de tumor hematológica in vitro e/ou in vivo em uma célula T γδ de controle que não compreende um construto de CAR.

20. Célula T γδ, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ exibe a elevada atividade de matança de célula de tumor hematológica contra células de tumor hematológicas HLA classe I+.

21. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade de matança de célula de tumor hematológica ou elevada atividade de matança de célula de tumor hematológica persiste, por cerca de, por pelo menos, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias após o primeiro contato com a célula de tumor hematológica.

22. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ prolifera em resposta a contato com uma célula de tumor hematológica que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA).

23. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ exibe elevada proliferação em resposta a contato com uma célula de tumor hematológica que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA) em comparação com uma célula T γδ de controle que não expressa funcionalmente o CAR codificado por ácido nucleico na superfície da célula T γδ.

24. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ prolifera em um organismo hospedeiro que compreende a célula de tumor hematológica que exibe expressão de superfície de célula do antígeno associado a tumor (TAA).

25. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, CARACTERIZADA pelo fato de que a proliferação de célula T γδ ou elevada proliferação de célula T γδ persiste, por cerca de, por pelo menos, ou por pelo menos cerca de 6 dias a 180 dias após o primeiro contato a célula de tumor hematológica.

26. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 25, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ expressa citocinas pró-inflamatórias compreendendo fator de necrose tumoral alfa ou interferon gama após contato com a célula de tumor hematológica.

27. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ exibe resposta de enxerto versus hospedeiro reduzida, substancialmente reduzida, essencialmente nenhuma ou nenhuma quando introduzida em um hospedeiro alogênico em comparação com uma resposta de enxerto versus hospedeiro exibida por uma célula T αβ administrada a um hospedeiro alogênico.

28. Célula T γδ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T γδ é uma célula T δ1, uma δ2, uma δ3 ou uma δ4 γδ, de preferência uma célula T δ2-γδ, mais preferencialmente uma célula T δ1 γδ.

29. Pluralidade de células T γδ, CARACTERIZADA pelo fato de que é de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 28.

30. Pluralidade de células T γδ, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADA pelo fato de que a pluralidade compreende pelo menos cerca de 108 células T γδ, de preferência de cerca de 108 células T γδ a cerca de 1011 células T γδ.

31. Pluralidade de células T γδ, de acordo com a reivindicação 29 ou 30,

CARACTERIZADA pelo fato de que a pluralidade compreende uma composição que é pelo menos 60%, 80%, ou de cerca de 60%, ou 80% a cerca de 90%, ou 95% de células T γδ δ1, δ2, δ3, ou δ4, preferencialmente células T γδ δ1 ou δ2, mais preferencialmente células T δ2-, mais preferencialmente células T γδ δ1.

32. Método para fazer a célula T γδ de qualquer uma das reivindicações 17 a 28, ou uma pluralidade de células T γδ, de qualquer uma das reivindicações 29 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende transfectar célula(s) T γδ com um construto compreendendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende transdução retroviral.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende expansão ex vivo da(s) célula(s) T γδ, em que a expansão ex vivo é realizada antes da transfecção e/ou após transfecção da sequência de ácido nucleico isolada.

35. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável e uma célula T γδ de qualquer uma das reivindicações 17 a 28 ou uma pluralidade de células T γδ de qualquer uma das reivindicações 29 a 31.

36. Método para matar uma célula de tumor hematológica, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende contatar a célula de tumor hematológica com uma quantidade eficaz de matança de célula de tumor de uma célula T γδ de qualquer uma das reivindicações 17 a 28; uma pluralidade de células T γδ de qualquer uma das reivindicações 29 a 31; ou uma composição farmacêutica da reivindicação 35.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende introduzir uma quantidade terapeuticamente eficaz da(s) célula(s) T γδ ou da composição farmacêutica em um organismo hospedeiro compreendendo a célula de tumor hematológica.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende introduzir em um organismo hospedeiro compreendendo a célula de tumor hematológica uma quantidade terapeuticamente eficaz da(s) célula(s) T γδ ou da composição farmacêutica e simultaneamente ou sequencialmente administrar um ou mais métodos para elevar a(s) citocina(s) de cadeia gama comum.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração de um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreende administrar simultaneamente com a introdução da(s) célula(s) T γδ ou sequencialmente uma quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum eficaz para elevar proliferação, atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T γδ introduzida(s), preferencialmente em que o método compreende administrar IL-2, mais preferencialmente em que o método compreende administrar IL-15.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que os um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreendem administrar uma quantidade de citocina(s) de cadeia gama comum eficaz para elevar proliferação, atividade citotóxica, persistência ou a combinação das mesmas da(s) célula(s) T γδ introduzida(s) antes e/ou após introdução da(s) célula(s) T γδ.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, CARACTERIZADO pelo fato de que os um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreendem linfodepleção antes de introduzir a(s) célula(s) T γδ.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40,

CARACTERIZADO pelo fato de que os um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum compreendem secreção de uma ou mais citocinas de cadeia gama comum das células T γδ introduzidas.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 42, CARACTERIZADO pelo fato de que o método reduz a carga de tumor in vivo no organismo hospedeiro e/ou aumenta o tempo de sobrevivência médio do organismo hospedeiro em comparação com um organismo controle, em que o organismo controle não é tratado com a(s) célula(s) T γδ ou a composição farmacêutica.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é um método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo.

45. Uso de uma quantidade eficaz de matança de célula de tumor de uma célula T γδ de qualquer uma das reivindicações 17 a 28; uma pluralidade de células T γδ de qualquer uma das reivindicações 29 a 31; ou composição farmacêutica da reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer de célula de tumor hematológico em um sujeito em necessidade do mesmo.

46. Método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a. administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T γδ, em que o câncer compreende células de tumor hematológico que exibem expressão de superfície de célula de CD20; ou b. administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T γδ, em que o câncer compreende células de tumor hematológico que exibem expressão de superfície de célula de BCMA.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende simultaneamente com a administração de células T γδ ou sequencialmente, administrar um ou mais métodos para elevar citocina(s) de cadeia gama comum.

48. Método, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende realizar uma pluralidade de administrações das células T γδ, em que o intervalo entre a pluralidade de administrações é de pelo menos cerca de uma semana, de preferência pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 12 semanas e/ou no máximo uma vez a cada 6 ou 12 meses.

49. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso em qualquer um dos métodos das reivindicações 46 a 48.

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 92/111 Fração Direcionamento Fração Direcionamento de de scFv Dobradiça/TM Dobradiça/TM scFv

Coestim.

Coestim. 1 Coestim. 2 1/19

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 93/111 Sequências de domínios VL e VH de ligantes CD20 recebidos de REGN 2/19

Sequências de domínios VL e VH de ligantes CD20 recebidos de REGN

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 94/111 continuação 3/19

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 95/111 Indução de apoptose em células B normais por células V 1 transduzidas com vários construtos CD20 CAR 4/19

% de citotoxicidade % de citotoxicidade

% de citotoxicidade

% de citotoxicidade Razão Efetor:Alvo Razão Efetor:Alvo Razão Efetor:Alvo Razão Efetor:Alvo

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 96/111 Células T CD20 CAR   Matam Potentemente Linhagens de Células de Linfoma

Linhagem de Célula Daudi Linhagem de Célula Raji

Matança efetiva de linhagem de célula HLA- 5/19

Classe 1 nula (Daudi)

3H7 CD20 CAR com domínio de coestimula- ção 41BB potencia matança inata de células

% de citotoxicidade Raji

Razão Efetor:Alvo

Matança mediada por CAR Matança inata (células não engenheiradas)

Luciferase Alvo (18 h)

Razão Efetor:Alvo % de citotoxicidade

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 98/111 Não transduzido

% de citotoxicidade Razão Efetor:Alvo 7/19

Raji Luciferase Alvo (18 h)

Todos os efetores: Dia 18 Fresco

% de citotoxicidade Razão Efetor:Alvo

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 99/111 Sinal de Alvo Vivo Intensidade Integrada Relativa (média FIFU x Área) Redesafio Raji somente 8/19

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 100/111 9/19

Grupo A: Tumor sozinho Grupo B: V 1, HC16, 5e6 células 3H7-5.1 Grupo C; V 1, HC16, 5e6 células CD3Z Grupo D: V 1, HC16, 5e6 células ICOSz Grupo E: V 1, HC16, 5e6 células CD27z

Volume de Tumor Médio (mm³) +/- SEM Dias Pós-tratamento

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 101/111 Número de células T   por mg de tumor Dia 2 Dia 6 Razão célula de tumor para célula T  

Dia 2 Dia 6 10/19

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 102/111 Célula T   prolifera em resposta a tumor

Dia 2 pós-tratamento Dia 6 pós-tratamento

Sangue 11/19

Baço

Medula óssea Número de Células

Número de Células Fígado

Tumor

Proliferação de célula T Proliferação de célula T

Células Células Dias Pós-tratamento

Tumor sozinho

Porcentagem Sobrevivendo

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 104/111 Mortes no grupo de células αβ CAR T devidas a GvHD Sobrevivência de Camundongo SRG-15 (Tumor Raji)

Células   CAR-T 13/19

Sem GvHD observada em camundongos tratados com células  

Células  β CAR-T

Construto 3H7-5.1 CAR

Porcentagem Sobrevivendo Tumor sozinho

Dias pós-trtamento

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 105/111 Fluxo de Processo de Fabricação de Célula T   e Célula T   CAR Aferese MNC-A do- ador Saudá- vel

Vetor codificando 14/19

Isolamento de mAb anti CAR (opcional) PBMC e Crio   TCR

Descong.

Transdução Expansão Colheita / Formulação Teste de Li- Ativação Depletação beração

< 1 mês

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 106/111 Desafio primário Redesafio com Raji

Não tratado 15/19

Células   CD20 CAR-T Células   CD20 CAR-T + sIL-15

Volume de Tumor Médio (mm³) +/- SEM Dias pós-tratamento Dias pós-redesafio

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 108/111 % de citotoxicidade % de citotoxicidade Razões E:T Razões E:T

% de citotoxicidade % de citotoxicidade Razões E:T

Razões E:T % de citotoxicidade

Razões E:T 17/19

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 109/111 % de citotoxicidade % de citotoxicidade Razões E:T Razões E:T

% de citotoxicidade % de citotoxicidade

Razões E:T Razões E:T 18/19

Petição 870210047800, de 26/05/2021, pág. 110/111 19/19

Volume de Tumor Médio (mm³) +/- SEM

Dias Pós-tratamento

Grupo A: Tumor somente Grupo B: Grupo C: