CN111484554A

CN111484554A - 一种靶向4-1bb的肿瘤抑制性抗体及其应用

Info

Publication number: CN111484554A
Application number: CN202010360846.1A
Authority: CN
Inventors: 张卫红; 谭曙光; 靳文静; 陈瑜
Original assignee: Yingwei Fusai Biology Technology Co ltd
Current assignee: Yingwei Fusai Biology Technology Co ltd
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2040-04-30
Also published as: CN111484554B

Abstract

本发明提供一种靶向4‑1BB的肿瘤抑制性抗体及其应用，该抗体或其片段能够特异性结合4‑1BB分子，结合之后能够对4‑1BB产生交联作用，能够阻断4‑1BB与其配体4‑1BBL的结合，并能够产生T细胞活化及抗肿瘤等生物学效应。

Description

一种靶向4-1BB的肿瘤抑制性抗体及其应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段特异性识别4-1BB(CD137，肿瘤坏死因子受体超家族成员9，tumor necrosis factor receptorsuperfamily member 9(TNFRSF9))，能够作为免疫活化物刺激机体的免疫反应，从而产生抗肿瘤等疾病的作用效果。

背景技术

2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。

一个健康的个体体内的免疫细胞足以消灭体内不断出现的病变细胞，这其中就包括一些可能会发生癌变的细胞。T细胞是机体所有抗肿瘤免疫体系的主力军，而肿瘤往往能够逃逸机体的免疫监视，让T细胞对肿瘤细胞“视而不见”，甚至有时候肿瘤细胞近在眼前，却又对它无能为力，只能“袖手旁观”。

在20世纪80年代早期，Allison及其它研究者确定了在T细胞表面负责识别抗原的αβT细胞受体(TCR)的基因结构。80年代后期，Boone、Rosenberg、Old等人分别研究发现，不同肿瘤病人体内均存在一些肿瘤特异性抗原，能够被T细胞所识别并特异性杀伤肿瘤细胞，使得肿瘤免疫治疗的希望重新燃起，大量研究致力于肿瘤治疗性疫苗的研究和开发。然而，Schwartz等人研究发现，仅有TCR信号并不足以激活抗原特异性T细胞，T细胞的激活还需要其它分子的参与，也就是所谓第二信号“共刺激分子”的协同作用。同时研究发现，只有特定的抗原递呈细胞(APC)才能够表达共刺激分子，而大多数细胞，包括肿瘤细胞，并不能够提供共刺激分子信号。在20世纪90年代早期，Allison等发现了CD28分子，其能够提供T细胞激活所需要的第二信号。之后Linsley等人研究发现表达在APC细胞表面的B7分子是CD28分子的配体，而Allison等通过小鼠模型研究，经过改造后能够表达B7分子的肿瘤细胞能够被小鼠免疫系统迅速清除。因此，肿瘤细胞B7分子表达的缺失可能是机体不能够有效激发T细胞免疫的重要因素。

在20世纪90年代的研究均表明，细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)在体内发挥着与CD28完全相反的功能，如果把CD28这一类分子比作是一部汽车的“油门”，那么CTLA-4这一类分子发挥的是“刹车”的功能。当机体T细胞活化之后，这类分子会“检查”免疫细胞激活程度，在激活的细胞中表达上调并发挥免疫抑制功能，从而使得机体的T细胞不至于过度增殖和活化而损伤正常细胞，因此这类分子又被称为“免疫检查点”分子。癌细胞利用这类分子的免疫抑制机制，逃避机体的免疫系统杀伤。研究表明，利用CTLA-4特异性单克隆抗体来阻断CTLA-4的信号，能够显著提高T细胞活性，并且在多种肿瘤的小鼠模型研究中发现，单克隆抗体阻断CTLA-4后能够大大提高小鼠对肿瘤的抑制能力。除了CTLA-4之外，免疫检查点分子还包括PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、TIGIT等B7超家族和CD28超家族分子。通过特异性单克隆抗体阻断这些“抑制”信号，能够重新释放T细胞的活性，从而使得这些T细胞能够发挥抗肿瘤作用。肿瘤免疫检查点疗法对抗肿瘤策略的贡献在于：一方面，免疫检查点疗法并不直接靶向肿瘤细胞，而是作用于病人的免疫系统，通过解除限制T细胞发挥功能的信号从而释放T细胞活性；另一方面，这种对T细胞的激活并不具有抗原特异性，而是对整个免疫系统的重新激活，因此能够适用于多种不同肿瘤的治疗，可以作为肿瘤的通用疗法。不仅如此，CTLA-4抗体阻断疗法的成功，开创了免疫抑制相关分子阻断在肿瘤治疗中的开发和应用，基于PD-1和PD-L1等为代表的免疫抑制分子开发的阻断性抗体同样取得了重大突破，2014年美国FDA批准了两项PD-1阻断性抗体，nivolumab和pembrolizumab，用于黑色素瘤的临床治疗。

在CTLA-4和PD-1对T细胞负调控机制研究和应用方面做出开创性贡献的美国科学家James Allison和日本科学家Tasuku Honjo共同获得了2018年诺贝尔生理学或医学奖。2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首，自此之后，肿瘤免疫疗法研究不断获得突破性进展，其临床应用也取得了巨大成功，是当前肿瘤治疗研究领域最具前景的治疗手段，有望成为继手术、放化疗方法后的新的常规治疗方法。

T细胞的活性很大程度上受到“阴”“阳”两类分子的调节，也就是抑制型和激活型“免疫检查点”分子的调节。

4-1BB(CD137)是T细胞表面一种重要的激活型免疫检查点分子，属于肿瘤坏死因子受体家族分子(TNFR)，4-1BB在T细胞上是诱导表达的，与4-1BBL结合后激活胞内的信号通路，涉及到多个TNFR相关因子，包括TRAF1、TRAF2和TRAF3，调节NF-κB和MAPK的活性，并产生细胞因子。ERK3和NF-κB激活必需TRAF1介导。TRAF2对K63有E3泛素连接酶活性，使其形成K63-泛素聚合物，招募下游TAK和TAB1等分子。也有结构研究表明TRAF1/TRAF2形成异源三聚体招募cIAP分子起始下游信号。有趣的是，4-1BB结合激活型抗体后会内化为内吞小体的组成部分，以此种方式保持它的信号。4-1BB信号激活后最终会导致IL-2和IFN-γ的分泌以及抗凋亡的Bcl-2家族分子Bcl-xL和Bfl-1的上调，抑制T细胞凋亡。使用4-1BB单抗后还会促使T细胞线粒体电位增加及数量增多，这也是嵌合抗原受体工程采用4-1BB胞内段后成功率大大提高的原因。缺氧会增强T细胞上4-1BB的表达，缺氧诱导因子HIF1-α是肿瘤浸润性细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)中4-1BB上调的重要因子。虽有报告称4-1BB和CD28是独立发挥功能的，但是CD28是强刺激信号，也有可能促进4-1BB的上调。

虽然最初认为4-1BB的表达仅限于活化的T细胞，但现在我们了解到，在整个造血和非造血区都有广泛的表达。4-1BB在DC、活化的单核细胞、NK细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞上表达。4-1BBL在活化的B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、髓系细胞上表达。在NK细胞中，当Fc与受体结合激活细胞时，4-1BB上调，细胞毒性功能增强，但当4-1BB激动剂作用于静息状态的NK细胞时可能会降低NK细胞的功能。在内皮细胞中，当TNF-a、LPS和IL-1b刺激后，4-1BB也可上调表达。4-1BB也在血管壁的炎症部位表达，特别是肿瘤微血管和动脉粥样硬化区，这些结果提示4-1BB可能会介导白细胞迁移。Treg细胞表面也表达4-1BB，但其功能尚不清楚。4-1BB作为一种多功能的免疫活性调节剂，已成为肿瘤免疫治疗中一个很有发展前途的靶点。

目前，含有4-1BB信号的嵌合抗原工程化T细胞(CAR-T)被广泛应用于各种靶点细胞治疗的研究和临床应用当中。不仅如此，目前已经有多种4-1BB激活型抗体进入临床研究阶段，包括百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)的urelumab抗体和辉瑞公司(Pfizer)的utomilumab抗体，这些抗体单独或与其它肿瘤治疗方法联合使用，能够显著提高肿瘤治疗效率。开发4-1BB激活型抗体对于提高肿瘤免疫治疗响应率和效果具有重要意义。

发明内容

本发明的第一方面提供一种含有抗4-1BB结合结构域的抗体或抗体片段，其中上述抗体或抗体片段包含以下的重链互补决定区(CD R)和轻链互补决定区(CDR)：

(a)包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)2；包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)3；包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)2；和包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)3；或

(b)包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)2；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)3；包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)2；和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)3。

在一个实施方式中，上述含有抗4-1BB结合结构域的抗体或抗体片段包含：

(a)与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链；和与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链；或

(b)与SEQ ID NO:9所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链；和与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链。

在一个优选的实施方式中，上述含有抗4-1BB结合结构域的抗体是单克隆抗体，该单克隆抗体优选是嵌合抗体或人源化抗体，该人源化抗体优选包含人Fc区，更优选包含人IgG4的Fc区。

在一个更优选的实施方式中，上述嵌合抗体包含：

与SEQ ID NO:15所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链；和与SEQ ID NO:16所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链。

在另一个更优选的实施方式中，上述人源化抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链可变区；和与SEQ ID NO:20所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链可变区；或

(b)与SEQ ID NO:23所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链可变区；和与SEQ ID NO:24所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链可变区。

在又一个更优选的实施方式中，上述人源化抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:17所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链；和与SEQ ID NO:18所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链；或

(b)与SEQ ID NO:21所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链；和与SEQ ID NO:22所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链。

在一个优选的实施方式中，上述含有抗4-1BB结合结构域的抗体片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)₂、双抗体和包含CDR的肽。

本发明的第二方面提供一种多核苷酸，其编码上述含有抗4-1BB结合结构域的抗体或抗体片段。本领域技术人员可以理解的是本发明的范围涵盖了编码所述的氨基酸序列的核苷酸序列，在本发明公开内容的基础上这样的序列是容易由本领域技术人员获得的。

本发明的第三方面提供一种表达载体，其包含上述的多核苷酸。

本发明的第四方面提供一种宿主细胞，其包含上述的表达载体。

本发明的第五方面提供一种制备上述含有抗4-1BB结合结构域的抗体或抗体片段的方法，该方法包括：

1)培养上述的宿主细胞；

2)从上述宿主细胞或培养基中回收上述抗体或抗体片段。

本发明的第六方面提供一种药物组合物，其包含上述含有抗4-1BB结合结构域的抗体或抗体片段，和药学上可接受的载体。

本发明的第七方面提供上述含有抗4-1BB结合结构域的抗体或抗体片段在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ及IL-2水平的药物中的用途。

本发明的第八方面提供上述含有抗4-1BB结合结构域的抗体或抗体片段在制备治疗结直肠癌及肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌的抗肿瘤药物中的用途。

上述含有抗4-1BB结合结构域的抗体或抗体片段能够激活免疫细胞的活性，上述抗体或抗体片段与4-1BB的结合能够阻断4-1BB与其配体4-1BBL的结合。

本发明提供的含有抗4-1BB结合结构域的抗体或抗体片段能够特异性结合4-1BB分子，并能够产生一系列生物学效应。这些生物学效应包括，例如：能够提高肿瘤病例肿瘤特异性T细胞分泌IFN-γ或IL-2的水平，特别是能够抑制小鼠体内肿瘤生长。

附图说明

图1是表示4-1BB蛋白昆虫细胞表达载体的构建(A)，镍柱纯化的峰图(B)及SDS-PAGE鉴定图(C)。

图2是表示4-1BB蛋白分子筛层析及SDS-PAGE鉴定的图。其中图2A为图1所得蛋白的分子筛层析分析图；图2B为4-1BB单体(mono-4-1BB)和二聚体(di-4-1BB)蛋白的SDS-PAGE鉴定图；图2C和图2D分别是二聚体和单体4-1BB蛋白的分子筛层析图。

图3是表示4-1BB各抗体阻断4-1BB/4-1BBL结合的流式细胞检测分析图。

图4是表示4-1BB抗体在NCG小鼠HT-29肿瘤模型抑制实验结果的总体图。

图5是表示4-1BB抗体在NCG小鼠HT-29肿瘤模型抑制实验结果的单只小鼠分析图。

图6是表示SPR检测11B6嵌合抗体及人源化4-1BB抗体结合4-1BB的亲和力的图。

具体实施方式

术语“抗体”是指一类能与抗原特异性结合的衍生自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体、可以是单链或多链或者完整的免疫球蛋白分子，可以为天然来源或来自重组技术。

在本发明中，表述“4-1BB抗体”或“鼠源4-1BB抗体”为针对4-1BB的鼠源单克隆抗体，在具体的实施方式中为11B6和15A8抗体。表述“人源化4-1BB抗体”为在鼠源4-1BB抗体基础上人源化而制得，在具体的实施方式中，对11B6抗体进行人源化而制得。

“Fc”区包括抗体重链的恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。

4-1BB分子是TNF受体家族的重要成员，该家族还包括TNF-α、GITR、CD27等。4-1BB分子主要表达在活化的T细胞，而在DC、活化的单核细胞、NK细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞等也有一定表达。4-1BB的配体为4-1BBL，其配体4-1BBL在活化的B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、髓系细胞上表达。4-1BB分子的活化机制主要在于通过其与三聚体的4-1BBL的结合，实现4-1BB分子在免疫细胞与抗原递呈细胞界面的交联，进而实现胞内信号的活化及细胞因子的分泌等免疫功能的激活。而活化的免疫细胞能够增强其对肿瘤细胞的杀伤能力，从而达到利用机体免疫系统杀伤肿瘤细胞进而进行肿瘤治疗的作用。

本发明是基于上述的原理作出的，本发明中的抗4-1BB抗体或其抗体片段通过与4-1BB分子特异性结合，能够激活T细胞活性，其结合位点在配体结合位点附近，能够阻断4-1BB与4-1BBL的结合，使T细胞活化，提高T细胞分泌IFN-γ或IL-2等的水平。

本发明包括与4-1BB特异性结合的抗体或衍生物，也包括与本发明的抗体显示实质上相同的抗原特异性的抗体片段。“抗体片段”或“抗体片段”是指抗体的抗体片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。抗体的片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。抗体片段包括选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)₂、双抗体、包含CDR的肽等。

“Fab片段”由一条轻链和一条重链的恒定区1(CH1)及重链可变区组成。

“Fab′片段”含有一条轻链和包含重链可变结构域(VH结构域)和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)₂分子。

“F(ab′)₂片段”含有两条轻链和两条包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)₂片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。

“Fab′-SH”是指其恒定区半胱氨酸残基带有一个游离巯基的Fab′。

“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。

“单链Fv抗体(scFv抗体)”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽另外在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。

“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗体片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。

非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式为含有最小限度的来源于非人类免疫球蛋白序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分为人免疫球蛋白，其中受体抗体的高变区氨基酸残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种高变区的氨基酸残基置换，非人类物种例如为小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区氨基酸残基被相应的非人类氨基酸残基取代。此外，人源化抗体可包含不在受体抗体或供体抗体中存在的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。

当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在该蛋白例如4-1BB的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。

本发明还提供含有本发明4-1BB抗体或抗体片段的药物组合物。为了制备药物组合物，可以通过使抗体或抗体片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合，制备成各种所需的剂型。作为本发明的药物组合物的剂型的种类，例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。

本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。

本发明药物组合物还可以含有其它药剂，包括但不限于细胞毒剂、细胞生长抑制剂、抗血管形成药物或抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂或免疫调节剂或与细胞毒剂、细胞生长抑制剂或其它毒性药物结合的抗体。

两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。适于测定序列同一性百分数和序列相似性的算法的两个实例为BLAST和BLAST2.0算法，见Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215:403-410中。

本发明通过具体实施方式和附图进一步阐述本发明的技术方案，但是本领域普通技术人员可以理解的是：以下具体实施方式以及实施例旨在阐述本发明，而不应理解为以任何方式限制本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特殊说明，均为本领域常规的实验方法，所使用的实验材料如无特别说明，均属于可以容易的从商业公司获取的实验材料。

实施例1. 4-1BB抗体的制备

1. 4-1BB重组表达质粒的构建

以4-1BB的cDNA(NM_005018.2)为参考，设计并合成用于表达该蛋白24-180位的4-1BB的cDNA部分基因，以pFasBac1(购自Invitrogen)为载体，构建pFasBac1-4-1BB(24-180)克隆用于通过昆虫杆状病毒表达系统表达4-1BB胞外段24-180位氨基酸。其构建策略如下：首先设计表达体系，GP67信号肽序列(MLLFSYSFVIKKPINIPDYSYRPTIGRGSRSEAR)的基因，位于4-1BB表达基因N端，通过酶切位点5’BamH I和3’EcoR I整合在pFasBac1载体中，然后接下来为目的基因4-1BB(编码24-180氨基酸序列的基因)，并在序列3’端添加6个His作为标签，利于随后蛋白纯化，同时增加终止密码子序列(4-1BB(24-180)+6个His+终止密码子序列)，将其通过酶切位点5’EcoR I和3’XhoI克隆至pFasBac1载体中，得到表达载体pFasBac1-4-1BB(24-180)(图1A)。

2. 4-1BB重组蛋白的表达与纯化

1)用步骤1获得的表达载体pFasBac1-4-1BB(24-180)转化DH10Bac感受态细胞(Invitrogen)，使外源基因转座到大肠杆菌DH10Bac中的bacmid中，产生重组bacmid。通过蓝白斑筛选出含有重组bacmid的菌株，扩大培养后提取重组bacmid，转染细胞产生可表达目的基因的重组病毒。预先准备好悬浮培养的sf9细胞(Invitrogen)，转染bacmid，72h收集上清，获得第一代(P1代)病毒，将P1代病毒传代感染sf9细胞，直到获得第四代(P4代)病毒。将P4代病毒感染昆虫细胞后，4-1BB蛋白在细胞上清中以可溶形式表达。细胞上清过滤后，流过HisTrap柱(GE healthcare)，目的蛋白由于含His标签，可与柱子上的镍离子结合。用不同浓度的咪唑洗脱柱子后，经还原胶鉴定洗脱峰(图1B和1C)，10mM咪唑洗脱蛋白为非目的蛋白，20mM、50mM和300mM咪唑洗脱液含有目的蛋白4-1BB，300mM咪唑可完全将目的蛋白洗脱，1M咪唑洗脱液中无目的蛋白。

2)将咪唑洗脱的目的蛋白(咪唑洗脱液浓度为20mM、50mM和300mM的收集液混合)浓缩、透析换液至20mM MES(pH 6.0)、5mM NaCl溶液中。通过阳离子柱Source^TM 15S(GEhealthcare)，不同浓度的盐离子强度洗脱，可初步分离4-1BB单体(mono-4-1BB)和二聚体(di-4-1BB)(图2A和2B)。将4-1BB单体和二聚体通过凝胶过滤层析柱superdex^TM 200PG(购自GE healthcare)进一步纯化得到4-1BB单体和二聚体。非还原胶鉴定结果显示(图2C为二聚体，图2D为4-1BB单体)，4-1BB二聚体在柱体积78mL处有280nm波长紫外吸收峰，分子量为40-50kDa；4-1BB单体在柱体积87mL处有280nm波长紫外吸收峰，分子量为20-25kDa。4-1BB蛋白中含多个糖基化位点，在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中蛋白呈弥散状。

3. 4-1BB鼠源单克隆抗体的制备与筛选

根据弗氏完全佐剂腹腔注射免疫方法，用步骤2得到的4-1BB单体(以下简称为4-1BB抗原)对B6/C57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1)动物免疫：经过纯化的4-1BB抗原以完全弗氏佐剂(Sigma)乳化，采用腹腔注射方法免疫6-8周龄B6/C57小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂(购自Sigma)乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2)细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c小鼠(购自维通利华公司)来源的sp2/0(ATCC)，融合时处于对数生长期；取步骤一获得的效价最高的小鼠的已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10的个数比混合，滴加37℃的50％PEG(pH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基(GBICO)悬浮混匀，定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3)筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用纯化的4-1BB单体蛋白进行ELISA测试杂交瘤细胞上清与4-1BB蛋白的结合能力。将4-1BB单体蛋白按照300ng/孔，包被到ELISA板，4℃过夜孵育，之后用PBS缓冲液清洗3次，加入5％脱脂奶粉(伊利)的封闭液，室温25℃孵育2小时；之后用PBS缓冲液清洗3次，加入细胞克隆的培养上清液，室温25℃孵育1小时；之后用PBS缓冲液清洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(三箭)，室温25℃孵育1小时；之后用PBS缓冲液清洗3次，加入TMB显色液，15min后加入终止液，并使用分光光度计检测OD450的吸收值。筛选OD450>0.5的细胞克隆进行后续筛选。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取ELISA检测OD450阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为11B6和15A8。

所获得抗体序列如下：

SEQ ID NO:1：11B6抗体重链

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTRESQTGTGYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

SEQ ID NO:2：11B6抗体轻链

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

SEQ ID NO:3：11B6重链CDR1

GYTFTSY

SEQ ID NO:4：11B6重链CDR2

GNIYPSDSY

SEQ ID NO:5：11B6重链CDR3

TRESQTGTGYYAMDY

SEQ ID NO:6：11B6轻链CDR1

QDISNY

SEQ ID NO:7：11B6轻链CDR2

YTS

SEQ ID NO:8：11B6轻链CDR3

QQGNTLPWTF

SEQ ID NO:9：15A8抗体重链

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTRQSVGYYFDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

SEQ ID NO:10：15A8抗体轻链

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

SEQ ID NO:3：15A8重链CDR1

GYTFTSY

SEQ ID NO:4：15A8重链CDR2

GNIYPSDSY

SEQ ID NO:11：15A8重链CDR3

TRQSVGYYFDY

SEQ ID NO:12：15A8轻链CDR1

QSVSTSSYSY

SEQ ID NO:13：15A8轻链CDR2

KYASNL

SEQ ID NO:14：15A8轻链CDR3

QHSWEIPYT

4.鼠源4-1BB抗体的表达纯化

分别将2×10⁶的细胞株11B6和15A8通过腹腔注射6-8周龄的BALB/C小鼠(购自维通利华公司)，2-3周后收取小鼠腹水，将获得的腹水先经过离心去沉淀后，向其中加入等体积的20mM Na₃PO₄(pH7.0)混合均匀，再用0.22μm的滤膜过滤腹水，主要是防止腹水中的其它杂质对柱子造成损伤；过滤完成后得到腹水过滤液，准备上样进行纯化。

将Protein G(5mL)HP亲和柱(GE公司)连接于AKTA Purifier/Explorer/FPLC/START(GE公司)上，在机器上操作下面的过程：先用水将柱中的20％乙醇冲出，再用20mMNa₃PO₄、pH 7.0的缓冲液平衡柱子，待仪器上显示电导为4.5％后，将上述腹水过滤液通过5mL loop环上样的方式注入，使其与Protein G结合，流速1mL/min；待UV平稳后，在随后的收集管中加入1M的Tris pH 9.0约0.8mL(收集体积为3.2mL)，然后在程序上改成100％的0.1M Gly pH 3.0洗脱挂在柱子上的抗体，收集洗脱的样品，制样，SDS-PAGE鉴定其纯度。单克隆抗体在还原性SDS-PAGE中(含10mM二硫苏糖醇(DTT))呈现两条带，分别为45kD左右的重链条带和23kD左右的轻链条带。若上述鉴定无误，采用浓缩换液的方法，用PBS不断的稀释浓缩的抗体，反复浓缩稀释100倍以上后将样品分装，直接使用或保存于-80℃冰箱。

实施例2. 4-1BB抗体筛选

对上述实施例1中步骤4获得的单克隆抗体进行4-1BB与4-1BBL(配体)的阻断实验，筛选结合位点在4-1BBL附近的抗体，且该抗体能够特异性阻断4-1BBL介导的信号。

1.表达全长4-1BBL的293T细胞制备

在本实施例中，通过将含全长4-1BBL(pEGFP-C1载体-GFP标签质粒(Clontech公司))的4-1BBL-GFP-p质粒转染293T细胞(ATCC)，获得表达全长4-1BBL的293T细胞。转染前1天，将293T细胞按照0.5～2×10⁵细胞每孔接种于24孔培养板，并加入500μL不含抗生素的DMEM完全培养基(GIBCO公司)，以保证转染时细胞汇合达70～80％。1μg 4-1BBL-GFP-p质粒稀释于50μL不含血清和抗生素的DMEM完全培养基中，轻轻混匀。将2μl聚醚酰亚胺(PEI)(Sigma)(4mg/mL)稀释于50μL不含血清和抗生素的DMEM完全培养基中，轻轻混匀。5分钟后，将50μL PEI稀释液滴加到50μL 4-1BBL-GFP-p质粒稀释液中，轻轻混匀，室温孵育20分钟。将100μL PEI/4-1BBL-GFP-p质粒复合物滴加到每孔中，并轻轻摇动使其与新鲜的DMEM完全培养基均匀混合。将细胞放入培养箱孵育4～6h后，更换含血清(GIBCO)的DMEM完全培养液去除复合物。将细胞放置在37℃、5％CO₂孵箱继续孵育24小时后，通过流式细胞分析仪(BDARIA II)检测GFP表达水平，评价293T细胞表达全长4-1BBL的表达水平。

2.抗体阻断实验

将实施例1制备的4-1BB抗体和4-1BB-His蛋白(实施例1获得)按照摩尔比2:1的比例混合后置冰上孵育1小时，之后加入到含2×10⁵的表达全长4-1BBL的293T细胞中，置冰上孵育30分钟。设置Ebola病毒GP蛋白特异性抗体13C6(Mapp Biopharmaceutical)为阴性对照；之后PBS清洗两次，加入APC标记的抗鼠IgG二抗(BD)，孵育30分钟后用PBS缓冲液清洗两次，最终用300mL PBS溶液重悬后进行流式细胞分析。结果如图3所示。

结果表明，4-1BB蛋白能够显著结合到4-1BBL全长表达的293T细胞上，而加入4-1BB抗体(11B6和15A8)后能够完全抑制4-1BB与4-1BBL的结合，从而使得4-1BB-His蛋白不能结合到293T细胞表面的4-1BBL蛋白上(图3)。因此，这些4-1BB抗体能够在细胞水平显著抑制4-1BB和4-1BBL的结合。

实施例3. 4-1BB抗体的NCG免疫缺陷鼠HT-29肿瘤模型肿瘤抑制实验

本实施例应用NCG免疫缺陷小鼠的HT-29人结肠癌肿瘤模型评价4-1BB抗体的肿瘤抑制效果。

4-1BB抗体的NCG小鼠肿瘤抑制实验步骤包括：

1. NCG小鼠人源免疫系统重建

NCG小鼠来源于南京大学-南京生物医药研究院，首先向每只NCG小鼠中接种2名健康个体来源的外周血单个核细胞(PBMC)，建立体内具有人源免疫系统的NCG小鼠：

a)接种人PBMC细胞数量：本实施例选取2名健康志愿者，采集外周血并分离PBMC，按照1×10⁷细胞/200μL/只进行注射；

b)接种部位：尾静脉；

2. HT-29细胞系成瘤

接种PBMC细胞3天后每只NCG小鼠中接种HT-29人结肠癌细胞系(ATCC)：

a)接种HT-29细胞数量：5×10⁷细胞/200μL/只；

b)接种部位：背部皮下；

3.分组及处理：

肿瘤细胞注射后约1周后选择成瘤较为均一的小鼠进行分组，之后进行抗体腹腔注射。本实施例以PBS注射组和埃博拉病毒特异性抗体13C6(Mapp Biopharmaceutical)注射组为阴性对照，以PD-1抗体pembrolizumab(Keytruda)注射组为阳性对照，选取4-1BB抗体11B6和15A8为处理组进行平行实验，每组5只小鼠(见表1)。

表1

小鼠分组	抗体注射及剂量	小鼠数量
			PBS对照组	100μL/只	5
阴性抗体13C6对照组	200μg/只，100μL	5
			Keytruda抗体组	200μg/只，100μL	5
11B6抗体组	200μg/只，100μL	5
			15A8抗体组	200μg/只，100μL	5

抗体注射：小鼠成瘤明显后(7天)，分4次注射抗体，第一次200μg/只，之后间隔两天，即第三天第二次注射200μg/只，之后每三天或四天注射(均为200μg/只)。

成瘤后每三到四天检测一次肿瘤大小，最后一次注射后继续观察两周。

4.治疗效果观察：

1)肿瘤大小检测：

a)在抗体注射后用卡尺进行直径测量，单位为mm，计算公式为：v＝1/2×a×b×b(a为长径，b为短径)；

结果如图4和5所示：结果表明，注射13C6抗体的阴性对照组小鼠在13C6抗体注射后均快速生长，而阳性对照抗体pembrolizumab注射组肿瘤显著小于阴性对照抗体组和PBS注射组。

4-1BB抗体11B6注射组在抗体注射后肿瘤生长迅速进入平台期，且与PBS和13C6对照组相比较差异显著(T检验，p<0.05)(图4)。从11B6抗体处理组每只小鼠肿瘤体积大小来看，抗体注射后肿瘤均有生长，肿瘤体积较为均一，且整体比PBS组和13C6对照组肿瘤体积显著较小。

4-1BB抗体15A8注射组在抗体注射后肿瘤生长迅速进入平台期，且与PBS和13C6对照组相比较差异显著(T检验，p<0.05)(图4)。从15A8抗体处理组每只小鼠肿瘤体积大小来看，抗体注射后肿瘤均有生长，肿瘤体积在抗体注射前期较为均一，而后期出现较大的组内差异，有3只小鼠肿瘤体积呈现变小趋势，而有2只小鼠体积持续增大，但整体比PBS组和13C6对照组肿瘤体积显著较小。

本实施例结果表明，11B6和15A8抗体能够有效抑制肿瘤生长，具有潜在的肿瘤治疗价值。

实施例4.鼠源抗体的人源化及抗体与4-1BB亲和力检测

根据11B6抗体的序列同源性，本发明在保留抗体轻链和重链的CDR区基础之上，通过替换人源抗体骨架，获得两种人源化11B6抗体(11B6-hu)。序列如下所示：

SEQ ID NO:15：11B6嵌合抗体重链

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTRESQTGTGYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:16：11B6嵌合抗体轻链

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:17：人源化11B6-hu-a重链

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRESQTGTGYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:18：人源化11B6-hu-a轻链

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:19：人源化11B6-hu-a抗体的重链可变区

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRESQTGTGYYAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:20：人源化11B6-hu-a抗体的轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO:21：人源化11B6-hu-b重链

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRESQTGTGYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:22：人源化11B6-hu-b轻链

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:23：人源化11B6-hu-b抗体的重链可变区

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRESQTGTGYYAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:24：人源化11B6-hu-b抗体的轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK

1.人源化11B6抗体的表达纯化：

将11B6鼠源的重链可变区与人源IgG4抗体的恒定区相连接，形成11B6嵌合抗体重链，将11B6鼠源的轻链可变区与人源κ链的恒定区相连接，形成11B6嵌合抗体轻链，两者组合形成11B6嵌合抗体(SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18)。本实施例对11B6嵌合抗体的重链和轻链可变区分别进行了人源化抗体改造，设计了两种人源化11B6抗体序列，分别为11B6-hu-a(重链可变区和轻链可变区分别为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22)和11B6-hu-b(重链可变区和轻链可变区分别为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26)。

将合成的11B6嵌合抗体的重链和轻链DNA序列利用酶切位点EcoRI和BglII，克隆入表达载体pCAGGS(Addgene公司)，构建11B6嵌合抗体重链和轻链的表达质粒。利用酶切位点EcoRI和BglII将合成的11B6-hu-a和11B6-hu-b的轻链或重链的DNA序列克隆入表达载体pCAGGS(Addgene公司)，建立11B6-hu-a和11B6-hu-b抗体的轻链和重链的重组真核表达质粒。将11B6嵌合抗体、11B6-hu-a或11B6-hu-b抗体轻链和重链的表达质粒按照2：1的比例，分别转染293T细胞，表达的抗体经Protein G亲和柱层析纯化。具体包括：

a.在转染前的14-16h将细胞密度较大的细胞分盘(如一盘100％铺满细胞的10cm培养皿以1:3进行传代)，14-16h后，细胞密度达到70％上即可进行转染。

b.以10cm培养皿转染贴壁293T细胞为例：转染所需的质粒的量为20μg/盘(轻链:重链＝1:1，质量比)，稀释到100μL/盘的HBS缓冲液(达科为)中，混匀后静置；以PEI(μL):质粒质量(μg)＝1:4的比例确定PEI(1mg/mL)的用量，稀释到100μL/盘的HBS缓冲液中，混匀后静置。上述两溶液分别单独静置混合5min，之后将二者混合继续静置20min，最后加入到要转染的细胞培养液中。

c.转染4-6h后，对转染的细胞进行换液，先用2-3mL的PBS润洗两遍后再换成新鲜的无血清的DMEM完全培养基(按1:1000加入青链霉素)，在37℃恒温、5％CO₂的培养箱中培养表达。

将上述转染后的细胞培养液，在培养3天后收取上清，用DMEM完全培养基换液，到第七天再收取一次上清。将2次收集的上清混合，纯化目的蛋白，纯化方法使用上述实施例1中的Protein G鼠源抗体纯化方法，得到11B6嵌合抗体、人源化11B6-hu-a抗体或11B6-hu-b抗体。

2. 11B6嵌合抗体及人源化11B6-hu-a和11B6-hu-b抗体的亲和力验证：

本实施例中，通过表面等离子共振技术(SPR)对上述获得的11B6嵌合抗体及人源化11B6-hu-a和11B6-hu-b抗体进行亲和力鉴定。

将实施例1中制备的4-1BB蛋白，以及11B6嵌合抗体及人源化11B6-hu-a和11B6-hu-b抗体换液至SPR缓冲液中(10mM HEPES-HCl，150mM Na-Cl，0.005％Tween-20，pH 7.4)。将11B6嵌合抗体及人源化11B6-hu-a和11B6-hu-b抗体稀释到20μg/ml固定到Protein A芯片(GE Healthcare)上，之后将梯度稀释的4-1BB蛋白(6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、400nM)分别流过芯片各通道，利用BIA evaluation软件分析结合动力学参数，并计算亲和力常数。

通过对11B6嵌合抗体及人源化11B6-hu-a和11B6-hu-b抗体与4-1BB亲和力的检测，结果显示，11B6嵌合抗体与4-1BB的亲和力为3.75nM，而人源化11B6-hu-a和11B6-hu-b抗体与4-1BB亲和力分别为5.84nM和9nM(如图6)。因此，从SPR结果可以得出，人源化11B6-hu-a和11B6-hu-b抗体亲和力与11B6嵌合抗体相当，仍保持nM数量级的亲和力，表明其具有与鼠源抗体同等的肿瘤抑制效果。而人源化抗体在作为药物注入人体后，其免疫原性小于鼠源抗体和嵌合抗体，提示人源化11B6-hu-a和11B6-hu-b抗体在肿瘤治疗中具有潜在应用价值。

序列表

<110> 英威福赛生物技术有限公司

<120> 一种靶向4-1BB的肿瘤抑制性抗体及其应用

<130> 190133

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 446

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Ser Gln Thr Gly Thr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His

195 200 205

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys

210 215 220

Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe

225 230 235 240

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

245 250 255

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

275 280 285

Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu

290 295 300

Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys

305 310 315 320

Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile

355 360 365

Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn

385 390 395 400

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp

405 410 415

Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

420 425 430

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 3

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1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr

1 5

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 5

Thr Arg Glu Ser Gln Thr Gly Thr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 6

Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

1 5

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 7

Tyr Thr Ser

1

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 8

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe

1 5 10

<210> 9

<211> 442

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gln Ser Val Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro

180 185 190

Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro

210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe

355 360 365

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370 375 380

Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe

385 390 395 400

Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn

405 410 415

Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

420 425 430

Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 10

<211> 218

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 10

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

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195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 11

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<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 12

Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 13

Lys Tyr Ala Ser Asn Leu

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 14

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr

1 5

<210> 15

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Ser Gln Thr Gly Thr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

195 200 205

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210 215 220

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

Lys

<210> 16

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

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100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

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180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 17

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

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65 70 75 80

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115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

130 135 140

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145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

195 200 205

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210 215 220

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro

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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

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Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

Lys

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

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65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Ser Gln Thr Gly Thr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr

210 215 220

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

Lys

<210> 22

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 23

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

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65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Ser Gln Thr Gly Thr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.含有抗4-1BB结合结构域的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含以下的重链互补决定区(CDR)和轻链互补决定区(CDR)：

(a)包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)1；包含SEQ IDNO:4所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)2；包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)3；包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)2；和包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)3；或

(b)包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)1；包含SEQ IDNO:4所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)2；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)3；包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)2；和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)3。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含：

3.根据权利要求1或2所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体是单克隆抗体，所述单克隆抗体优选是嵌合抗体或人源化抗体，所述人源化抗体优选包含人Fc区，更优选包含人IgG4的Fc区。

4.根据权利要求3所述的抗体或抗体片段，其中所述嵌合抗体包含：

5.根据权利要求3所述的抗体或抗体片段，其中所述人源化抗体包含：

6.根据权利要求3所述的抗体或抗体片段，其中所述人源化抗体包含：

7.根据权利要求1或2所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)₂、双抗体和包含CDR的肽。

8.一种多核苷酸，其编码权利要求1-7中任一项所述的抗体或抗体片段。

9.一种表达载体，其包含权利要求8所述的多核苷酸。

10.一种宿主细胞，其包含权利要求9所述的表达载体。

11.一种制备权利要求1-7中任一项所述的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括：

1)培养权利要求10所述的宿主细胞；

2)从所述宿主细胞或培养基中回收所述抗体或抗体片段。

12.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的抗体或抗体片段，和药学上可接受的载体。

13.权利要求1-7中任一项所述的抗体或抗体片段在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ及IL-2水平的药物中的用途。

14.权利要求1-7中任一项所述的抗体或抗体片段在制备治疗结直肠癌及肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌的抗肿瘤药物中的用途。