CN110357961A

CN110357961A - 抗人4-1bb单克隆抗体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN110357961A
Application number: CN201910283623.7A
Authority: CN
Inventors: 郑勇; 刘静静; 李竞
Original assignee: Wuxi Zhikang Hongyi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Wuxi Zhikang Hongyi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-04-10
Filing date: 2019-04-10
Publication date: 2019-10-22
Anticipated expiration: 2039-04-10
Also published as: CN110357961B

Abstract

提供了结合人4‑1BB的新型完全人单克隆抗体。还提供了使用人源化大鼠的杂交瘤生成方法，编码抗4‑1BB抗体的核酸分子，用于表达抗4‑1BB抗体的载体和宿主细胞。本发明进一步提供了体外验证抗体功能和体内验证抗体功效的方法。本发明的抗体提供了通过调节人免疫功能治疗多种癌症的非常有效的药剂。

Description

抗人4-1BB单克隆抗体及其制备方法和用途

优先权要求

本申请要求2018年4月10日提交的中国申请号201810315613.2的优先权。

序列表

本申请包含序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本申请一般而言涉及抗体。更具体地，本申请涉及结合人4-1BB的完全人单克隆抗体、其制备方法及其用途。

背景技术

4-1BB(也称为CD137，TNFRSF9)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，其是活化诱导的T细胞共刺激分子。它主要在活化的CD4⁺和CD8⁺ T细胞、活化的B细胞和天然杀伤(NK)细胞上表达，但也可发现于静止的单核细胞和树突细胞上。作为共刺激分子，4-1BB参与CD4⁺、CD8⁺和NK细胞的活化和存活。4-1BB激动剂疗法在先天性和适应性免疫上均引起不同的免疫效应应答。在临床前肿瘤模型中，4-1BB单一疗法和与其他免疫调节剂的组合疗法可建立持久的抗肿瘤T细胞记忆应答，这使得该受体成为癌症免疫治疗的有吸引力的靶标。

越来越多的证据表明，抗4-1BB单克隆抗体具有很强的抗肿瘤特性。抗4-1BB激动剂可强烈激活CD8⁺ T细胞以产生干扰素(IFN)-γ并诱导细胞裂解标记。还可以刺激CD4⁺效应T细胞以扩增并产生促炎细胞因子。4-1BB激动疗法可以抑制常规效应细胞向Treg的分化以及抑制Treg功能。4-1BB信号传导诱导树突细胞成熟，导致B7共刺激配体的上调，增加DC存活，并且促进炎症性细胞因子如IL-6、IL-12和IL-27的产生。

对于作为治疗剂的针对4-1BB的抗体有一些改进的空间。作为针对共刺激受体的激动剂，激动性4-1BB抗体的毒性(如细胞因子风暴)可能是最受关注的问题，这限制了其临床应用。此外，目前在临床试验中测试的抗4-1BB抗体只能与人和食蟹猴4-1BB蛋白结合，而不与小鼠4-1BB蛋白结合，这限制了用于测试潜在候选剂的治疗效力和毒性的临床前体内模型。

在本发明中，发明人利用专有的杂交瘤技术产生了针对4-1BB的完全人抗体。本发明的抗体具有高结合亲和力，与人、食蟹猴以及小鼠4-1BB蛋白特异性结合；有效调节免疫应答，包括增强T细胞增殖和增加细胞因子IFN-γ产生；具有优良的抗肿瘤活性；并且延长受试者的存活率。

发明概述

广义而言，本发明涉及提供具有改善功效的抗体的化合物、方法、组合物和制品。本发明提供的益处广泛地适用于抗体治疗和诊断领域，并且可以与能够与各种靶标反应的抗体联合使用。本发明提供了与人4-1BB结合的抗体，优选完全人单克隆抗体。还提供了使用人源化大鼠产生杂交瘤的方法，编码抗4-1BB抗体的核酸分子，用于表达抗4-1BB抗体的载体和宿主细胞。本发明进一步提供了体外和体内验证抗体功能的方法。本发明的抗体提供了通过调节人免疫功能治疗多种疾病的有效药剂。

在一些方面，本发明包括分离的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分具有一种或多种以下性质：

(a)以2×10^-10M或更低的K_D结合人4-1BB，如通过SPR所检测的；

(b)以5×10^-10M或更低的K_D结合食蟹猴4-1BB，如通过SPR所检测的；

(c)以3×10^-8M或更低的K_D结合小鼠4-1BB，如通过SPR所检测的；

(d)诱导CD4⁺ T细胞中细胞因子(例如IFN-γ)的产生；

(e)增强T细胞增殖；

(f)分别结合人、食蟹猴或小鼠4-1BB；

(g)与人OX40、CD40或GITR没有交叉反应性；或

(h)对活化的人T细胞没有ADCC和/或CDC作用。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分结合至少一个以下残基：SEQID NO：21的L112，T113，W136，T137，N138，V146，T151或D155。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个(如1、2或3个)重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：(i)与选自SEQ ID NO：1和7序列之一所示的CDRH1具有至少90％序列同一性的CDRH1；(ii)与选自SEQID NO：2和8序列之一所示的CDRH2具有至少90％序列同一性的CDRH2；和(iii)与选自SEQID NO：3和9序列之一所示的CDRH3具有至少90％序列同一性的CDRH3；

B)一个或多个(如1、2或3个)轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：(i)与选自SEQ ID NO：4和10的序列之一所示CDRL1具有至少90％序列同一性的CDRL1；(ii)与选自SEQID NO：5和11序列之一所示的CDRL2具有至少90％序列同一性的CDRL2；和(iii)与选自SEQID NO：6和12序列之一所示的CDRL3具有至少90％序列同一性的CDRL3；或

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个(如1、2或3个)重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：(i)选自SEQID NO：1和7的CDRH1或与所述CDRH1在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：2和8的CDRH2或与所述CDRH2在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH2；和(iii)选自SEQ IDNO：3和9的CDRH3或与所述CDRH3在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH3；

B)一个或多个(如1、2或3个)轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：(i)选自SEQID NO：4和10的CDRL1或与所述CDRL1在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：5和11的CDRL2或与所述CDRL2在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL2；和(iii)选自SEQ IDNO：6和12的CDRL3或与所述CDRL3在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL3；或

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)包含SEQ ID NO：3或9的CDRH3；或

B)与选自SEQ ID NO：3和9序列之一所示的CDRH3具有至少90％序列同一性的CDRH3；或

C)与A)的CDRH3在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH3；

并且其中分离的抗体或其抗原结合部分以2×10^-10M或更低的K_D结合人4-1BB。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：1或由其组成的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：2或由其组成的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：3或由其组成的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：4或由其组成的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：5或由其组成的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：6或由其组成的CDRL3。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：7或由其组成的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：8或由其组成的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：9或由其组成的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：10或由其组成的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：11或由其组成的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：12或由其组成的CDRL3。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：13具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：13相比具有一个或多个(如1-10个，1-5个，1-3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：14具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：14相比具有一个或多个(如1-10个，1-5个，1-3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：15具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：15相比具有一个或多个(如1-10个，1-5个，1-3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：16具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：16相比具有一个或多个(如1-10个，1-5个，1-3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。

在一些方面，本发明涉及包含编码如本文所公开的抗体或其抗原结合部分的核酸分子的载体。

在一些方面，本发明涉及包含如本文所公开的表达载体的宿主细胞。

在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

在一些方面，本发明涉及用于制备抗4-1BB抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在宿主细胞中表达抗体或其抗原结合部分并从宿主细胞分离抗体或抗原结合部分。

在一些方面，本发明涉及调节受试者的免疫应答的方法，其包括向受试者施用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答受到调节。

在一些方面，本发明涉及治疗受试者的异常细胞生长的方法，包括将有效量的本文公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物施用至受试者。

在一些方面，本发明涉及抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，包括将有效量的本文公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物施用至受试者。

在一些方面，本发明涉及用于减少受试者的肿瘤细胞转移的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。

在一些方面，本发明涉及用于治疗或预防受试者中的增殖性病症例如癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。

在一些方面，本发明涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防增殖性病症例如癌症的药物中的用途。

在一些方面，本发明涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断增殖性病症例如癌症的诊断剂中的用途。

在一些方面，本发明涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分用于治疗或预防增殖性病症例如癌症。

在一些方面，本发明涉及使用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分的试剂盒或装置和相关方法，以及如本文所公开的药物组合物，其可用于治疗增殖性病症例如癌症。为此，本发明优选提供可用于治疗此类病症的制品，其包含含有如本文所公开的抗体或其抗原结合部分的容器以及用于使用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分来治疗、改善或预防增殖性疾病或其进展或复发的说明材料。在选定的实施方案中，装置和相关方法将包括使至少一种循环肿瘤细胞与如本文所公开的抗体或其抗原结合部分接触的步骤。

以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。提供概述以简化地介绍一些选择的概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段。此外，贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用整体并入本文。

附图简述

图1显示了通过流式细胞术测量的抗人4-1BB抗体与表达人4-1BB的CHO-K1细胞的结合，如实施例4.2所述，通过MFI(中值荧光强度)表示并且通过BD FACSCanto II测量。

图2显示通过流式细胞术测量的抗人4-1BB抗体与活化的人T细胞的结合，如实施例4.3所述。

图3显示通过流式细胞术测量的抗4-1BB抗体与表达食蟹猴4-1BB的CHO-K1细胞的跨物种结合，如实施例4.4.1所述。

图4显示了通过流式细胞术测量的抗4-1BB抗体与表达鼠4-1BB的CHO-K1细胞的跨物种结合，如实施例4.4.2所述。

图5显示了通过报告基因测定法(RGA)测定的抗4-1BB抗体与交联剂的激动作用，由相对萤光素酶单位(RLU)表示，如实施例4.8所述。

图6显示了通过RGA测定的抗4-1BB抗体与表达CD32的细胞(图6A)和不与表达CD32的细胞(图6B)的激动作用，由RLU表示，如实施例4.8所述。

图7显示通过流式细胞术测量的工程化CHO-K1细胞上抗-4-1BB抗体的配体竞争测试结果，如实施例4.7所述。

图8显示了通过ELISA测量的针对BMK3的抗原表位竞争结合测试的结果，如实施例4.6所述。

图9显示了通过ELISA测量的针对BMK4的抗原表位竞争结合测试的结果，如实施例4.6所述。

图10显示了通过ELISA测量的抗4-1BB抗体与其他TNFR家族成员的交叉家族结合测试的结果，如实施例4.5所述。

图11显示了在人CD4⁺ T细胞共刺激测定中抗4-1BB抗体对IFN-γ分泌的影响，如实施例4.9所述。

图12显示了在人CD4⁺ T细胞共刺激测定中抗4-1BB抗体对细胞增殖的影响，如通过[³H]胸苷掺入评估和通过CPM(每分钟计数)表示的，如实施例4.9所述。

图13显示在人CD8⁺ T细胞共刺激测定中抗4-1BB抗体对IFN-γ产生的影响，如实施例4.9所述。

图14显示了在人CD8⁺ T细胞共刺激测定中抗4-1BB抗体对增殖的影响，如通过[³H]胸苷掺入评估和通过CPM表示的，如实施例4.9所述。

图15显示了在活化的人T细胞上抗4-1BB抗体的ADCC测试结果，如实施例4.10.1所述。

图16显示了在活化的人T细胞上抗4-1BB抗体的CDC测试结果，如实施例4.10.2所述。

图17显示了绘制在人4-1BB结构上的热点残基，即，抗体2.19.8-u1-3-IgG1L或2.19.8-u1-3-IgG4L(图17A)以及2.27.16-u1-1-IgG1L或2.27.16-u1-1-IgG4L(图17B)分别与人4-1BB的结合位点。

图18显示了B-h4-1BB转基因小鼠中4-1BB抗体的体内药效测试结果。如实施例6.1所述，用4-1BB抗体处理接种MC38细胞的小鼠，并且每周两次测量肿瘤大小。图18A显示4-1BB抗体对MC38肿瘤生长的有效抑制作用，图18B和18C显示4-1BB抗体的剂量依赖性抗肿瘤作用。

发明详述

虽然本发明可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方案。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方案。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。

除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和断点之间的所有值。

通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,6^th ed.,W.B.Saunders Company(2010)；SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人,Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；和Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。与本文描述的分析化学，合成有机化学和药物和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的术语。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。

定义

为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。

如本文所用，术语“抗体”或“Ab”通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。氨基酸在各种区域或结构域中的分布遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature342:878-883中的定义。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”，其可以在本申请的上下文中互换使用，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或其与全长抗体竞争结合相同的抗原。一般而言，参见FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第二版,Raven Press,N.Y.(1989)，其出于所有目的通过引用并入本文。抗体的抗原结合片段可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。在一些条件下，抗原结合片段包括Fab,Fab',F(ab')₂,Fd,Fv,dAb和互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如scFv)，嵌合抗体，双抗体和包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的至少一部分抗体的多肽。抗体的抗原结合片段可从给定抗体(例如，在本申请中提供的单克隆抗人4-1BB抗体)通过本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学切割方法)获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选特异性。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指单分子成分的抗体分子制剂。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

如本文所用，术语“人抗体”或“完全人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已经嫁接到人框架序列上的抗体。

如本文所用，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有其中框架和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。

术语“人源化抗体”旨在指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。

如本文所用的术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列来自一个物种并且恒定区序列来自另一物种，例如其中可变区序列源自小鼠抗体和恒定区序列来源于人抗体。

如本文所用，术语“重组抗体”是指通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，例如从就另一物种的免疫球蛋白基因而言是转基因的动物分离的抗体，使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。

如本文所用，术语“抗4-1BB抗体”或“4-1BB抗体”是指能够结合4-1BB受体例如人4-1BB受体的如本文所定义的抗体。

本文可互换使用的术语“4-1BB”、“4-1BB受体”、“4-1BB蛋白”、“CD137”或“肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)”是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，并且是活化诱导的T细胞共刺激分子。术语“4-1BB”可以包括人4-1BB受体，以及其变体、同种型和物种同源物。因此，如本文所定义和公开的抗体或其抗原结合部分也可以结合来自除人之外的物种的4-1BB，例如食蟹猴4-1BB或小鼠4-1BB。

如本文所用，术语“人4-1BB”是指人序列4-1BB，例如具有Genbank登录号NP_001552.2的人4-1BB的完整氨基酸序列。人4-1BB序列可以与Genbank登录号NP_001552.2的人4-1BB不同，例如在非保守区中具有保守的突变，并且4-1BB具有与Genbank登录号NP_001552.2的人4-1BB基本上相同的生物学功能。

如本文所用，术语“小鼠4-1BB”是指小鼠序列4-1BB，例如具有Genbank登录号NP_035742.1的小鼠4-1BB的完整氨基酸序列。

如本文所用，术语“食蟹猴4-1BB”是指食蟹猴序列4-1BB，例如具有Genbank登录号NP_001253057.1的食蟹猴4-1BB的完整氨基酸序列。

如本文所用，术语“Ka”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。抗体的Kd值可以使用本领域良好建立的方法来确定。如本文所用，术语“K_D”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离常数，其从Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。确定抗体Kd的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如系统。

如本文所用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指针对靶抗原(例如4-1BB受体)具有1×10^-7M或更低，更优选5×10^-8M或更低，甚至更优选1×10^-8M或更低，甚至更优选5×10^-9M或更低，和甚至更优选1×10^-9M或更低的K_D的抗体。

如本文所用的术语“EC₅₀”，也被称为“半数有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中，EC₅₀的单位为“nM”。

如本文所用，术语“竞争结合”是指两种抗体在与其结合靶标结合上的相互作用。如果第一抗体与其同源表位的结合在第二抗体存在时与在不存在第二抗体时第一抗体的结合相比可检测地降低，则第一抗体与第二抗体竞争结合。在第一抗体存在下第二抗体与其表位的结合可以但不一定也可检测地降低。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，在每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位的结合的情况下，无论是相同、更大还是更小程度地，抗体均被称为彼此“交叉竞争”结合它们各自的表位。

如本文所用，“抑制结合”的能力是指抗体或其抗原结合片段抑制两个分子(例如人4-1BB和人抗4-1BB-3抗体)的结合至任何可检测水平。在某些实施方案中，两个分子的结合可以被抗体或其抗原结合片段抑制至少50％。在某些实施方案中，这种抑制作用可以大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。

如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。例如，表位通常包含独特立体构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或不连续的氨基酸，其可以是“线性”或“构象”表位。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用位点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用位点跨越蛋白质中彼此分离的氨基酸残基。取决于通过本领域技术人员已知的常规技术检测的结合相同表位的竞争性，可以筛选抗体。例如，可以进行竞争或交叉竞争研究以获得彼此竞争或交叉竞争结合抗原(例如RSV融合蛋白)的抗体。在国际专利申请WO 03/48731中描述了用于获得结合相同表位的抗体的高通量方法，其基于它们的交叉竞争。

如本文所用，术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然发生变化，或者物质与天然分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从该天然状态分离的相同的高纯度多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。

如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合4-1BB蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除4-1BB蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人4-1BB蛋白的分离的抗体对其他抗原如来自其他物种的4-1BB蛋白可能具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

如本文所用，术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可被工程化以产生感兴趣的蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于培养细胞，例如来源于啮齿动物(大鼠，小鼠，豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如CHO，BHK，NSO，SP2/0，YB2/0；或人体组织或杂交瘤细胞，酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。该术语不仅涵盖特定的受试细胞，还涵盖这种细胞的后代。由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。

如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的间隙(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.,ed.),1988,New York:Oxford University Press；BiocomputingInformatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:AcademicPress；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysisin Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo等人,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。

如本文所用，术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质，还指抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫系统中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够成功诱导宿主中免疫应答的产生取决于三个因素：抗原的性质，宿主的反应性和免疫手段。

如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染和化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如Graham等人,1973,Virology 52:456；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,同上；Davis等人,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu et al,1981,Gene 13:197。在本发明的一个具体实施方案中，将人4-1BB基因转染入293F细胞。

如本文所用，术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”可以互换使用。当提及术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”时，它们也包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。

如本文所用，术语“SPR”或“表面等离子体共振”是指并且包括允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)。关于详细描述，参见实施例和U.,等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；U.,等人(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.,等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.,等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。

如本文所用，术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence ActivatedCell Sorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且可以对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACSStar Plus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，FL)的EpicsC和来自Cytomation(Colorado Springs，Colorado)的MoFlo。

如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指其中与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且对于这种杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的464页的表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选或另外地，感兴趣分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的动物模型中评估。

术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与结合其同源抗原的抗体(适当的亚类)结合而启动。为了评估补体活化，可以执行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述的。

术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。

如本文所用，术语“癌症”是指引发医学病症的任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤如白血病。

本文在治疗病情的情况中使用的术语“治疗”和“医治”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病情进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，病情消退，病情改善和病情治愈。还包括了作为预防措施(即预防)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其某种组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。

如本文所用，术语“有效量”涉及活性化合物的量或包含活性化合物的材料、组合物或剂量的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。例如，当与治疗4-1BB相关疾病或病症联合使用时，“有效量”是指抗体或其抗原结合部分有效治疗所述疾病或病症的量或浓度。

如本文所用，关于哺乳动物中的某种疾病状况的术语“预防”、“防止”或“阻止”是指预防或延迟疾病的发作或预防其临床或亚临床症状的表现。

如本文所用，术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至有机体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)，短小棒状杆菌，脂多糖，细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。

抗4-1BB抗体

在一些方面，本发明包括分离的抗体或其抗原结合部分。

在本申请的上下文中，“抗体”可以包括多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，人源化和灵长类动物化抗体，CDR移植抗体，人抗体，重组产生的抗体，胞内抗体，多特异性抗体，双特异性抗体，单价抗体，多价抗体，抗独特型抗体，合成抗体，包括其突变蛋白及变体；及其衍生物(包括Fc融合蛋白和其他修饰)，以及任何其他免疫反应性分子，只要其表现出与4-1BB蛋白的优先结合或缔合。此外，除非上下文另外规定，否则该术语还包括所有类别的抗体(即IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)和所有亚类(即IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)。在一个优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。在更优选的实施方案中，抗体是人单克隆抗体。

人抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生。一种技术是噬菌体展示，其中在噬菌体上合成(优选人)抗体文库，用感兴趣的抗原或其抗体结合部分筛选文库，并分离结合抗原的噬菌体，从其中可以获得免疫反应性片段。用于制备和筛选这种文库的方法是本领域众所周知的，并且用于产生噬菌体展示文库的试剂盒可商购获得(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；以及Stratagene SurfZAP^TM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还有其他方法和试剂可用于产生和筛选抗体展示文库(参见例如Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982(1991))。

人抗体还可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全失活并且已引入人免疫球蛋白基因的小鼠)中来制备。在攻击时，观察到人抗体产生，其与在人中各方面观察到的非常相似，包括基因重排、装配和抗体库。这种方法例如描述于美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和关于XenoMouse技术的美国专利6,075,181和6,150,584；Lonberg andHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。或者，可以通过产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞(这样的B淋巴细胞可以从患有肿瘤性疾病或者可能已经在体外被免疫的个体中获得)的永生化来制备人抗体。参见例如Cole等人,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner等人,J.Immunol,147(l):86-95(1991)；和U.S.P.N.5,750,373。

单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术来制备，包括杂交瘤技术，重组技术，噬菌体展示技术，转基因动物(例如)或其一些组合。例如，可以使用杂交瘤和本领域公认的生物化学和遗传工程技术来生产单克隆抗体，如详细描述于An,Zhigiang(ed.)Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic,JohnWileyand Sons,1^st ed.2009；Shire et.al.(eds.)Current Trends in MonoclonalAntibody Development and Manufacturing,Springer Science+Business Media LLC,1^sted.2010；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,2nd ed.1988；Hammerling,等人,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)，每篇文献在此全部引入作为参考。应该理解，可以进一步改变选定的结合序列，例如以提高对靶的亲和力、使靶结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产生、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的抗体。在一个优选的实施方案中，通过使用杂交瘤来制备抗人4-1BB单克隆抗体。

产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的产生

为了获得产生本发明抗体例如本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自免疫小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞并将其融合至合适的永生化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。就抗原特异性抗体的产生筛选产生的杂交瘤。杂交瘤的产生在本领域中是众所周知的。参见例如Harlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Publications,New York。

产生本发明的单克隆抗体的转染瘤的产生

本发明的抗体还可以在宿主细胞转染瘤中使用例如本领域众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)来产生。在一个实施方案中，将通过标准分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，使得所述基因可操作地连接于转录和翻译调节序列。在此上下文下，术语“可操作地连接”意在表示将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能。

术语“调控序列”旨在包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。这些调节序列描述于例如Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。用于哺乳动物宿主细胞表达的示例性调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒的启动子和/或增强子，或者可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子；还有，由不同来源的序列组成的调控元件，如SRa启动子系统，其包含来自SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列的序列(Takebe等人(1988)MoI.Cell.Biol.8:466-472)。表达载体和表达控制序列被选择为与使用的表达宿主细胞相容。

可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入相同或不同的表达载体中。在一些实施方案中，可变区用于通过将其插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中来产生任何抗体同种型的全长抗体基因，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段和VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。另外或可选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽符合读框地连接到抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。

除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带额外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择导入了载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择标记基因赋予载体已经导入其中的宿主细胞对药物(例如G418，潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。选择标记基因可以包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。可以在原核或真核宿主细胞例如哺乳动物宿主细胞(其可以装配和分泌适当折叠和免疫活性的抗体)中表达本发明的抗体。

用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括与DHFR选择标记(例如，如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.MoI.Biol.159:601-621中所述的)一起使用的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr CHO细胞)，NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。特别地，为了与NSO骨髓瘤一起使用，另一种表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达的时间段或将抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中来产生抗体。使用标准蛋白质纯化方法可从培养基中回收抗体。

具有某些性质的抗4-1BB抗体

本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或性质。在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分具有一种或多种以下性质：

(a)以2×10^-10M或更低的K_D结合人4-1BB，如通过SPR所检测的；

(c)以3×10^-8M或更低的K_D结合小鼠4-1BB，如通过SPR所检测的；

(d)诱导CD4⁺ T细胞中细胞因子(例如IFN-γ)的产生；

(e)增强T细胞增殖；

(f)分别结合人、食蟹猴或小鼠4-1BB；

(g)与人OX40、CD40或GITR没有交叉反应性；或

(h)对活化的人T细胞没有ADCC和/或CDC作用。

本发明的抗体以高亲和力结合人4-1BB。本发明的抗体与4-1BB的结合可以使用本领域中良好建立的一种或多种技术，例如ELISA来评估。本发明抗体的结合特异性也可以通过例如流式细胞术监测抗体与表达4-1BB蛋白的细胞的结合来确定。例如，抗体可以通过流式细胞术测定来测试，其中抗体与表达人4-1BB的细胞系例如已经转染以在其细胞表面上表达4-1BB的CHO细胞反应。用于流式细胞术测定的其他合适的细胞包括表达天然4-1BB的抗CD3-刺激的CD4+活化的T细胞。另外或可选地，可以在BIAcore结合测定中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如Kd值)。其他合适的结合分析包括ELISA分析，例如使用重组4-1BB蛋白。例如，本发明的抗体以5×10^-10M或更低的K_D结合人4-1BB，以2×10^-10M或更低的K_D结合人4-1BB，以1×10^-10M或更低的K_D结合人4-1BB，以5×10^-11M或更低的K_D结合人4-1BB蛋白，以3×10^-11M或更低的K_D结合人4-1BB蛋白，或以2×10^-11M或更低的K_D结合人4-1BB蛋白。

本发明的抗体还以高亲和力与小鼠4-1BB结合。例如，本发明的抗体以1×10^-7M或更低的K_D结合小鼠4-1BB，以5×10^-8M或更低的K_D结合小鼠4-1BB，以3×10^-8M或更低的K_D结合小鼠4-1BB蛋白，以2×10^-8M或更低的K_D结合小鼠4-1BB蛋白，或以1×10^-8M或更低的K_D结合小鼠4-1BB蛋白。

就本发明人所知，本领域可用的抗4-1BB抗体只能结合人和食蟹猴4-1BB蛋白，但不结合小鼠4-1BB蛋白，这限制了用于测试潜在候选剂的治疗功效和毒性的临床前体内模型。相反，本发明的抗4-1BB抗体以高亲和力与人、食蟹猴以及小鼠4-1BB蛋白结合，因此可以提供用于测试潜在候选剂的治疗功效和毒性的临床前体内模型。

包含具有特定序列的CDR的抗4-1BB抗体

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：(i)与选自SEQ ID NO：1和7序列之一所示的CDRH1具有至少90％序列同一性的CDRH1；(ii)与选自SEQ ID NO：2和8序列之一所示的CDRH2具有至少90％序列同一性的CDRH2；和(iii)与选自SEQ ID NO：3和9序列之一所示的CDRH3具有至少90％序列同一性的CDRH3；

B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：(i)与选自SEQ ID NO：4和10序列之一所示的CDRL1具有至少90％序列同一性的CDRL1；(ii)与选自SEQ ID NO：5和11序列之一所示的CDRL2具有至少90％序列同一性的CDRL2；和(iii)与选自SEQ ID NO：6和12序列之一所示的CDRL3具有至少90％序列同一性的CDRL3；或

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

除非另有说明，否则将氨基酸分配给每个CDR可以根据以下提供的编号方案之一：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(5^th Ed.),USDept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242；Chothia等人,1987,PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel,Ed.(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies,3^rd Ed.,Wily-VCHVer4-1BB GmbH and Co.。

抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述，例如Kabat编号系统)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。在Kontermann andDubel,eds.,Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001和Dinarello等人,Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000中描述了鉴定这些区域的方法。抗体序列的示例性数据库描述于并可获自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”网站(由Department of Biochemistry&Molecular Biology UniversityCollege London,London,England的A.C.Martin维护)和VBASE2网站www.vbase2.org，如Retter等人,Nucl.Acids Res.,33(Database issue):D671-D674(2005)中所述。优选使用Abysis数据库分析序列，其整合了来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据，参见Dr.Andrew C.R.Martin所著的书中的Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains.In:Antibody Engineering LabManual(Ed.:Duebel,S.and Kontermann,R.,Springer-Ver4-1BB,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547，也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。Abysis数据库网站还包括已经开发用于识别可以根据本文的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文所述的所有CDR均根据Kabat的Abysis数据库网站获得。

两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))确定，其已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空隙权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

另外地或可选地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如识别相关序列。这种搜索可以使用Altschul,等人(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)来执行。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可使用空位BLAST，如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

在其他实施方案中，CDR氨基酸序列可以与上述各个序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。作为说明性实例，抗体可以包含与选自SEQID NO：1和7序列之一所示的CDRH1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的CDRH1.

包含具有氨基酸添加、缺失和/或取代的CDR的抗4-1BB抗体

在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：(i)选自SEQ ID NO：1和7的CDRH1或与所述CDRH1在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：2和8的CDRH2或与所述CDRH2在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH2；和(iii)选自SEQ ID NO：3和9的CDRH3或与所述CDRH3在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH3；

B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：(i)选自SEQ ID NO：4和10的CDRL1或与所述CDRL1在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：5和11的CDRL2或与所述CDRL2在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL2；和(iii)选自SEQ ID NO：6和12的CDRL3或与所述CDRL3在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL3；或

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

优选地，分离的抗体或其抗原结合部分的CDR含有不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸的保守取代。如本文所用，术语“保守取代”是指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质的氨基酸取代。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，它们通过引用并入本文)。

包含CDR的抗4-1BB抗体

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：1的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：2的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：3的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：4的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：5的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：6的CDRL3。

在具体实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)由SEQ ID NO：1组成的CDRH1；

(b)由SEQ ID NO：2组成的CDRH2；

(c)由SEQ ID NO：3组成的CDRH3；

(d)由SEQ ID NO：4组成的CDRL1；

(e)由SEQ ID NO：5组成的CDRL2；和

(f)由SEQ ID NO：6组成的CDRL3。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：7的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：8的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：9的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：10的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：11的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：12的CDRL3。

在具体实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)由SEQ ID NO：7组成的CDRH1；

(b)由SEQ ID NO：8组成的CDRH2；

(c)由SEQ ID NO：9组成的CDRH3；

(d)由SEQ ID NO：10组成的CDRL1；

(e)由SEQ ID NO：11组成的CDRL2；和

(f)由SEQ ID NO：12组成的CDRL3。

包含重链可变区和轻链可变区的抗4-1BB抗体

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；

(iii)包含与SEQ ID NO：13相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：14具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；

(iii)包含与SEQ ID NO：14相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在具体实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的重链可变区；和/或

(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；

(iii)包含与SEQ ID NO：15相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；

(iii)包含与SEQ ID NO：16相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在具体实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的重链可变区；和/或

(b)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区。

在其它实施方案中，重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列可以与上述各个序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。作为说明性实例，抗体可以包含与由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的重链可变区具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区。

在一些进一步的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分可以包含重链和/或轻链的可变区中的一个或多个(如1-10个，1-5个，1-3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的保守取代或修饰。本领域理解的是，可以进行某些不消除抗原结合的保守序列修饰。参见例如Brummell等人(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt等人(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov等人(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall等人(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley and O’Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy等人(1998)Int.Immunol.10:341-6和Beers等人(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。

本文使用的术语“保守取代”是指氨基酸取代，其不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

竞争结合和表位作图

将进一步理解的是，所公开的抗体将与由所选择的靶或其片段呈递的离散表位或免疫原性决定簇缔合或结合。在一些实施方案中，表位或免疫原性决定簇包括分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。在一些实施方案中，表位可以具有特定的三维结构特征和/或特异性电荷特性。因此，如本文所用，术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。在一些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，抗体被认为特异性结合(或免疫特异性结合或反应)抗原。在一些实施方案中，当平衡解离常数(K_D)小于或等于10^-6M或小于或等于10^-7M时，更优选当K_D小于或等于10^-7M时，称抗体与抗原特异性结合等于10^-8M，甚至更优选当K_D小于或等于10^-9M时，抗体被认为特异性结合抗原。

由连续氨基酸形成的表位(有时称为“线性”或“连续”表位)通常在蛋白质变性时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性后丢失。在任何情况下，抗体表位通常在独特的空间构象中包含至少3个，更通常地至少5或8-10个氨基酸。

在这方面，应该理解的是，在一些实施方案中，表位可以与例如4-1BB蛋白的一个或多个区域、结构域或基序结合或位于其中。类似地，本领域公认的术语“基序”将根据其通用含义使用，并且通常应该是指通常十至二十个连续氨基酸残基的蛋白质的短保守区域。

无论如何，一旦确定了抗原上的所需表位，就有可能产生针对该表位的抗体，例如通过使用本发明中描述的技术用包含表位的肽免疫。或者，在发现过程中，抗体的产生和表征可以阐明关于位于特定结构域或基序中的期望表位的信息。从这些信息中，可以竞争性筛选与相同表位的结合的抗体。实现这一点的方法是进行竞争研究以发现彼此竞争性结合的抗体，即抗体竞争结合抗原。在WO 03/48731中描述了基于其交叉竞争对抗体进行竞争结合的高通量方法。竞争结合或结构域水平或表位作图包括抗体竞争或在酵母上的抗原片段表达的其他方法在本领域中是公知的。

如本文所用，术语“竞争结合”是指用于基于抗原结合特征和竞争对抗体进行分组或分类的方法。尽管这些技术对于定义和分类本发明的抗体是有用的，但是这些仓(bin)并不总是直接与表位结合，并且表位结合的这种初始测定可以通过本领域中和如本文所述的其他公认的方法进一步改进和确认。然而，可以理解的是，将抗体凭经验性地分配至各个仓提供了可以指示所公开的抗体的治疗潜力的信息。

更具体地，可以通过使用本领域已知和本文实施例中所示的方法确定选定的参考抗体(或其片段)是否结合相同的表位或与第二测试抗体交叉竞争结合(即，在相同的仓内)。

其他相容的表位作图技术包括丙氨酸扫描突变体，肽印迹(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)(特别地通过引用整体并入本文)或肽切割分析。另外，可以使用抗原的表位切除，表位提取和化学修饰等方法(Tomer(2000)Protein Science 9：487-496)(特别地通过引用整体并入本文)。

编码本发明抗体的核酸分子

本发明的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤表达的抗体(例如，如下文进一步描述的由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，编码这种抗体的核酸可以从基因文库中回收。

通过将编码VH的核酸可操作地连接至编码重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的另一DNA分子，可将编码VH区的分离的核酸转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat等(1991)，同上)，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区，但更优选是IgG1或IgG4恒定区。

通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，可将编码VL区的分离的核酸转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat等，同上)，并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。

一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质的另一DNA片段例如抗体恒定区或柔性接头可操作地连接。在本文中使用的术语“可操作地连接”旨在表示两个DNA片段连接成使得两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。

在一些实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的重链可变区的核酸序列。

在一些具体的实施方案中，编码分离的抗体的重链可变区的分离的核酸分子包含选自以下的核酸序列：

(A)编码SEQ ID NO：13或15所示的重链可变区的核酸序列；

(B)SEQ ID NO：17或19所示的核酸序列；或

(C)在高度严格条件下与(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。

例如，核酸分子由SEQ ID NO：17或19组成。或者，核酸分子与SEQ ID NO：17或19具有至少80％(例如至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％)的序列同一性。在一些具体的实施方案中，同一性的百分比源自遗传密码的简并性，并且编码的蛋白质序列保持不变。

在一些实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的轻链可变区的核酸序列。

在一些具体的实施方案中，编码分离的抗体的轻链可变区的分离的核酸分子包含选自以下的核酸序列：

(A)编码SEQ ID NO：14或16所示的轻链可变区的核酸序列；

(B)SEQ ID NO：18或20所示的核酸序列；或

例如，核酸分子由SEQ ID NO：18或20组成。或者，核酸分子与SEQ ID NO：18或20具有至少80％(例如至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％)的序列同一性。在一些具体的实施方案中，同一性的百分比源自遗传密码的简并性，并且编码的蛋白质序列保持不变。

示例性的高度严格条件包括在45℃下在5X SSPE和45％甲酰胺中杂交，并在65℃在0.1X SSC中进行最终洗涤。在本领域中应该理解，可以通过如Ausubel等人(Eds.),Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1994),第6.0.3至6.4.10页所述的温度和缓冲液或盐浓度的变化来实现等同严格条件。杂交条件下的修饰可凭经验确定或根据探针的鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基配对的长度和百分比精确计算。杂交条件可以如Sambrook等人(Eds.),Molecular Cloning:A laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press:Cold Spring Harbor,New York(1989)，第9.47至9.51页中所述进行计算。

药物组合物

组合物的组分

药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用，使得抗4-1BB抗体增强对疫苗的免疫反应。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体，凝胶或固体载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。

合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸，抗坏血酸，EDTA，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，巯基甘油，巯基乙酸，巯基山梨糖醇，丁基甲基苯甲醚，丁基化羟基甲苯和/或丙基砷酸盐。如本发明所公开的，在包含还原抗体或其抗原结合片段的一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的含有本发明公开的组合物的抗体或抗原结合片段的溶剂中，其可被氧化。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本发明进一步提供了多种方法，其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合。从而，抗体或其抗原结合片段可以被防止氧化，以延长其保质期和/或增加活性。

为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如含水载体，例如氯化钠注射液，林格氏注射液，等渗右旋糖注射液，无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性载体如植物来源的固定油，棉籽油，玉米油，芝麻油或花生油，抑细菌剂或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨酯80(TWEEN-80)，隔绝剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)，乙二醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可以添加到包含酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可以包括例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。

施用、制剂和剂量

本发明的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服，静脉内，动脉内，皮下，肠胃外，鼻内，肌内，颅内，心内，心室内，气管内，口腔，直肠，腹膜内，皮内，局部，经皮和鞘内，或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，栓剂，灌肠剂，注射剂，吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。

用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊，丸剂，片剂，包括包衣片剂，酏剂，混悬剂，糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。

适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液，混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水，醇，多元醇，甘油，植物油等。适用于此类制剂的等渗载体的实例包括氯化钠注射液，林格溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(包括剂量，时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期，清除率等)的经验考虑。

施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少，减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。或者，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。

本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用，施用时间，化合物清除速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，病症的严重程度，以及物种，患者的性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。

通常，本发明的抗体或其抗原结合部分可以以各种范围施用。这些包括每剂量约5μg/kg体重至约100mg/kg体重；每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重；每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重。其他范围包括每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重和每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量为至少约100μg/kg体重，至少约250μg/kg体重，至少约750μg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约5mg/kg体重，至少约10mg/kg体重。

无论如何，本发明的抗体或其抗原结合部分优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗病症、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。

在某些优选的实施方案中，涉及本发明的抗体或其抗原结合部分的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用的多剂量的所选药物产品。更具体地说，本发明的抗体或其抗原结合部分可以每天，每两天，每四天，每周，每十天，每两周，每三周，每月，每六周，每两个月，每十周或每三个月施用。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整间隔。

在给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方案中，剂量可分别根据经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减轻。为了评估所选择的组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或病情的标志物。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样本的显微镜检查评估的改善；测量根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如用于前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的减轻；与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明白，剂量将根据个体、肿瘤病情的类型、肿瘤病情的阶段、肿瘤病情是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。

用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含浓度为约10μg/ml至约100mg/ml的本文公开的抗体或其抗原结合部分。在某些选定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml或1mg/ml。在其他优选的实施方案中，ADC浓度将包括2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，12mg/ml，14mg ml，16mg/ml，18mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml或100mg/ml。

本发明的应用

本发明的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括例如4-1BB的检测或免疫应答的增强。例如，可以将这些分子体外或离体施用于培养细胞，或例如体内施用于人受试者，以增强各种情况下的免疫力。免疫应答可以被调节，例如被增强、刺激或上调。

优选的受试者包括需要增强免疫应答的人患者。所述方法特别适用于治疗具有可通过增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)治疗的病症的人患者。在一个具体的实施方案中，所述方法特别适合于体内治疗癌症。为了实现免疫的抗原特异性增强，可以将抗4-1BB抗体与感兴趣的抗原一起施用，或者抗原可能已经存在于待治疗的受试者中(例如携带肿瘤或病毒的受试者)。当4-1BB的抗体与另一种药剂一起施用时，两者可以以任何顺序施用或同时施用。

本发明进一步提供了用于检测样品中人4-1BB抗原的存在或测量人4-1BB抗原的量的方法，包括在允许抗体或其部分与人4-1BB之间形成复合物的条件下使样品和对照样品与特异性结合人4-1BB的人单克隆抗体或其抗原结合部分接触。然后检测复合物的形成，其中与对照样品相比，样品之间的差异复合物形成表明样品中存在人4-1BB抗原。此外，本发明的抗4-1BB抗体可用于通过免疫亲和纯化来纯化人4-1BB。

治疗包括癌症在内的疾病

在一些方面，本发明提供了治疗哺乳动物病症的方法，其包括向需要治疗的患者(例如人)施用治疗有效量的抗体或其抗原结合部分。例如，这种疾病是一种癌症。

可以使用本公开提供的方法治疗或预防涉及4-1BB的多种癌症，无论是恶性的还是良性的，以及是原发性的还是继发性的。这些癌症的实例包括肺癌如支气管癌(例如鳞状细胞癌，小细胞癌，大细胞癌和腺癌)，肺泡细胞癌，支气管腺瘤，软骨性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；结肠癌或结肠瘤；心脏癌如粘液瘤，纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌例如骨软骨瘤，软骨瘤，软骨母细胞瘤，软骨样软骨瘤，骨样骨瘤，巨细胞瘤，软骨肉瘤，多发性骨髓瘤，骨肉瘤，纤维肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，尤因氏肿瘤(尤因氏肉瘤)和网织细胞肉瘤；脑癌例如神经胶质瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)，间变性星形细胞瘤，星形细胞瘤，少突神经胶质瘤，成神经管细胞瘤，脊索瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，脑膜瘤，垂体腺瘤，松果体瘤，骨瘤，血管母细胞瘤，颅咽管瘤，脊索瘤，生殖细胞瘤，畸胎瘤，皮样囊肿和血管瘤；消化系统中的癌症如平滑肌瘤，表皮样癌，腺癌，平滑肌肉瘤，胃腺癌，肠脂肪瘤，肠神经纤维瘤，肠纤维瘤，大肠息肉和结肠直肠癌；肝癌如肝细胞腺瘤，血管瘤，肝细胞癌，纤维板层癌，胆管癌，肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌如肾腺癌，肾细胞癌，高肾上腺瘤和肾盂的移行细胞癌；膀胱癌；血液系统癌症如急性淋巴细胞白血病(急性淋巴细胞性白血病)，急性骨髓性(髓细胞性，骨髓，成髓细胞性，骨髓单核细胞性)白血病，慢性淋巴细胞性白血病(例如Sezary综合征和毛细胞性白血病)，慢性髓细胞性(髓性，骨髓性，粒细胞性)淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，蕈样霉菌病和骨髓增殖性疾病(包括骨髓增生性疾病，如真性红细胞增多症，骨髓纤维化，血小板增多症和慢性粒细胞白血病)；皮肤癌如基底细胞癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，卡波西肉瘤和佩吉特氏病；头颈部癌症；与眼相关的癌症，如成视网膜细胞瘤和眼内黑素癌；男性生殖系统癌症如良性前列腺增生，前列腺癌和睾丸癌(例如精原细胞瘤，畸胎瘤，胚胎癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系统癌症如子宫癌(子宫内膜癌)，宫颈癌(宫颈肿瘤)，卵巢癌(卵巢肿瘤)，外阴癌，阴道癌，输卵管癌和葡萄胎；甲状腺癌(包括乳头状，滤泡状，间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌；和血液学癌症例如白血病，骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在一个具体的实施方案中，癌症是黑素瘤。在另一个具体的实施方案中，癌症是结肠癌。

在一些其他实施方案中，病症是自身免疫性疾病。可以用抗体或其抗原结合部分治疗的自身免疫性疾病的实例包括自身免疫性脑脊髓炎，红斑狼疮和类风湿性关节炎。抗体或其抗原结合部分也可用于治疗或预防感染性疾病，炎症性疾病(例如变应性哮喘)和慢性移植物抗宿主病。

刺激免疫反应

在一些方面，本发明还提供增强(例如刺激)受试者的免疫应答的方法，其包括向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，以使受试者的免疫应答增强。例如，受试者是哺乳动物。在具体的实施方案中，受试者是人。

术语“增强免疫应答”或其语法变化意味着刺激、诱发、增加、改善或增强哺乳动物免疫系统的任何反应。免疫应答可以是细胞应答(即细胞介导的，如细胞毒性T淋巴细胞介导的)或体液应答(即抗体介导的应答)，并且可以是主要或次要免疫应答。增强免疫应答的实例包括增加的CD4⁺辅助T细胞活性和细胞溶解性T细胞的产生。可以使用本领域技术人员已知的许多体外或体内测量来评估免疫应答的增强，所述测量包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞测定，细胞因子释放(例如IL-2产生或IFN-γ产生)，肿瘤消退，携带肿瘤的动物的存活，抗体产生，免疫细胞增殖，细胞表面标记的表达和细胞毒性。典型地，本公开内容的方法与未治疗的哺乳动物或没有使用本文公开的方法治疗的未治疗的哺乳动物的免疫应答相比，增强了哺乳动物的免疫应答。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分用于增强人对微生物病原体(例如病毒)的免疫应答。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分用于增强人对疫苗的免疫应答。在一个实施方案中，该方法增强细胞免疫应答，特别是细胞毒性T细胞应答。在另一个实施方案中，细胞免疫应答是T辅助细胞应答。在又一个实施方案中，免疫应答是细胞因子产生，特别是IFN-γ产生或IL-2产生。抗体或其抗原结合部分可用于增强人对微生物病原体(如病毒)或疫苗的免疫应答。

抗体或其抗原结合部分可以作为单一疗法单独使用，或者可以与化学疗法或放射疗法组合使用。

与化疗组合使用

抗体或其抗原结合部分可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。

术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂，并且包括但不限于细胞毒性剂，细胞抑制剂，抗血管生成剂，放射疗法和放射治疗剂，靶向抗癌剂，BRM，治疗性抗体，癌症疫苗，细胞因子，激素疗法，放射疗法和抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是，在如上所述的选定实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的位点特异性抗体结合。更具体而言，在一些实施方案中，将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的不配对半胱氨酸以提供如本文所述的工程化偶联物。因此，这样的工程化缀合物被明确地考虑在本发明的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在一些实施方案中，该物质是源自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于细菌(例如，白喉毒素，假单胞菌内毒素和外毒素，葡萄球菌肠毒素A)，真菌(例如α-八叠球菌素，局限曲霉素)，植物(相思豆毒蛋白，蓖麻毒素，蒴莲根毒素，槲寄生素，美洲商陆抗病毒蛋白，皂草素，白树毒素，momoridin，天花粉蛋白，大麦毒素，油桐(Aleurites fordii)蛋白，石竹素蛋白，Phytolacca mericana蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻风树毒蛋白，巴豆毒素，石碱草抑制剂，白树毒素，mitegellin，局限曲霉素，酚霉素，新霉素和单端孢霉烯族化合物)或动物(例如细胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)的小分子毒素或酶促活性毒素。

为了本发明的目的，“化学治疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这些化学试剂通常针对细胞生长或分裂所需的细胞内过程，因此对于通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，从而抑制细胞进入有丝分裂。通常，化学治疗剂可以包括抑制或被设计用于抑制癌细胞或可能变成性或产生致瘤后代(例如TIC)的细胞的任何化学药剂。这些药剂通常是组合使用的，并且通常是最有效的，例如，在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。

可以与本发明的位点特异性构建体组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或未缀合状态)的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺、多聚乙酰(acetogenins)、喜树碱、苔藓抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀、多卡米星、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔类抗生素、dynemicin、双膦酸盐、埃斯波霉素、色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢物、埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗-肾上腺素、叶酸补充剂如弗林酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布希(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵、爱波喜龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)、雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱，长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨；考布他汀；甲酰四氢叶酸；奥沙利铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞增殖)，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括的是用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂，抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，和抗-雄激素；以及曲沙他滨(1，3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核酶诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗， rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

与放射疗法组合使用

本发明还提供了抗体或其抗原结合部分与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射，X-射线，UV-照射，微波，电子发射等)的组合。还考虑了使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法，并且所公开的缀合物可以与靶向的抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1周至约2周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单剂量或作为多个顺序剂量施用。

诊断

本发明提供了用于检测、诊断或监测增殖性病症的体外和体内方法以及筛选来自患者的细胞以鉴定肿瘤细胞包括致瘤细胞的方法。这样的方法包括鉴定用于治疗的患有癌症的个体或监测癌症的进展，包括将患者或从患者获得的样品(体内或体外)与本文所述的抗体接触，并检测样品中与结合的或游离的靶分子的结合的抗体的存在或不存在或结合水平。在一些实施方案中，抗体将包含如本文所述的可检测标记或报道分子。

在一些实施方案中，抗体与样品中特定细胞的结合可表示样品可能含有致瘤细胞，从而表明具有癌症的个体可用本文所述的抗体有效治疗。

可以通过多种测定法分析样品，例如放射免疫测定法，酶免疫测定法(例如ELISA)，竞争结合测定法，荧光免疫测定法，免疫印迹测定法，Western印迹分析和流式细胞术测定法。兼容的体内诊断或诊断测定可以包括本领域公知的成像或监测技术，例如本领域技术人员已知的磁共振成像，计算机化断层摄影(例如CAT扫描)，正电子断层扫描(例如PET扫描)，放射线照相术，超声波等。

药物包装和试剂盒

还提供了包含包含一个或多个剂量的抗体或其抗原结合部分的一个或多个容器的药物包装和试剂盒。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体或其抗原结合部分，具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方案，这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在其他实施方案中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。或者，在一些实施方案中，缀合物组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重建。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的缀合物组合物用于治疗选择的肿瘤疾病状况。

本发明还提供了用于产生位点特异性缀合物以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，小瓶，注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且包含药学有效量的所公开的缀合或非缀合形式的缀合物。在其他优选实施例中，容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含工程化偶联物的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。例如，除了本发明的抗体或其抗原结合部分之外，这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂，例如化学治疗剂或放射治疗剂；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。

更具体地说，试剂盒可以具有含有所公开的抗体或其抗原结合部分的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以具有用于每种所需试剂的不同容器。在提供用于缀合的组合治疗剂的情况下，可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。或者，试剂盒的缀合物和任何任选的抗癌剂可以在施用于患者之前分开保存在不同的容器中。试剂盒还可以包含用于容纳无菌药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想溶剂也可以提供于另一个容器中。

如上简要所述，所述试剂盒还可含有向患者施用抗体或其抗原结合部分和任何任选组分的工具，例如一种或多种针，I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置，通过其可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件，例如注射或吹塑塑料容器，其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。

序列表概述

本申请附带有包含许多核酸和氨基酸序列的序列表。下表A提供了所包含的序列的概述。

如本文所公开的四种说明性抗体，其是完全人抗4-1BB单克隆抗体，被命名为“2.19.8-u1-3-hIgG1L”，“2.19.8-u1-3-hIgG4L”，“2.27.16-u1-1-hIgG1L“和”2.27.16-u1-1-hIgG4L“。抗体“2.19.8-u1-3-hIgG1L”和“2.19.8-u1-3-hIgG4L”是相同的可变区(包括重链可变区和轻链可变区)，并且彼此不同之处在于，抗体“2.19.8-u1-3-hIgG1L”的恒定区是人IgG1恒定区，抗体“2.19.8-u1-3-hIgG4L”的恒定区是人IgG4恒定区。类似地，抗体“2.27.16-u1-1-hIgG1L”和“2.27.16-u1-1-hIgG4L”是相同的可变区(包括重链可变区和轻链可变区)，并且彼此不同抗体“2.27.16-u1-1-hIgG1L”的恒定区是人IgG1恒定区，抗体“2.27.16-u1-1-hIgG4L”的恒定区是人IgG4恒定区。

表A

具体地，表B示出了本文所公开的四种说明性完全人抗4-1BB单克隆抗体的CDR序列。下文还在表C和表D中分别提供了本文所公开的四种说明性抗体的重链和轻链可变区(VH和VL)的氨基酸序列和核苷酸序列。

表B.CDR氨基酸序列

表C.可变区的氨基酸序列

表D.可变区的核酸序列

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1

材料的制备

1.1免疫原的产生

由Sangon Biotech合成编码全长人、小鼠和食蟹猴4-1BB或4-1BBECD(细胞外结构域，ECD)的核酸。从合成的核酸扩增4-1BB基因片段并将其插入表达载体pcDNA3.3(ThermoFisher)中。插入的4-1BB基因片段通过DNA测序进一步证实。通过将人4-1BB基因转染到293F细胞(ThermoFisher)中获得含有人和小鼠4-1BB ECD与各种标签(包括人Fc，食蟹猴Fc，小鼠Fc和His标签)的融合蛋白。将细胞在37℃、5％CO₂下在FreeStyle 293表达培养基(ThermoFisher)中培养。培养5天后，将从瞬时转染细胞培养物收获的上清液用于蛋白质纯化。通过镍、蛋白质A和/或SEC柱纯化融合蛋白，并定量用于免疫、筛选和表征。

1.2基准抗体的产生

基于专利申请US7288638B2和US20130078240A1(US7288638B2中BMK3被称为“20H4.9-IgG1,4”，BMK4在US 20130078240A1中被称为“PF05082566”)中公开的信息分别合成抗人4-1BB基准抗体(BMK3和BMK4)的基因序列。如上面第1节所述，将合成的基因序列整合到质粒pcDNA3.3中。将质粒瞬时转染到293F细胞中。以与第1节中所述相同的方式培养细胞。培养5天后，从瞬时转染细胞培养物收获的上清液用于蛋白质纯化。基准抗体从上清液中纯化。

1.3建立稳定的细胞系

产生人、小鼠和食蟹猴4-1BB转染细胞系。简而言之，使用Lipofectamine 2000转染试剂盒，，分别用含有全长人、小鼠和食蟹猴4-1BB的pcDNA3.3表达载体转染Flp-In-293、Flp-In-CHO或293F细胞。在转染后48-72小时，将转染的细胞在含有杀稻瘟菌素的培养基中培养以进行选择并测试4-1BB的表达。通过有限稀释获得人4-1BB表达细胞系、食蟹猴4-1BB表达细胞系和小鼠4-1BB表达细胞系，并按比例放大至较大体积。然后将所建立的单克隆细胞系维持在含有适当剂量杀稻瘟菌素的培养基中。

实施例2

抗体杂交瘤细胞生成

2.1免疫和细胞融合

分别用20μg人4-1BB ECD蛋白皮下和足底免疫6-8周龄的OMT大鼠(具有重组免疫球蛋白基因座的转基因大鼠，如US8,907,157B2中所述和产生)，并且每周交替地用人或小鼠4-1BB ECD蛋白进行加强免疫，以Alum-Phos和TiterMax作为免疫佐剂。每月对动物抽血以收集血清，通过ELISA测量抗4-1BB抗体滴度。一旦抗体滴度达到足够高，用在无佐剂的DPBS中的35μg人4-1BB ECD蛋白对大鼠进行最终加强。如下进行细胞融合：在无菌条件下从免疫动物解剖的淋巴结中分离B淋巴细胞。然后将分离的B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以1：1的比例混合。使用BTX 2000Electro cell操纵器进行细胞融合。然后将细胞接种在96孔板中并在37℃、5％CO₂下培养直至准备筛选。

2.2杂交瘤上清液的初步筛选和确认筛选

使用ELISA测定作为第一筛选方法来选择含有与人和食蟹猴4-1BB蛋白结合的抗体的上清液样品。简言之，将平板(Nunc)在4℃用人或食蟹猴4-1BB细胞外结构域的可溶性蛋白包被过夜。封闭并洗涤后，将杂交瘤上清液转移至包被的平板并在室温下孵育1小时。然后洗涤平板，随后用二抗山羊抗大鼠IgG HRP(Bethyl)孵育45分钟。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸光度。

为了确认4-1BB抗体对细胞膜上表达的天然4-1BB分子的结合，使用4-1BB转染的CHO-K1细胞系进行流式细胞术分析。将表达人4-1BB的CHO-K1细胞转移到96孔U底板(BD)中。然后将根据初筛结果选择的杂交瘤上清液转移至平板并在4℃下孵育1小时。洗涤后，加入荧光素标记的山羊抗大鼠IgG二抗(JacksonImmunoResearch)并与细胞在4℃在黑暗中孵育1小时。然后洗涤细胞并重悬于PBS中，然后用流式细胞仪(BD)分析。作为阴性对照平行进行抗体与亲本CHO-K1细胞系的结合。

2.3杂交瘤亚克隆：

一旦通过初步和确认性筛选验证了特异性结合，则将阳性杂交瘤细胞系亚克隆以获得单克隆抗h4-1BB抗体。简而言之，对于每种杂交瘤细胞系，计数细胞并连续稀释到DMEM培养基中。将细胞悬液铺在96孔板中，在37℃、5％CO₂下培养，直至可以做ELISA检测。收集所选单克隆的耗竭上清液(ESN)以进行纯化。

实施例3

杂交瘤测序和全人抗体分子的构建和纯化

3.1杂交瘤测序

通过使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)从杂交瘤细胞中提取总RNA，并如表1和表2所示制备第一链cDNA。如表3和表4所示，通过使用3'-恒定区简并引物和5'-简并引物组(它们与Ig可变序列的上游信号序列编码区互补)如表3和表4所示从cDNA扩增抗体VH和VL基因。表5显示了包括制造商在内的试剂信息。

将PCR产物(10μL)连接到pMD18-T载体中，并将10μL连接产物转化到Top10感受态细胞中。将转化的细胞铺在2-YT+Cab平板上并在37℃孵育过夜。随机挑选阳性克隆用于在Shanghai Biosune Biotech Co.,Ltd进行测序。

表1.cDNA扩增反应(20μL)

表2.cDNA扩增反应条件

	步骤1	步骤2	步骤3	步骤4
					温度(℃)	25	50	85	4
时间	10min	50min	5min	∞

表3.PCR反应体系(50μL)

组分	量
		cDNA	2.0μL
Premix Ex Taq	25μL
		5’-简并引物组(10pM)	2.5μL
3’-恒定区简并引物(10pM)	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	19.5μL

表4.PCR反应条件

表5.试剂信息

试剂	制造商
		RNeasy Plus Mini试剂盒	QIAGEN
SuperScript III第一链合成SuperMix	Invitrogen
		热启动Premix Ex Taq	TaKaRa
DNA凝胶提取试剂盒	Axygen
		pMD 18-T载体	TaKaRa

在测序后，获得例举的抗体的序列，并且序列信息在上表A中提供。

3.2全人抗体分子的构建和纯化

用含有合适限制性位点的克隆引物重新扩增VH和VL基因，并克隆到WuXiBiologics的专有表达载体pcDNA3.4中。用载体瞬时转染Expi-293F细胞用于抗体表达。收集含有抗体的培养上清液并使用蛋白A层析纯化。

实施例4

抗体表征

4.1通过表面等离子体共振(SPR)进行的完整动力学结合亲和力测试

通过使用Biacore T200(GE)的SPR测定法对抗体对人、食蟹猴和小鼠4-1BB的亲和力和结合动力学进行表征。蛋白G被预先固定到传感器芯片(CM5)上，并且当抗4-1BB抗体注入芯片时捕获抗4-1BB抗体。不同浓度的4-1BB蛋白和运行缓冲液流过传感器芯片进行结合阶段，然后解离。使用Biacore T200评估软件2.0版分析结合和解离曲线。

实验结果如下表6和表7所示。

表6.使用表面等离子体共振进行的4-1BB抗体对重组人4-1BB蛋白的完全动力学结合亲和力。

*人4-1BB胞外结构域，His标签

如表6所示，针对4-1BB的示例性抗体(包括2.19.8-u1-3-hIgG1L、2.19.8-u1-3-hIgG4L、2.27.16-u1-1-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG4L)对重组人4-1BB的亲和力为1.77×10^-11M至1.78×10^-10M。

表7.使用表面等离子体共振进行的4-1BB抗体对重组食蟹猴4-1BB蛋白的完全动力学结合亲和力。

*食蟹猴4-1BB细胞外结构域，His标签

如表7所示，针对4-1BB的示例性抗体(包括2.19.8-u1-3-hIgG1L、2.19.8-u1-3-hIgG4L、2.27.16-u1-1-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG4L)对重组食蟹猴4-1BB的亲和力为1.58×10^-11M至4.39×10^-10M。

表8.使用表面等离子体共振进行的4-1BB抗体对重组小鼠4-1BB蛋白的完全动力学结合亲和力。

*小鼠4-1BB细胞外结构域，His标签

如表8所示，针对4-1BB的示例性抗体(包括2.19.8-u1-3-hIgG1L、2.19.8-u1-3-hIgG4L、2.27.16-u1-1-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG4L)对重组小鼠4-1BB的亲和力为6.27×10^-9至2.61×10^-8M。

4.2通过流式细胞术将抗体与细胞表面4-1BB分子结合。

将表达人4-1BB的CHO-K1细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度转移到96孔U形底板中。将测试抗体(包括本发明的示例性抗体，以及BMK3和BMK4)连续稀释并与细胞在4℃孵育1小时。洗涤后，应用PE标记的山羊抗人IgG Fc片段(Jackson ImmunoResearch)的第二抗体，并在4℃在黑暗中与细胞孵育1小时。然后洗涤细胞并重悬于PBS中，然后通过流式细胞仪(BD)分析。

图1中显示了通过流式细胞术测量的抗人4-1BB抗体与表达人4-1BB的CHO-K1细胞的结合的数据。数据表明示例性抗体显示与表达人4-1BB的CHO-K1细胞的良好结合效力。

4.3通过流式细胞术测量的抗体与活化的人T细胞的结合。

根据制造商的方案使用人T细胞富集试剂盒(StemCell)从人PBMC分离人T细胞。分离的人T细胞通过PMA和Inomycin刺激48小时。细胞以1x10⁵个细胞/孔的密度转移到96孔U形底板中。加入系列稀释的抗体并在4℃下与细胞孵育1小时。洗涤后，应用PE标记的山羊抗人IgG Fc片段(Jackson ImmunoResearch)的第二抗体，并在4℃在黑暗中与细胞孵育1小时。然后洗涤细胞并重悬于PBS中，然后通过流式细胞仪(BD)分析。

图2中显示了通过流式细胞术测量的抗4-1BB抗体与活化的人T细胞的结合的数据。数据显示示例性抗体以剂量依赖性方式结合活化的人T细胞。

4.4直系同源(跨物种)测试

4.4.1通过流式细胞术测量对食蟹猴4-1BB的交叉反应性。

将表达食蟹猴4-1BB的Flp-CHO细胞以1x10⁵个细胞/孔的密度转移到96孔U形底板中。将测试抗体在含有1％BSA的PBS中连续稀释，并与细胞在4℃孵育1小时。洗涤后，应用PE标记的山羊抗人IgG Fc片段(Jackson ImmunoResearch)的第二抗体，并在4℃在黑暗中与细胞孵育1小时。然后洗涤细胞并重悬于PBS中，然后通过流式细胞仪(BD)分析。

如图3所示，示例性抗体与表达食蟹猴4-1BB的CHO-K1细胞具有交叉结合。

4.4.2通过流式细胞术测量对鼠4-1BB的交叉反应性。

将表达鼠4-1BB的CHO-K1细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度转移到96孔U形底板中。将测试抗体在含有1％BSA的PBS中连续稀释，并与细胞在4℃下孵育1小时。洗涤后，应用PE标记的山羊抗人IgGFc片段(Jackson ImmunoResearch)的第二抗体，并在4℃在黑暗中与细胞孵育1小时。然后洗涤细胞并重悬于PBS中，然后通过流式细胞仪(BD)分析。

如图4所示，示例性抗体与表达小鼠4-1BB的CHO-K1细胞具有交叉反应性结合。

4.5同源(跨家族)测试

通过ELISA确定对TNFR家族成员OX40、CD40和GITR的交叉反应性。在4℃下将平板(Nunc)用OX40、CD40或GITR包被过夜。封闭和洗涤后，将抗4-1BB抗体加入平板并在室温下孵育1小时。然后洗涤平板，随后用作为二抗的HRP缀合的山羊抗人IgG Fc片段抗体(Bethyl)孵育45分钟。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪(Molecular Device)读取450和540nm处的吸光度。

通过ELISA测量的抗4-1BB抗体与其他TNFR家族成员的交叉家族结合测试的结果显示在图10中。结果显示4-1BB抗体特异性结合4-1BB，并且不结合其他家族成员OX40、CD40和GITR。

4.6针对BMK抗体的抗原表位竞争结合测试

将平板在4℃下预先用人4-1BB蛋白质包被过夜。封闭后，将各种浓度的测试抗体与生物素化的BMK抗体预混合并加入板中。将平板在室温下孵育1小时。通过链霉抗生物素蛋白-HRP检测BMK抗体与人4-1BB的结合。通过分配TMB底物显色，然后用2N HCl终止。使用微孔板分光光度计在450nM和540nM读取吸光度。实验数据如图8和图9所示。

图8中的数据显示示例性抗体2.27.16-u1-1-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG4L与BMK3部分竞争结合人4-1BB，但是其他示例性抗体2.19.8-u1-3-hIgG1L和2.19.8-u1-3-hIgG4L不与BMK3竞争结合人4-1BB。

图9中的数据显示示例性抗体2.19.8-u1-3-hIgG1L和2.19.8-u1-3-hIgG4L与BMK4竞争结合人4-1BB，但其他示例性抗体2.27.16-u1-1-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG4L不与BMK4竞争结合人4-1BB。

4.7通过流式细胞术进行的配体竞争测定

将表达人4-1BB的CHO-K1细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度转移到96孔U形底板中。将测试抗体的连续稀释液与恒定浓度的人4-1BBL-His(BioLegend)预混合，然后加入细胞并在4℃孵育1小时。洗涤后，加入在PBS中稀释的抗His-生物素(GenScript)，并与细胞在4℃孵育45分钟。将细胞洗涤两次并使用PE标记的链霉亲和素(eBioscience)来检测4-1BBL与细胞的结合。通过流式细胞仪测量细胞的MFI并通过FlowJo分析。

图7中的数据显示示例性抗体2.27.16-u1-1-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG4L阻断人4-1BB配体(4-1BBL)与人4-1BB的结合，其与BMK4(Pfizer)类似，但示例性抗体2.19.8-u1-3-hIgG1L和2.19.8-u1-3-hIgG4L以与BMK3(BMS)类似的模式部分抑制4-1BBL与4-1BB的结合。

4.8 4-1BB信号传导的报告基因测定

制备表达人4-1BB以及稳定整合的NF-κB萤光素酶报道基因的CHO-K1细胞。收集细胞，洗涤并重悬于F12K完全培养基中，然后加入到96孔板中。在存在相应的交联抗体或表达CD32的CHO-K1细胞的情况下将系列稀释的测试抗体加入到细胞中。平板在37℃孵育5小时。孵育后，加入萤光素酶底物(Promega)并通过酶标仪(Molecular Device)测量萤光素酶强度。

如图5所示，结果表明本发明的示例性抗4-1BB抗体显示对4-1BB信号传导的激动作用并激活下游NF-κB途径。

此外，图6中的结果显示，本发明的抗4-1BB抗体(包括2.19.8-u1-3-hIgG1L、2.19.8-u1-3-hIgG4L、2.27.16-u1-1-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG4L)显示出对具有CD32表达细胞的4-1BB信号传导的激动作用(图6A)，而抗体在缺乏CD32表达细胞时不显示任何作用(图6B)。

4.9人T细胞体外共刺激测定

使用人CD4⁺和CD8⁺ T细胞富集试剂盒(StemCell)根据制造商的方案从人PBMC分离人CD4⁺和CD8⁺ T细胞。将细胞重悬于完全RPMI 1640培养基中。

抗4-1BB抗体对人CD4⁺和CD8⁺ T细胞的作用：简言之，将非组织培养物处理的平底96孔板用小鼠抗人CD3抗体和抗4-1BB系列稀释液抗体与包被。将平板在4℃孵育过夜，然后用完全RPMI 1640培养基洗涤以去除未结合的抗体。分别向每个孔中添加新鲜分离的人CD4⁺或CD8⁺ T细胞。将板在37℃，5％CO₂下孵育3天，然后收获上清液用ELISA方法测定IFNγ含量。收集细胞团块以通过[³H]-胸苷掺入来测量T细胞增殖。共刺激分析的结果显示在图11-14中。

如图11所示，本发明的抗4-1BB抗体以剂量依赖性方式增加人CD4⁺ T细胞的IFN-γ分泌。此外，如图12所示，本发明的抗4-1BB抗体以剂量依赖性方式促进CD4⁺ T细胞的增殖。

如图13所示，本发明的抗4-1BB抗体(包括2.19.8-u1-3-hIgG1L、2.19.8-u1-3-hIgG4L、2.27.16-u1-1-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG4L)增加人CD8⁺ T细胞的IFN-γ分泌。此外，如图14所示，本发明的抗4-1BB抗体也促进CD8⁺ T细胞的增殖。

4.10ADCC和CDC测试：

为了评估抗4-1BB抗体是否可以在结合到表达4-1BB的细胞上时触发Fc效应子功能，评估抗体介导抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性的细胞毒性(CDC)的能力。

4.10.1ADCC测试：

将作为靶标的活化的人T细胞和不同浓度的抗4-1BB抗体在96孔圆底平板(BD)中预孵育30分钟；然后以50:1的效应物/靶标比率加入同种异体PBMC作为效应物。将平板放置在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中6小时。通过基于LDH的细胞毒性检测试剂盒(Roche)测定靶细胞裂解。使用酶标仪(Molecular Device)读取492nm处的吸光度。

图15中的结果表明示例性抗体2.19.8-u1-3-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG1L不介导对活化的人T细胞的ADCC作用。

4.10.2CDC测试：

将作为靶标的活化的人T细胞和不同浓度的抗4-1BB抗体在96孔圆底平板(BD)中混合。然后将人补体以1:50的最终稀释度添加到每个孔中。将平板放置在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中2小时。通过CellTiter-Glo(Promega)测定靶细胞裂解。使用酶标仪(MolecularDevice)读取化学发光。

图16中的结果表明，示例性抗体(包括2.19.8-u1-3-hIgG1L、2.19.8-u1-3-hIgG4L、2.27.16-u1-1-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG4L)不介导对活化的人T细胞的CDC作用。

实施例5

抗原表位竞争结合和定位

对人4-1BB进行丙氨酸扫描实验并评估它们对抗体结合的影响。将人4-1BB上的丙氨酸残基突变为甘氨酸密码子，并将所有其他残基(除半胱氨酸残基外)突变为丙氨酸密码子。对于人4-1BB细胞外结构域(ECD)的每个残基，使用两个连续的PCR步骤进行点氨基酸替换。使用编码人4-1BB的ECD和C端His标签的pcDNA3.3-h4-1BB_ECD.His质粒作为模板，并使用一组诱变引物用于使用QuikChange闪电多位点定向诱变试剂盒(Agilenttechnologies,Palo Alto,CA)的第一步PCR。在突变链合成反应后，使用Dpn I内切酶消化亲本模板。在第二步PCR中，扩增由CMV启动子、4-1BB的胞外结构域(ECD)、His-标签和单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)聚腺苷酸化组成的线性DNA表达盒，并将其在293F细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)中瞬时表达。

将单克隆抗体包被在平板中用于ELISA结合测定。在与含有定量4-1BB突变体或人4-1BB_ECD.His蛋白质的上清液相互作用后，加入HRP缀合的抗His抗体作为检测抗体。根据对照突变体的平均值将吸光度标准化。在设定了额外的结合倍数变化的临界值(<0.75)后，鉴定了最终确定的表位残基。

基于4-1BB-4-1BBL复合物已知的结构(PDB:6BWV)分析数据。在对结合倍数改变(<0.75)和SASA(溶剂可及表面积(solvent accessiblesurface area)；≥10)设置另外的临界值后，最终确定的表位残基列在表9中。小于10的SASA值表示残基包埋在蛋白中。对于2.19.8-u1-3-IgG1L或2.19.8-u1-3-IgG4L存在12个热点残基，对于2.27.16-u1-1-IgG1L或2.27.16-u1-1-IgG4L存在15个热点残基。

因此，将表9中的所有数据绘制到人4-1BB的晶体结构上，从而进行更好的显现和比较(如图17所示)。图17显示了绘制在人4-1BB结构上的热点残基，即，抗体2.19.8-u1-3-IgG1L或2.19.8-u1-3-IgG4L(图17A)以及2.27.16-u1-1-IgG1L或2.27.16-u1-1-IgG4L(图17B)分别与人4-1BB的结合位点。数据来自表9。

表9.鉴定抗体与人4-1BB在不同位置结合的热点残基。

注：人4-1BB包含四个富含半胱氨酸的结构域。CRD1：在人4-1BB(SEQ ID NO：21)的氨基酸24至45内；CRD2：在SEQ ID NO：21的氨基酸47至86内；CRD3：在SEQ ID NO：21的氨基酸87至118内；CRD4：在SEQ ID NO：21的氨基酸119至159内；邻近的跨膜结构域(ATD)：在SEQID NO：21的氨基酸160至186内。SASA≥10。

^c倍数变化临界值<0.75。

从表9可以看出，2.19.8-u1-3-hIgG1L或2.19.8-u1-3-hIgG4L与2.27.16-u1-1-hIgG1L或2.27.16-U1-1-hIgG4L具有重叠的热点残基。它们全部包含SEQ ID NO：21的热点残基L112，T113，W136，T137，N138，V146，T151和D155。

实施例6

4-1BB抗体的体内抗肿瘤活性

6.1抗4-1BB抗体在人4-1BB敲入小鼠中的抗肿瘤功效

评估4-1BB单克隆抗体(mAbs)在人4-1BB敲入小鼠(B-h4-1BBmice,Biocytogen)中的抗肿瘤功效。对8周龄的B-h4-1BB小鼠皮下接种小鼠结肠癌MC38细胞系。当肿瘤达到50-100mm³时，基于肿瘤大小随机分组。每3天以指定剂量注射4-1BB单克隆抗体和同种型对照抗体，共给药5次。使用卡尺每周两次测量肿瘤大小直至研究终止。

图18的结果显示具有IgG1或IgG4的4-1BB抗体(包括2.19.8-u1-3-hIgG1L、2.19.8-u1-3-hIgG4L2.27.16-u1-1-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG4L)有效地抑制MC38肿瘤生长(图18A)。并且，在用2.19.8-u1-3-hIgG1L、2.19.8-u1-3-hIgG4L、2.27.16-u1-1-hIgG1L和2.27.16-u1-1-hIgG4L治疗的B-h4-1BB转基因小鼠中观察到剂量依赖性的抗肿瘤作用(图18B和18C)。

本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

序列表

<110> 无锡智康弘义生物科技有限公司

<120> 抗人4-1BB单克隆抗体及其制备方法和用途

<130> IDC196023

<150> 201810315613.2

<151> 2018-04-10

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.19.8-u1-3-hIgG1L"或"2.19.8-u1-3-hIgG4L"的CDRH1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Phe Met Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.19.8-u1-3-hIgG1L"或"2.19.8-u1-3-hIgG4L"的CDRH2

<400> 2

Tyr Ile Ser Asn Ala Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.19.8-u1-3-hIgG1L"或"2.19.8-u1-3-hIgG4L"的CDRH3

<400> 3

Asp Pro Tyr Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.19.8-u1-3-hIgG1L"或"2.19.8-u1-3-hIgG4L"的CDRL1

<400> 4

Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asp Lys Tyr Thr Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.19.8-u1-3-hIgG1L"或"2.19.8-u1-3-hIgG4L"的CDRL2

<400> 5

Gln Asp His Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.19.8-u1-3-hIgG1L"或"2.19.8-u1-3-hIgG4L"的CDRL3

<400> 6

Gln Ala Trp Asp Lys Gly Ile Val Val

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.27.16-u1-1-hIgG1L"或"2.27.16-u1-1-hIgG4L"的CDRH1

<400> 7

Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Tyr Trp Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.27.16-u1-1-hIgG1L"或"2.27.16-u1-1-hIgG4L"的CDRH2

<400> 8

Tyr Ile Tyr Asp Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Arg

1 5 10 15

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.27.16-u1-1-hIgG1L"或"2.27.16-u1-1-hIgG4L"的CDRH3

<400> 9

Ile Val Ala Ala Gly Arg Ile Asp Pro

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.27.16-u1-1-hIgG1L"或"2.27.16-u1-1-hIgG4L"的CDRL1

<400> 10

Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ile Lys Ile Val His

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.27.16-u1-1-hIgG1L"或"2.27.16-u1-1-hIgG4L"的CDRL2

<400> 11

Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser

1 5

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.27.16-u1-1-hIgG1L"或"2.27.16-u1-1-hIgG4L"的CDRL3

<400> 12

Gln Val Trp Asp Arg Arg Ser Asp His Val Val

1 5 10

<210> 13

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.19.8-u1-3-hIgG1L"或"2.19.8-u1-3-hIgG4L"的VH

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Phe Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Asn Ala Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Asp Pro Tyr Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.19.8-u1-3-hIgG1L"或"2.19.8-u1-3-hIgG4L"的VL

<400> 14

Ser Tyr Asp Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asp Lys Tyr Thr

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Gln Asp His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Lys Gly Ile Val Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 15

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.27.16-u1-1-hIgG1L"或"2.27.16-u1-1-hIgG4L"的VH

<400> 15

Gln Glu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gln

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Asp Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Glu Arg Arg Val Ala Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Val Ala Ala Gly Arg Ile Asp Pro Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "2.27.16-u1-1-hIgG1L"或"2.27.16-u1-1-hIgG4L"的VL

<400> 16

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Met Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ile Lys Ile Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Arg Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 17

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码"2.19.8-u1-3-hIgG1L"或"2.19.8-u1-3-hIgG4L"的VH的DNA序列

<400> 17

caggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactg 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactacttca tgagctggat ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggaatg ggtttcatac attagtaatg ccggtagttc caaatattat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgt gagagatcct 300

tatagtggga gttactccgg gtggttcgac ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 18

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码“2.19.8-u1-3-hIgG1L”或“2.19.8-u1-3-hIgG4L”的VL的DNA序列

<400> 18

tcctatgacc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60

acctgttctg gagatgattt gggagataaa tatactagct ggtatcagca gaagccgggc 120

cagtcccctg tattggtcgt ctatcaagat cacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccaattctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240

gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg gacaagggca ttgtggtatt cggcggaggg 300

accaaactga ccgtccta 318

<210> 19

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码“2.27.16-u1-1-hIgG1L”或“2.27.16-u1-1-hIgG4L”的VH的DNA序列

<400> 19

caggagcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cttgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcaac agtcagggtt actactggag ctggatccgc 120

cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct atgacagtgg aagtgcctac 180

tacaatccgt ccctcgagag gcgagttgcc atatcattag acacgtctaa gaaccagttc 240

tccctgaacc tgaactctgt gactgtcgcg gacacggccg tttattactg cgcgaggata 300

gtagcagctg gtcggatcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 20

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码“2.27.16-u1-1-hIgG1L”或“2.27.16-u1-1-hIgG4L”的VL的DNA序列

<400> 20

tcctatgtcc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc ccggacagac ggccaggatg 60

acctgtgggg gagacaacat tggaattaaa attgtgcact ggtaccagca gaaggcaggc 120

caggcccctg tgttggtcgt ctatgatgat aatgaccggc cctcagggat ccctgaccga 180

ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgcagccggg 240

gatgaggccg actactactg tcaggtgtgg gataggagga gtgatcatgt ggttttcggc 300

ggagggacca agttgaccgt ccta 324

<210> 21

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长人4-1BB的氨基酸序列

<400> 21

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro

20 25 30

Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile

50 55 60

Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu

100 105 110

Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln

115 120 125

Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala

165 170 175

Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

195 200 205

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

245 250 255

<210> 22

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人4-1BB细胞外结构域的氨基酸序列

<400> 22

Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn

1 5 10 15

Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser

20 25 30

Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val

35 40 45

Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp

50 55 60

Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu

65 70 75 80

Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp

85 90 95

Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro

100 105 110

Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr

115 120 125

Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro

130 135 140

Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His

145 150 155 160

Ser Pro Gln

Claims

1.分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：

(i)与选自SEQ ID NO：1和7序列之一所示的CDRH1具有至少90％序列同一性的CDRH1；

(ii)与选自SEQ ID NO：2和8序列之一所示的CDRH2具有至少90％序列同一性的CDRH2；和

(iii)与选自SEQ ID NO：3和9序列之一所示的CDRH3具有至少90％序列同一性的CDRH3；

B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：

(i)与选自SEQ ID NO：4和10序列之一所示的CDRL1具有至少90％序列同一性的CDRL1；

(ii)与选自SEQ ID NO：5和11序列之一所示的CDRL2具有至少90％序列同一性的CDRL2；和

(iii)与选自SEQ ID NO：6和12序列之一所示的CDRL3具有至少90％序列同一性的CDRL3；或

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：

(i)选自SEQ ID NO：1和7的CDRH1或与所述CDRH1在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH1；

(ii)选自SEQ ID NO：2和8的CDRH2或与所述CDRH2在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH2；和

(iii)选自SEQ ID NO：3和9的CDRH3或与所述CDRH3在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH3；

B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：

(i)选自SEQ ID NO：4和10的CDRL1或与所述CDRL1在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL1；

(ii)选自SEQ ID NO：5和11的CDRL2或与所述CDRL2在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL2；和

(iii)选自SEQ ID NO：6和12的CDRL3或与所述CDRL3在氨基酸序列上具有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL3；或

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

3.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：1或由其组成的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：2或由其组成的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：3或由其组成的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：4或由其组成的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：5或由其组成的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：6或由其组成的CDRL3。

4.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：7或由其组成的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：8或由其组成的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：9或由其组成的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：10或由其组成的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：11或由其组成的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：12或由其组成的CDRL3。

5.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：13具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；

6.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；

7.前述权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分结合至少一个以下残基：SEQ ID NO：21的L112，T113，W136，T137，N138，V146，T151或D155。

8.前述权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分结合至少一个以下残基：SEQ ID NO：21的S29，L112，T113，F125，W136，T137，N138，V146，T151，D155，L165或S170。

9.前述权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分结合至少一个以下残基：SEQ ID NO：21的A33，T35，R66，K76，N83，D105，L112，T113，R134，W136，T137，N138，V146，T151或D155。

10.前述权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其具有一种或多种以下性质：

(a)以2×10^-10M或更低的K_D结合人4-1BB，如通过SPR所检测的；

(c)以3×10^-8M或更低的K_D结合小鼠4-1BB，如通过SPR所检测的；

(d)诱导CD4⁺T细胞中细胞因子(例如IFN-γ)的产生；

(e)增强T细胞增殖；

(f)分别结合人、食蟹猴或小鼠4-1BB；

(g)与人OX40、CD40或GITR没有交叉反应性；或

(h)对活化的人T细胞没有ADCC和/或CDC作用。

11.前述权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

12.前述权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是完全人单克隆抗体。

13.前述权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是由转基因哺乳动物产生的完全人单克隆抗体。

14.权利要求13的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述转基因哺乳动物是转基因大鼠，包括具有重组免疫球蛋白基因座的转基因大鼠。

15.前述权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体与IgG的恒定区(例如，人IgG，优选人IgG1或人IgG4)融合。

16.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其与前述权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分竞争结合相同的表位。

17.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-16中任一项所定义的分离的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。

18.权利要求17的分离的核酸分子，其编码权利要求1-16中任一项所定义的分离的抗体的重链可变区，并且包含选自以下的核酸序列：

(A)编码SEQ ID NO：13或15所示的重链可变区的核酸序列；

(B)SEQ ID NO：17或19所示的核酸序列；或

19.权利要求17的分离的核酸分子，其编码权利要求1-16中任一项所定义的分离的抗体的轻链可变区并且包含选自以下的核酸序列：

(A)编码SEQ ID NO：14或16所示的轻链可变区的核酸序列；

(B)SEQ ID NO：18或20所示的核酸序列；或

20.一种载体，其包含权利要求17-19中任一项的核酸分子。

21.一种宿主细胞，其包含权利要求20的载体。

22.一种药物组合物，其包含至少一种权利要求1-16中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

23.制备权利要求1-16中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分的方法，包括以下步骤：

-在权利要求21的宿主细胞中表达权利要求1-16中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分；和

-从宿主细胞分离抗体或其抗原结合部分。

24.权利要求1-16中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分或权利要求22的药物组合物在制备用于调节受试者的免疫应答的药物中的用途。

25.权利要求24的用途，其中所述受试者中的T细胞增殖得到增强。

26.权利要求24或25的用途，其中细胞因子IFN-γ产生增加。

27.权利要求1-16中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分或权利要求22的药物组合物在制备用于治疗受试者的异常细胞生长的药物中的用途。

28.权利要求1-16中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分或权利要求22的药物组合物在制备用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的药物中的用途。

29.权利要求1-16中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分或权利要求22的药物组合物在制备用于减少受试者中的肿瘤细胞转移的药物中的用途。

30.权利要求1-16中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分或权利要求22的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病包括增殖性病症如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病的药物中的用途。

31.权利要求1-16中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分或权利要求22的药物组合物在制备用于诊断疾病包括增殖性病症如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病的诊断剂中的用途。

32.用于治疗或诊断疾病包括增殖性病症如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病的试剂盒，其包含容器，所述容器包含至少一种权利要求1-16中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分。

33.权利要求30或31的用途或权利要求32的试剂盒，其中所述癌症包括肺癌如支气管癌(例如鳞状细胞癌，小细胞癌，大细胞癌和腺癌)，肺泡细胞癌，支气管腺瘤，软骨性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；结肠癌或结肠瘤；心脏癌如粘液瘤，纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌例如骨软骨瘤，软骨瘤，软骨母细胞瘤，软骨样软骨瘤，骨样骨瘤，巨细胞瘤，软骨肉瘤，多发性骨髓瘤，骨肉瘤，纤维肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，尤因氏肿瘤(尤因氏肉瘤)和网织细胞肉瘤；脑癌例如神经胶质瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)，间变性星形细胞瘤，星形细胞瘤，少突神经胶质瘤，成神经管细胞瘤，脊索瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，脑膜瘤，垂体腺瘤，松果体瘤，骨瘤，血管母细胞瘤，颅咽管瘤，脊索瘤，生殖细胞瘤，畸胎瘤，皮样囊肿和血管瘤；消化系统中的癌症如平滑肌瘤，表皮样癌，腺癌，平滑肌肉瘤，胃腺癌，肠脂肪瘤，肠神经纤维瘤，肠纤维瘤，大肠息肉和结肠直肠癌；肝癌如肝细胞腺瘤，血管瘤，肝细胞癌，纤维板层癌，胆管癌，肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌如肾腺癌，肾细胞癌，高肾上腺瘤和肾盂的移行细胞癌；膀胱癌；血液系统癌症如急性淋巴细胞白血病(急性淋巴细胞性白血病)，急性骨髓性(髓细胞性，骨髓，成髓细胞性，骨髓单核细胞性)白血病，慢性淋巴细胞性白血病(例如Sezary综合征和毛细胞性白血病)，慢性髓细胞性(髓性，骨髓性，粒细胞性)淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，蕈样霉菌病和骨髓增殖性疾病(包括骨髓增生性疾病，如真性红细胞增多症，骨髓纤维化，血小板增多症和慢性粒细胞白血病)；皮肤癌如基底细胞癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，卡波西肉瘤和佩吉特氏病；头颈部癌症；与眼相关的癌症，如成视网膜细胞瘤和眼内黑素癌；男性生殖系统癌症如良性前列腺增生，前列腺癌和睾丸癌(例如精原细胞瘤，畸胎瘤，胚胎癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系统癌症如子宫癌(子宫内膜癌)，宫颈癌(宫颈肿瘤)，卵巢癌(卵巢肿瘤)，外阴癌，阴道癌，输卵管癌和葡萄胎；甲状腺癌(包括乳头状，滤泡状，间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌；和血液学癌症例如白血病，骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。