CN112538116A - 一组4-1bb单克隆抗体及其医药用途 - Google Patents

一组4-1bb单克隆抗体及其医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域；具体涉及一组抗4‑1BB的单克隆抗体及其医药用途。本发明通过杂交瘤技术获得了一组在激活T细胞方面有优异效果的抗4‑1BB单克隆抗体，并成功地对其进行了人源化改造。所述抗体在制备用于激活和调节4‑1BB的作用与水平以及显著增强机体免疫力的相关药物，尤其是治疗癌症相关药物方面表现出巨大的应用前景。

Description

一组4-1BB单克隆抗体及其医药用途
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗和分子免疫学领域，涉及4-1BB抗体及其用途。具体地，本发明涉及到多种4-1BB的单克隆抗体。
技术背景
4-1BB也称为CD137，属于肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF9)，是一种具有协同激活作用的受体(Vinay,et al.,(2012),Mol.Cancer Ther.11:1062–70)。最初，4-1BB被证实表达在活化的T淋巴细胞，而非静态的T淋巴细胞(Kwon,et al.,(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1963–1967)；后来发现在一些非T淋巴细胞上，例如单核细胞、中心粒细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞上也有表达(Pollok,et al.,(1993),J.Immunol.150:771-781；Vinay,et al.,(1998),Sem.Immunol.10:481-9；Vinay et al.,(2012),PLoS One 7:e50272；Melero,et al.,(1998),Cell Immunol 190:167–72)。4-1BB的配体为CD137L(或4-1BBL)，是一种TNF家族的跨膜蛋白分子，表达在活化的巨噬细胞、B细胞和树突状细胞的表面(Alderson,et al.,(1994),Eur.J.Immunol.24:2219-2227；Goodwin,et al.,(1993),Eur.J.Immunol.23:2631-2641；Pollok,et al.,(1994),Eur.J.Immunol.24:367-374；Croft,et al.,(2003),Nat.Rev.Immunol.3:609-20)。
4-1BB是一种多功能分子，交联4-1BB配体或者4-1BB激发型抗体能够快速激活T细胞表面的4-1BB，促进T细胞的增殖和活化(Vinay,et al.,(2006),J.Mol.Med.84:726–736；Wen,et al.,(2002),J Immunol.168:4897–4906；Cannons,et al.,(2001),JImmunol.167:1313-24)。4-1BB通过招募TNFR相关因子1(TRAF1)和相关因子2(TRAF2)，激活转录因子NF-κB和MAP激酶，并进一步诱导细胞的信号传递(Jang et al.,(1998),Biochemical&Biophysical Research Communications 242:613-20；Sa bbagh,et al.,(2008),J.Immunol.180:8093–8101；Saoulli,et al.,(1998),J.Exp.Med.187:1849–1862)。4-1BB能够诱导抗凋亡Bcl-2家族成员Bcl-XL、Bcl-2和Bfl1等因子的转录，阻断T细胞活化引起的凋亡(AICD)(Lee,et al.,(2003),Cellular Immunol.223:143-50；Lee,etal.,(2002),J.Immunol.169:4882–4888)。4-1BB还能够刺激T细胞产生I型细胞因子，如IL-2、IFN-γ和TNF-α等，并通过与CD28共刺激分子的协同作用减少免疫调节因子IL-4和TGF-β的产生。4-1BB通过诱导TH1型效应T细胞分化，打破细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的无反应性。4-1BB还可以通过与其配体的相互作用，促进B细胞的增殖、存活和细胞因子分泌(Zhang,etal.,(2010),J.Immunol.184:787–795)。此外，4-1BB也会增强NK细胞的杀伤作用(Kohrt,etal.,(2012),J.Clin.Invest.122:1066-1075；Houot,et al.,(2011)Trends Immunol.32:510–516)。
由于具有多种免疫调节功能，4-1BB是目前肿瘤治疗的一个热门靶点。Melero等首次报道了4-1BB抗体能够消除小鼠体内肿瘤，包括缺乏免疫原性的Ag104A肉瘤和P815肥大细胞瘤(Melero,et al.,(1997),Nat.Med.3:682-5)。Vinay等报道4-1BB激发型抗体在MCA205肉瘤、MC38结肠癌、GL261神经胶质瘤、TC1卵巢癌、J558骨髓瘤和A549等肿瘤模型中具有良好的抗肿瘤效果(Vinay DS,et al.,(2012),Mol.Cancer Ther.11:1062–70)。4-1BB抗体治疗肿瘤主要依赖于CD8+T细胞(Melero,et al.,(1997),Nat.Med.3:682-5；Wilcox,et al.,(2002),J Clin Invest 109:651–9)，在某些模型中也需要NK细胞或者树突状细胞的参与(Melero,et al.,(1998),Cell Immunol.190:167–72；Murillo,et al.,(2009),Eur.J.Immunol.39:2424–36)。4-1BB抗体能够使小鼠对肿瘤产生持久性免疫记忆反应(Yonezawa,et al.,(2016),Chin Clin Oncol 5:5-11)。4-1BB抗体单独治疗不能消除缺乏免疫原性的肿瘤细胞，如C3肿瘤和B16/D5黑色素瘤(Kimet，al.,(2001),Cancer Res.61:2031–7；Wilcox,et al.,(2002),J.Clin.Invest.109:651–9)。联合治疗能够增加4-1BB抗体的疗效，例如将4-1BB抗体与多肽疫苗(Bartkowiak,et al.,(2015),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 112:E5290–E5299)、树突状细胞疫苗(Ito,et al,(2004),Cancer Res.64:8411–8419)、化学疗法(Kim,et al.,(2008),Cancer Res.68:7264–7269)、放射疗法(Shi,et al.,(2006),Anticancer Res.26:3445–3453)或T细胞疗法(Weigelin,(2015)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 112:7551–7556)等治疗手段联合使用，可以显著提高抗肿瘤效果。此外，4-1BB抗体与其它免疫检查点抗体在肿瘤治疗方面有协同作用，包括CTLA-4抗体(Kocak,et al.,(2006),Cancer Res.66:7276–7284)、PD-1抗体(Wei et al.,(2014),Oncoimmunology 3:e28248.),CD40抗体(Uno,et al,(2006),Nat.Med.12:693–698)、以及OX40抗体(Cuadros.et al.,(2005),Int.J Cancer 116:934–943)。
目前有两款4-1BB抗体(Urelumab和Utomilumab)进入临床试验。Urelumab在黑色素瘤、肾癌和卵巢癌患者的治疗中显示出抗肿瘤活性(Sznol,et al.,(2008),J.Clin.Oncol.26(supp15):3007)，但在部分病人中出现剂量依赖的肝脏毒性副作用。相对于Urelumab，Utomilumab具有良好的安全性，但其抗肿瘤效果相对较弱。因此，研发更安全有效的4-1BB抗体，将对肿瘤的临床治疗具有重要的价值。
发明内容
本发明采用杂交瘤技术获得了一组4-1BB单克隆抗体，并成功对其进行了人源化改造。这些抗体在FcγR II(CD32)的交联作用下，能够显著促进T细胞的激活以及细胞因子的分泌。
本发明的技术方案如下：
抗人4-1BB杂交瘤抗体1A2重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、2；8H8重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4；10B2重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5、6；3F10重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：7，8；8E9重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：9、10；8A8重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：11、12；2F10重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：13、14；3A11重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：15、16。这些抗体的CDR区氨基酸序列是：1A2重链的CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：17、18、19，其轻链CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：20、21、22；8H8重链的CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：23、24、25，其轻链CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：26、27、28；10B2重链的CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：29、30、31，其轻链CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：32、33、34；3F10重链的CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：35、36、37，其轻链CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：38、39、40；8E9重链的CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：41、42、43；其轻链CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：44、45、46；8A8重链的CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：47、48、49，其轻链CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：50、51、52；2F10重链的CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：53、54、55，其轻链CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：56、57、58；3A11重链的CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：59、60、61，其轻链CDR1，CDR2，CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：62、63、64。
进一步，抗人4-1BB抗体或片段经过改造后，成为人源化抗体。
分离的核酸分子：编码上述的抗体或功能性片段。
抗人4-1BB人源化抗体8H8重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：65，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：66；人源化抗体10B2重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：67，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：68；人源化抗体3A11重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO：69，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：70；人源化抗体1A2重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：71，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：72；人源化抗体2F10重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：73，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：74。
表达载体，包含表达上述抗体的核酸分子。
药物组合物，其包含上述的抗体或其功能片段，以及药用载体
上述的抗体或其功能性片段，核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物在制备影响4-1BB免疫功能药物中的用途。
本发明获得了如下有益效果：本发明采用哺乳动物细胞表达系统制备重组4-1BB作为抗原免疫小鼠，将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后获得杂交瘤细胞。通过对大量杂交瘤细胞的多次克隆及筛选后，得到一些单克隆杂交瘤细胞株。这些杂交瘤细胞株能够产生和4-1BB特异性结合的单克隆抗体(图1、图2)，有效阻断4-1BB与4-1BB配体的结合(图3)，能够激活NF-κB信号(图4、图5)，促进Jurkat产生细胞因子IL-2(图6、图7)，能够促进人源CD4+T细胞分泌细胞因子IFN-γ(图8)。通过RT-PCR(Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction，反转录-聚合酶链式扩增)克隆编码抗体轻链和重链可变区的基因，采用互补决定簇嫁接(complementarity-determining regions graft，CDR-graft)方法构建人源化抗体。体外功能试验表明，这些人源化的4-1BB抗体能特异性结合4-1BB蛋白(图9、图10)，在FcγRII(CD32)介导的交联作用下，激活NF-κB信号通路(图11),促进Jurkat分泌细胞因子IL-2(图12)，刺激人外周血淋巴细胞(PBMC)分泌IFN-γ，并且该刺激活性显著高于阳性对照抗体(图13)。本专利中阳性对照抗体的序列来自专利EP2614082B1(MOR7480.1,Utomilumab)。以上实验结果表明，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包含本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段的偶联物，在制备应用于刺激T淋巴细胞活性、促进T淋巴细胞表达IL-2和IFN-γ的药物、以及在预防和治疗或者辅助治疗肿瘤的药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1：用ELSIA测定4-1BB杂交瘤抗体与4-1BB-hFc蛋白结合的EC50；
图2：用FACS测定4-1BB杂交瘤抗体与Jurkat-4-1BB细胞结合的EC50；
图3：用FACS测定4-1BB杂交瘤抗体阻断4-1BB配体与Jurkat-4-1BB细胞结合的IC50；
图4：4-1BB杂交瘤抗体与293T-CD32a细胞交联对NF-κB信号通路的激活作用；
图5：4-1BB杂交瘤抗体对293T-CD32b细胞交联对NF-κB信号通路的激活作用；
图6：4-1BB杂交瘤抗体与293T-CD32a细胞交联对Jurkat-4-1BB分泌IL-2的刺激作用；
图7：4-1BB杂交瘤抗体与293T-CD32b细胞交联对Jurkat-4-1BB分泌IL-2的刺激作用；
图8：4-1BB杂交瘤抗体对人CD4+T细胞分泌IFN-γ的刺激作用；
图9：用ELISA测定人源化4-1BB抗体与4-1BB蛋白结合的EC50；
图10：用FACS测定人源化4-1BB抗体与Jurkat-4-1BB细胞结合的EC50；
图11：4-1BB人源化抗体与293T-CD32b细胞交联对NF-κB信号通路的激活作用；
图12A-B：人源化4-1BB抗体与293T-CD32b交联对Jurkat-4-1BB分泌IL-2的刺激作用，图A为未交联，图B为交联；
图13：人源化4-1BB抗体对人PBMC细胞分泌IFN-γ的刺激作用；
具体实施方式
实施例1
4-1BB杂交瘤抗体的制备
用人4-1BB的胞外区与小鼠Fc的融合蛋白(4-1BB-mFc)作为抗原，与等体积完全弗氏佐剂(Sigma,Cat No:F5581)充分乳化后，经皮下免疫6-8周龄Balb/c小鼠(购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司)，抗原免疫量为50μg/只。随后每隔2周，用相同剂量的抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma,Cat No:F5506)充分乳化后，经皮下免疫小鼠三次。三次免疫后测定小鼠血清效价，融合前3天经腹腔进行加强免疫。以PEG Hybri-Max(Sigma,Cat No:7181)作为融合剂，将小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞按照4:1的比例混合。将融合后的细胞加入到96孔板中(1×105细胞/孔)，每孔含有0.1mL 1×HAT(Invitrogen,Cat No:21060-017)培养基。在第3天加入0.1mL HT(Invitrogen,Cat No:11067-030)培养基，在第7天吸掉96孔板中的培养基，补加0.2mL新鲜的HT培养基。在第9天，收取上清液进行ELISA和FACS检测。
用4-1BB-ECD-hFc包被96孔ELISA板(Corning,Cat No:9018)，置室温过夜，用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次后，加入封闭缓冲液(PBS+1％BSA(Sigma,Cat No:V90093))孵育1小时；洗涤96孔板3次；加入杂交瘤上清液孵育1小时，洗涤3次；每孔加入100μL 1:400倍稀释的羊抗鼠IgG二抗(Thermo,Cat No:31432)，室温孵育1小时后洗涤3次；每孔加入100μL TMB(北京百奥赛博，Cat No:ES-002)显色3分钟，再加入100μL/孔的终止液(2N H2SO4)终止反应，用Tecan Spark酶标仪测定各样品的OD450信号。
取50μl在上述ELISA检测中呈阳性的杂交瘤上清与50μl Jurkat-4-1BB细胞混合(1×105细胞/孔)加入到U形底96孔板中孵育1小时，用FACS缓冲液(PBS+3％FCS)离心洗涤2次后加入1:400倍稀释的PE标记羊抗鼠(Biolegend,Cat No:405307)二抗，孵育30分钟，经FACS缓冲液洗涤后，用BD C6流式细胞仪检测Jurkat-4-1BB细胞的PE信号。
采用报告基因方法筛选4-1BB激发型抗体。在96孔板中加入50μl(5×104细胞/孔)Jurkat-4-1BB-NFkB-luc细胞以及50μl在上述ELISA检测中呈阳性的杂交瘤上清，再加入293T-CD32a或者293T-CD32b细胞(2×104细胞/孔)，混合后置37℃孵育4小时。加入25μlBright Glo(Promega,Cat No:E2620)室温孵育5分钟，用Tecan Spark酶标仪测定各样品的化学发光信号。
用有限稀释法，对能够刺激4-1BB报告基因信号的杂交瘤进行亚克隆，随后再重复采用ELISA和FACS方法进行检测筛选，获得阳性杂交瘤单克隆。将阳性单克隆杂交瘤置50mL无血清培养基中(Invitrogen,Cat No:12045-076)培养8-9天后，离心收取上清液。用Protein A亲和层析纯化单克隆抗体，纯化后的抗体样品经超滤离心管(Millipore,CatNo:ACS500024)换液浓缩后，用BCA方法测定蛋白浓度，用鳌试剂(厦门鲎试剂生物科技股份有限公司)检测抗体样品的内毒素含量。用ELISA和FACS检测纯化的抗体样品与4-1BB的结合、对4-1BB与其配体(4-1BBL)结合的阻断作用、及其激活4-1BB报告基因的活性，如表1-5和图1-5所示。候选的4-1BB杂交瘤抗体能够与4-1BB蛋白结合，抑制4-1BB与其配体4-1BBL的结合，并能够激活下游的信号通路。
表1.用ELISA测定杂交瘤抗体和人4-1BB的结合作用
Figure BDA0002855937210000061
表2.用FACS测定杂交瘤抗体和人4-1BB的结合作用
Figure BDA0002855937210000062
表3.用FACS测定杂交瘤抗体对4-1BB与其配体4-1BBL结合的阻断作用
Figure BDA0002855937210000063
Figure BDA0002855937210000065
表4.用报告基因方法测定杂交瘤抗体与293T-CD32a细胞对NF-κB的作用
表5.用报告基因方法测定杂交瘤抗体与293T-CD32b细胞对NF-κB的作用
Figure BDA0002855937210000064
Figure BDA0002855937210000071
实施例2：
4-1BB杂交瘤抗体对T淋巴细胞系Jurkat-4-1BB分泌细胞因子的影响
在96孔板中，每孔加入50μL 2×106/ml Jurka-4-1BB细胞，50μl 4×105/ml 293T-OKT3细胞和50μl 4×105/ml 293T-CD32a或293T-CD32b细胞以及50μL不同浓度的4-1BB抗体(起始浓度为20μg/mL,10倍系列稀释)，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中孵育48小时，收集上清液，用IL-2ELISA试剂盒(R&D Systems,Cat No:DY202)检测细胞因子浓度，如图6，7所示，所选的4-1BB抗体能够显著激活IL-2的表达。
实施例3
4-1BB杂交瘤抗体对人CD4+T细胞和PBMC细胞分泌细胞因子的影响
在50mL无菌离心管中加入淋巴细胞分离液Histopaque(Sigma,Cat No:1077-1)，然后加入等体积的新鲜血液，在室温用1500rpm离心30min。样品在离心管中分成四层，从上至下分别为血浆层，白细胞层，淋巴细胞分离液和红细胞层。将中间的白细胞层收集到新的离心管中，加入5倍体积的洗涤缓冲液(PBS+3％FBS)混匀洗涤，于1500rpm离心10min，共重复洗涤3次，用洗涤缓冲液重悬细胞并计数。根据说明书，使用CD4+T细胞分离试剂从PBMC中分离出CD4+T细胞。提前一天，将2μg/mL Goat anti-mouse Fc(Jackson,Cat:115-005-071)和2μg/mL Goat anti-human Fc(Jackson,Cat No:109-005-008)包被在Corning 96孔平底板，室温过夜。第二天用PBS洗涤后加入Blocking buffer(PBS+2％BSA)，37℃孵育60分钟，PBS洗涤，加入含40ng/mL OKT3(eBioscience,Cat No:16-0037-85)的PBS，置37℃孵育90分钟，PBS洗涤。CD4+T细胞计数后，用完全培养基RPMI1640+10％FCS重悬CD4+T细胞(1×106细胞/mL)。在96孔板中，每孔加入100μL CD4+T细胞以及100μL不同浓度的4-1BB抗体(起始浓度为20μg/mL，10倍系列稀释)，将96孔细胞培养板置于37℃,5％CO2培养箱中孵育48-72小时，收集上清液。用IFN-γELISA试剂盒(R&D Systems,Cat No:DY285)检测细胞因子的浓度。如图8所示，与阳性对照抗体Utomilumab相比，本发明中列举的4-1BB抗体1A2,2F10,3A11,3F10,8A8,8E9,8H8,10B2具有更强的促进CD4+T细胞分泌IFN-γ的活性。
实施例4
4-1BB抗体可变区基因的克隆
用TRIzon(Cwbiotech,Cat No:CW0580)裂解4-1BB单克隆杂交瘤细胞株，提取杂交瘤细胞的总RNA。用HiFi Script cDNA合成试剂盒(Cwbiotech,Cat No:CW2569)将杂交瘤细胞的RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，用简并引物通过PCR方法(Kettleborough,et al.，(1993)Eur.J.Immunol.23:206-211；Strebe,et al.,(2010)Antibody Engineering 1:3-14)，扩增抗体的重链和轻链的可变区基因。将PCR扩增产物连接到T/A载体后，转化DH5a感受态细胞，涂板并置37℃过夜培养。从培养板上挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，测定抗体的基因序列。根据抗体的基因序列，分析其互补决定簇(CDR)和骨架区。抗体的重链和轻链的可变区基因序列和氨基酸序列见表6。
表6.4-1BB杂交瘤抗体序列编号
Figure BDA0002855937210000081
Figure BDA0002855937210000091
Figure BDA0002855937210000101
Figure BDA0002855937210000111
Figure BDA0002855937210000121
Figure BDA0002855937210000131
实施例5
人源化4-1BB抗体的构建
对4-1BB杂交瘤抗体10B2、8H8、3A11、1A2和2F10进行了人源化改造
采用互补决定区嫁接法来进行4-1BB抗体的人源化。首先，在IMGT数据库中分别搜寻与鼠源抗体的轻、重链可变区同源性最高的人胚系抗体(germline antibody)序列。10B2抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV2-29*02，重链可变区人源化选取IGHV3-30*03。8H8抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV4-1*01，重链可变区人源化选取IGHV7-4-1*02。3A11抗体轻链人源化选取IGKV1-39*01，重链人源化选取IGHV3-15*01。1A2抗体轻链人源化选取IGKV3-11*01，重链人源化选取IGHV1-69-2*01。2F10抗体轻链人源化选取IGKV3-11*01，重链人源化选取IGHV1-69-2*01。保留鼠源抗体的CDR区，将鼠源抗体的框架区(framework)序列用人胚系抗体的框架区序列置换。其次，建立鼠源抗体的结构模型，逐个对比人源抗体与相应鼠源抗体结构模型中的每个不同氨基酸位点，如果在框架区的某个位点采用人的氨基酸序列没有导致CDR区域空间结构的破坏或改变，则该位点使用人的氨基酸序列，否则在该位点使用对应的鼠源序列(即回复突变为鼠源序列)。根据结构模拟，将人源化抗体框架区的部分氨基酸回复突变为鼠源序列。
表7.4-1BB人源化抗体序列编号
Figure BDA0002855937210000141
Figure BDA0002855937210000151
10B2抗体人源化重链的第93位Ala回复突变为Thr。10B2抗体人源化轻链的第2位Ile回复突变为Val，第4位Met回复突变为Val。8H8抗体人源化重链的第2位Val回复突变为Ile，第30位Thr回复突变为Ser。8H8抗体人源化轻链的第4位Met回复突变为Leu，第68位Gly回复突变为Arg。3A11抗体人源化重链的第28位Thr回复突变为Ile，第30位Ser回复突变为Asn，第48位Val回复突变为Ile，第49位Gly回复突变为Ala，第93位Thr回复突变为Asn，第94位Thr回复突变为Trp。3A11抗体人源化轻链的第49位Tyr回复突变为Phe，第66位Gly回复突变为Ala，第69位Thr回复突变为Asn，第71位Phe回复突变为Tyr。1A2抗体人源化重链的第2位Val回复突变为Ala，第27位Tyr回复突变为Phe，第28位Thr回复突变为Asn，第29位Phe回复突变为Ile，第30位Thr回复突变为Lys，第48位Met回复突变为Ile，第67位Val回复突变为Ala。1A2抗体人源化轻链的第68位Gly回复突变为Arg。2F10抗体人源化重链的第27位Tyr回复突变为Phe，第28位Thr回复突变为Asn，第29位Phe回复突变为Ile，第30位Thr回复突变为Glu，第48位Met回复突变为Ile，第67位Val回复突变为Ala，第93位Ala回复突变为Thr。2F10抗体人源化轻链的第68位Gly回复突变为Arg。
合成编码10B2、8H8、3A11、1A2和2F10的人源化抗体轻链和重链的核酸序列，并插入到表达载体pcDNA3.1。用抗体轻链和重链表达质粒各0.1mg共转染200毫升293细胞(细胞密度为1×106)，在37℃振摇培养6天，离心收集上清液，用Protein A纯化人源化抗体，纯化后的人源化抗体用于活性检测。
实施例6
采用ELISA和FACS检测纯化的人源化抗体样品与4-1BB的结合，用报告基因方法测定人源化4-1BB抗体对NF-κB信号通路的激活作用。具体方法参考实施例1。人源化抗体hu8H8、hu10B2、hu3A11、hu1A2和hu2F10的测定结果见表8-10和图9-11。结果表明，人源化抗体能够与4-1BB结合，在293T-CD32b细胞交联下，人源化抗体能够显著激活NF-kb信号通路。
表8.用ELISA测定4-1BB人源化抗体与4-1BB的结合作用
Figure BDA0002855937210000161
表9.用FACS测定4-1BB人源化抗体与4-1BB的结合作用
Figure BDA0002855937210000162
表10.用报告基因测定与293T-CD32b细胞交联的4-1BB人源化抗体对NF-κB信号通路的激活作用
Figure BDA0002855937210000163
实施例7
4-1BB人源化抗体对Jurkta-4-1BB分泌细胞因子的影响。
将4-1BB人源化抗体与293T-OKT3和293T-CD32b共培养48小时，收细胞上清，检测IL-2的表达量，具体测定方法参考实施例2。结果如图12A，在没有交联(Uncrosslinking)条件下,人源化4-1BB抗体以及阳性对照抗体Utomilumab均不能激活IL-2的表达。如图12B，在293T-CD32b交联情况下，与阳性对照抗体Utomilumab相比，人源化抗体hu8H8,hu10B2,hu3A11,hu1A2,hu2F10具有更强的促进Jurkat细胞分泌IL-2的活性。
实施例8
4-1BB人源化抗体对人CD4+T细胞和PBMC分泌细胞因子的影响。
将4-1BB人源化抗体与人PBMC共培养72小时，收集上清液，检测上清液中IFN-γ的浓度，具体测定方法参考实施例3。结果如图13，人源化的4-1BB抗体能够显著促进PBMC分泌IFN-γ，且人源化抗体hu10B2、hu3A11、hu1A2、以及hu2F10的活性显著优于阳性对照抗体Utomilumab。
实施例9
人源化4-1BB抗体的亲和力检测
用Biacore测定各人源化抗体样品与4-1BB的结合。测定方法包括如下步骤：以氨基偶联的方式将anti-human IgG固定于CM5芯片上，接着以10μL/min的流速捕获人源化抗体。切换流速到30μL/min，将不同浓度的带组氨酸标签的4-1BB抗原(100nM,50nM,25nM,12.5nM,6.25nM,3.125nM等)依次流经样品通道和参比通道，结合时间为3min，解离时间为10min。最后用pH1.7的甘氨酸缓冲液再生芯片。
对序列中潜在的糖基化位点、异构化位点和脱酰胺化位点进行分析并做突变改造。对hu10B2重链第53位Asp(D)、第54位Ser(S)，hu10B2轻链第27D位Asn(N)、第27E位Ser(S)和hu3A11轻链重链第61位Asp(D)、第62位Ser(S)做点突变，突变后用293F细胞表达并纯化，用Biacore测定突变后抗体的亲和力。如表11-13所示,人源化抗体hu8H8,hu10B2,hu3A11和hu2F10对4-1BB的亲和力优于阳性对照抗体Utomilumab，而人源化抗体hu1A2与4-1BB解离的速度也显著慢于阳性对照抗体。
表11.人源化4-1BB抗体与4-1BB抗原的亲和力
Figure BDA0002855937210000181
表12.人源化3A11及其突变抗体与4-1BB抗原的亲和力。
Figure BDA0002855937210000182
表13.人源化10B2及其突变抗体与4-1BB抗原的亲和力。
Figure BDA0002855937210000183
Figure BDA0002855937210000191
上述实施例1-9表明，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包含本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段的偶联物，在制备应用于刺激T淋巴细胞活性、促进T淋巴细胞表达IL-2和IFN-γ的药物、以及在预防和治疗或者辅助治疗肿瘤的药物方面具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 东大生物技术（苏州）有限公司
<120> 一组4-1BB单克隆抗体及其医药用途
<130> 2020
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1A2重链可变区 氨基酸序列
<400> 1
Glu Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Ala Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Gln Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Asn
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Gly Ser Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ala Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1A2轻链可变区 氨基酸序列
<400> 2
Glu Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Arg Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Val
85 90 95
Glu Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H8重链可变区 氨基酸序列
<400> 3
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Val Leu Thr Met Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H8轻链可变区 氨基酸序列
<400> 4
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ile Ile Asp Gly Ser
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Ser Cys Leu Gln Thr Val
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10B2重链可变区 氨基酸序列
<400> 5
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Pro Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gly Gly Arg Phe Val Tyr
100 105 110
Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser
115 120 125
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10B2轻链可变区 氨基酸序列
<400> 6
Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly
1 5 10 15
Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Thr Asn Ser
20 25 30
Tyr Gly His Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Ile Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Thr Val Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr His Gln Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
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<212> PRT
<213> 人工
<223> 3F10重链可变区 氨基酸序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Phe Gly Phe Thr Phe Thr His His
20 25 30
His Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Ser Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工
<223> 3F10轻链可变区 氨基酸序列
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Ile Trp
35 40 45
Ile Ser Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Asn Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8E9重链可变区 氨基酸序列
<400> 9
Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Arg Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Ile Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工
<223> 8E9轻链可变区 氨基酸序列
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Val Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp His Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 11
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<212> PRT
<213> 人工
<223> 8A8重链可变区 氨基酸序列
<400> 11
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Ala Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ser Ala Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Pro Tyr Tyr Thr Asn Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8A8轻链可变区 氨基酸序列
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Gly Asn Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Gly Glu Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<223> 2F10重链可变区 氨基酸序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Glu Thr Pro Ser Asn Lys Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Tyr Gly Ser Asn Phe Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<223> 2F10轻链可变区 氨基酸序列
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ala Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Val Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Leu Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ile
100 105 110
<210> 15
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3A11重链可变区 氨基酸序列
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Asn Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asn Thr Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ile Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Asn Trp Asp Glu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3A11轻链可变区 氨基酸序列
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Ala Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Ile Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1A2重链CDR1区 氨基酸序列
<400> 17
Asp Thr Tyr Met Asn
1 5
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1A2重链CDR2区 氨基酸序列
<400> 18
Arg Ile Ala Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Gln Phe Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1A2重链CDR3区 氨基酸序列
<400> 19
Ser Tyr Gly Ser Asn Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1A2轻链CDR1区 氨基酸序列
<400> 20
Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr Asp Asn Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1A2轻链CDR2区 氨基酸序列
<400> 21
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1A2轻链CDR3区 氨基酸序列
<400> 22
Gln Gln Ser Val Glu Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H8重链CDR1区 氨基酸序列
<400> 23
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H8重链CDR2区 氨基酸序列
<400> 24
Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H8重链CDR3区 氨基酸序列
<400> 25
Val Leu Thr Met Val Met Asp Tyr
1 5
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H8轻链CDR1区 氨基酸序列
<400> 26
Arg Ala Ser Glu Ile Ile Asp Gly Ser Gly Asn Ser Phe Val His
1 5 10 15
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H8轻链CDR2区 氨基酸序列
<400> 27
Arg Thr Ser Thr Leu Glu Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H8轻链CDR3区 氨基酸序列
<400> 28
Leu Gln Thr Val Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10B2重链CDR1区 氨基酸序列
<400> 29
Thr Phe Gly Leu His
1 5
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10B2重链CDR2区 氨基酸序列
<400> 30
Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Met Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10B2重链CDR3区 氨基酸序列
<400> 31
Gly Asp Pro Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gly Gly Arg Phe Val Tyr Ala Leu
1 5 10 15
Asp Phe
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10B2轻链CDR1区 氨基酸序列
<400> 32
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Thr Asn Ser Tyr Gly His Thr Tyr Leu Ser
1 5 10 15
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10B2轻链CDR2区 氨基酸序列
<400> 33
Gly Ile Ser Ile Arg Phe Ser
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10B2轻链CDR3区 氨基酸序列
<400> 34
Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Trp Thr
1 5
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3F10重链CDR1区 氨基酸序列
<400> 35
His His His Ile Asn
1 5
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3F10重链CDR2区 氨基酸序列
<400> 36
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Ser Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3F10重链CDR3区 氨基酸序列
<400> 37
Gly Gly Leu Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3F10轻链CDR1区 氨基酸序列
<400> 38
Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu His
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3F10轻链CDR2区 氨基酸序列
<400> 39
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3F10轻链CDR3区 氨基酸序列
<400> 40
Gln Gln Tyr Ser Gly Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8E9重链CDR1区 氨基酸序列
<400> 41
Gly Tyr Trp Met His
1 5
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8E9重链CDR2区 氨基酸序列
<400> 42
Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8E9重链CDR3区 氨基酸序列
<400> 43
Trp Arg Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Ile Ala Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8E9轻链CDR1区 氨基酸序列
<400> 44
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8E9轻链CDR2区 氨基酸序列
<400> 45
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8E9轻链CDR3区 氨基酸序列
<400> 46
Gln Asn Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8A8重链CDR1区 氨基酸序列
<400> 47
Asn Tyr Gly Val His
1 5
<210> 48
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8A8重链CDR2区 氨基酸序列
<400> 48
Ala Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ser Ala Ala Phe Met Ser
1 5 10 15
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8A8重链CDR3区 氨基酸序列
<400> 49
Asn Pro Tyr Tyr Thr Asn Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8A8轻链CDR1区 氨基酸序列
<400> 50
Arg Ala Ser Gly Asn Ile Gly Asn Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8A8轻链CDR2区 氨基酸序列
<400> 51
Asn Gly Glu Thr Leu Ala Asp
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8A8轻链CDR3区 氨基酸序列
<400> 52
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 2F10重链CDR1区 氨基酸序列
<400> 53
Asp Thr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 2F10重链CDR2区 氨基酸序列
<400> 54
Lys Ile Tyr Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 2F10重链CDR3区 氨基酸序列
<400> 55
Gly Tyr Gly Ser Asn Phe Phe Asp Cys
1 5
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<223> 2F10轻链CDR1区 氨基酸序列
<400> 56
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Asp Asn Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 2F10轻链CDR2区 氨基酸序列
<400> 57
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 2F10轻链CDR3区 氨基酸序列
<400> 58
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3A11重链CDR1区 氨基酸序列
<400> 59
Thr Asn Ala Met Asn
1 5
<210> 60
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3A11重链CDR2区 氨基酸序列
<400> 60
Arg Ile Arg Ser Lys Ile Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 61
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3A11重链CDR3区 氨基酸序列
<400> 61
Asp Glu Ala Tyr
1
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3A11轻链CDR1区 氨基酸序列
<400> 62
Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3A11轻链CDR2区 氨基酸序列
<400> 63
Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3A11轻链CDR3区 氨基酸序列
<400> 64
Gln Gln Tyr Trp Ser Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 65
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体8H8重链可变区氨基酸序列
<400> 65
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Leu Thr Met Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 66
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体8H8轻链可变区氨基酸序列
<400> 66
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ile Ile Asp Gly Ser
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr Val
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 67
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体10B2重链可变区氨基酸序列
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Pro Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gly Gly Arg Phe Val Tyr
100 105 110
Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体10B2轻链可变区氨基酸序列
<400> 68
Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Thr Asn Ser
20 25 30
Tyr Gly His Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Ile Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr His Gln Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 69
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体3A11重链可变区氨基酸序列
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asn Thr Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ile Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Asn Trp Asp Glu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 70
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体3A11轻链可变区氨基酸序列
<400> 70
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Ala Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Ile Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 71
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体1A2重链可变区氨基酸序列
<400> 71
Glu Ala Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Ala Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Gln Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Gly Ser Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 72
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体1A2轻链可变区氨基酸序列
<400> 72
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Val
85 90 95
Glu Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 73
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体2F10重链可变区氨基酸序列
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Tyr Gly Ser Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 74
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体2F0轻链可变区氨基酸序列
<400> 74
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (9)

1.一组4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链的CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：17、23、29、35、41、47、53、59中的一种；所述重链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：18、24、30、36、42、48、54、60中的一种；所述重链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：19、25、31、37、43、49、55、61中的一种；所述轻链的CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：20、26、32、38、44、50、56、62中的一种；所述轻链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：21、27、33、39、45、51、57、63中的一种；所述轻链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：22、28、34、40、46、52、58、64中的一种；其中所述抗原结合片段的重链和轻链包含分别跨越所述抗体的重链和轻链的CDR1到CDR3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一组4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15中的一种；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO： 2、4、6、8、10、12、14、16中的一种。
3.根据权利要求2所述的一组4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链和轻链经过人源化；所述人源化后的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：65、67、69、71、73中的一种；所述人源化后的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：66、68、70、72、74中的一种。
4.根据权利要求3所述的一组4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源化抗体序列中潜在的糖基化位点、异构化位点和脱酰胺化位点进行分析并做突变改造；将hu10B2重链第53位Asp(D)、第54位Ser(S)，hu10B2轻链第27D位Asn(N)、第27E位Ser(S)和hu3A11轻链重链第61位Asp(D)、第62位Ser(S)做点突变。
5.权利要求1-4任一项所述的一组4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段在制备如下药物中的用途：与4-1BB结合的药物、调节4-1BB活性或4-1BB水平的药物、调节4-1BB对机体免疫激活的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
6.一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其中，所述单克隆抗体为权利要求1-4任一项所述的一组4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、细胞因子受体片段、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种。
7.权利要求6中所述的单克隆抗体偶联物在制备如下药物中的用途：阻断4-1BB与4-1BB配体结合的药物，调节4-1BB活性或4-1BB水平的药物、调节4-1BB对机体免疫激活的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
8.权利要求6中所述的单克隆抗体偶联物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
9.表达权利要求1-4任一项所述的一组4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子、表达载体、宿主细胞在制备如下药物中的用途：与4-1BB结合的药物、调节4-1BB活性或4-1BB水平的药物、调节4-1BB对机体免疫激活的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
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