CN1357009A - 人源化的特异于人4－1bb的抗体和含有它的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异地结合蛋白质4－1BB的人源化抗体。这种抗体可通过将针对人4－1BB的小鼠单克隆抗体的互补性决定区移植到人抗体的剩余部分上,并通过进一步的氨基酸替换来制备。此外,可制备含有这种人源化抗体的药物组合物并用于治疗自身免疫疾病来抑制免疫反应。本发明的人源化抗体对人4－1BB具有很高的亲和性,并与人抗体具有序列相似性。本发明的药物组合物可用于治疗自身免疫疾病并充当人体内的免疫抑制剂而不产生任何副作用。

Description

人源化的特异于人4-1BB的抗体和含有它的药物组合物
发明领域
本发明涉及特异地结合4-1BB受体蛋白，优选人的4-1BB受体蛋白的人源化抗体。这种人源化的抗体可被用作诊断试剂或被用于配制给病人施用的药物组合物。
发明的背景
免疫系统变化的多样性，并且由于B细胞和T细胞随机地特异表达各种成份，该成份特异的与许多包括自身在内的组分结合。因此，体内必须建立自身-免疫耐受机制以区别自体和非自体的决定簇以避免自身反应。但所有的机制都有被破坏的危险。自我-识别机制也不例外，已经证明许多疾病是由于自身免疫产生大量的自身抗体和自身反应T细胞而引起的。
至少有30多种疾病是自身免疫引起的或与自身免疫有关。此类疾病有类风湿性关节炎，寻常天疱疮，肾小球肾炎，恶性贫血，甲状腺炎和系统性红斑狼疮。在韩国，每一百人中就有一人患类风湿性关节炎。
目前主要的治疗手段是组织移植以替换患病的器官。在大多数病例中，移植成功的最大障碍是对移植组织的免疫反应适应。当移植的组织含有有核细胞时，T细胞立即与经常引起移植器官排斥的高度多态性主要组织相容性基因复合体分子(MHC)反应。供体和受体MHC类型的配型会增加移植的成功率。只有当供体和受体有亲缘关系，才可能有相当好的配型。但在这种情况下，其它遗传位点的差异也会引起排异反应。
对于自身免疫病和移植排异，人们可以利用或控制免疫系统，抑制不希望的免疫反应。目前临床上常用几种不同的免疫抑制剂，如氨甲喋呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、强的松、环胞A、FK506(tacrolimus)，抗淋巴细胞球蛋白(ALG)和抗胸腺球蛋白(ATG)。最近，已经利用抗体高度的特异性用于治疗，以抑制特异免疫反应。该类抗体的靶分子可以分成两组，第一组包括在淋巴细胞表面表达的分子，如CD3，CD4，IL-2R，CDw52和ICAM-1。另一组主要是细胞因子，如TNF-α，和IL-6。其中一些抗体是有效的，已作为药物出售。
然而，目前使用的免疫抑制剂都有一个共同的问题，即与免疫反应无关的细胞或正常细胞都会受到这些药物的影响。会引起不可避免的严重的副作用。因此，需要一种对活化的免疫细胞是特异的，具有最好的免疫抑制活性而没有有害副作用的免疫抑制剂。
虽然鼠类的单克隆抗体已被广泛用作诊断试剂，但已经证实只有极少数情况下可以用它们进行治疗。以下三种原因可能限制其应用；第一，多次证明鼠类的单克隆抗体对于人类一般会引起人抗这些分子的免疫反应。人抗小鼠抗体(HAMA)反应针对两个不同的区域。抗可变区反应称作抗-个体基因型反应，该反应能阻断抗原与鼠类抗体结合的活性。抗恒定区的反应为抗-同型反应，该反应阻断抗体的效应子功能。HAMA反应不仅阻断了作为新药物的抗体功能，而且也与鼠类抗体形成免疫复合物，结果引起一些副作用，并降低了抗体的半衰期。第二，在体内，即使没有形成免疫复合物，鼠类抗体的半衰期也比人的抗体半衰期短。第三，鼠类抗体Fc区产生的效应子功能比人的抗体弱或没有。上述所有因素都会降低鼠类单克隆抗体的疗效，而且在人类免疫治疗中普遍存在的问题也是由于异源性的单克隆抗体引起的。
为了避免鼠类单克隆抗体固有的不需要的特性，我们利用基因工程的手段将鼠类抗体余人抗体区域重组，开发了“人源化的抗体”。采用这种替换策略是由于免疫系统对自身抗原会产生免疫耐受性，很难对人的抗原如细胞表面分子产生人的抗体。这种人源化的抗体含有互补性决定区(CDR)区域，只有极少数几个氨基酸是鼠类的，而其余的全部是人的抗体的结构。
发明概述
4-1BB是活化的T细胞表面表达的一类附带分子(Kwon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1963(1989)；Pollok等，J.Immunol.151：771(1993))，是与肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关的一种膜蛋白(Malett等，Immunol.Today 12：220(1991))。4-1BB分子量为55KD，是一个均一的二聚体。此外，4-1BB与细胞内蛋白激酶p561ck结合。已显示4-1BB蛋白介导细胞外向细胞内的信号传导途径。(Kim等，J.Immunol.151：1255(1993))。
人的4-1BB基因已经从人外周血活化的T-细胞mRNA制备的cDNA文库中分离出来(Goodwin等，Eur.J.Immunol.23：2631(1993))。人的4-1BB氨基酸序列与小鼠4-1BB 60％同源(Kwon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1963(1989))，表明这些序列是高度保守的。氨基酸序列分析表明，4-1BB与CD40，CD27，TNFR-I，TNFR-II，Fas和CD30一起属于神经生长因子超家族(Alderson等，Eur.J.Immunol.24：2219(1994))。当单克隆抗体与小鼠T-细胞表面表达的4-1BB结合时，抗-CD3 T-细胞活性增加许多倍(Pollok等，J.Immunal.150：771(1993))。
4-1BB与几种抗原递呈细胞所表达的高亲和性配体结合，例如巨噬细胞和活化的B细胞(Pollok等，J.Immunol.150：771(1993))；Schwarz等，Blood 85：1043(1995))。4-1BB与其配体的相互作用产生共刺激信号而引起T细胞的活化和生长(Goodwin等，Eur.J.Immunol.23：2631(1993)；Alderson等，Eur.J.Immunol.24：2219(1994)；Hurtado等，J.Immuno.155：3360(1995)；Pollok等，Eur.J.Immunol.25：488(1995)；DeBenedette等，J.Exp.Med.181：985(1995)。这些观察提示4-1BB在调节由T细胞介导的免疫反应中起着很重要的作用(Ignacio等，Nature Med.3：682(1997))。
发明者已经用杂交瘤的方法产生了小鼠单克隆抗体，该抗体是特异地与活化的T细胞表面表达的人的4-1BB(h4-1BB)结合(韩国公开专利号no.96-37064)。为了寻找只对活化的T淋巴细胞特异而没有任何副作用的免疫抑制剂，本发明者利用只抗活化的T细胞表达的4-1BB的小鼠单克隆抗体构建了人源化的单克隆抗体(韩国公开专利号no.96-37064)。这种人源化的单克隆抗体与4-1BB有很高的亲和性。将这种人源化的抗4-1BB单克隆抗体用于非-人类的灵长类治疗没有产生抗-抗体反应，相反却产生了很强的免疫抑制活性。
本发明的一个目的是提供一种人源化的单克隆抗体，该抗体特异与4-1BB结合，特别是与人的4-1BB(h4-1BB)有很高的亲和性。本发明的人源化抗体与人的4-1BB具有很高的亲和性，而且其序列与人的抗体十分相似。由于与本发明抗体特异结合的4-1BB受体蛋白好像参与免疫系统的激活，因此该产品可以有效地用于治疗自身免疫病或作为一种免疫抑制剂抑制移植排异反应。由于本发明的抗体十分类似于人的抗体，因此可以作为药物用于治疗而没有相反的副作用，如人抗小鼠抗体反应。
本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，它含有人源化的抗h4-1BB单克隆抗体。该药物组合物用于治疗自身免疫病或作为一种免疫抑制剂、防止移植排异是十分有效的。如类风湿性关节炎可能是由于4-1BB受体的异常活性造成的，这种组合物治疗类风湿性关节炎就特别有效。
本发明的另一目的是提供一种诊断试剂，用于诊断由于4-1BB受体蛋白过高或过低活性而引起的免疫机能障碍。
附图简要说明
图1，人源化抗人4-1BB抗体，Hz4B4-1，Hz4B4-2重链(VH)和轻链(VL)可变区的氨基酸序列比较。这些序列与小鼠单克隆抗体4B4-1-1，人的抗体VHM17750和人的抗体VL X82934的氨基酸序列进行了比较。
图2，PCR方法合成编码人源化抗体Hz4B4-1的VH和VL基因时所用的引物定位以及人源化的定位。
图3，表达质粒pRc-Hz4B4-k-gs的构建及其限制性酶切图谱。
图4，表达质粒pCI-Hz4B4-H的构建及其限制性酶切图谱。
图5，PCR方法合成编码人源化抗体Hz4B4-2的VH和VL基因时所用的引物定位以及人源化的定位。
图6a-6i经卵白蛋白免疫和用人源化抗体Hz4B4-1治疗时，狒狒体内OVA-特异IgG含量的变化。
图7a-7d，图7a和7b表明正常人和类风湿关节炎病人外周血中与4B4单克隆抗体反应的细胞与CD4+和CD8+T细胞的比例，图7c和7d表示正常人和类风湿关节炎病人外周血和滑膜液中与4B4单克隆抗体反应的细胞与CD4+和CD8+T细胞的比例。
发明的详细说明
本发明体现在两种从小鼠单克隆抗体4B4-1-1制得的人源化单克隆抗体，这种小鼠单克隆抗体与人的4-1BB特异结合(韩国公开专利号no.96-37064)。这些人源化单克隆抗体被用于人体实验。
第一种人源化的抗体Hz4B4-1的制备是将小鼠单克隆抗体4B4-1-1可变区的抗原结合区，互补性决定区(CDR)移植。为了增加人源化抗体与抗原结合的亲和性，将类似于小鼠抗体框架结构区(FR)的几个氨基酸残基进行置换，使该抗体与原小鼠单克隆抗体有几乎完全相同的抗原结合亲和性。人源化的抗体Hz4B4-1是由轻链可变区，氨基酸序列是SEQID NO：1和重链可变区，氨基酸序列是SEQ ID NO：2所组成。
为了使Hz4B4-1与人的抗体更相似，将小鼠框架结构区(FR)和互补性决定区(CDR)(参见，pp.24-28 of Hood等，“Immunology”，second ed.c.1984，by Benjamin/Cumming Publishing Co.，Inc.，Menlo Park，CA，esp.图.2-6和2-10和PP.288-296 of Paul，“Fundamental Immunology”，third ed.c.1993 by Raven Press，Ltd.，New York，NY.，esp.表2)的另外几个氨基酸也用人抗体的相应几个位点进行了替换，从而构建了人源化的抗体Hz4B4-2。Hz4B4-2与抗原结合的亲和性比Hz4B4-1高5倍，比原小鼠单克隆抗体高7倍。人源化抗体Hz4B4-2轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，重链可变区氨基酸序列是SEQ ID NO：4。
含有编码本发明的人源化抗体Hz4B4-1轻链的基因的表达质粒pRc-Hz4B4-Mok-gs和编码重链基因的表达质粒pCI-Hz4B4-MoH的细菌已经于1998年10月27保存在韩国科学和技术研究所，生命科学研究所基因库，编号分别为KCTC 0537BP和KCTC 0536BP。
生产Hz4B4-1抗体的细胞系MH200-3和生产Hz4B4-2抗体的SB500-23细胞系，也于1998年10月27保存在韩国科学和技术研究所，生命科学研究所基因库，编号分别为KCTC 0540BP和KCTC0541BP。
本发明的人源化抗体对人的4-1BB具有很高的亲和性，而且其序列与人的抗体十分相似。因此该人源化的抗体可以用于治疗自身免疫病，和作为有效的免疫抑制剂而不会产生任何副作用。
为了这一目的，本发明的人源化抗体可被用作治疗自身免疫性疾病的药物组合物中的活性成分，也可被用作免疫抑制剂。这种药物组合物可被配制成口服或非口服剂型，以便药物立即或缓慢释放。该组合物可含有通常用于制药的非活性成分，如稀释剂，填充剂，崩解剂，甜化剂，润滑剂，调味剂。给药的最好方式是静脉注射，或者是大丸剂注射(bolusinjection)或点滴，或者胶囊释放。典型的用于静脉内注射的剂型使用生理盐水作为稀释剂。
本发明的抗体的Fab或Fab’部分也可以用作治疗的活性组分。这些抗体片段的制备方法是本领域公知的技术。
病人服用的剂量与所用的特定的抗体，体重，年龄，性别，健康程度，饮食，给药时间，药物的剂型，给药的途径和所治疗的疾病有关。常规的剂量是0.1mg/kg/天-100mg/kg/天，最常用的剂量是1mg/kg/天-50mg/kg/天。
本发明的组合物也可包括使用说明书，用以描述可使用这种抗体作为治疗剂的临床指症，所用的剂量，服用方式和/或治疗病人时的禁忌。
本发明的抗体也可以用于诊断检验。本发明的诊断检测的一个优选的形式是定量样品中在其表面表达h4-1BB的细胞。计数携带特定的表面标记的细胞的方法是本领域公知的技术。例如可使用荧光标记活化细胞分类。另一种诊断检验的形式是对标本中h4-1BB蛋白进行定量分析。还有许多这类检验，例如，固定抗原或“三明治”式的酶联免疫吸附试验。
本发明通过下面的实施例加以说明，这些实施例是为了说明本发明而不是为了限定本发明的。
实施例1：人源化抗体Hz4B4-1的设计
为了构建人源化的抗体，将小鼠单克隆抗体4B4-1-1(韩国公开申请号no.96-37064)的轻链和重链可变区的氨基酸序列与基因数据库中人的序列进行比较。选择出与小鼠4B4-1-1抗体重链序列十分相似的人重链可变区序列M17750(Dersimonian，H.等，J.Immunol.，139，2496(1987))以及与小鼠4B4-1-1抗体轻链非常相似的人的轻链可变区序列X82934(Esposito，G.等，Arch.Vitrol.，142，601(1997))。为了将小鼠单克隆抗体4B4-1-1人源化，将小鼠抗体的CDR区转移到人的抗体上。同时将人源化的轻链FR区的10个关键氨基酸残基和人源化的重链FR区的11个关键氨基酸残基用小鼠4B4-1-1抗体相应的氨基酸所替换。
如上所述设计的人源化抗体Hz4B4k-1轻链可变区和人源化重链可变区Hz4B4h-1分别具有被称作SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列。这些序列与小鼠单克隆抗体4B4-1-1轻链可变区序列(SEQ ID NO：38)和重链可变区序列(SEQ ID NO：39)进行比较，然后再与人的抗体轻链可变区序列X82934(SEQ ID NO：40)和重链可变区序列M17750(SEQID NO：41)进行比较。排列如图1所示。
实施例2：编码人源化抗体Hz4B4-1基因和表达质粒的构建
制备的引物包括了期望替换的区域中的碱基序列。这些引物是：KXA(SEQ ID NO：5)，KXB(SEQ ID NO：6)，KXC(SEQ ID NO：7)，KXD(SEQ IDNO：8)，KXE(SEQ ID NO：9)，KXF(SEQ ID NO：10)，KXG(SEQ ID NO：11)，KXH(SEQ ID NO：12)，AMH(SEQ ID NO：13)，BMH(SEQ ID NO：14)，CMH(SEQ ID NO：15)，DMH(SEQ ID NO：16)，EMH(SEQ ID NO：17)，FMH(SEQ ID NO：18)，GMH(SEQ ID NO19)，HMH(SEQ ID NO：20)。
上述引物中，引物KXA(SEQ ID NO：5)至KXH(SEQ ID NO：12)被用于构建编码人源化κ-轻链可变区的基因。引物AMH(SCQ ID NO：13)至HMH(SEQ ID NO：20)被用于构建编码人源化重链可变区的基因。图2由引物的定位表明在人源化抗体Hz4B4-1中的人源化区域，包括编码VL(SEQ ID NO：42)和VH(SEQ ID NO：43)的基因。为了便于比较，图2列出了小鼠单克隆抗体4B4-1-1轻链可变区(SEQ ID NO：44)和重链可变区(DEQ ID NO：45)的基因序列。
上述引物被用于以编码小鼠单克隆抗体4-1BB(韩国公开专利号no.96-37064)轻链和重链可变区的DNA为模板进行聚合酶链反应(PCR)。产物通过常规PCR重组方法连接，形成完整的VL和VHcDNA。
人源化的VL的PCR产物用HindIII酶切，Klenow酶平端化，然后再用BglII酶切。将编码VL的PCR产物插入到pBluescriptTM质粒中，该PCR产物合成时，引物为HKD(SEQ ID NO：22)和Ryu-93(SEQ ID NO：48)，模板为含有质粒pAcS2-CK(Jin等，Virus Research，38：269-277(1995))的人VL(HCk)。如此构建的质粒pBS-Ck用SpeI酶切，Klenow酶平端化，然后再用BglII酶切，从而构建了含有人源化VL的pBS-Vk-Ck质粒。
为将人源化的VL插入到表达载体，将含有EPO基因的HindIII-SalI片段从质粒pcDNA-EPO-dE1-gs(韩国专利申请no.97-76923)中切出，然后用从质粒pBS-Vk-Ck中得到的含有NotI-SalI片段的人源化VL cDNA替换。由此得到的质粒被称为pRc-Hz4B4-k-gs。表达质粒pRc-Hz4B4-k-gs的构建及其酶切图谱的详细说明如图3所示。
为了构建重链，将用类似的方法制得的VH的PCR产物用NotI和NheI酶切。然后将编码VH的PCR产物cDNA插入到pBluescriptTM质粒中，该PCR的模板DNA为含有人抗体VH基因的质粒pAcS2-CH(Jin等，Virus Research，38：269-277(1995)，引物为HHCD(SEQ ID NO：21)和Ryu-101(SEQ ID NO：49)，从而构建了pBS-Cr1质粒。将pBS-Cr1质粒用NotI和NheI酶切后，又构建了pBS-Vh-Cr1质粒。为了将编码人源化重链基因插入到表达载体中，pBS-Vh-Cr1质粒用NotI酶切，用Klenow酶平端化，再用SalI酶切，然后插入到质粒pCI-neo的XhoI-SalI位点，得到pCI-Hz4B4-H质粒。图4详细说明了pCI-Hz4B4-H质粒的构建及其限制性酶切图谱。
从每种质粒得到的编码人源化轻链和重链基因的碱基序列通过DNA序列分析进行了证实。在表达质粒中人源化轻链和重链基因是与人巨细胞病毒(HCMV)启动子连接的。
实施例3：人源化抗体Hz4B4-1的表达及细胞的筛选
在含10％透折的牛血清(FBS)的GDMEM培养基中5％CO2，37℃条件下培养的CHO-K1细胞(ATCC CCL61)，接种到直径为6cm的培养皿中，得到5×105细胞。GDMEM培养基含DMEM(Gibco)，4.5g/L葡萄糖，15mg/L酚红，1mM丙酮酸钠，1.75g/L碳酸氢钠，500μm天门冬酰胺，30μm腺苷，30μm鸟苷，30μm胞苷，30μm尿苷，10μm胸腺嘧啶核苷和非必需氨基酸(GIBCO)。从实施例2制备的2.5μg的pRc-Hz4B4-k-gs质粒和2.5μg的pCI-Hz4B4-H质粒合并，用0.3mlOPTI-MEM ITM(GIBCO)稀释，同时用0.3ml的OPTI-MEM ITM稀释15μl的LipofectamineTM(GIBCO)，然后混合，放置15分钟。
预先培养好的细胞用OPTI-MEM ITM洗3次。然后将上步制备的质粒-LipofectamineTM混合物均匀地加到细胞中。细胞在5％CO2，37℃下培养6小时。然后将培养基换成3ml含10％透析的牛血清的GDMEM培养基，继续培养48小时。在培养基中，在37℃加入3ml 0.25％胰酶(GIBCO)，反应3分钟，离心(1,000×g，5分钟)。将得到的细胞接种到96孔板，每孔2×103细胞。48小时后，将5μM甲硫氨酸硫代酰胺(methionine sulfoxamine，MSX)加到含10％透析的牛血清的GDMEM中，将细胞在5％CO2，37℃进行培养。每隔4天换一次培养基，连续培养2周。
检测每个存活细胞克隆产生抗体的能力。进行使用偶联到辣根过氧化物酶上(HRP)的羊抗人IgG(Sigma)(Park等，Hybridoma，15，435-441，1996)的ELISA三明治检测，得到产生抗体的克隆。在这些克隆中，有5个克隆(A6B，A9A，B1E 212A，A7B)产生很高的抗体。将这5个克隆在含10％透析的牛血清的GDMEM中培养。向每个培养物种加入100、200、350、500和1000μM的MSX，然后检测细胞生长最好而且产生抗体量最高的克隆并将其分离出来。产生抗体的量最高的3个克隆示于表1。表1克隆              MSX(μM)的浓度       产生抗体的量(μg/106细胞/天)A6B-200-2         200                  11.3MH200-2           200                  12.2MH200-3           200                  16.2
实施例4：人源化抗体Hz4B4-1的分离和纯化
从实施例3中得到的MH200-3克隆的细胞在T175培养瓶中，于无血清培养基(CHO-S-SFM II，GIBCO)5％CO2，37℃下培养。收集这种条件培养的培养液，经过蛋白G-Sepharose亲和柱(Pharmacia)，用0.1M的甘氨酸(pH2.7)将结合到柱上的抗体洗脱下来，用1M Tris(PH9.0)中和，然后用PBS缓冲液(pH7.0)透析。纯化的抗体经10％ SDS-PAGE电泳分析，可以观察到55KD(重链)和约25KD(轻链)的二条带，表明人源化的抗体已被纯化。
实施例5，人源化抗体Hz4B4-1与抗原结合的亲和性
测定了小鼠单克隆抗体4B4-1-1和人源化抗体与抗原结合亲和性并用BIAcoreTM检测(Pharmacia)进行了比较。用10mM醋酸缓冲液稀释兔抗小鼠IgG(Sigma)和羊抗人IgG(Fc-特异的)，然后偶联到Dextran CM-5sensor chip(Pharimacia)。加1M乙醇胺终止反应。用HEPES缓冲液(HBS)将小鼠单克隆抗体，4B4-1-1和人源化的抗体，Hz4B4-1稀释至浓度为50μg/ml。偶联的抗体以100频率单位结合(R-U)，25μg/ml的4-1BB抗原以10μl/分的流速加入，使其结合5分钟。然后以同样的流速用HBS缓冲液洗脱5分钟，使其解离。用BIA计算软件测定结合速率，解离速率和相应的速率常数。Kon、Koff和kd值测定结果如表2所示。表2人源化抗体Hz4B4-1与抗原结合的亲和性
抗体 Kon(M-1S-1) Koff(S-1) Kd(M)
小鼠单克隆抗体4B4-1-1 1.16×104 1.54×10-6 1.33×10-10
人源化抗体Hz4B4-1 5.00×104 4.36×10-6 8.72×10-11
上述结果表明，人源化抗体Hz4B4-1与抗原结合和解离的速度比小鼠的抗体高，抗原结合亲和性(kd)比小鼠抗体高约1.5倍。实施例6，人源化抗体Hz4B4-2的设计
为了获得比Hz4B4-1更人源化的抗体，将轻链CDR1的1个氨基酸残基和小鼠FR的8个氨基酸残基用相应的人的氨基酸残基进行替换。同时，将人源化的重链CDR2的4个氨基酸，小鼠FR的8个氨基酸残基用相应的人抗体的氨基酸残基进行替换。如上所述，新构建的人源化轻链Hz4B4k-2和重链Hz4B4h-2的氨基酸序列分别是SEQ ID NOS：3和4。图1排列出所有这些序列：小鼠单克隆抗体4B4-1-1 VL(SEQ ID NO：38)和VH(SEQ ID NO：39)，人抗体VL X82934(SEQ ID NO：40)和VH M17750(SEQ ID NO：41)，和人源化抗体序列Hz4B4-1(SEQ ID NOS：1和2)。实施例7编码人源体抗体Hz4B4-2基因及其表达质粒的构建
合成的引物包括了设计需要替换的碱基序列，这些引物是：MOKA(SEQ ID NO：23)，MOKB(SEQ ID NO：24)，MOKC(SEQ ID NO：25)，MOKD(SEQ ID NO：26)，MOKE(SEQ ID NO：27)，MOKF(SEQ ID NO：28)，MOKG(SEQ ID NO：29)，MOKH(SEQ ID NO：30)，MOHA(SEQ ID NO：31)，MOHB(SEQ ID NO：32)，MOHC(SEQ ID NO：33)，MOHD(SEQ ID NO：34)，MOHE(SEQ ID NO：35)，MOHF(SEQ ID NO：36)，MOHG(SEQ ID NO：37)。
上述引物中，从MOKA(SEQ ID NO：23)至MOKH(SEQ ID NO：30)是用于构建编码人源化κ-轻链可变区基因的引物。从MOHA(SEQ IDNO：31)至MOHG(SEQ ID NO：37)是用于构建编码人源化重链可变区基因的引物。此外，HMH(SEQ ID NO：20)也是用于构建编码人源化重链可变区基因的引物。图5表明Hz4B4-1的人源化区域和Hz4B4-1的VL基因(SEQ ID NO：42)和VH基因(SEQ ID NO：43)。
上述引物中的MOK*系列是以Hz4B4-1抗体的轻链基因为模板，合成编码人源化抗体Hz4B4k-2轻链基因。上述引物中的MOH*系列是以Hz4B4-1抗体的重链基因为模板，合成VH基因，然后用常规重组PCR方法使抗体进一步人源化。合成了编码VL(Hz4B4k-2，SEQ ID NO：46)和VH(Hz4B4h-2，SEQ ID NO：47)基因。将上述得到的Hz4B4k-2 DNA用XbaI和Bgl II酶切后，插入到Hz4B4-1轻链表达载体pRC-Hz4B4-k-gs的XbaI/Bgl II位点。构建了表达Hz4B4-2轻链的质粒pRc-Hz4B4MoK-gs。
对于重链来说，将Hz4B4h-2 DNA用XhoI和NheI酶切，然后插入到重链表达载体pCI-Hz4B4-H的XhoI/ NheI位点。从而构建了表达人源化抗体Hz4B4-2重链的质粒pCI-Hz4B4-MoH。
通过DNA序列分析证实了来自每种质粒的编码人源化轻链和重链的基因的碱基序列。实施例8：人源化抗体Hz4B4-2的表达及细胞筛选
如实施例3所述，CHO-K1细胞用pRc-Hz4B4-Mok-gs和pCI-Hz4B4-MoH质粒转染。将转化的细胞在含25μM甲硫氨酸硫代酰胺(methionine sulphoximine)的GDMEM培养基中于37℃ 5％ CO2培养2周。分离有抗性的克隆，然后用三明治ELISA法检测产生的抗体。在这些克隆中，大量产生SB的克隆在含10％透析牛血清的GDMEM培养基中培养，加入100、200、350、500和1000μM的MSX。将生长最好和在500μM MSX时产生最大量抗体的克隆分离出来。这些克隆产生的抗体大约是3μg/106细胞/天。实施例9：人源化抗体Hz4B4-2的分离和纯化
如实施例4所述，将上述SB500的细胞培养在无血清的培养基中。然后收集这种条件培养的培养液经过蛋白G-Sepharose亲和柱(Pharmacia)。纯化后的抗体经10％SDS-PAGE电泳鉴定，可以看到约55KD(重链)和约25KD(轻链)的二条蛋白带，表明这些人源化的抗体已被纯化。实施例10：人源化抗体Hz4B4-2的抗原结合亲和性
测定纯化的人源化抗体Hz4B4-2的抗原结合亲和性是按实施例5所用的BIAcoreTM方法(Pharmacia)进行的。结果如表3所示。表3人源化抗体Hz4B4-2与抗原结合的亲和性
抗体 kon(M-1s-1) koff(s-1) Kd(M)
小鼠单克隆抗体4B4-1-1 1.16×104 1.54×1016 1.33×10-10
人源化抗体Hz4B4-1 5.00×104 4.36×10-6 8.72×10-11
人源化抗体Hz4B4-2 1.17×104 2.14×10-6 1.83×10-11
如表3所示，Hz4B4-1抗原结合亲和性(Kd)比小鼠单克隆抗体4B4-1-1高1.5倍。人源化抗体Hz4B4-2比小鼠单克隆抗体的抗原结合亲和性高7.3倍。本发明的人源化的抗体Hz4B4-1和Hz4B4-2具有我们所希望的与人的抗体相同的亲和性。实施例11：实验结果——人源化抗体的免疫反应和免疫抑制效应
A.狒狒的免疫反应和人源化抗体Hz4B4-1的施用
使用了Southwest Foundation for Biomedical Research(San Artonio，Texas)的7-8岁雄性和雌性狒狒(P.anubis)，体重12-15kg。将狒狒分成3组，每组2只雄性，1只雌性，在标准的饲养动物条件下饲养。每只动物肌肉注射氢氧化铝佐剂(Sigma)配制的1mg OVA进行免疫。设开始OVA-免疫时为0周，6周后，用OVA(1mg，PBS配制)进行第二次免疫。人源化抗体(或PBS，对照组)的第一次注射与第一次OVA免疫同时进行(0周)，随后分别在1，2，3，6，7，8，9周给予注射人源化抗体或PBS。第1组的3只狒狒(对照组)静脉注射10ml PBS。而第2和第3组用人源化的抗体Hz4B4-1进行治疗，该抗体是从实施例4中获得，分别以1或4mg/kg体重给予治疗。在-1.5周，0周和每隔一周收集血清标本直至第10周。
B.宿主体液免疫反应的评价
通过ELISA测定抗-OVA和IgM水平。用浓度为500ng/孔的OVA包被ImmunomaxisorpTM板(Nunc InterMed，Rockilde，Denmark)。板用1％牛血清白蛋白封闭后，将从步骤1收集的血清标本进行一系列的2倍稀释，从1/32稀释开始，向每孔中加入0.1ml。室温孵育4小时后，用碱性磷酸酶(AP)偶联的兔抗猴IgG(Sigma)或AP偶联的羊抗人IgM(Sigma)检测结合的IgG和IgM。每孔加0.1ml偶联剂，在上述温度下孵育，然后用自动微量板测定仪在A405波长下测定光吸收(MolecularDevices Corp.，Menlo Park，California)。IgG和IgM滴度测定是以最高稀释度时在A405的光吸收，应分别是本底的3倍或5倍。
用ELISA法定量测定血清中总的IgG或Hz4B4-1的含量。稀释的血清样品如上所述加到包被了羊抗人IgG(150ng/孔)或GST-4-1BB(100ng/孔)的板上，在上述所用的温度下孵育4小时。温浴后，每孔加入AP-偶联的羊抗人IgG(Sigma)，用P-硝基苯磷酸盐显色，在自动微量测定仪在A405波长下测定光吸收。结果如表4和图6a-6i所示。每个样品的总IgG或Hz4B4-1的含量是分别参考人的IgG或纯化的Hz4B4-1制备的标准曲线计算的。
表4
实验动物No Hz4B4-1剂量(mg/kg) 7周和0周时OVA-特异的IgG的滴度比率 7周和0周时OVA-特异的IgM的滴度比率 7周和1周时血清总IgG浓度的比率 1周时血清中Hz4B4-1的浓度(μg/ml)
A1 0 64 2 1.13 -
A2 0 16 1 1.02 -
A3 0 32 1 1.05 -
B1 1 2 1 0.96 6.66
B2 1 128 1 1.06 0.42
B3 1 2 1 1.01 3.85
C1 4 4 2 1.09 25.74
C2 4 1 0.5 1.16 10.14
C3 4 2 1 1.09 14.49
对照组中血清的抗OVA IgG水平显著地增加。在第7周时滴度最高，第2次OVA免疫一周后，A1、A2和A3狒狒抗体滴度比0周时滴度分别高64-，16-和32倍(表4和图6a、6b、6c)。相比之下，在Hz4B4-1治疗的狒狒中，OVA-特异抗体反应被明显抑制。在第2组中，Hz4B4-1治疗的剂量为1mg/kg，3只狒狒中有2只(B1和B3)也表现出抑制作用。在第7周时，滴度是0周时的2倍(表1，图6d、6e和6f)。但在B2狒狒中没有检测到这种抑制，而在第7周时，其滴度比0周时高128倍。在第3组中，Hz4B4-1治疗浓度为4mg/kg，在所有的3只狒狒中都有这种抑制作用。C1、C2和C3狒狒中滴度分别增加4，1和2倍(表1和图6g，6h和6I)。
在所有的动物中，抗OVA IgM滴度都没有明显增加，无论它们是否经Hz4B4-1处理，表明用Hz4B4-1处理都没有影响可检测水平的IgM的产生。综上所述，这些数据表示，一种对OVA(一种T-细胞依赖的抗原)的体液无反应状态，由于Hz4B4-1的治疗而被诱导出来。这一点也可以通过测定血清中Hz4B4-1的浓度来进一步证实。在所有的狒狒中，第一周时，血清中Hz4B4-1的浓度是最高的。但在B2狒狒(其没有表现出OVA——特异的IgG抑制反应)中，其血清中Hz4B4-1的浓度比用相同剂量治疗的B1和B3明显降低(表1)。
比较了每只狒狒在0周和7周时总IgG含量。如表1所示，总的IgG变化很小，而不论是否用Hz4B4-1治疗。此外，用Hz4B4-1治疗过程中，流式细胞仪分析每份血清标本中B和T细胞的数量和比例也没有明显的改变。综上所述，这些数据表明经Hz4B4-1治疗所引起的这种免疫系统无反应是抗原-特异性的，而不是由于全部的免疫抑制。C.4-1BB阳性T细胞分析
为了评价4-1BB分子在临床上的重要性，用4B4单克隆抗体通过FACS分析法分析了类风湿性关节炎病人(RA)的T淋巴细胞上这些分子的表达。PBMC是从正常志愿者或类风湿病人肝素抗凝的静脉血中制备的，而滑膜液细胞是从类风湿病人滑膜液中得到的。5×105 PBMC或关节滑膜液细胞与5μl藻红蛋白(PE)标记的抗人CD4或者PE标记的抗人CD8的小鼠单克隆抗体(Immune Source，Los  Altos，California)在一种含有DMEM(1％BSA和0.005％ NaNH3)的染色缓冲液中，于4℃在避光条件下孵育30分钟。温浴之后，用染液缓冲液洗细胞，然后与5μl FITC-标记的4B4单克隆抗体在染色缓冲液中于4℃孵育30分钟。通过流式细胞仪分析表达4-1BB的T淋巴细胞的百分率。通过FACStar PlusTM细胞计数仪(Becton Dicknson & Co.Mountain View，California)分析T淋巴细胞上4-1BB分子的表达。
比较了41例类风湿关节炎病人与13例正常志愿者的外周血(PBMC)T淋巴细胞中这些分子的表达。结果如图7a和7b所示。正常志愿者的CD4或CD8 T淋巴细胞与4B4单克隆抗体的反应很低或不能观察到：CD4+，＜0.5％；CD8+，＜1.2％。而相比之下，一些类风湿关节炎病人T淋巴细胞CD4+，或CD8+表现对4B4单克隆抗体的反应明显增强。在CD4+T细胞的情况下，41例病人有18例反应速率超过1％，峰值达7.5％。在CD8+T细胞中，38例病人中有17例的反应速率超过了2％，最大值是15％。
类风湿性关节炎特征为滑膜炎。受影响的滑膜组织的是淋巴细胞和血浆的浸润。这种疾病是由对一些诱发关节炎的因子响应的T淋巴细胞诱发的，T淋巴细胞在类风湿性关节炎病人的发病机制中起了重要的作用，表明T淋巴细胞在类风湿性关节炎病人滑膜液中是处于活化状态(G.S.Firestein，p.851 in“Etiology and Pathogenesis of Rheumatoid Arthrisis”，5thed.，W.N.Kelley等eds.，c.1997 by W.B.Saunders，Philadelphia，PA)。因此，将13例类风湿性关节炎病人滑膜液的T淋巴细胞中4-1BB分子的表达与相同的病人的外周血T淋巴细胞中4-1BB分子的表达进行比较，结果如图7c和7d所示。滑膜液中的CD4+和CD8+T淋巴细胞与4B4单克隆抗体比外周血中的反应性更强；13例类风湿性关节炎病人中8～9例的CD4+或CD8+的亚类超过了正常的2倍。图7c和7d中，在两个圆点之间的每一条线代表从相同的病人得到了相应的PBMC和SFC。这些发现提示4-1BB的表达可能与类风湿性关节炎的发病过程有关。
本发明人没有局限于任何一种理论，推测Hz4B4-1的这种免疫抑制效应可能有两种互不排斥的机制。首先，该抗体可能干扰了在T细胞活化中起重要作用的4-1BB/4-1BBL的相互作用。第二，抗体可能通过补体-依赖的细胞毒性和抗体-依赖的细胞毒性消除表达4-1BB的T细胞。在许多由T细胞介导的自身免疫病的病例中，自身抗原的确定较难，或是由于变化太大而无法控制这些抗自身抗原的免疫反应。由此看来，在患自身免疫病的病人中，功能的阻断和/或活化的T细胞的消除(在患有自体免疫疾病的患者中，其中的大部分可能是自体抗原特异性的)，将有可能成为减轻疾病的一种途径。本发明者已经发现，类风湿性关节炎病人PBMC和滑膜液的大部分T细胞表达4-1BB，提示4-1BB可能是对类风湿性关节炎的抗体介导的治疗中理想的靶标，因为，仅仅活化的T细胞，可能大部分的病理性T细胞，才表达4-1BB。在这方面，与其它共刺激分子如CD40L相比，4-1BB较长的表达时间(超过72小时)，可能是另一个用抗体靶击4-1BB的有利因素。除了类风湿性关节炎，也可以用Hz4B4-1治疗其它T细胞介导的自身免疫病和移植排斥。
本发明说明书包括后附的序列表，其中有49个核酸或氨基酸序列。本文中引用的专利文献和科学文献全部引入本文作为参考。
微生物国际保藏证明
保藏人 洪孝贞
地址 韩国，大田广域市
保藏日 1998年10月27日
保藏号 KCTC 0536BP
微生物分类命名 大肠杆菌DH5α/pCI-HZ4B4-MOH
国际保藏单位名称 韩国典型培养物保藏中心
微生物国际保藏证明
保藏人 洪孝贞
地址 韩国，大田广域市
保藏日 1998年10月27日
保藏号 KCTC 0537BP
微生物分类命名 大肠杆菌DH5α/pRC-HZ4B4-MOK-gs
国际保藏单位名称 韩国典型培养物保藏中心
微生物国际保藏证明
保藏人 洪孝贞
地址 韩国，大田广域市
保藏日 1998年10月27日
保藏号 KCTC 0540BP
保藏人命名名称 MH200-3
国际保藏单位名称 韩国典型培养物保藏中心
微生物国际保藏证明
保藏人 洪孝贞
地址 韩国，大田广域市
保藏日 1998年10月27日
保藏号 KCTC 0541BP
保藏人命名名称 SB500-23
国际保藏单位名称 韩国典型培养物保藏中心
                      序列表<110>株式会社LG化学<120>人源化的特异于人4-1BB的抗体和含有它的药物组合物<130>PC91146/LKY<150>KR 1998-49177<151>1999-05-11<160>49<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>107<212>蛋白质<213>人工序列<220><223>人源化抗体Hz4B4-1的轻链的可变区<400>1Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Ser Pro Gly1               5                  10                  15Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
         20                  25                  30Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
     35                  40                  45Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
 50                  55                  60Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Pro65                  70                  75                  80Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly Hi s Ser Phe Pro Pro
             85                  90                   95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        100                 105<210>2<211>119<212>蛋白质<213>人工序列<220><223>人源化抗体Hz4B4-1的重链的可变区<400>2Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala1               5                  10                  15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile
     35                  40                  45Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
 50                  55                  60Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
        100                 105                 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    115<210>3<211>107<212>蛋白质<213>人工序列<220><223>人源化抗体Hz4B4-2的轻链的可变区<400>3Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1               5                  10                  15Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
         20                  25                  30Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
     35                  40                  45Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
 50                  55                  60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65                  70                  75                  80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro
             85                  90                  95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
        100                 105<210>4<211>119<212>蛋白质<213>人工序列<220><223>人源化抗体Hz4B4-2的重链的可变区<400>4Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1               5                  10                  15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
     35                  40                  45Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Ser Gln Lys Phe
 50                  55                  60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
        100                 105                 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    115<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物KXA<400>5actaagcttc atcagacagg cagggga                                 27<210>6<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物KXB<400>6tggagacaca gactgggtgg ctggagactg ggtcatcaca atgtcccc          48<210>7<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物KXC<400>7acccagtctg tgtctccagg agaaagagtc accctttcct gcagggcc          48<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物KXD<400>8agactggcca ggtttttgtt gataccagtg                                    30<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物KXE<400>9caaaaacctg gccagtctcc aaggcttctc atc                                33<210>10<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物KXF<400>10ttcaggttcc acactgctga tggtgagagt gaaatctgac cc                     42<210>11<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物KXG<400>11agcagtgtgg aacctgaaga ttttggagtg tattactgt                            39<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物KXH<400>12aggcagatct tttgatttct agcttggt                                       28<210>13<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物AMH<400>13attagcggcc gccaccatgg gatggagcta tatc                                34<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物BMH<400>14ttcagcccca gactgcacca gttggacctg gga                                  33<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物CMH<400>15cagtctgggg ctgaagtggt gaagcctggg gct                                  33<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物DMH<400>16tccaggggcc tgcttcaccc agtgcat                                         27<210>17<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物EMH<400>17aagcaggccc ctggacaagt ccttgag                               27<210>18<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物FMH<400>18caggctgctg agctccatgt aggctgtgct cgcggatttg tctacagt       48<210>19<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物GMH<400>19atggagctca gcagcctgag atctgaggac acggcggtct attactgt       48<210>20<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HMH<400>20tatagctagc tgaagagaca gtgaccagag t                                   31<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HHCD<400>21atatgctagc accaagggcc catcggtc                                       28<210>22<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HDK<400>22atatagatct gtggctgcac catctgtc                                       28<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKA<400>23ccgctctaga actagagctt c                                             21<210>24<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKB<400>24cagagaaagg gttggtggag actgggtcat c                                  31<210>25<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKC<400>25accaaccctt tctctgtctc caggagaaag a                                  31<210>26<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKD<400>26cgctaatgga ctggctggcc ctgca                                     25<210>27<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKE<400>27agccagtcca ttagcgacta cttac                                     25<210>28<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKF<400>28tggtgagagt gaaatcggtc cctgatccac tgccactgaa cctagcgggg atccc    55<210>29<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKG<400>29gatttcactc tcaccatcag cagtctggaa cctgaagatt ttgctgtgta ttac     54<210>30<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKH<400>30aggcagatct tttgatttcc accttggtgc ctccaccg                           38<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOHA<400>31gccgactagt ctcgaggccg ccacc                                         25<210>32<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOHB<400>32actgaagccc caggcttctt cacttcagc                                     29<210>33<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOHC<400>33agcctggggc ttcagtgaag gtgtcctgca                                    30<210>34<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOHD<400>34aaggcgttgt ccaggggcct ggcgcaccca gtg                                33<210>35<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOHE<400>35ccctggacaa cgccttgagt ggatgggaga gatt                               34<210>36<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOHF<400>36acgcgtccct ggaacttctg ggagtagtta gtatgaccgt t                  41<210>37<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOHG<400>37agttccaggg acgcgtgaca atcactgtag acaaatccgc g                  41<210>38<211>107<212>蛋白质<213>人工序列<220><223>小鼠单克隆抗体4B4-1-1的轻链可变区<400>38Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly1               5                  10                  15Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
         20                  25                  30Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
     35                  40                  45Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
 50                  55                  60Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro65                  70                  75                  80Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro
             85                  90                  95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        100                 105<210>39<211>119<212>蛋白质<213>人工序列<220><223>小鼠单克隆抗体4B4-1-1的重链可变区<400>39Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1               5                  10                  15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile
     35                  40                  45Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
 50                  55                  60Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
        100                 105                 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
    115<210>40<211>107<212>蛋白质<213>人工序列<220><223>人抗体(X82934)的轻链可变区<400>40Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1               5                  10                  15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
     35                  40                  45Tyr Asp Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
 50                  55                  60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65                  70                  75                  80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Leu
             85                  90                  95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
        100                 105<210>41<211>119<212>蛋白质<213>人工序列<220><223>人抗体(M17750)的重链可变区<400>41Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1               5                  10                  15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
     35                  40                  45Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
 50                  55                  60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Glu Gly
        100                 105                 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    115<210>42<211>415<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码人源化抗体Hz4B4-1的轻链可变区的基因<400>42actagagctt catcagacag gcaggggaag caagatggat tcacaggccc aggttcttat     60gttactgctg ctatgggtat ctggtacctg tggggacatt gtgatgaccc agtctccagc    120cacccagtct gtgtctccag gagaaagagt caccctttcc tgcagggcca gccagactat    180tagcgactac ttacactggt atcaacaaaa acctggccag tctccaaggc ttctcatcaa    240atatgcttcc caatccatct ctgggatccc ctccaggttc agtggcagtg gatcagggtc    300agatttcact ctcaccatca gcagtgtgga acctgaagat tttggagtgt attactgtca    360agatggtcac agctttcctc cgacgttcgg tggaggcacc aagctagaaa tcaaa         415<210>43<211>423<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码人源化抗体Hz4B4-1的重链可变区的基因<400>43gccgccacca tgggatggag ctatatcatc ctctttttgg tagcaacagc tacagatgtc     60cactcccagg tccaactggt gcagtctggg gctgaagtgg tgaagcctgg ggcttcagtg    120aagctgtcct gcaaggcttc tggctacacc ttcagcagct actggatgca ctgggtgaag    180caggcccctg gacaagtcct tgagtggatt ggagagatta atcctggcaa cggtcatact    240aactacaatg agaagttcaa gagcaaggcc acactgactg tagacaaatc cgcgagcaca    300gcctacatgg agctcagcag cctgagatct gaggacacgg cggtctatta ctgtgcaaga    360tcttttacta cggcacgggc gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct    420tca                                                                  423<210>44<211>415<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码小鼠单克隆抗体4B4-1-1的轻链可变区的基因<400>44actagagctt catcagacag gcaggggaag caagatggat tcacaggccc aggttcttat     60gttactgctg ctatgggtat ctggtacctg tggggacatt gtgatgaccc agtctcaagc    120cacccagtct gtgactccag gagatagagt ctctctttcc tgcagggcca gccagactat    180tagcgactac ttacactggt atcaacaaaa atcacatgag tctccaaggc ttctcatcaa    240atatgcttcc caatccatct ctgggatccc ctccaggttc agtggcagtg gatcagggtc    300agatttcact ctcagtatca acagtgtgga acctgaagat gttggagtgt attactgtca    360agatggtcac agctttcctc cgacgttcgg tggaggcacc aagctagaaa tcaaa         415<210>45<211>423<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码小鼠单克隆抗体4B4-1-1的重链可变区的基因<400>45gccgccacca tgggatggag ctatatcatc ctctttttgg tagcaacagc tacagatgtc     60cactcccagg tccaactgca gcagcctggg gctgaactgg tgaagcctgg ggcttcagtg    120aagctgtcct gcaaggcttc tggctacacc ttcagcagct actggatgca ctgggtgaag    180cagaggcctg gacaagtcct tgagtggatt ggagagatta atcctggcaa cggtcatact    240aactacaatg agaagttcaa gagcaaggcc acactgactg tagacaaatc ctccagcaca    300gcctacatgc aactcagcag cctgacatct gaggactctg cggtctatta ctgtgcaaga    360tcttttacta cggcacgggc gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct    420gca                                                                  423<210>46<211>415<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码人源化抗体Hz4B4-2的轻链可变区的基因<400>46actagagctt catcagacag gcaggggaag caagatggat tcacaggccc aggttcttat     60gttactgctg ctatgggtat ctggtacctg tggggacatt gtgatgaccc agtctccacc    120aaccctttct ctgtctccag gagaaagagt caccctttcc tgcagggcca gccagtccat    180tagcgactac ttacactggt atcaacaaaa acctggccag tctccaaggc ttctcatcaa    240atatgcttcc caatccatct ctgggatccc cgctaggttc agtggcagtg gatcagggac    300cgatttcact ctcaccatca gcagtctgga acctgaagat tttgctgtgt attactgtca    360agatggtcac agctttcctc cgacgttcgg tggaggcacc aaggtggaaa tcaaa         415<210>47<211>423<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码人源化抗体Hz4B4-2的重链可变区的基因<400>47gccgccacca tgggatggag ctatatcatc ctctttttgg tagcaacagc tacagatgtc     60cactcccagg tccaactggt gcagtctggg gctgaagtga agaagcctgg ggcttcagtg    120aaggtgtcct gcaaggcttc tggctacacc ttcagcagct actggatgca ctgggtgcgc    180caggcccctg gacaacgcct tgagtggatg ggagagatta atcctggcaa cggtcatact    240aactactccc agaagttcca gggacgcgtg acaatcactg tagacaaatc cgcgagcaca    300gcctacatgg agctcagcag cctgagatct gaggacacgg cggtctatta ctgtgcaaga    360tcttttacta cggcacgggc gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct    420tca                                                                  423<210>48<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Ryu-93<400>48gaagtcgacc taacactctc ccctgtt                                      27<210>49<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Ryu-101<400>49cggtcgactc atttacccgg agacag                                       26

Claims (32)

1.一种含有至少一种人源化抗体的组合物，其中，所述的至少一种人源化抗体含有：
a)一种抗体轻链，该抗体轻链含有一种人单克隆抗体的轻链，该人的单克隆抗体的轻链的抗原结合区域的互补性决定区被特异地与h4-1BB蛋白结合的小鼠单克隆抗体轻链抗原结合区的互补性决定区替换；和
b)一种抗体重链，该抗体重链含有一种人单克隆看体的重链，该人的单克隆抗体的重链的抗原结合区的互补性决定区被特异地与h4-1BB蛋白结合的小鼠单克隆抗体重链抗原结合区的互补性决定区替换。
2.权利要求1的组合物，其中，所述的人单克隆抗体轻链的全部抗原结合区被所述的小鼠单克隆抗体轻链的全部抗原结合区替换。
3.权利要求1的组合物，其中，连接所述的人单克隆抗体轻链互补性决定区的部分抗原结合区被所述的小鼠单克隆抗体轻链的抗原结合区的相应部分替换。
4.权利要求1的组合物，其中，所述的人单克隆抗体重链的全部抗原结合区被所述的小鼠单克隆抗体重链的全部抗原结合区替换。
5.权利要求1的组合物，其中，连接所述的人单克隆抗体重链互补性结合区的部分抗原结合区被所述的小鼠单克隆抗体重链的抗原结合区的相应部分替换。
6.权利要求2的组合物，其中，所述的人单克隆抗体重链的全部抗原结合区被所述的小鼠单克隆抗体重链的全部抗原结合区替换。
7.权利要求1的组合物，其中，轻链构架部分多达10个氨基酸被特异地与h4-1BB蛋白结合的小鼠单克隆抗体的相应氨基酸替换。
8.权利要求1的组合物，其中，重链构架部分的多达11个氨基酸被特异地与h4-1BB蛋白结合的小鼠单克隆抗体的相应氨基酸替换。
9.权利要求7的组合物，其中，重链构架部分的多达11个氨基酸被特异地与h4-1BB蛋白结合的小鼠单克隆抗体的相应氨基酸替换。
10.权利要求1的组合物，其中，所述的至少一种针对h4-1BB的人源化抗体的Kd小于或等于8.7×10-11M。
11.权利要求1的组合物，它含有至少2种所述的人源化抗体。
12.权利要求1的组合物，其中，所述的至少1种人源化抗体是由保藏号为KCTC 0540BP或KCTC 0541BP的细胞系产生的。
13.权利要求11的组合物，其中，所述的至少2种人源化抗体是由保藏号为KCTC 0540BP和KCTC 0541BP的细胞系产生的。
14.一种人源化抗体，它含有：
a)一种轻链可变区，它含有具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
b)一种重量可变区，它含有具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽；
c)一种轻链恒定区，它与人抗体的轻链恒定区相同；和
d)一种重链恒定区，它与人抗体的重链恒定区相同。
15.权利要求14的人源化抗体，其中，所述的人源化抗体是由保藏号为KCTC 0540BP的细胞系表达的。
16.一种人源化抗体，它含有：
a)一种轻链可变区，它含有具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；
b)一种重量可变区，它含有具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽；
c)一种轻链恒定区，它与人抗体的轻链恒定区相同；和
d)一种重链恒定区，它与人抗体的重链恒定区相同。
17.权利要求14或16的人源化抗体，其中，该重链是γ1，γ2，γ3，或γ4链。
18.权利要求14或16的人源化抗体，其中，该轻链是κ或λ轻链。
19.权利要求16的人源化抗体，其中，所述的人源化抗体是由保藏号为KCTC 0541 BP的细胞系表达的。
20.一种质粒，它含有一种多核苷酸，该多核苷酸编码一种人源化抗体的轻链可变区，其中，所述的质粒是存在于保藏号为KCTC 0537BP的细胞中的pRc-Hz4B4-k-gs或pRc-Hz4B4-Mok-gs。
21.一种质粒，它含有一种多核苷酸，该多核苷酸编码一种人源化抗体的重链可变区，其中，该质粒是存在于保藏号为KCTC 0536 BP的细胞中的pCI-Hz4B4-H或pCI-Hz4B4-MoH。
22.一种用权利要求20的质粒转化的宿主细胞。
23.一种用权利要求21的质粒转化的宿主细胞。
24.一种保藏号为KCTC 0540 BP或KCTC 0541 BP的细胞系的细胞。
25.一种用于抑制人体免疫反应的方法，包括，对该人体施用抑制T细胞活性有效量的权利要求1和10-13中任何一项所述的组合物，或者施用含有权利要求14-19中任何一项所述的抗体的组合物。
26.一种用于筛查病人进行自身免疫反应的方法，包括将来自所述病人的一个样品与特异地结合H4-1BB蛋白质的抗体相接触，并确定由所述的抗体特异地结合的CD4+和CD8+细胞的数量，其中，＞1％的所述的CD4+或＞2％的所述的CD8+细胞是被标记的，表示具有自身免疫反应。
27.权利要求25的方法，其中，所述的抗体是权利要求12-15中任何一项所述的抗体。
28.一种用于免疫抑制的组合物，含有：(i)权利要求1和10-13中的任何一项所述的组合物，或(ii)权利要求14-19中任何一项所述的抗体和一种药物可接受的载体。
29.权利要求28的组合物，还包括描述向显示自身免疫疾病症状的病人施用所述的组合物的说明书。
30.权利要求29的组合物，其中，所述的自身免疫疾病是类风湿性关节炎。
31.一种用于抑制病人免疫反应的方法，包括向所述的病人施用抑制所说的免疫反应有效量的权利要求28的组合物。
32.权利要求31的方法，其中，所述的免疫反应是移植排异。
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