CN113004416A

CN113004416A - 靶向her2-cd137双特异性抗体的构建及其应用

Info

Publication number: CN113004416A
Application number: CN201911316134.3A
Authority: CN
Inventors: 程联胜; 赵群; 刘雯婷
Original assignee: Hefei Hankemab Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hefei Hankemab Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN113004416B

Abstract

本发明公开了靶向HER2‑CD137双特异性抗体的构建及其应用。本发明提供了一种靶向HER2和CD137的双特异性抗体，含有HER2抗原结合结构域和CD137抗原结合结构域；所述HER2抗原结合结构域含有抗HER2抗体的重链可变区和轻链可变区；所述CD137抗原结合结构域含有抗CD137抗体的重链可变区和轻链可变区。本发明所提供的双特异性抗体具有良好的T细胞激活效应，并且在此基础上表现出良好的体外肿瘤细胞杀伤效果和体内肿瘤抑制效应，因此，本发明所提供的双特异性抗体用于制备抗体靶向药物具有重要意义和应用潜力。

Description

靶向HER2-CD137双特异性抗体的构建及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤治疗和免疫学的技术领域，涉及一种靶向HER2-CD137双特异性抗体的构建及其应用，具体涉及一种抗人HER2-抗人CD137的双功能抗体、其药物组合及其用途。

背景技术

双特异性抗体(BsAb)又称为双功能抗体，可同时识别和结合两个不同的抗原或者表位，并阻断两种不同的信号通路以发挥其作用，因此相对于普通抗体的只能结合单一靶点，双特异性抗体具有同时结合2个不同表位的能力，因而能够起到一些特殊的生物学功能，表现出巨大的优势，因此日益成为抗体药物研究的新的热点之一。

肿瘤免疫疗法是在肿瘤免疫学基础之上发展起来的一种新的治疗方法，其特征是利用生物学手段，通过调节机体的免疫防御机制来发挥抗肿瘤效应。近年来，免疫治疗新靶点和免疫激活新途径不断被发现，肿瘤免疫治疗取得了重大进展。

随着Opdive以及Keytruda等众多免疫检查点抗体的相继问世，肿瘤免疫疗法，尤其是在抗体疗法上的一些弊端也逐渐暴露出来，例如有效率较低，疾病控制时间较短等诸多问题，而且同其他所有的单抗药物一样，PD-1疗法不可避免也面临着耐药性的问题。

双特异性抗体为突破免疫检查点抗体的发展瓶颈提供了一个全新的解决方案，通过双特异性抗体介导的细胞毒性作用杀死肿瘤细胞是现今肿瘤免疫治疗领域的研究热点之一，其主要机理是BsAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞表面的靶分子，双管齐下，发挥独特的或者重叠的功能，有效的防止耐药，进一步增强药效，与此同时提高治疗的靶向性、特异性，降低脱靶毒性，最终降低患者的治疗成本，为肿瘤患者带去福音。以下针对所研究的肿瘤细胞表面抗原和免疫细胞表面抗原以及相关的背景技术进行介绍：

CD137分子：

CD137又称为4-1BB，是一种tumor necrosis factor receptor(TNFR)超家族的免疫共刺激受体，主要表达于激活的CD4+、CD8+T细胞表面以及激活的B细胞和naturalkiller(NK)细胞表面，此外在处于静息状态的单核细胞以及树突状细胞或者上皮细胞表面也能发现表达。CD137在免疫反应调控过程中的一个重要分子，是肿瘤免疫治疗的一个重要目标之一，CD137 ligand(CD137L)是目前已知的唯一自然存在的CD137配体，在一些种类的APC细胞，例如激活的B细胞、单核细胞以及脾脏树突状细胞表面是组成性表达的，在T淋巴细胞表面可以诱导表达。CD137L以一种三聚体的形式表达于细胞表面，或者以一种可溶的异构体形式存在，后者的激活效应更弱。CD137L与细胞表面的CD137结合诱导其聚集成簇，进而激活其下游的信号通路。对于那些被他们特定的识别靶标激活的T细胞，CD137的共刺激能够更进一步的加强这种激活效应，增强细胞的活力和增殖以及促炎症因子的释放，进而增强杀伤活力。

CD137对肿瘤细胞的杀伤能力在临床前的体内药效模型中得到了广泛的证实。系统性的对小鼠进行CD137抗体给药可以有效的抑制肿瘤生长。因此目前有多家药企针对这一靶点开发相应的治疗用抗体，其中Utomilumab(PF-05082566,Plizer)以及Urelumab(BMS-663513,Bristol-Myers Squibb)是目前研究最快的，双双已经进入了临床阶段，然而，二者目前在临床阶段的进展都相对缓慢，究其原因，主要是由于CD137强大的激活效应所带来的毒副作用，所以目前急需要一种方法既可以充分利用CD137对免疫系统的激活效应，又可以避免由此带来的毒副作用。

HER2抗原：

1981年Shih等人首次从大鼠神经母细胞瘤基因组中克隆出癌基因neu，Slamom等人从人cDNA文库中分离出Her2基因，后经证实，neu和Her2是同一基因，习惯上称之为Her2/neu基因或者erbB2基因。Her2基因编码的蛋白我们称之为HER2蛋白或者ErbB2蛋白，是一种糖蛋白，属于I型受体酪氨酸激酶家族中的表皮生长因子受体(ErbB/HER)家族。ErbB2与肿瘤的发生发展密切相关，在多种癌症(如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌)中都可以检测到ErbB2原癌基因或ErbB2的高表达。同时，ErbB2还经常被用来作为一些肿瘤(如乳腺癌)重要的预后判定指标，ErbB2高表达的肿瘤往往预后效果差。由此可见，ErbB2是一个良好的肿瘤靶向治疗的靶点之一。肿瘤的靶向治疗是治疗肿瘤的一个重要手段。一个成功的策略是利用单克隆抗体特异性识别肿瘤细胞表面的抗原决定簇，从而靶向杀死癌细胞。据此，可以利用抗体靶向肿瘤细胞表面的ErbB2来特异性的杀死肿瘤细胞。曲妥珠单抗(Trastuzumab，商品名为Herceptin)和帕妥珠单抗(Pertuzumab，商品名Perjeta)均为抗ErbB2人源化单克隆抗体。“曲妥珠单抗与化疗联用”或“曲妥珠单抗与帕妥珠联用”均能有效治疗ErbB2高表达的肿瘤(如乳腺癌)。但是，临床上曲妥珠单抗的治疗方法非常受限，且极易出现原发性或继发性肿瘤耐药性以及肿瘤异质性。因此，需要寻找ErbB2高表达的肿瘤的新的治疗方法。

将针对肿瘤细胞表面抗原的抗体与针对免疫细胞表面的抗体通过工程化改造手段合二为一构建成的双特异性抗体可以实现在肿瘤组织内部特异性的激活肿瘤浸润淋巴细胞，从而实现在激活T淋巴细胞的同时避免其带来的副作用，是现今肿瘤免疫治疗领域的研究热点之一。

发明内容

本发明在于克服常规单克隆抗体的不足之处，通过基因工程和抗体工程实现对抗体的工程化改造，在传统单克隆抗体主要是通过ADCC、CDC和凋亡能力杀伤肿瘤细胞的基础上，增加了通过T细胞来介导肿瘤细胞的杀伤，大大增强了免疫系统杀伤肿瘤细胞的功效，与此同时避免免疫系统大规模激活所带来的毒副作用。

第一方面，本发明要求保护一种靶向HER2和CD137的双特异性抗体。该双特异性抗体可以同时识别CD137即4-1BB和HER2两个抗原靶点。

所述双特异性抗体具有同时识别肿瘤细胞表面抗原HER2和免疫细胞表面的抗原4-1BB的能力，因此，其能有效的避免CD137激动性抗体激活全身免疫细胞所带来的系统性毒性，同时，通过HER2在肿瘤细胞附近高效富集来激活免疫细胞。可以通过对这一结构的优化来进一步实现TAA-CD137双特异性抗体的高效低毒。

本发明所要求保护的靶向HER2和CD137的双特异性抗体，含有HER2抗原结合结构域和CD137抗原结合结构域；所述HER2抗原结合结构域含有抗HER2抗体的重链可变区和轻链可变区；所述CD137抗原结合结构域含有抗CD137抗体的重链可变区和轻链可变区。

这种双特异性抗体包括一个免疫激动剂模块，例如CD137抗原结合结构域，可以特异性的结合到CD137抗原，以及一个肿瘤靶向模块，例如HER2抗原结合结构域，可以特异性的结合到肿瘤相关抗原。

进一步地，所述HER2抗原结合结构域由抗HER2抗体的重链可变区、连接肽和抗HER2抗体的轻链可变区顺次连接而成；所述CD137抗原结合结构域由抗CD137抗体的重链可变区、连接肽和抗CD137抗体的轻链可变区顺次连接而成。

进一步地，所述双特异性抗体是一个由两条多肽链形成的二聚体，每条所述多肽链均由Fc片段和连接于所述Fc片段一端的所述HER2抗原结合结构域和连接于所述Fc片段另一端的所述CD137抗原结合结构域组成。所述多肽链通过位于所述Fc片段的铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键进一步形成二聚体结构。

其中，所述HER2抗原结合结构域连接于所述Fc片段的N端，所述CD137抗原结合结构域连接于所述Fc片段的C端。

所述HER2抗原结合结构域通过铰链区与所述Fc片段相连；所述CD137抗原结合结构域通过连接肽与所述Fc片段相连。

其中，所述Fc片段可来自IgG1或者IgG2或者IgG4。所述Fc片段含有本领域所熟知的S228P，以稳定IgG4分子，阻止半分子的形成，同时还含有F234A、L235A突变，以降低抗体与Fc受体之间的亲和力。

其中，所述连接肽可由正整数倍的GGGGS亚单元构成，例如1、2、3、4、5或6，优选的，在所述双特异性抗体中，连接肽均由3个GGGGS亚单元构成。

在本发明的具体实施方式中，所述抗HER2抗体为抗人HER2单克隆抗体Trastuzumab；所述抗CD137抗体为抗人CD137单克隆抗体HuB6(即专利申请201911105611.1中的Hanke10F4)；所述Fc片段为来自于人IgG4的Fc片段。

相应的，所述抗HER2抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1-120位所示；所述抗HER2抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第136-243位所示。所述抗CD137抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第1-117位所示；所述抗CD137抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第133-239位所示。

进一步地，所述HER2抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述CD137抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述Fc片段的氨基酸序列如SEQID No.5的第244-472位所示。

更进一步地，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

第二方面，本发明要求保护与前文所述双特异性抗体相关的生物材料。

本发明所要求保护的与前文所述双特异性抗体相关的生物材料，可为如下任一：

(A1)编码前文所述双特异性抗体的核酸分子；

(A2)含有(A1)中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

在(A1)中，编码所述抗HER2抗体的重链可变区的核苷酸序列可如SEQ ID No.2的第1-360位所示；编码所述抗HER2抗体的轻链可变区的核苷酸序列可如SEQ ID No.2的第406-729位所示。编码所述抗CD137抗体的重链可变区的核苷酸序列可如SEQ ID No.4的第1-351位所示；编码所述抗CD137抗体的轻链可变区的核苷酸序列可如SEQ ID No.4的第397-717位所示；

进一步地，编码所述HER2抗原结合结构域的核苷酸序列可如SEQ ID No.2所示；

编码所述CD137抗原结合结构域的核苷酸序列可如SEQ ID No.4所示；编码所述Fc片段的核苷酸序列可如SEQ ID No.6的第730-1416位所示。

更进一步地，编码所述双特异性抗体的核苷酸序列可如SEQ ID No.6所示。

在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将所述双特异性抗体的编码基因克隆到pcDNA3.4载体中(如XbaI和HindIII位点之间)后得到的重组质粒。具体为：将“kozak共识别序列(5’-GCCACC-3’)+信号肽序列(5’-ATGGAGTTCGGCCTGTCCTGGCTGTTTCTGGTGGCCATCCTGAAGGGCGTGCAGTGC-3’)+SEQ ID No.6所示DNA片段+终止密码子”插入到pcDNA3.4载体的酶切位点XbaI和HindIII之间后得到的重组质粒。相应的，所述重组细胞系为含有所述重组载体的细胞系。

第三方面，本发明要求保护一种制备Hbody双特异性抗体的方法。

本发明所要求保护的制备前文所述双特异性抗体的方法，可包括如下步骤：将编码所述双特异性抗体的核酸分子导入宿主细胞，得到重组细胞；培养所述重组细胞后获得所述双特异性抗体。

其中，所述核酸分子可通过重组载体的形式导入所述宿主细胞中。

在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将所述双特异性抗体的编码基因克隆到pcDNA3.4载体中(如XbaI和HindIII位点之间)后得到的重组质粒。具体为：将“kozak共识别序列(5’-GCCACC-3’)+信号肽序列(5’-ATGGAGTTCGGCCTGTCCTGGCTGTTTCTGGTGGCCATCCTGAAGGGCGTGCAGTGC-3’)+SEQ ID No.6所示DNA片段+终止密码子”插入到pcDNA3.4载体的酶切位点XbaI和HindIII之间后得到的重组质粒。相应的，所述重组细胞系为向宿主细胞中转入所述重组载体后得到。

在所述方法中，编码所述双特异性抗体的核酸分子在所述重组细胞中翻译成对应的多肽链后，两条多肽链会自组装成本发明所述双特异性抗体。

在所述方法中，可以用亲和层析加分子筛的方法对所述双特异性抗体进行分离纯化，利用此方法可以将双特异性抗体纯化为基本均一的物质。

在本发明中，以上所述受体细胞可为哺乳动物细胞或昆虫细胞。所述哺乳动物细胞具体如人肾上皮细胞系HEK293F。

第四方面，本发明要求保护前文所述的双特异性抗体或生物材料在如下任一中的应用：

(B1)制备抗体靶向药物；

(B2)制备激活T淋巴细胞的产品；

(B3)制备杀伤肿瘤细胞的产品；

(B4)制备预防和/或治疗肿瘤的产品。

在(B2)中，所述激活T淋巴细胞为在表达HER2的肿瘤细胞存在的情况下激活T淋巴细胞。

在(B3)中，所述杀伤肿瘤细胞为通过PBMC杀伤肿瘤细胞。所述肿瘤细胞优选为表达HER2的肿瘤细胞。

在本发明的具体实施方式中，所述表达HER2的肿瘤细胞具体为如下任一：SKOV3、NCI-N87、MCF-7/HER2、MCF-7、JIMT-1。

在(B4)中，所述肿瘤优选为表达HER2的肿瘤。

实验证明，本发明所提供的双特异性抗体具有良好的T细胞激活效应，并且在此基础上表现出良好的体外肿瘤细胞杀伤效果和体内肿瘤抑制效应，因此，本发明所提供的双特异性抗体用于制备抗体靶向药物具有重要意义和应用潜力。

术语及释义

BsAb：双特异性抗体(bispecific antibody)；

TAA：肿瘤相关抗原(Tumor associated antibody)；

VH：重链可变区(Heavy chain variable domain)；

VL：轻链可变区(Light chain variable domain)；

ScFv：单链可变区抗体片段，又称为单链抗体(Single-chain variablefragment)；

FACS：荧光激活细胞分选，也称为流式细胞术(Fluorescence-activated cellsorting).

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，当提及CD137蛋白或者4-1BB蛋白(UniProt Q07011)的氨基酸序列时，其包括CD137蛋白的全长，或者CD137的胞外片段CD137ECD或者包含CD137ECD的片段；还包括CD137ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在CD137蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“CD137蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述CD137蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。

如本文中所使用的，术语EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。

如本文中所使用的，术语“抗体”或者Antibody是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。特别地，重链还可以包含3个以上CDR，例如6、9、或12个。例如在本发明的双功能抗体中，重链可以是IgG抗体的重链的C端连接另一个抗体的ScFv，这种情况下重链含有9个CDR。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”、“抗原结合域”。通常参见，FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

如本文中所使用的，术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，CancerImmunol.描述。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。在本发明的一些实施方案中，术语“靶向”是指特异性结合。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

附图说明

图1为HK006A1的结构示意图。

图2为HK006A1在还原条件下的CE-SDS检测结果。

图3为HK006A1在非还原条件下的CE-SDS检测结果。

图4为ELISA检测HK006A1与HER2抗原之间的结合活性。

图5为ELISA检测HK006A1与4-1BB抗原之间的结合活性。

图6为FACS检测HK006A1与不同HER2表达量细胞株之间的结合活性。

图7为FACS检测HK006A1与细胞表面4-1BB抗原之间的结合活性。

图8为竞争性ELISA检测HK006A1与Herceptin竞争结合HER2抗原。

图9为竞争性ELISA检测HK006A1与HuB6竞争结合4-1BB抗原。

图10为流式法检测HK006A1与HuB6竞争结合细胞表面4-1BB抗原。

图11为不同HER2表达水平的细胞介导的HK006A1对CD8⁺T细胞的激活实验。

图12为肿瘤细胞介导的HK006A1通过人PBMC对靶细胞的杀伤作用。

图13为体内药效检测双特异性抗体对肿瘤生长的抑制效应。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。

下述实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于基因扩增、重组质粒构建、以及将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.,et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press。

pcDNA3.4载体：Life公司。

HEK293F细胞：ATCC美国细胞库。

T6-17细胞：美国宾夕法尼亚大学医学院Mark I Greene教授赠予。

SKOV3细胞：上海细胞库。

N87细胞：上海细胞库。

MCF-7细胞：美国ATCC细胞库。

MCF-7/HER2细胞：由MCF-7细胞转染HER2基因之后构建的稳转细胞株，参考文献“沈国栋等.人乳腺癌细胞MCF-7/HER2稳转株裸鼠移植瘤模型的建立.中国药理学通报.2013年04期”。

JIMT-1细胞：南京科柏生物技术有限公司。

AC16细胞：百纳生物。

CHO-K1细胞：上海细胞库。

实施例1、用于表达抗人HER2/4-1BB双特异性抗体的重组载体的构建

抗人HER2单克隆抗体Trastuzumab(又名Herceptin)(IgG1,κ)的序列来自于Genentech公司的专利US5821337，抗人4-1BB单克隆抗体HuB6由合肥瀚科迈博生物技术有限公司自行创建，为专利申请201911105611.1中的Hanke10F4(下文出现的HuB6同理)。将Trastuzumab的轻重链可变区通过GGGGSGGGGSGGGGS连接形成所述双特异性抗体抗HER2端的scFv(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，对应核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)，同样的，将抗体HuB6的轻重链可变区通过GGGGSGGGGSGGGGS连接形成所述双特异性抗体抗4-1BB端的scFv(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，对应核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)。本发明抗人HER2/4-1BB双特异性抗体命名为HK006A1。双特异性抗体HK006A1全长氨基酸序列如SEQ IDNo.5所示，对应核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。SEQ ID No.5的第1-120位为Herceptin抗体的重链可变区，第136-243位为Herceptin抗体的轻链可变区，第121-135位为连接肽；第244-472位为Fc片段的氨基酸序列，其中第244-255位为铰链区；第488-604位为HuB6抗体的重链可变区，第620-726位为HuB6抗体的轻链可变区，第605-619位为连接肽；第473-487位为连接肽。双特异性抗体的结构示意图如图1所示。所述双特异性抗体为两条氨基酸序列相同的多肽链通过位于铰链区的半胱氨酸残基形成链间二硫键连接而成的二聚体。

双特异性抗体HK006A1的重组表达载体的构建：直接合成HK006A1核苷酸全长序列并在N端引入XbaI酶切位点(TCTAGA)、kozak共识别序列(5’-GCCACC-3’)、及信号肽序列(5’-ATGGAGTTCGGCCTGTCCTGGCTGTTTCTGGTGGCCATCCTGAAGGGCGTGCAGTGC-3’)，C端引入终止密码子及HindIII酶切位点(AAGCTT)，合成序列经XbaI和HindIII双酶切后接入到同样经过酶切的pcDNA3.4载体上即得所述双特异性抗体的重组载体。经测序验证，正确的重组质粒命名为pcDNA3.4(HK006A1)。重组质粒pcDNA3.4(HK006A1)的结构描述为：将“上述kozak共识别序列+上述信号肽序列+SEQ ID No.6所示DNA片段+终止密码子”插入到pcDNA3.4载体的酶切位点XbaI和HindIII之间后得到的重组质粒。

实施例2、双特异性抗体的表达和纯化

将实施例1中所述重组载体pcDNA3.4(HK006A1)转染到人肾上皮细胞系HEK293F细胞，培养三天后，利用Protein A亲和层析柱加分子筛两步纯化方法从培养上清中纯化抗体蛋白。通过BCA方法对纯化的抗体蛋白进行定量。纯化的抗体利用CE-SDS在还原和非还原条件下检测其分子量和纯度。

结果显示，在还原条件下，HK006A1的主峰面积百分比为99.23％，即纯度可以达到99.23％(图2)。在非还原条件下，HK006A1的主峰面积百分比为99.58％，即纯度可以达到99.58％(图3和表1和表2)。

表1

表2

实施例3、ELISA方法测定HK006A1与HER2抗原结合特性

T6-17细胞为小鼠上皮成纤维细胞NIH3T3转入人Her2/ErbB2基因后的稳转细胞株，其细胞膜表面高表达HER2蛋白。将对数生长期的T6-17细胞经胰酶消化培养基重悬以后，1000rpm/min，离心5min，取上清，按照1×10⁷个细胞/mL的比例加入细胞裂解液(50mMTris-HCl pH7.5，150mM NaCl，体积分数1％Triton-100，4mM蛋白酶抑制剂Complete(Roche))重悬，冰上裂解20min，然后，12000rpm/min，离心15min，取上清。裂解液用50mMNaHCO₃ pH9.6溶液按照1:1000的体积比进行稀释，每孔100μl包被ELISA板(Nunc公司)，置于4℃孵育过夜；加入含有1％(10g/L)BSA的PBST(PBS+0.1％Tween 20，％表示体积百分含量)置于37℃封闭1h；将本发明实施例2制得的双特异性抗体HK006A1及对照抗体(Herceptin)，均稀释至2、0.5、0.125、0.03125、0.0078125、0.001953、0.000488、0.000122μg/mL，共8个梯度，每个梯度2个平行孔，每孔100μl加到ELISA板中，室温振荡孵育1h；加入1:8000(体积比)稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人-IgG(Thermo公司)，每孔100μl，室温振荡温育1h；加入OPD底物显色3-5分钟，最后用1M H₂SO₄终止反应，用BIO-TEK ELX-800酶标仪测量测量OD 450值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数Logistic拟合方法作图。

结果曲线如图4所示。双特异性抗体HK006A1对HER2抗原的结合活性低于其亲本抗体Herceptin(表3)。

表3 ELISA方法测定HK006A1与HER2抗原结合特性

EC50(ng/ml)	Herceptin	HK006A1	IgG
				HER2	103.7	130.9	-

实施例4、ELISA方法测定HK006A1与4-1BB抗原结合特性

将带有人4-1BB抗原序列(SEQ ID No.7)的pcDNA3.4重组载体转染293细胞后，通过ProteinA纯化柱从培养上清中纯化出4-1BB抗原。将4-1BB抗原用50mM NaHCO₃pH9.6稀释至0.1μg/ml，每孔100μl包被ELISA板(Nunc公司)，置于4℃孵育过夜；加入含有1％(10g/L)BSA的PBST(PBS+0.1％Tween 20，％表示体积百分含量)置于37℃封闭1h；将本发明实施例2制得的双特异性抗体HK006A1及对照抗体(HuB6，专利申请201911105611.1)，均稀释至1、0.25、0.0625、0.015625、0.0039、0.00097、0.000244、0.000061μg/mL，共8个梯度，每个梯度2个平行孔，每孔100μl加到ELISA板中，室温振荡孵育1h；加入1:8000(体积比)稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人-IgG(Thermo公司)，每孔100μl，室温振荡温育1h；加入OPD底物显色3-5分钟，最后用1M H₂SO₄终止反应，用BIO-TEK ELX-800酶标仪测量测量OD 450值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数Logistic拟合方法作图。

结果曲线如图5所示。双特异性抗体HK006A1对4-1BB抗原的结合活性同样低于其亲本抗体HuB6。

表4 ELISA方法测定HK006A1与4-1BB抗原结合特性

EC50(ng/ml)	HuB6	HK006A1	IgG
				4-1BB	6.342	21.03	-

实施例5、FACS方法测定HK006A1与细胞表面HER2抗原结合特性

体外培养HER2表达细胞株(见表5)至对数生长期，经胰酶消化培养基重悬后，收集于锥形底离心管中。4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，加入PBS缓冲液重悬细胞，使重悬后的细胞浓度为2×10⁷细胞/ml，将细胞悬液以50μl每管分装至各离心管中。

将本发明实施例2制得的双特异性抗体HK006A1及对照抗体(Herceptin)，均稀释至30、7.5、1.875、0.46875、0.11719、0.02930μg/mL，共6个梯度，然后每管50μl加入到所述细胞悬液中，室温孵育45-60min，期间每隔10min轻弹混匀一次。然后，4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，去除上清，重复此步骤两次以去除残留的抗体。在各离心管中加入100μl 10μg/ml FITC标记的羊抗人IgG，4℃避光孵育30min后，加入1ml的FACS buffer洗涤细胞，重复此过程两次，最后将细胞重悬于500μl PBS中，流式观察。

结果表明，双特异性抗体HK006A1与肿瘤细胞的结合呈现出HER2表达水平依赖性，对于HER2高表达的细胞株展示出更强的结合，随着HER2表达水平的降低，HK006A1的结合逐渐减弱，但是各细胞株之间结合的EC50彼此相差不大(图6和表5)。

表5 FACS方法测定HK006A1与细胞表面HER2抗原结合特性

EC50(μg/ml)	Herceptin	HK006A1
			SKOV3	1.227	3.865
N87	1.996	6.162
			MCF-7/HER2	1.38518	5.63179
JIMT-1	1.10234	3.34219
			AC16	0.85067	-

实施例6、FACS方法测定HK006A1与细胞表面4-1BB抗原结合特性

首先构建表达4-1BB抗原的CHO-K1稳转系细胞株，然后采用流式细胞术检测抗体与细胞表面抗原的结合能力。

1、构建表达4-1BB抗原的CHO-K1稳转系细胞株

构建含有人4-1BB全长基因序列(SEQ ID No.7)的pcDNA3.4重组载体，转染CHO-K1细胞，经筛选后获得稳定表达4-1BB抗原的CHO-K1-Hu4-1BB稳转细胞株。

2、检测抗体与细胞表面抗原的结合

采用常规胰酶消化方法处理上述获得的稳定表达4-1BB抗原的CHO-K1-Hu4-1BB稳转细胞株，重悬后，收集于锥形底离心管中。4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，加入PBS缓冲液重悬细胞，使重悬后的细胞浓度为2×10⁷细胞/ml，将细胞悬液以50μl每管分装至各离心管中。

将本发明实施例2制得的双特异性抗体HK006A1以及对照抗体(HuB6，专利申请201911105611.1)均稀释至6、2、0.667、0.222、0.074、0.025μg/mL，共6个梯度，然后每管50μl加入到所述细胞悬液中，室温孵育45-60min，期间每隔10min轻弹混匀一次。然后，4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，去除上清，重复此步骤两次以去除残留的抗体。在各离心管中加入100μl 10μg/ml FITC标记的羊抗人IgG，4℃避光孵育30min后，加入1ml的FACS buffer洗涤细胞，重复此过程两次，最后将细胞重悬于500μl PBS中，流式观察。

结果如图7所示，与ELISA的结果基本一致，HK006A1与细胞表面4-1BB抗原的结合活性比亲本抗体HuB6弱(表6)。

表6 FACS方法测定HK006A1与细胞表面4-1BB抗原结合特性

EC50(μg/ml)	HuB6	HK006A1	IgG
				4-1BB	2.49	5.46	-

实施例7、竞争性ELISA检测HK006A1与Herceptin竞争结合HER2抗原的实验

T6-17细胞裂解液用50mM NaHCO₃ pH9.6溶液按照1:1000的体积比进行稀释，每孔100μl包被ELISA板(Nunc公司)，置于4℃孵育过夜；加入含有1％(10g/L)BSA的PBST(PBS+0.1％Tween 20，％表示体积百分含量)置于37℃封闭1h；将本发明实施例2制得的双特异性抗体HK006A1及对照抗体(Herceptin)，均稀释至200、50、12.5、3.125、0.78125、0.195313、0.04883、0.01220μg/ml，共8个梯度，每个梯度2个平行孔，同时在其中加入生物素标记的Herceptin 0.2μg/ml作为被竞争抗体，充分混合以后每孔100μl加到ELISA板中，室温振荡孵育1h；辣根过氧化物酶标记亲和素(ThermoFisher公司)按照1:8000的体积比进行稀释，然后每孔加入100μl，室温振荡温育1h；加入OPD底物显色3-5min，最后用1M H₂SO₄终止反应，用BIO-TEK ELX-800酶标仪测量OD 450值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数Logistic拟合方法作图。

结果如图8所示，与之前的ELISA检测结果一致，HK006A1与HER2抗原的结合活性弱于Herceptin。

实施例8、竞争性ELISA检测HK006A1与HuB6竞争结合4-1BB抗原的实验

4-1BB抗原(见实施例4)用50mM NaHCO₃ pH9.6溶液稀释至0.5μg/ml每孔100μl包被ELISA板(Nunc公司)，置于4℃孵育过夜；加入含有1％(10g/L)BSA的PBST(PBS+0.1％Tween 20，％表示体积百分含量)置于37℃封闭1h；将本发明实施例2制得的双特异性抗体HK006A1及对照抗体(HuB6，专利申请201911105611.1)，均稀释至50、12.5、3.125、0.78125、0.195313、0.04883、0.01220、0.00317μg/ml，共8个梯度，每个梯度2个平行孔，同时在其中加入生物素标记的HuB60.05μg/ml，充分混合以后每孔100μl加到ELISA板中，室温振荡孵育1h；辣根过氧化物酶标记亲和素(ThermoFisher公司)按照1:8000的体积比进行稀释，然后每孔加入100μl，室温振荡温育1h；加入OPD底物显色3-5min，最后用1M H₂SO₄终止反应，用BIO-TEK ELX-800酶标仪测量OD 450值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数Logistic拟合方法作图。

结果如图9所示，与之前的ELISA检测结果一致，HK006A1与4-1BB抗原的结合活性弱于亲本抗体HuB6。

实施例9、双特异性抗体对细胞膜表面抗原的竞争性结合

采用竞争流式细胞法测定HK006A1与HuB6(专利申请201911105611.1)对细胞膜表面抗原4-1BB的竞争性结合，具体方法如下：

将CHO-K1-Hu4-1BB(见实施例6)按照常规方法进行消化，重悬后，收集于锥形底离心管中。4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，加入PBS缓冲液重悬细胞，使重悬后的细胞浓度为2×10⁷细胞/ml，将细胞悬液以50μl每管分装至各离心管中。

将本发明实施例2制得的双特异性抗体HK006A1以及对照抗体(HuB6，专利申请201911105611.1)，均稀释至300、75、18.75、4.6875、1.171875、0.293μg/ml，共6个梯度，同时在其中加入生物素标记的HuB6 5μg/ml。然后将原细胞上清吸掉，每管加入100μl稀释之后的抗体，室温孵育45-60min，期间每隔10min轻弹混匀一次。然后，4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，去除上清，重复此步骤两次以去除残留的抗体。在各离心管中加入100μl 10μg/ml FITC标记的链霉亲和素，4℃避光孵育30min后，加入1ml的FACS buffer洗涤细胞，重复此过程两次，最后将细胞重悬于500μl PBS中，流式观察。

结果如图10所示，HK006A1与4-1BB的结合与亲本抗体HuB6之间存在很明显的竞争，但是有之前的结果基本一致，结合活性减弱。

实施例10、体外药效检测双特异性抗体对T淋巴细胞的激活效应

采用靶细胞依赖性T细胞激活实验来评估双特异性抗体HK006A1在靶细胞表达不同水平HER2抗原的情况下对T细胞的激活效果，所采用的靶细胞如表7所示。

表7靶细胞信息

注：PS为100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。膜表面HER2水平一栏，数值越高表示膜表面HER2表达水平越高。

具体实验过程如下：

1、将CD3抗体(BioVision，6198-100)用PBS稀释至0.5μg/ml，然后每孔60μl加到96孔板里面，37℃孵育2hr。

2、去掉上清，用PBS洗板两遍，然后将靶细胞按照每孔2×10⁴加入96孔板中，培养箱中培养过夜。

3、第二天，首先采用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)分离PBMC，进一步，采用磁珠法从PBMC中分离CD8⁺T细胞，将原96孔板中的培养基洗掉之后，将CD8⁺T细胞按照每孔100μl加入到96孔板中，加入的T细胞的数量是靶细胞的2倍。

4、稀释抗体，共设置3组，HK006A1组，HuB6与Herceptin联用组以及IgG组。将待测抗体HK006A1和IgG用无酚红的含有10％FBS的1640培养基分别稀释至6、1、0.17、0.028、0.004630、0.000772μg/ml(对应HK006A1组和IgG组)；将HuB6与Herceptin均稀释成12，2，0.34，0.056，0.009260，0.001544，然后等体积混合(对应HuB6与Herceptin联用组)。然后按照每孔100μl加入到96孔板中，37℃，5％CO₂条件下培养72hr。

5、72小时之后检测上清中IFN-γ的表达量。具体过程如下：首先，用0.05M NaHCO₃稀释捕获抗体MD-1(Biolegend，507501)至工作浓度，每孔100μl加入酶标板中，4℃过夜包被；弃去孔中液体并用PBST洗板3次；每孔350μl 1％BSA加入酶标板中，37℃孵育2小时；洗板3次之后，用1％BSA稀释标准品与待检样品，每孔100μl加入酶标板中，室温孵育1小时；洗板3次，然后，用1％BSA稀释检测抗体4S.B3(Biolegend，502503)，每孔100μl加入酶标板中，室温孵育1小时；洗板3次，然后，用1％BSA稀释SA-HRP，每孔100μl加入酶标板中，室温孵育0.5小时；洗板3次，然后，每孔100μl加入TMB，室温避光显色5分钟，每孔加100μL 1M H₂SO₄终止显色反应。手指轻弹酶标板以确保每孔反应均匀；将酶标板放入酶标仪中，在450nm下测定吸光值。

结果如图11所示，双特异性抗体HK006A1能够有效介导T细胞的激活，并且只有在HER2表达的肿瘤细胞存在的情况下才具有激活效应，对于HER2不表达的肿瘤细胞，无法通过HK006A1来激活T细胞。同时，HuB6和Herceptin联用组未检测出IFN-γ的释放，这表明HuB6与Herceptin联用未能有效的激活T淋巴细胞。上述结果表明双特异性抗体HK006A1能够有效的通过HER2抗原结合结构域与肿瘤细胞表面的HER2抗原结合并进一步通过另外一端的CD137抗原结合结构域来促使淋巴细胞表面的CD137聚集成簇，进而达到肿瘤特异性激活淋巴细胞的目的。

实施例11、体外药效检测双特异性抗体对肿瘤细胞的杀伤作用

将CD3抗体(BioVision，6198-100)用PBS稀释至0.5μg/ml，然后每孔60μl加到96孔板里面，37℃孵育2hr。去掉上清，用PBS洗板两遍，备用。

用胰酶消化靶细胞(包括HER2高表达的胃癌细胞N87，HER2中等表达的MCF7/HER2细胞以及HER2低表达的MCF-7细胞)，制成单细胞悬液，调节密度至2×10⁵/ml，然后按照2×10⁴/孔，即100μl/孔加入到96孔板(含有CD3抗体)中，37℃培养箱中培养过夜以使细胞充分贴壁。次日吸去原培养基，按照100μl/孔加入5倍数量的人PBMC。同时设置两组对照孔，其中一组无需加入PBMC(加入同等体积的培养基)，作为靶细胞自发释放；另一组只加入PBMC，预先未加肿瘤细胞(加入同等体积的培养基)，作为效应细胞自发释放。加入PBMC的同时按照试验设计加入相应的抗体，最高浓度设置5μg/ml，20倍稀释3个梯度(高、中、低)，100μl/孔，无需加入抗体的孔用相应体积的培养基补齐。培养96小时后，检测上清中LDH的释放(#G1780,Promega)，在其中没有加入PBMC的对照孔中加入15μl of 10×细胞裂解液(试剂盒自带)作为靶细胞最大裂解值。

杀伤效率＝(实验组-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)×100％/(靶细胞最大裂解值-靶细胞自发释放)。

结果如图12所示，HK006A1对HER2高表达的肿瘤细胞的杀伤非常明显，最高杀伤效率可以达到45％左右，而对照组Herceptin以及HuB6和Herceptin联用组与本底无异。对于HER2中等表达的MCF7/HER2，最高杀伤效率有所降低，但是仍然明显强于对照组。对于HER2低表达的MCF-7，虽然相对于对照仍有部分杀伤作用，但是最大杀伤效率已经降到10％左右。

实施例12、体内药效检测双特异性抗体对肿瘤生长的抑制效应

体外培养SKOV3细胞，用胰酶消化之后，按照1×10⁷/只皮下接种6-8周龄的雌性BNDG小鼠(百奥赛图)，待肿瘤大小长到100mm³左右的时候根据肿瘤大小进行随机分组，每组6只，然后按照1×10⁷/只尾静脉注射PBMC，1小时之后进行双特异性抗体HK006A1腹腔给药处理，给药剂量为50μg/只，对照组为生理盐水组。每周给药两次并测量肿瘤的体积。计算体积公式为1/2×长×宽×宽(mm³)。实验结果如图13所示，对照生理盐水组，肿瘤的生长受到了有效的抑制。

序列表

<110> 合肥瀚科迈博生物技术有限公司

<120> 靶向HER2-CD137双特异性抗体的构建及其应用

<130> GNCLN192545

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 243

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ile Gly Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

225 230 235 240

Val Leu Gly

<210> 2

<211> 729

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ctggaggatc cctgaggctg 60

agctgtgccg cttctggctt taacatcaag gacacctaca tccactgggt gaggcaggct 120

ccaggcaagg gactggagtg ggtggctcgg atctatccta ccaatggcta cacaagatat 180

gccgactccg tgaagggccg ctttaccatc tccgccgata ccatcggcaa cacagcttac 240

ctgcagatga attctctgag agccgaggac acagccgtgt actattgctc cagatggggc 300

ggcgacggct tctacgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc 360

ggcggcggcg gctctggagg aggaggatcc ggaggaggag gaagcgatat ccagatgacc 420

cagtctccat cttccctgtc cgccagcgtg ggcgacagag tgaccatcac atgtcgcgct 480

tcccaggatg tgaacacagc cgtggcttgg tatcagcaga agcccggcaa ggcccctaag 540

ctgctgatct actctgcttc cttcctgtat tctggcgtgc cttccaggtt tagcggatct 600

cggtccggaa ccgacttcac cctgacaatc agctctctgc agccagagga ttttgccacc 660

tactattgcc agcagcatta caccacaccc cctacattcg gcggaggaac caagctgaca 720

gtgctgggc 729

<210> 3

<211> 239

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Pro Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Thr Gly Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

130 135 140

Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly

145 150 155 160

Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val

165 170 175

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser

210 215 220

Lys Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 4

<211> 717

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

caggtgcagc tgcaggagtc tggcccaggc ctggtgaagc cctctgagac cctgagcatc 60

acctgtacag tgagcggcag ctccctgaca tcctacggag tgcactgggt gcggcagcca 120

cctggcaagg gcctggaggg actgggcgtg atctggccag gaggcagcac caactataat 180

tccgccctga tgagccggct gacaatctct aaggacaaca gcaagtccca ggtgagcctg 240

aagatgtcta gcctgaccgc cgccgacaca gccatgtact attgcgcccg ggtgaccggc 300

acatggtact tcgacgtgtg gggccagggc accacagtga ccgtgtcctc tggcggcggc 360

ggctccggcg gcggcggatc cggaggagga ggcagcgaca tccagatgac ccagtcccca 420

agctccctgt ccgcctctct gggcgatagg gtgacaatca gctgctccgc ctctcagggc 480

atctccaact acctgaattg gtatcagcag aagccagacg gcaccgtgaa gctgctgatc 540

tactatacca gcacactgca ctccggagtg ccaagccggt tcagcggctc cggctctggc 600

accgacttta ccctgacaat ctctagcctg cagcccgagg atgtggccac atactattgt 660

cagcagtact ctaagctgcc ttggaccttc ggcggcggca caaagctgga gatcaag 717

<210> 5

<211> 726

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ile Gly Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

225 230 235 240

Val Leu Gly Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

340 345 350

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

465 470 475 480

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro

485 490 495

Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser

500 505 510

Gly Ser Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro

515 520 525

Gly Lys Gly Leu Glu Gly Leu Gly Val Ile Trp Pro Gly Gly Ser Thr

530 535 540

Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn

545 550 555 560

Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp

565 570 575

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Thr Gly Thr Trp Tyr Phe Asp

580 585 590

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

595 600 605

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

610 615 620

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile

625 630 635 640

Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

645 650 655

Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr

660 665 670

Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

675 680 685

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr

690 695 700

Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly

705 710 715 720

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

725

<210> 6

<211> 2178

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ctggaggatc cctgaggctg 60

agctgtgccg cttctggctt taacatcaag gacacctaca tccactgggt gaggcaggct 120

ccaggcaagg gactggagtg ggtggctcgg atctatccta ccaatggcta cacaagatat 180

gccgactccg tgaagggccg ctttaccatc tccgccgata ccatcggcaa cacagcttac 240

ctgcagatga attctctgag agccgaggac acagccgtgt actattgctc cagatggggc 300

ggcgacggct tctacgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc 360

ggcggcggcg gctctggagg aggaggatcc ggaggaggag gaagcgatat ccagatgacc 420

cagtctccat cttccctgtc cgccagcgtg ggcgacagag tgaccatcac atgtcgcgct 480

tcccaggatg tgaacacagc cgtggcttgg tatcagcaga agcccggcaa ggcccctaag 540

ctgctgatct actctgcttc cttcctgtat tctggcgtgc cttccaggtt tagcggatct 600

cggtccggaa ccgacttcac cctgacaatc agctctctgc agccagagga ttttgccacc 660

tactattgcc agcagcatta caccacaccc cctacattcg gcggaggaac caagctgaca 720

gtgctgggcg agagcaagta tggaccacca tgccctccat gtccagctcc agaggctgct 780

ggaggccctt ccgtgttcct gtttccccct aagccaaagg acaccctgat gatcagcaga 840

acccctgagg tgacatgcgt ggtggtggac gtgtctcagg aggatccaga ggtgcagttt 900

aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcac aatgctaaga ccaagcccag ggaggagcag 960

ttcaattcta cctaccgggt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcatcagga ttggctgaac 1020

ggcaaggagt ataagtgcaa ggtgtccaat aagggcctgc cttccagcat cgagaagacc 1080

atcagcaagg ctaagggaca gcctagggag ccacaggtgt acacactgcc accctcccag 1140

gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acatgtctgg tgaagggctt ttatccatct 1200

gacatcgctg tggagtggga gtccaatggc cagcccgaga acaattacaa gaccacacct 1260

ccagtgctgg acagcgatgg ctctttcttt ctgtattcca ggctgaccgt ggataagagc 1320

cggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc tctgtgatgc acgaggccct gcacaatcat 1380

tacacacaga agtccctgag cctgtctctg ggcaagggtg gtggtggttc cggcggcggc 1440

ggcagcggag gaggaggaag ccaggtgcag ctgcaggagt ctggcccagg cctggtgaag 1500

ccctctgaga ccctgagcat cacctgtaca gtgagcggca gctccctgac atcctacgga 1560

gtgcactggg tgcggcagcc acctggcaag ggcctggagg gactgggcgt gatctggcca 1620

ggaggcagca ccaactataa ttccgccctg atgagccggc tgacaatctc taaggacaac 1680

agcaagtccc aggtgagcct gaagatgtct agcctgaccg ccgccgacac agccatgtac 1740

tattgcgccc gggtgaccgg cacatggtac ttcgacgtgt ggggccaggg caccacagtg 1800

accgtgtcct ctggcggcgg cggctccggc ggcggcggat ccggaggagg aggcagcgac 1860

atccagatga cccagtcccc aagctccctg tccgcctctc tgggcgatag ggtgacaatc 1920

agctgctccg cctctcaggg catctccaac tacctgaatt ggtatcagca gaagccagac 1980

ggcaccgtga agctgctgat ctactatacc agcacactgc actccggagt gccaagccgg 2040

ttcagcggct ccggctctgg caccgacttt accctgacaa tctctagcct gcagcccgag 2100

gatgtggcca catactattg tcagcagtac tctaagctgc cttggacctt cggcggcggc 2160

acaaagctgg agatcaag 2178

<210> 7

<211> 765

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atgggcaact cctgctacaa catcgtggcc accctgctgc tggtgctgaa cttcgagcgc 60

acccgctccc tgcaggaccc atgctccaat tgtcccgccg gcaccttctg cgataacaat 120

aggaaccaga tctgctctcc ctgtccccct aatagcttta gctccgccgg aggacagagg 180

acatgcgaca tctgtagaca gtgcaagggc gtgttcagga cccgcaagga gtgttctagc 240

acaagcaacg ccgagtgcga ctgtacccct ggatttcact gcctgggagc aggatgttcc 300

atgtgcgagc aggattgtaa gcagggccag gagctgacca agaagggctg caaggactgc 360

tgtttcggca ccttcaacga tcagaagagg ggcatctgtc gcccttggac caactgcagc 420

ctggatggca agtccgtgct ggtgaatggc acaaaggaga gggacgtggt gtgcggacct 480

tctccagccg atctgagccc aggcgcctcc tctgtgaccc caccagcacc agcaagagag 540

cctggacact ccccacagat catctccttc tttctggccc tgacctctac agccctgctg 600

ttcctgctgt tctttctgac cctgaggttt tccgtggtga agaggggccg caagaagctg 660

ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgaga cccgtgcaga ccacacagga ggaggatggc 720

tgctcttgta ggtttccaga ggaggaggag ggaggatgtg agctg 765

Claims

1.靶向HER2和CD137的双特异性抗体，含有HER2抗原结合结构域和CD137抗原结合结构域；所述HER2抗原结合结构域含有抗HER2抗体的重链可变区和轻链可变区；所述CD137抗原结合结构域含有抗CD137抗体的重链可变区和轻链可变区。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：所述HER2抗原结合结构域由抗HER2抗体的重链可变区、连接肽和抗HER2抗体的轻链可变区顺次连接而成；和/或

所述CD137抗原结合结构域由抗CD137抗体的重链可变区、连接肽和抗CD137抗体的轻链可变区顺次连接而成。

3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其特征在于：所述双特异性抗体是由两条多肽链形成的二聚体，每条所述多肽链均由Fc片段和连接于所述Fc片段一端的所述HER2抗原结合结构域和连接于所述Fc片段另一端的所述CD137抗原结合结构域组成。

4.根据权利要求1-3中任一所述的双特异性抗体，其特征在于：所述HER2抗原结合结构域连接于所述Fc片段的N端，所述CD137抗原结合结构域连接于所述Fc片段的C端；

和/或

所述HER2抗原结合结构域通过铰链区与所述Fc片段相连；和/或

所述CD137抗原结合结构域通过连接肽与所述Fc片段相连。

5.根据权利要求1-4中任一所述的双特异性抗体，其特征在于：所述抗HER2抗体抗人HER2单克隆抗体Trastuzumab；和/或

所述抗CD137抗体为抗人CD137单克隆抗体HuB6；和/或

所述Fc片段为来自于人IgG4的Fc片段。

6.根据权利要求1-5中任一所述的双特异性抗体，其特征在于：所述抗HER2抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1-120位所示；所述抗HER2抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第136-243位所示；和/或

所述抗CD137抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第1-117位所示；所述抗CD137抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第133-239位所示；

进一步地，所述HER2抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；和/或

进一步地，所述CD137抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；和/或

进一步地，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No.5的第244-472位所示；

7.与权利要求1-6中任一所述双特异性抗体相关的生物材料，为如下任一：

(A1)编码权利要求1-6中任一所述双特异性抗体的核酸分子；

8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于：在(A1)中，编码所述抗HER2抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第1-360位所示；编码所述抗HER2抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第406-729位所示；和/或

编码所述抗CD137抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第1-351位所示；编码所述抗CD137抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第397-717位所示；

进一步地，编码所述HER2抗原结合结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；和/或

进一步地，编码所述CD137抗原结合结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；和/或

进一步地，编码所述Fc片段的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第730-1416(位所示；

更进一步地，编码所述双特异性抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

9.一种制备权利要求1-6中任一所述双特异性抗体的方法，包括如下步骤：将权利要求7或8中所述的编码所述双特异性抗体的核酸分子导入宿主细胞，经培养后获得所述双特异性抗体。

10.权利要求1-8中任一所述的双特异性抗体或生物材料在如下任一中的应用：

(B1)制备抗体靶向药物；

(B2)制备激活T淋巴细胞的产品；

(B3)制备杀伤肿瘤细胞的产品；

(B4)制备预防和/或治疗肿瘤的产品。