CN109651507B - 一种激动型4-1bb单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种激动型4‑1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1区，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2区及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3区；所述的轻链可变区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR1区，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2区及氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR3区。本发明提供了针对h4‑1BB的单克隆抗体，其能够特异性结合h4‑1BB，进而激活T细胞。本发明的抗体通过免疫调节作用对治疗多种癌症具有应用潜力。

Description

一种激动型4-1BB单克隆抗体
技术领域
本发明涉及抗体，尤其是特异性结合人4-1BB的单克隆抗体。
背景技术
T淋巴细胞的激活需要双重信号刺激，第一信号为T细胞表面的抗原识别受体(TCR)与MHC分子—抗原肽的特异性结合提供的抗原识别信号，第二信号是抗原提呈细胞(APC)表面的共刺激分子与T细胞表面相应受体结合所提供的共刺激信号(Chambers C A,et al.1999.CurrOpin Cell Biol,11(2):203-210)。只有在这双重信号的共同作用下，T细胞才能有效活化，增殖进而发挥相应的生物学功能，若缺乏共刺激信号，T细胞则处于无能或无应答状态(Seo S K,et al.2003.J Immunol,171(2):576-583)。
CD28是最早发现的共刺激分子，CD28/B7协同刺激信号主要在T细胞活化前期起作用，促进其增殖并维持短期的存活(Boulougouris G,et al.1998.J Immunol,161(8):3919-3924)，4-1BB/4-1BBL是独立于CD28/B7之外的关键共刺激信号，与CD28/B7在T细胞活化中作用的时期不同，4-1BB/4-1BBL产生的协同刺激信号主要作用于应答晚期，能协同CD28进一步活化T细胞，尤其对于维持CD8+T细胞的生存和效应功能是必不可少的。
4-1BB(CD137；TNFRSF9)属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，以单体或二聚体的形式表达于活化的T细胞表面，主要是CD8+T细胞，也表达于CD4+T细胞、NK细胞、CD4+CD25+调节性T细胞等。
早期研究表明，4-1BB分子是一个激活型共刺激分子，它既能提供共刺激信号激活T细胞，使T细胞活化、增殖、分泌细胞因子并增强其细胞毒活性，同时它也介导反向共刺激信号，诱导APC活化增殖和分泌细胞因子(Vinay D S,et al.2006.J Mol Med(Berl),84(9):726-736)。体外实验表明，4-1BB信号能通过促进CD8+T细胞和CD4+T细胞增殖以及细胞因子分泌，发挥增强细胞抗感染、抑制肿瘤生长的免疫调节作用。动物肿瘤模型中，应用4-1BB单克隆抗体或4-1BBL基因转入肿瘤细胞可有效诱导细胞介导的抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤消退。在针对4-1BB/4-1BBL缺陷型小鼠病毒感染后CD8+T的数量和功能的研究中发现，4-1BB/4-1BBL相互作用不但可以增强病毒特异性CD8T细胞的杀伤功能，而且可以促进记忆T细胞的存活和增殖，控制病毒感染(Fuse S,et al.2007.J Immunol,178(8):5227-5236)。后续研究发现，4-1BB分子在免疫调节中不仅有共刺激活性，还有抑制作用。激动型4-1BB抗体作用于自身免疫性疾病模型时，IFN-γ、IDO和TGF-β的表达上调,CD11+CD8+调节T细胞大量增殖,进而抑制CD 4+T细胞增殖及其功能，抑制自身免疫性疾病的发展进程(Kim Y H,etal.2009.J LeukocBiol,85(5):817-825)。4-1BB途径的活化不但会通过促进T细胞向移植器官的浸润，缩短移植器官的存活时间加重宿主抗移植物排斥反应，还会促进CD4+及CD8+T细胞介导的移植物抗宿主反应，因此阻断供体T细胞与受体之间的4-1BB途径可降低宿主抗移植物排斥反应的发生。
因此可以通过干预4-1BB信号途径的作用来调节淋巴细胞的免疫功能，即可以通过针对人4-1BB的抗体激活或阻断4-1BB/4-1BBL信号通路，进而达到治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、病毒感染或移植物抗宿主反应等疾病的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性结合人4-1BB的抗体，并且不阻断h4-1BBL与h4-1BB的结合。本发明还通过激动型4-1BB单克隆抗体激活4-1BB/4-1BBL信号途径，增强T细胞介导的免疫反应，发挥抗肿瘤、抗感染及对自身免疫性疾病的调节作用。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
本发明的目的是提供一种激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1区，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2区及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3区；所述的轻链可变区包括：氨基酸序列如SEQID NO:4所示的CDR1区，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2区及氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示的CDR3区。
根据一个实施方案，所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括如SEQID NO:7所示的重链可变区。
根据另一个实施方案，所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
根据一个优选实施方式，所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7所示的重链可变区和如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
根据一些实施方案，所述的激动型4-1BB单克隆抗体具有如下一种或多种性质：
(a)与人4-1BB特异性结合，
(b)激活T细胞，
(c)抑制肿瘤细胞生长，
(d)治疗癌症。
根据一个具体实施方案，所述的激动型4-1BB单克隆抗体包括重链和轻链。
本发明中，所述的激动型4-1BB单克隆抗体为IgG、IgA、IgE、IgM或IgD，优选为IgG。
进一步地，所述的激动型4-1BB单克隆抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选为IgG1亚类。
本发明的另一个目的是提供一种人源化抗人4-1BB抗体，所述的人源化抗人4-1BB抗体为所述的激动型4-1BB单克隆抗体经人源化改造而成。
根据一个优选实施方式，所述的人源化抗人4-1BB抗体包括轻链和重链，所述的轻链序列如SEQ ID NO:9所示，所述的重链序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明的第三个目的是提供一种所述的人源化抗人4-1BB抗体的制备方法，将所述的激动型4-1BB单克隆抗体采用模板替换的方法进行人源化改造。
本发明的第四个目的是提供一种激动型4-1BB单克隆抗体的衍生物，所述的激动型4-1BB单克隆抗体的衍生物为上述激动型4-1BB单克隆抗体的氨基酸序列或者是人源化抗人4-1BB抗体的氨基酸序列经修饰后的抗体。
本发明的第五个目的是提供一种编码上述激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段或者是人源化抗人4-1BB抗体的核酸。
本发明的第六个目的是提供一种表达上述核酸的宿主细胞。
本发明的第七个目的是提供一种上述激动型4-1BB单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(a)抗原免疫小鼠，制备杂交瘤细胞；
(b)筛选阳性杂交瘤细胞；
(c)克隆抗体轻重链可变区的核酸序列，并与人IgG1的恒定区连接后构建真核表达载体；
(d)转染宿主细胞表达抗体，经纯化后得到抗4-1BB的单克隆抗体。
本发明的第八个目的是提供一种上述激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段在制备抑制肿瘤细胞生长、炎症及自身反应性疾病的发展进程方面的药物中的应用。
本发明的第九个目的是提供一种药物组合物，包括上述激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药物可接受的载体。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明提供了针对h4-1BB的单克隆抗体或人源化抗人4-1BB抗体，其能够特异性结合h4-1BB，进而激活T细胞。本发明的抗体通过免疫调节作用对治疗多种癌症具有应用潜力。
附图说明
图1为杂交瘤分泌的抗体ab1人PBMC的体外活化作用结果图；
图2为ab1嵌合抗体对人PBMC的体外活化作用结果图；
图3为ab1嵌合抗体与人4-1BB的特异性结合结果图；
图4为ab1嵌合抗体的物种交叉反应性结果图；
图5为采用ELISA检测人源化前后ab1抗体的结合活性的变化结果图。
图6为ab1人源化单抗对小鼠MC38肿瘤模型的肿瘤体积影响的结果图；
具体实施方式
本发明所述“抗体(antibody，Ab)”即免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)，是一种特异性结合抗原的糖蛋白，由B细胞接受抗原刺激后增殖分化生成的浆细胞产生。抗体以一个或多个Y型单体形式存在，单体由两条重链和两条轻链组成，其中，重链包括3个高度可变区即H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3及三个恒定区即(CH1、CH2、CH3)，轻链包括3个高度可变区即L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3及一个恒定区。重链分为μ、σ、γ、α及ε链，根据重链的不同，抗体可分为IgM、IgD、IgG、IgA及IgE五种类型，而轻链有κ和λ两种类型。抗体轻重链的可变区是抗原结合部位，负责识别及结合抗原，恒定区与抗体的生物学效应相关。
本发明所述“嵌合抗体”是指人免疫球蛋白的恒定区与鼠源抗体的可变区拼接而成的基因工程抗体。
本发明所述“单克隆抗体”是指针对某一特定的抗原表位，高度同源的抗体。其与多克隆抗体针对某一抗原上多个抗原决定基不同，不易与不同抗原产生交叉反应，具有高度特异性。
本发明所述“抗原结合片段”是指保留与抗原结合活性的抗体的一个或多个部分。
本发明所述“抗人4-1BB的抗体”是指能与人4-1BB特异性结合的抗体。
本发明所述“激动剂”是指本文中涉及的抗人4-1BB的抗体，其通过结合人4-1BB激活4-1BB/4-1BBL信号通路，促进T细胞的活化，增殖及细胞因子的分泌，而且能进一步增加T细胞表面的共刺激分子的表达。
本发明所述“特异性结合”是指该抗体在特定条件下与某物种的抗原相互作用，而不与该抗原同家族的其它抗原反应的能力。抗体的特异性结合作用可以用ELISA、FACS、Western blot等方法确定。
本发明所述“核酸”是指基因组、cDNA及其重组的核酸分子，其是与同一来源的其它组分相分离的。本文中的核酸是编码感兴趣的目的蛋白的基因片段。
本发明所述“载体”是指能存活于宿主细胞并自主复制，含有多个限制酶切位点及标记基因的DNA分子，能够将编码目的蛋白的核酸序列导入宿主细胞，并表达其携带的遗传信息的一种运载工具。
本发明所述“宿主细胞”是指表达目的基因序列的外源基因表达系统。宿主细胞包括原核生物细胞及真核生物细胞。
在一些实施方案中，所述抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的H-CDR1区，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的H-CDR2区及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的H-CDR3区，在其它的一些实施方案中，所述抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的L-CDR1区，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的L-CDR2区及氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的L-CDR3区。
本发明提供的抗体或抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
具体地，SEQ ID NO:1:GYAFTNYWLG。
具体地，SEQ ID NO:2:DIYPGNGNSYYNEKFKG。
具体地，SEQ ID NO:3:SSSYYRDVMDY。
具体地，SEQ ID NO:4:RASENIYSYLV。
具体地，SEQ ID NO:5:NAKTLAE。
具体地，SEQ ID NO:6:QHHYGTPLT。
具体地，SEQ ID NO:7：
QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGNGNSYYNEKFKGRATLTADKSSSTVYMQLSSLTSEDSVVYFCTRSSSYYRDVMDYWGQGTSVTVSS。
具体地，SEQ ID NO:8：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLVWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVSSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELKR。
在一些实施方案中，本文提及的抗体，至少具有一种下述性质：
(a)与人4-1BB特异性结合
(b)激活T细胞
(c)抑制肿瘤细胞生长
(d)治疗癌症
本文中提到的抗人4-1BB抗体的类别可以是IgG、IgA、IgE、IgM或IgD。优选IgG类，其中IgG又分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四个亚类，优选IgG1亚类。抗人4-1BB抗体可以使用本领域通用的方法进行类别转换。
本文中提到的抗体可以通过本领域已知的方法生产，包括B细胞杂交瘤技术，重组抗体技术等。
本文中提供了本发明中任何的抗4-1BB抗体的抗原结合片段。
抗原结合片段可包含所述抗体的任一序列，其中，抗原结合片段包括的氨基酸序列如下：
(a)抗4-1BB抗体的重链；
(b)抗4-1BB抗体的轻链；
(c)抗4-1BB抗体的重链的可变区；
(d)抗4-1BB抗体的轻链的可变区；
(e)抗4-1BB抗体的一个或多个CDR；
(f)抗4-1BB抗体的重链的三个CDR及轻链的三个CDR。
一方面，本文提供了任何抗人4-1BB抗体的衍生物。
在一些方面，抗人4-1BB抗体的衍生物来自示例抗体(“原始抗体”)的氨基酸序列的修饰，同时原始抗体氨基酸序列的分子结构保持不变。原始抗体的框架区、高度可变区及恒定区的氨基酸序列都可以能发生氨基酸插入、缺失、取代或组合。
本发明的抗体可能会发生一种氨基酸被性质相似的氨基酸取代的过程，该过程称为保守取代，保守取代产生的抗体一般不影响抗体的结合活性。取代类型如下：丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
本发明的抗体可以利用原核表达系统如大肠杆菌或真核表达系统如CHO细胞进行抗体的制备。其中，哺乳动物表达体系是表达本发明的抗体的最优的选择。用于表达抗体的宿主细胞包括：CHO细胞、HEK 293细胞、酵母、COS(非洲绿猴纤维母细胞细胞系)细胞系，NS0骨髓瘤细胞及Sp2/0细胞。
本发明的抗体可用于调节T细胞活性，增强细胞介导的免疫反应。本发明的抗体适于治疗癌症、辅助其它药物治疗癌症及抑制自身免疫性疾病。
实施例1：杂交瘤的制备
本发明提供的抗体的重链和轻链的可变区最初从杂交瘤细胞中获取。所述杂交瘤细胞的制备是通过人4-1BB-Fc融合蛋白与等量IFA重复免疫Balb/c小鼠3次，取具有合适抗体滴度的已免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按常规方法进行细胞融合。
杂交瘤上清的筛选
ELISA筛选与人4-1BB结合的杂交瘤细胞：为筛选抗h4-1BB的阳性杂交瘤细胞，以PBS缓冲液稀释h4-1BB-Fc融合蛋白为0.5μg/mL，100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜。然后弃去溶液，PBST洗涤三次，再用3％BSA-PBST，37℃封闭1h。弃去溶液，PBST洗板三次，之后加入100μL杂交瘤上清，37℃孵育1h。如前述方法洗涤ELISA板，与过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-Fcγ抗体37℃共孵育1h后洗板，加TMB底物100μL，37℃孵育20min，最后用50μL硫酸终止，于酶标仪上，450nm处读板。
ELISA筛选不与人IgG结合的杂交瘤细胞：为筛选抗h4-1BB的阳性杂交瘤细胞，以PBS缓冲液稀释hIgG为1μg/mL，100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜。然后弃去溶液，PBST洗涤三次，再用3％BSA-PBST，37℃封闭1h。弃去溶液，PBST洗板三次，之后加入100μL杂交瘤上清，37℃孵育1h。如前述方法洗涤ELISA板，与过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-Fcγ抗体37℃共孵育1h后洗板，加TMB底物100μL，37℃孵育20min，最后用50μL硫酸终止，于酶标仪上，450nm处读板。
FACS筛选与人4-1BB结合的杂交瘤细胞：为筛选到能与h4-1BB结合的杂交瘤细胞，将表达h4-1BB的CHO-K1与杂交瘤上清共孵育后，再与ifluor 647标记的羊抗鼠IgG二抗结合，同时使用对应的母本细胞系做阴性对照，小鼠IgG做同型对照，商业化的anti-4-1BBmAb作为阳性对照，并用FACS分析。
抗体的激活特性：体外实验测定抗体对人PBMC的T细胞活化作用。首先从人PBMC中分离CD3+T细胞，用anti-CD3mAb活化得到的CD3+T细胞，与杂交瘤上清共孵育，再通过ELISA的方法测定IFN-γ分泌，通过IFN-γ分泌的测定间接反应抗体对T细胞的激活活性。结果如图1所示,杂交瘤产生的分泌的抗体ab1能够显著的刺激T细胞的活性,促进T细胞分泌IFN-γ.
分泌的抗体能与h4-1BB结合的杂交瘤细胞进一步扩增并亚克隆。阳性杂交瘤细胞计数后，用有限稀释法将每株母克隆亚两块96孔板，直至抗体分泌阳性率大于95％，扩大培养并及时液氮冻存。
实施例2：抗h4-1BB嵌合抗体的制备
抗体cDNA的制备：以异硫氰酸胍－苯酚－氯仿法提取实施例1制得的杂交瘤细胞总RNA，以RNA为模板，采用cDNA合成试剂盒合成cDNA第一条链。
抗体可变区基因克隆及序列分析：采用文献报道的通用引物，以cDNA第一条链为模板，PCR扩增抗体VH和VL序列，VH和VL分别与T载体连接，并转化大肠杆菌，经菌落PCR鉴定阳性菌后进行测序，测序结果用IMGT/QUEST及IgBlast分析软件对抗体的轻链和重链基因进行了确认。
嵌合抗体的真核表达载体的构建：将鼠源性抗体重链V区序列和人IgG1 CH基因进行拼接到pRBH5载体，将轻链的V区序列和人IgG Cκ基因进行拼接到pRBL2载体。再进行测序鉴定，测定结果显示其包含如SEQ ID NO:11所示的重链可变区核苷酸序列和如SEQ ID NO:12所示的轻链可变区核苷酸序列。
SEQ ID NO:11
caggttcagctgcagcagtctggagctgagctggtaaggcctgggacttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggatacgccttcactaactactggctaggttgggtaaagcagaggcctggacatggacttgagtggattggagatatttaccctggaaatggaaattcttactataatgagaagttcaagggaagagccacactgactgcagacaaatcctcgagcacagtctatatgcagctcagtagcctgacatctgaggactctgttgtctatttctgtacaagatcatcctcatactatagggatgttatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcg
SEQ ID NO:12
gacatccagatgactcagtctccagcctccctatctgcatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtcgagcaagtgaaaatatttacagttatttagtatggtatcagcagaaacagggaaaatctcctcaactcctggtctataatgcaaaaaccttagcagaaggtgtgtcatcaaggttcagtggcagtggatcaggcacacagttttctctgaagatcaacagcctgcagcctgaagattttgggagttattactgtcaacatcattatggaactccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgg
嵌合抗体的表达、纯化：以试剂盒抽提的重组质粒通过阳离子聚合物法转染HEK293F细胞，同时转染空质粒作为对照。6d后，收集转染质粒的HEK 293F细胞的培养上清，用Protein A亲和柱分离纯化嵌合抗体。将纯化后抗体用PBS进行透析。
实施例3：抗体的体外活性鉴定
抗体的亲和力：利用BIAcore T200测定实施例2制得的纯化后的抗体与h4-1BB的结合动力学。采用氨基偶联的方法将1mg/mL的抗原(h4-1BB-Fc融合蛋白)偶联于CM5芯片表面，抗体的浓度在0.3125-5.0μg/mL以30μL/min流速结合300s，随后进行300s的解离。Biacore T200记录的数据采用Biacore T200 Evaluation Software进行分析。结果如表1所示。
表1
Figure BDA0001824164190000091
抗体的激活特性：体外实验测定实施例2制得的纯化后的抗体对人PBMC的活化作用。首先使用抗凝采血管采血，将采血管里的血液和抗凝素的混合物加入离心管中，使用DPBS均匀洗涤采血管，2000rpm/min离心10min，弃上层血浆，下层血细胞加入等体积的DPBS稀释，再将其缓慢加入Ficoll中，2000rpm/min离心10min，进行密度梯度离心分层。弃去上清液，缓慢吸出PBMC并加入DPBS洗涤PBMC，2000rpm/min离心10min，弃去上清，采用DPBS重悬PBMC，1200rpm/min，离心10min，弃上清液，吸取完全培养基(RPMI1640+10wt％FBS+1wt％PS)重悬PBMC细胞密度至5×107cells/mL。
采用anti-CD3mAb(1μg/mL)活化PBMC细胞(2×105cell/well)，再与抗h4-1BB单克隆抗体(10μg/mL以3倍梯度稀释，共8个浓度梯度)共孵育，同时以CD28(2μg/mL)为阳性对照，最后经ELISA的方法测定IFN-γ分泌，通过IFN-γ分泌的测定间接反应抗体对PBMC细胞的激活活性。ab1嵌合抗体对对人PBMC中T淋巴细胞的体外活化作用见图2。其中，ab1嵌合抗体对PBMC的活化作用明显呈现浓度依赖性。
实施例4：抗体的结合特异性
ELISA测定抗人4-1BB抗体ab1的结合特异性。人OX-40或4-1BB蛋白(1μg/mL)包被ELISA板，4℃孵育过夜；PBST(0.1％Tween 20)洗涤3次，再以3％BSA封闭1h；洗涤3次，加入实施例2制得的纯化后的抗人4-1BB抗体ab1，孵育1h；洗涤3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG(1:2000稀释)，孵育1h；洗涤3次，然后加入底物溶液(TMB)，室温避光显色；最后，加入终止液(2N H2SO4)，于450nm处读取光密度(optical density；OD)值。结果显示，克隆号为58A10H5的抗人4-1BB抗体可以特异性结合人4-1BB，而不与其同家族成员OX-40发生非特异结合，如图3所示。
实施例5：抗体的物种交叉反应性
采用ELISA方法鉴定该抗体与食蟹猴4-1BB分子的交叉反应活性，以人4-1BB或食蟹猴4-1BB(1μg/mL)包被ELISA板，4℃孵育过夜；PBST(0.1％Tween 20)洗涤3次，再以3％BSA封闭1h；洗涤3次，加入实施例2制得的纯化后的抗人4-1BB抗体，孵育1h；洗涤3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG(1:2000稀释)，孵育1h；洗涤3次，然后加入底物溶液(TMB)，室温避光显色；最后，加入终止液(2N H2SO4)，于450nm处读取光密度(opticaldensity；OD)值。结果见图4，由拟合曲线可知，该抗体与人4-1BB蛋白的EC50为0.67nM，与食蟹猴4-1BB蛋白的EC50为2.67nM，表明本实验的抗人4-1BB抗体与食蟹猴4-1BB蛋白之间具有交叉反应活性。
实施例6：人源化抗人4-1BB抗体
为进一步降低抗人4-1BB抗体ab1的免疫原性，本文采用模板替换的方法进行人源化改造。首先采用Blastp在线检索与抗体VH或VL的氨基酸序列同源的人源抗体。然后利用easymodeller生成抗体的三维空间模型。再将模型导入SAVES服务器，判定模型的可行性。根据抗体序列与人源序列对比信息分析，选取同源度最高的抗体胚系基因作为人源化抗体模板，利用IMGT网站划分模板与目标抗体的框架区和高度可变区，将目标抗体的可变区替换模板的可变区，结合模建结果和抗体可变区序列获得关键氨基酸的序列信息，再将鼠源可变区中的关键氨基酸回复突变，获得人源化抗体序列。轻链序列见SEQ ID NO:9，重链序列见SEQ ID NO:10。最后合成人源化抗体基因，并构建至本实验室的表达载体(pRBH5/pRBL2)中，将嵌合抗体和人源化抗体，转染HEK293细胞，并采用Protein A纯化后，采用ELISA检测人源化前后抗体的结合活性的变化。结果见图5。
SEQ ID NO:9
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASENIYSYLVWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGAGTKLEI
KR
SEQ ID NO:10
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYWLGWVRQAPGHGLEWMGDIYPGNGNSYYAQKFQGRVTMTRDKSSSTVYMELSSLRSEDTAVYFCTRSSSYYRDVMDYWGQGTLVTVSS
实施例7：抗人4-1BB抗体ab1人源化单克隆抗体的抗肿瘤活性
将实施例6中获得的ab1的人源化后的重链可变区序列分别与人IgG1，IgG4的重链恒定区序列进行拼接，获得人源化的ab1IgG1，IgG4重链完整序列。序列见SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14。
SEQ ID NO13：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYWLGWVRQAPGHGLEWMGDIYPGNGNSYYAQKFQGRVTMTRDKSSSTVYMELSSLRSEDTAVYFCTRSSSYYRDVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO14：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYWLGWVRQAPGHGLEWMGDIYPGNGNSYYAQKFQGRVTMTRDKSSSTVYMELSSLRSEDTAVYFCTRSSSYYRDVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
将实施例6中获得的ab1的人源化后的轻链可变区序列与人kappa轻链的恒定区序列进行拼接，获得人源化的ab1轻链完整序列。序列见SEQ ID NO:15。
SEQ ID NO:15
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASENIYSYLVWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
通过包含人源化ab1完整序列的表达载体瞬时转染CHO-K1细胞，并通过Protein A亲和层析纯化以及离子交换层析纯化获得用于小鼠肿瘤模型体内药效实验所需的人源化ab1IgG1抗体和IgG4抗体。
将MC38结肠癌细胞5×105个/0.1mL接种于雌性B-h4-1BB人源化小鼠右侧前肋部皮下，待肿瘤生长到约150mm3时按肿瘤体积随机分组，每组6只，共2组，分别为：对照组(PBS溶剂)和实验组(人源化ab1IgG1和人源化ab1 IgG4)。给药途径为腹腔注射,给药剂量为10mg/kg体重,给药频率为1dos/3天，共8次给药，分组给药第21天后结束实验。每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。实验结束时，动物安乐死，剥取肿瘤称重、拍照，计算相对肿瘤抑制率(TGI)和瘤重抑制率(IRTW)。抗人4-1BB单抗对小鼠MC38肿瘤模型的肿瘤体积变化结果见图6。由结果分析可知其ab1IgG1和ab1IgG4的相对肿瘤抑制率(TGI)分别为99.84％和94.61％，接受给药的动物肿瘤基本上完全消失。
序列表
<110> 瑞阳（苏州）生物科技有限公司
<120> 一种激动型4-1BB单克隆抗体
<150> 201710946874X
<151> 2017-10-12
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
Asp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
Ser Ser Ser Tyr Tyr Arg Asp Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Val
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Val Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Ser Ser Tyr Tyr Arg Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 9
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 9
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Ser Ser Tyr Tyr Arg Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 11
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aactactggc taggttgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gacttgagtg gattggagat atttaccctg gaaatggaaa ttcttactat 180
aatgagaagt tcaagggaag agccacactg actgcagaca aatcctcgag cacagtctat 240
atgcagctca gtagcctgac atctgaggac tctgttgtct atttctgtac aagatcatcc 300
tcatactata gggatgttat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctcg 360
<210> 12
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 12
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtga aaatatttac agttatttag tatggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcaactcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgtcatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat cattatggaa ctccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acgg 324
<210> 13
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Ser Ser Tyr Tyr Arg Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 14
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Ser Ser Tyr Tyr Arg Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 15
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (14)

1.一种激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1区，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2区及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3区；所述的轻链可变区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR1区，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2区及氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR3区。
2.根据权利要求1所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7所示的重链可变区。
3.根据权利要求1所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型4-1BB单克隆抗体具有如下一种或多种性质：
（a）与人4-1BB特异性结合，
（b）激活T细胞，
（c）抑制肿瘤细胞生长，
（d）治疗癌症。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型4-1BB单克隆抗体包括重链和轻链。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型4-1BB单克隆抗体为IgG、IgA、IgE、IgM或IgD。
7.根据权利要求6所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型4-1BB单克隆抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
8.根据权利要求6所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型4-1BB单克隆抗体为IgG1。
9.一种人源化抗人4-1BB 抗体，其特征在于：所述的人源化抗人4-1BB 抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述的轻链可变区序列如SEQ ID NO:9所示，所述的重链可变区序列如SEQ ID NO:10所示。
10.一种如权利要求9述的人源化抗人4-1BB 抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求1至8中任一项所述的激动型4-1BB单克隆抗体采用模板替换的方法进行人源化改造。
11.一种编码权利要求1至8中任一项所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求9所述的人源化抗人4-1BB 抗体的核酸。
12.一种表达权利要求11所述的核酸的宿主细胞。
13.一种如权利要求1至8中任一项所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求9所述的人源化抗人4-1BB 抗体在制备抑制肠癌细胞的荷瘤生长的药物中的应用。
14.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1至8中任一项所述的激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求9所述的人源化抗人4-1BB 抗体，以及药物可接受的载体。
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