CN115850487A

CN115850487A - 一种抗人cd137抗体、核酸分子及应用

Info

Publication number: CN115850487A
Application number: CN202211633205.4A
Authority: CN
Inventors: 张洪涛; 金鑫; 王敬慧; 易玲; 闫卓红; 王小珏; 韦攀健; 杨斌
Original assignee: Beijing Chest Hospital; Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Current assignee: Beijing Chest Hospital; Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Priority date: 2022-12-19
Filing date: 2022-12-19
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明公开了一种抗人CD137抗体、核酸分子及应用，涉及生物医药技术领域。该抗体可交叉结合猴CD137，表现出偏弱的协同刺激T细胞刺激的活性，该克隆命名为BXME8，具有独特的可变区序列，其对CD137分子的天然配受体结合有封阻活性，为“封阻型”抗体。本发明实现了全抗体真核表达、纯化批量制备，抗体可用于人或猴CD137检测，在功能上表现出较为温和的协同刺激T细胞活化、增殖，显示出对CD8+T细胞的选择扩增作用，基于该抗体的全长序列可以实施进一步的工程化改造、表达和应用，具有潜在的体内外适宜免疫调节活性。

Description

一种抗人CD137抗体、核酸分子及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种抗人CD137抗体、核酸分子及应用。

背景技术

肿瘤的免疫治疗获得突破进展，T细胞是主要效应细胞，近几年来以PD-1抗体为代表的T细胞免疫调节抗体快速进入临床，广谱用于肿瘤治疗，但有效人群比例较低，在最大适应症肺癌有效率约为18％。联合免疫治疗是提高疗效的发展方向，包括PD-1抗体联合化疗、放疗、抗血管生成药物和联合治疗策略，此对于扩大收益人群，延长病人存活、甚至治愈肿瘤具有现实意义，也是国际公认的研究方向。

1993年Kwon首先从CD8+T细胞克隆出了4-1BB(CD137)，具有协同刺激T细胞作用，随后报道了CD137抗体体内具有调节免疫、根除小鼠肿瘤移植模型效能，随后临床前系列抗肿瘤治疗研究中显现了该靶点抗体优异的抗肿瘤活性，包括低免疫原性肿瘤。CD137分子调控因此成为最受关注的抗肿瘤免疫调控靶点之一。CD137是一个经典的T细胞协同活化分子，呈抗原诱导性表达，特别是偏于CD8+T细胞表达，其调控有助于CD8+T细胞存活，促进记忆T细胞分化，CD8+T细胞是抗肿瘤的核心效应细胞。CD137分子被引入嵌合抗原受体T细胞(CAR-T cells,Chimeric Antigen Receptor T-Cells)被认为是迄今CAR-T细胞的最佳调节分子，也显示出该分子对肿瘤免疫调控治疗具有重要意义。CD137一直以来是受到高度关注的免疫调节点，包括肿瘤和某些自身免疫病治疗潜力，其抗体调节制剂是最主要的应用形式。

Urelumab是第一个准入临床的CD137抗体，充分表现出高效的体内免疫T细胞免疫激活能力，超强的免疫激活甚至出现一定的免疫过激反应，随后，另一个不同的抗体Utomilumab准入临床实验，但其临床效果不及Urelumab，这两个抗体仍在持续的临床验证中[1,2]。基于此，国际上正立足开发更好临床效果的CD137抗体，近来报道有新的CD137抗体进入临床前研究，考量进入临床可能，包括CD137单独和PD-1联合治疗，表现出对新型抗体的渴望及其研发的发展趋向[3]。

立足近年基础研究分析，早期产生的Urelumab和Utomilumab特异性结合位点存在明显的不同点，一个是天然配受体非封阻性，另一个则具有天然配受体封阻性，这可能导致不同的免疫治疗效果和毒性反应，平衡协同刺激效能和毒性反应，这是临床需要考量的重要问题。鉴于上述超强的协同刺激CD137抗体的系统应用(即，静脉用药)可能产生免疫过激活化现象，产生系统炎症副反应，而适度刺激强度的协同刺激CD137抗体，增加安全性，也适于导向肿瘤，进一步降低用量，有效的进行局部免疫调节[4]，有可能避免系统应用过程中的伴随毒性。就抗体本身而言，急切需要认知个性化CD137抗体“强”协同刺激T细胞和“弱”协同刺激T细胞产生的机理和分子基础，才可能适于不同需要的临床检测和治疗应用，基于这些新的认知，需要产出特征鲜明的新一代抗人CD137单克隆抗体。这一过程通常是从众多CD137抗体中“精细”筛选出差异性和特征鲜明的CD137抗体克隆，而活性特点根本上由抗体克隆独特序列、并与其形成独特空间结构的个性密切相关。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人CD137抗体，被命名为BXME8，该抗体具有明显“偏弱”协同刺激T细胞刺激活性，具有突出的特点。对抗人CD137的天然配受体结合有封阻活性，为“封阻型”抗体，且全抗体实现了真核表达、纯化批量制备，可用于人和猴CD137检测，在功能上仍能适宜地协同刺激T细胞活化、增殖，尤其是用于扩增CD8+T细胞，抗体的全长序列可以进一步工程化改造表达。

除非另外定义，在此使用的所有技术术语、注释以及其他科学术语或科学术语是旨在具有本发明涉及领域普通技术人员所通常理解的含义。在一些情况中，为了清楚和/或为了便于引用在此定义了具有通常理解含义的术语，并且在此包括这类定义不必解释成表示与本领域通常理解的具有显著差异。在此说明或引用的许多技术和步骤被本领域普通技术人员良好地理解并且使用常规方法一般性地使用。除非另外说明，通常地根据制造商限定的实验方案和/或参数来执行涉及使用可商购的试剂盒和试剂的步骤。

本发明是这样实现的：

发明人通过对一组抗人CD137抗体比较研究，探寻了具有不同协同活性特征且特征独特的抗体，特别是对抗体结合CD137胞外区CRDs(cysteine rich domains)进行了作图，明确抗体结合CD137-CRD的结构分区，印证了不同抗体克隆协同刺激活性与配受体结合封阻性无关，同时靠近结合CD137-CRDI抗体也不是产生高协同刺激活性的主要原因，显示不同协同抗体免疫协同刺激活性抗体产生，具有高度的空间结构依赖性。成功筛选出其中一株明显偏弱协同刺激T细胞刺激活性的CD137抗体(命名为：BXME8)，特点突出，获取了该抗体特异性可变区序列。本发明将系统介绍该株抗体特点及基本特征、生产制备，并提供其应用范围。

第一方面，本发明提供了一种抗人CD137的抗体或其功能性片段，该抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

CDR-VH1：SYWIN；

CDR-VH2：NIYPSDSYTNYNQKFKD；

CDR-VH3：FYYGGSYYAMDY；

CDR-VL1：RASQDISNYLN；

CDR-VL2：YTSRLHS；

CDR-VL3：QQGYTLPYT。

本发明提供了一种新型抗人CD137(也称为抗人4-1BB)抗体，该抗体可交叉结合猴(Rhesus)天然CD137膜表达蛋白，对人T细胞活化特征偏弱，发明人将其命名为克隆BXME8，该单克隆抗体有独特的可变区序列，对该分子的天然配受体结合有封阻活性，为“封阻型”抗体，全抗体实现了真核表达、纯化批量制备，可用于人和猴4-1BB检测，在功能上适度协同刺激T细胞活化、增殖，尤其是用于激活CD8+T细胞的扩增，抗体的全长序列可以进一步工程化改造表达。

本发明提供的BXME8抗体具有较高的亲和力，为CD137靶点相关的癌症治疗提供了一种新的抗体选择。

术语“抗体”特别地是指包含通过二硫键连接的至少两个重链和两个轻链的蛋白质。术语“抗体”包括天然产生的抗体以及抗体的重组形式，例如，在原核生物中表达的抗体、未糖基化的抗体、人源抗体和嵌合抗体。每个重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。每个轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链恒定区包含三个或-在IgM-或IgE-型抗体的情况下-四个重链恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)，其中第一个恒定结构域CH1与可变区相邻，并且可以通过铰链区连接第二个恒定结构域CH2。轻链恒定区仅由一个恒定结构域组成。可变区可以进一步细分成超可变区，称为互补决定区(CDR)，其中散布更保守的区域，称为框架区(FR)，其中每个可变区包含三个CDR和四个FR。然而，根据本发明的术语“抗体”还包括如重链抗体(即，抗体只由一个或多个(特别是两个)重链组成)和纳米抗体(即，抗体只由单个单体可变结构域组成)这样的抗体。

在本发明应用较佳的实施方式中，抗体包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。

在一种可选的实施方式中，抗体还包括恒定区。

在一种可选的实施方式中，恒定区选自IgM、IgD、IgG、IgA和IgE中的任意一种的恒定区。

例如IgG选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。

抗体的轻链恒定区选自κ型轻链或λ型轻链的恒定区。

抗体的恒定区可以源自任何人抗体或人抗体共有序列，也可以选自其他种属来源的恒定区。特别地，重链恒定区可以是任何类型的，如γ、δ、α、μ或ε型重链。

在一种可选的实施方式中，恒定区的种属来源为小鼠；恒定区的轻链恒定区的序列如SEQ ID NO.9所示，恒定区的重链恒定区的序列如SEQ ID NO.10所示。

BXME8抗体含信号肽的重链具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。含信号肽的轻链具有如SEQ IDNO.12所示的氨基酸序列。

在一种可选的实施方式中，功能性片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、双特异性抗体和scFv中的任意一种。

第二方面，本发明还提供了一种检测CD137蛋白的试剂或试剂盒，其包括上述的抗人CD137的抗体或其功能性片段。

本发明提供的BXME8抗体具有独特的可变区序列，对于人和猴天然细胞膜表达的CD137蛋白具有良好的结合活性，可用于人和猴CD137的检测。

在可选的实施方式中，上述试剂或试剂盒中抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。

可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。

在可选的实施方式中，可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

在可选的实施方式中，化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在可选的实施方式中，纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体。纳米颗粒例如选自：有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

在可选的实施方式中，胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、乳胶、胶体硒和染料标记的微球。

在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银。

第三方面，本发明还提供了一种抗人CD137的抗体或其功能性片段在如下任一项中的应用：

(1)扩增T细胞亚群；

(2)制备促进T淋巴细胞IFN-γ分泌产品；

(3)制备促进T淋巴细胞IL-10分泌产品；

(4)制备促进T淋巴细胞活化和/或增殖产品；

(5)制备检测CD137产品；

(6)制备免疫调节和联合免疫调节治疗药物；

在一种可选的实施方式中，T细胞亚群选自：CD4+T细胞和CD8+T细胞中的至少一种；

在一种可选的实施方式中，T细胞亚群选自CD8+T细胞；

在一种可选的实施方式中，应用(4)中，抗人CD137的抗体或其功能性片段协同抗原刺激信号试剂或协同刺激信号试剂在制备促进T淋巴细胞活化和/或增殖产品。

在一种可选的实施方式中，抗原刺激信号试剂选自抗T细胞抗原受体(T cellreceptor,TCR)抗体、抗CD3γ抗体、抗CD3δ抗体、抗CD3ε抗体、抗CD3ζ抗体。

协同刺激信号试剂选自抗CD28抗体、抗CD27抗体、抗CD134(OX40)、抗CD26抗体、抗CD40抗体、抗GITR抗体、抗CD270抗体、抗CD5抗体、抗CD154抗体、抗CD79a抗体、抗CD22抗体、抗CD66d抗体、抗CD2抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD79b抗体、和抗ICOS抗体中的至少一种。

第四方面，本发明还提供了一种抗人CD137的抗体或其功能性片段与抗原刺激信号试剂或协同刺激信号试剂联用在制备抗肿瘤的药物中的用途，抗原刺激信号试剂选自抗T细胞抗原受体T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)抗体、抗CD3γ抗体、抗CD3δ抗体、抗CD3ε抗体、抗CD3ζ抗体；协同刺激信号试剂选自抗CD28抗体、抗CD27抗体、抗CD134(OX40)、抗CD26抗体、抗CD40抗体、抗GITR抗体、抗CD270抗体、抗CD5抗体、抗CD154抗体、抗CD79a抗体、抗CD22抗体、抗CD66d抗体、抗CD2抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD79b抗体和抗ICOS抗体等协同分子活性抗体中的至少一种。

特别是抗人CD137的抗体或其功能性片段与抗CD3抗体联用后，具有比单纯的抗CD3抗体刺激更强的协同刺激效果，显著促进了扩增CD8+T细胞，并促进效应细胞和记忆细胞分化形成。

在一种可选的实施方式中，肿瘤为实体瘤、血液肿瘤或某些自身免疫病。

在一种可选的实施方式中，血液肿瘤例如选自急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)或急性淋巴细胞白血病(ALL)。

在一种可选的实施方式中，上述自身免疫病选自以下任意一种：I型糖尿病、系统性红斑狼疮潜在的应用发展。

在一种可选的实施方式中，肿瘤为消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、生殖系统肿瘤、运动系统肿瘤、神经系统肿瘤、内分泌系统肿瘤、循环系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、生殖系统肿瘤中的一种或多种。

在一种可选的实施方式中，肿瘤为消化系统肿瘤。

更在一种可选的实施方式中，消化系统肿瘤为食道肿瘤、胃肿瘤、贲门肿瘤、肠肿瘤、肝肿瘤、胆囊肿瘤中的一种或多种。

在一种可选的实施方式中，肿瘤为结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌，结直肠肿瘤包括息肉样型、狭窄型和溃疡型中的一种或多种。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述肿瘤为上皮性肿瘤，包括不限于乳头状瘤、胃肠癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、腺癌、乳腺癌、腺瘤或鳞癌。

胃肠癌选自食道癌、胆囊癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、小肠癌、结肠直肠癌和肛门癌。

在一种可选的实施方式中，腺癌包括不限于肺腺癌、甲状腺癌、涎腺癌或胰腺癌。

在一种可选的实施方式中，腺瘤包括不限于囊腺瘤、纤维腺瘤、多形性腺瘤或息肉状腺瘤。

在一种可选的实施方式中，乳腺癌包括不限于乳腺导管癌、乳腺上皮癌或乳腺小叶癌。乳腺癌，优选II期至IV期和/或不良分化的侵袭性导管癌、粉刺癌以及髓样癌(优选2级)。

卵巢癌，浆液性和粘液性癌(优选地Ic期至IIIb期)、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤。

子宫癌，优选地包括子宫内膜样腺癌(优选地I期至IIIc期)。

膀胱癌，优选地包括移行细胞癌(优选地II期至IV期)。

肺癌，优选地包括小细胞肺癌(优选地I期至IIIb期)、非小细胞肺癌(优选地不良至中度分化的鳞状和腺癌)以及大细胞肺癌。

鳞癌为口腔鳞癌、咽鳞癌、喉癌、食道鳞癌(例如食管鳞癌)、唇的鳞状细胞癌、子宫鳞癌、阴道鳞癌和皮肤鳞癌中的一种或多种。

口腔鳞状上皮细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)又称口腔鳞癌。口腔鳞癌例如包括不限于舌鳞癌。

在其他实施方式中，上述鳞癌也可以是支气管、膀胱、肾盂等部位通过鳞状上皮化生而形成的鳞状细胞癌。

第五方面，本发明还提供了一种抗体偶联物，其含有上述抗人CD137的抗体或其功能性片段。

本发明的抗体偶联物可以利用各种标记偶联技术，如酶、荧光素和同位素等标记，用于检测。

与人源化的抗体或其抗原结合片段偶联的分子可以是成像剂，或其他分子。

成像剂例如可以是放射性元素、酶、当暴露于紫外等一定的光谱照射时能发出荧光的化学药品和其他物质。许多荧光材料是已知的并且可用作成像剂。这些成像剂包括例如荧光素、罗丹明、金胺、德克萨斯红、AMCA蓝和荧光黄。

可检测的成像剂包括但不限于放射性标记物例如同位素³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²¹I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、²¹¹At、¹⁹⁸Au、⁶⁷Cu、²²⁵Ac、²¹³Bi、⁹⁹Tc和¹⁸⁶Re，可使用抗体成像领域内已知的常规化学作用将其连接至本发明的抗体或其人源化抗体。成像剂还包括荧光标记物和在本领域中常规用于MRI-CT成像的标记物。它们还包括酶标记物，例如辣根过氧化物酶。标记物还包括化学部分例如生物素，其可通过结合至特定的关联(cognate)可检测部分例如经标记的抗生物素蛋白而被检测。

第六方面，本发明还提供了一种核酸分子，其编码上述抗人CD137的抗体或其功能性片段。

BXME8抗体含信号肽的重链的DNA序列如SEQ ID NO.13所示，BXME8抗体含信号肽的轻链的DNA序列如SEQ ID NO.14所示。

在此用的术语“核酸分子”是指由天然碱基、糖和糖间(骨架)键连组成的核苷(nucleoside)或核苷酸(nucleotide)单体的序列。该术语也包括含有非天然发生的单体或其部分的修饰过的或取代过的序列。本发明的核酸分子可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并可包含天然碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。也可含修饰的碱基。这些修饰的碱基的例子包括含氮和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。

第七方面，本发明还提供了一种载体，其含有上述的核酸分子。

在此以其最通常的意思来使用术语“载体”并且包括用于核酸的任何中间媒介物，其能够使所述核酸例如引入原核生物和/或真核生物细胞中，并且在合适的情况下，整合至基因组中。这种类型的载体优选在细胞中复制和/或表达。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。如在此所用的术语“质粒”通常涉及染色体外基因材料的构建体，通常是环状DNA双链，其可以独立于染色体DNA而进行复制。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。

在一种可选的实施方式中，上述载体为表达载体，表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

第八方面，本发明还提供了一种重组细胞，其含有上述的载体。

术语“重组细胞”指的是可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明的术语“重组细胞”包含原核生物(例如，大肠杆菌)或真核生物细胞(例如，哺乳动物细胞，特别是人细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，如来自人、鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞。细胞可以源自多个组织类型，并且包含初级细胞和细胞系。核酸可以以单拷贝形式或两个或多个拷贝形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，在重组细胞中表达。

在一种可选的实施方式中，重组细胞为真核细胞。

在一种可选的实施方式中，重组细胞为哺乳动物细胞。

在一种可选的实施方式中，重组细胞为HEK293。

第九方面，本发明还提供了一种制备上述的抗人CD137的抗体或其功能性片段的方法，其包括：(a)培养上述的重组细胞；(b)从步骤(a)的培养产物中回收抗人CD137的抗体或其功能性片段。

步骤(a)中，在合适的培养基中培养上述的重组细胞，步骤(b)中的培养产物是指培养基或培养细胞。

根据所用的重组细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于重组细胞生长的条件下进行培养。当重组细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的步骤(b)可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化抗人CD137的抗体。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的抗人CD137的抗体能够结合人和猴子可溶性CD137蛋白，能够高亲和力地结合人或猴的天然细胞膜表达的CD137蛋白，且不具有交叉结合鼠CD137分子的活性。该抗体可以用于开发相应的检测人或猴的CD137的试剂或试剂盒。

发明人对抗体结合CD137胞外区CRDs(cysteine rich domains)进行作图，明确抗体结合CD137-CRD的结构分区，该抗体结合CD137胞外域的CRDIV+STP区域。印证了不同抗体克隆协同刺激活性与配受体结合封阻性无关，同时靠近结合CD137-CRDI抗体也不是产生高协同刺激活性的主要原因，显示不同协同抗体免疫协同刺激活性抗体产生，具有高度的空间结构依赖性。

该抗体对CD137分子的天然配受体结合有封阻活性，为“封阻型”抗体，全抗体实现了真核表达、纯化批量制备。

本发明提供的抗人CD137抗体在功能上偏弱协同刺激T细胞活化、增殖，特点突出，尤其是用于激活CD8+T细胞的扩增并维持存活，抗体的全长序列可以进一步工程化改造表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为两种可溶性CD137蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图，(A)CD137-His蛋白；(B)CD137-Fc蛋白；CD137胞外区DNA序列(NP-001552.2)表达的His和Fc融合蛋白，表达细胞HEK293细胞，纯度95％；

图2为本发明提供的抗体和天然人CD137L结合人CD137-His蛋白的ELISA测定结果图；具体为本发明提供的抗体、天然配体蛋白(CD137L-Fc)与CD137-His蛋白的ELISA反应测定的OD450数值，不加抗体和CD137L-Fc的对照OD值<0.1；

图3为流式细胞仪检测转染293-T细胞膜表达CD137的细胞散点图，如图显示质粒转染GFP蛋白检出率约18％，本发明提供的抗体BXMD12检测有效转染细胞膜CD137表达率为17.0％，表明转染外源人CD137分子的细胞CD137蛋白有效表达，经本发明提供的抗体染色CD137蛋白后，其检出率近100％；

图4为本发明提供的抗体与小鼠CD137结合的检查试验结果统计图，ELISA检测本发明提供的抗体与鼠CD137蛋白结合情况显示，本发明提供的抗体不结合鼠CD137分子，而人CD137配体(CD137L)则明显结合鼠CD137-His蛋白，结果表明本发明提供的抗体不具有交叉结合鼠CD137分子活性；

图5为ELISA检测本发明提供的抗体与猴可溶CD137-His及其膜表达蛋白结合情况以及流式细胞术检测散点图；A，ELISA检测本发明提供的抗体与猴可溶CD137蛋白结合情况显示，本发明提供的抗体结合猴可溶CD137-His蛋白，且相较CD137L结合猴可溶性CD137-His蛋白活性更高；B，流式细胞术检测散点图显示，本发明提供的抗体可有效结合膜表达形式的猴CD137；

图6为人CD137胞外区域CRD及其表达片段蛋白示意图；图6显示hCD137整个细胞外区域和涵盖不同的CD137-CRD片段；hE，hE3，hE4分别代表不同的hCD137表达片段；STP区(丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸富含区)，位于160-186氨基酸；

图7为ELISA检测抗体对配体的封阻试验结果图，图7横坐标为抗体系列稀释单位，OD值反映抗体干扰CD137-CD137L程度，OD值越低表明越干扰配受体结合，结果显示BXME8抗体可封阻CD137-CD137L结合，其中BXE8即为BXME8，其他的抗体分别为BXF12、BXA10、BXG12、BXMD12、BXD10、BXD3和BXC11。

图8为BLI测得不同稀释浓度梯度(0-0.08nM)CD137-His融合蛋白结合及其解离曲线，通过生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)分析BXME8抗体亲和力；

图9为BXME8抗体应用于蛋白免疫印迹的实验结果图；图9显示，BXME8抗体在非还原(不加2-巯基乙醇)状态下的Western Blot显示具有结合CD137-His蛋白活性(附图9A)，在还原状态(加2-巯基乙醇)下不结合CD137-His融合蛋白(附图9B)；

图10为抗体协同刺激扩增淋巴细胞的实验结果图；用OKT3(0.1ng/ml)刺激5×10⁵个PBMC(细胞浓度1×10⁶/ml)12小时，然后分别加入抗CD28、BXD12、BXE8、BXD3 2μg/ml单抗，每孔加入IL-250IU/ml。继续培养至第10天，用胎盘蓝染色法计数细胞总数，图中BXD12即BXMD12，BXE8即BXME8，星号代表所标识组之间细胞数量值具有统计学差别；

图11为BXME8协同OKT3刺激淋巴细胞产生细胞因子的实验结果图；OKT3+CD137刺激PBMC培养72小时后，收集培养上清液，测定IFNγ(A)和IL-10(B)浓度，ELISA检测方上清两种细胞因子浓度，本发明提供的抗体明显地协助OKT3激活淋巴细胞，促进IFNγ和IL-10产生，单独OKT3培养对照IFNγ和IL-10浓度分别小于500pg/ml和5pg/ml，BXME8显示出具有促进IFNγ和IL-10产生能力。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1本发明抗体的制备过程

1.动物的免疫

免疫原采用可溶性真核表达的人CD137标签(Fc)蛋白(义翘公司)，为人IgG1-Fc融合蛋白，CD137包含胞外区域氨基酸(Met-Gln186)，表达于HEK293细胞，经过ProteinA亲和层析纯化，蛋白纯度>90％。选择4-6周龄纯种BALB/c小鼠，在融合前2个月开始初次免疫，为增加可溶性蛋白免疫原性，本实验中采用的佐剂包括福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂(Sigma)。

免疫程序如下：第0天，进行初免，完全佐剂乳化抗原，每只小鼠0.25mL，10-100μg，腹腔注射免疫，共5只小鼠；第14天，二免，不完全佐剂乳化抗原，每只小鼠0.25mL，10-50μg，腹腔注射免疫；第24天，尾静脉采血，于37℃1小时，4℃2小时后离心，收集上清，初次检测血清效价；第35天，三免，不完全佐剂乳化抗原，每只小鼠0.25mL，10-50μg，腹腔注射免疫；在第45天，尾静脉采血，37℃1小时，4℃2小时后离心，收集上清，ELISA检测血清效价。所免疫的5只小鼠效价均达到或超过1:512000，选择2只效价超过1:512000的小鼠，在第56天，进行终免，抗原溶于PBS，每只小鼠0.25mL，10-50μg，尾静脉及腹腔注射免疫。一周后(第60天)，进行后续的细胞融合。

2.细胞融合

(1)饲养细胞制备：选用小鼠腹腔巨噬细胞。与免疫小鼠相同品系的小鼠，为BALB/c小鼠6～10周龄，拉颈处死，浸泡在75％酒精内，3～5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5～6mL预冷的培养液，反复冲洗，吸出冲洗液，冲洗液放入10mL离心管，1200rpm/min分离5～6min，用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数至1×10⁵/mL，加入96孔板，100μL/孔，放入37℃CO₂孵箱培养。

(2)免疫脾细胞的制备：最后一次加强免疫3天后，将小鼠引颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次。

脾脏研碎，过不锈钢筛网，离心后，将细胞用培养液洗2次，计数，取10⁸个脾淋巴细胞悬液备用。

(3)制备骨髓瘤细胞：取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，计数，取1×10⁷个细胞备用。

(4)融合：

①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50mL离心管中用无血清不完全培养液洗1次，于1200rpm/min条件下离心8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

②90s内加入37℃预温的1mL 45％PEG(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动。于37℃水浴作用90s。

③加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL和6mL。

④于800rpm/min条件下离心6min。

⑤除上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬。

⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层96孔板内，每孔加100μL，一个免疫脾脏接种10块96孔板，共计20块。

⑦将培养板置37℃、5％CO₂培养箱中培养。

3.杂交瘤初筛及其分泌抗体检测

(1)HAT选择杂交瘤。脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，在HAT选择培养液中维持7～10天后，换用HT培养液，维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

(2)抗体的检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，包被2μg/mL浓度的人CD137-Fc和配对CD137-his(Met-Gln186，His融合蛋白，义翘)双筛选检测杂交瘤培养上清，通过酶标记的抗小鼠二抗和底物显色，并检测OD值。本试验中初步筛选出过40个阳性孔(CD137-Fc阴性和CD137-his阳性)，进一步克隆化。

4.杂交瘤克隆化

将检测为阳性杂交克隆进行克隆化，避免被抗体非分泌的细胞所抑制，造成抗体分泌细胞丢失，克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期再克隆，以防止杂交瘤细胞突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力，并经过冻融实验杂交瘤稳定。本实验中具体采用了有限稀释法进行克隆化，试验中筛选的抗体经过4次以上亚克隆。

(1)克隆前1天制备饲养细胞层(同细胞融合)。

(2)将要克隆杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹起，计数。

(3)调整细胞为3～10个细胞/mL。

(4)取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μL，孵育于37℃、5％CO₂孵箱中。

(5)在第7天换液，以后每2～3天换液1次。

(6)8～9天可见细胞克隆形成，及时ELISA检测抗体活性。

(7)将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。

(8)检测抗体，扩大培养，必要时，如此重复进行再克隆化，从中获得本实施例中的克隆BXME8。

5.杂交瘤细胞冻存与复苏

(1)细胞的培养过程中可能发生分泌抗体能力的丧失，杂交瘤冻存可验证杂交瘤稳定性和长期保存杂交瘤株。杂交瘤细胞的冻存每支安瓿含1×10⁷以上，细胞冻存液：50％小牛血清；40％不完全培养液；10％DMSO(二甲基亚砜)。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

(2)细胞复苏：将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5％CO₂孵箱中培养，当细胞形成集落时，ELISA检测上清抗体活性，本发明涉及杂交瘤经历反复冻融过程，其抗体分泌活性和产量稳定。

6.对单克隆抗体的核酸全长测序

依据

试剂(AMBION，CAT，编号：15596－026)技术手册，从杂交瘤BXME8细胞中分离出总RNA，依据PrimeSeCpTTM第一链cDNA合成试剂盒(Takara，CAT，号码：610A)技术手册，使用同种型特异性反义引物(或通用引物)将总RNA逆转录成cDNA，根据GESTcript的cDNA末端(RACE)快速扩增标准操作程序(SOP)扩增VH、VL、CH和CL的抗体片段，将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中、测序，可变区的序列分析工具：(i)NCBI NucleotideBLAST；(ii)IMGT/V Quest program；(iii)NCBI Ig BLAST.选用菌落PCR筛选具有正确大小插入物，不少于五个具有正确大小插入物的片段被测序，对不同克隆序列进行比对，得到一致测序结果(BXME8抗体含信号肽的重链具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。含信号肽的轻链具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。BXME8抗体含信号肽的重链的DNA序列如SEQ ID NO.13所示，BXME8抗体含信号肽的轻链的DNA序列如SEQ ID NO.14所示)。/>

如下本实施例2-8分别对抗体的生物特征进行检测。

实施例2 BXME8抗体结合可溶性CD137(soluble CD137,sCD137)蛋白

本发明提供的BXME8抗体确证对CD137胞外区的可溶性形式融合蛋白(包括人和猴)的结合，以人sCD37为例。

①检测材料采用采用了两种CD137融合蛋白：包括人CD137-Fc蛋白和CD137-His融合蛋白。两种CD137融合蛋白采用真核表达体系293细胞表达，经过亲和层析纯化，获得纯度大于90％纯化蛋白(见附图1：人CD137胞外区CD137-Fc和CD137-His融合表达蛋白电泳鉴定图)，两者分别以双聚体和单体形式存在；

②抗体特异性的结合上述两种sCD137蛋白实验验证过程如下：在96孔ELISA检测板中，包被1μg/ml人CD137-His蛋白，每孔100μl，4度过夜，用0.05％Tween-20洗涤液洗三次，用5％奶粉4度封闭过夜,再洗三次。加入本纯化抗体或人CD137配体(Arg71-Glu254,CD137L-Fc)1μg/ml，每孔100μl，37度2h。用0.05％Tween-20洗涤液洗五次，加入HRP标记的山羊抗人IgG(1:5000)100μl/孔，37度1h。0.05％Tween-20洗五次，加入TMB显色液避光反应5min，用硫酸终止液终止反应，用酶标仪检测450nm处的OD值。

附图2为ELISA测定本发明提供的BXME8抗体和CD137L分别与CD137-His蛋白结合的反应活性，结果显示抗体结合力明显高于天然CD137L对CD137-His蛋白的结合。

实施例3 BXME8抗体结合天然细胞膜表达CD137蛋白

用pCMV3-CD137-GFPSpark表达质粒，采用Invitrogen Lipofectamine 2000试剂转染培养的293T细胞，48h后收集细胞，取此表达质粒转染细胞1×10⁶置于流式管中，进行免疫荧光染色：首先加入1μg小鼠抗人CD137单抗，对照管加入1μg小鼠IgG1同种型作为对照，室温避光染色25min，用2ml 1％FBS的PBS缓冲液洗两次，再加入APC标记兔抗小鼠IgG二抗，室温避光染色25min，洗两次，将细胞重悬于200μl缓冲液中，用流式细胞仪检测转染293-T细胞膜表达CD137分子情况。

结果显示(如附图3)，抗体与293T-CD137转染细胞结合流式细胞术检测，其中对照抗体采用的是anti-mIgG1 isotype代替本发明中的小鼠抗人CD137单抗，结果显示质粒转染GFP蛋白检出率约18％，抗体BXME8检测有效转染细胞膜CD137表达率为17.0％，表明转染外源人CD137分子的细胞，经本发明提供的BXME8抗体染色CD137蛋白的有效表达，其检出率近100％，抗体具有结合天然结构细胞膜表达CD137蛋白活性。

实施例4BXME8抗体不交叉结合小鼠CD137蛋白

鼠CD137-His蛋白同样采用真核表达蛋白(重组HEK 293表达ECD-His-Tag融合蛋白，CD137为Met1-Leu187)。表达的小鼠CD137融合蛋白用于ELISA试验，用coating buffer稀释为1μg/ml浓度，100μl/孔加入96孔板中，4度包被过夜，洗涤液洗三次，加入200μl 5％奶粉封闭液4度过夜，再洗三次；加入100μl稀释抗体BXME8 100μl(1μg/ml)，37度2h。随后洗涤五次，加入酶标大鼠抗小鼠IgG(1:5000)100μl/孔，作用后加入显色液A+B显色。

结果显示，抗体BXME8不结合鼠CD137分子，而是结合人CD137配体，而CD137L则明显结合鼠CD137-His蛋白，见附图4，ELISA检测抗体BXME8与鼠CD137蛋白结合情况。结果表明本发明提供的BXME8抗体不具有交叉结合鼠CD137分子活性。

实施例5BXME8抗体交叉结合猴(Rhesus)天然CD137膜表达蛋白

猴CD137-His蛋白采用真核表达蛋白(重组HEK 293表达ECD-His-Tag融合蛋白，CD137为Met1-Leu186)，此外，用pCMV3-RhesusCD137-His质粒，转染293F细胞。猴CD137-His蛋白用于ELISA试验，与coating buffer稀释为1μg/ml浓度，100μl/孔加入96孔板中，4度包被过夜，洗涤液洗三次，加入200μl5％奶粉封闭液4度过夜，再洗三次，加入100μl由封闭液稀释的1μg/ml。加入本发明提供的BXME8抗体100μl(1μg/ml)，37度2h。随后洗涤五次，加入酶标大鼠抗猴IgG(1:5000)100μl/孔，作用后加入显色液A+B显色。

结果显示，本发明提供的BXME8抗体结合可溶性猴CD137-His蛋白，而人CD137配体(hCD137L)也明显结合猴CD137-His蛋白，具体见附图5A ELISA检测本发明提供的BXME8抗体与猴可溶CD137-His蛋白结合情况，结果表明本发明提供的BXME8抗体具有BXME8具有交叉结合猴可溶CD137蛋白活性，其活性高于人CD137配体交叉结合活性。

同时收集质粒转染细胞作为检测细胞膜上的Rhesus CD137蛋白流式细胞术，APC标记兔抗小鼠二抗测定小鼠抗人CD137单抗，结合转染293F表达CD137情况，通过质粒转染细胞用于细胞膜上的猴CD137蛋白表达的流式细胞术分析，APC标记抗小鼠二抗检测本抗人CD137单抗，测定结合转染293F表达CD137蛋白情况。

结果见附图5B：流式细胞术检测本发明提供的BXME8抗体BXD12与猴CD137-293F细胞膜表达蛋白结合。结果显示BXME8具有交叉结合细胞膜天然状态的猴CD137表达蛋白活性，可检出率为2.2％(293F细胞的质粒转染转染率约为2.2％)，表明转染猴CD137表达细胞100％检出率，而不结合抗体对照染色仅0.1％阳性细胞。BXME8与人可溶性和细胞膜表达CD137，以及与猴CD137的交叉结合反应性汇总见表1。

表1，本抗体与不同形式人和猴CD137蛋白结合情况

hCD137-His,人CD137-His；rCD137，猴CD137蛋白；++强结合，NO，不结合，YES，结合

实施例6BXME8抗体结合人CD137胞外半胱氨酸富集区(CRDs)的定位

(1)人CD137胞外区共包括186个氨基酸，有4个半胱氨酸富集区(CRDI，CRDII，CRDIII和CRDIV)，CRD中两个半胱氨酸间形成二硫键，产生局部空间结构，其中天然CD137L主要结合CD317-CRDIII，我们表达胞外区蛋白hE基础上，进一步表达了hE3和hE4片段，分别表达裁断的CD137胞外区CRD1+CRDII和CRDI+CRDII+CRDIII，包括胞外区N端引导序列，CRD1+CRDII包括1-86氨基酸，CRDI+CRDII+CRDIII包括1-118氨基酸。见附图6人CD137胞外区域CRD及其表达片段蛋白示意图。蛋白在真核表达体系转染COS-7细胞，转染细胞的培养上清液，经鉴定得到有效表达(同上述CD137-Fc胞外区蛋白表达和鉴定)，表达产物用于ELISA检测，分析抗体结合CRDs区。

(2)本发明提供的抗体结合定位于CD137胞外域CRDIV+STP区。

抗体BXME8结合胞外区全长片段(hE)的直接ELISA检测显色OD值>2.0，但不结合CRDI+CRDII和CRDI+CRDII+CRDIII片段(hE3和hE4)，ELISA检测显色OD值分别为0.065和0.077,通过此结合区域作图分析表明，本抗体BXME8结合CD137胞外域的CRDIV+STP区域(表2)。

表2.BXME8与人CD137-CRDs片断结合ELISA测得OD值和结合区定位

实施例7BXME8抗体对人CD137-CD137L结合的封阻活性

抗体封阻CD137-CD137L结合试验采用两种测定方法：

①基于生物膜层光学干涉(BLI)技术

采用ForteBio Octet生物分子相互作用技术，将AMC传感器在平衡液中预湿10min,避光96孔板第一列加入平衡液，将8株抗体加到避光96孔板第二列中，第三列为平衡液，第四列为抗原hCD137-his，第五列为hCD137L-hFc，抗原与配体稀释为5μg/ml,每孔加200μl的体积。使用fortebio octet96仪器进行检测，将传感器在第一列中平衡60s,获得基础平衡曲线，第二列进行抗体固化300s,第三列进行再平衡60s，第四列结合抗原180s，第五列结合配体180s。方法同上，固定配体结合抗原，检测抗体能否与抗原结合。将传感器平衡60s，配体固化300s,再平衡60s,结合抗原180s，结合抗体180s。

②ELISA检测抗体对配体的封阻试验。包被CD137-his蛋白(2μg/ml)每孔100μL，4度过夜,洗三次。加入5％奶粉的封闭液封闭200μl/孔，37度2h,洗3次。每孔加100μL预混液(CD137配体/CD137抗体:1/0,1/1,1/2.5,1/12.5),37度2h,洗五次。每孔加入100μL山羊抗人辣根酶标记物(1:6000),37度反应2h，洗五次。显色液A+B等比混合，每孔加100μl,显色10min,加入50μl终止液，酶标仪测吸光度。

鉴于天然CD137L主要结合CD317-CRDIII，并且CRDIV+STP也涉及CD137L与CD137蛋白复合体形成。ForteBio Octet生物分子相互作用技术和ELISA检测两种方法均显示，抗体BXME8明显的具有明确的封阻CD137L-CD137结合的特征，但封阻活性不及克隆BXD3。见附图7，这与BXME8结合CD137胞外区作图结合CRDIV+STP区域预期结果一致，而结合CRDIV+STP区域抗体会通常具有封阻活性。

实施例8本发明提供的BXME8抗体类型鉴定和亲和力测定

①抗体亲和力和同种型测定方法

采用ForteBio Octet生物分子相互作用技术，将AMC传感器在加入0.1％BSA和0.02％TWEEN20的PBS平衡液中预湿10分钟，然后将小鼠抗人CD137单抗用平衡液稀释为20μg/ml，加到避光96孔板第二列中，200μl/孔。将CD137-His蛋白从500nM起始倍比稀释至31.3nM，加入避光96孔板的第四列中，200ul/孔。将平衡液加入第一列与第三列中，200μl/孔。使用Fortebio octet96仪器检测，将传感器在第一列中平衡120s获得基础平衡曲线，然后在第二列中进行抗体固化300s。在第三列中进行再平衡120s，在第四列中结合抗原180s，获得结合曲线，回到第三列中解离300s，获得解离曲线。用Fortebio Octet96分析软件对曲线进行拟合分析，获得亲和力数值。采用经典的ELISA方法进行抗体亚类测定，试剂盒为博奥生物产品(Bo'ao biology Co.,Ltd,Cat no.BF06004)，可进行重链IgA,IgM,IgG(IgG1,IgG2,IgG3和IgG4)分类，鉴定轻链分型κ型轻链或λ型轻链。

②BXME8抗体高亲和力和亚类

生物膜光学干扰技术(ForteBio Octet)测定抗原-抗体相互作用的结合常数和解离常数，测定抗体亲和力，根据本抗体结合不同稀释浓度梯度(500nM-31nM)CD137-His蛋白结合和解离曲线，见附图8，计算本抗体的亲和力KD值在6.9×10^-9(3.9×10^-8)，其亲和力测定中的各种参数值见表3。ELISA进行本抗体类别测定为IgG1，轻链为κ型轻链。

表3.生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLA)分析BXME8亲和力参数值

注：测定中抗体结合抗原为人CD137-His蛋白

实验例1本实验例进行抗体的生产纯化。

采用真核系统的表达与亲和层析纯化策略。可依据所提供的抗体序列，进行本抗体的生产纯化。将含有轻链DNA(SEQ ID NO.14所示)全长和含有重链DNA(SEQ ID NO.13所示)，其全长分别克隆入pcDNA3.1或pcDNA3.4，转化感受态大肠杆菌，扩增质粒，经过酶切和测序鉴定序列正确性后，使用分光光度计定量，下述质粒用量为轻链载体和重链表达载体按照2：1混合后的DNA质量(μg)，用于哺乳细胞ExpiCHO-STM(ThemoFisher)瞬时转染表达。

第1天：将新鲜解冻的ExpiCHO-STM细胞复苏、扩增至细胞密度达到约4-6×10⁶个活细胞/mL。

第2天：分种ExpiCHO-STM培养物，调整细胞密度为3-4×10⁶个活细胞/mL，细胞过夜生长。

第3天：测定活细胞密度和存活率百分比。细胞密度应达到约7-10×10⁶个活细胞/mL。存活率应为95-99％，方可继续转染。

使用新鲜预热至37℃的ExpiCHOTM表达培养基，将细胞稀释至最终密度为6×10⁶个活细胞/mL，轻轻晃动培养瓶，混匀细胞。

第4天：转染。使用冷的试剂(4℃)，ExpiFectamineTMCHO和冷质粒溶液，充分混匀配制ExpiFectamineTMCHO/质粒。以轻链可变区总质粒0.5-1.0μg DNA/mL的浓度为转染培养体积(以1升培养瓶体系为例，培养体积为280mL，质粒DNA的体积为8mL，质粒总量需要4.0-8.0μg)。

具体按下所述操作：

(i)将ExpiFectamineTMCHO试剂瓶轻轻上下颠倒4-5次，充分混匀。使用冷的OptiPROTM培养基(ThemoFisher)稀释质粒DNA，晃动或上下颠倒试管，室温与DNA混合，使得总质粒DNA为0.5-1.0μg/mL培养物体积，混匀。

(ii)使用OptiPROTM7.4mL培养基稀释ExpiFectamineTMCHO试剂(ThemoFisher)640μL,晃动或上下颠倒试管，混匀。

(iii)将稀释的ExpiFectamineTMCHO试剂加入到稀释的DNA中，晃动或上下颠倒试管，混匀。

(iV)室温孵育ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA复合物1-5分钟(即刻加入ExpiFectamineTMCHO/DNA复合物至细胞中，混合不超过5分钟，然后将溶液缓慢转移至第4步的培养瓶中，在添加过程中轻轻晃动培养瓶。将细胞置于轨道摇床上，于37℃培养箱含8％ CO₂的湿化空气条件下培养，摇床振荡速度(25-mm轨道)120±5rpm。

第5天：转染后次日(第1天，转染后18-22小时)，根据所选择的实验方案进行添加ExpiFectamineTMCHO增强剂1.2mL和ExpiCHOTM辅料48mL：将培养瓶转移至32℃培养箱含5％ CO₂的湿化空气条件下振荡培养。

第12-14天：收集培养上清。抗体蛋白最佳收集时间通常为转染后8-10天。

抗体纯化：4000g离心20min，去除细胞颗粒或碎片，用0.22μm或0.45μm膜滤器过滤，测定上清液的pH值，用0.2M Na₂HPO₄或0.2M NaH₂PO₄(1M NaOH或1M HCl)调节pH值至7.0～7.4，用缓冲液(PBS，pH7-7.4)完全平衡蛋白质A纯化柱(Sigma)，用AKTA系统或蠕动泵将细胞培养上清液在4℃加载到完全平衡的柱上，用3CV～5CV结合缓冲液平衡柱；用AKTA系统从洗脱缓冲液中从柱中洗脱抗体/蛋白质。根据UV280吸光度在1-3mL/min收集洗脱液，经脱盐柱脱盐，进行分光光度计定量，分装，-80度或冷冻干燥保存。

实验例2本发明提供的抗体用于蛋白印迹(Western Blot)检测CD137分析

1.样品准备

将2微克CD137-His蛋白20μl与5μl含2-巯基乙醇5*上样缓冲液混合，沸水煮5min，待冷却后离心备用。将2微克CD137-His蛋白20μl与5μl不含2-巯基乙醇5*上样缓冲液混合离心备用。

2.电泳

进行SDS-PAGE，将样品分别上样在还原/非还原PAGE胶上，上样顺序从左至右为还原/非还原CD137-His蛋白，蛋白Marker。电压140V，冰浴电泳60min。

3.转膜

分别取适当大小的硝酸纤维素膜进行转膜，电压70V，冰浴电转移70分钟。

4.免疫学检测

丽春红染色5min，清水冲洗至条带清晰。后用5％脱脂牛奶/PBST室温封闭1h。将BXME8抗体溶于2ml5％脱脂牛奶/PBST封闭液中。将膜放入杂交袋中，用配置好的BXME8抗体孵育，4℃孵育过夜。次日，将膜用PBS+0.05％Tween 20漂洗3次，每次10min。后抗小鼠IgG抗体(1：5000稀释)，室温孵育1h。将膜用PBS+0.05％Tween 20漂洗3次，每次10min。暗室中，将ECL试剂盒中的A、B两液各0.5ml混合均匀滴到两张硝酸纤维素膜上，吸干表面液体，用化学发光成像仪进行结果拍摄。

抗体结合CD137-His蛋白的免疫以及结果显示，BXME8抗体在非还原(不加2-巯基乙醇)状态下的Western Blot具有结合CD137-His蛋白活性(附图9A)，在还原状态(加2-巯基乙醇)下不结合CD137-His(附图9B)，表明本发明提供的抗体结合天然结构CD137，而不结合破坏二硫键后的非天然结构CD137，本发明提供的抗体可以用来鉴别与此相关的CD137蛋白空间结构的存在。

实验例3抗体协同抗原刺激信号扩增CD8+T细胞

T细胞需要在抗原TCR/CD3刺激信号和协同协同刺激信号作用下被激活，仅有抗原刺激信号，T细胞缺乏协同刺激信号，T细胞走向衰竭，为此T细胞激活扩增需要上述双信号存在，其中最重要的T细胞协同刺激信号包括CD28和CD137，但两者协同刺激作用有所不同，CD28主要协同刺激CD4+T细胞，而CD137协同刺激信号偏于激活CD8+T细胞，后者细胞亚群是抗肿瘤的核心效应细胞。本发明提供的抗体证明可以有效激活T细胞，具有偏于CD8+T亚群特征，可以用来体外激活和扩增CD8+T细胞，也显示出具有体内激活CD8+T细胞发挥抗肿瘤活性的潜能。本发明提供的抗体具有激活CD8+T细胞扩增的应用，见如下述所述方法：

(1)密度梯度离心法分离PBMC的方法

外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)，主要包括淋巴细胞(Lymphocyte)、单核细胞(Monocyte)，指外周血中具有单个核的细胞群。人PBMC通过Ficoll密度梯度离心获得，Ficoll是蔗糖的多聚体，保持正常生理性渗透压，不破坏生物膜，维护细胞活性。血液中红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底，淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后位于分层液的细胞组分的最上面，其上是无形成分血浆，由此，吸取分层液液面的细胞，可从外周血中分离PBMC，具体操作流程为：

①在10ml离心管中加入淋巴细胞分离液Ficoll 4ml。

②取抗凝外周血(全血)2ml与无菌PBS按照1:1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。淋巴细胞分离液与稀释血液最终体积为1:1比例。

③水平离心400g×20分钟，具体根据淋巴细胞分离液Ficoll或所用离心机转子要求调整，通常1800-2000rpm。

④离心后管内分为三层，上层为血浆液体层，中层为Ficoll，下层为红细胞和粒细胞等有形细胞层。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的薄层白色细胞，即，单个核细胞PBMC。

⑤去除部分上层液体，余下约1mL，用移液器轻轻吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5-7ml含1％胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。

⑥第二次离心后，弃上清，加入含有10％FBS的RPMI1640，台盼蓝染色计算细胞活力、细胞计数，使用10％ FBS的RPMI1640调整、重悬细胞浓度1x10⁶/ml，备用。

(2)PBMC的刺激培养方法和检测

①去上述浓度1x10⁶/ml的细胞悬液，放入24孔板，每孔1ml，共5孔，放入一定湿度的二氧化碳细胞培养箱，放入37℃孵育。

②配置抗CD3抗体作为抗原刺激信号试剂，选择克隆OKT3，用含有10％FBS的RPMI1640配备浓度0.2ng/ml，协同刺激信号的BXME8抗体，用含有10％FBS的RPMI1640配备为1mg/ml备用；同样另一参比协同刺激信号CD28抗体用10％1640配备。

③分别设置OKT3、OKT3+anti-CD28、OKT3+BXME8和无刺激对照，操作时，分别向5孔细胞中加入1ml的OKT3(0.2ng/ml)试剂。

④至此，每孔细胞培养浓度为0.5x10⁶/ml，各种刺激试剂浓度为OKT3为0.1ng/ml，为亚适量抗原刺激浓度，上述条件在细胞培养箱培养12小时，随后在相应的实验孔本加入不同抗体协同的抗体，组成BXME8(或OKT3+BXMD12)或CD28抗体(取1mg/ml，加入4μl/孔)，建立协同刺激培养条件，使得终浓度为协同刺激抗体2μg/ml。并加入IL-2 50IU/ml。

⑤上述培养条件下，在组织培养箱培养细胞10天。

⑥细胞培养完毕，取出细胞，轻轻离心(800rpm,5min),收集细胞，用10％PBS重选细胞，胎盘蓝计数活细胞数(淋巴细胞扩增数量结果见附图10)。

流式细胞术染色及CD8+T细胞扩增的检测分析方法

采用美国BD公司的6色淋巴细胞亚群分析试剂盒(BD Multitest 6-ColorTBNKReagent)，该产品保存在含0.1％叠氮化钠的1mL缓冲盐溶液中。它包含FITC标记的CD3细胞，克隆SK7；PE&#61482；标记的CD16，克隆的B73.1和CD56，克隆NCAM16.2；PerCP-Cy5.5标记的CD45细胞，克隆2D1(Hle-1)；PE-Cy7标记CD4，克隆SK3；APC标记的CD19，克隆SJ25C1；和APC-Cy7标记的CD8，克隆SK1。按照说明书进行淋巴细胞染色，分析T细胞主要亚群。

结果见表4显示，经过10天不同协同刺激信号培养后，相较单纯OKT3刺激，OKT3协同信号CD28抗体，主要表现为促进CD4+T细胞扩增，绝对数量由5.88x10⁴扩增至2.37x10⁶,扩增了1393倍。相比较CD4+T细胞的扩增而言，抗CD137的抗体协同OKT3刺激信号更偏向于扩增CD8+T细胞，BXME8扩增11.9倍，抗CD137的抗体协同OKT3刺激活性越强，扩增CD8+T细胞倍数越高。因此，本发明提供的抗体可以协同抗原刺激信号，用于促进扩增CD8+T细胞。

表4.不同共刺激信号刺激下扩增T细胞亚群变化

注：表中数值为PBMC培养前及不同刺激条件下培养10天细胞的流式细胞术分析数据。表中BXE8即BXME8

实验例4抗体激活T细胞促进细胞因子产生

健康PBMC由FicollPaque PLUS(GE Healthcare Life Sciences)分离，并在96孔板中以1×104//0.1ml/孔的细胞密度培养，同时加入抗人CD3抗体(OKT3，MiltenyiBiotecInc.)和CD137单克隆抗体，分别以0.1ng/ml和10ng/ml添加OKT3。以10μg/ml的浓度添加单个CD137单克隆抗体，于72小时后，收集培养上清液，测定IFNγ和IL-10浓度，采用ELISA检测方法，ELISA试剂盒为Thermo Scientific,Rockford,IL,USA产品，按照说明书操作检测各种上清两种细胞因子浓度。

参照图11所示，本发明提供的抗体明显地协助OKT3激活淋巴细胞，促进IFNγ和IL-10产生。BXME8具有相对偏弱的协同刺激能力特点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

参考文献：

1.Segal NH,etal.Results from an Integrated Safety Analysis ofUrelumab,an Agonist Anti-CD137Monoclonal Antibody.Clin Cancer Res；2017；23(8):1929–36.

2.Chester C,etal.Immunotherapy targeting 4-1BB:mechanistic rationale,clinical results,and futurestrategies.Blood 2018；4；131(1):49-57.

3.Qiao Y,et al.Cancer immune therapy with PD-1-dependent CD137 co-stimulation provides localizedtumour killing without systemic toxicity.NatCommun 2021.12:6360.

4.Aznar MA,et al.Intratumoral Delivery of Immunotherapy--Act Locally,Think Globally.J Immunol 2017；198:31-39。

Claims

1.一种抗人CD137的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

CDR-VH1：SYWIN；

CDR-VH2：NIYPSDSYTNYNQKFKD；

CDR-VH3：FYYGGSYYAMDY；

CDR-VL1：RASQDISNYLN；

CDR-VL2：YTSRLHS；

CDR-VL3：QQGYTLPYT。

2.根据权利要求1所述的抗人CD137的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H；

优选地，所述抗体还包括恒定区；

优选地，所述恒定区选自IgM、IgD、IgG、IgA和IgE中的任意一种的恒定区；

优选地，所述恒定区的种属来源为小鼠；所述恒定区的轻链恒定区的序列如SEQ IDNO.9所示，所述恒定区的重链恒定区的序列如SEQ ID NO.10所示；

优选地，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、双特异性抗体和scFv中的任意一种。

3.一种检测CD137蛋白的试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-2任一项所述的抗人CD137的抗体或其功能性片段。

4.一种如权利要求1-2任一项所述的抗人CD137的抗体或其功能性片段在如下任一项中的应用：

(1)扩增T细胞亚群；

(2)制备促进T淋巴细胞IFN-γ分泌产品；

(3)制备促进T淋巴细胞IL-10分泌产品；

(4)制备促进T淋巴细胞活化和/或增殖产品；

(5)制备检测CD137产品；

(6)制备免疫调节和联合免疫调节治疗药物；

优选地，所述T细胞亚群选自：CD4+T细胞和CD8+T细胞中的至少一种；

优选地，所述T细胞亚群选自CD8+T细胞；

优选地，所述应用(4)中，抗人CD137的抗体或其功能性片段，协同抗原刺激信号试剂或协同刺激信号试剂在制备促进T淋巴细胞活化和/或增殖产品；

优选地，所述抗原刺激信号试剂选自抗T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)抗体、抗CD3γ抗体、抗CD3δ抗体、抗CD3ε抗体、抗CD3ζ抗体；所述协同刺激信号试剂选自抗CD28抗体、抗CD27抗体、抗CD134(OX40)、抗CD26抗体、抗CD40抗体、抗GITR抗体、抗CD270抗体、抗CD5抗体、抗CD154抗体、抗CD79a抗体、抗CD22抗体、抗CD66d抗体、抗CD2抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD79b抗体、和抗ICOS抗体中的至少一种。

5.一种如权利要求1-2任一项所述的抗人CD137的抗体或其功能性片段与抗原刺激信号试剂或刺激信号试剂联用在制备抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述抗原刺激信号试剂选自抗T细胞抗原受体T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)抗体、抗CD3γ抗体、抗CD3δ抗体、抗CD3ε抗体、抗CD3ζ抗体；所述协同刺激信号试剂选自抗CD28抗体、抗CD27抗体、抗CD134(OX40)、抗CD26抗体、抗CD40抗体、抗GITR抗体、抗CD270抗体、抗CD5抗体、抗CD154抗体、抗CD79a抗体、抗CD22抗体、抗CD66d抗体、抗CD2抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD79b抗体和抗ICOS抗体中的至少一种；

优选地，所述肿瘤为实体瘤、血液肿瘤或自身免疫病；

优选地，所述自身免疫病选自以下任意一种：I型糖尿病和系统性红斑狼疮(SLE)。

6.一种抗体偶联物，其特征在于，其含有权利要求1-2任一项所述的抗人CD137的抗体或其功能性片段。

7.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-2任一项所述的抗人CD137的抗体或其功能性片段。

8.一种载体，其特征在于，其含有权利要求7所述的核酸分子。

9.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求8所述的载体；

优选地，所述重组细胞为真核细胞；

优选地，所述重组细胞为哺乳动物细胞；

优选地，所述重组细胞为HEK293。

10.一种制备权利要求1-2任一项所述的抗人CD137的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：(a)培养权利要求9所述的重组细胞；(b)从步骤(a)的培养产物中回收所述抗人CD137的抗体或其功能性片段。