KR20210072784A - 항b7-h3의 모노클로널 항체 및 그가 세포 치료 중에서의 응용 - Google Patents

항b7-h3의 모노클로널 항체 및 그가 세포 치료 중에서의 응용 Download PDF

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KR20210072784A
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leu
gly
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KR1020217012404A
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리에핑 첸
리쿤 루오
강시옹 후앙
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푸저우티셀테크 바이오테크놀로지 씨오 엘티디.
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Abstract

본 발명은 항B7-H3의 모노클로널 항체 및 그가 세포 치료 중에서의 응용을 제공하는 것이고 구체적으로 본 발명은 표적 B7-H3을 특이 표적 하는 scFv, 항체 및 그 특이성의 CAR_T세포를 제공하는 것이다. 본 발명은 일종 공통발현 할 수 있는 표적 하는 B7-H3의 CAR 및 PD-L1의 키메릭 분자 또는 분비 단백질의 공학화된 면역세포를 제공하는 것이고 양호한 종양 살상 효과가 있다.

Description

항B7-H3의 모노클로널 항체 및 그가 세포 치료 중에서의 응용
본 발명은 생물의약 분야에 관한 것이고 구체적으로 항B7-H3의 모노클로널 항체 및 그가 세포 치료 중에서의 응용에 관한 것이다.
종양세포가 발현하는 표적분자는 종양이 식별될 수 있고 따라서 치료에 응용할 수 있는 주요 결정적 요인이다. 현재 각종 종양 치료 기술은 표적 치료, 항체 와/또는 CAR-T세포 등 면역 치료 수단을 포함하여 모두 종양 및 그 관련 성분이 발현하는 특이성 표적 분자에 의지하는 것이다. 표적 분자의 특이성은 종양을 치료하는 치료 효과, 치료 부작용 수준 등과 밀접히 연관된다. B7-H3(CD276)은 정상 조직, 세포 중에서 발현되지 않거나 극히 낮게 발현되지만 대부분 실체적 악성 종양세포 및 종양 내 혈관 내피세포 또는 종양 미환경 기타 세포 성분에서 높게 발현되는 것은 양호한 특이성 종양 표적 분자이다.
모노클로널 항체는 어느 한 특정 항원결정기에 겨냥한 단일 B세포에서 클론 한 항체이다. 모노클로널 항체는 특이성 표적 분자 식별을 통하여 이미 생물, 의학의 연구, 임상 진단과 치료 등에 범용되고 있다.
키메릭 항원 수용체 T세포 치료는 일종 T세포에 키메릭 항원 수용체(CAR)의 유전자 변형을 통하여 CAR를 발현하는 T세포(CAR-T)를 형성한 후 CAR-T세포를 유기체에 환송하여 치료에 사용하는 일종 기술 방법이다. CAR-T세포 종양 치료는 현재 연구와 응용 개발의 인기 분야이다. 일반적으로 CAR-T세표는 CAR분자 위의 단쇄 항체 가변영역(scFv)을 통하여 종양세포 위의 특이성 표적 분자를 식별하여 종양세포를 살상하고 따라서 항종양 면역 효과를 발휘한다.
현재 B7-H3표적 분자에 겨냥한 항체가 종양 치료에서의 치료 효과는 아직 명확하지 않다. 이 항체는 주로 면역세포 위의 억제분자의 저지와 조절로 임상 응용하는 것이지만 B7-H3분자의 면역 기능 메커니즘이 아직 명확하지 않아 그 치료 효과는 아직 알 수 없다.
현재 CAR-T세포가 실체 종양을 치료하는 치료 효과는 아직 좋지 않다. 효과적인 종양 특이성 표적분자는 CAR-T세포 치료 요인의 하나이고 실체 종양에 겨냥한 현재 알려진 표적분자 CAR-T세포 치료는 모두 아직 확실하고 지구적인 치료 효과를 취득하지 못하였다.
그래서 본 분야는 일종 특이성 표적 B7-H3, 또한 양호한 종양 살상 효과를 가진 항체 및 그 상응한 공학화된 면역세포 개발이 절실하다.
본 발명의 목적은 일종 특이성 표적B7-H3, 또한 양호한 종양 살상 효과를 가진 항체 및 그 상응한 공학화된 면역세포를 제공하는 것이다.
본 발명 제1방면은 일종 항체의 중사슬 가변영역을 제공하였고 상기 중사슬 가변영역은 다음과 같은 세가지 상보적 결정영역 CDR을 포함한다.
SEQ ID NO: 1, 2또는 3에 표시한 CDR1,
SEQ ID NO: 4, 5또는 6에 표시한 CDR2, 와
SEQ ID NO: 7, 8또는 9에 표시한 CDR3이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 중사슬 가변영역의 CDR은 SEQ ID NO:NH, NH+3, 과 NH+6이 표시한 3개 CDR을 포함하고 그 중 NH는 각각 1, 2 또는 3이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 아미노산배열 중 임의 일종 아미노산배열은 임의로 선택한 적어도 한 개 (1-3개와 같이, 바람직한 적은 1-2개, 더 바람직한 것은 1개) 아미노산을 추가, 상실, 변형 과/또는 치환하여 B7-H3 결합 친화력을 보류할 수 있는 파생 서열도 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 중사슬 가변영역은 인간의 FR영역 또는 쥐원 FR영역도 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 중사슬 가변영역은 SEQ ID NO:19-24 중 임의 표시된 아미노산배열을 가진다.
본 발명 제2방면은 일종 항체의 중사슬을 제공하였고 상기 중사슬은 본 발명 제1방면과 같이 상기 중사슬 가변영역을 가진다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체의 중사슬은 중사슬 불변영역도 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 중사슬 불변영역은 인간적, 쥐원적 또는 토끼원적이다.
본 발명 제3방면은 일종 항체의 경사슬 가변영역을 제공하였고 상기 경사슬 가변영역은 다음과 같은 세가지 상보적 결정영역 CDR을 포함한다.
SEQ ID NO: 10, 11또는 12에 표시한CDR1'，
SEQ ID NO: 13, 14 또는 15에 표시한 CDR2', 와
SEQ ID NO: 16, 17 또는 18에 표시한 CDR3'이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 경사슬 가변영역의 CDR은 SEQ ID NO: NL,NL+3, 과 NL+6에 표시한 3개 CDR을 포함하고 그 중 NL은 각각 10, 11 또는 12이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 아미노산배열 중 임의 일종 아미노산배열은 임의로 선택한 적어도 한 개 (1-3개와 같이, 바람직한 적은 1-2개, 더 바람직한 것은 1개) 아미노산을 추가, 상실, 변형 과/또는 치환하여 B7-H3 결합 친화력을 보류할 수 있는 파생 서열도 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 경사슬 가변영역은 인간의 FR영역 또는 쥐원의 FR영역도 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 경사슬 가변영역은 SEQ ID NO: 25-30 중 임의 표시한 아미노산배열을 가진다.
본 발명 제4방면은 일종 항체의 경사슬을 제공하였고 상기 경사슬은 본 발명 제3방면과 같이 상기 경사슬 가변영역을 가진다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체의 경사슬은 경사슬 불변영역도 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 경사슬 불변영역은 인간적, 쥐원적 또는 토끼원적이다.
본 발명 제5방면은 일종 항체를 제공하였고 상기 항체는 다음과 같은 것을 가진다.
(1) 본 발명 제1방면과 같이 상기 중사슬 가변영역 과/또는
(2) 본 발명 제3방면과 같이 상기 경사슬 가변영역이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체는 본 발명 제2방면과 같이 상기 중사슬 과/또는 본 발명 제4방면과 같이 상기 경사슬을 가진다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Ka(1/Ms)≥2Х104(예를 들면3Х104~1.5Х105)이고 바람직한 것은 ≥4Х104이며 더 바람직한 것은 ≥5Х104이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Kd(1/s)≤5Х10-4 (예를 들면5Х10-6~5Х10-4)이고 바람직한 것은 ≤4Х10-4이며 더 바람직한 것은 ≤3Х10-4이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 KD(M)≤8Х10-9 (예를 들면 1.0Х10-10~8Х10-9)이고 바람직한 것은 ≤6Х10-9이며 더 바람직한 것은 ≤5Х10-9이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Ka(1/Ms)가 8.89E+4이고 Kd(1/s)가 8.72E-6이며 KD(M)은 9.81E-11이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Ka(1/Ms)가 6.13E+4이고 Kd(1/s)가 2.30E-4이며 KD(M)은 3.76E-9이다. (인간화HC1+LC1)
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Ka(1/Ms)가 4.12E+4이고 Kd(1/s)가 6.44E-5이며 KD(M)은 1.56E-9이다. (인간화HC1+LC2)
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Ka(1/Ms)가 4.11E+4이고 Kd(1/s)가 1.78E-4이며 KD(M)은 4.34E-9이다. (인간화HC1+LC3)
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Ka(1/Ms)가 5.29E+4이고 Kd(1/s)가 3.06E-5이며 KD(M)은 5.78E-10이다. (인간화HC2+LC1)
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Ka(1/Ms)가 5.48E+4이고 Kd(1/s)가 2.34E-5이며 KD(M)은 4.28E-10이다. (인간화HC2+LC2)
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Ka(1/Ms)가 6.73E+4이고 Kd(1/s)가 8.74E-6이며 KD(M)은 1.30E-10이다. (인간화HC2+LC3)
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Ka(1/Ms)가 7.16E+4이고 Kd(1/s)가 3.33E-5이며 KD(M)은 4.66E-10이다. (인간화HC3+LC1)
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Ka(1/Ms)가 6.24E+4이고 Kd(1/s)가 3.26E-5이며 KD(M)은 5.23E-10이다. (인간화HC3+LC2)
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체가 인간에 대하여 B7-H3(야생형)의 친화력인 Ka(1/Ms)가 4.25E+4이고 Kd(1/s)가 1.96E-5이며 KD(M)은 4.62E-10이다. (인간화HC3+LC3)
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체는 다음과 같은 동물원 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체는 이중 사슬 항체 또는 단쇄 항체이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체는 모노클로널 항체다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체는 일부분 또는 전부 인간화 모노클로널 항체이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체의 중사슬 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 19-24 중 임의로 표시한 것 과/또는
상기 항체의 경사슬 가변영역 서열 SEQ ID NO: 25-30 중 임의로 표시한 것과 같다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체는 IgG유형이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체는 약물 접합체 형식이다.
본 발명 제6방면은 일종 재조합 단백질을 제공하였고 상기 재조합 단백질은 다음과 같은 것을 가진다.
(i) 본 발명 제1방면과 같이 상기 중사슬 가변영역, 본 발명 제2방면과 같이 상기 중사슬, 본 발명 제3방면과 같이 상기 경사슬 가변영역, 본 발명 제4방면과 같이 경사슬 또는 본 발명 제5방면과 같이 상기 항체; 및
(ⅱ) 임의 선택한 협조 발현 과/또는 순화된 태그 서열을 가진 것을 특징으로 하는 일종 재조합단백질.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 태그 서열은 6His태그를 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 재조합 단백질(또는 폴리펩티드)은 융합 단백질을 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 재조합 단백질은 단체, 이합체 또는 중합체이다.
본 발명 제7방면은 일종 CAR구성물을 제공하였고 상기 CAR구성물의 항원 결합영역은 B7-H3의 scFv에 특이성 결합하며 또한 상기 scFv는 본 발명 제1방면과 같이 상기 중사슬 가변영역과 본 발명 제3방면과 같이 상기 경사슬 가변영역을 가진다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 CAR의 구조는 다음 공식I에 표시한 것과 같다.
L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-Z-P (I)
공식 중,
각 "-"은 독립적으로 연결 펩티드 또는 펩티드 결합이고;
L는 무 또는 시그널 펩티드 서열이며
scFv는 표적 B7-H3의 단클론항체 서열이고;
H는 무 또는 경첩 영역이며;
TM은 막관통영역이고;
C는 공동 자극 시그널 분자이며;
CD3ζ은 CD3ζ에서 나온 세포질기질 시그널 전도 서열이고;
Z는 무 또는 자가절단 단백질의 코딩 서열이며;
P는 무 또는 PD1-CD28이나 PD1-IL7R 융합 단백질을 포함한 코딩 서열이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 scFv의 구조는 공식 A1 또는 A2에 표시한 것과 같다.
VL-VH (A1); 또는
VH-VL (A2)
그 중 VL는 항 B7-H3항체의 경사슬 가변영역이고 VH는 항B7-H3항체의 중사슬 가변영역이며 "-"는 연결 펩티드 (또는 유연성 이음매) 또는 펩티드 결합이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 공식 A1과 A2 구조는 N터미널에서 C터미널까지다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 VL와 VH은 한 개 유연성 이음매를 통하여 서로 연결한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 유연성 이음매는 1-5개(바람직한 것은 2-4개이고 더 바람직한 것은 3-4개다.) 연속적인 (G)4S에 표시한 서열이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 VL와 VH는 각각 단독으로 쥐원적, 인간적, 토끼원적 또는 인적이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 VL의 아미노산배열은 SEQ ID No.: 25-30 중 임의로 표시한 VL또는 그 파생 VL(또는 그 활성 조각)에서 선택하는 것을 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 VH의 아미노산배열은 SEQ ID No.: 19-24 중 임의로 표시한 VH 또는 그 파생 VH(또는 그 활성 조각)에서 선택하는 것을 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 scFv는 쥐원, 인간, 인간과 쥐원 키메릭 또는 전체 인간화 단쇄 항체 가변영역 조각이다.
다른 한 바람직한 실시에 중에서 상기 L는 다음과 같은 단백질의 시그널 펩티드인 CD8, CD28, GM-CSF, CSF2RB, CD4, CD137, IL-2, IFNr 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 H는 다음과 같은 단백질의 경첩 영역인 CD8, CD28, CD137, CD80, CD86 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 TM은 다음과 같은 단백질의 막관통영역인 CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 C는 다음과 같은 단백질의 공동 자극 시그널 분자인 OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD134, 4-1BB(CD137), PD1, Dap10, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS (CD278), NKG2D, GITR, TLR2 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 C는 CD28 과/또는 4-1BB(CD137)에서 온 공동 자극 시그널 분자이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 자가절단 단백질은 다음과 같은 T2A, P2A, E2A, F2A 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 자가절단 단백질은 다음과 같은 furin-V5-SGSG-T2A, furin-V5-SGSG-P2A, furin-V5―SGSG-E2A, furin-V5-SGSG-F2A 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 자가절단 단백질은 다음과 같은 furin-SGSG-T2A, furin-SGSG-P2A, furin-SGSG-E2A, furin-SGSG-F2A 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 융합단백질의 구조는 공식 Ⅱ에 표시한 것과 같다.
L1-I1-L2-H1-TM1-C1 (Ⅱ)
공식 중,
각 "-"은 독립적으로 연결 펩티드 또는 펩티드 결합이고;
L1은 무 또는 시그널 펩티드 서열이며;
I1은 PD-1의 세포 외 조각이고;
L2는 무 또는 연결 펩티드 소자이며;
H1은 임의 선택한 경첩 영역이고;
TM1은 무 또는 막관통영역이며;
C1은 무 또는 세포내 영역이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 L1은 다음과 같은 단백질의 시그널 펩티드인 GM-CSF, CD4, CD8, IL-2, IFNr, TNF 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 L1의 시그널 펩티드 서열은 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO:31)이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 PD-1 세포 외 조각은 SEQ ID NO:32에 표시한 것과 같은 아미노산배열을 가진다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 PD-1 세포 외 조각의 아미노산배열은 SEQ ID NO:32에 표시한 것과 같다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 연결 펩티드 소자는 1-9개 (바람직한 것은 2-7개이고 더 바람직한 것은 2-4개다.) 연속적인 G4S, mlgG3UH, LFL, cTPRs, ZAG, β2m, polyPro(Glyc), polyPro, GlySer(Glyc) 또는 그 조합의 서열이다.
다른 한 바람직한 실시예 중 상기 H1은 다음과 같은 단백질의 경첩 영역인 IgG4, CD8, CD28, CD137 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 TM1은 다음과 같은 단백질의 막관통영역인 CD4, CD8, CD28 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 TM1은 다음과 같은 단백질의 막관통영역인 CD28에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 TM1은 SEQ ID NO: 33에 표시한 아미노산배열을 가진다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 TM1의 아미노산배열은 SEQ ID NO: 33에 표시한 것과 같다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 C1은 다음과 같은 단백질의 세포내 조각인 CD137, CD28, IL-7R 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 C1은 CD28 과/또는 IL-7R에서 온 세포내 조각이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 C1은 SEQ ID NO:34에 표시한 것과 같은 아미노산배열을 가진다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 P소자는SEQ ID NO:35에 표시한 것과 같은 아미노산배열을 가진다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 P소자의 코딩 서열은 SEQ ID NO:36에 표시한 것과 같은 뉴클레오티드 서열을 가진다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 CAR의 아미노산배열은SEQ ID NO: 37에 표시한 것과 같다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 CAR의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 38에 표시한 것과 같다.
본 발명 제8방면은 일종 공학화된 면역세포를 제공하였고 상기 면역세포는 다음과 같은 것을 포함한다.
(a) 제1발현함, 상기 제1발현함은 외인을 발현하는 본 발명 제7방면과 같이 상기 CAR구성물을 사용하고; 과
(b) 임의 선택한 제2발현함, 상기 제2발현함의 발현은 PD1-CD28 또는 PD1-IL7R의 융합단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 일종 공학화된 면역세포.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1발현함과 상기 제2발현함 사이는 자가절단 단백질의 코딩 서열을 통하여 연결(또는 직렬)한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 자가절단 단백질은 다음과 같은 T2A, P2A, E2A, F2A 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 자가절단 단백질은 다음과 같은 furin-V5-SGSG-T2A, furin-V5-SGSG-P2A, furin-V5―SGSG-E2A, furin-V5-SGSG-F2A 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 자가절단 단백질은 다음과 같은 furin-SGSG-T2A, furin-SGSG-P2A, furin-SGSG-E2A, furin-SGSG-F2A 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 융합 단백질의 결과는 공식Ⅱ에 표시한 것과 같다.
L1-I1-L2-H1-TM1-C1 (Ⅱ)
공식 중,
각 "-"은 독립적으로 연결 펩티드 또는 펩티드 결합이고;
L1은 무 또는 시그널 펩티드 서열이며;
I1은 PD-1의 세포 외 조각이고;
L2는 무 또는 연결 펩티드 소자이며;
H1은 임의 선택한 경첩 영역이고;
TM1은 무 또는 막관통영역이며;
C1은 무 또는 세포내 영역이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO:35에 표시한 것과 같은 아미노산배열을 가진다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 융합 단백질의 코딩 서열은SEQ ID NO:36에 표시한 것과 같은 뉴클레오티드 서열을 가진다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1발현함은 제7항의 상기 CAR구성물을 코딩하는 염기서열을 함유한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제2발현함은 상기 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 함유한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1발현함과 제2발현함은 각각 프로모터 와/또는 터미네이터도 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 프로모터는 포유동물 프로모터이고 바람직한 것은 hEF1이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 39에 표시한 것과 같다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1발현함과 제2발현함은 운반체 위에 위치하거나 상기 공학화된 면역세포의 염색체 속에 통합된다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1발현함과 제2발현함은 독립적이거나 서로 연결된 것이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1발현함과 제2발현함은 동일 또는 서로 다른 운반체 위에 위치한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1발현함과 제2발현함은 동일 운반체에 위치한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 운반체는 다음과 같은 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 운반체, 아데노바이러스 운반체, 레트로바이러스 운반체, 트랜스포슨, 종양용해바이러스 운반체, 기타 유전자 전송 시스템 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 운반체는 렌티바이러스 운반체이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 운반체는 트랜스포슨 운반체이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 세포는 포유동물 세포이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 면역세포는 생체외이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 면역세포는 자가적인 것이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 면역세포는 비자가적인 것이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 면역세포는 인간 또는 비인간 포유동물(예를 들면 쥐)에서 온 것이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 면역세포는 영장목 동물(바람직한 것은 인간임)에서 온 것이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 면역세포는 다음과 같은 조에서 선택한다.
(i) 키메릭 항원 수용체T세포(CAR-T세포);
(ⅱ) 키메릭 항원 수용체 NK세포(CAR-NK세포); 또는
(ⅲ) 외인 T세포 수용체(TCR) T세포(TCR-T세포)
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 면역세포는 NK세포, T세포, NKT세포, (γδ) T세포, 단핵 세포 또는 대식세포를 포함한다.
본 발명 제9방면은 일종 항체 약물 접합체를 제공하였고 상기 항체 약물 접합체는 다음과 같은 것을 함유한다.
(a) 항체부분, 상기 항체 부분은 다음과 같은 본 발명 제1방면과 같이 상기 중사슬 가변영역, 본 발명 제2방면과 같이 상기 중사슬, 본 발명 제3방면과 같이 상기 경사슬 가변영역, 본 발명 제4방면과 같이 상기 경사슬 또는 본 발명 제5방면과 같이 상기 항체 또는 그 조합에서 선택한다; 과
(b) 상기 항체부분과 접합한 접합부분, 상기 접합부분은 다음과 같은 조에서 선택한다. 검출가능표지물, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소 또는 그 조합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 일종 항체 약물 접합체.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체 부분은 상기 접합 부분과 화학 결합 또는 이음매를 통하여 접합한다.
본 발명 제10방면은 일종 본 발명 제1방면의 상기 중사슬 가변영역, 본 발명 제2방면의 상기 중사슬, 본 발명 제3방면의 상기 경사슬 가변영역, 본 발명 제4방면의 상기 경사슬, 본 발명 제5방면의 상기 항체, 본 발명 제6방면의 상기 재조합 단백질, 본 발명 제7방면의 상기 CAR 구성물, 본 발명 제8방면의 상기 면역세포 또는 본 발명 제9방면의 상기 항체 약물 접합체의 용도를 제공하였고 (i)암 또는 종양을 예방과/또는 치료하는 약물 또는 제제의 제조; 와/또는(ⅱ) 검사시약 또는 시약 키트의 제조에 사용한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 종양은 다음과 같은 혈액 종양, 고형종양 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 혈액 종양은 다음과 같은 급성골수세포백혈병(AML), 다발성 골수종(MM), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 광범위 큰B세포림프종(DLBCL) 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 고형종양은 다음과 같은 위암, 위암 복막 전이, 간암, 백혈병, 신장 종양, 폐암, 소장암, 골암, 골육종, 전립선암, 직장암, 유방암, 대장암, 자궁경부암, 난소암, 림프종, 비인두암, 부신 종양, 방광 종양, 비소세포 폐암(NSCLC), 신경계통 종양, 뇌교질 종양, 신경 모세포 종양, 전이성 악성 종양, 고형종양 복강 전이, 고형종양 골반강 전이 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 고형종양은 다음과 같은 두경부 종양, 인후암, 폐암, 비소세포 폐암, 기관지암, 위암, 위암 복막 전이 종양, 식도암, 간암, 담관암, 췌장암, 직장암, 직장암 복막 전이 종양, 소장암, 신장 종양, 신장암, 방광종양, 유주성 상피 악성 종양, 내분비 종양, 갑상선암, 부신 종양, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 난소암 복막 전이 종양, 자궁내막암, 융모암, 전립선암, 정소 종양, 생식세포 종양, 정낭피종, 배아원성종양, 신경계통종양, 뇌교질 종양, 신경 모세포 종양, 피부 종양, 악성 흑색종, 림프종, 흉선종양, 비인두암, 골암, 육종, 횡문근육종, 지방육종, 혈관육종, 평활근육종, 섬유육종, 골육종, 유잉 육종, 고형종양 전이성 종양, 예를 들면 복강, 흉강, 골반강, 실질기관 등 전이 종양 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 종양은 B7-H3을 발현하거나 높게 발현한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 종양은 B7-H3 양성의 종양을 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 종양은 종양 혈관 내피 세포 또는 종양 미환경 속에 B7-H3 양성의 종양을 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체는 약물 접합체(ADC) 형식의 항체를 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 검사 시약 또는 시약 키트는 B7-H3의 종양을 발현하거나 높게 발현하는 진단에 사용한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 검사 시약 또는 시약 키트는 샘플 중의 B7-H3단백질 검사에 사용한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 검사 시약은 검사편이다.
본 발명 제11방면은 일종 의약조성물을 제공하였고 상기 의약조성물은 다음과 같은 것을 포함한다.
본 발명 제1방면의 상기 중사슬 가변영역, 본 발명 제2방면의 상기 중사슬, 본 발명 제3방면의 상기 경사슬 가변영역, 본 발명 제4방면의 상기 경사슬 또는 본 발명 제5방면의 상기 항체, 본 발명 제6방면의 상기 재조합 단백질, 본 발명 제7방면의 상기 CAR구성물, 본 발명 제8방면의 상기 면역세포, 와/또는 본 발명 제9방면의 상기 항체 약물 접합체 및 약리학상 허용 가능한 운반체, 희석제 또는 부형약이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 의약조성물은 액상제제이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 의약조성물의 약제 형태는 주사제이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 의약조성물 중 상기 세포의 농도는 1Х103-1Х109개 세포/ml이고 바람직한 것은 1Х105-1Х108개 세포/ml이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 의약조성물은 종양세포를 선택적 살상하는 기타 약물(예를 들면 핵산 약물, 항체 약물, 표적화 약물, 기타 면역세포 약물, 기타 CAR-T약물, 화학 요법 약물 또는 그 조합이다.)도 함유한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 항체 약물은 PD-1 또는 PD-L1 억제제를 포함한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 억제제는 다음과 같은 항체, 소분자 화합물, microRNA, siRNA, shRNA 또는 그 조합에서 선택한다.
본 발명 제12방면은 일종 폴리뉴클레오티드를 제공하였고 상기 폴리뉴클레오티드 코드는 다음과 같은 폴리펩티드에서 선택한다.
(1) 본 발명 제1방면의 상기 중사슬 가변영역, 본 발명 제2방면의 상기 중사슬, 본 발명 제3방면의 상기 경사슬 가변영역, 본 발명 제4방면의 상기 경사슬 또는 본 발명 제5방면의 상기 항체;
(2) 본 발명 제6방면의 상기 재조합 단백질; 과
(3) 본 발명 제7방면의 상기 CAR구성물이다.
본 발명 제13방면은 일종 운반체를 제공하였고 상기 운반체는 본 발명 제12방면의 상기 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 운반체는 세균 플라스미드, 박테리오파지, 효모플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물세포 바이러스 예를 들면 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 기타 운반체를 포함한다.
본 발명 제14방면은 일종 유전자 공학화된 숙주세포를 제공하였고 상기 숙주세포는 본 발명 제13방면의 상기 운반체를 함유하거나 게놈 중에 본 발명 제12방면의 상기 폴리뉴클레오티드를 통합한다.
본 발명 제15방면은 일종 공학화 면역세포를 제조하는 방법을 제공하였고 다음과 같은 절차를 포함한다.
(A) 개조 대기 중인 면역세포를 제공한다; 과
(B) 제1발현함 과/또는 임의로 선택한 제2발현함을 상기 개조 대기 중인 면역세포로 도입하고 그 중 상기 제1발현함은 제7항과 같이 상기 CAR구성물을 발현하며 상기 제2발현함은 PD1-CD28또는 PD1-IL7R의 융합 단백질을 발현하여 공학화된 면역세포를 획득한다.
다른 한 바람직한 실시예 중 절차(B) 중에서 (B1) 본 발명 제7방면의 상기 CAR구성물을 발현하는 제1발현함을 상기 면역세포에 도입하는 것; 과 임의로 선택한 (B2) 상기 융합 단백질의 제2발현함을 상기 면역세포에 도입하는 것을 포함하고; 그 중 상기 절차(B1) 은 절차(B2) 전, 후, 동시 또는 교차적으로 진행 가능하다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1발현함은 본 발명 제7방면의 상기CAR구성물을 코딩하는 염기서열을 함유한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제2발현함은 상기 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 함유한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1발현함과 제2발현함은 운반체 위에 위치하거나 상기 공학화된 면역세포의 염색체 속에 통합된다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1발현함과 제2발현함은 동일 또는 서로 다른 운반체 위에 위치한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1발현함과 제2발현함은 동일 운반체에 위치한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 운반체는 다음과 같은 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 운반체, 아데노바이러스 운반체, 레트로바이러스 운반체, 트랜스포슨, 종양용해바이러스 운반체, 기타 유전자 전송 시스템 또는 그 조합에서 선택한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 운반체는 바이러스 운반체(예를 들면 렌티바이러스 운반체임)이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 운반체는 트랜스포슨 운반체이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 면역세포는 T세포 또는 NK세포이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 방법은 획득한 공학화 면역세포에 대한 기능과 효과적 검사를 진행하는 절차도 포함한다.
본 발명 제16방면은 일종 샘플 중 B7-H3 단백질을 체외 검사하는 방법을 제공하였고 상기 방법은 다음과 같은 절차를 포함한다.
(1) 체외에서 상기 샘플을 본 발명 제5방면과 같이 상기 항체와 접촉시킨다.
(2) 항원-항체 복합물 형성 여부를 검출하고 그 중 복합물을 형성하면 샘플 중에 B7-H3 단백질이 존재함을 표시한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 방법은 비진단과 비치료인 것이다.
본 발명 제17방면은 일종 검사판을 제공하였고 상기 검사판은 기판(지지판)과 테스트 스트립을 포함하며 상기 테스트 스트립은 본 발명 제5방면과 같이 상기 항체 또는 본 발명 제9방면과 같이 상기 항체 약물 접합체를 함유한다.
본 발명 제18방면은 일종 본 발명 제8방면의 상기 공학화된 면역세포 제조에 사용하는 시약 키트를 제공하고 상기 시약 키트는 다음과 같은 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(a) 제1용기 및 제1용기 내에 위치한 제1염기서열이고 상기 제1염기서열은 제7항의 상기 CAR구성물을 발현하는 제1발현함을 함유하며; 과
임의 선택한 (b) 제2용기 및 제2용기에 위치한 제2염기서열이고 상기 제2염기서열은 상기 융합 단백질을 발현하는 제2발현함을 함유하는 것을 포함한다.
'다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1, 제2염기서열은 독립적이거나 연결된 것이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1, 제2염기서열은 동일 또는 다른 용기 내에 위치한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1, 제2염기서열은 동일 또는 다른 운반체 위에 위치한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 제1, 제2염기서열은 동일 운반체에 위치한다.
본 발명 제19방면은 일종 진단 시약 키트를 제공하였고 다음과 같은 것을 포함한다.
(1) 제1용기, 상기 제1용기 속에 본 발명 제5방면의 상기 항체를 함유하고; 와/또는
(2) 제2용기, 상기 제2용기 속에 본 발명 제5방면의 상기 항체의 이차 항체를 함유한다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 시약 키트는 본 발명 제17방면의 상기 검사판을 함유한다.
본 발명 제20방면은 일종 암 또는 종양을 치료하는 방법을 제공하였고 상기 방법은 필요한 대상에게 본 발명 제5방면의 상기 항체, 본 발명 제6방면의 상기 재조합 단백질, 본 발명 제7방면의 상기 CAR구성물, 제8방면의 상기 면역세포, 본 발명 제9방면의 상기 항체 약물 접합체, 본 발명 제11방면의 상기 의약조성물을 시용하는 것을 포함한다.
본 발명 범위 내에서 본 발명의 상기 각 기술 특징과 아래 문장(예를 들면 실시예) 중 구체적으로 설명한 각 기술 특징 사이는 모두 서로 조합 가능하고 따라서 새로운 것 또는 바람직한 과제를 구성한다는 것을 이해하여야 한다. 편폭의 제한으로 더 이상 서술하지 않는다.
도1, 항인체 B7-H3 모노클로널 항체 및 그 단쇄 항체(scFv)는 B7-H3에 대하여 모두 특이성 결합 능력을 가진다. B7동족 모노클로널 항체와 항인체 B7-H3단쇄 항체 단백질(scFv)을 활용하여 각각 B7동족 분자 인간 hB7-H1, hB7-H4, hB7-H3과 쥐원 mB7-H3을 안정적으로 발현하는 CHO세포에 대하여 염색하고 생쥐 IgG항체를 동종 항체로 대조(isotope)하며 유세포 분석기 검사를 통하여 B7-H3 모노클로널 항체 및 그 단쇄 항체 단백질(scFv)는 모두 B7-H3에 특이성 결합이 가능하다는 것이 나타난다.
도2, 항인체 B7-H3 단쇄 항체 및 그 모노클로널 항체는 B7-H3에 대하여 비슷한 특이성 결합 능력을 가진다. 서로 다른 농도의 항인체 B7-H3 모노클로널 항체 또는 항인체 B7-H3 단쇄 항체로 각각 B7-H3을 안정적으로 발현하는 CHO세포에 대하여 염색하고 유세포 분석기 검사를 통하여 항인체 B7-H3 모노클로널 항체 및 단쇄 항체(scFv)가 B7-H3에 특이성 결합하는 능력은 대체로 비슷하다는 것으로 나타난다.
도3, B7-H3 막단백질이 서로 다른 종양세포에서의 발현이다. 도3-1, 여러 가지 종양의 파라핀 절편을 사용하여 면역 조직 화학 염색을 진행하고 현미경으로 염색 결과를 관찰한다. 도3-2, B7-H3 모노클로널 항체를 1차 항체로 APC가 표시한 항mIgG 모노클로널 항체를 이차 항체로 활용하여 종양세포에 대하여 염색하고 유세포 분석기를 통하여 B7-H3이 각종 종양세포막 위에서의 발현을 검사하며 생쥐 IgG1을 동종 1차 항체로 하여 대조한다.
도4, 항B7-H3 키메릭 항원 수용체 또는 공통발현 분자의 항 B7-H3 키메릭 항원 수용체의 구성 설명도이다.
각각 ① B7-H3 단쇄 항체와 절단한 4-1BB를 함유하고 CD3ζ를 상실한 B7-H3 CAR((B7-H3 Del-Z-CAR; Del-Z); ② 항B7-H3 단쇄 항체와 4-1BB 및 CD3ζ 세포 내 기능 조각을 함유한 B7-H3 CAR (B7-H3 4-1BB-CAR; BB-Z); ③ PD-1-CD28 키메릭 분자를 공통 발현하는 B7-H3 4-1BB-CAR (BB-Z-PD28); PD1-CD28 키메릭 분자는 PD-1분자 세포외 조각이 CD28분자 세포 내 조각에 연결된 키메릭 분자를 가리킨다. ④ PD-1-IL-7R 키메릭 분자를 공통 발현하는 B7-H3 4-1BB-CAR (BB-Z-PDCA7R); PD1-IL-7R키메릭 분자는 PD-1분자 세포외 조각이 인터류킨7 수용체(IL-7R) 분자 세포내 조각 또는 그 변체에 연결된 키메릭 분자를 가리킨다. ⑤ 항B7-H3 단쇄 항체와 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ 세포내 기능 조각을 함유한 B7-H3 CAR (B7-H3 CD28- 4-1BB-CAR; 28BB-Z);
도5, 서로 다른 구조의 B7-H3CAR-T세포가 B7-H3표적 세포에 대한 항원 자극의 세포증식 반응이다. PD-1-IL-7R 키메릭 분자를 공통 발현하는 B7-H3 CAR-T세포(BB-Z-PDCA7R)는 가장 우수한 증식 능력을 가지고 B7-H3 4-1BB-CAR T세포 (BB-Z), B7-H3 CD28-4-1BB-CAR T세포 (28BB-Z)와 PD1-CD28분자를 공통 발현하는 B7-H3 CAR-T세포(BB-Z-PD28)는 비교적 양호한 비슷한 증식 능력을 가지며 대조로 세포내 시그널 기능이 상실한B7-H3 CAR T세포 (Del-Z)는 효과적인 세포 증식이 없다.
도6, 서로 다른 구조의 B7-H3에 겨냥한 CAR-T세포가 표적 종양세포에 대한 사이토카인 분비 반응이다. 서로 다른 구조의 CAR-T세포가 B7-H3양성 종양세포에 대한 특이성 식별과 활성화 후 서로 다른 수준의 사이토카인(IL-2，IFN-r)의 분비 반응이다. MDA-MB-231-H3KO는 B7-H3이 제거한 후 음성인 유방암 세포를 음성 표적 세포로 대조하고 PBS를 공백으로 대조한다.
도7, 서로 다른 구조의 B7-H3 CAR-T세포가 표적 종양세포에 대한 체외 특이성 살상이다. 서로 다른 구조의 B7-H3에 겨냥한 CAR-T세포를 일정한 효과 표적비(effect target ratio, E≥T)에 따라 각각 표적 종양세포(폐암PG세포, 난소암 SKOV3세포, 유방암MDA-MB-231세포)와 공동 부화한 후 그 살상 기능을 검사한다. 완전한 CD3x 기능을 상실한 B7-H3 CAR T세포만 효과적인 살상 역할이 없는 외에 기타 여러 가지 CAR-T세포는 모두 근사한 살상 기능을 가진다. MDA-MB-231-B7H3KO는 B7-H3이 제거한 후 음성인 유방암 세포이고 서로 다른 구조의 B7-H3 CAR-T세포는 이에 대하여 모두 살상 기능이 부족하며 B7-H3 CAR-T세포가 B7-H3표적 항원에 대한 특이성을 확인한다.
도8, 서로 다른 구조의 B7-H3에 겨냥한 CAR-T세포 치료는 생쥐 피하 종양 모형(난소암, 폐암) 중 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다. 생쥐 난소암, 폐암 피하 모형 중에서 서로 다른 구조의 B7-H3 CAR-T세포로 정맥 주사 치료를 진행하며 대조로 하는 완전한 CD3x을 상실한 B7-H3 CAR-T세포(Del-Z)가 종양 성장을 억제 할 수 없는 외에 기타 각종 B7-H3 CAR-T세포는 모두 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있다.
도9, B7-H3 CAR-T세포는 항 PD-1항체와 결합하여 항종양 치료 효과를 향상시킨다. 생쥐 폐암 PG 모형 중에서 B7-H3 CAR-T세포 단독 사용 또는 B7-H3 CAR-T세포에 항PD-1 항체를 결합하는 정맥 주사 치료를 진행하고 종양 크기 모니터링을 통하여 치료의 효과를 평가한다.
도10, 서로 다른 친화력의 인간화 단쇄 항체가 구성한 CAR-T세포가 표적 세포에 대한 살상 역할을 나타낸다. 인간화 후 서로 다른 경사슬과 중사슬의 조합으로 형성된 단쇄 항체는 서로 다른 항체 친화력을 가진다. 이런 서로 다른 친화력 단쇄 항체에 따라 각각 CAR-T세포를 구성하고 B7H3-CAR-T-ori(인간화 서열을 구성하지 않은 CAR-T), 인간화 후의 서로 다른 조합 서열로 구성한 CAR-T세포(B7H3 CART-H2L2, B7H3 CART-H2L1, B7H3 CART-H1L2, B7H3 CART-L2H2) 를 포함한다. 상기 서로 다른 조합의 B7H3 CAR-T세포는 결장암 LOBO 세포와 공동 부화(8시간)후 그 살상 효과 및 사이토카인 분비(IL-2，IFN-g)를 검사한다.
도11, 도11-1. 인간화 B7-H3 CAR-T세포 （B7H3 CART-H2L2）가 결장암 LOVO 세포를 체외 살상한다. 살상 효과 및 사이토카인 분비를 검사한다; 도11-2. 인간화 B7-H3 CAR-T세포가 생쥐 결장암 종양 모형 중에서의 항종양 역할이다.
도12, 도12-1. 인간화 B7-H3 CAR-T세포 （B7H3 CART-H2L2）가 난소암 SKOV3 세포를 체외 살상한다. 살상 효과 및 사이토카인 분비를 검사한다; 도12-2. 인간화 B7-H3 CAR-T세포가 생쥐 난소암 종양 모형 중에서의 항종양 역할이다.
도13, 인간화 B7-H3 CAR-T세포 （B7H3 CART-H2L2）가 위암 HGC27세포를 체외 살상한다. 살상 효과 및 사이토카인 분비를 검사한다.
도14, 인간화 B7-H3 CAR-T세포 （B7H3 CART-H2L2）가 간암 MHCC7721세포를 체외 살상한다. 살상 효과 및 사이토카인 분비를 검사한다.
도15, 항B7-H3단쇄 항체(H2L2)가 항B7-H3단쇄 항체(MGA271,84D)와의 경쟁적 결합실험이다. 항B7-H3단쇄 항체 H2L2는 84D의 단쇄 항체와 경쟁적 결합하지 않고 양자는 B7-H3분자 위의 서로 다른 항원 결정기에 있다는 결과가 나타났다.
본 발명자는 광범위하고 깊이 있는 연구를 통하여 대량의 선별을 거쳐 처음 의외로 일종 B7-H3에 대하여 높은 특이성과 높은 친화력을 가진 항체 및 상기 항체에 근거한 높은 특이성의 키메릭 항원 수용체 면역세포를 개발하였다. 구체적으로 본 발명은 특별히 우수한 친화력과 특이성을 구비한 항B7-H3 모노클로널 항체를 의외로 획득하였고 이 항체에 근거하여 인간화 항체를 획득하였다. 본 발명 항체는 B7-H3항원에 높은 특이성으로 결합할 수 있고 이는 매우 높은 친화력을 가진다. (그의 Ka(1/Ms), Kd(1/s)와 KD(M) 측정은 모두 매우 우수하다.) 본 발명의 항체 및 그 상응한 키메릭 항원 수용체 면역세포는 B7-H3양성을 특이성 표적할 수 있거나 B7-H3 종양세포를 발현하거나 높게 발현할 수 있고 우수한 종양 살상 효과를 가지며 정상 세포에 대하여 살상 능력이 없다. 이 기초에서 본 발명을 완성하였다.
용어
본 공개를 더 쉽게 이해할 수 있도록 우선 일부 용어를 정의한다. 본 출원 중 사용하는 바와 같이 본 문에 별도로 명확하게 규정하지 않으면 다음 용어 중의 하나 하나는 모두 아래에 주어진 뜻을 가진다. 전체 출원 중에서 기타 정의를 서술한다.
용어 "약(約)" 은 본 분야에 있어서의 종상의 지식을 가진 자가 확정한 특정값 또는 구성된 허용 오차 범위 내의 값 또는 구성을 가리키고 이는 부분적으로 어떻게 측정 또는 측정 값 또는 구성에 의하여 결정될 것이다.
본문에서 사용하는 바와 같이 "키메릭 항원 수용체(CAR)"은 일종 융합단백질이고 이는 항원을 결합시킬 수 있는 세포외 영역, 세포외 영역과 서로 다른 폴리펩티드에서 파생한 막관통영역, 그리고 적어도 한 개 세포내 영역을 포함한다. "키메릭 항원 수용체(CAR)" 는 "키메릭 수용체", "T-body" 또는 "키메릭 면역 수용체(CIR)"이라고도 부른다. 상기 "항원을 결합시킬 수 있는 세포외 영역"은 어느 한 항원을 결합시킬 수 있는 임의한 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 가리킨다. "세포내 영역"은 알려진 전달 시그널로서 세포내 생물 과정을 활성화 또는 억제시키는 영역의 임의한 올리코펩티드 또는 폴리펩티드를 가리킨다.
본문에서 사용하는 바와 같이 "영역"은 폴리펩티드 중 기타 구역에 독립되고 특이 구조로 접힌 영역을 가리킨다.
본문에서 사용하는 바와 같이 "종양 항원"은 항원성을 가진 생체 분자를 가리키고 그 발현은 암을 초래한다.
본문에서 사용하는 바와 같이 "단클론항체 조각(scFv)" 은 항체의 단쇄 폴리펩티드에서 파생한 것을 가리키고 이는 항원을 결합시키는 능력을 보존한다. scFv의 실시예는 재조합 DNA 기술로 이루어진 항체 폴리펩티드를 포함하고 그 중 면역 글로불린 중사슬(H사슬)과 경사슬(L사슬) 조각의 Fv 영역은 스페이서 서열을 거쳐 연결된다. scFv를 개조하는 여러 가지 방법은 본 분야 당업자는 이미 알고 있는 것이다.
본문에서 사용하는 바와 같이 용어 "부여"와 "처리"는 외인성 약물, 치료제, 진단제 또는 조성물을 동물, 인간, 피험자, 세포, 조직, 기관 또는 생물 유체에 응용하는 것을 가리킨다. "부여" 와 "처리"는 치료, 약물동태학, 진단, 연구와 실험 방법을 가리킨다. 세포의 처리는 시약이 세포와의 접촉 및 시약이 유체와의 접촉, 유체가 세포와의 접촉을 포함한다. "부여" 와 "처리" 는 시약, 진단, 결합 조성물을 통하거나 다른 한 종류의 세포외와 생체외 처리를 통하는 것도 가리킨다. "처리"가 인간, 동물 또는 연구 피험자에게 응용할 경우 치료 처리, 예방 또는 예방성 조치, 연구와 진단을 가리키고 항인체 B7-H3 항체가 인간 또는 동물, 피험자, 세포, 조직, 생리격실 또는 생리 유체와의 접촉을 포함한다.
본문에서 사용하는 바와 같이 용어 "치료" 는 환자에게 부여한 내복 또는 외용 치료제를 가리키고 본 발명의 임의 한 종류의 항인체 B7-H3 항체 및 그 조성물을 포함하며 상기 환자는 한가지 또는 여러 가지 질병 증상을 가지고 알고 있는 상기 치료제는 이런 증상에 대하여 치료 효과를 가진다. 일반적으로 한가지 또는 여러 가지 질병 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있는 치료제의 량(치료 유효량)으로 환자에게 부여한다.
본문에서 사용하는 바와 같이 용어 "임의 선택" 또는 "임의로 선택한"은 뒤에 설명하는 사건 또는 상황이 발생할 수 있지만 반드시 발생하는 것은 아니라는 것을 의미한다. 예를 들면 "1-3개 항체 중사슬 가변영역을 포함한 임의 선택"은 특정 서열의 항체 중사슬 가변영역은 있을 수 있지만 반드시 있어야 하는 것은 아니고 1개, 2개 또는 3개 일 수 있다는 것을 가리킨다.
본 발명에 있어서, 상기 "서열 동일성"은 적절한 치환, 삽입 또는 상실 등 돌발적인 상황에서 바람직한 대조와 비교할 경우 두 개 핵산 또는 두 개 아미노산배열 사이의 동일성 정도를 표시한다. 본 발명에 있어서, 상기 서열과 그 동일성을 가진 서열 사이의 서열 동일성은 적어도 85%, 90% 또는 95%이고 바람직한 것은 적어도 95%이다. 비제한적인 실시예는 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%를 포함한다.
B7-H3
인체 B7-H3 분자는 B7동족의 성원이고 506개 아미노산, 분자량이 110kDa인 I형 막관통 단백질을 함유한다. 인체 B7-H3 유전자는 우선 인류 수지상 세포에서 출처한 cDNA라이브러리에서 클론한 것이고 그 구조가 B7동족 유전자와 비슷하기 때문에 B7 Homolog3으로 명명하였으며 B7-H3으로 약칭한다. B7-H3 단백질은 시그널 펩티드에서 유도하여 발현한 세포외가 IgC와 IgV 모양인 영역과 세포내가 고도 가변한 시그널 영역인 I형 막관통 단백질이고 아미노산배열에서 B7동족의 기타 성원과 20%~27%의 상동성이 있다.
B7-H3 발견 초기 주로 면역학의 연구에 집중되었지만 서로 다른 연구 중에서 B7-H3은 T세포에 대해 양성 공동자극 활성화가 있을 뿐만 아니라 면역 억제 기능도 있다는 다른 보도가 있기 때문에 그 기능은 아직 명확하지 않다. 연구 보도에 따르면 B7-H3 분자는 CD4+T세포와 CD8+T세포의 증식을 공동자극을 할 수 있고 T세포 면역 살상 반응 유발을 증강시킬 수 있으며 IFN-γ, IL-8, TNF-α 및 IL-10 등 분비를 선택적으로 자극할 수 있다. 사후 더 많은 연구는 B7-H3은 T세포 활성화를 음성 조절할 수 있고 CD4+T세포 활성화 및 상응한 사이토카인 예를 들면 IFN-γ, IL-4의 분비를 억제한다는 것을 증명한다. 동시에 B7-H3은 Treg가 DC활성화와 항원제시를 억제하는 기능에 참여할 수도 있다.
B7-H3 단백질은 정상 조직, 세포 중에서 발현되지 않거나 극히 낮게 발현되지만 여러 가지 종양 조직에서 높게 발현되고 종양의 진전, 환자 예후 불량과 임상 결과가 떨어지는 것과 관련된다. 서로 다른 각항 연구 중에서 B7-H3이 비소세포 폐암, 전립선암, 흑색종, 유방암 및 췌장암 등 여러 가지 환자 종양 조직 중에서 발현되고 B7-H3의 높은 발현은 관련 종양의 림프 전이 또는 골 전이, 종양 치료와 서로 저항하며 수술 후 진전 재발 및 환자 사망률은 정상관 한다는 것을 발견하였다. 따라서 B7-H3 분자는 일종 새로운 고형종양 표적 분자로 할 수 있다.
PD-1 세포외 조각
PD-1 세포외 조각은 PD-1분자의 세포외 조각이다.
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAH (SEQ ID NO:32)
항체
본문에서 사용하는 바와 같이 용어 "항체"는 면역 글로불린을 가리키고 두 가닥 동일한 중사슬과 두 가닥 동일한 경사슬이 체인 간 이황화물 결합을 통하여 연결된 테트라펩티드사슬 구조이다. 면역 글로불린 중사슬 불변영역의 아미노산 구성과 배열 순서가 다르기 때문에 그 항원성도 다르다. 이에 면역 글로불린을 다섯 가지 종류로 나눌 수 있거나 면역 글로불린의 동종형으로 부를 수 있고 즉 IgM, IgD, IgG, IgA와 IgE이며 그 대응한 중사슬은 각각 μ사슬, δ사슬, γ사슬, α사슬과 ε사슬이다. 동일 유형 Ig는 그 경첩 영역 아미노산 구성과 중사슬 이황화물 결합의 수량과 위치의 차이에 따라 서로 다른 아형으로 나눌 수도 있고 IgG와 같이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 나눌 수 있다. 경사슬은 불변영역의 다름에 따라 k사슬 또는 λ사슬로 나눈다. 다섯 종류 Ig 중 Ig종류마다 모두 k사슬 또는 λ사슬이 있을 수 있다. 서로 다른 종류 면역 글로불린의 부차적 단위 구조와 3차원 구조는 본 분야 당업자가 잘 알고 있는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 경사슬은 진일보하여 경사슬 불변영역을 포함하고 상기 경사슬 불변영역은 인간적 또는 쥐원의 κ, λ 사슬 또는 그 변체를 포함한다.
본 발명 중에서 본 발명의 상기 항체 중사슬은 진일보 하여 중사슬 불변영역을 포함하고 상기 중사슬 불변영역은 인간적 또는 쥐원의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 그 변체를 포함한다. 항체 중사슬과 경사슬은 N터미널에 가까이한 약 110개 아미노산의 배열 변화가 크고 가변영역(Fv영역)으로 하며 C터미널에 가까이한 그 나머지 아미노산배열은 상대적으로 안정적이고 불변영역으로 한다. 가변영역은 초가변영역(HVR) 3개와 서열이 상대적으로 보수적인 골격영역(FR) 4개를 포함한다. 3개 초가변영역은 항체의 특이성을 결정하고 상보적 결정영역(CDR)이라고도 부른다. 경사슬 가변영역(LCVR) 과 중사슬 가변영역(HCVR)마다 CDR영역 3개와 FR영역 4개로 구성되고 아미노기 터미널에서 카르복실기터미널까지 순서에 따라 배열한 순서는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3과 FR4이다. 경사슬의 3개 CDR영역은 LCDR1, LCDR2와 LCDR3을 가리키고 중사슬의 3개 CDR영역은 HCDR1, HCDR2와 HCDR3를 가리킨다.
본 발명의 항체는 쥐원 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체를 포함하고 바람직한 것은 인간화 항체다. 용어 "쥐원 항체"는 본 발명 중에서 본 분야 종래 지식과 기술에 따라 제조한 항인체 B7-H3의 모노콜로널 항체이다. 제조시 B7-H3항원으로 실험대상에 주사한 후 필요한 서열 또는 기능 특징을 갖춘 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리한다. 본 발명에 한 바람직한 실시방안 중에서 상기 쥐원 B7-H3 항체 또는 그 항원 결합 조각은 진일보하여 쥐원 κ, λ 사슬 또는 그 변체의 경사슬 불변영역을 포함하거나 진일보하여 쥐원 IgG1, IgG2, IgG3 또는 그 변체의 중사슬 불변영역 포함한다.
용어 "키메릭 항체(chimeric antibody)"는 쥐원적 항체의 가변영역을 인간 항체의 불변영역과 융합시킨 항체이고 쥐원 항체가 유발하는 면역 반응을 경감시킬 수 있다.
용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 CDR이식 항체(CDR-grafted antibody)로도 불리는 쥐의 CDR서열을 인간의 항체 가변영역 프레임으로 이식하는 것을 가리키고 즉 서로 다른 유형의 인간 생식 계열 항체 프레임 서열 중에서 생긴 항체이다. 인간화 항체는 키메릭 항체가 많은 쥐 단백질 성분을 휴대하여 이종성 반응을 유발시키는 것을 극복할 수 있다. 이런 프레임 서열은 생식 계열 항체 유전자 서열을 포함한 공공 DNA 데이터 베이스 또는 공개된 참고 문헌에서 얻을 수 있다. 면역원성 감소하는 동시에 일으킨 활성화 하락을 피하기 위하여 상기 인간 항체 가변영역 프레임 서열에 대하여 최소 역방향 돌변 또는 복구 돌변을 진행하여 활성화를 유지할 수 있다.
용어 "항체의 항원 결합 조각"(또는 "항체 조각"으로 약칭)은 항체의 특이성 결합 항원(예를 들면 B7-H3)의 능력을 유지하는 한 개 또는 여러 개 조각을 가리킨다. 표시된 이용 가능한 전장 항체의 조각으로 항체의 항원 결합 기능을 진행한다. 용어 "항체의 항원 결합 조각" 중 포함된 결합 조각의 실시예에는 다음과 같은 것을 포함한다.
(i) Fab 조각. VL, VH, CL와 CH1 영역으로 구성한 일가 조각;
(ⅱ) F(ab')2 조각. 경첩 영역 위의 이중황화교를 통하여 연결된 두 개 Fab 조각의 2가 조각을 포함한다.
(ⅲ) VH와 CH1 영역으로 구성된 Fd조각;
(ⅳ) 항체 외팔의 VH와 VL영역으로 구성된 Fv조각이다.
Fv항체는 항체 중사슬 가변영역, 경사슬 가변영역을 함유하지만 불변영역이 없고 전체 항원 결합 사이트의 최소 항체 조각을 가진다. 일반적으로 Fv항체는 VH와 VL영역 사이의 폴리펩티드 이음매도 포함하고 항원 결합이 필요한 구조를 이룰 수 있다.
용어 "CDR"은 항체의 가변영역 내 주로 항원 결합을 촉진시키는 6개 초가변영역 중의 하나를 가리킨다. 상기 6개 CDR의 흔히 사용하는 정의 중 하나는 Kabat E.A 등이 (1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242) 에서 제공하였다.
용어 "결정기" 또는 "항원 결정자"는 항원 위 면역 글로불린 또는 항체가 특이성 결합한 부위(예를 들면 B7-H3분자 위의 특정 부위)를 가리킨다. 결정기는 일반적으로 독특한 공간 배열로 최소 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 연속 또는 비연속적인 아미노산을 포함한다.
용어 "특이성 결합", "선택성 결합" , "선택적 결합" 과 "특이성적 결합"은 항체가 사전 확정된 항원 위의 결정기에 대한 결합을 가리킨다. 일반적으로 항체는 약 10-7M보다 작고, 예를 들면 약 10-8M, 10-9M 또는 10-10M보다 작거나 더 작은 친화력(KD)으로 결합한다.
용어 "경쟁적 결합"은 본 발명의 모노클로널 항체와 인간 B7-H3을 식별하는 세포외 영역 위의 동일 결정기(항원 결정자라고도 부름) 또는 동일 결정기의 일부분이 상기 항원과 결합하는 항체를 가리킨다. 본 발명의 모노클로널 항체와 동일 결정기에 결합하는 항체는 본 발명의 모노클로널 항체에 식별 결합되어 식별되는 인간 B7-H3의 아미노산배열의 항체를 가리킨다.
용어 "KD" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원이 상호 작용하는 해리 균형 상수를 가리킨다. 일반적으로 본 발명의 항체는 약 10-7M보다 작고, 예를 들면 약 10-8M, 10-9M 또는 10-10M보다 작거나 더 작은 해리 균형 상수(KD)로 B7-H3을 결합하고 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 사용하여 BIACORE계기 중에서 측정한 것이다.
본문에서 사용하는 바와 같이 용어 "항원 결정자"는 항원 위 연속하지 않은 것이고 본 발명 항체 또는 항원 결합 조각에서 식별하는 3차원 공간 사이트를 가리킨다.
본 발명은 완전한 항체를 포함할 뿐만 아니라 면역 활성화를 가진 항체의 조각 또는 항체가 기타 서열과 이루어진 융합단백질도 포함한다. 따라서 본 발명은 상기 항체의 조각, 유도체와 유사체도 포함한다.
본 발명 중에서 항체는 본 분야 당업자가 숙지하는 기술로 제조한 쥐적, 키메릭, 인간화적 또는 전인의 항체를 포함한다. 재조합 항체, 예를 들면 키메릭과 인간화 모노클로널 항체는 인간과 비인간의 부분을 포함하고 본 분야에서 잘 알려진 DNA재조합 기술을 채택하여 제조할 수 있다.
본문에서 사용하는 바와 같이 용어 "모노클로널 항체"는 단일 세포에서 출처한 클론이 분비한 항체를 가리킨다. 모노클로널 항체는 고도 특이성인 것이고 단일 항원 결정기에 겨냥한 것이다. 상기의 세포는 진핵적, 원핵 또는 박테리오파지의 클론 세포주일 수 있다.
본 발명 중에서 항체는 단일 특이성, 이중 특이성, 삼중 특이성 또는 더 많은 다중 특이성일 수 있다.
본 발명 중에서 본 발명의 항체는 그 보수적 변이체도 포함하고 본 발명 항체와의 아미노산배열과 비교할 경우 많아야 10개, 바람직한 것은 많아야 8개, 더 바람직한 것은 많아야 5개, 가장 바람직한 것은 많아야 3개 아미노산이 성질이 비슷하거나 근사한 아미노산이 치환되어 폴리펩티드를 이루어진 것을 가리킨다. 이런 보수적 변이 폴리펩티드는 바람직한 것은 표A에 따라 아미노산 치환을 진행하여 생성한다.
표 A
Figure pct00001
인간 B7-H3 특이성 항체
본 발명은 항인체 B7-H3 항체(아래에 B7-H3항체로 약칭)를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 일종 B7-H3에 겨냥한 고특이성과 고친화력의 항체를 제공하고 이는 중사슬과 경사슬을 포함하며 상기 중사슬은 중사슬 가변영역(VH) 아미노산배열을 함유하고 상기 경사슬은 경사슬 가변영역(VL) 아미노산배열을 함유한다. 본 발명 B7-H3 항체는 항원 특이성 T세포 자극 반응을 통하여 T세포의 항종양 역할을 강화하여 환자가 종양에 대한 면역 계통 반응을 최대한 향상시켜 종양세포에 대한 살상 목적에 달성한다.
바람직하게, 중사슬 가변영역(VH) 아미노산배열과 경사슬 가변영역(VL) 아미노산배열의 각자 CDR은 다음과 같은 조에서 선택한다.
a1) SEQ ID NO: 1；
a2) SEQ ID NO: 2；
a3) SEQ ID NO: 3；
a4) SEQ ID NO: 4；
a5) SEQ ID NO: 5；
a6) SEQ ID NO: 6；
a7) SEQ ID NO: 7；
a8) SEQ ID NO: 8；
a9) SEQ ID NO: 9；
a10) SEQ ID NO: 10；
a11) SEQ ID NO: 11；
a12) SEQ ID NO: 12；
a13) SEQ ID NO: 13；
a14) SEQ ID NO: 14；
a15) SEQ ID NO: 15；
a16) SEQ ID NO: 16；
a17) SEQ ID NO: 17；
a18) SEQ ID NO: 18.
상기 아미노산배열 중 임의 한가지 아미노산배열은 최소 한 개(1-5, 1-3개, 바람직한 것은 1-2개, 더 바람직한 것은 1개) 아미노산을 추가, 상실, 변형 과/또는 치환한 B7-H3결합 친화력을 가진 서열이다.
다른 한 바람직한 실시예 중에서 상기 최소 한 개 아미노산배열을 추가, 상실, 변형 과/또는 치환하여 이루어진 서열에서 바람직한 것은 상동성이 최소 80%인 것으로 하고 비교적 바람직한 것은 최소 85%인 것으로 하며 더 바람직한 것은 최소 90%인 것으로 하고 가장 바람직한 것은 최소 95%인 아미노산배열로 한다.
본 발명의 항체는 이중 사슬 또는 단쇄 항체일 수 있고 동물원 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체에서 선택하는 것일 수 있으며 더 바람직한 것은 인간화 항체, 인간-동물 키메릭 항체이고 더 바람직한 것은 전체 인간화 항체이다.
본 발명 상기 항체 유도체는 단쇄 항체 와/또는 항체 조각일 수 있고 예를 들면 Fab, Fab', (Fab')2 또는 해당 분야 내 기타 알려진 항체 유도체 등 그리고 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM항체 또는 기타 아형의 항체 중의 임의 한가지 또는 몇 가지이다.
그 중 상기 동물이 바람직한 것은 포유동물이고 쥐 같은 것이다.
본 발명 항체는 표적 인간 B7-H3의 쥐원 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, CDR 접목 과/또는 변형한 항체일 수 있다.
본 발명의 일종 바람직한 실시예 중에서 상기 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8과 9 중 임의 한가지 또는 몇 가지 서열 또는 이들이 최소 한 개 아미노산을 추가, 상실, 변형 과/또는 치환한 B7-H3결합 친화력을 가진 서열은 중사슬 가변영역(VH)의 CDR영역에 위치한다.
본 발명의 일종 바람직한 실시예 중에서 상기 SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17과 18 중 임의 한가지 또는 몇 가지 서열 또는 이들이 최소 한 개 아미노산을 추가, 상실, 변형 과/또는 치환한 B7-H3 결합 친화력을 가진 서열은 경사슬 가변영역(VL)의 CDR영역에 위치한다.
본 발명의 일종 더 바람직한 실시예 중에서 VH CDR1, CDR2, CDR3은 각각 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8과 9 중 임의 한가지 또는 몇 가지 서열 또는 이들이 최소 한 개 아미노산을 추가, 상실, 변형 과/또는 치환한 B7-H3 결합 친화력을 가진 서열에서 독립적으로 선택하고 VL CDR1, CDR2, CDR3은 각각 SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17과 18 중 임의 한가지 또는 몇 가지 서열 또는 이들이 최소 한 개 아미노산을 추가, 상실, 변형 과/또는 치환한 B7-H3 결합 친화력을 가진 서열에서 독립적으로 선택한다.
본 발명 상기 내용 중 상기 추가, 상실, 변형 과/또는 치환한 아미노산 수량이 바람직한 것은 초기 아미노산배열 총 아미노산 수량의 40%를 넘지 않는 것이고 더 바람직한 것은 35%를 넘지 않는 것이며 더 바람직한 것은 1-33%이고 더 바람직한 것은 5-30%이며 더 바람직한 것은 10-25%이고 더 바람직한 것은15-20%이다.
본 발명 중에서 상기 추가, 상실, 변형 과/또는 치환한 아미노산 수량은 일반적으로 1, 2, 3, 4 또는 5 개이고 비교적 바람직한 것은 1-3개이며 더 바람직한 한 것 1-2개이고 가장 바람직한 것은 1개이다.
항체의 제조
어떠한 모노클로널 항체 생성에 적합한 방법은 모두 본 발명의 B7-H3항체 생성에 사용 가능하다. 예를 들면 연결하거나 자연적으로 존재하는 B7-H3 단백질 또는 그 조각을 사용하여 동물을 면역할 수 있다. 보강제, 면역 자극제, 면역 반복 강화 접종을 포함하는 적합한 면역 접종 방법을 사용할 수 있으며 한가지 또는 여러 가지 수단을 사용할 수 있다.
어떤 적합한 형식의 B7-H3이나 모두 면역원(항원)으로 하여 B7-H3에 대하여 특이를 생성하는 비인간 항체에 사용하여 상기 항체의 생물학 활성을 선별한다. 면역원은 단독 사용하거나 본 분야 알려진 한가지 또는 여러 가지 면역원성 강화제 조합으로 사용할 수 있다. 면역원은 자연적 출처에서 정화하거나 유전 변형한 세포 중에서 생성할 수 있다. 면역원을 코딩하는 DNA는 출처에서 게놈 또는 비게놈(예를 들면 cDNA)의 것일 수 있다. 적합한 유전 운반체를 사용하여 면역원을 코딩하는 DNA를 발현할 수 있고 상기 운반체는 아데노바이러스 운반체, 바큐로바이러스 운반체, 플라스미드와 비바이러스 운반체를 포함하고 이에 한하지 않는다.
본 발명의 B7-H3 항체를 생산하는 예시성 방법은 실시예1에 설명한다.
인간화 항체는 어떠한 종류의 면역 글로불린에서 선택 가능하고 IgM, IgD, IgG, IgA와 IgE을 포함한다. 본 발명 중에서 항체는 IgG항체이고 IgG1 또는 IgG4 아형을 사용한다.
마찬가지로 임의 한가지 경사슬은 본문의 화합물과 방법 중에서 사용할 수 있다. 구체적으로 κ, λ사슬 또는 그 변체는 본 발명의 화합물과 방법 중에서 사용 가능한 것이다.
인간화 본 발명 B7-H3 항체의 예시성 방법은 실시예1에 설명한다.
본 발명 항체 또는 그 조각의 DNA분자의 서열은 일반 기술을 사용 가능하고, 예를 들면 PCR을 이용하여 증폭하거나 게놈 라이브러리 선별 등 방법을 이용하여 획득한다. 이 밖에 서로 다른 경사슬과 중사슬의 코드 서열을 서로 다른 구성 형식으로 함께 융합시켜 단쇄 항체를 이룬다. 서로 다른 조합 또는 서로 다른 링크로 변형한 단쇄 항체의 기능에 대한 검사 분석을 통하여 바람직한 단쇄 항체를 획득한다.
일단 관련 서열을 획득하면 재조합 방법으로 대량으로 관련 서열을 획득 가능하다. 이는 일반적으로 그를 운반체에 클론하고 다시 세포에 전입한 후 일반 방법을 통하여 증식 후의 숙주세포 중에서 관련 서열을 분리하여 획득한다.
이 밖에 인공 합성의 방법으로 관련 서열을 합성 가능하고 특히 조각 길이가 비교적 짧은 경우이다. 일반적으로 먼저 여러 개 작은 조각을 합성한 후 다시 연결하는 것을 통하여 서열이 긴 조각을 획득 가능하다. 다음 해당 DNA서열을 본 분야에서 알려진 여러 가지 기존 DNA분자(또는 운반체와 같이)와 세포 속에 도입시킨다.
용어 "핵산 분자" 는 DNA분자와 RNA 분자를 가리킨다. 핵산 분자는 단쇄 또는 이중 사슬일 수 있지만 바람직한 것은 이중 사슬 DNA이다. 핵산을 다른 한 염기서열과 기능 관계 속에 둘 경우 핵산은 "유효적으로 연결된 것이다." 예들 들면 프로모터 또는 증폭제가 코드 서열의 전사에 영향을 미치면 프로모터 또는 증폭제는 상기 코드 서열까지 효과적으로 연결된다.
용어 "운반체" 는 그와 연결된 다른 한 개 핵산을 운반할 수 있는 핵산분자를 가리킨다. 한 실시 방안 중에서 운반체는 "플라스미드"이고 이는 별도의 DNA 조각을 그 중의 환상 이중 사슬 DNA루프까지 연결 가능한 것을 가리킨다.
본 발명은 상기 적당한 DNA 서열 및 적당한 프로모터 또는 서열을 제어하는 운반체를 포함하는 것에 관한 것이다. 이런 운반체는 적당한 숙주세포 전환에 사용하여 그가 단백질을 발현할 수 있게 할 수 있다.
용어 "숙주세포"는 그 속에 발현 운반체를 도입한 세포를 가리킨다. 숙주세포는 세균 세포와 같은 원핵세포 또는 효모 세포와 같은 저급 진핵 세포 또는 식물이나 동물 세포(예를 들면 포유동물세포)와 같은 고급 진핵 세포일 수 있다.
본 발명 중 상기 재조합 DNA로 숙주세포를 전환하는 절차는 본 분야에 잘 알려진 종래 기술로 진행할 수 있다. 획득한 전환체는 일반 방법으로 배양 가능하고 전환체는 본 발명의 유전자가 코딩한 폴리펩티드를 발현한다. 사용하는 숙주세포에 따라 일반 배양기로 적합한 조건에서 배양한다.
일반적으로 본 발명 항체 발현에 적합한 조건에서 전환하여 획득한 숙주세포를 배양한다. 다음 일반적인 면역 글로불린 정화 절차를 사용하고 예를 들면 단백질A-Sepharose, 하이드록시 인회석 크로마토그래피, 겔 전기 영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 소수성크로마토그래피, 분자체크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피 등 본 분야 당업자가 익숙한 일반 분리 정화 수단으로 정화하여 본 발명의 항체를 획득한다.
얻은 모노클로널 항체는 일반 수단으로 감정 가능하다. 예를 들면 모노클로널 항체의 결합 특이성은 면역 침전 또는 체외 결합 실험(예를 들면 방사성 면역 측정(RIA) 또는 효소결합면역흡착측정법(ELISA))으로 측정할 수 있다.
키메릭 항원 수용체(CAR)
키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptors，CARs)는 세포외 항원 식별 영역, 일반적으로 scFv (single-chain variable fragment), 막관통영역 및 세포내 공동자극 시그널 영역으로 구성한다. CARs의 설계는 아래와 같은 과정을 거쳤다. 1세대 CAR은 한 개 세포내 시그널 구성부분 CD3ζ 또는 FcγRI 분자만 있고 세포내 한 개 활성화 영역만 있기 때문에 이는 짧은 T세포 증식과 비교적 적은 사이토카인 분비를 일으킬 수 밖에 없으며 오랜 시간의 T세포 증식 시그널과 지속적인 체내 항종양 효과를 제공할 수 없기 때문에 매우 좋은 임상 치료 효과를 얻지 못하였다. 제2대 CARs는 기존 구성 기초에서 한 개 CD28, 4-1BB, OX40, ICOS와 같은 공동자극 분자를 도입하였고 1세대 CARs와 비교하면 기능이 매우 향상되었으며 CAR-T세포의 지속성과 종양세포에 대한 살상 능력을 진일보 강화시켰다. 2세대 CARs기초에서 일부 새로운CD27, CD134와 같은 면역 공동자극 분자를 직렬하여 3세대와 4세대 CARs로 발전시켰다.
CARs의 세포외 조각은 한 개 특이한 항원을 식별한 후 세포내 영역에서 해당 시그널 형질 도입을 통하여 세포의 활성화 증식, 세포의 독성 용해와 사이토카인 분비를 일으켜 표적 세포를 제거한다. 우선 환자 자체 세포(또는 이종 공급체)를 분리하고 활성화하여 유전자를 개조하여 CAR의 면역세포를 생성한 후 동일 환자 체내에 주입한다. 이런 방식은 대숙주성 이식편병의 유병률이 극히 낮고 항원은 면역세포가 비MHC한정 방식으로 식별한다.
CAR-면역 세포 치료는 혈액 악성 종양 치료 중에서 매우 높은 임상 반응율을 취득하였고 이런 높은 반응율은 이전 어떤 한가지 치료 수단이나 모두 달성할 수 없는 것이며 세계 각지에서 임상 연구의 붐을 일으킨다.
구체적으로 본 발명의 키메릭 항원 수용체(CAR)는 세포외 영역, 막관통영역과 세포내 영역을 포함한다. 세포외 영역은 표적-특이성 결합 소자(항원 결합영역이라고도 불림)를 포함한다. 세포내 영역은 공동자극 시그널 전도 영역 과/또는ζ 사슬 부분을 포함한다. 공동자극 시그널 전도 영역은 공동자극 분자를 포함한 세포내 영역의 일부분을 가리킨다. 공동자극 분자는 림프세포가 항원에 대한 효과적인 반응에 필요한 세포 표면 분자이고 항원 수용체 또는 이들의 리간드가 아니다.
CAR의 세포외 영역과 막관통영역 사이 또는 CAR의 세포질기질 영역과 막관통 영역 사이에서 이음매를 병입할 수 있다. 본문에서 사용하는 바와 같이 용어 "이음매"는 일반적으로 막관통영역을 폴리펩티드 사슬의 세포외 영역 또는 세포질기질 영역까지 연결시키는 역할을 하는 어떠한 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 가리킨다. 이음매는 0-300개 아미노산을 포함하고 바람직한 것은 2-100개 아미노산과 가장 바람직한 것은 3-50개 아미노산이다.
본 발명의 CAR이 T세포 속에서 발현할 경우 항원 결합 특이성에 근거하여 항원 식별을 진행할 수 있다. 그가 그 관련 항원을 결합할 경우 종양세포에 영향을 미쳐 종양세포의 불성장, 사망 재촉되거나 기타 방식으로 영향을 받게 하고 환자의 종양 부하를 축소 또는 제거시킨다. 항원 결합영역은 바람직하게 공동자극 분자와/ 또는 ζ 사슬 중의 한 개 또는 여러 개의 세포내 영역과 융합한다. 바람직하게 항원 결합영역은 4-1BB시그널 전도 영역과/ 또는 CD3ζ 시그널 영역이 조합한 세포내 영역과 융합한다.
본문에서 사용하는 바와 같이 "항원 결합영역" "단쇄 항체 조각"은 모두 항원 결합 활성을 가진 Fab조각, Fab'조각, F(ab')2조각 또는 단일 Fv조각을 가리킨다. Fv항체는 항체 중사슬 가변영역, 경사슬 가변영역을 함유하지만 불변영역이 없고 전체 항원 결합 사이트의 최소 항체 조각을 가진다. 일반적으로 Fv항체는 VH와 VL 영역 사이의 폴리펩티드 이음매도 포함하고 항원 결합에 필요한 구조를 이룰 수 있다. 항원 결합영역은 일반적으로 scFv(single-chain variable fragment) 이다. scFv의 크기는 일반적으로 한 개 완전한 항체의 1/6이다. 단쇄 항체가 바람직한 것은 한 가닥 뉴클레오티드 사슬이 코딩한 한 가닥 아모노산 사슬 서열이다. 본 발명의 바람직한 방식으로 상기 scFv는 종양 고발현 항원 B7-H3을 특이성 식별하는 항체를 포함하고 바람직한 것은 단쇄 항체이다.
본 발명 중에서 본 발명의 scFv는 그 보수적 변이체도 포함하고 본 발명scFv의 아미노산배열과 비교하면 많아야 10개, 비교적 바람직한 것은 많아야 8개, 더 바람직한 것은 많아야 5개, 가장 바람직한 것은 많아야 3개 아미노산이 성질이 비슷하거나 근접한 아미노산에 치환되어 폴리펩티드를 이루어진 것을 가리킨다.
본 발명 중에서 상기 추가, 상실, 변형 과/또는 치환한 아미노산 수량이 바람직한 것은 초기 아미노산배열 총 아미노산 수량의 40%를 초과하지 않고 더 바람직한 것은 35%를 초과하지 않으며 더 바람직한 것은 1-33%이고 더 바람직한 것은 5-30%이며 더 바람직한 것은 10-25%이고 더 바람직한 것은 15-20%이다.
본 발명 중에서 상기 추가, 상실, 변형 및/또는 치환한 아미노산 수량은 일반적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개이고 바람직한 것은 1-3개이며 더 바람직한 것은1-2개이고 가장 바람직한 것은 1개이다.
경첩 영역과 막 횡단 영역(막관통영역)에 있어서 CAR은 CAR의 세포외 영역까지 융합된 막관통영역을 포함하는 것으로 설계할 수 있다. 한 개 실시예 중에서 CAR 중 영역의 하나와 자연 관련된 막관통영역을 사용한다. 일부 실시예 중에서 막관통영역을 선택할 수 있거나 아미노산 치환을 통하여 변형하고 이런 영역을 동일 또는 다른 표면 막 단백의 막관통영역까지 결합하는 것을 피하며 따라서 수용체 복합물과의 기타 성원의 상호 역할을 최소화한다.
본 발명 중에서 본 발명의 CAR은 본 발명 제7방면에 서술한 바와 같다.
키메릭 항원 수용체 T세포(CAR-T세포)
본문에서 사용하는 바와 같이 용어 "CAR-T세포", "CAR-T", "본 발명 CAR-T세포"는 모두 본 발명 제7방면의 상기 CAR-T세포를 가리키고 본 발명 CAR-T세포는 종양 항원(예를 들면 B7-H3)을 표적할 수 있다.
본 발명의 상기 CAR발현 후 세포막을 관통하여 세포막에 위치한다.
CAR-T세포는 기타 T세포에 근거한 치료 방식에 비교하면 다음과 같은 장점이 존재한다. (1) CAR-T세포의 작용 과정은 MHC의 제한을 받지 않는다. (2) 많은 종양세포가 동일한 종양 항원을 발현하는 것을 감안하여 어느 한 종양 항원에 겨냥한 CAR유전자 구축이 완성되면 범용할 수 있다. (3) CAR은 종양 단백질을 이용하여 항원 할 수도 있고 당지류 비단백질을 이용하여 항원 할 수도 있으며 종양 항원의 표적 범위를 확대한다. (4) 환자 자체 세포를 사용하여 거부 반응의 위험을 낮추었다. (5) CAR-T세포는 면역 기억 기능을 가지고 장시간으로 체내에서 생존할 수 있다.
키메릭 항원 수용체 NK세포(CAR-NK세포)
본문에서 사용하는 바와 같이 용어 "CAR-NK세포", "CAR-NK", "본 발명 CAR-NK 세포"는 모두 본 발명 제1방면의 상기 CAR-NK세포를 가리킨다. 본 발명 CAR-NK세포는 종양 항원(예를 들면 B7-H3)을 표적할 수 있다.
자연 살상(NK)세포는 한가지 주요한 면역효과세포이고 비항원 특이성 수단을 통하여 유기체가 바이러스 감염과 종양세포의 침입을 면하게 보호한다. 공학화(유전자 변형)된 NK세포는 새로운 기능을 획득할 수 있고 종양 항원을 특이성 식별하는 능력 및 강화된 항종양세포독성 작용을 포함한다.
자체 CAR-T세포와 비교하면 CAR-NK세포는 다음과 같은 장점도 가진다. 예를 들면 (1) 퍼포린과 미립자효소 방출을 통하여 종양세포를 직접 살상하고 유기체 정상적인 세포에 대하여 살상 역할이 없다. (2) 이들은 아주 적은 량의 사이토카인을 방출하여 사이토카인 폭풍의 위험을 낮추었다. (3) 체외는 매우 쉽게 "기성" 제품으로 증폭 및 발전한다. 이 외, CAR-T세포 치료와 유사하다.
외인 T세포 항원 수용체
본문에서 사용하는 바와 같이 외인 T세포 항원 수용체(T cell receptor, TCR) 는 유전자 전달 기술을 통하여 종양 반응성 T세포 중에서 TCR의 α사슬과 β사슬을 클론하고 유전자 공학의 수단을 통하여 렌티바이러스 또는 레트로바이러스를 운반체로 하여 T세포 내의 TCR로 외인성 전입한다.
외인 TCR이 변형한 T세포는 종양세포를 특이성 식별과 살상할 수 있고 TCR이 종양성 특이성 항원과의 친화력 최적화를 통하여 T세포가 종양과의 친화력을 향상시킬 수 있으며 항종양 효과를 높인다.
운반체
기대분자의 염기서열 코딩은 본 분야 중 알려진 재조합 방법을 이용하여 획득할 수 있고 예를 들면 발현유전자의 세포 중에서 라이브러리를 선별하는 것, 알려진 해당 유전자의 운반체를 포함한 것에서 해당 유전자를 얻거나 표준적인 기술을 이용하여 해당 유전자가 함유된 세포와 조직 중에서 직접 분리한다. 선택 가능하게, 관심 있는 유전자는 합성 생산될 수 있다.
본 발명도 그 중 본 발명의 발현함 삽입하는 운반체를 제공한다. 레트로바이러스를 비롯한 렌티바이러스의 운반체는 장기 유전자 전달을 실현하는 적합한 공구이고 이들은 유전자 변형이 장기적이고 안정적인 통합을 허용하고 그가 딸세포 속에서 증식하기 때문이다. 렌티바이러스 운반체는 발암에서 유래된 레트로바이러스를 초과하여 예를 들면 쥐과 백혈병 바이러스의 운반체 장점을 가지고 이들은 비증식의 세포, 예를 들면 간세포를 형질 도입할 수 있기 때문이다. 이들도 저 면역원성의 장점을 가진다.
간단히 개괄하면 일반적으로 본 발명의 발현함 또는 염기서열을 프로모터까지 연결을 조작할 수 있고 이를 발현 운반체에 병입할 수 있다. 이 운반체는 진핵 세포의 복사와 통합에 적합하다. 전형적인 클론 운반체는 기대 염기서열 발현 조절에 사용할 수 있는 전사와 번역 종료자, 초기 서열과 프로모터를 포함한다.
본 발명의 발현 구성체도 표준적인 유전자 전달 방안을 이용하여 핵산 면역과 유전자 치료에 사용할 수 있다. 유전자 전달의 방법은 본 분야 중에서 알려진 것이다. 예를 들면 미국 특허번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466을 참조하여 여기서 전문 인용을 통하여 병입한다. 다른 한 실시예 중에서 본 발명은 유전자 치료 운반체를 제공한다.
이 핵산은 많은 유형의 운반체에 클론될 수 있다. 예를 들면 이 핵산은 이와 같은 운반체에 클론될 수 있고 이는 플라스미드, 파스미드， 박테리오파지 유도체, 동물 바이러스와 코스미드를 포함하며 이에 한하지 않는다. 특정한 관심을 가진 운반체는 발현 운반체, 복사 운반체, 프로브 생성 운반체와 서열 결정 운반체를 포함한다.
진일보하여 발현 운반체는 바이러스 운반체 형식으로 세포에 제공할 수 있다. 바이러스 운반체 기술은 본 분야 중에서 공개된 것이고 예를 들면 Sambrook 등 (2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York) 과 기타 바이러스학과 분자 생물학 수첩 중에서 설명하였다. 운반체로 사용할 수 있는 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관바이러스, 헤르페스 바이러스와 렌티바이러스를 포함하고 이에 한하지 않는다. 일반적으로 적합한 운반체는 적어도 한가지 유기체 속에서 작용을 일으키는 복제 기점, 프로모터 서열, 간편한 제한 효소 사이트와 한 개 또는 여러 개 선택 가능한 표시(예를 들면WO01/96584; WO01/29058과 미국 특허번호6,326,193이다.) 를 포함한다.
이미 많은 바이러스에 근거한 계통을 개발하여 유전자를 포유동물 세포로 전달에 사용한다. 예를 들면 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템에 사용하는 간편한 플랫폼을 제공한다. 본 분야 중에서 알려진 기술을 이용하여 선택한 유전자를 운반체에 삽입하고 레트로바이러스 과립에 도입 포장할 수 있다. 이 재조합 바이러스는 뒤이어 체내 또는 생체외의 대상세포로 분리와 전달될 수 있다. 많은 레트로바이러스 시스템은 본 분야 중에서 알려진 것이다. 일부 실시예 중에서 아데노바이러스 운반체를 사용한다. 많은 아데너바이러스 운반체는 본 분야 중에서 알려진 것이다. 한 개 실시예 중에서 렌티바이러스 운반체를 사용한다.
추가한 프로모터 소자, 예를 들면 증폭제는 전사 시작의 주파수를 조절할 수 있다. 일반적으로 이런 것이 시작 사이트 상류의 30-110bp 영역 중에 위치하고 비록 최근 많은 프로모터가 시작 사이트 하류의 기능 소자를 포함하고 있다는 것을 나타냈다. 프로모터 소자 사이의 간격은 늘 유연성이고 소자가 다른 한 개에 비교하여 도치 또는 이동 할 시 프로모터 기능을 유지하도록 한다. 티미딘키나아제(tk) 프로모터 중에서 프로모터 소자 사이의 간격은 50bp 추가 격리되어야 활성이 낮아지기 시작한다. 프로모터에 따라 결정되고 단일 소자가 협력 또는 독립적으로 역할을 하여 전사를 시작할 수 있음을 발현한다.
적합한 프로모터의 한 개 실시예는 즉시 초기 거대세포 바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 그 위에 어떠한 폴리뉴클레오티드 서열까지 연결을 부팅할 수 있는 고수준으로 발현한 강구성성 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 한 실례는 신장성장인자- 1α(EF-1α)이다. 그러나 기타 구성성 프로모터 서열을 사용할 수도 있고 유인원 바이러스40(SV40) 초기 프로모터, 생쥐 유암 바이러스(MMTV), 인체 면역 결핍 바이러스(HIV)장말단 중복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바(Epstein-Barr)바이러스 즉시 조기 프로모터, 라우스육종 바이러스 프로모터 및 인간 유전자 프로모터를 포함하고 이에 한하지 않으며 이를 테면 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터와 크레아틴 키나아제 프로모터를 포함하고 이에 한하지 않는다. 진일보하여 본 발명은 구성성 프로모터의 응용에 한정되어서는 안 된다. 유도성 프로모터도 본 발명의 일부분으로 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 분자 스위치를 제공하고 이는 이런 발현이 기대한 것일 경우 조작 가능한 연결 유도성 프로모터의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 열 수 있거나 발현이 기대하지 않을 경우 발현을 닫을 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오네인 프로모터, 당질 코르티코이드 프로모터, 프로게스테론과 테트라시클린 프로모터를 포함하고 이에 한하지 않는다.
CAR 폴리펩티드 또는 그 일부분의 발현을 평가하기 위하여 세포로 도입한 발현 운반체도 선택 가능한 표지유전자 또는 리포터 유전자 중의 임의의 한 개 또는 양자를 포함할 수 있고 바이러스 운반체를 통하여 트랜스펙션되거나 감염된 세포군 중에서 발현 세포를 감정과 선택하여 찾는 것이 편리하다. 기타 방면에서 선택 가능한 표지는 단독 한 단락 DNA위에 휴대하여 공동트랜스펙션 프로그램에 사용한다. 선택 가능한 표지와 리포터 유전자 양자의 측면은 모두 적당한 조절 서열을 가지고 숙주세포 중에서 발현할 수 있는 것에 편리하다. 유용한 선택 가능한 표지는 예를 들면 항생제 항성 유전자를 포함하고 neo과 같을 것 등이다.
리포터 유전자는 잠재 트랜스펙션의 세포 감정에 사용하고 조절 서열의 기능성 평가에 사용한다. 일반적으로 리포터 유전자는 다음과 같은 유전자이다. 이는 수용체 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 수용체 유기체 또는 조직에서 발현하고 그가 폴리펩티드를 코딩하고 해당 폴리펩티드의 발현은 일부 쉽게 검출한 성질 예를 들면 효소 활성에서 명확히 표시한다. DNA를 수용체 세포에 도입한 후 리포터 유전자의 발현은 적합한 시간에 측정한다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라아제,β-갈락토시다아제, 클로람페니콜아세틸전달효소, 분비성 알칼리 포스파타아제 또는 녹색형광단백질의 유전자(예를 들면 Ui-Tei등, 2000FEBS Letters479:79-82)를 코딩하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 발현 시스템은 공개적이고 이미 알고 있는 기술을 이용하여 제조 또는 상업에서 획득할 수 있다. 일반적으로 최고 수준을 표시하는 리포터 유전자가 발현한 최소 5개 측면 영역을 가진 구성체가 프로모터로 감정되었다. 이런 프로모터 영역은 리포터 유전자로 연결되어 시약 조절 프로포터- 구동 전사의 능력을 평가하는 것에 사용할 수 있다.
유전자를 세포에 도입과 유전자를 세포로 발현하는 방법은 본 분야 중에서 알고 있는 것이다. 발현 운반체의 내용 중에서 운반체는 본 분야 중의 어떠한 방법을 통하여 숙주세포로 쉽게 도입할 수 있고 예를 들면 포유동물, 세균, 효모 또는 곤충 세포이다. 예를 들면 발현 운반체는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단을 통하여 숙주세포로 전달할 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주세포로 도입하는 물리 방법은 인산칼슘침전, 리포펙션, 알파 입자 충격, 미주입법, 전기 천공법 등등을 포함한다. 운반체와/ 또는 외인 핵산 세포를 포함한 생산 방법은 본 분야 중에서 공개된 것이다. Sambrook등 (2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)과 같은 예를 참조한다. 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입하는 바람직한 방법은 인산칼슘형질주입이다.
관심을 가진 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입하는 생물학적 방법은 DNA와 RNA 운반체를 사용하는 것을 포함한다. 바이러스 운반체, 특히 레트로바이러스 운반체는 이미 범용하는 유전자를 포유동물 예를 들면 인간 세포에 삽입하는 방법으로 되었다. 기타 바이러스 운반체는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순헤르페스바이러스I, 아데노바이러스와 아데노연관바이러스 등등에서 유래한다. 미국 특허번호 5,350,674와 5,585,362와 같은 예를 참조한다.
폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입하는 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예를 들면 고분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스페어, 마이크발롱; 와 지질에 근거한 시스템이 포함되고 오일인워터 유제, 미셀, 혼합 미셀과 리포솜을 포함한다. 체외와 체내 전달 공구(delivery vehicle)로 사용하는 예시성 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들면 인조 막소포)이다.
비바이러스 전달 시스템을 사용하는 상황에서 예시성 전달 공구는 리포솜이다. 지질 제제 사용을 고려하여 핵산을 숙주세포에 도입한다. (체외, 생체외(ex vivo) 또는 체내) 다른 한 방면에서 이 핵산은 지질과 서로 연관될 수 있다. 지질과 서로 연관된 핵산은 리포솜의 수성 내부 속에 봉입될 수 있고 리포솜의 지질2중층 내에 분산되며 리포솜과 올리고뉴클레오타이드 양자와 모두 연관된 연결 분자를 거쳐 리포솜에 접합하고 리포솜에 몰입하며 리포솜과 복합하여 지질을 포함한 용액 속에 분산되고 지질과 혼합하며 지질과 결합하여 현탁액으로 지질 속에 포함되고 미셀 속을 포함하거나 미셀과 복합하거나 기타 방식으로 지질과 연관된다. 조성물과 연관된 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 운반체는 용액 속의 어떠한 구체적인 구조에 한하지 않는다. 예를 들면 이들은 이분자층 구조 속에 존재할 수 있고 미셀 또는 "붕괴(collapsed)" 를 가진 구조로 한다. 이들도 용액 속에 간단하게 분산될 수 있고 크기 또는 형상이 불일치한 집합체를 이룰 수 있다. 지질은 지방 물질이고 이는 자연스럽게 발생 또는 합성된 지질일 수 있다. 예를 들면 지질은 지방 방울을 포함하고 이는 세포질 및 긴 사슬 지방족탄화수소와 이들의 유도체를 포함한 지방산, 알코올류, 아민류, 아미노 알코올류와 알데히드류의 해당 종류 화합물 등 같은 것 속에 자연스럽게 발생한다.
본 발명의 한 개 바람직한 실시예 중에서 상기 운반체는 렌티바이러스 운반체이다.
제제
본 발명은 일종 본 발명 제1방면의 상기 중사슬 가변영역, 본 발명 제2방면의 상기 중사슬, 본 발명 제3방면의 상기 경사슬 가변영역, 본 발명 제4방면의 상기 경사슬, 제5방면의 상기 항체, 본 발명 제6방면의 상기 재조합 단백질, 본 발명 제7방면의 상기 CAR구성물, 본 발명 제8방면의 상기 면역세포 또는 본 발명 제9방면의 상기 항체 약물 접합체 및 약리학상 허용 가능한 운반체, 희석제 또는 부형약을 포함하는 것을 제공하였다. 한 실시예 중에서 상기 제제는 액상제제이다. 바람직하게, 상기 제제는 주사제이다. 바람직하게, 상기 제제 중 상기 CAR-T세포의 농도는 1Х103-1Х109개 세포/ml이고 더 바람직한 것은 1Х105-1Х108개 세포/ml이다.
한 실시예 중에서 상기 제제는 완충용액 이를 테면 중성 완충 염수, 황산염 완충 염수 등; 탄수화합물 이를 테면 포도당, 마노스, 자당 또는 글루칸, 마니톨 등; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산 이를 테면 글리신; 항산화제; 킬레이팅제 이를 테면 EDTA 또는 글루타티온; 보강제(예를 들면 수산화알루미늄); 과 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 제제이 바람직한 제조는 정맥 또는 복강내 시용에 사용한다.
치료성 응용
본 발명은 본 발명 발현함의 렌티바이러스 운반체(LV)가 형질 도입한 세포(예를 들면 T세포)를 코딩하여 진행하는 치료성 응용을 포함한다. 형질 도입한 T세포는 종양세포의 표지물 B7-H3 단백질을 표적 가능하고 T세포 활성화를 협력하며 세포 면역 반응을 일으켜 그가 악성 종양에서 온 종양세포의 살상효율을 현저하게 향상시킨다.
따라서 본 발명은 자극이 포유동물의 표적 세포군 또는 조직의 T세포-매개에 대한 면역 반응 방법도 제공하였고 이는 다음과 같은 절차를 포함한다. 포유동물에 본 발명의 CAR-T세포를 시용한다.
한 실시예 중에서 본 발명은 한가지 세포 치료법을 포함하고 환자 자체 T세포(또는 이종 공여체) 를 분리하며 활성화 및 유전자 개조를 거쳐 CAR-T세포를 생성한 후 동일 환자 체내에 주입한다. 이런 방식은 대숙주성 이식편병 유병률이 극히 낮고 항원은 T세포가 무 MHC제한 방식으로 식별된다. 이 외, 일종 CAR-T가 해당 항원을 발현하는 모든 암을 치료할 수 있다. 항체 요법과 다르게 CAR-T세포는 체내 복제하여 지속적으로 종양을 제어할 수 있도록 장기 지구성을 생성할 수 있다.
한 실시예 중에서 본 발명의 CAR-T세포는 안정적인 체내 T세포 확장 및 지속 연장하는 시간량을 경과할 수 있다. 그밖에 CAR매개에 대한 면역 반응은 차용면역요법 절차의 일부분일 수 있고 그 중 CAR- 변형 T세포는 CAR 중의 항원 결합영역 특이성의 면역 반응을 유도한다. 예를 들면 B7-H3의 CAR-T세포는 항 발현 B7-H3의 세포의 특이성 면역 반응을 일으킨다.
비록 본문에서 공개한 데이터는 구체적으로 B7-H3의 scFv, 경첩과 막관통영역, CD28과/ 또는 4-1BB(CD137), CD3ζ 시그널 전달 영역 및 임의 선택한 자가절단 단백질의 코딩 서열과 임의 선택한 PD1-CD28 또는 PD1-IL7R융합 단백질의 코딩 서열의 렌티바이러스 운반체를 포함지하만 본 발명은 구성체 구성 부분 중의 매개에 대한 임의 수량의 변화를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
치료 가능한 암은 혈관화 되지 않거나 기본적으로 혈관화 되지 않은 종양 및 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 비고형종양(이를 테면 혈액학 종양, 예를 들면 백혈병과 림프종) 또는 고형종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR로 치료하는 암 종류는 암, 모세포종과 육종과 일부 백혈병 또는 악성 림프종, 양성과 악성 종양, 약성종을 포함하고 이에 한하지 않으며 예를 들면 육종, 암과 흑색종이다. 성인 종양/암과 어린이 종양/암도 포함한다.
혈액학 암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액학(또는 혈액원성) 암의 예는 백혈병을 포함하고 급성 백혈병(이를 테면 급성림프구성백혈병, 급성골수세포백혈병, 급성골수성백혈병과 골수아세포성, 전골수구성, 알-단핵 세포성, 단핵 세포성과 적백혈병이다.), 만성 백혈병(이를 테면 만성의 골수아세포성(과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병과 만성 림프 구성 백혈병이다.), 진성다혈구증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨 림프종 (무통과 고등급 형식), 다발성 골수종, 발텐스트롬마크로글로불린혈증, 중사슬 질환, 골수증이상증후군, 털세포백혈병과 척수형성부전증을 포함한다.
고형종양은 일반적으로 낭종 또는 액체영역의 조직의 이상 종양을 포함하지 않는다. 고형종양은 양성 또는 악성인 것이다. 서로 다른 종류의 고형종양은 이들을 형성한 세포 종류로 명명한다. (이를 테면 육종, 암과 림프종이다.) 고형종양 이를 테면 육종과 암의 예는 두경부 종양, 인후암, 폐암, 비소세포 폐암, 기관지암, 위암, 위암 복막 전이 종양, 식도암, 간암, 담관암, 췌장암, 직장암, 직장암 복막 전이 종양, 소장암, 신장 종양, 신장암, 방광종양, 유주성 상피 악성 종양, 내분비 종양, 갑상선암, 부신 종양, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 난소암 복막 전이 종양, 자궁내막암, 융모암, 전립선암, 정소 종양, 생식세포 종양, 정낭피종, 배아원성종양, 신경계통종양, 뇌교질 종양, 신경 모세포 종양, 피부 종양, 악성 흑색종, 림프종, 흉선종양, 비인두암, 골암, 육종, 횡문근육종, 지방육종, 혈관육종, 평활근육종, 섬유육종, 골육종, 유잉 육종, 고형종양 전이성 종양, 예를 들면 복강, 흉강, 골반강, 실질기관 등 전이 종양을 포함한다.
본 발명의 CAR-T세포는 포유동물에 대한 생체외 면역과/ 또는 체내 치료법의 백신 종류로 사용할 수도 있다. 바람직한 포유동물은 인간이다.
생체외 면역에 있어서, 다음 중의 최소 한 가지는 세포를 포유동물에 시용하기 전에 체외에서 발생한다. i) 세포 증폭, ii) CAR를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 것과/ 또는 iii)세포 냉동 보관이다.
생체외 절차는 본 분야에서 공지된 것이고 아래에 더 완전히 토론을 진행한다. 간단하게 말하면 세포는 포유동물(바람직한 것은 인간) 속에서 분리하여 본문에서 공개한 CAR를 발현한 운반체로 유전자 변형을 진행한다. (즉 체외 전달 또는 트랜스펙션이다.) CAR-변형한 세포는 포유동물 접수자에게 시용하여 치료 이점을 제공할 수 잇다. 포유동물 접수자는 인간일 수 있고 CAR-변형한 세포는 접수자에 상대적으로 자체일 수 있다. 선택 가능하게 세포는 접수자에 상대적으로 동종 이형 유전자, 동일 유전자 (syngeneic) 또는 이종일 수 있다.
생체외 면역에 있어서, 세포에 근거한 백신을 사용하는 외에 본 발명은 체내 면역으로 환자 속 항원에 겨냥한 면역 반응을 일으키는 조성물과 방법도 제공하였다.
본 발명은 종양을 치료하는 방법을 제공하고 이는 이를 필요한 대상에게 유효량의 본 발명의 CAR-변형한 T세포를 시용하는 것을 포함한다.
본 발명의 CAR-변형한 T세포는 단독 시용되거나 의약 조성물로 희석제와/ 또는 기타 구성 또는 기타 사이토카인 또는 세포군과 결합하여 시용할 수 있다. 간단하게 말하면, 본 발명의 의약조성물은 본문에서 서술하는 바와 같이 상기 표적세포군은 한가지 또는 여러 가지 약리학 또는 생리학상 허용 가능한 수용체, 희석제 또는 부형제와 결합하는 것을 포함할 수 있다. 이런 조성물은 완충용액 이를 테면 중성 완충 염수, 황산염 완충 염수 등; 탄수화합물 이를 테면 포도당, 마노스, 자당 또는 글루칸, 마니톨 등; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산 이를 테면 글리신; 항산화제; 킬레이팅제 이를 테면 EDTA 또는 글루타티온; 보강제(예를 들면 수산화알루미늄); 과 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 바람직한 제조는 정맥 또는 복강내 시용에 사용한다.
본 발명의 의약조성물은 치료(또는 예방)를 대기하는 질병에 적합한 방식으로 시용한다. 시용하는 수량과 빈도는 비록 적당한 사용량은 임상실험에서 확정할 수 있지만 환자의 병증, 환자 질병의 종류와 심각한 정도와 같은 이러한 요소로 결정한다.
"면역학상 유효량" ,"항종양 유효량" , "종양-억제 유효량" 또는 "치료량"을 지적할 경우 시용하려는 본 발명 조성물의 정확한 량은 의사가 결정할 수 있고 그는 환자(대상)의 연령, 몸무게, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도와 병증의 개체 차이를 고려한다. 일반적으로 지적할 수 있는 것은 본문에서 설명한 T세포의 의약조성물은 103-108개 세포/kg체중의 사용량, 바람직한 것은 105-106개 세포/kg체중의 사용량(이런 범위 내의 모든 정수 값을 포함한다. )으로 시용하는 것을 포함한다. T세포 조성물도 이런 사용량으로 여러 번 시용할 수 있다. 세포는 면역치료법 중 공개된 주입 기술(예를 들면 Rosenberg 등, NewEng.J. of Med.319:1676，1988 참조)을 통하여 시용할 수 있다. 구체적 환자의 바람직한 사용량과 치료방안에 대하여 환자의 질병 징후 모니터링을 통하여 치료를 조절할 수 있고 의학계 엔지니어는 쉽게 확정한다.
대상 조성물의 시용은 어떠한 간편한 방식으로나 진행할 수 있고 분무법, 주사, 삼킴, 정맥주사, 삽입 또는 이식을 통하는 것을 포함한다. 본문이 설명한 조성물은 피하, 피내, 혹내, 결내, 척수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 통한 주사, 또는 체강내 예를 들면 복강내, 골반강내, 흉강내, 뇌실내, 척수강내, 관절강내 등을 통하여 환자에서 시용할 수 있다. 한 실시예 중에서 본 발명의 T세포 조성물은 피내 또는 피하 주사를 통하여 환자에게 시용한다. 다른 한 실시예 중에서 본 발명의 T세포 조성물은 바람직하게 i.v. 주사를 통하여 시용한다. T세포의 조성물은 종양, 림프선 또는 감염 부위에 직접 주입할 수 있다.
본 발명의 일부 실시예 중에서 본문에서 설명한 방법 또는 본 분야에서 알고 있는 기타 T세포를 치료성 수준으로 확장하는 것을 이용하여 활성화와 확장한 세포는 어떠한 수량의 연관 치료 형식과 결합하여(예를 들면 이전, 동시 또는 이후) 환자에게 시용하고 상기 치료 형식은 다음과 같은 시약으로 치료를 포함하지만 이에 한하지 않는다. 상기 시약 이를 테면 항바이러스치료법, 시도포비어와 인터류킨-2, 시토신아라비노시드(ARA-C로 알고 있음) 또는 MS환자에 대한 나탈리주마브 치료 또는 PML환자에 대한 기타 치료이다. 진일보한 실시예 중에서 본 발명의 T세포는 아래와 같은 것과 결합하여 사용할 수 있다. 화학 치료, 방사, 면역 억제제이고 이를 테면 시클로스포린, 아지티오프린, 메토프테린, 미코페놀레이트와 FK506, 항체 또는 기타 면역 치료제이다. 진일보한 실시예 중에서 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 화학 치료제 이를 테면 플루다라빈, 외부 광속방사치료법(XRT) , 엔독산 결합(예를 들면 이전, 동시 또는 이후)을 이용하여 환자에게 시용한다. 예를 들면 한 실시예 중에서 대상은 고사용량 화학 치료의 표준 치료를 경과한 후 말초혈액 간세포를 이식할 수 있다. 일부 실시예 중에서 이 식후 대상은 본 발명의 확장한 면역세포의 주입을 수용한다. 추가한 실시예 중에서 확장된 세포는 외과 수술 전 또는 외과 수술 후 시용한다.
환자에게 시용하는 상기 치료하는 사용량은 병증 치료의 정확한 속성과 치료하는 수용자에 따라 변화한다. 인간이 시용하는 사용량 비례는 본 분야가 수용하는 실천에 따라 실시한다. 일반적으로 매번 치료 또는 매 치료 과정마다 1Х103개- 1Х109개 본 발명이 변형한 T세포를 예를 들면 정맥 환송의 방식을 통하여 환자에게 시용한다.
검사 용도와 시약 키트
본 발명의 항체는 검사 응용에 사용할 수 있고 예를 들면 샘플 검사에 사용하여 진단 정보를 제공한다.
본 발명 중 채택한 샘플(견본)은 세포, 조직 샘플과 생체 조직 검사 표본을 포함한다. 본 발명에 사용하는 용어 "생체 조직 검사"는 본 분야 당업자가 알고 있는 모든 종류의 생체 조직 검사를 포함하여야 한다. 따라서 본 발명 중 사용하는 생체 조직 검사는 예를 들면 내시경 방법 또는 기관의 천자 또는 침술 생체 조직 검사를 통하여 제조한 조직 샘플을 포함할 수 있다.
본 발명 중 사용하는 샘플은 고정 또는 보존된 세포 또는 조직 샘플을 포함한다.
본 발명은 일종 본 발명의 항체(또는 그 조각), scFv를 함유하는 시약 키트도 제공하였고 본 발명의 바람직한 예에서 상기 시약 키트는 용기, 사용 설명서, 완충제 등도 포함한다. 바람직한 예에서 본 발명의 항체는 검사판에 고정할 수 있다.
본 발명의 주요 장점은 다음과 같은 것을 포함한다.
(1) 본 발명의 항체는 고친화력, 고특이성의 특징을 가진다.
(2) 본 발명의 인간화 항체 또는 scFv는 여전히 B7-H3에 겨냥한 고친화력과 고특이성을 가진다.
(3) 본 발명의 공학화 면역세포는 종양 항원(B7-H3과 같이)을 표적 가능하여 종양세포를 선택적으로 살상한다.
(4) 본 발명의 공학화 면역세포는 종양 내 증식한 혈관내피 세포를 표적 가능하고 종양의 혈관 생성과 혈액 공급을 파괴하는 것을 통하여 종양세포를 억제하거나 손상하여 종양세포와 종양 혈관을 동시에 표적할 수 있으며 종양세포를 이중적 더 효과적으로 살상할 수 있다.
(5) 본 발명의 공학화 면역세포는 종양 미세환경에 표적할 수 있고 섬유세포 또는 면역세포 등 성분을 포함하고 이에 한하지 않아 종양세포와 종양 미세환경을 동시에 표적할 수 있으며 종양세포를 이중적 더 효과적으로 살상할 수 있다.
(6) 본 발명의 일종 공학화 면역세포는 B7-H3을 표적하는 CAR과 PD-L1을 표적하는 CAR 또는 분비 단백질을 공통 발현할 수 있어 종양세포에 대한 살상 효과를 강화한다.
(7) 본 발명 중 B7-H3을 표적하는 CAR 및 PD-L1을 표적하는 융합 단백질은 시너지 효과를 가지고 CAR-T세포의 활성화, 증식, 사이토카인 분비 및 이전을 향상시킬 수 있으며 CAR-T세포가 체내에서의 살상 기능을 향상시키며 CAR-T세포가 종양 조직으로 향하는 이전 귀소를 촉진하고 CAR-T세포가 체내에서의 존재 시간을 향상시키며 기억 세포를 생성하는 능력을 강화하기 때문에 단일한 CAR에 비교하여 CAR-T세포의 치료 효과를 강화할 수 있고 특히 CAR-T세포가 고형종양을 치료하는 효과를 향상시킨다.
(8) 본 발명은 처음으로 B7-H3 모노클로널 항체에서 출처한 단쇄 항체 가변영역(scFv)을 이용하여 B7-H3 특이성 CAR-T세포(B7-H3-CAR-T)의 구축을 진행하였고 체외와 동물 모형 체내에서 B7-H3-CAR-T세포의 기능 및 그가 여러 가지 종양에 대한 치료 효과를 검증하였다.
(9) 본 발명의 B7-H3의 모노클로널 항체는 진일보하여 이중특이성항체, ADC항체, 생물 시약, 임상 진단 시약, 영상시약 등에 응용할 수 있다.
(10) B7-H3 CAR세포 및 그 신형 CAR구성과 기술은 T세포가 CAR-T 형성에 사용할 뿐만 아니라 기타 면역 세포에 사용하여 유전자 변형과 개량할 수도 있고 이를 테면 NK 세포이다.
(11) 본 발명의 신형 CAR-T 구조와 기술은 기타 표적 분자와의 결합에 사용하여 연구와 응용할 수 있다.
아래에 구체적인 실시 예를 통해 본 발명에 대해 진일보하게 설명한다. 이런 실시예는 본 발명의 설명에만 사용할 뿐 본 발명의 범위 한정에 사용하지 않음을 알아야 한다. 다음 실시예 중 구체적 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 일반적으로 일반 조건 예를 들면 Sambrook 등 사람, 분자 클론: 실험실 매뉴얼(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 중 상기 조건 또는 메이커에서 권장한 조건에 따른다. 별도 설명하지 않으면 비례와 부수는 중량 비례와 중량 부수이다.
특별히 설명하지 않으면 본 발명 실시예 중 사용하는 재료와 시약은 모두 시판 제품이다.
실시예1 항체의 제조
인간 B7-H3 단백질(4Ig-B7-H3과 쥐 IgG Fc조각의 융합 단백질, 4Ig-B7-H3-mFc, 자가 제조)을 항원으로 Balb/c생쥐를 면역하고 생쥐 혈청을 수집하여 그가 B7-H3 단백질에 대한 친화력과 역가를 검증하고 양성 결과는 생쥐 혈청 속에 항B7-H3의 항체가 생성되었음을 표시한다. 다음 면역에 성공한 생쥐 비장 세포를 추출하고 SP2/0세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 획득한다. ELISA 및 유동식 검출 기술을 응용하여 항인체 B7-H3의 양성 모노클로널 하이브리도마 세포를 선별한다. 하이브리도마 세포의 상청액을 수집하고 정화하여 B7-H3 mAb를 획득하며 항체 기능의 검증에 사용한다.
실시예2 항체 서열의 측정
모노클로널 하이브리도마 세포를 추출하고 시약 키트로 총RNA를 추출하여 정화한다. RNA의 역전사 및 5'-RACE- cDNA의 증폭을 통하여 모노클로널 항체의 cDNA를 획득한다. 획득한 cDNA를 형판으로 하고 PCR방법을 통해 증폭하여 모노클로널 항체의 경사슬과 중사슬 가변영역의 cDNA 획득한 후, TA운반체 클론 기술을 통하여 경사슬과 중사슬 가변영역의 cDNA를 플라스미드 운반체에 연결한다.
중사슬, 경사슬 플라스미드를 컴피턴트 세포 위에서 전환하여 클론균판에서 모노클론 균락의 선별을 진행한다.
모노클론 균락을 선별하여 정화 플라스미드를 추출하고 일반 DNA 서열 결정을 통하여 경사슬과 중사슬 가변영역의 cDNA서열을 획득한다.
항체 가변영역의 서열 결정 결과를 kabat 등 데이터 베이스와 대조하여 CDR영역을 판독하고 정확한 항체 서열을 선택한다.
링크 펩티드(linker peptide)가 중사슬, 경사슬 가변영역 서열에 연결을 통하여 단쇄 항체 조각(scFv)을 획득하고 scFv를 phIgV, pmIgV 플라스미드 운반체에 클론한다. scFv-phIgV 또는 scFv-pmIgV 운반체를 293 T세포를 트랜스펙션하여 단쇄 항체를 제조하고 단쇄 항체의 기능 검증을 진행한다.
실시예3 B7-H3 모노클로널 항체 및 그 단쇄 항체 scFv의 친화력과 특이성
(1) B7-H3 단쇄 항체 scFv 특이성 검사
표시한 B7-H3 단쇄 항체(scFv, 자가 제조)를 각각 발현이 다른 B7동족 분자 (인간 B7-H1, B7-H3, B7-H4, 쥐원B7-H3 분자를 포함)의 CHO세포(자가 제조)와 부화 염색한다. 대응한 B7동족 분자 항체로 양성 염색 대조 실험을 진행하고 초기 CHO세포를 음성 대조로 하며 생쥐 IgG항체를 동종 항체 대조(isotope)로 한다. 유세포 분석기로 검사하고 도1 결과와 같이 B7-H3 단쇄 항체 scFv 특이성은 B7-H3분자를 식별 결합하고 기타 B7 동족 분자를 결합할 수 없다.
(2) B7-H3모노클로널 항체 또는 그 scFv친화력 검사
동일 조건 상황에서 표기한 서로 다른 농도의 항인B7-H3모노클로널 항체 또는 항인 B7-H3 단쇄 항체 단백질 scFv를 사용하여 각각 B7-H3을 안정적으로 발현하는 CHO 에 대하여 염색하고 4→에서 30분간 부화시킨 후 유세포 분석기로 검사하며 양자가 인체 B7-H3을 결합하는 능력을 비교한다. 결과는 도2에 표시한 바와 같이 B7-H3 모노클로널 항체와 그의 단쇄 항체(scFv)는 B7-H3분자에 대하여 상당하거나 동등한 결합 능력을 가지고 양자는 모두 인간에 결합한 B7-H3분자를 효과적으로 특이성 표적할 수 있다.
실시예 4 B7-H3이 각종 종류 종양세포 속에서의 발현
다양한 종양의 파라핀 절편에 대하여 면역 조직 화학 염색을 진행한다. 구연산/ 마이크로파 스팀 수욕 100℃의 항원 복구 방법을 통하여 항원을 복구하고 항B7-H3 mAb를 1차 항체로 하며 ABC complex시약 키트 및 Streptavidin-HRP을 사용하여 면역 조직 화학 염색을 진행하고 현미경으로 관찰하여 B7-H3이 다양한 고형종양 중에서 높게 발현되며 직장암, 난소암, 유방암, 위암, 간암, 췌장암, 전립선암, 교모세포종, 신경모세포종, 두경부 종양, 악성 흑색종 등을 포함하고 정상 조직 중에서 없거나 낮게 발현한다. 동시에 B7-H3은 고형종양 내 증식한 혈관 내피 세포에서 발현될 수 있다. 일부 면역 조직 화학 결과는 도3-1 참조한다.
항 B7-H3을 응용한 단쇄 항체는 유세포 검사법을 통하여 B7-H3이 각종 종양세포주에서의 발현을 측정하고 예들 들면 인간 결장암 HT-29세포, 인간 결장암 SW620세포, 인간 비소세포폐암 A549세포, 인간 폐 거세포암 PG세포, 인간 간암 HepG2세포, 인간 간암 Huh7세포, 인간 흑색종 624Mel세포, HLB100, 유방암 MDA-MB-231세포, 난소암 SKOV3세포, 편평세포암종 SCC47세포, 자궁경부암 Hela세포, 인간 백혈병 K562세포이다. 결과는 도3-2에 표시한 바와 같이 B7-H3은 다양한 고형종양세포주 및 일부 혈액 종양세포주에서 높게 발현된다.
실시예5 B7-H3 CAR 및 그와 다른 분자는 공통 발현하여 신형 CAR-T세포를 형성.
(1) 운반체 구축
중복 연장 PCR기술을 통하여 항인체 B7-H3의 단쇄 항체 조각(scFv), CD8경첩 영역과 막관통영역, CD28 과/또는 4-1BB 의 세포내 시그널 전달 영역, CD3ζ의 활성화 기능 영역을 연결하여 CAR의 cDNA구조를 구축한다. 중복 연장 PCR기술을 통하여 PD-1 세포외 조각과 CD28 세포내 조각, PD-1 세포외 조각과 IL-7 수용체(IL-7R)의 세포내 기능 조각(또는 세포내 돌변 수용체 자각)을 각각 연결하여 PD1-CD28(PD28)과 PD1-IL-7R（PDCA7R）의 융합cDNA를 구축한다. 중복 연장 PCR기술을 통하여 T2A서열을 절단 연결 서열로 응용하고 CAR cDNA를 각각 PD28, PDCA7R, 과/또는 EGFP조각과 연결하여 서로 다른 분자가 공통 발현하는 CAR분자의 유전자 구조를 구축하며 4-1BB를 절단하고 CD3ζ을 상실한 CAR를 대조로 한다. 구조 설명도는 도4를 참조한다.
전형적인 CAR구조는 도4에 표시한 바와 같이 그 중 공통발현 분자를 함유한 CAR구조의 아미노산배열은 SEQ ID NO.:37에 표시한 바와 같고 코드에 공통발현 분자를 함유한 CAR 구조의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.:38에 표시한 바와 같다.
(2) B7-H3 CAR 렌티바이러스 운반체의 제조
분자 클론 기술을 통하여 상기 다른 구조의 CAR 또는 공통발현 분자를 함유한 CAR구조를 렌티바이러스 발현 운반체에 연결한다. 일반적인 PEI, 인산칼슘침전 또는 기타 트랜스펙션 방법을 통하여 Lenti-X 293T세포 또는 293T세포 위에서 2세대 또는 3세대 렌티바이러스 운반체의 포장 제조를 진행한다. 생성된 렌티바이러스 원액은 0.45μm 여과기로 여과한 후 원심 분리하여 농축하고 크로마트그래피 또는 이온 교환을 통하여 정화할 수도 있다. 렌티바이러스 운반체는 적정 농도 감정을 거쳐 액체 질소에 급속 냉동한 후 -80℃에 보관한다.
(3) B7-H3 CAR-T세포의 제조
렌티바이러스 운반체와 활성화된 PBMCs 또는 T세포를 IL-2를 함유한 T세포 배양액 속에 넣고 배양장치에 넣어 PBMCs 또는 T세포의 바이러스 운반체 트랜스펙션을 진행한다. 48시간 배양 후 CAR 및 공통발현 분자의 발현 및 그 발현형을 검사한다. 그 다음 서로 다른 구조의 CAR-T세포는 IL-2(또는 IL2, IL-7, IL-15를 함유)등 사이토카인을 함유한 배양액 속에서 수확까지 계속 배양한다.
실시예6 B7-H3 CAR-T세포가 표적 세포 항원 자극에 대한 반응
100Gy 조사를 거친 표적 세포를 1:1의 효과 표적비에 따라 새로 제조한 B7-H3 CAR-T세포와 혼합하여 3일 자극한 후 트리판블루 염색 후 CAR-T세포에 대하여 계수한다. 그 후 재반복 자극 3차례 반응하고 매 차례 반응은 5-7일이며 과정 중 외인 사이토카인을 추가하지 않고 반량 환액만 한다. 매 차례 반응 후 CAR-T세포의 총량을 계수한다.
결과는 도5를 참조하고 데이터는 서로 다른 구조의 B7-H3 CAR-T세포는 B7-H3 항원 자극을 받은 후 모두 유효 증식하는 동시에 PDCA7R를 공통 발현하는 B7-H3 CAR-T세포(BB-Z-PDCA7R CAR-T세포)는 비교적 양호한 증식 능력을 가진다.
실시예7 B7-H3 CAR-T세포가 표적 종양세포에 대한 면역 반응
서로 다른 구조의 B7-H3 CAR-T세포를 100Gy조사를 거치거나 방사를 거치지 않은 표적 종양세포와 함께 부화 후 CBA시약 키트를 응용하여 유세포 기술을 통하여 각종 사이토카인의 분비를 검사한다. B7-H3 양성의 표적 종양세포는 B7-H3 양성의 혈액성과 실체성 악성 종양을 포함하고 예를 들면 (이에 한하지 않는다.) 유방암 HLB100세포, 폐거세포암 PG세포, 난소암 SKOV3세포, 유방암 MDA-MV-231세포이다. B7-H3 유전자가 제거한 후의 종양세포(예를 들면 MDA-MB-231-H3KO)를 음성 표적 세포로 하여 대조한다.
결과는 도6에 표시한 바와 같이 B7-H3 CAR-T세포는 B7-H3 양성인 표적 종양세포 공동 배양 자극을 거친 후 인터페론(IFN-γ), 인터류킨2(IL-2) 등 Th1형 사이토카인을 대량으로 방출할 수 있다. BB-Z-PDCA7R CAR-T세포는 최고의 사이토카인 생성을 유발하는 능력을 가지고 B7-H3 CAR-T세포가 B7-H3항원에 대한 특이성을 제시하며 BB-Z-PDCA7R CAR-T세포는 더 높은 활성화 기능을 가진다.
실시예8 B7-H3 CAR-T세포가 종양세포에 대한 살상
서로 다른 구조의 CAR-T세포는 서로 다른 효과 표적비(1:1, 5:1, 10:1, 15:1)에 따라 각각 FarRed가 표시한 표적 종양세포(인간 폐거세포암 PG세포, 난소암 SKOV3세포, 유방암 MDA-MB-231세포) 와 12h 공동 부화 후 DAPI 또는 Annexin V 등 시약/시약 키트를 응용하여 염색하고 유세포 분석기를 통하여 CAR-T세포가 표적 종양세포에 대한 살상 기능을 검사한다.
결과는 도7을 참조하고 다양한 구조의 B7-H3 CAR-T세포는 모두 B7-H3 양성의 종양세포를 효과적으로 살상할 수 있고 그 살상 기능은 항원 특이성을 가진다는 것을 나타낸다.
실시예9 B7-H3 CAR-T세포가 동물 모형 체내 항종양의 역할
NCG 생쥐 피하에 B7-H3 양성인 종양세포(폐 거세포암 PG세포, 난소암 SKOV3세포)를 주사하여 종양 모형을 구축한다. 폐 종양 직경이 약 3-4mm일 경우 SKOV3 그룹 생쥐는 제12, 20, 29일에 5Х106 서로 다른 구조의 CAR-T세포를 정맥주사하고 PG그룹 생쥐는 각각 제5, 10, 15일에 5Х106 서로 다른 구조의 CAR-T세포를 정맥 주사한 후 종양 성장, 생쥐의 생존 시간을 검사한다.
결과는 도8을 참조하고 B7-H3 CAR-T세포는 피하 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 동시에 공통발현 분자의 CAR-T세포를 가지고 BB-Z-PD28 CAR-T와 BB-Z-PDCA7R CAR-T세포를 포함하여 더 좋은 치료 효과를 가진다.
실시예10 B7-H3 CAR-T세포가 PD-1 항체와 병용 요법은 항종양 역할을 향상.
NCG 생쥐 피하에 0.5Х106 폐거세포암 PG세포를 주사하고 피하 종양 모형을 구축한다. 모든 생쥐를 무작위로 그룹을 나눈다.(그룹마다 5마리) 4-5일 후 종양 직경이 약 4mm에 도달할 경우 각각 제5, 9, 15일에 B7-H3 CAR-T세포(상대적 저 사용량)를 정맥 단독 주사하고, 병용 요법 그룹에서 각각 제6, 11일에 항PD-1항체를 추가 주사한다. 매주 2회 캘리퍼스로 종양 크기를 측정한다.
결과는 도9를 참조하고 데이터에서 병용 요법은 통한 항PD-1항체는 B7-H3 CAR-T세포의 항종양 효과를 현저하게 향상시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시에11 인간화 항체 활성화 및 CAR-T세포 살상 능력 측정
(1) 인간화 항체 및 그 활성화 측정
획득한 쥐원 항B7-H3 항체의 가변영역 FR서열을 인간 FR서열과 대조하고 선별하여 FR영역 서열에 대하여 인간화 돌변을 진행한 후 각각 3가닥 경사슬(L1, L2, L3) 과 3가닥 중사슬(H1, H2, H3)의 인간화 서열을 획득하고 진일보하여 Biacore를 통하여 각 경사슬과 중사슬 조합으로 형성한 9개 단쇄 항체의 친화력 상수를 검사하고 결과는 표1을 참조한다.
표1
Figure pct00002
(2) 인간화 B7-H3 CAR-T세포 살상 능력 측정
서로 다른 경사슬과 중사슬 가변영역에서 조합한 인간화 단쇄 항체를 각각 CAR-T세포 구축에 사용한다. 각 조합 CAR-T세포를 각각 B7-H3 양성인 결장암 LOVO세포와 8시간 공동 부화하고 그 살상 효과와 사이토카인 분비를 검사한다. PBMCs와 CD19 CAR-T세포를 음성으로 대조하고 B7-H3 유전자가 제거한 후의 B7-H3 음성인 LOVO세포(LOVO-KO, 자가 제조)를 표적 음성 종양세포의 대조로 하여 종양 표적 특이성을 검증하며 결과는 도10을 참조한다. 표시한 바와 같이 서로 다른 조합의 단쇄 항체에서 출처한 CAR-T세포는 모두 표적 세포에 대하여 서로 다른 살상 효과, 서로 다른 정도의 사이토카인 IL-2와 IFN-g의 분비를 가진다.
상기 결과에서 인간화 후 서로 다른 조합의 scFv는 서로 다른 친화력을 가지고 서로 다른 scFv의 친화력이 대응한 CAR-T세포의 살상과 면역 반응 기능과 관련된다는 것을 알 수 있다. 따라서 적합한 친화력을 가진 단쇄 항체를 선택하여 CAR-T세포 구축 및 그 치료 응용에 사용하면 CAR-T세포의 항종양 활성화 최적화하고 부반응을 낮추는 것에 도움이 된다.
실시예12 인간화 B7-H3 CAR-T세포가 서로 다른 종양에 대한 항종양 역할
(1) 체외 살상 기능 검사
인간화 B7-H3 CAR-T세포를 서로 다른 효과 표적비로 각각 표시한 표적 종양세포와(결장암 LOVO세포, 난소암 SKOV3세포, 위암 HGC27세포, 간암 MHCC7721세포) 4℃에서 12h 공동 부화 후 DAPI 또는 Annexin V 등 시약/시약 키트를 응용하여 염색하고 유세포 분석기를 통하여 CAR-T세포가 표적 종양세포에 대한 살상 기능 및 그 사이토카인 방출을 검사한다.
결과는 도11-1, 12-1, 13, 14를 참조하고 결과는 인간화의 B7-H3 CAR-T세포는 모두 B7-H3을 발현하는 종양세포를 효과적으로 살상할 수 있고 Il-2와 IFN-γ를 생성하며 그 살상 기능은 항원 특이성을 가진다.
(2) 동물 모형 체내 항종양 역할
루시페라아제가 표시한 결장암 LOVO세포를 NCG생쥐 복강(5Х104 Lovo 세포/마리)에 주입하고 결장암 복막 종양 모형을 구축한다. 종양 재배 4일 후 인간화 B7-H3 CAR-T세포를 사용하여 복강 주사 치료를 진행하여 치료조로 하고 동일 조건에서 CD19 CAR-T세포로 치료하여 대조군으로 한다. 매번 사용량은 1.0Х106세균/마리이고, 총 2회 치료한다. 각각 치료 전 1일, 치료 후 제21, 28, 35일에서 종양세포 플루오레세인 강도를 검사하고 종양의 성장을 검사 평가한다.
위와 같이 NCG생쥐 복강에 난소암 SKOV3세포를 주사하여 난소암 종양 모형을 구축하고 인간화 B7-H3 CAR-T세포로 동일 사용량 및 방법으로 복강주사 치료를 진행하며 치료 후 제0, 7, 14일에서 종양의 성장을 검사한다.
결과에 표시한 바와 같이 B7-H3 CAR-T세포 치료는 결장암, 난소암 복막종양의 성장을 효과적으로 억제하고 종양을 제거(도 11-2, 12-2 참조)하며 생쥐 생존기간을 연장한다. 그러나 대조군 CD19 CAR-T세포, PBS조의 종양은 뚜렷하게 성장하고 생존기간이 짧다.
실시예13 항B7-H3 모노클로널 항체의 항원 결정기(epitope) 특이성
유세포 기술을 응용하여 인간 B7-H3을 발현하는 293T세포를 표적 세포로 하여 본 특허 중의 항 B7-H3 모노클로널 항체의 단쇄 항체를 이미 있는 항B7-H3 모노클로널 항체의 단쇄 항체(예를 들면 MGA271, 84D[1]; 미국Microgenesis회사) 와 경쟁적 결합 검사를 진행한다.
도 15에 표시한 바와 같이 B7-H3+ 293T 표적 세포를 추출하여 각각 10ng, 1ug, 10ug 항B7-H3 모노클로널 항체(MGA271, 84D)의 단쇄 항체(84D-mlgG) 와 4℃에서 30분간 부화하고 100ng 비오틴(biotin)이 표시한 본 특허 중의 항B7-H3 항체의 단쇄 항체(H2L2-biotin)를 추가하여 1% 송아지혈청을 함유한 PBS를 사용하여 세정하고 PE가 표시한 항스트렙토마이신(anti-SA) 2차 항체를 추가하고 4℃에서 20분간 부화하며 세정 후 유세포 분석기로 분석한다. (도15A) 유사하게, B7-H3 단쇄 항체와 84D단쇄 항체 경쟁 실험을 진행한다. 293T세포는 4ug 항84D-mlgG 항체와 4℃에서 30min 부화하고 PE가 표시한 anti-mlgG 2차 항체를 추가하고 세정 후 각각 100ng, 2ug, 8ug 항B7-H3 단쇄 항체(H2L2-biotin)를 추가하여 1h부화하여 세정 후 유세포 검사를 진행한다. (도15B)
결과에 표명한 바와 같이 항B7-H3 단쇄 항체 H2L2는 84D단쇄 항체와 경쟁적 결합이 존재하지 않고 두 개 모노클로널 항체는 각각 B7-H3 분자의 서로 다른 결정기에 결합한다는 것을 설명한다.
참고 문헌
[1]. Loo D, et al. Development of an Fc-enhanced anti-B7-H3 monoclonal antibody　with　potent antitumor activity. Clan Cancer Res 2012 Jul 15;18(14):3834-45
본 발명에서 언급한 모든 문헌은 모두 본 출원 중 참조로 인용하였고 매 한편 문헌이 단독으로 인용되어 참조가 되는 것과 같다. 이 외에 이해하여야 할 것은 본 발명의 상기 강의 내용을 읽은 후 본 분야 당업자는 본 발명에 대하여 다양한 변경과 수정을 할 수 있고 이런 등가 형식은 마찬가지로 본 출원이 첨부한 청구범위가 한정하는 범위에 속한다.
<110> FUZHOU TCELLTECH BIOTECHNOLOGY CO., LTD. <120> ANTI-B7-H3 MONOCLONAL ANTIBODY AND USE THEREOF IN CELL THERAPY <130> PIPB214017CN <150> CN 201811125056.4 <151> 2018-09-26 <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 1 Gly Leu Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 2 Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr Gly 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 3 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 4 Ile Asn Phe Tyr Thr Gly Ala Thr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 5 Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 6 Ile Asp Pro Thr Ser Gly Asn Thr 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 7 Ala Ile Leu Gly Phe Ala Leu Asp Tyr 1 5 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23 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Leu Arg His His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the heavy chain variable region <400> 24 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Leu Arg His His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the light chain variable region <400> 25 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Phe Cys Ser Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg <210> 26 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the light chain variable region <400> 26 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Ser Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the light chain variable region <400> 27 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 28 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the light chain variable region <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 29 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the light chain variable region <400> 29 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 30 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the light chain variable region <400> 30 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the signal peptide sequence of L1 <400> 31 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 32 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the extracellular fragment of PD-1 <400> 32 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Glu Val Pro Thr Ala His 130 135 <210> 33 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TM1 <400> 33 Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro 20 25 30 Ile Leu Leu Thr Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val 35 40 45 Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 50 55 <210> 34 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C1 <400> 34 Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys 1 5 10 15 Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val 20 25 30 Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp 35 40 45 Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe 50 55 60 Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val 65 70 75 80 Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser 85 90 95 Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala 100 105 110 Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu 115 120 125 Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu 130 135 140 Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser 165 170 175 Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr 180 185 190 Gln Asn Gln 195 <210> 35 <211> 404 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P component <400> 35 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Glu Val Pro Thr Ala His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser 145 150 155 160 Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser 165 170 175 Ser Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Thr Cys Pro Thr Ile Ser Ile 180 185 190 Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu 195 200 205 Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His 210 215 220 Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn 225 230 235 240 Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val 245 250 255 Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr 260 265 270 Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp 275 280 285 Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu 290 295 300 Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser 305 310 315 320 Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg 325 330 335 Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser 340 345 350 Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser 355 360 365 Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr 370 375 380 Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe 385 390 395 400 Tyr Gln Asn Gln <210> 36 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the coding sequence of the P component <400> 36 ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 60 ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 120 gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 180 gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 240 cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 300 tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 360 gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccacggtgg aggcggttca 420 ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg cctgatcact attttaaagg cttctggagt 480 gaatggagtc caagttatta cttcagaact ccagagatca ataatagctc aggggagatg 540 gatcctatct tactaaccat cagcattttg agttttttct ctgtcgctct gttggtcatc 600 ttggcctgtg tgttatggaa aaaaaggatt aagcctatcg tatggcccag tctccccgat 660 cataagaaga ctctggaaca tctttgtaag aaaccaagaa aaaatttaaa tgtgagtttc 720 aatcctgaaa gtttcctgga ctgccagatt catagggtgg atgacattca agctagagat 780 gaagtggaag gttttctgca agatacgttt cctcagcaac tagaagaatc tgagaagcag 840 aggcttggag gggatgtgca gagccccaac tgcccatctg aggatgtagt catcactcca 900 gaaagctttg gaagagattc atccctcaca tgcctggctg ggaatgtcag tgcatgtgac 960 gcccctattc tctcctcttc caggtcccta gactgcaggg agagtggcaa gaatgggcct 1020 catgtgtacc aggacctcct gcttagcctt gggactacaa acagcacgct gccccctcca 1080 ttttctctcc aatctggaat cctgacattg aacccagttg ctcagggtca gcccattctt 1140 acttccctgg gatcaaatca agaagaagca tatgtcacca tgtccagctt ctaccaaaac 1200 cag 1203 <210> 37 <211> 934 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the amino acid sequence of CAR <400> 37 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Leu Arg His His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn 130 135 140 Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys 145 150 155 160 Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu 180 185 190 Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 245 250 255 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 260 265 270 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 275 280 285 Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu 290 295 300 Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys 305 310 315 320 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 325 330 335 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 340 345 350 Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 355 360 365 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 370 375 380 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 385 390 395 400 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 405 410 415 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 420 425 430 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 435 440 445 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 450 455 460 Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu 465 470 475 480 Leu Gly Leu Asp Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu 485 490 495 Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu 500 505 510 Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala 515 520 525 Arg Pro Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro 530 535 540 Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala 545 550 555 560 Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn 565 570 575 Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe 580 585 590 Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr 595 600 605 Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg 610 615 620 Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro 625 630 635 640 Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu 645 650 655 Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 660 665 670 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe 675 680 685 Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn 690 695 700 Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Thr Cys Pro Thr Ile 705 710 715 720 Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys 725 730 735 Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro 740 745 750 Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn 755 760 765 Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His 770 775 780 Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln 785 790 795 800 Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly 805 810 815 Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr 820 825 830 Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn 835 840 845 Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp 850 855 860 Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu 865 870 875 880 Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu 885 890 895 Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile 900 905 910 Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser 915 920 925 Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 930 <210> 38 <211> 2793 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the coding sequence of CAR <400> 38 gatgttgtga tgacgcagag tccactctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct tgaacttccg 300 ctcacgttcg gtcaggggac caagctggag atcaaaggtg gaggcggttc aggcggaggt 360 ggctctggcg gtggcggatc gcagatccag ttggtgcagt ctggatctga actgaagaag 420 cctggagcgt cagtcaaggt ctcctgcaag gtttctgggt ataccttcag aaactatgga 480 atgagctggg tgaggcaggc tccaggacag ggtttagagt ggatgggctg gataaacacc 540 tacactggag agccaacata tgctcaagac ttcaggggac ggtttgtctt ctctttggat 600 acctctgtca gcactgccta tttgcagatc agtagcctca aagctgagga cacggctgtc 660 tattactgtg caagatggtt acgacaccat gctatggact actggggtca aggaaccttg 720 gtcaccgtct cctcaaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 780 gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtcccggc cagcggcggg gggcgcagtg 840 cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 900 tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa 960 ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1020 ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgcg ggtgaagttc 1080 agccggagcg ccgacgcccc tgcctaccag cagggccaga accagctgta caacgagctg 1140 aacctgggcc ggagggagga gtacgacgtg ctggacaagc ggagaggccg ggaccctgag 1200 atgggcggca agccccggag aaagaaccct caggagggcc tgtataacga actgcagaaa 1260 gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg gcgagcggcg gaggggcaag 1320 ggccacgacg gcctgtacca gggcctgagc accgccacca aggataccta cgacgccctg 1380 cacatgcagg ccctgccccc cagaagagcc aagcggggta agcctatccc taaccctctc 1440 ctcggtctcg attctacgag cggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct 1500 ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg gccctgcccg tgaccgccct gctgctgccc 1560 ctggccctgc tgctgcacgc cgccaggccg ccaggatggt tcttagactc cccagacagg 1620 ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc 1680 accttcacct gcagcttctc caacacatcg gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg 1740 agccccagca accagacgga caagctggcc gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc 1800 caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg 1860 gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc tacctctgtg gggccatctc cctggccccc 1920 aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa 1980 gtgcccacag cccacggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg 2040 cctgatcact attttaaagg cttctggagt gaatggagtc caagttatta cttcagaact 2100 ccagagatca ataatagctc aggggagatg gatcctatct tactaaccat cagcattttg 2160 agttttttct ctgtcgctct gttggtcatc ttggcctgtg tgttatggaa aaaaaggatt 2220 aagcctatcg tatggcccag tctccccgat cataagaaga ctctggaaca tctttgtaag 2280 aaaccaagaa aaaatttaaa tgtgagtttc aatcctgaaa gtttcctgga ctgccagatt 2340 catagggtgg atgacattca agctagagat gaagtggaag gttttctgca agatacgttt 2400 cctcagcaac tagaagaatc tgagaagcag aggcttggag gggatgtgca gagccccaac 2460 tgcccatctg aggatgtagt catcactcca gaaagctttg gaagagattc atccctcaca 2520 tgcctggctg ggaatgtcag tgcatgtgac gcccctattc tctcctcttc caggtcccta 2580 gactgcaggg agagtggcaa gaatgggcct catgtgtacc aggacctcct gcttagcctt 2640 gggactacaa acagcacgct gccccctcca ttttctctcc aatctggaat cctgacattg 2700 aacccagttg ctcagggtca gcccattctt acttccctgg gatcaaatca agaagaagca 2760 tatgtcacca tgtccagctt ctaccaaaac cag 2793 <210> 39 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence of the promoter <400> 39 aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 60 cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120 aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180 gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240 acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg 300 ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac 360 tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct 420 cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca 480 actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc tgtgaccggc 540 gcctac 546

Claims (19)

  1. 중사슬 가변영역이 다음과 같은 세가지 상보적 결정영역CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체의 중사슬 가변영역:
    SEQ ID NO: 1, 2 또는 3에 표시한 CDR1,
    SEQ ID NO: 4, 5 또는 6에 표시한 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7, 8 또는 9에 표시한 CDR3이다.
  2. 중사슬이 제1항과 같이 상기 중사슬 가변영역을 가진 것을 특징으로 하는 항체의 중사슬.
  3. 경사슬 가변영역이 다음과 같은 세가지 상보적 결정영역 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체의 경사슬 가변영역:
    SEQ ID NO: 10, 11 또는 12에 표시한CDR1'，
    SEQ ID NO: 13, 14 또는 15에 표시한 CDR2', 및
    SEQ ID NO: 16, 17 또는 18에 표시한 CDR3'이다.
  4. 경사슬이 제3항과 같이 상기 경사슬 가변영역을 가진 것을 특징으로 하는 항체의 경사슬.
  5. 항체가
    (1) 제1항과 같이 상기 중사슬 가변영역 및/또는
    (2) 제3항과 같이 상기 경사슬 가변영역을 가진 것을 특징으로 하는 항체.
  6. 재조합 단백질이
    (i) 제1항과 같이 상기 중사슬 가변영역, 제2항과 같이 상기 중사슬, 제3항과 같이 상기 경사슬 가변영역, 제4항과 같이 상기 경사슬 또는 제5항과 같이 상기 항체; 및
    (ⅱ) 임의 선택한 발현 및/또는 정제를 돕는 태그 서열을 가진 것을 특징으로 하는 재조합단백질.
  7. CAR구성물의 항원 결합영역이 B7-H3의 scFv에 특이성 결합되고 상기 scFv는 제1항과 같이 중사슬 가변영역과 제3항과 같이 상기 경사슬 가변영역을 가진 것을 특징으로 하는 CAR구성물.
  8. 면역세포가
    (a) 제 7항과 같이 상기 외인성 CAR 구성물을 발현하는 제 1발현 카세트; 및
    (b) 임의 선택한 PD1-CD28 또는 PD1-IL7R을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 제2 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 공학화된 면역세포.
  9. 항체-약물 접합체가
    (a) 항체부분, 상기 항체 부분은 제1항과 같이 상기 중사슬 가변영역, 제2항과 같이 상기 중사슬, 제3항과 같이 상기 경사슬 가변영역, 제4항과 같이 상기 경사슬 또는 제5항과 같이 상기 항체 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택되고; 및
    (b) 상기 항체부분과 접합한 접합부분, 상기 접합부분은 검출가능표지물, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소 또는 그 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 함유하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  10. (i) 예방 및/또는 암 또는 종양 치료에 사용하는 약물 또는 제제의 제조; 및/또는 (ⅱ) 검사 시약 또는 시약 키트의 제조에 사용하는 것을 특징으로 하는 제1항의 상기 중사슬 가변영역, 제2항의 상기 중사슬, 제3항의 상기 경사슬 가변영역, 제4항의 상기 경사슬, 제5항의 상기 항체, 제6항의 상기 재조합 단백질, 제7항의 상기 CAR구성물, 제8항의 상기 면역세포 또는 제9항의 상기 항체-약물 접합체의 용도.
  11. 의약조성물이
    제1항의 상기 중사슬 가변영역, 제2항의 상기 중사슬, 제3항의 상기 경사슬 가변영역, 제4항의 상기 경사슬 또는 제5항의 상기 항체, 제6항의 상기 재조합 단백질, 제7항의 상기 CAR구성물, 제8항의 상기 면역세포 및/또는 제9항의 상기 항체 약물 접합체 및 약리학상 허용 가능한 운반체, 희석제 또는 부형약을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  12. 폴리뉴클레오티드 코딩을 다음과 같은 조의 폴리펩티드에서 선택하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드:
    (1) 제1항의 상기 중사슬 가변영역, 제2항의 상기 중사슬, 제3항의 상기 경사슬 가변영역, 제4항의 상기 경사슬 또는 제5항의 상기 항체;
    (2) 제6항에 있어서 재조합 단백질; 및
    (3) 제7항에 있어서 CAR구성물이다.
  13. 운반체가 제12항의 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 운반체.
  14. 숙주세포가 제13항의 상기 운반체를 함유하거나 게놈 중에 제12항의 상기 폴리뉴클레오티드를 통합하는 것을 특징으로 하는 유전 공학화된 숙주세포.
  15. 다음과 같은 절차,
    (A) 개조 대기 중인 면역세포를 제공하고; 및
    (B) 제1발현 카세트 및/또는 임의 선택한 제2발현 카세트를 상기 개조 대기 중인 면역세포로 도입하고 그 중 상기 제1발현 카세트는 제7항과 같이 상기 CAR구성물을 발현하며 상기 제2발현 카세트는 PD1-CD28또는 PD1-IL7R을 포함하는 융합 단백질을 발현하여 공학화된 면역세포를 획득하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 공학화된 면역세포를 제조하는 방법.
  16. 방법은
    (1) 체외에서 샘플을 제5항의 상기 항체와 접촉시키고; 및
    (2) 항원-항체 복합물 형성 여부를 검출하고, 그 중 복합물을 형성하면 샘플 중에 B7-H3 단백질이 존재함을 표시하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플 중 B7-H3 단백질을 체외 검출하는 방법.
  17. 검사판은 기판(지지판)과 테스트 스트립을 포함하고 상기 테스트 스트립은 제5항의 상기 항체 또는 제9항의 상기 항체 약물 접합체를 함유하는 것을 특징으로 하는 검사판.
  18. 시약 키트는
    (a) 제1용기 및 제1용기 내에 위치한 제1염기서열이고 상기 제1염기서열은 제7항의 상기 CAR구성물을 발현하는 제1발현 카세트를 함유하며; 및
    임의 선택한 (b) 제2용기 및 제2용기에 위치한 제2염기서열이고 상기 제2염기서열은 상기 융합 단백질을 발현하는 제2발현 카세트를 함유하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 제8항의 상기 공학화된 면역세포를 제조하는 시약키트.
  19. (1) 제1용기, 상기 제1용기 중 제5항의 상기 항체를 함유한다; 및/또는
    (2) 제2용기, 상기 제2용기 중 제5항의 상기 항체에 대한 이차 항체를 함유하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 시약키트.
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