RS61828B1 - Anti-b7-h3 antitela i antitelske konjugacije lekova - Google Patents

Anti-b7-h3 antitela i antitelske konjugacije lekova

Info

Publication number
RS61828B1
RS61828B1 RS20210139A RSP20210139A RS61828B1 RS 61828 B1 RS61828 B1 RS 61828B1 RS 20210139 A RS20210139 A RS 20210139A RS P20210139 A RSP20210139 A RS P20210139A RS 61828 B1 RS61828 B1 RS 61828B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
adc
antibodies
mixture
cancer
Prior art date
Application number
RS20210139A
Other languages
English (en)
Inventor
Lorenzo Benatuil
Milan Bruncko
Debra Chao
Kamel Izeradjene
Andrew S Judd
Andrew C Phillips
Andrew J Souers
Archana Thakur
Original Assignee
Abbvie Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbvie Inc filed Critical Abbvie Inc
Publication of RS61828B1 publication Critical patent/RS61828B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/498—Pyrazines or piperazines ortho- and peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinoxaline, phenazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6877—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the antibody being an immunoglobulin containing regions, domains or residues from different species
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
POZADINA PRONALASKA
[0001] Protein B7 homologije 3 (B7-H3) (takođe poznat kao CD276 i B7RP-2, i ovde nazvan kao „B7-H3“) je transmembranski glikoprotein tip I superfamilije imunoglobulina. Ljudski B7-H3 sadrži putativni signalni peptid, V slične i C slične Ig domene, transmembranski region i citoplazmatski region. Duplikacija eksona kod ljudi dovodi do ekspresije dve B7-H3 izoforme koje imaju ili jedan IgV-IgC sličan domen (2IgB7-H3 izoforma) ili IgV-IgCIgV-IgC sličan domen (4IgB7-H3 izoforma) koji sadrži nekoliko konzervisanih cisteinskih ostataka. Predominantna B7-H3 izoforma u ljudskim tkivima i ćelijskim linijama je 4IgB7-H3 izoforma (Steinberger et al., J. Immunol.172(4): 2352-9 (2004)).
[0002] Prijavljeno je da B7-H3 ima i kostimulativnu i koinhibitornu signalirajuću funkciju (videti, na primer, Chapoval et al., Nat. Immunol. 2: 269-74 (2001); Suh et al., Nat. Immunol. 4: 899-906 (2003); Prasad et al., J. Immunol. 173: 2500-6 (2004); i Wang et al., Eur. J. Immunol. 35: 428-38 (2005)). Na primer, in vitro istraživanja su pokazala B7-H3 kostimulativnu funkciju obzirom da je B7-H3 uspeo da poveća proliferaciju citotoksičnih T-limfocita (CTL) i poveća regulaciju proizvodnje interferona gama (IFN-γ) u prisustvu anti-CD3 antitela kako bi se imitirao receptorski signal T ćelije (Chapoval et al., 2001). Štaviše, in vivo istraživanja korišćenjem srčanih algografta kod miševa B7-H3 -/- su pokazala smanjenu proizvodnju ključnog citokina, hemokina i mRNK transkripata receptora hemokina (na primer, IL-2, IFN-γ, monocitni hemoatraktantni protein (MCP-1) i IFN-inducibilni protein (IP)-10) u poređenju sa kontrolom divljeg tipa (Wang et al., 2005). Suprotno tome, uočena je koinhibitorna funkcija B7-H3, na primer, kod miševa gde je B7-H3 protein inhibirao T-ćelijsku aktivaciju i efektorsku proizvodnju citokina (Suh et al., 2003). Iako za ljudski B7-H3 nisu identifikovani ligandi, otkriveno je da se murinski B7-H3 vezuje za pokretački receptor eksprimiran na mijeloidnim ćelijama (TREM-) kao transkript 2 (TLT-2), modulator adaptivnih ćelijskih odgovora urođenog imuniteta. Vezivanje murinskog B7-H3 za TLT-2 na CD8<+>T-ćelijama pojačava efektorske funkcije T-ćelije kao što je proliferacija, citotoksičnost i proizvodnja citokina (Hashiguchi et al., Proc. Nat’1. Acad. Sci. U.S.A.105(30): 10495-500 (2008)).
[0003] B7-H3 nije konstitutivno eksprimiran kod mnogih imunih ćelija (na primer, prirodne ćelije ubice (NK), T-ćelije, ćelije koje predstavljaju antigen (APC)), ipak, njegova ekspresija se može indukovati. Dalje, ekspresija B7-H3 nije ograničena na imune ćelije. B7-H3 transkripti su eksprimirani kod različitih ljudskih tkiva uključujući debelo crevo, srce, jetru, placentu, prostatu, tanko crevo, testise i matericu, kao i kod osteoblasta, fibroblasta, epitelnih ćelija i drugih ćelija nelimfoidnog soja, što potencijalno ukazuje na imunološke i neimunološke funkcije (Nygren et al. Front Biosci. 3:989-93 (2011)). Ipak, proteinska ekspresija kod normalnih tkiva se obično održava na niskom nivou i stoga, može biti predmet posttranskripcione regulacije.
[0004] B7-H3 je takođe eksprimiran kod mnoštva ljudskih karcinoma, uključujući karcinom prostate, bistroćelijski karcinom bubrežnih ćelija, gliom, melanom, karcinom pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), sitnoćelijski karcinom pluća, karcinom pankreasa, karcinom želuca, akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), nehodžkinov limfom (NHL), karcinom jajnika, kolorektalni karcinom, karcinom debelog creva, renalni karcinom, hepatocelularni karcinom, karcinom bubrega, karcinom glave i vrata, hipofaringealni karcinom skvamoznih ćelija, glioblastom, neuroblastom, karcinom dojke, karcinom endometrijuma i karcinom urotelijalnih ćelija. Iako je uloga B7-H3 u ćelijama karcinoma nejasna, njegova ekspresija može orkestrirati signalirajuće događaje koji mogu zaštititi ćelije karcinoma od urođenih i adaptivnih imunoloških odgovora. Na primer, B7-H3 je prekomerno izražen kod visokostepene intraepitelne neoplazije i adenokarcinoma prostate, a visoki ekspresioni nivoi B7-H3 kod ovih karcinomskih ćelija su povezani sa povećanim rizikom progresije karcinoma nakon hirurgije (Roth et al. Cancer Res. 67(16): 7893-900 (2007)). Dalje, tumorska ekspresija B7-H3 kod NSCLC je u obrnutoj korelaciji sa brojem limfocita koji infiltriraju tumor i u značajnoj korelaciji sa metastazama u limfnim čvorovima (Sun et al. Lung Cancer 53(2): 143-51 (2006)). Nivo cirkulišućeg rastvorljivog B7-H3 kod NSCLC pacijenata je takođe povezan sa višim stadijumom tumora, veličinom tumora, metastazom u limfnim čvorovima, i udaljenim metastazama (Yamato et al., Br. J. Cancer 101(10): 1709-16 (2009)).
[0005] B7-H3 takođe može imati važnu ulogu kod antitumorskih odgovora posredovanih T-ćelijom na način u zavisnosti od konteksta. Na primer, tumorska ćelijska ekspresija B7-H3 kod karcinoma želuca je u pozitivnoj korelaciji sa vremenom preživljavanja, dubinom infiltracije i tipom tkiva (Wu et al., World J. Gastroenterol. 12(3): 457-9 (2006)). Dalje, visoka ekspresija B7-H3 u ćelijama tumora pankreasa je bila povezana sa preživljavanjem pacijenta nakon hiruške resekcije i u značajnoj korelaciji sa brojem CD8<+>T-ćelija koje infiltriraju tumor (Loos et al., BMC Cancer 9:463 (2009).
[0006] Konjugati lekova sa antitelima (ADC) predstavljaju relativno novu klasu terapeutskih sredstava koja sadrže antitelo konjugovano za citotoksični lek preko hemijskoj povezivača. Terapeutski koncept ADC je da poveže vezujuće mogućnosti antitela sa lekom, pri čemu antitelo je korišćeno da isporuči lek u ćeliju tumora pomoću vezivanja za ciljni površinski antigen, uključujući ciljne površinske antigene koji su prekomerno izraženi u ćelijama tumora.
[0007] Ostaje potreba u praksi za anti B7-H3 antitelima i anti B7-H3 ADC koji se mogu koristiti u terapeutske svrhe u lečenju karcinoma.
[0008] US 2012/0294796 se odnosi na anti B7-H3 antitela i farmaceutske kompozicije koje sadrže isto. US 2012/0294796 naznačava da se ovde otkrivena anti B7-H3 antitela mogu konjugovati za ili povezati sa radioaktivnim molekulom, toksinom (kaliheamicin), hemoterapeutskim molekulom, lipozomima ili drugim vezikulama koje sadrže hemoterapeutske kompozicije. US 2012/0294796 međutim ne otkriva konjugovanje anti B7-H3 antitela sa Bcl-xL inhibitorima.
[0009] Deryk Loo et al "abstract 1201: Anti-B7-H3 antibody-drug conjugates as potential therapeutics for solid cancer" otkriva anti B7-H3 auristatin E ADC. Ipak, ne otkrivaju konjugovanje anti B7-H3 antitela sa Bcl-xL inhibitorima.
REZIME PRONALASKA
[0010] Predmetni pronalazak obezbeđuje konjugate leka antitela (ADC) koji se specifično vezuju za ljudski B7-H3. Predmetni pronalazak obezbeđuje nove ADC koje mogu selektivno isporučiti Bcl-xL inhibitore ciljnim ćelijama karcinoma, na primer, ćelijama koje eksprimiraju B7-H3.
[0011] Predmetni pronalazak pruža konjugat leka anti-hB7-H3 antitela (ADC) koji sadrži sledeću strukturu:
gde m je 2 a Ab je anti-hB7-H3 antitelo, pri čemu antitelo Ab sadrži
CDR3 domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 35, CDR2 domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 34 i CD1 domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 33; i CDR3 domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 39, CDR2 domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 38 i CDR1 domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 37.
[0012] U jednoj izvedbi, Ab je anti-hB7-H3 antitelo, pri čemu anti-hB7H3 antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 147, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 144. U jednoj izvedbi, Ab je anti-hB7-H3 antitelo, pri čemu anti-hB7-H3 antitelo obuhvata teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 168 a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 169.
[0013] U jednoj izvedbi, ADC je huAb13v1-AAA, pri čemu AAA je sinton otkriven u Tabeli B, i pri čemu konjugovani sinton je u otvorenoj formi.
[0014] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži efikasnu količinu ovde opisanog ADC i farmaceutski prihvatljivog nosača.
[0015] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metod za lečenje karcinoma, koji obuhvata primenu terapeutski efikasne količine ovde opisanog ADC nad subjektom koji ima takvu potrebu.
[0016] U jednoj izvedbi, karcinom je izabran iz grupe koja se sastoji od sitnoćelijskog karcinoma pluća, nesitnoćelijskog karcinoma pluća, karcinoma dojke, karcinoma jajnika, glioblastoma, karcinoma prostate, karcinoma pankreasa, karcinoma debelog creva, karcinoma želuca, melanoma, hepatocelularnog karcinoma, karcinoma glave i vrata, karcinoma bubrega, leukemije, na primer, akutna mijeloidna leukemija (AML), i limfoma, na primer, nehodžkinov limfom (NHL).
[0017] U jednoj izvedbi, karcinom je karcinom skvamozne ćelije. U jednoj izvedbi, karcinom skvamozne ćelije je skvamozni karcinom pluća ili skvamozni karcinom glave i vrata.
[0018] U jednoj izvedbi, karcinom je trostruki negativni karcinom dojke.
[0019] U jednoj izvedbi, karcinom je nesitnoćelijski karcinom.
[0020] U jednoj izvedbi, karcinom je karakterisan da ima aktivirajuću EGFR mutaciju. U jednoj izvedbi, aktivirajuća EGFR mutacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od delecione mutacije egzona 19, supstitucione mutacije u jednoj tački L858R u egzonu 21, tačke mutacije T790M, i njihovih kombinacija.
[0021] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metod za inhibiranje ili smanjenje rasta čvrstog tumora kod subjekta koji ima čvrst tumor, pomenuti metod obuhvata primenu efikasne količine ovde opisane ADC nad subjektom koji ima čvrst tumor, tako da je rast čvrstog tumora inhibiran ili smanjen.
[0022] U jednoj izvedbi, čvrst tumor je nesitnoćelijski karcinom pluća.
[0023] U jednoj izvedbi, ADC se primenjuje u kombinaciji sa dodatnim agensom ili dodatnom terapijom.
[0024] U jednoj izvedbi, dodatni agens je izabran iz grupe koja se sastoji od anti-PD1 antitela (na primer, pembrolizumab), anti-PD-Ll antitela (na primer, atezolizumab), anti-CTLA-4 antitela (na primer ipilimumab), MEK inhibitora (na primer trametinib), ERK inhibitora, BRAF inhibitora (na primer dabrafenib), osimertiniba, erlotiniba, gefitiniba, sorafeniba, CDK9 inhibitora (na primer dinaciclib), MCL-1 inhibitora, temozolomida, Bcl-2 inhibitora (na primer venetoklaks), Bcl-xL inhibitora, ibrutiniba, mTOR inhibitora (na primer everolimus), PI3K inhibitora (na primer, buparlisib), duvelisiba, idelalisiba, AKT inhibitora, HER2 inhibitora (na primer lapatinib), taksana (na primer docetaksel, paclitaksel, nab-paclitaksel), ADC koje sadrži auristatin, ADC koje sadrži PBD (na primer rovalpituzumab tesirin), ADC koje sadrži maitanzinoid (na primer TDM1), TRAIL agonista, proteazomnog inhibitora (na primer bortezomib) i nikotinamid fosforibosiltransferaza (NAMPT) inhibitora.
[0025] U jednoj izvedbi, anti-B7-H3 ADC pronalaska je primenjen u kombinaciji sa venetoklaksom nad ljudskim subjektom radi tretmana sitnoćelijskog karcinoma pluća (SCLC).
[0026] U jednoj izvedbi, dodatna terapija je radijacija.
[0027] U jednoj izvedbi, dodatni agens je hemoterapeutski agens.
U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu ADC prema zahtevu, postupak obuhvata:
tretiranje antitela u vodenom rastvoru sa efikasnom količinom disulfidnog redukcionog agensa na 30-40 °C tokom najmanje 15 minuta, a zatim hlađenje rastvora antitela do 20-27°C;
dodavanje redukovanom rastvoru antitela rastvora voda/dimetil sulfoksid koji sadrži sinton 2.166 (Tabela B); prilagođavanje pH rastvora na pH 7,5 do 8,5;
omogućavanje reakciji da se dešava 48 do 80 sati kako bi se formiralo ADC;
pri čemu masa je promenjena za 18 - 2 amu za svaku hidrolizu sukcinimida u sukcinamid kako je izmereno masenom spektrometrijom elektronskim raspršivanjem; i
gde je ADC opciono prečišćen hidrofobnom interakcionom hromatografijom.
[0028] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ADC pripreman postupkom kao što je opisano u prethodnom tekstu.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0029]
Slika 1 je grafička prezentacija epitopnog grupisanja murinskog anti-B7-H3 hibridom antitela kao što je utvrđeno testovima vezivanja u paru.
Slika 2 prikazuje antitelnu redukciju, modifikaciju sa derivatom maleimida kako bi se dobio tiosukcinimid intermedijer i naknadna hidroliza tiosukcinimid funkcionalne grupe
Slika 5 prikazuje MS karakterizaciju lakog lanca i teškog lanca huAb13v11) pre konjugacije, 2) nakon konjugacije sa derivatom maleimida kako bi se dobio tiosukcinimid intermedijer i 3) nakon hidrolize posredovane sa pH 8 tiosukcinimidnog prstena.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0030] Aspekti pronalaska se odnose na, anti-B7-H3 ADC, i njegove farmaceutske kompozicije. Metode korišćenja ovde opisanog ADC za detektovanje ljudskog B7-H3, za inhibiranje ljudske B7-H3 aktivnosti (in vitro ili in vivo), i za lečenje karcinoma su takođe obuhvaćene pronalaskom. U određenim izvedbama, pronalazak obezbeđuje anti-B7-H3 ADC kompozicije koje obuhvataju ADC, metode pravljenja ADC i različite metode korišćenja ADC.
[0031] Takođe se podrazumeva za iskusne stručnjake da ovde opisani različiti ADC i/ili ovde opisani ADC sintoni mogu biti u formi soli, i u određenim izvedbama, konkretno farmaceutski prihvatljivih soli. Jedinjenja predmetnog otkrića koja poseduju dovoljno kiselu, dovoljno baznu, ili obe funkcionalne grupe, mogu reagovati sa bilo kojim brojem neorganskih baza, neorganskih i organskih kiselina, da bi se formirala so. Alternativno, jedinjenja koja su inherentno naelektrisana, kao ona sa kvaternarnim azotom, mogu formirati so sa odgovarajućim kontrajonom, na primer, halidom kao što je bromid, hlorid ili fluorid.
[0032] Kiseline koje se često koriste za formiranje kiselinskih adicionih soli su neorganske kiseline kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, jodovodonična kiseilna, sumporna kiselina, fosforna kiselina i slične, i organske kiseline kao što su p-toluensulfonska kiselina, metansulfonska kiselina, oksalna kiselina, pbromofenilsulfonska kiselina, ugljena kiselina, sukcinatna kiselina, citrična kiselina itd. Bazne adicione soli uključuju one dobijene iz neorganskih baza, kao što su hidroksidi amonijuma i alkalnih ili zemnoalkalnih metala, karbonati, bikarbonati i slični.
[0033] U otkrivanju u nastavku, ukoliko su uključeni oba strukturna dijagrama i nomenklatura i ukoliko je nomenklatura u sukobu sa strukturnim dijagramom, strukturni dijagram kontroliše.
[0034] Skica detaljnog opisa pronalaska je data u nastavku:
I. Definicije
II. Anti-B7-H3 antitela
II.A. Anti-B7-H3 himerna antitela
II.B. Humanizovana anti-B7-H3 antitela
III. Konjugati Anti-B7-H3 leka antitela (ADC)
III.A. Anti-B7-H3 / Bcl-xL inhibitor ADC
III.A.1. Bcl-xL inhibitori
III.A.2. Bcl-xL povezivači
Deljivi povezivači
Nedeljivi povezivači
Grupe koje se koriste za prikačinjanje povezivača za anti-B7-H3 antitela
Razmatranja selekcije povezivača
III.A.3. Bcl-xL ADC sintoni
III.A.4. Metode sinteze Bcl-xL ADC
III.A.5. Opšte metode za sintetizovanje Bcl-xL inhibitora
III.A.6. Opšte metode za sintetizovanje sintona
III.A.7. Opšte metode za sintetizovanje anti-B7-H3 ADC
III.B. Anti-B7-H3 ADC: drugi primerni lekovi za konjugaciju
III.C. Anti-B7-H3 ADC: drugi primerni povezivači
IV. Prečišćavanje anti-B7-H3 ADC
V. Upotrebe anti-B7-H3 antitela i anti-B7-H3 ADC
VI. Farmaceutske kompozicije
I. Definicije
[0035] Kako bi pronalazak bio lakše shvaćen, prvo se definišu određeni pojmovi. Dodatno, treba naglasiti da kada god se iznosi vrednost ili opseg vrednosti parametra, podrazumeva se da vrednosti i opsezi koji su posredni iznesenim vrednostima su takođe deo ovog pronalaska.
[0036] Pojam „anti-B7-H3 antitelo“ se odnosi na antitelo koje se određeno vezuje za B7-H3. Antitelo „koje vezuje“ antigen od interesa, to jest, B7-H3, je ono koje može da veže taj antigen sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno u ciljanju ćelije koja eksprimira antigen. U poželjnoj izvedbi, antitelo se specifično vezuje za ljudski B7-H3 (hB7-H3). Primeri anti-B7-H3 antitela su otkriveni u primerima u nastavku. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, pojam „anti-B7-H3 antitelo“ se odnosi na antitelo koje se vezuje za divlji tip B7-H3 (na primer, 4IgB7-H3 izoforma od B7-H3) ili bilo koju varijantu B7-H3. Aminokiselinska sekvenca divljeg tipa ljudskog B7-H3 je data u nastavku kao sekvenca identifikacionog broja: 149, pri čemu signalni peptid (aminokiselinski ostaci 1-28) je podvučen.
Stoga, ADC vezuje ljudski B7-H3 kao što je definisano u sekvenci identifikacionog broja: 149. Ekstracelularni domen (ECD) ljudskog B7-H3 je dat u sekvenci identifikacionog broja: 152 (uključujući His oznaku). Kao takvo, u jednoj izvedbi pronalaska, antitelo ADC vezuje ECD ljudskog B7-H3 kao što je opisano u sekvenci identifikacionog broja: 152.
[0037] Pojam „specifično vezivanje“, kao što je ovde korišćeno, u odnosu na interakciju antitela ili ADC sa drugom hemijskom vrstom, znači da je interakcija zavisna od prisustva određene strukture (na primer, antigenski determinant ili epitop) na hemijskim vrstama; na primer, antitelo prepoznaje i vezuje se za određenu proteinsku strukturu pre nego za proteine generalno. Ukoliko je antitelo ili ADC specifično za epitop „A“, prisustvo molekula koji sadrži epitop A (ili slobodno, neoznačeno A), u reakciji koja sadrži označeno „A“ i antitelo, će redukovati količinu označenog A vezanog za antitelo ili ADC. Primera radi, antitelo se „specifično vezuje“ za cilj ukoliko antitelo, kada je označeno, može da se nadmeće dalje od svog cilja odgovarajućim neoznačenim antitelom. U jednoj izvedbi, antitelo se specifično vezuje za cilj, na primer, B7-H3, ukoliko antitelo ima KDza cilj od najmanje približno 10-<4>M, 10<-5>M, 10<-6>M, 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M ili manje (manje znači broj koji je manji od 10<-12>, na primer 10<-13>). U jednoj izvedbi, pojam „specifično vezivanje za B7-H3“ ili „specifično vezuje za B7-H3“, kao što je ovde korišćeno, se odnosi na antitelo ili ADC koje se vezuje za B7-H3 i ima konstantu disocijacije (KD) od 1,0 x 10<-7>M ili manju, kako je utvrđeno površinskom plazmonskom rezonancom. Podrazumeva se da, ipak, antitelo ili ADC može biti sposobno za specifično vezivanje za dva ili više antigena koja su povezana u sekvenci. Na primer, u jednoj izvedbi, antitelo se može specifično vezati i za ljudske i za neljudske (na primer, miš ili neljudski primat) ortologe B7-H3.
[0038] Pojam „antitelo“ se odnosi na imunoglobulinski molekul koji se specifično vezuje za antigen i sadrži teški (H) lanac(e) i laki (L) lanac(e). Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde je označeno kao HCVR ili VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac je sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde je označeno kao LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VH i VL regioni se mogu dodatno podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regionima koji određuju komplementarnost (CDR), isprekidane regionima koji su konzervativniji, nazvanim okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Antitelo može biti od bilo kog tipa (na primer, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY) i klase (na primer, IgG1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase.
[0039] Dok pojam „antitelo“ nije predviđen da obuhvati delove antitela koji vezuju antigen (definisano u nastavku), ima za cilj da, u određenim izvedbama, uključi manji broj aminokiselinskih delecija iz karboksi završetka teškog lanca(a). U jednoj izvedbi, antitelo obuhvata teški lanac koji ima 1-5 aminokiselinskih delecija karboksi završetka teškog lanca. U jednoj izvedbi, antitelo je monoklonsko antitelo koje je IgG, koje ima četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca, i dva laka (L) lanca koje se može vezati za hB7-H3. U jednoj izvedbi, antitelo je monoklonalno IgG antitelo koje obuhvata lambda ili kappa laki lanac.
[0040] Pojam „deo koji vezuje antigen“ ili „fragment koji vezuje antigen“ antitela (ili jednostavnije „deo antitela“ ili „fragment antitela“), kao što je ovde korišćeno, se odnosi na jedan ili više fragmenata antitela koji sadržavaju sposobnost da se specifično vežu za antigen (na primer, hB7-H3). Pokazalo se da funkciju antitela za vezivanje antigena mogu vršiti fragmenti antitela pune dužine. Takve izvedbe antitela mogu takođe biti bispecifičnih, dual specifičnih ili multispecifičnih formata; naročito vezivanje za dva ili više različitih antigena. Primeri vezivajućih fragmenata obuhvaćeni unutar pojma „deo za vezivanje antigena“ antitela uključuje (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab’)2fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana sa disulfidnim mostom u hinge regionu; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., PCT publication WO 90/05144 A1 ovde inkorporirana referencom), koji obuhvata jedan varijabilni domen; i (vi) izolovan region utvrđivanja komplementarnosti (CDR). Štaviše, iako se dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodiraju odvojenim genima, mogu se združiti, korišćenjem rekombinantnih metoda, sintetičkim povezivačem koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kom se regioni VL i VH uparuju kako bi formirali monovalentne molekule (poznato kao jednolančani Fv (scFv); videti, na primer, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takva jednolančana antitela takođe treba da budu obuhvaćena u okviru pojma antitelni „deo za vezivanje antigena“. U određenim izvedbama pronalaska, scFv molekuli mogu biti inkorporirani u fuzioni protein. Druge forme jednolančanih antitela, kao što su diatela, su takođe obuhvaćene. Diatela su bivalentna, bispecifična antitela kod kojih su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali korišćenjem povezivača koji je prekratak da bi omogućio uparivanje dva domena istog lanca, time prisiljavajući domene da se upare sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvarajući dva vezivajuća mesta antigena (videti, na primer, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Takvi delovi za vezivanje antigena su poznati u struci (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
[0041] IgG je klasa antitela koja obuhvata dva teška lanca i dva laka lanca raspoređena u Y oblik. IgG konstantni domen se odnosi na konstantni domen teškog ili lakog lanca. Primerni ljudski IgG konstantni domen teškog i lakog lanca aminokiselinskih sekvenci su poznati u praksi i predstavljeni u nastavku u Tabeli A.
Tabela A: Sekvence konstantnih domena teškog i lakog lanca ljudskog IgG
[0042] „Izolovano antitelo“, kao što je ovde korišćeno, se odnosi na antitelo koje je u osnovi bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (na primer, izolovano antitelo koje specifično vezuje B7-H3 je u osnovi bez antitela koja se specifično vezuju za antigene koji nisu B7-H3). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za B7-H3 može, ipak, imati unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima, kao što su B7-H3 molekuli iz drugih vrsta. Štaviše, izolovano antitelo može biti suštinski bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.
[0043] Pojam „humanizovano antitelo“ se odnosi na antitela koja obuhvataju sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca iz neljudskih vrsta (na primer, miš) ali kod kojih je bar deo VH i/ili VL sekvence izmenjen kako bi bio više sličniji „ljudskom“, to jest, sličniji varijabilnoj sekvenci ljudskih klica. Konkretno, pojam „humanizovano antitelo“ znači antitelo ili njegova varijanta, derivat, analog ili fragment koji se imunospecifično vezuje za antigen od interesa i koji obuhvata okvirni region (FR) koji u osnovi ima aminokiselinsku sekvencu ljudskog antitela i region za utvrđivanje komplementarnosti (CDR) koji u osnovi ima aminokiselinsku sekvencu neljudskog antitela. Kao što je ovde korišćeno, pojam „suštinski“ u kontekstu CDR se odnosi na CDR koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci neljudskog antitela CDR. Humanizovano antitelo obuhvata suštinski sva od najmanje jednog, a obično dva, varijabilna domena (Fab, Fab’, F(ab’)2, FabC, Fv) u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima od neljudskog imunoglobulina (tj. donorsko antitelo) a svi ili suštinski svi regioni okvira su oni iz sekvence konsenzusa ljudskog imunoglobulina. Poželjno, humanizovano antitelo takođe obuhvata najmanje deo regiona konstante imunoglobulina (Fc), obično od ljudskog imunogobulina. U nekim izvedbama, humanizovano antitelo sadrži oba, i laki lanac kao i najmanje varijabilni domen teškog lanca. Antitelo takođe može uključivati CH1, hinge, CH2, CH3 i CH4 regione teškog lanca. U nekim izvedbama, humanizovano antitelo sadrži samo humanizovan laki lanac. U drugim izvedbama, humanizovano antitelo sadrži samo humanizovan teški lanac. U određenim izvedbama, humanizovano antitelo sadrži samo humanizovan varijabilni domen lakog lanca i/ili humanizovan teški lanac.
[0044] Humanizovano antitelo može biti izabrano iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog izotopa, uključujući bez ograničavanja IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Humanizovano antitelo može obuhvatati sekvence više od jedne klase ili izotopa, i određeni domeni konstante mogu biti selektovani kako bi se optimizovale željene efektorske funkcije upotrebom tehnika dobro poznatih u struci.
[0045] Pojmovi „Kabat numerisanje“, „Kabat definicije“ i „Kabat označavanje“ se ovde koriste naizmenično. Ovi pojmovi, koji su prepoznati u struci, se odnose na sistem numerisanja aminokiselinskih ostataka koji su varijabilniji (to jest, hipervarijabilni) u odnosu na druge aminokiselinske ostatke u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca antitela, ili njegovog dela za vezivanje antigena (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci.190:382-391 and, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).Kod varijabilnog regiona teškog lanca, hipervarijabilni region varira od aminokiselinskih pozicija 31 do 35 za CDR1, aminokiselinskih pozicija 50 do 65 za CDR2 i aminokiselinskih pozicija 95 do 102 za CDR3. Za varijabilni region lakog lanca, hipervarijabilni region varira od aminokiselinskih pozicija 24 do 34 za CDR1, aminokiselinskih pozicija 50 do 56 za CDR2 i aminokiselinskih pozicija 89 do 97 za CDR3.
[0046] Kao što je ovde korišćeno, pojam „CDR“ se odnosi na region za utvrđivanje komplementarnosti unutar varijabilnih sekvenci antitela. Postoje tri CDR u svakom od varijabilnih regiona teškog lanca (HC) i lakog lanca (LC), koji su označeni CDR1, CDR2 i CDR3 (ili specifično HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 i LC CDR3), za svaki od varijabilnih regiona. Pojam „CDR skup“ kao što je ovde korišćeno se odnosi na grupu od tri CDR koja se pojavljuje u jednom varijabilnom regionu sposobnom za vezivanje antigena. Tačne granice ovih CDR su definisane u skladu sa različitim sistemima. Sistem opisan od strane Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) i (1991)) ne samo da obezbeđuje nedvosmislen sistem numerisanja ostataka primenjiv na bilo koji varijabilni region antitela, već takođe i obezbeđuje precizne granice ostataka koje definišu tri CDR. Ovi CDR se mogu nazvati Kabatovi CDR. Chothia i saradnici (Chothia &Lesk, J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987) i Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) su otkrili da određeni poddelovi unutar Kabatovih CDR usvajaju gotovo identične konformacije okosnice peptida, uprkos tome što imaju veliku raznolikost na nivou aminokiselinske sekvence. Ovi poddelovi su označeni kao L1, L2 i L3 ili HI, H2 i H3 gde „L“ i „H“ označavaju regione lakog i teškog lanca, respektivno. Ovi regioni se mogu nazvati i Chothia CDR, koji imaju granice koje se preklapaju sa Kabatovim CDR. Druge granice koje definišu CDR koji se preklapaju sa Kabatovim CDR su opisane od strane Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) and MacCallum (J. Mol. Biol. 262(5):732-45 (1996)). Ipak, druge definicije granica CDR možda neće striktno pratiti jedan od prethodno pomenutih sistema, ali će se ipak preklapati sa Kabatovim CDR, iako mogu biti skraćene ili produžene u svetlu predviđanja ili eksperimentalnih otkrića da određeni ostaci ili grupe ostataka ili čak celi CDR ne utiču značajno na vezivanje antigena. Ovde korišćene metode mogu koristiti CDR definisane u skladu sa bilo kojim od ovih sistema, iako poželjne izvedbe koriste CDR definisane od strane Kabata ili Chothia.
[0047] Kao što je ovde korišćeno, pojam „okvir“ ili „okvirna sekvenca“ se odnosi na preostale sekvence varijabilnog regiona umanjene za CDR. Iz razloga što se precizna definicija CDR sekvence može utvrditi različitim sistemima, značenje okvirne sekvence je predmet različitih interpretacija. Šest CDR (CDR-L1, CDRL2 i CDR-L3 lakog lanca i CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 teškog lanca) takođe dele okvirne regione na lakom lancu i teškom lancu na četiri podregiona (FR1, FR2, FR3 i FR4) na svakom lancu, u kom je CDR1 pozicioniran između FR1 i FR2, CDR2 između FR2 i FR3 a CDR3 između FR3 i FR4. Bez navođenja određenih podregiona kao FR1, FR2, FR3 ili FR4, okvirni region, kako kažu drugi, predstavlja spojene FR unutar varijabilnog regiona jednog imunoglobulinskog lanca nastalog prirodnim putem. Kao što je ovde korišćeno, FR predstavlja jedan od četiri podregiona, a FRs predstavlja dva ili više od četiri podregiona koji konstituišu okvirni region.
[0048] Okvir i CDR regioni humanizovanog antitela ne moraju tačno odgovarati parentalnim sekvencama, na primer, CDR donatorskog antitela ili konseznusni okvir mogu biti mutagenizovani supstitucijom, insercijom i/ili delecijom najmanje jednog aminokiselinskog ostatka tako da CDR ili okvirni ostatak na tom mestu ne odgovaraju ni donorskom antitelu ni konsenzusnom okviru. U poželjnoj izvedbi, takve mutacije, ipak, neće biti ekstenzivne. Obično će, bar 80%, poželjno bar 85%, poželjnije bar 90% i najpoželjnije bar 95% ostataka humanizovanog antitela odgovarati onima od parentalnih FR i CDR sekvenci. Kao što je ovde korišćeno, pojam „konsenzusni okvir“ se odnosi na okvirni region u konsenzusnoj imunoglobulinskoj sekvenci. Kao što je ovde korišćeno, pojam „konsenzusna imunoglobulinska sekvenca“ se odnosi na sekvencu formiranu od aminokiselina koje se najčešće javljaju (ili nukleotida) u familiji srodnih imunoglobulinskih sekvenci (Videti, na primer, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). U familiji imunoglobulina, svaku poziciju u konsenzusnoj sekvenci zauzima aminokiselina koja se najčešće javlja na toj poziciji u familiji. Ukoliko se dve aminokiseline pojavljuju jednako učestalo, bilo koja može biti uključena u konsenzusnu sekvencu.
[0049] Pojam „humani akceptorski okvir“, kao što je ovde korišćeno, se odnosi na okvir antitela ili njegovog antitelnog fragmenta koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VH ili VL okvira dobijenu iz ljudskog antitela ili njegovog antitelnog fragmenta ili humani okvir konsenzusne sekvence u koji se CDR iz nehumanih vrsta mogu inkorporirati.
[0050] „Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u odnosu na peptidnu ili polipeptidnu sekvencu je definisan kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidatnoj sekvenci koji su identični aminokiselinskim ostacima u određenoj peptidnoj ili polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ukoliko je potrebno, kako bi se postigao maksimalni procenat sekventne identičnosti, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo sekventne identičnosti. Poravnavanje u svrhu utvrđivanja procenta aminokiselinske sekventne identičnosti se može postići na različite načine koji su u okviru znanja u struci, na primer, upotrebom javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci mogu utvrditi odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući bilo koje algoritme koji su potrebni da bi se dostiglo maksimalno poravnanje u punoj dužini sekvenci koje se porede.
[0051] Pojam „multivalentno antitelo“ je ovde korišćen kako bi označio antitelo koje sadrži dva ili više mesta za vezivanje antigena. U određenim izvedbama, multivalentno antitelo može biti projektovano da ima tri ili više mesta za vezivanje antigena, i obično nije antitelo koje se javlja prirodnim putem.
[0052] Pojam „multispecifično antitelo“ se odnosi na antitelo sposobno za vezivanje dva ili više nepovezanih antigena. U jednoj izvedbi, multispecifilčno antitelo je bispecifično antitelo koje je sposobno za vezivanje do dva nepovezana antigena, na primer, bispecifično antitelo, ili njegov deo za vezivanje antigena, koje vezuje B7-H3 i CD3.
[0053] Pojam „aktivnost“ uključuje aktivnosti kao što je specifičnost/afinitet vezivanja antitela ili ADC za antigen, na primer, anti-hB7-H3 antitelo koje se vezuje za hB7-H3 antigen i/ili neutralisanje potencije antitela, na primer, antihB7-H3 antitelo čije vezivanje za hB7-H3 inhibira biološku aktivnost hB7-H3, na primer, inhibicija proliferacije B7-H3 koji eksprimira ćelijske linije, na primer, ljudske H146 ćelija karcinoma pluća, ljudske H1650 ćelije karcinoma pluća ili ljudske EBC1 ćelije karcinoma pluća.
[0054] Pojam „test ksenografta nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC)“, kao što se ovde koristi, se odnosi na in vivo test korišćen za utvrđivanje da li anti-B7-H3 antitelo ili ADC, može inhibirati rast tumora (na primer, dalji rast) i/ili smanjiti rast tumora kao rezultat transplantacije NSCLC ćelija u imunodeficijentnog miša. Test ksenografta NSCLC uključuje transplantaciju NSCLC ćelija u imunodeficijentnog miša tako da tumor naraste na željene dimenzije, na primer, 200-250 mm<3>, pri čemu se antitelo ili ADC daje mišu kako bi se utvrdilo da li antitelo ili ADC mogu inhibirati i/ili smanjiti rast tumora. U određenim izvedbama, aktivnost antitela ili ADC je utvrđena prema procentu inhibicije rasta tumora (%TGI) u odnosu na kontrolno antitelo, na primer, ljudsko IgG antitelo (ili njegova kolekcija) koje se ne vezuje posebno za ćelije tumora, na primer, je usmereno na antigen koji nije povezan sa karcinomom ili je dobijeno iz izvora koji je nekancerozan (na primer, normalan ljudski serum). U takvim izvedbama, antitelo (ili ADC) i kontrolno antitelo su dati mišu u istoj dozi, sa istom frekvencijom, i na isti način. U jednoj izvedbi, miš korišćen u NSCLC ksenograft testu je miš sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom (SCID) i/ili atimični CD-1 goli miš. Primeri NSCLC ćelija koje se mogu koristiti u NSCLC ksenograft testu uključuju, ali se ne ograničavaju na, H1299 ćelije (NCI-H1299 [H1299] (ATCC® CRL-5803)), H1975 ćelije (NCI-H1975 ćelije [H1975] (ATCC® CRL-5908™)) i EBC-1 ćelije.
[0055] Pojam „test ksenografta sitnoćelijskog karcinoma pluća (SCLC)“, kao što se ovde koristi, se odnosi na in vivo test korišćen kako bi se utvrdilo da li anti-B7-H3 antitelo ili ADC, može inhibirati rast tumora (na primer, dalji rast) i/ili smanjiti rast tumora kao rezultat transplantacije SCLC ćelija u imunodeficijentnog miša. SCLC test ksenografta uključuje transplantaciju SCLC ćelija u imunodeficijentnog miša tako da tumor naraste na željene dimenzije, na primer, 200-250 mm<3>, pri čemu antitelo ili ADC je dato mišu kako bi se utvrdilo da li antitelo ili ADC mogu inhibirati i/ili smanjiti rast tumora. U određenim izvedbama, aktivnost antitela ili ADC je utvrđena prema procentu inhibicije rasta tumora (%TGI) u odnosu na kontrolno antitelo, na primer, ljudsko IgG antitelo (ili njegova kolekcija) koje se ne vezuje specifično za ćelije tumora, na primer, je usmereno na antigen koji nije povezan sa karcinomom ili je dobijen iz izvora koji je nekancerozan (na primer, normalan ljudski serum). U takvim izvedbama, antitelo (ili ADC) i kontrolno antitelo su dati mišu u istoj dozi, sa istom frekvencijom i na isti način. U jednoj izvedbi, miš korišćen u NSCLC ksenograft testu je miš sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom (SCID) i/ili atimični CD-1 goli miš. Primeri SCLC ćelija koje se mogu koristiti u SCLC ksenograft testu uključuju, ali se ne ograničavaju na, H146 ćelije (NCI-H146 ćelije [H146] (ATCC® HTB-173™)) i H847 ćelije (NCI-H847 [H847] (ATCC® CRL-5846™)). Pojam „epitop“ se odnosi na region antigena koji je vezan antitelom ili ADC. U određenim izvedbama, epitopske determinante uključuju hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil, i, u određenim izvedbama, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. U određenim izvedbama, rečeno je da se antitelo specifično vezuje za antigen kada preferencijalno prepoznaje svoj ciljni antigen u kompleksnoj smeši proteina i/ili makromolekula.
[0056] Pojam „površinska plazmonska rezonanca“, kako se koristi ovde, se odnosi na optički fenomen koji omogućuje analizu biospecifičnih interakcija u stvarnom vremenu detekcijom alteracija u koncentracijama proteina unutar biosenzorne matrice, na primer korišćenjem BIAcore sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Za dodatne opise, pogledati Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277. U jednoj izvedbi, površinska plazmonska rezonanca je utvrđena u skladu sa metodama opisanim u Primeru 2.
[0057] Pojam „kon“ ili „ka“, kao što se ovde koristi, se odnosi na on rate konstantu stope asocijacije antitela sa antigenom kako bi se formirao antitelo/antigen kompleks.
[0058] Pojam „koff“ ili „kd“, kao što se koristi ovde, namenjen je da se odnosi na off rate konstantu disocijacije antitela iz antitelo/antigen kompleksa.
[0059] Pojam „KD“, kao što se koristi ovde, namenjen je da se odnosi na konstantu disocijacije ekvilibrijuma određene antitelo-antigen interakcije (na primer, huAb13 antitelo i B7-H3). KDse izračunava sa ka/ kd.
[0060] Pojam „kompetitivno vezivanje“, kao što se koristi ovde, se odnosi na situaciju u kojoj se prvo antitelo nadmeće sa drugim antitelom, za mesto vezivanja na trećem molekulu, na primer, antigenu. U jednoj izvedbi, kompetitivno vezivanje između dva antitela je utvrđeno korišćenjem FACS analize.
[0061] Pojam „test kompetitivnog vezivanja“ je test koji se koristi za utvrđivanje da li se dva ili više antitela vezuju za isti epitop. U jednoj izvedbi, test kompetitivnog vezivanja je test kompeticije fluorescentnog aktiviranog ćelijskog sortiranja (FACS) koji se koristi kako bi se utvrdilo da li se dva ili više antitela vezuju za isti epitop utvrđivanjem da li je fluorescentni signal označenog antitela redukovan usled uvođenja neoznačenog antitela, pri čemu će kompeticija za isti epitop smanjiti nivo fluorescencije.
[0062] Pojam „označeno antitelo“, kao što se ovde koristi, se odnosi na antitelo, ili njegov deo za vezivanje antigena, sa oznakom inkorporiranom koja obezbeđuje identifikaciju vezujućeg proteina, na primer, antitela. Poželjno, oznaka je detektabilni marker, na primer, inkorporacija radio-označene aminokiseline ili prikačinjanje za polipeptid biotinil funkcionalnih grupa što se može detektovati označenim avidinom (na primer, streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kolorimetrijskim metodama). Primeri oznaka za polipeptide uključuju, ali se ne ograničavaju na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (na primer,<3>H,<14>C,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I,<177>Lu,<166>Ho ili<153>Sm); fluorescentne oznake (na primer, FITC, rodamin, lantanidni fosfori), enzimatske oznake (na primer, peroksidaza rena, luciferaza, alkalna fosfataza); hemiluminescentni markeri; biotinil grupe; preutvrđeni polipeptidni epitopi prepoznati od sekundarnog reportera (na primer, par sekvenci leucinskog zipper, mesta vezivanja sekundarnih antitela, domeni vezivanja metala, oznake epitopa); i magnetski agensi, kao što su helati gadolinijuma.
[0063] Pojam „antitelo-lek-konjugat“ ili „ADC“ se odnosi na vezujući protein, kao njegov antitelni ili antigenski fragment, hemijski povezan sa jednim ili više hemijskih lekova (takođe se ovde nazivaju i agens(i), bojne glave, i korisni teret(i)) koji mogu opciono biti terapeutski ili citotoksični agensi. U predmetnom pronalasku ADC uključuje antitelo, lek (na primer, citotoksični lek), i povezivač koji omogućuje prikačinjanje ili konjugaciju leka za antitelo. ADC pronalaska ima 2 leka konjugovana za antitelo. U predmetnom pronalasku lek je inhibitor Bcl-xL.
[0064] Pojmovi „konjugat leka antitela anti-B7-H3“ ili „anti-B7-H3 ADC“, koji se ovde koriste naizmenično, se odnose na ADC koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za B7-H3, pri čemu antitelo je kojugovano za jedan ili više hemijskih agenasa. U jednoj izvedbi, anti-B7-H3 ADC obuhvata antitelo huAb13v1 konjugovano za inhibitor Bcl-xL. U predmetnom pronalasku anti-B7-H3 ADC se vezuje za ljudski B7-H3 (hB7-H3).
[0065] Pojam „inhibitor Bcl-xL“, kao što se ovde koristi, se odnosi na jedinjenje koje antagonizuje aktivnost Bcl-xL u ćeliji. U jednoj izvedbi, inhibitor Bcl-xL promoviše apoptozu ćelije inhibiranjem aktivnosti Bcl-xL.
[0066] Pojam „odnos leka i antitela“ ili „DAR“ se odnosi na broj lekova, na primer, inhibitor Bcl-xL, prikačenih za antitelo ADC. Broj lekova, na primer, inhibitora Bcl-xL, prikačenih za antitelo ADC predmetnog pronalaska je 2.
[0067] Pojam „test ksenografta“, kao što se ovde koristi, se odnosi na test ksenografta ljudskog tumora, pri čemu ćelije ljudskog tumora su transplantovane, ili pod kožom ili u organski tip iz kog je tumor potekao, u imunokompromitovane miševe koji ne odbijaju ljudske ćelije.
[0068] Pojam „karcinom“ se odnosi na ili opisuje fiziološko stanje kod sisara koje je obično karakterisano neregulisanim ćelijskim rastom. Primeri karcinoma uključuju, ali se ne ograničavaju na, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju ili limfoidne malignitete. Konkretniji primeri takvih karcinoma uključuju glioblastom, akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), nehodžkinov limfom (NHL), nesitnoćelijski karcinom pluća, karcinom pluća, karcinom debelog creva, kolorektalni karcinom, karcinom glave i vrata, karcinom dojke (na primer, trostruki negativni karcinom dojke), karcinom pankreasa, tumori skvamoznih ćelija, skvamoznoćelijski karcinom (na primer, skvamoznoćelijski karcinom pluća ili skvamoznoćelijski karcinom glave i vrata), analni karcinom, karcinom kože, karcinom vulve. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima tumor(e) koji prekomerno eksprimiraju B7-H3. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima čvrst tumor koji najverovatnije prekomerno izražava B7-H3. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima nesitnoćelijski skvamoznoćelijski karcinom pluća (NSCLC). U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima čvrste tumore, uključujući uznapredovale čvrste tumore. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima karcinom prostate. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima nesitnoćelijski karcinom pluća. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima glioblastom. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima karcinom debelog creva. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima karcinom glave i vrata. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima karcinom bubrega. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima bistroćelijski karcinom renalnih ćelija. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima gliom. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima melanom. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima karcinom pankreasa. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima karcinom želuca. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima karcinom jajnika. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima kolorektalni karcinom. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima karcinom bubrega. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima sitnoćelijski karcinom pluća. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima hepatocelularni karcinom. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima hipofaringealni skvamoznoćelijski karcinom. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima neuroblastom. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima karcinom dojke. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima endometrijski karcinom. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima urotelijalni karcinom. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima akutnu mijeloidnu leukemiju (AML). U jednoj izvedbi, ADC pronalaska su primenjeni nad pacijentom koji ima nehodžkinov limfom (NHL).
[0069] Pojam „B7-H3 koji eksprimira tumor“, kao što se ovde koristi, se odnosi na tumor koji eksprimira protein B7-H3. U jednoj izvedbi, ekspresija B7-H3 u tumoru je utvrđena korišćenjem imunohistohemijskog bojenja membrana tumorskih ćelija, pri čemu svako imunohistohemijsko bojenje iznad pozadinskog nivoa u uzorku tumora ukazuje na to da je tumor tumor koji eksprimira B7-H3. Metode za detektovanje ekspresije B7-H3 u tumoru su poznate u struci, i uključuju imunohistohemijske testove. Nasuprot tome, „B7-H3 negativni tumor“ je definisano kao tumor sa odsustvom B7-H3 membranskog bojenja iznad pozadine u uzorku tumora kako je utvrđeno imunohistohemijskim tehnikama.
[0070] Pojam „prekomerno eksprimirati“ ili „prekomerno eksprimirano“ se naizmenično odnosi na gen koji je transkribovan ili translatovan pri uočljivo višem nivou, obično u ćeliji karcinoma, u poređenju sa normalnom ćelijom. Prekomerna ekspresija se stoga odnosi i na prekomernu ekspresiju proteina i RNK (usled povećane transkripcije, posttranskripcione obrade, translacije, posttranslacione obrade, izmenjene stabilnosti i izmenjene proteinske degradacije), kao i na lokalnu prekomernu ekspresiju usled izmenjenih obrazaca prometa proteina (povećana nuklearna lokalizacija), i povećanu funkcionalnu aktivnost, na primer, kao u povećanoj enzimskoj hidrolizi supstrata. Stoga, prekomerna ekspresija se odnosi ili na protein ili na nivoe RNK. Prekomerna ekspresija može takođe biti za 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više u poređenju sa normalnom ćelijom ili ćelijom za poređenje. U određenim izvedbama, anti-B7-H3 ADC pronalaska su korišćeni za lečenje čvrstih tumora koji verovatno prekomerno eksprimiraju B7-H3.
[0071] Pojam „amplifikacija gena“, kao što se ovde koristi, se odnosi na ćelijski proces karakterisan proizvodnjom višestrukih kopija bilo kog određenog dela DNK. Na primer, ćelija tumora može amplifikovati, ili kopirati, hromozomske segmente kao rezultat ćelijskih signala i ponekad događaja u okruženju. Proces amplifikacije gena dovodi do proizvodnje dodatnih kopija gena. U jednoj izvedbi, gen je B7-H3, to jest, „amplifikacija B7-H3“. U jednoj izvedbi, ovde opisane kompozicije i metode se koriste za lečenje subjekta koji ima karcinom amplifikovan sa B7-H3.
[0072] Pojam „administriranje“ kao što se ovde koristi se odnosi na isporuku supstance (na primer, anti-B7-H3 antitela ili ADC) kako bi se postigao terapeutski cilj (na primer, tretman poremećaja povezanog sa B7-H3). Načini primene mogu biti parenteralni, enteralni ili topikalni. Parenteralna primena je obično injekcijom, i uključuje, bez ograničavanja, intravenoznu, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
[0073] Pojam „kombinaciona terapija“ ili „kombinacija“ u kontekstu terapeutskog metoda (na primer, metode lečenja), kao što se ovde koristi, se odnosi na primenu dve ili više terapeutskih supstanci, na primer, ADC i dodatni terapeutski agens. Dodatni terapeutski agens može biti primenjen istovremeno sa, pre ili nakon primene anti-B7-H3 ADC.
[0074] Kao što se ovde koristi, pojam „efikasna količina“ ili „terapeutski efikasna količina“ se odnosi na količinu leka, na primer, antitela ili ADC, koja je dovoljna za redukovanje ili ublažavanje težine i/ili trajanja poremećaja, na primer, karcinoma, ili jednog ili više njegovih simptoma, prevenciju napredovanja poremećaja, izaziva regresiju poremećaja, sprečava recidiv, razvoj, nastanak ili progresiju jednog ili više simptoma povezanih sa poremećajem, detektuje poremećaj, ili pojačava ili poboljšava profilaktičke ili terapijske efekte druge terapije (na primer, profilaktički ili terapeutski agens). Efikasna količina ADC može, na primer, inhibirati rast tumora (na primer, inhibira povećanje zapremine tumora), smanjiti rast tumora (na primer, smanjiti zapreminu tumora), redukovati broj ćelija karcinoma, i/ili ublažiti donekle jedan ili više simptoma povezanih sa karcinomom. Efikasna količina može, na primer, poboljšati preživljavanje bez bolesti (DFS), poboljšati sveukupno preživljavanje (OS) ili smanjiti verovatnoću recidiva.
[0075] Kao što se ovde koristi, pojam „stabilno“ se odnosi na jedinjenja koja poseduju dovoljnu stabilnost što omogućava proizvodnju i koja održavaju integritet jedinjenja tokom dovoljnog vremenskog perioda da bi bila korisna radi ovde detaljno opisanih svrha.
[0076] Kao što se ovde koristi, sledeći pojmovi treba da imaju sledeća značenja:
Pojam so kada se koristi u kontekstu „ili njegove soli“ uključuje soli koje se obično koriste za formiranje soli alkalnih metala i za formiranje adicionih soli slobodnih kiselina ili slobodnih baza. Generalno, ove soli se obično mogu pripremiti konvencionalnim načinima reagovanjem, na primer, odgovarajuće kiseline ili baze sa jedinjenjem pronalaska.
Tamo gde je so namenjena da se primeni nad pacijentom (za razliku od, na primer, upotrebe u in vitro kontekstu), so
1
je poželjno farmaceutski prihvatljiva i/ili fiziološki kompatibilna. Pojam „farmaceutski prihvatljiva“ se u ovoj patentnoj aplikaciji koristi pridevno da znači da je modifikovana imenica pogodna za upotrebu kao farmaceutski proizvod ili kao deo farmaceutskog proizvoda. Pojam „farmaceutski prihvatljiva so“ uključuje soli koje se obično koriste za formiranje soli alkalnih metala i za formiranje adicionih soli slobodnih kiselina ili slobodnih baza. Generalno, ove soli se obično mogu pripremiti konvencionalnim načinima reagovanjem, na primer, odgovarajuće kiseline ili baze sa jedinjenjem pronalaska.
II. Anti-B7-H3 antitela
[0077] Ovde opisana anti-B7-H3 antitela obezbeđuju ADC pronalaska sa mogućnošću da se vežu za B7-H3 tako da se citotoksični Bcl-xL lek prikačen za antitelo može isporučiti u ćeliju koja eksprimira B7-H3, naročito ćeliju karcinoma koja eksprimira B7-H3.
[0078] Iako se pojam „antitelo“ koristi u celosti, treba naglasiti da su fragmenti antitela (to jest, delovi anti-B7-H3 antitela koji vezuju antigen) takođe uključeni u pronalazak i mogu biti uključeni u izvedbe (metode i kompozicije) koje su opisane. Na primer, fragment anti-B7-H3 antitela može biti konjugovan za ovde opisane inhibitore Bcl-xL. Stoga, unutar opsega pronalaska je da su, u određenim izvedbama, antitelni fragmenti ovde opisanog anti-B7-H3 antitela konjugovani za inhibitore Bcl-xL preko povezivača. U određenim izvedbama, vezujući deo anti-B7-H3 antitela je Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, disulfidno povezan Fv, scFv, antitelo sa jednim domenom ili diatelo.
II.A. Himerna antitela anti-B7-H3
[0079] Himerno antitelo je molekul kod kog su različiti delovi antitela dobijeni od različitih životinjskih vrsta, kao što antitela imaju varijabilni region dobijen od murinskog monoklonalnog antitela i ljudski konstantni region imunoglobulina. Metode za proizvodnju himernih antitela su poznate u struci. Videti, na primer, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Pat. Nos. 5,807,715; 4,816,567; i 4,816,397. Dodatno, mogu se koristiti tehnike razvijene za proizvodnju „himernih antitela“ (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454,) spajanjem gena iz molekula antitela miša odgovarajuće antigenske specifičnosti zajedno sa genima iz molekula ljudskog antitela odgovarajuće biološke aktivnosti.
[0080] Kao što je opisano u Primeru 3, osamnaest murinskih anti-B7-H3 antitela je identifikovano da imaju visoku aktivnost specifičnog vezivanja za ljudski i cinomolgusni B7-H3. Himerna antitela, u kontekstu konstantnog regiona ljudskog imunoglobulina, su generisana iz ovih osamnaest antitela.
II.B. Humanizovana anti-B7-H3 antitela
[0081] Ovde otkrivena himerna antitela se mogu koristiti u proizvodnji humanizovanih anti-B7-H3 antitela. Na primer, nakon generisanja i karakterizacije himernih anti-B7-H3 antitela chAb1-chAb18, antitela chAb3, chAb13 i chAb18 su izabrana za humanizaciju. Specifično, šest različitih humanizovanih antitela je kreirano na osnovu chAb3, devet različitih humanizovanih antitela je kreirano na osnovu chAb13 (ovde se nazivaju huAb13v1, huAb13v2, huAb13v3, huAb13v4, huAb13v5, huAb13v6, huAb13v7, huAb13v8, huAb13v9) i deset različitih humanizovanih antitela je kreirano na osnovu chAb18. Tabele 18 i 19 pružaju aminokiselinske sekvence CDR, VH i VL regiona humanizovanog chAb13.
[0082] Generalno, humanizovana antitela su antitelni molekuli od antitela neljudskih vrsta koji vezuju željeni antigen koji ima jedan ili više regiona za utvrđivanje komplementarnosti (CDR) od neljudskih vrsta i okvirne regione iz ljudskog molekula imunoglobulina. Poznate ljudske Ig sekvence su otkrivene, na primer, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp .html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/ mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html. www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.unimarburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.unihd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci. missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Webpages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Takve uvezene sekvence se mogu koristiti za redukovanje imunogenosti ili redukovanje, pojačavanje ili modifikovanje vezivanja, afiniteta, on-rate, off-rate, avidnosti, specifičnosti, half-life ili bilo koje druge pogodne karakteristike, kao što je poznato u struci.
[0083] Ostaci okvira u ljudskim regionima okvira mogu biti supstituisani sa odgovarajućim ostatkom od CDR donorskog antitela kako bi se izmenilo, poželjno poboljšalo, antigensko vezivanje. Ove okvirne supstitucije su identifkovane metodama poznatim u struci, na primer, modeliranjem interakcija CDR i okvirnih ostataka kako bi se identifikovali okvirni ostaci važni za antigensko vezivanje i sekventno poređenje da bi se identifkovali neobični okvirni ostaci na određenim pozicijama. (Videti, na primer, Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)) Trodimenzionalni imunoglobulinski modeli su lako dostupni i poznati stručnjacima. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacione strukture izabranih kandidatnih sekvenci imunoglobulina. Inspekcija ovih prikaza dozvoljava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidatne sekvence imunoglobulina, to jest, analiza ostataka koji utiču na mogućnost kandidatnog imunoglobulina da vezuje svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu biti izabrani i spojeni od konsenzusnih i uvoznih sekvenci tako da je željena antitelna karakteristika, kao što je povećan afinitet za ciljne antigene, postignuta. Uopšteno, CDR ostaci su direktno i najznačajnije uključeni u uticaj na vezivanje antigena. Antitela se mogu humanizovati korišćenjem mnoštva tehnika poznatih u struci, kao što je, ali bez ograničavanja na one opisane u Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.
196:901 (1987), Caster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994); PCT publication WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, U.S. Pat. Nos. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567.
Humanizovana anti-B7-H3 antitela dobijena iz chab13
[0084] Devet različitih humanizovanih antitela stvorenih na osnovu chAb13 uključuju sledeće:
A) huAb13v1 (VH aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 147 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 33, 34 i 35, respektivno; i VL aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 144 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 37, 38 i 39, respektivno);
B) huAb13v2 (VH aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 146 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 33, 34 i 35, respektivno; i VL aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 143 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 37, 38 i 39, respektivno);
C) huAb13v3 (VH aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 146 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 33, 34 i 35, respektivno; i VL aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 144 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 37, 38 i 39, respektivno);
D) huAb13v4 (VH aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 146 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 33, 34 i 35, respektivno; i VL aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 145 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 37, 38 i 39, respektivno);
E) huAb13v5 (VH aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 147 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 33, 34 i 35, respektivno; i VL aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 143 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 37, 38 i 39, respektivno);
F) huAb13v6 (VH aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 147 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 33, 34 i 35, respektivno; i VL aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 145 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 37, 38 i 39, respektivno);
G) huAb13v7 (VH aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 148 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 33, 34 i 35, respektivno; i VL aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 143 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 37, 38 i 39, respektivno);
H) huAb13v8 (VH aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 148 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 33, 34 i 35, respektivno; i VL aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 144 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 37, 38 i 39, respektivno);
I) huAb13v9 (VH aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 148 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 33, 34 i 35, respektivno; i VL aminokiselinska sekvenca navedena u sekvenci identifikacionog broja: 145 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence navedene u sekvencama identifikacionih brojeva: 37, 38 i 39, respektivno);
[0085] Stoga, jedan aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje antitela koja obuhvataju varijabilne i/ili CDR sekvence iz humanizovanog antitela dobijenog od chAb13. Predmetno otkriće obuhvata anti-B7-H3 antitela koja su dobijena od chAb13 i imaju poboljšane karakteristike, na primer, poboljšan afinitet vezivanja za izolovan B7-H3 protein i poboljšano vezivanje za ćelije koje eksprimiraju B7-H3, kao što je opisano u primerima u nastavku. Ova nova antitela se kolektivno nazivaju kao „Ab13 varijantna antitela“. Generalno, Ab13 varijantna antitela zadržavaju istu epitopsku specifičnost kao Ab13.
[0086] Konzervativne aminokiselinske supstitucije takođe mogu biti napravljene u porcijama osim, ili pored CDR. Na primer, konzervativne aminokiselinske modifikacije se mogu napraviti u okvirnom regionu ili u Fc regionu. Varijabilni region ili teški ili laki lanac mogu sadržati 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25 ili 1-50 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na ovde date sekvence anti-B7-H3 antitela. U određenim izvedbama, anti-B7-H3 antitelo sadrži kombinaciju konzervativnih i nekonzervativnih aminokiselinskih modifikacija.
[0087] Da bi se generisali i izabrali CDR koji imaju preferirano vezivanje B7-H3 i/ili neutrališuću aktivnost u odnosu na hB7-H3, mogu biti korišćene uobičajene metode poznate u struci za generisanje antitela, ili njegovih delova koji vezuju antigen, i procenjivanje vezivanja B7-H3 i/ili neutralizujućih karakteristika tih antitela, ili njihovih delova koji vezuju antigen, uključujući ali se ne ograničavajući na ona koja su ovde specifično opisana.
[0088] U određenim izvedbama, antitelo obuhvata konstantni region teškog lanca, kao što je IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD konstantni region. U određenim izvedbama, anti-B7-H3 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, obuhvata konstantni domen imunoglobulina teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od ljudskog IgG konstantnog domena, ljudskog IgM konstantnog domena, ljudskog IgE konstantnog domena i ljudskog IgA konstantnog domena. U sledećim izvedbama, antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, ima konstantni region teškog lanca IgG1, konstantni region teškog lanca IgG2, konstantni region IgG3 ili konstantni region teškog lanca IgG4. Poželjno, konstantni region teškog lanca je konstantni region teškog lanca IgG1 ili konstantni region teškog lanca IgG4. Dalje, antitelo može sadržati konstantni region lakog lanca, ili konstantni region lakog lanca kapa ili konstantni region lakog lanca lambda. Poželjno, antitelo obuhvata konstantni region lakog lanca kapa. Alternativno, deo antitela može biti, na primer, fragment Fab ili jednolančani Fv fragment.
[0089] U određenim izvedbama, vezujući deo anti-B7-H3 antitela je Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, disulfidno povezan Fv, scFv, antitelo sa jednim domenom, ili diatelo.
[0090] U određenim izvedbama, anti-B7-H3 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, je multispecifično antitelo, na primer bispecifično antitelo.
[0091] Zamenjivanje aminokiselinskih ostataka u Fc delu kako bi se izmenila antitelna efektorska funkcija je opisano (Winter, et al. US Patent Nos. 5,648,260 and 5,624,821). Fc deo antitela posreduje nekoliko važnih efektorskih funkcija, na primer, indukciju citokina, ADCC, fagocitozu, citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) i halflife/stopa klirensa antitela i antigen-antitelo kompleksa. U nekim slučajevima ove efektorske funckije su poželjne za terapeutska antitela ali u drugim slučajevima mogu biti nepotrebne ili čak štetne, u zavisnosti od terapeutskih ciljeva. Određeni ljudski IgG izotipovi, naročito IgG1 i IgG3, posreduju ADCC i CDC vezivanjem za FcγRs i komplementni C1q, respektivno. Neonatalni Fc receptori (FcRn) su kritične komponente utvrđivanja cirkulišućeg poluživota antitela. U sledećoj izvedbi najmanje jedan aminokiselinski ostatak je zamenjen u konstantnom regionu antitela, na primer Fc regionu antitela, tako da su efektorske funkcije antitela izmenjene.
[0092] Jedna izvedba pronalaska uključuje označeno anti-B7-H3 antitelo, ili njegov antitelni deo, pri čemu antitelo je derivatizovano ili povezano za jedan ili više funkcionalnih molekula (na primer, drugi peptid ili protein). Na primer, označeno antitelo može biti dobijeno funkcionalnim povezivanjem antitela ili dela antitela pronalaska (hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili drugačije) sa jednim ili više molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo (na primer, bispecifično antitelo ili diatelo), detektabilnim agensom, farmaceutskim agensom, proteinom ili peptidom koji mogu posredovati asocijaciju antitela ili njegovog dela sa drugim molekulom (kao što je region jezgra streptavidina ili oznaka polihistidina), i/ili citotoksični ili terapeutski agens izabran iz grupe koja se sastoji od mitotskog inhibitora, antitumorskog antibiotika, imunomodulišućeg agensa, vektora za gensku terapiju, alkilujući agens, antiangiogeni agens, antimetabolit, agens koji sadrži boron, hemoprotektivni agens, hormon, antihormonski agens, kortikosteroid, fotoaktivni terapeutski agens, oligonukleotid, radionuklidni agens, inhibitor topoizomeraze, inhibitor kinaze, radiosenzibilizator i njihova kombinacija.
[0093] Korisni detektabilni agensi sa kojima antitelo ili njegov deo, mogu biti derivatizovani uključuju fluorescentna jedinjenja. Primerni fluorescentni detektabilni agensi uključuju fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, 5-dimetilamin-1-naftalensulfonil hlorid, fikoeritrin i slične. Antitelo takođe može biti derivatizovano sa detektabilnim enzimima, kao što su alkalna fosfataza, peroksidaza rena, glukozna oksidaza i slični. Kada je antitelo derivatizovano sa detektabilnim enzimom, detektovano je dodavanjem dodatnih reagenasa koje enzim koristi kako bi proizveo detektabilni reakcioni proizvod. Na primer, kada je detektabilni agens peroksidaza rena prisutan dodavanje hidrogen peroksida i diaminobenzidina dovodi do obojenog reakcionog proizvoda, koji je detektabilan. Antitelo takođe može biti derivatizovano sa biotinom, i detektovano indirektnim merenjem vezivanja avidina ili streptavidina.
[0094] U jednoj izvedbi, antitelo pronalaska je konjugovano sa agensom za obradu slike. Primeri agenasa za obradu slike koji se mogu koristiti u ovde opisanim kompozicijama i metodama uključuju, ali se ne ograničavaju na, radiooznaku (na primer, indijum), enzim, fluoroscentnu oznaku, luminiscentnu oznaku, bioluminiscentnu oznaku, magnetsku oznaku i biotin.
[0095] U jednoj izvedbi, antitela ili ADC su povezana za radiooznaku, kao što je, ali bez ograničavanja na, inidijum (<111>In).<111>Inidijum se može koristiti da označi antitela i ovde opisane ADC za upotrebu u identifikovanju tumora pozivinih na B7-H3. U određenoj izvedbi, ovde opisana anti-B7-H3 antitela (ili ADC) su označena sa<111>I putem bifunkcionalnog helatora koji je bifunkcionalni helat cikloheksil dietilentriaminpentaacetatne kiseline (DTPA) (videti Patent SAD brojevi: 5,124,471; 5,434,287; i 5,286,850).
[0096] Druga izvedba pronalaska pruža glikozilirani vezujući protein pri čemu anti-B7-H3 antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen obuhvata jedan ili više ostataka ugljenih hidrata. Nascentna in vivo proizvodnja proteina može biti podvrgnuta daljoj obradi, poznatoj kao posttranslaciona modifikacija. Konkretno, ostaci šećera (glikozil) se mogu dodati enzimski, proces poznat kao glikozilacija. Dobijeni proteini koji nose kovalentno povezane bočne lance oligosaharida su poznati kao glikozilovani proteini ili glikoproteini. Antitela su glikoproteini sa jednim ili više ostataka ugljenih hidrata u Fc domenu, kao i varijabilni domen. Ostaci ugljenih hidrata u Fc domenu imaju važno dejstvo na efektorsku funkciju Fc domena, sa minimalnim efektom na vezivanje antigena ili poluživot antitela (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). Suprotno tome, glikozilacija varijabilnog domena može imati dejstvo na
1
antitelnu aktivnost vezivanja antigena. Glikozilacija u varijabilnom domenu može imati negativan uticaj na afinitet vezivanja antitela, najverovatnije usled steričke smetnje (Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361- 1367), ili dovesti do povećanog afiniteta za antigen (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717-2723).
[0097] Jedan aspekt pronalaska je usmeren na generisanje mutanata na mestu glikozilacije kod kojih je mutirano O ili N-povezujuće mesto glikozilacije vezujućeg proteina. Stručnjak može generisati takve mutante korišćenjem uobičajenih dobro poznatih tehnologija. Mutanti mesta glikozilacije koji zadržavaju biološku aktivnost, ali imaju povećanu ili smanjenu aktivnost vezivanja, su drugi predmet pronalaska.
[0098] U sledećoj izvedbi, glikozilacija anti-B7-H3 antitela ili dela za vezivanje antigena pronalaska je modifikovana. Na primer, može se napraviti aglikozilirano antitelo (to jest, antitelu nedostaje glikozilacija). Glikozilacija se može promeniti tako da, na primer, poveća afinitet antitela za antigen. Takve ugljenohidratne modifikacije se mogu postići, na primer, menjanjem jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvence antitela. Na primer, može se napraviti jedna ili više aminokiselinskih supstitucija što dovodi do eliminacije jednog ili više mesta glikozilacije varijabilnog regiona čime se eliminiše glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može povećati afinitet antitela za antigen. Takav pristup je detaljnije opisan u PCT Publikaciji WO2003016466A2, i patentima SAD pod brojevima: 5,714,350 i 6,350,861.
[0099] Dodatno ili alternativno, može se napraviti modifikovano anti-B7-H3 antitelo pronalaska da ima izmenjen tip glikozilacije, kao hipofukozilovano antitelo koje ima redukovane količine fukozil ostataka ili antitelo koje ima povećane podeljene GlcNAc strukture. Pokazalo se da tako izmenjeni glikozilacioni obrasci povećavaju ADCC sposobnost antitela. Takve ugljenohidratne modifikacije se mogu postići, na primer, ekspresijom antitela u ćeliji domaćina sa izmenjenom glikozilacionom mašinerijom. Ćelije sa izmenjenom glikozilacionom mašinerijom su opisane u struci i mogu se koristiti kao ćelije domaćina u kojima se eksprimiraju rekombinantna antitela pronalaska čime se proizvodi antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Videti, na primer, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem.
277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, kao i, European Patent No: EP 1,176,195; PCT Publications WO 03/035835; WO 99/5434280.
[0100] Proteinska glikozilacija zavisi od aminokiselinske sekvence proteina od interesa, kao i od ćelije domaćina u kojoj je protein eksprimiran. Različiti organizmi mogu proizvesti različite glikozilacione enzime (na primer, glikoziltransferaze i glikozidaze), i imati različite dostupne supstrate (nukleotidni šećeri). Usled takvih faktora, obrazac proteinske glikozilacije, i kompozicija glikozilnih ostataka, se može razlikovati u zavisnosti od sistema domaćina u kom je određeni protein eksprimiran. Glikozilni ostaci korisni u pronalasku mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na, glukozu, galaktozu, manozu, fukozu, n-acetilglukozamin i sijalinsku kiselinu. Poželjno glikozilirani vezujući protein obuhvata glikozilne ostatke tako da je glikozilacioni obrazac ljudski.
[0101] Različita proteinska glikozilacija može rezultirati različitim proteinskim karakteristikama. Na primer, efikasnost terapeutskog proteina proizvedenog u mikroorganizmu domaćina, kao što je kvasac, i glikozilirano korišćenje endogene putanje kvasca može biti redukovano u poređenju sa istom proteinski eksprimiranom u ćeliji sisara, kao što je CHO ćelijska linija. Takvi glikoproteini mogu takođe biti imunogeni kod ljudi i pokazivati redukovan poluživot in vivo nakon primene. Specifični receptori kod ljudi i drugih životinja mogu prepoznati specifične ostatke glikozila i promovisati rapidno prečišćavanje proteina iz krvotoka. Drugi štetna dejstva mogu uključiti promene u proteinskom savijanju, rastvorljivosti, osetljivosti na proteaze, trafikingu, transportu, kompartmentalizaciji, sekreciji, rekogniciji od strane drugih proteina i ili faktora, antigenosti ili alergenosti. Shodno tome, praktikant može preferirati terapeutski protein sa specifičnom kompozicijom i obrascom glikozilacije, na primer glikozilaciona kompozicija i uzorak identični, ili barem slični, onima proizvedenim u ljudskim ćelijama ili u ćelijama specifičnim za vrste predviđene predmetne životnje.
[0102] Eksprimiranje glikoziliranih proteina različito od onog od ćelije domaćina se može postići genetskom modifikacijom ćelije domaćina kako bi eksprimirala heterologne glikozilacione enzime. Korišćenjem rekombinantnih tehnika, praktikant može generisati antitela ili njihove delove koji vezuju antigen koja eksprimiraju ljudsku proteinsku gklikozilaciju. Na primer, sojevi kvasca su genetski modifikovani kako bi eksprimirali glikozilacione enzime koji ne nastaju prirodnim putem tako da glikozilirani proteini (glikoproteini) proizvedeni u ovim sojevima kvasca ispoljavaju proteinsku glikozilaciju identičnu onoj iz životinjskih ćelija, naročito ljudskih ćelija (Patentna publikacija SAD broj 20040018590 i 20020137134 i PCT publikacija WO2005100584 A2).
[0103] Antitela se mogu proizvesti bilo kojom od brojnih tehnika. Na primer, ekspresijom iz ćelija domaćina, pri čemu ekspresioni vektor(i) koji kodira teške i lake lance je(su) transfektovan u ćeliju domaćina uobičajenim tehnikama. Različite forme pojma „transfekcija“ imaju za cilj da obuhvate širok spektar tehnika obično korišćenih za introdukciju egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, na primer, elektroporacijom, precipitacijom kalcijumfosfata, DEAE-dekstran transfekcijom i slično. Iako je moguće eksprimirati antitela u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina, poželjna je ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, a najpoželjnija je u ćelijama domaćina sisara, jer će takve eukariotske ćelije (a konkretno ćelije sisara) verovatnije u odnosu na prokariotske ćelije da sastave i izluče pravilno presavijeno i imunološki aktivno antitelo.
[0104] Preferirane ćelije domaćina sisara za eksprimiranje rekombinantnih antitela pronalaska uključuju ovarijum kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, korišćene sa DHFR selektabilnim markerom, na primer, kao što je opisano u R.J. Kaufman i P.A. Sharp (1982) Mol. Biol.159:601-621), NS0 ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvedu u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda dovoljnog da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćina ili, još poželjnije, sekreciju antitela u medijum kulture u kom se ćelije domaćina uzgajaju. Antitela se mogu povratiti iz medijuma kulture korišćenjem uobičajenih metoda proteinskog prečišćavanja.
[0105] Ćelije domaćina se takođe mogu koristiti za proizvodnju funkcionalnih antitelnih fragmenata, kao što su Fab fragmenti ili scFv molekuli. Podrazumevaće se da su varijacije na gore pomenutu proceduru unutar opsega pronalaska. Na primer, može biti poželjno transfektovati ćeliju domaćina sa DNK koja kodira funkcionalne fragmente ili lakog lanca i/ili teškog lanca antitela pronalaska. Rekombinantna DNK tehnologija se takođe može koristiti za uklanjanje neke, ili sve, DNK koja kodira neki ili oba lake i teške lance koji nisu neophodni za vezivanje za antigene od interesa. Molekuli eksprimirani iz takvih krnjih DNK molekula su takođe obuhvaćeni antitelima pronalaska. Dodatno, bifunkcionalna antitela se mogu proizvesti u kojima su jedan teški i jedan laki lanac antitelo pronalaska a drugi teški i laki lanac su specifični za antigen koji nije od antigena interesa, unakrsnim povezivanjem antitela pronalaska za drugo antitelo uobičajenim hemijskim metodama ukrštanja.
[0106] U preferiranom sistemu za rekombinantnu ekspresiju antitela, ili njegovog dela za vezivanje antigena, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira teški lanac antitela i laki lanac antitela je uveden u dhfr-CHO ćelije transfekcijom posredovanom kalcijum fosfatom. Unutar rekombinantnog ekspresionog vektora, geni teškog i lakog lanca antitela su svaki operativno povezani sa regulatornim elementima CMV pojačivača/AdMLP promotora da bi se postigli visoki nivoi transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gen, koji omogućava selekciju CHO ćelija koje su transfektovane sa vektorom upotrebom selekcije/amplifikacije metotreksata. Selektovane transformantne ćelije domaćina su kultivisane kako bi se omogućila ekspresija teških i lakih lanaca antitela i netaknuto antitelo je izvučeno iz medijuma kulture. Standardne tehnike molekularne biologije se koriste za pripremanje rekombinantnog ekspresionog vektora, transfektovanje ćelija domaćina, selektovanje transformanata, kultivisanje ćelija domaćina i izvlačenje antitela iz medijuma kulture. Dalje pronalazak obezbeđuje metod za sintetizovanje rekombinantnog antitela pronalaska kultivisanjem ćelije domaćina u pogodnom medijumu kulture dok se rekombinantno antitelo ne sintetiše. Rekombinantna antitela pronalaska se mogu proizvesti korišćenjem molekula nukleinske kiseline koji odgovaraju ovde otkrivenim aminokiselinskim sekvencama. Metod može dalje obuhvatati izolovanje rekombinantnog antitela iz medijuma za kulturu.
[0107] N i C krajevi polipeptidnih lanaca antitela predmetnog pronalaska se mogu razlikovati od očekivane sekvence usled uobičajeno uočenih posttranslacionih modifikacija. Na primer, C-terminalni lizinski ostaci često nedostaju u teškim lancima antitela. Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132. N-terminalni glutaminski ostaci, i u manjoj meri ostaci glutamata, su često konvertovani u piroglutamatne ostatke na lakim i teškim lancima terapeutskih antitela. Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011) JBC 28611211; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem.
286:11211.
III. Konjugati leka anti-B7-H3 antitela (ADC)
[0108] Ovde opisana anti-B7-H3 antitela se mogu konjugovati za funkcionalnu grupu leka kako bi se formirao konjugat leka anti-B7-H3 antitela (ADC). Konjugati leka antitela (ADC) mogu povećati terapeutsku efikasnost antitela u lečenju bolesti, na primer, karcinoma, usled mogućnosti ADC da selektivno isporuči jednu ili više funkcionalnih grupa leka ciljnim tkivima, kao što je antigen povezan sa tumorom, na primer, tumori koji eksprimiraju B7-H3. Stoga, pronalazak pruža anti-B7-H3 ADC za terapeutsku upotrebu, na primer, lečenje karcinoma.
[0109] Anti-B7-H3 ADC pronalaska obuhvataju anti-B7-H3 antitelo, to jest, antitelo koje se specifično vezuje za B7-H3, prikačeno za 2 funkcionalne grupe leka. Specifičnost ADC je definisana specifičnosti antitela, to jest, anti-B7-H3.
[0110] Pojmovi „lek“, „agens“ i „funkcionalna grupa leka“ se naizmenično koriste ovde. Pojmovi „povezan“ i „konjugovan“ se takođe ovde koriste naizmenično i ukazuju na to da su antitelo i funkcionalna grupa kovalentno povezani.
[0111] U predmetnom pronalasku ADC patentnih zahteva ima sledeću opštu formulu (formula I):
pri čemu Ab je antitelo, (L) je povezivač, (D) je lek a LK predstavlja kovalentni spoj koji povezuje povezivača L sa antitelom Ab; a m je 2. DAR od ADC je ekvivalentno „m“ navedenom u Formuli I.
[0112] U predmetnom pronalasku, ADC je:
1
pri čemu m je 2 a Ab je anti-B7-H3 antitelo, gde antitelo Ab obuhvata
teški lanac CDR3 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 35, teški lanac CDR2 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvencionom identifkacionom broju: 34 i teški lanac CDR1 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 33; i laki lanac CDR3 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 39, laki lanac CDR2 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 38 i laki lanac CDR1 domena koji sadrži aminokiselisnku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 37.
III. A. Anti-B7-H3 ADC: Inhibitori Bcl-xL, povezivači, sintoni i metode stvaranja istih
[0113] Disregulisane apoptotičke putanje su takođe implicirane u patologiji karcinoma. Implikacija da je downregulated apoptoza (a konkretnije Bcl-2 familija proteina) umešana u nastanak kancerogenog maligniteta je obelodanila nov način ciljanja ove još uvek neuhvatljive bolesti. Istraživanja su pokazala da su, na primer, antiapoptotički proteini, Bcl 2 i Bcl-xL, prekomerno izraženi kod mnogih tipova ćelija karcinoma. Videti, Zhang, 2002, Nature Reviews/Drug Discovery 1:101; Kirkin et al., 2004, Biochimica Biophysica Acta 1644:229-249; and Amundson et al., 2000, Cancer Research 60:6101-6110. Posledica ove deregulacije je opstanak izmenjenih ćelija koje bi inače bile podvrgnute apoptozi u normalnim uslovima. Smatra se da je ponavljanje ovih defekata povezano sa neregulisanom proliferacijom polazna tačka evolucije karcinoma.
[0114] Otkriće se tiče anti-hB7-H3 ADC koji obuhvataju anti-hB7-H3 antitelo konjugovano sa lekom preko povezivača, pri čemu lek je inhibitor Bcl-xL kao što je definisano prema patentnom zahtevu 1.
III.A.1. Inhibitori Bcl-xL
[0115] Jedan aspekt trenutnog otkrića se tiče inhibitora Bcl-xL koji imaju nisku ćelijsku propusnost. Jedinjenja su generalno heterociklična u prirodi i uključuju jednu ili više solubilizujućih grupa koje daju jedinjenjima visoku rastvorljivost u vodi i nisku ćelijsku propusnost. Solubilizujuće grupe su generalno grupe koje su sposobne za vodonično vezivanje, formirajući dipol-dipol interakcije, i/ili koje uključuju polietilen glikol polimer koji sadrži od 1 do 30 jedinica, jedan ili više poliola, jednu ili više soli ili jednu ili više grupa koje su napunjene pri fiziološkom pH.
[0116] Inhibitori Bcl-xL se vezuju za i inhibiraju anti-apoptotičke Bcl-xL proteine, uključujući apoptozu. Sposobnost specifičnih inhibitora Bcl-xL da se vežu i inhibiraju aktivnost Bcl-xL se može potvrditi standardnim testovima vezivanja i aktivnosti, uključujući, na primer, testove vezivanja TR-FRET Bcl-xL opisane u Tao et al., 2014, ACS Med. Chem. Lett., 5:1088-1093. Specifičan test vezivanja TR-FRET Bcl-xL koji se može koristiti za potvrđivanje vezivanja Bcl-xL je dat u Primeru 4, u nastavku. Obično, inhibitori Bcl-xL korisni kao inhibitori per se i u ovde opisanim ADC će ispoljiti Kiu testu vezivanja Primera 5 manje od približno 1 nM, ali mogu ispoljiti značajno nižu Ki, na primer Kinižu od približno 1, 0,1 ili čak 0,01 nM.
[0117] Inhibitorna aktivnost Bcl-xL može takođe biti potvrđena kroz standardne testove citotoksičnosti na bazi ćelije, kao što su testovi FL5.12 ćelijski i Molt-4 citotoksičnosti opisani u Tao et al., 2014, ACS Med. Chem. Lett., 5:1088-1093. Specifični test Mol-4 ćelijske citotoksičnosti koji se može koristiti za potvrđivanje inhibitorne aktivnosti Bcl-xL specifičnih inhibitora Bcl-xL koji su sposobni da prožmu ćelijske membrane je dat u primerima 5 i 6, u nastavku. Obično, takvi ćelijsko propustljivi inhibitori Bcl-xL će ispoljiti EC50nižu od približno 500 nM u testu Mol-4 citotoksičnosti primera 5 i 6, ali može ispoljiti značajno niže EC50, na primer EC50manje od približno 250, 100, 50, 20, 10 ili čak 5 nM.
[0118] Zahvaljujući prisustvu solubilizujućih grupa, očekuje se da će mnogi ovde opisani inhibitori Bcl-xL ispoljiti nisku ili vrlo nisku ćelijsku propusnost, i stoga neće pružiti značajnu aktivnost u određenim ćelijskim testovima usled nemogućnosti jedinjenja da prođe ćelijsku membranu, uključujući test Molt-4 ćelijske toksičnosti primera 5 i 6. Inhibitorna aktivnost Bcl-xL jedinjenja koja ne prolaze slobodno ćelijske membrane može biti potvrđena u ćelijskim testovima sa permeabilizovanim ćelijama. Proces mitohondrijske permeabilizacije spoljašnje membrane (MOMP) je kontrolisan od strane Bcl-2 familije proteina. Specifično, MOMP je promovisan proapoptotskom Bcl-2 familijom proteina Bax i Bak koji se, nakon aktivacije oligomerizuju na spoljnoj mitohondrijskoj membrani i formiraju pore, što dovodi do oslobađanja citohroma c (cyt c). Oslobađanje cyt c aktivira formulaciju apoptozoma koji, zauzvrat, rezultira aktivacijom kaspaze i drugim događajima koji obavezuju ćeliju da se podvrgne programiranoj ćelijskoj smrti (videti, Goldstein et al., 2005, Cell Death and Differentiation 12:453-462). Oligomerizaciono delovanje Bax i Bak je antagonizovano anti-apoptotskim članovima Bcl-2 familije, uključujući Bcl-2 i Bcl-xL Inhibitori Bcl-xL, u ćelijama čiji opstanak zavisi od Bcl-xL, mogu izazvati aktivaciju Bax i/ili Bak, MOMP, oslobađanje cyt c i nizvodne događaje koji dovode apoptoze. Proces cyt c oslobađanja se može izmeriti preko western blot metode mitohondrijskih i citosolnih frakcija ćelija i koristiti kao proxy merenje apoptoze u ćelijama.
[0119] Kao načini detektovanja inhibitorne aktivnosti Bcl-xL i posledičnog oslobađanja cyt c za inhibitore Bcl-xL sa niskom ćelijskom propusnosti, ćelije mogu biti tretirane sa agensom koji izaziva selektivnu formaciju pora u plazmi, ali ne mitohondrijskoj membrani. Specifično, odnos holesterol/fosfolipid je mnogo viši u membrani plazme u odnosu na mitohondrijsku membranu. Kao rezultat, kratka inkubacija sa niskim koncentracijama deterdženta digitonina usmerenog na holesterol selektivno permeabilizuje plazmu membrane bez značajnog uticaja na mitohondrijsku membranu. Ovaj agens formira nerastvorljive komplekse sa holesterolom što dovodi do segregacije holesterola sa svojih normalnih fosfolipidnih mesta vezivanja. Ovo delovanje, zauzvrat, dovodi do formacije otvora približno 40-50 A širokih u lipidnom dvosloju. Nakon što je membrana plazme permeabilizovana, citosolne komponente koje mogu proći kroz otvore formirane digitoninom se mogu isprati, uključujući citohrom C koji je oslobođen iz mitohondrije u citosol u apoptotskim ćelijama (Campos, 2006, Cytometry A 69(6):515-523).
1
[0120] Obično, inhibitori Bcl-xL će dati EC50manje od približno 10 nM u Molt-4 ćelijski permeabilizovanom cyt c testu primera 5 i 6, iako jedinjenja mogu ispoljiti značajno niže EC50, na primer, niže od približno 5, 1 ili čak 0,5 nM. Kao što je demonstrirano u Primeru 6, inhibitori Bcl-xL koji imaju nisku ili veoma nisku ćelijsku permeabilnost koja ne ispoljava aktivnost u standardnom Molt-4 testu ćelijske toksičnosti sa nepermeabilizovanim ćelijama ispoljavaju potentnu funkcionalnu aktivnost, kako je izmereno oslobađanjem cyt c, u testovima ćelijske citotoksičnosti sa permeabilizovanim ćelijama. Pored oslobađanja citohroma c, mitohondrija koja je podvrgnuta apoptozi često gubi svoj transmembranski mitohondrijsko membranski potencijal (Bouchier-Hayes et al., 2008, Methods 44(3): 222-228). JC-1 je kationska karbocijaninska boja koja se akumulira u mitohondriji i fluorescira crveno kada je mitohondrija zdrava a gubi se kada je mitohondrijska membrana kompromitovana (procenat depolarizacije; Smiley et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3671-3675; Reers et al., 1991: Biochemistry, 30: 4480-4486). Ovaj gubitak signala se može detektovati u permeabilizovanim ćelijama upotrebom fluorimetra (ekscitacija 545 nm i emisija 590 nm) i stoga je u potpunosti kvantitativan, poboljšavajući reproduktivnost i propusnost. Obično, inhibitori Bcl-xL će dati EC50manje od približno 10 nM u Molt-4 testu ćelijske permeabilnosti JC-1 primera 5 i 6, iako jedinjenja mogu ispoljiti značajno niže EC50, na primer, manje od približno 5, 1, 0,5 ili čak 0,05 nM. Kao što je demonstrirano u Primeru 6, inhibitori BclxL koji imaju nisku ili veoma nisku permeabilnost koji ne ispoljavaju aktivnost u standardnom Molt-4 testu ćelijske toksičnosti sa nepermeabilizovanim ćelijama ispoljavaju potentnu funkcionalnu aktivnost, kako je izmereno njihovim gubitkom transmembranskog mitohondrijskog membranskog potencijala u JC-1 testu, u testovima ćelijske citotoksičnosti sa permeabilizovanim ćelijama. Niska permeabilnost inhibitora Bcl-xL takođe ispoljava potentnu aktivnost kada se administrira nad ćelijama u formi ADC.
[0121] Iako mnogi inhibitori Bcl-xL predmetnog otkrića selektivno ili specifično inhibiraju Bcl-xL u odnosu na druge anti-apoptotske proteine familije Bcl-2, selektivna i/ili specifična inhibicija Bcl-xL nije neophodna. Inhibitori Bcl-xL i ADC koji obuhvataju jedinjenja mogu takođe, pored inhibiranja Bcl-xL, inhibirati jedan ili više drugih anti-apoptotskih proteina Bcl-2 familije, kao što je, na primer, Bcl-2. U nekim izvedbama, inhibitori Bcl-xL i/ili ADC su selektivni i/ili specifični za Bcl-xL. Pod specifičnim ili selektivnim se podrazumeva da određeni inhibitor Bcl-xL i/ili ADC vezuje ili inihibira Bcl-xL u većem obimu u odnosu na Bcl-2 pod identičnim uslovima testa. U specifičnim izvedbama, inhibitori Bcl-xL i/ili ADC ispoljavaju u opsegu od približno 10 puta, 100 puta ili čak veću specifičnost ili selektivnost za Bcl-xL u odnosu na Bcl-2 u testovima vezivanja.
III.A.2. Povezivači Bcl-xL
[0122] U ovde opisanim ADC, inhibitori Bcl-xL su povezani sa antitelom putem povezivača.
[0123] Iskusni stručnjaci će shvatiti, povezivači povezuju inhibitore Bcl-xL sa antitelom formiranjem kovalentne veze sa inhibitorom Bcl-xL na jednoj lokaciji i kovalentne veze sa antitelom na drugoj. Kovalentne veze se formiraju reakcijom između funkcionalnih grupa na povezivaču i funkcionalnih grupa na inhibitorima i antitelu. Kao što se ovde koristi, pojam „povezivač“ ima za cilj da obuhvati (i) nekonjugovane forme povezivača koje uključuju funkcionalnu grupu sposobnu da kovalentno povezuje povezivača sa inhibitorom Bcl-xL i funkcionalnu grupu sposobnu da kovalentno povezuje povezivača sa antitelom; (ii) delimično kojugovane forme povezivača koje uključuju funkcionalnu grupu sposobnu za kovalentno povezivanje povezivača sa antitelom a da je kovalentno povezano sa inhibitorom Bcl-xL, ili vice versa; i (iii) potpune konjugovane forme povezivača koji je kovalentno povezan sa i sa inhibitorom Bcl-xL i sa antitelom.
III.A.3. Bcl-xL ADC sintoni
[0124] Sintoni konjugata leka antitela su sintetički intermedijeri korišćeni za formiranje ADC. Sintoni su generalno jedinjenja prema strukturnoj formuli (III):
(III) D-L-R<x>
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu D je inhibitor Bcl-xL kao što je prethodno opisano, L je povezivač kao što je prethodno opisano a R<x>je reaktivna grupa pogodna za povezivanje sintona sa antitelom.
[0125] Sintoni korišćeni u primerima predmetne aplikacije su navedeni u nastavku u Tabeli B. Sinton predmetnog pronalaska je Primer broj 2.166 (AAA).
1
[0126] U predmetnom pronalasku sinton je 2.166 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. Naziv jedinjenja sintona je dat u nastavku:
6-(8-(benzo[d]tiazol-2-ilkarbamoil)-3,4-dihidroizohinolin-2(1H)-il)-3-(1-((3-(2-((((2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-karboksi-3,4,5-trihidroksitetrahidro-2H-piran-2-il)etil)-4-((S)-2-((S)-2-(2-((3S,5S)-3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-2-okso-5-((2-sulfoetoksi)metil)pirolidin-1-il)acetamido)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil)oksi)karbonil)((S)-3,4-dihidroksibutil)amino)etoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)pikolinska kiselina;
[0127] U predmetnom pronalasku, ADC, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, je:
pri čemu m je 2, Ab je ili anti-hB7-H3 antitelo, pri čemu anti-hB7-H3 antitelo sadrži domen teškog lanca CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 35, domen teškog lanca CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 34 i domen teškog lanca CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 33; i domen lakog lanca CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 39, domen lakog lanca CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 38 i domen lakog lanca CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 37; ili anti-hB7-H3 antitelo, pri čemu anti-hB7H3 antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 147, a varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 144; ili anti hB7-H3 antitelo, pri čemu anti-hB7-H3 antitelo obuhvata teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 168, a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 169.
[0128] Inhibitori Bcl-xL, uključujući bojeve glave i sintone, i metode pravljenja istih, su opisani u US 2016/0339117 (AbbVie Inc.).
III.A.4. Metode sintenze Bcl-xL ADC
[0129] Ovde opisani Inhibitori Bcl-xL i sintoni se mogu sintetizovati korišćenjem standardnih, poznatih tehnika organske hemije. Specifične metode sintetizovanja primernih inhibitora Bcl-xL i sintona koji mogu biti korisni za vođenje su date u sekciji primera.
[0130] Primeri prethodno navedenih inhibitora Bcl-xL, povezivača, i njihovih sintona, kao i metode pravljenja istih, se mogu pronaći u Patentnoj publikaciji SAD broj US 2016/0339117.
[0131] Specifične metode za sintetizovanje ovde opisanih primernih ADC su date u sekciji primera.
III.A.7. Generalne metode za sintetizovanje anti-B7-H3 ADC
[0132] Predmetni pronalazak takođe otkriva postupak pripreme anti-B7-H3 ADC pronalaska koji obuhvata:
tretiranje antitela u vodenom rastvoru sa efikasnom količinom agensa za redukciju disulfida na 30-40 °C tokom najmanje 15 minuta a zatim hlađenje antitelnog rastvora na 20-27 °C;
dodavanje redukovanom antitelnom rastvoru rastvora voda/dimetil sulfoksid koji sadrži sinton 2.166 (Tabela B); prilagođavanje pH rastvora na pH od 7,5 do 8,5;
omogućavanje reakciji da traje 48 do 80 sati kako bi se formirao ADC;
pri čemu masa je pomerena za 18+-2 amu za svaku hidrolizu sukcinimida u sukcinamid kao što je izmereno masenom spektrometrijom elektronskog raspršivanja; i
pri čemu ADC je opciono prečišćen hromatografijom hidrofobne interakcije.
[0133] U određenim izvedbama, antitelo je huAb13v1.
[0134] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na anti-B7-H3 ADC pripremljeno gore opisanim postupkom.
[0135] U određenim izvedbama, anti-B7-H3 ADC otkriveno u predmetnoj aplikaciji je formirano kontaktovanjem antitela koje vezuje receptor ćelijske površine hB7-H3 ili antigena povezanog sa tumorom eksprimiranog na ćeliji tumora sa sintonom povezivačem leka pod uslovima u kojima se sinton povezivač leka konvalentno povezuje sa antitelom preko maleimidne funkcionalne grupe kao što je prikazano u formuli (Iif).
pri čemu D je lek inhibitor Bcl-xL a L<1>je deo povezivača koji nije nastao iz maleimida; i pri čemu sinton povezivač leka je primer 2.166 (Tabela B), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
IV.Prečišćavanje anti-B7-H3 ADC
[0136] Prečišćavanje ADC se može postići na takav način da su prikupljeni ADC koji imaju određene DAR. Na primer, HIC resin se može koristiti za razdvajanje ADC napunjenih visokim lekom od ADC koji imaju optimalan odnos lek i antitelo (DAR), na primer, DAR od 4 ili niže. Hidrofobni resin je dodat ADC smeši tako da neželjeni ADC, to jest, ADC sa većim lekom, vezuju resin i mogu se selektivno ukloniti iz smeše. Razdvajanje ADC se može postići kontaktovanjem ADC smeše (na primer, smeša koja sadrži vrste ADC napunjene lekom od 4 ili manje i vrste ADC opterećene lekom od 6 ili više) sa hidrofobnim resinom, pri čemu je količina resina dovoljna da se omogući vezivanje vrsta opterećenih lekom koje se uklanjaju iz ADC smeše. Resin i ADC smeša su pomešani zajedno, tako da se ADC vrste koje se uklanjaju (na primer, vrste opterećene lekom od 6 ili više) vezuju za resin i mogu se razdvojiti od drugih ADC vrsta u ADC smeši. Količina resina korišćenog u metodi je zasnovana na odnosu mase između vrsta koje se uklanjanju i resina, gde količina korišćenog resina ne omogućuje značajno vezivanje vrsta opterećenih lekom koje je poželjno. Stoga, mogu se koristiti metode za redukovanje prosečnog DAR na manje od 4. Dalje, ovde opisane metode prečišćavanja se mogu koristiti za izolaciju ADC koji imaju bilo kakav željeni opseg vrsta opterećenih lekom, na primer, vrste opterećene lekom od 4 ili manje, vrste opterećene lekom od 3 ili manje, vrste opterećene lekom od 2 ili manje, vrste opterećene lekom od 1 ili manje.
[0137] Određene vrste molekula se vezuju za površinu na osnovu hidrofobnih interakcija između vrsta i hidrofobnog resina. U jednoj izvedbi predmetnog otkrića, metod se odnosi na postupak prečišćavanja koji se oslanja na mešanje hidrofobne smole i smeše ADC, pri čemu količina smole dodate smeši utvrđuje koje vrste (na primer, ADC sa DAR od 6 ili više) će se vezati. Nakon proizvodnje i prečišćavanja antitela iz ekspresionog sistema (na primer, ekspresioni sistem sisara), antitelo je redukovano i kuplovano za lek preko konjugatne reakcije. Dobijena ADC smeša često sadrži ADC koji imaju opseg DAR, na primer, 1 do 8. ADC smeša može biti prečićena korišćenjem postupka, kao što je, ali bez ograničavanja na, serijski postupak, kao što je taj gde ADC koji imaju vrste opterećene lekom od 2 su izabrane i razdvojene od ADC koji imaju veće opterećenje leka.
[0138] Ovde opisan separacioni metod ADC se može sprovesti korišćenjem serijske metode prečišćavanja. Serijski proces prečišćavanja generalno obuhvata dodavanje ADC smeše hidrofobnoj smoli u sudu, mešanje, i kasnije razdvajanje smole od supernatanta. Na primer, u kontekstu serijskog prečišćavanja, hidrofobna smola se može pripremiti ili uravnotežiti na željeni ekvilibracioni pufer. Tako se može dobiti kaša hidrofobne smole. ADC smeša se zatim može kontaktovati sa talogom da bi adsorbovala specifične vrste ADC koje treba razdvojiti hidrofobnom smolom. Rastvor koji sadrži željene ADC koji se ne vezuju za materijal hidrofobne smole se zatim mogu razdvojiti iz taloga, na primer, filtracijom ili ostavljanjem taloga da se slegne i uklanjanjem supernatanta. Dobijen talog se može podvrgnuti jednom ili više koraka ispiranja. Kako bi eluirali povezani ADC, koncentracija soli se može smanjiti.
[0139] Alternativno, prečišćavanje se može sprovesti korišćenjem procesa cirkulacije, pri čemu smola je upakovana u kontejner i smeša ADC se prebacuje preko sloja hidrofobne smole sve dok se ne uklone specifične vrste koje treba ukloniti. Supernatant (koji sadrži željene ADC vrste) se zatim pumpa iz kontejnera i sloj smole se može podvrgnuti koracima ispiranja.
[0140] Alternativno, proces protoka se može koristiti za prečišćavanje smeše ADC kako bi se stiglo do kompozicije koja sadrži većinu ADC koji imaju određen željeni DAR. Tokom procesa protoka, smola je upakovana u kontejner, na primer, kolonu, a ADC smeša se prebacuje preko upakovane smole tako da željene ADC vrste suštinski ne vezuju za smolu i teku kroz smolu, a neželjene ADC vrste se vezuju za smolu. Proces protoka se može sprovesti u režimu jednog prolaska (gde su vrste ADC od interesa dobijene kao rezultat jednog prolaza kroz smolu kontejnera) ili u režimu višestrukog prolaska (gde su ADC vrste od interesa dobijene kao rezultat višestrukih prolaza kroz smolu kontejnera). Proces protoka se sprovodi tako da se težina odabrane smole vezuje za neželjnu ADC populaciju, a željeni ADC (na primer, DAR 2-4) teku nad smolom i prikupljaju se u protoku nakon jednog ili više prolaza.
[0141] Nakon procesa protoka, smola se može isprati sa jednim ili više sledećih ispiranja kako bi se dodatno oporavili ADC koji imaju željen DAR opseg (pronađeni u filtratu ispiranja). Na primer, mnoštvo pranja sa smanjenom provodljivošću se može koristiti za dodatno oporavljanje ADC koji imaju interesni DAR. Elucioni materijal dobijen iz ispiranja smole se može naknadno spajati sa filtratom dobijenim iz procesa protoka radi poboljšanog oporavka ADC koje imaju interesni DAR.
[0142] Prethodno pomenuta serija, cirkulacija, i metode prečišćavanja procesa protoka se baziraju na upotrebi hidrofobne smole kako bi se razdvojile visoko lekom opterećene od niže lekom opterećene ADC vrste. Hidrofobna smola obuhvata hidrofobne grupe koje interaguju sa hidrofobnim svojstvima ADC. Hidrofobne grupe ADC interaguju sa hidrofobnim grupama unutar hidrofobne smole. Što je protein hidrofobniji to će snažnije interagovati sa hidrofobnom smolom.
[0143] Hidrofobna smola uobičajeno sadrži baznu matricu (na primer, unakrsno povezanu agarozu ili sintetički kopolimerni materijal) za koju se kupluju hidrofobni ligandi (na primer, alkil ili aril grupe). Mnoge hidrofobne smole su komercijalno dostupne. Primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na, Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow with low or high substitution (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Fenul Sefaroza™ visoke performanse (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Oktil Sefaroza™ visoke performanse (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Fraktogel™ EMD Propil ili Fraktogel ™ EMD Fenil kolone (E. Merck, Germany); Makro-Prep™ Metil ili Makro-Prep™. t-Butil podržava (Bio-Rad, California); WP HI-Propil (C3)™ (J. T. Baker, New Jersey); i Toyopearl™ etar, heksil, fenil ili butil (TosoHaas, PA). U jednoj izvedbi, hidrofobna smola je butil hidrofobna smola. U sledećoj izvedbi, hidrofobna smola je fenil hidrofobna smola. U sledećoj izvedbi, hidrofobna smola je heksil hidrofobna smola, oktil hidrofobna smola ili decil hidrofobna smola. U sledećoj izvedbi, hidrofobna smola je metakrilni polimer koji ima n-butil ligande (na primer TOYOPEARL® Butil-600M).
[0144] Dodatne metode za prečišćavanje ADC smeša da bi se dobila kompozicija koja ima željeno DAR su opisane u Aplikaciji SAD broj 14/210,602 (U.S. Patent Appln. Publication No. US 2014/0286968).
[0145] U određenim izvedbama pronalaska, ovde opisani ADC koji imaju DAR2 su prečišćeni iz ADC koji imaju više ili niže DAR. Tako prečišćene DAR2 ADC se ovde nazivaju kao “E2”. Metode prečišćavanja za dostizanje kompozicije koja ima E2 anti-B7-H3 ADC. U jednoj izvedbi, pronalazak pruža kompoziciju koja sadrži ADC smešu, pri čemu najmanje 75% ADC su anti-B7H3 ADC (kao oni ovde opisani) koji imaju DAR2. U sledećoj izvedbi, pronalazak pruža kompoziciju koja sadrži ADC smešu, pri čemu najmanje 80% ADC su anti-B7H3 ADC (kao oni ovde opisani) koji imaju DAR2. U sledećoj izvedbi, pronalazak pruža kompoziciju koja sadrži ADC smešu, pri čemu najmanje 85% ADC su anti-B7H3 ADC (kao oni ovde opisani) koji imaju DAR2. U sledećoj izvedbi, pronalazak pruža kompoziciju koja sadrži ADC smešu, pri čemu najmanje 90% ADC su anti-B7H3 ADC (kao oni ovde opisani) koji imaju DAR2.
V. Upotrebe anti-B7-H3 antitela i anti-B7-H3 ADC
[0146] ADC pronalaska su poželjno sposobni za neutralizovanje ljudske B7-H3 aktivnosti i in vivo i in vitro. Shodno tome, takvi ADC pronalaska se mogu koristiti za inhibiranje hB7-H3 aktivnosti, na primer, u ćelijskoj kulturi koja sadrži hB7-H3, kod ljudskih subjekata ili drugih sisarskih subjekata koji imaju B7-H3 sa kojim antitelo pronalaska unakrsno reaguje. U jednoj izvedbi, pronalazak obezbeđuje metodu za inhibiranje hB7-H3 aktivnosti koja obuhvata kontaktovanje hB7-H3 sa ADC pronalaska tako da je aktivnost hB7-H3 inhibirana. Na primer, u ćelijsku kulturu koja sadrži, ili se sumnja da sadrži hB7-H3, može se dodati antitelo ili deo antitela ADC pronalaska kulturnom medijumu da bi inhibiralo aktivnost hB7-H3 u kulturi.
[0147] U sledećoj izvedbi pronalaska metoda za redukovanje hB7-H3 aktivnosti kod subjekta, prednosno kod subjekta koji boluje od bolesti ili poremećaja kod kog je aktivnost B7-H3 štetna. Pronalazak obezbeđuje metode za redukovanje B7-H3 aktivnosti kod subjekta koji boluje od takve bolesti ili poremećaja, čiji metod obuhvata primenu nad subjektom ADC pronalaska tako da je aktivnost B7-H3 kod subjekta redukovana. Poželjno, B7-H3 je ljudski B7-H3, a subjekt je čovek. Alternativno, subjekt može biti sisar koji eksprimira B7-H3 za koji su antitela pronalaska sposobna da se vežu. Dalje subjekt može biti sisar kod kog je B7-H3 uveden (na primer, administracijom B7-H3 ili ekspresijom B7-H3 transgena). ADC pronalaska se mogu administrirati nad ljudskim subjektom radi terapeutskih ciljeva. Štaviše,
2
ADC pronalaska şe mogu administrirati nad neljudskim sisarom koji eksprimira B7-H3 za koji se antitelo vezuje u veterinarske svrhe ili kao životinjski model ljudske bolesti. U vezi sa ovim poslednjim, takvi životinjski modeli mogu biti korisni za evaluiranje terapeutske efikasnosti antitela pronalaska (na primer, testiranje doza i vremenskih tokova administracije).
[0148] Kao što se ovde koristi, pojam “poremećaj kod kog je ekspresija B7-H3 štetna” treba da uključi bolesti i druge poremećaje kod kojih se pokazalo da je prisustvo B7-H3 kod subjekta koji boluje od poremećaja eksprimirano, ili se pokazalo ili se sumnja da je odgovorno za patofiziologiju poremećaja ili faktor koji doprinosi poremećaju. Na primer, ADC pronalaska se mogu koristiti za ciljanje ćelija tumora koje eksprimiraju B7-H3. Neograničavajući primeri poremećaja koji se mogu tretirati sa ADC pronalaska, uključuju, ali se ne ograničavaju na, mnoštvo karcinoma uključujući, ali se ne ograničavajući na, sitnoćelijski karcinom pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), karcinom dojke, karcinom jajnika, karcinom pluća, gliom, karcinom prostate, karcinom pankreasa, karcinom debelog creva, karcinom glave i vrata, leukemiju, na primer, akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), limfom, na primer, nehodžkinov limfom (NHL) i karcinom bubrega. Drugi primeri karcinoma koji se mogu tretirati upotrebom ovde otkrivenih kompozicija i metoda uključuju skvamoznoćelijski karcinom (na primer, skvamoznoćelijski karcinom pluća ili skvamoznoćelijski karcinom glave i vrata), trostruki negativni karcinom dojke, nesitnoćelijski karacinom pluća, kolorektalni karcinom i mezoteliom. U jednoj izvedbi, ovde opisani ADC se koriste za lečenje čvrstog tumora, na primer, inhibiranje rasta ili smanjenje veličine čvrstog tumora, koji prekomerno eksprimira B7-H3 ili je pozitivan na B7-H3. U jednoj izvedbi, pronalazak je usmeren na tretman skvamoznoćelijskog karcinoma pluća povezanog sa ekspresijom B7-H3. U sledećoj izvedbi, ovde otkriveni ADC se koriste za lečenje trostrukog negativnog karcinoma dojke (TNBC). Ovde opisane bolesti i poremećaji se mogu tretirati sa anti-B7-H3 ADC pronalaska, kao i sa farmaceutskim kompozicijama koje sadrže takve anti-B7-H3 ADC.
[0149] U određenim izvedbama, karcinom se može karakterisati da ima prekomernu ekspresiju EGFR. U jednoj izvedbi, ADC pronalaska se mogu koristiti za tretiranje karcinoma povezanog sa aktivirajućom EGFR mutacijom. Primeri takvih mutacija uključuju, ali se ne ograničavaju na, delecionu mutaciju egzona 19, supstitucionu mutaciju L858R u jednoj tački u egzonu 21, T790M tačkastu mutaciju, i njihove kombinacije.
[0150] U određenim izvedbama, ovde otkriveni ADC su administrirani nad subjektom sa takvom potrebom kako bi se tretirali uznapredovali tipovi čvrstih tumora koji verovatno ispoljavaju povišene nivoe B7-H3. Primeri takvih tumora uključuju, ali se ne ograničavaju na, sitnoćelijski karcinom pluća, karcinom dojke, karcinom jajnika, skvamoznoćelijski karcinom glave i vrata, nesitnoćelijski karcinom pluća, trostruki negativni karcinom dojke, kolorektalni karcinom i multiformni glioblastom.
[0151] U određenim izvedbama, pronalazak uključuje metod za inhibiranje ili smanjenje rasta čvrstog tumora kod subjekta koji ima čvrst tumor, pomenuta metoda obuhvata primenu ovde opisanog anti-B7-H3 ADC, nad subjektom koji ima čvrst tumor, tako da je rast čvrstog tumora inihibiran ili smanjen. U određenim izvedbama, čvrst tumor je nesitnoćelijski karcinom pluća ili glioblastom. U dodatnim izvedbama, čvrst tumor su čvrsti tumori koji eksprimiraju B7-H3. U dodatnim izvedbama, čvrst tumor su čvrsti tumori koji imaju prekomernu ekspresiju B7-H3. U određenim izvedbama, ovde opisani anti-B7-H3 ADC su primenjeni nad subjektom koji ima multiformni glioblastom, samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim agensom, na primer, zračenjem i/ili temozolomidom.
[0152] U određenim izvedbama ovde opisani anti-B7-H3 ADC su primenjeni nad subjektom koji ima sitnoćelijski karcinom pluća, samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim agensom, na primer, ABT-199 (venetoclax).
[0153] U određenim izvedbama ovde opisani anti-B7-H3 ADC su primenjeni nad subjektom koji ima nesitnoćelijski karcinom pluća samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim agensom, na primer, taksanom. U određenim izvedbama ovde opisani anti-B7-H3 ADC su primenjeni nad subjektom koji ima karcinom dojke, samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim agensom, taksanom. U određenim izvedbama, ovde opisani anti-B7-H3 ADC su primenjeni nad subjektom koji ima karcinom jajnika, samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim agensom, na primer, taksanom.
[0154] Druge kombinacione terapije koje su uključene u pronalazak su administracija anti-B7-H3 ADC sa agensom izabranim iz grupe koja se sastoji od anti-PDI antitela (na primer, pembrolizumab), anti-PD-Ll antitela (na primer, atezolizumab), anti-CTLA-4 antitela (na primer, ipilimumab), MEK inhibitora (na primer, trametinib), ERK inhibitora, BRAF inhibitora (na primer dabrafenib), osimertinib, erlotinib, gefitinib, sorafenib, CDK9 inhibitora (na primer dinaciclib), MCL-1 inhibitora, temozolomida, Bcl-xL inhibitora, Bcl-2 inhibitora (na primer venetoklaksa), ibrutinib, mTOR inhibitora (na primer everolimus), PI3K inhibitora (na primer buparlisib), duvelisib, idelalisib, AKT inhibitora, HER2 inhibitora (na primer lapatinib), taksana (na primer, docetaksel, paclitaksel, nab-paclitaksel), venetoklaksa, ADC koji sadrži auristatin, ADC koji sadrži PBD (na primer rovalpituzumab tesirin), ADC koji sadrži maitanzinoid (na primer TDM1), TRAIL agonist, proteazomni inhibitor (na primer bortezomib), i nikotinamid fosforibosiltransferazni (NAMPT) inhibitor.
[0155] Kombinacione terapije uključuju administraciju ADC pronalaska pre, istovremeno sa ili nakon administracije dodatnog terapeutskog agensa, uključujući one opisane u prethodnom tekstu.
[0156] U određenim izvedbama, pronalazak obuhvata metod za inhibiranje ili smanjivanje rasta čvrstog tumora kod subjekta koji ima čvrst tumor koji je identifikovan kao tumor koji eksprimira B7-H3 ili prekomerno eksprimira B7-H3, pomenuti metod obuhvata primenu ovde opisanog anti-B7-H3 ADC, nad subjektom koji ima čvrst tumor, tako da je rast čvrstog tumora inhibiran ili smanjen. Metode za identifikovanje tumora koji eksprimiraju B7-H3 (na primer, tumori koji prekomerno eksprimiraju B7-H3) su poznate u struci, i uključuju testove odobrene od strane FDA i validacione testove. Na primer, B7-H3 test je kvalitativni sistem imunohistohemijskog (IHC) kompleta korišćen za identifikovanje B7-H3 ekspresije u normalnim i neoplastičnim tkivima rutinski fiksiran za histološku evaluaciju. Dodatno, testovi na bazi PCR se takođe mogu koristiti za identifikovanje tumora sa prekomernom ekspresijom B7-H3. Amplifikovani PCR proizvodi mogu biti naknadno analizirani, na primer, gel elektroforezom korišćenjem uobičajenih metoda poznatih u struci kako bi se utvrdila veličina PCR proizvoda. Takvi testovi se mogu koristiti za identifikovanje tumora koji se mogu lečiti ovde opisanim metodama i kompozicijama.
[0157] Bilo koji metod genske terapije dostupan u struci se može koristiti u skladu sa pronalaskom. Za opšte preglede metoda genske terapije, pogledati Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Metode poznate u struci rekombinantne DNK tehnologije koje se mogu koristiti su opisane u Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Detaljan opis različitih metoda genske terapije je dat u US20050042664 A1.
[0158] U sledećem aspektu, aplikacija obuhvata metod tretiranja (na primer, lečenje, suzbijanje, poboljšavanja, odlaganja ili sprečavanja nastanka, ili sprečavanja recidiva ili relapsa) ili prevencije poremećaja povezanog sa B7-H3 kod subjekta. Metod uključuje: primenu nad subjektom agensa koji vezuje B7-H3, na primer, anti-B7-H3 antitela ili njegovog fragmenta kao što je ovde opisano, u količini dovoljnoj za tretiranje ili prevenciju poremećaja povezanog sa B7-H3. B7-H3 antagonist, na primer, anti-B7-H3 antitelo ili njegov fragment, se može primeniti nad subjektom, sam ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim modalitetima kao što je ovde opisano.
[0159] Antitela ili ADC pronalaska, ili njihovi delovi za vezivanje antigena se mogu koristiti samostalno ili u kombinaciji kako bi tretirali takve bolesti. Treba razumeti da se antitela pronalaska ili njihov deo za vezivanje antigena mogu koristiti samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim agensom, na primer, terapeutskim agensom, pomenuti dodatni agens je izabran od strane iskusnog stručnjaka radi svoje predviđene svrhe. Na primer, dodatni agens može biti terapeutski agens koji je struka prepoznala kao koristan u tretiranju bolesti ili stanja koje se tretira antitelom pronalaska. Dodatni agens takođe može biti agens koji terapeutskoj kompoziciji daje blagotvorno svojstvo, na primer, agens koji utiče na viskoznost kompozicije.
[0160] Dalje treba razumeti da kombinacije koje se uključuju unutar ovog pronalaska kombinacije koje su korisne u svojoj predviđenoj svrsi. Agensi koji su navedeni u nastavku su ilustrativni radi svrhe i ne treba da ograničavaju. Kombinacije, koje su deo ovog pronalaska, mogu biti antitela pronalaska i najmanje jedan dodatni agens izabran sa lista u nastavku teksta. Kombinacija takođe može uključiti više od jednog dodatnog agensa, na primer, dva ili tri dodatna agensa ukoliko je kombinacija takva da formirana kompozicija može sprovesti svoju namenjenu funkciju.
[0161] Kombinaciona terapija može uključiti jedan ili više B7-H3 antagonista, na primer, anti-B7-H3 antitela ili njihove fragmente, formulisana sa, i/ili zajednički administrirana sa, jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa, na primer, jednim ili više citokina i inhibitora faktora rasta, imunosupresanata, anti-inflamatornih agenasa (na primer, sistemski antiinflamatorni agensi), anti-fibrotskih agenasa, metaboličkih inhibitora, enzimskih inhibitora, i/ili citotoksičnih ili citostatičkih agenasa, mitotičkih inhibitora, antitumorskih antibiotika, imunomodulišućih agenasa, vektora za gensku terapiju, alkilirajućih agenasa, antiangiogenih agenasa, antimetabolita, agenasa koji sadrže boron, hemoprotektivnih agenasa, hormona, antihormonskih agenasa, kortikosteroida, fotoaktivnih terapeutskih agenasa, oligonukleotida, radionukleotidnih agenasa, inhibitora topoizomeraze, inhibitora kinaze ili radiosenzibilizatora, kao što je ovde opisano.
[0162] U određenoj izvedbi, ovde opisani proteini za vezivanje anti-B7-H3 se koriste u kombinaciji sa sa antikarcinomskim agensom ili antineoplastičnim agensom. Pojmovi “antikarcinomski agens” i “antineoplastični agens” se odnose na lekove koji se koriste za tretiranje maligniteta, kao što je kancerogeni rast. Terapija lekom se može sprovesti samostalno ili u kombinaciji sa drugim tretmanima kao što je hirurgija ili terapija zračenjem. Nekoliko klasa lekova se može koristiti u tretmanu karcinoma, u zavisnosti od prirode obuhvaćenog organa. Na primer, karcinome dojke obično stimulišu estrogeni, i mogu se tretirati sa lekovima koji neaktivno deluju na polne hormone. Slično tome, karcinom prostate se može tretirati sa lekovima koji neaktivno deluju na androgene, muški polni hormon. Antikarcinomski agensi koji se mogu koristiti u konjunkciji sa anti-B7-H3 ADC pronalaska uključuju, između ostalih, anti-PDI antitelo (na primer, pembrolizumab), anti-PD-LI antitelo (na primer, atezolizumab), anti-CTLA-4 antitelo (na primer, ipilimumab), MEK inhibitor (na primer, trametinib), ERK inhibitor, BRAF inhibitor (na primer, dabrafenib), osimertinib (AZD9291), erlotinib, gefitinib, sorafenib, CDK9 inhibitor (na primer, dinaciclib), MCL-1 inhibitor, temozolomid, Bcl-xL inhibitor, Bcl-2 inhibitor (na primer, venetoklaks), ibrutinib, mTOR inhibitor (na primer, everolimus), PI3K inhibitor (na primer, buparlisib), duvelisib, idelalisib, AKT inhibitor, HER2 inhibitor (na primer, lapatinib), herceptin, taksan (na primer, docetaksel, paclitaksel, nab-paclitaksel), ADC koji sadrži auristatin, ADC koji sadrži PBD (na primer, rovalpituzumab tesirin), ADC koji sadrži maitanzinoid (na primer, TDM1), TRAIL agonist, inhibitor proteazoma (na primer, bortezomib) i inhibitor nikotinamid fosforibosiltransferaze (NAMPT), kao i sledeći agensi:
Antikarcinomski agens Komentari Primeri
Antitela Antitela koja vezuju IGF-1R (receptor A12 (potpuno humanizovan mAb) 19D12 tipa 1 faktora rasta sličan insulinu), koji (potpuno humanizovan mAb) Cp751-871 je eksprimiran na ćelijskoj površini kod (potpuno humanizovan mAb) H7C10 većine ljudskih karcinoma (humanizovan mAb) alphaIR3 (miš) ScFV/FC (mišja/ljudska himera) EM/164 (miš) Antitela koja vezuju EGFR; mutacije Matuzumab (EMD72000) Erbitux® / koje pogađaju ekspresiju ili aktivnost Cetuksimab (Imclone) Vectibix® / EGFR mogu dovesti do karcinoma Panitumumab (Amgen) mAb 806 Antitela koja vezuju cMET (mezehimni Nimotuksumab (TheraCIM) AVEO (AV299) epitelni tranzicioni faktor); član MET (AVEO) AMG102 (Amgen) 5D5 (OA-5d5) familije receptorskih tirozin kinaza (Genentech) H244G11 (Pierre Fabre) Anti-ErbB3 antitela Ab #14 (MM 121-14) Herceptin®
(Trastuzumab; Genentech) 1B4C3; 2D1D12 (U3 Pharma AG)
2
Mali molekuli koji Receptor tipa 1 faktora rasta sličan NVP-AEW541-A BMS-536,924 ciljaju IGF1R insulinu koji je eksprimiran na ćelijskoj (1Hbenzoimidazol-2-il)-1H-piridin2-jedno) površini kod mnogih ljudskih karcinoma BMS-554,417 Cikloligan TAE226 PQ401 Mali molekuli koji EGFR; Iressa® / Gefitinib (AstraZeneca) ciljaju EGFR
Prekomerna ekspresija ili mutacije koje CI-1033 (PD 183805) (Pfizer) Lapatinib (GW-utiču na ekspresiju ili aktivnost EGFR 572016) (GlaxoSmithKline) Tykerb® / mogu dovesti do karcinoma Lapatinib Ditosilat (Smith Kline Beecham)
Tarceva ® / Erlotinib HCL (OSI774) (OSI Pharma) PKI-166 (Novartis) PD-158780 EKB-569 Tirphostin AG 1478 (4-(3- hloroanillino)-6,7- dimetoksihinazolin)
Mali molekuli koji cMET (mezehimni epitelni tranzicioni PHA665752 ARQ 197
ciljaju cMET faktor); član MET familije receptorskih
tirozin kinaza
Antimetaboliti Flourouracil (5-FU) Capecitabine / XELODA®
(HLR Roche) 5-Trifluorometil-2’- deoksiuridin metotreksat natrijum (Trexall) (Barr) Raltitrexed/ Tomudex® (AstraZeneca) Pemetrexed / Alimta® (Lilly) Tegafur Citozin Arabinozid (Cytarabine, Ara-C) / Tioguanin® (GlaxoSmithKline) 5 -azacitidin 6-merkaptopurin (Mercaptopurine, 6-MP) Azathioprine / Azasan® (AAIPHARMA LLC) 6-thioguanine (6-TG) / Purinethol® (TEVA) Pentostatin / Nipent® (Hospira Inc.) Fludarabin fosfat / Fludara® (Bayer Health Care) Cladribin (2-CdA, 2-hlorodeoksiadenozin) / Leustatin® (Ortho Biotech)
Alkilirajući agensi Alkilirajući antineoplastični agens je Inhibitor ribonukleotidne reduktaze (RNR) alkilirajući agens koji prikačinje alkil Ciklofosfamid / Citoksan (BMS) Neosar grupu za DNK. Obzirom da ćelije (TEVA) Ifosfamid / Mitoxana® (ASTA Medica) karcinoma generalno proliferišu Tiotepa (Bedford, Abraxis, Teva) BCNU→ nerestriktivno više od zdravih ćelija 1,3-bis(2-hloroetil)- 1-nitosourea CCNU1, -senzitivnije su na oštećenje DNK, i (2- hloroetil)-3-cikloheksil-1- nitrosourea alkilirajući agensi se koriste klinički za (metil CCNU) Heksametilmelamin tretiranje raznih tumora. (Altretamine, HMM) / Hexalen® (MGI Pharma Inc.) Busulfan / Mileran (GlaxoSmithKline) Prokarbazin HCL/ Matulane (Sigma Tau Pharmaceuticals, Inc.) Dakarbazin (DTIC) hlorambucil / Leukara® (SmithKline Beecham) Melphalan / Alkeran® (GlaxoSmithKline) Cisplatin (Cisplatinum, CDDP) / Platinol (Bristol Myers) Karboplatin / Paraplatin (BMS) Oksaliplatin /Eloxitan® (SanofiAventis US) Inhibitori topoizomeraze Inhibitori topoizomeraze su Doksorubicin HCL / Doxil® (Alza) hemoterapijski agensi dizajnirani da Daunorubicin citrat / Daunoksom® (Gilead) ometaju delovanje enzima Mitoksantron HCL / Novantron (EMD Serono) topoizomeraze (topoizomeraza I i II), što Actinomicin D Etopozid / Vepezid® (BMS)/ su enzimi koji kontrolišu promene u DNK Etopofos® (Hospira, Bedford, Teva strukturi katalizujući razbijanje ponovno Parenteral, Etc.) Topotekan HCL / spajanje oslonca fosfodiestra DNK lanaca Hycamtin® (GlaxoSmithKline) Tenipozid (VM-tokom normalnog ćelijskog ciklusa 26) / Vumon® (BMS) Irinotekan HCL(CPT-ll) /
Camptosar® (Pharmacia & Upjohn) Agensi za ciljanje Mikrotubule su jedna od komponenti Vinkristin / Onkovin® (Lilly) Vinblastin sulfat mikrotubula citoskeleta. Imaju prečnik od ~24 nm i / Velban® (ukinut) (Lilly) Vinorelbin dužinu koja varira od nekoliko tartrat / Navelbine® (PierreFabre) Vindesin mikrometara do moguće je milimetara u sulfat / Eldisine® (Lilly) Paclitaksel / aksonima nervnih ćelija. Mikrotubule Taksol® (BMS) Docetaksel / Taxotere® služe kao strukturne komponente unutar (Sanofi Aventis US) Nanočestica paclitaksel ćelija i uključene su u mnoge ćelijske (ABI007) / Abraxane® (Abraxis BioScience, procese uključujući mitozu, citokinezu i Inc.) Iksabepilon / IXEMPRA™ (BMS) vezikularni transport.
2
Inhibitori kinaze Kinaze su enzimi koji katališu transfer Imatinib mezilat / Gleevec (Novartis) fosfatnih grupa iz visokoenergetskih, Sunitinib malat / Sutent® (Pfizer) Sorafenib molekula koji doniraju fosfat u tozilat / Neksavar® (Bayer) Nilotinib specifične supstrate, i koriste se hidrohlorid monohidrat / Tasigna® transmisiju signala i regulisanje (Novartis), Osimertinib, Cobimetinib, kompeksnih procesa u ćelijama. Trametinib, Dabrafenib, Dinaciklib Inhibitori proteinske Indukuju ćelijsku apoptozu L-asparaginaza / Elspar® (Merck & Co.) sinteze
Imunoterapeutski agensi Indukuju pacijente sa karcinomom da Alfa interferon Angiogeneza inhibitor / ispoljavaju imunološku odzivnost Avastin® (Genentech) IL-2→ Interleukin 2
(Aldesleukin) / Proleukin ® (Chiron) IL-12→ Interleukin 12
Modulatori imune kontrolne tačke Anti-CTLA-4 i PR-1 terapije Yervoy® antitela/malih molekula (ipilimumab; BristolMyers Squibb) Opdivo®
(nivolumab; BristolMyers Squibb) Keytrada® (pembrolizumab; Merck)
Hormoni Hormonske terapije povezane sa Toremifen citrat / Fareston® (GTX, Inc.) menopauzom i starenjem teže da Fulvestrant / Faslodex® (AstraZeneca) povećaju količinu određenih hormona u Raloksifen HCL / Evista® (Lilly) Anastrazol / vašem telu kako bi kompenzovalo Arimidex® (AstraZeneca) Letrozol / hormonsko opadanje povezano sa Femara® (Novartis) Fadrozol (CGS 16949A) starenjem ili bolesti. Hormonska terapija Egzemestan / Aromasin® (Pharmacia & kao tretman karcinoma ili redukuje nivo Upjohn) Leuprolid acetat / Eligard® (QTL specifičnih hormona ili menja sposobnost USA) Lupron® (TAP Pharm) Goserelin karcinoma da koristi te hormone za rast i acetat / Zoladex® (AstraZeneca) Triptorelin širenje. pamoat / Trelstar® (Watson Labs)
Buserelin / Suprefact® (Sanofi Aventis) Nafarelin / Synarel® (Pfizer) Cetroreliks / Cetrotide® (EMD Serono) Bikalutamid / Casodex® (AstraZeneca) Nilutamid / Nilandron® (Aventis Pharm.) Megestrol acetat / Megace® (BMS) Somatostatin Analozi (Oktreotid acetat / Sandostatin® (Novartis)
Glukokortikoidi Anti-inflamatorni lekovi koji se koriste za Prednizolon Deksametazon / Decadron® redukovanje oticanja koje izaziva (Wyeth)
karcinomski bol.
Inhibitori aromatoze Uključuju imidazole Ketokonazol
Inhibitori mTOR mTOR signalna putanja je originalno Sirolimus (Rapamycin) / Rapamune® (Wyeth) otkrivena tokom studija Temsirolimus (CCI-779) / Torisel® (Wyeth) imunosupresivnog agensa rapamicina. Deforolimus (AP23573) / (Ariad Pharm.) Ova visoko konzervirana putanja reguliše Everolimus (RAD00I) / Certican® (Novartis) ćelijsku proliferaciju metabolizam kao
odgovor na faktore okruženja,
povezujući receptorsko signaliranje
faktora ćelijskog rasta putem
fosfoinozitid-3-kinaze (PI-3K) sa
ćelijskim rastom, proliferacijom i
angiogenezom.
[0163] Kao dodatak gore pomenutim antikarcinomskim agensima, ovde opisan anti-B7-H3 ADC se može administrirati u kombinaciji sa ovde opisanim agensima.
[0164] U određenim izvedbama, anti-B7-H3 ADC se mogu administrirati samostalno ili sa drugim antikarcinomskim agensom koji deluje u konjunkciji sa ili sinergistički sa antitelom kako bi tretirali bolest povezanu sa aktivnošću B7-H3. Takvi antikarcinomski agensi uključuju, na primer, agense koji su dobro poznati u struci (na primer, citotoksine,chemoterapeutske agense, male molekule i zračenje). Primeri antikarcinomskih agenasa uključuju, ali se ne ograničavaju na, Panorex (Glaxo-Welcome), Rituxan (IDEC/Genentech/Hoffman la Roche), Mylotarg (Wyeth), Campath (Millennium), Zevalin (IDEC and Schering AG), Bexxar (Corixa/GSK), Erbitux (Imclone/BMS), Avastin (Genentech) and Herceptin (Genentech/Hoffman la Roche). Drugi antikarcinomski agensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, one otkrivene u Patentu SAD broj 7,598,028 i Internacionalnoj publikaciji broj WO2008/100624. Jedan ili više antikarcinomskih agenasa se mogu administrirati ili simultano ili pre ili nakon administracije antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen pronalaska.
[0165] U određenim izvedbama ovog pronalaska, ovde opisani anti-B7-H3 ADC se mogu koristiti u kombinacionoj terapiji sa apoptotskim agensom, kao što je inhibitor Bcl-xL ili inhibitor Bcl-2 (B-ćelijski limfom 2)(na primer, ABT-199 venetoklaks) za tretiranje karcinoma, kao što je leukemija, kod subjekta. U jednoj izvedbi, ovde opisani anti-B7-H3 se mogu koristiti u kombinacionoj terapiji sa inhibitorom Bcl-xL za tretiranje karcinoma. U jednoj izvedbi, ovde opisani anti-B7-H3 ADC se mogu koristiti u kombinacionoj terapiji sa venetoklaksom za tretiranje karcinoma.
2
[0166] U određenim izvedbama pronalaska, ovde opisani anti-B7-H3 ADC se mogu koristiti u kombinacionoj terapiji sa inhibitorom NAMPT (videti primere inhibitora u US 2013/0303509; AbbVie, Inc.) za tretiranje subjekta sa takvom potrebom. NAMPT (takođe poznat kao faktor poboljšavanja pred-B-ćelijske kolonije (PBEF) i visfatin) je enzim koji katalizuje fosforibozilaciju nikotinamida i enzim je koji ograničava protok u jednoj od dve putanje koje spašavaju NAD. U jednoj izvedbi pronalaska, ovde opisani anti-B7-H3 ADC su primenjeni u kombinaciji sa inhibitorom NAMPT kod tretmana karcinoma kod subjekta.
[0167] U određenim izvedbama pronalaska, ovde opisani anti-B7-H3 ADC se mogu koristiti u kombinacionoj terapiji sa SN-38, koji je aktivni metabolit inhibitora topoizomeraze irinotekana.
[0168] U sledećim izvedbama pronalaska, ovde opisani anti-B7-H3 ADC se mogu koristiti u kombinacionoj terapiji sa inhibitorom PARP (poli ADP riboza polimeraza), na primer, veliparibom, za tretiranje karcinoma, uključujući karcinome dojke, jajnika i nesitnoćelijski karcinom pluća.
[0169] Dalji primeri dodatnih terapeutskih agenasa koji se mogu zajednički primeniti i/ili formulisati sa ovde opisanim anti-B7-H3 ADC, uključuju, ali se ne ograničavaju na, jedan ili više: inhaliranih steroida, beta-agonista, na primer, kratkotrajnih ili dugotrajnih beta-agonista; antagonista leukotriena ili receptora leukotriena; kombinacionih lekova kao što je ADVAIR; inhibitora IgE, na primer, anti-IgE antitela (na primer, XOLAIR®, omalizumab); inhibitora fosfodiesteraze (na primer, inhibitori PDE4); ksantini; antiholinergički lekovi; agensi za stabilizaciju mastocita kao što je kromolin; inhibitori IL-4; inhibitori IL-5; inhibitori eotaksin/CCR3; antagonisti histamina ili njegovih receptora uključujući H1, H2, H3 i H4, i antagonisti prostaglandina D ili njegovih receptora (DP1 i CRTH2). Takve kombinacije se mogu koristiti za tretiranje, na primer, astme i drugih respiratornih poremećaja. Drugi primeri dodatnih terapeutskih agenasa koji se mogu zajedno primeniti i/ili formulisati sa ovde opisanim anti-B7-H3 ADC, uključuju, ali se ne ograničavaju na, jedno ili više, an anti-PDl antitelo (na primer, pembrolizumab), anti-PD-Ll antitelo (na primer, atezolizumab), anti-CTLA-4 antitelo (na primer, ipilimumab), inhibitor MEK (na primer, trametinib), inhibitor ERK, inhibitor BRAF (na primer, dabrafenib), osimertinib (AZD9291), erlotinib, gefitinib, sorafenib, inhibitor CDK9 (na primer, dinaciclib), inhibitor MCL-1, temozolomid, inhibitor Bcl-xL, inhibitor Bcl-2 (na primer, venetoklaks), ibrutinib, inhibitor mTOR (na primer, everolimus), inhibitor PI3K (na primer, buparlizib), duvelizib, idelalizib, inhibitor AKT, inhibitor HER2 (na primer, lapatinib), herceptin, taksan (na primer, docetaksel, paclitaksel, nab-paclitaksel), ADC koji sadrži auristatin, ADC koji sadrži PBD (na primer, rovalpituzumab tezirin), ADC koji sadrži maitanzinoid (na primer, TDM1), TRAIL agonist, inhibitor proteazoma (na primer, bortezomib) i inhibitor nikotinamid fosforibosiltransferaze (NAMPT). Dodatni primeri terapeutskih agenasa koji se mogu zajednički primeniti i/ili formulisati sa jednim ili više anti-B7-H3 antitela li njihovih fragmenata uključuju jedan ili više: TNF antagonista (na primer, rastvorljiv fragment TNF receptora, na primer, p55 ili p75 ljudski TNF receptor ili njegovi derivati, na primer, 75 kD TNFR-IgG (75 kD TNF receptor-IgG fuzioni protein, ENBREL)); antagonisti TNF enzima, na primer, inhibitori TNF konvertujućeg enzima (TACE); antagonisti muskarinskog receptora; TGF-beta antagonisti; interferon gama; perfenidon; hemoterapeutski agensi, na primer, metotreksat, leflunomid ili sirolimus (rapamicin) ili njegov analog, na primer, CCI-779; inhibitori COX2 i cPLA2; NSAID; immunomodulatori; inhibitori p38, TPL-2, MK-2 i NFkB inhibitori, između ostalih.
[0170] Druge preferirane kombinacije su citokinski supresivni antiinflamatorni lekovi (CSAID); antitela ili antagonisti drugih ljudskih citokina ili faktora rasta, na primer, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-31, interferoni, EMAP-II, GM-CSF, FGF, EGF, PDGF i edotelin-1, kao i receptori ovih citokina i faktora rasta. Antitela pronalaska, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, se mogu spojiti sa antitelima u molekule ćelijske površine kao što su CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA, CTLA-4, PD-1 ili njihovi ligandi uključujući CD154 (gp39 ili CD40L).
[0171] Preferirane kombinacije terapeutskih agenasa se mogu umešati u različitim tačkama u inflamatornoj kaskadi; preferirani primeri uključuju antagoniste TNF kao što su himerna, humanizovana ili ljudska TNF antitela, adalimumab, (HUMIRA; D2E7; PCT publikacija broj WO 97/29131 i Patent SAD broj 6,090,382), CA2 (RemicadeTM), CDP 571, i rastvorljivi p55 ili p75 TNF receptori, njihovi derivati (p75TNFR1gG (EnbrelTM) ili p55TNFR1gG (Lenercept), i takođe inhibitori TNF konvertujućeg enzima (TACE); slično tome inhibitori IL-1 (inhibitori enzima koji kovertuje interleukin-1, IL-1RA itd.) mogu biti efikasni iz istog razloga. Druge preferirane kombinacije uključuju interleukin 4.
[0172] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu uključivati “terapeutski efikasnu količinu” ili “profilaktički efikasnu količinu” antitela ili dela antitela pronalaska. “Terapeutski efikasna količina” se odnosi na količinu koja je efikasna, u dozama i tokom potrebnog vremenskog perioda, za postizanje željenog terapeutskog rezultata. Terapeutski efikasna količina antitela ili dela antitela se može odrediti od strane iskusne osobe iz struke i može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, uzrast, pol i težina pojedinca, i mogućnosti antitela ili dela antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj su bilo koja toksična ili detrimentalna dejstva antitela, ili dela antitela, nadmašena terapeutski blagotvornim dejstvima. “Profilaktički efikasna količina” se odnosi na efikasnu količinu, u dozama i tokom potrebnog vremenskog perioda, za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Obično, obzirom da se profilaktička doza koristi kod subjekata pre ili u ranijoj fazi bolesti, profilaktički efikasna količina će biti manja od terapeutski efikasne količine.
[0173] Dozni režimi se mogu prilagoditi kako bi dali optimalni željeni odgovor (na primer, terapeutski ili profilaktički odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, nekoliko podeljenih doza tokom vremenskog perioda ili se doza može proporcionalno redukovati ili povećati na šta ukazuje hitnost terapeutske situacije. Posebna je prednost formulisati parenteralne kompozicije u doznoj jediničnoj formi radi lakše primene i uniformnosti doze. Dozna jedinična forma kao što se ovde koristi se odnosi na fizički diskretne jedinice pogodne kao unitarne doze sa sisarske subjekte koji se tretiraju; svaka jedinica sadrži predodređenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeno terapetsko dejstvo u saradnji sa zahtevanim farmaceutskim nosačem. Specifikacija doznih jedničnih formi pronalaska je diktirana i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog ili profilaktičkog dejstva koje treba da se postigne i (b) ograničenja inherentnih u veštini mešanja tako aktivnog jedinjenja za tretman senzitivnosti kod pojedinaca.
2
[0174] Primerni, neograničavajući opseg terapeutski ili profilaktički efikasne količine ADC je 0,1-20 mg/kg, poželjnije 1-10 mg/kg. U jednoj izvedbi, doza ovde opisanog ADC je 1 do 6 mg/kg, uključujući pojedinačne doze navedene tamo, na primer, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg i 6 mg/kg. U sledećoj izvedbi, doza ovde opisanih ADC je 1 do 200 ug/kg, uključujući pojedinačne doze navedene tamo, na primer, 1 ug/kg, 2 ug/kg, 3 ug/kg, 4 ug/kg, 5 ug/kg, 10 ug/kg, 20 ug/kg, 30 ug/kg, 40 ug/kg, 50 ug/kg, 60 ug/kg, 80 ug/kg, 100 ug/kg, 120 ug/kg, 140 ug/kg, 160 ug/kg, 180 ug/kg i 200 ug/kg. Treba naznačiti da vrednosti doze mogu varirati u zavisnosti od tipa i ozbiljnosti stanja koje se ublažava. Treba razumeti da se za bilo kog određenog subjekta, specifični dozni režimi trebaju prilagođavati vremenom shodno potrebi pojedinca i profesionalnom mišljenju osobe koja administrira ili vrši nadzor nad administracijom kompozicija, i da je ovde naveden opseg doza samo primeran i nema za cilj da ograniči opseg ili praksu zahtevane kompozicije.
[0175] U jednoj izvedbi, anti-B7-H3 ADC je primenjen nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, u dozi od 0,1 do 30 mg/kg. U sledećoj izvedbi, anti-B7-H3 antitelo je primenjeno nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 1 do 15 mg/kg. U sledećoj izvedbi, anti-B7-H3 antitelo je primenjeno nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 1 do 10 mg/kg. U sledećoj izvedbi, anti-B7-H3 antitelo je primenjeno nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 2 do 3. U sledećoj izvedbi, anti-B7-H3 antitelo je primenjeno nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 1 do 4 mg/kg.
[0176] U jednoj izvedbi, ovde opisan anti-B7-H3 ADC je primenjen nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 1 do 200 ug/kg. U sledećoj izvedbi, anti-B7-H3 antitelo je primenjeno nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 5 do 150 ug/kg. U sledećoj izvedbi, anti-B7-H3 antitelo je primenjeno nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 5 do 100 ug/kg. U sledećoj izvedbi, anti-B7-H3 antitelo je primenjeno nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 5 do 90 ug/kg. U sledećoj izvedbi, anti-B7-H3 antitelo je primenjeno nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 5 do 80 ug/kg. U sledećoj izvedbi, anti-B7-H3 antitelo je primenjeno nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 5 do 70 ug/kg. U sledećoj izvedbi, anti-B7-H3 antitelo je primenjeno nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 5 do 60 ug/kg. U sledećoj izvedbi, anti-B7-H3 antitelo je primenjeno nad subjektom sa takvom potrebom, na primer, subjektom koji ima karcinom, kao ADC u dozi od 10 do 80 ug/kg.
[0177] Gore opisane doze mogu biti korisne za administraciju ovde otkrivenog anti-B7-H3.
[0178] Obzirom na mogućnost vezivanja za ljudski B7-H3, anti-humana B7-H3 antitela, ili njihovi delovi (kao i njihovi ADC) se mogu koristiti za detektovanje ljudskog B7-H3 (na primer, u biološkom uzorku, kao što je serum ili plazma), korišćenjem konvencionalnog imunotesta, kao što su enzimski povezani imunosorbentni testovi (ELISA), radioimunotest (RIA) ili imunohistohemija tkiva. U jednom aspektu, pronalazak pruža metodu za detektovanje ljudskog B7-H3 u biološkom uzorku koji sadrži kontaktovanje biološkog uzorka sa antitelom (ili delom antitela) i detektovanje ili antitela (ili dela antitela) vezanog za ljudski B7-H3 ili nevezanog antitela (ili dela antitela) čime se detektuje ljudski B7-H3 u biološkom uzorku. Antitelo je direktno ili indirektno označeno sa detektabilnom supstancom kako bi se olakšala detekcija vezanog ili nevezanog antitela. Pogodne detektabilne supstance uključuju različite enzime, prostetične grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, β-galaktosidazu ili acetilholinsterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetične grupe uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbelliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili ficoeritrin; primer luminescentnog materijala uključuje luminol; i primeri pogodnog radioaktivnog materijala uključuju<3>H,<14>C,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In<125>I,<131>I,<177>Lu,<166>Ho ili<153>Sm.
[0179] Alternativno obeležavanju antitela, ljudski B7-H3 se može ispitivati u biološkim tečnostima kompeticionim imunotestom koji koristi rhB7-H3 standarde označene sa detektabilnom supstancom i neoznačenim anti-humanim B7-H3 antitelom. U ovom testu, biološki uzorak, označeni rhB7-H3 standardi i anti-humano B7-H3 antitelo su spojeni i utvrđena je količina označenog rhB7-H3 standarda vezanog za neoznačeno antitelo. Količina ljudskog B7-H3 u biološkom uzorku je obrnuto proporcionalna količini označenog rhB7-H3 standarda vezanog za anti-B7-H3 antitelo. Slično tome, humani B7-H3 se takođe može testirati u biološkim tečnostima kompeticionim imumotestom koji koristi rhB7-H3 standarde označene sa detektabilnom supstancom i neoznačeno anti-humano B7-H3 antitelo.
VI. Farmaceutske kompozicije
[0180] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže ADC pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske kompozicije koje sadrže ADC pronalaska su za upotrebu u, ali bez ograničavanja na, dijagnostiku, detektovanje ili praćenje poremećaja, prevenciji, tretiranju, upravljanju ili ublažavanju poremećaja ili jednog ili više njegovih simptoma, i/ili u istraživanju. U sledećoj izvedbi, farmaceutske kompozicije koje sadrže jedan ili više ADC pronalaska i jedan ili više profilaktičkih ili terapeutskih agenasa sem ADC pronalaska za tretiranje poremećaja kod kog je aktivnost B7-H3 detrimentalna. Preferirano, profilaktički i terapeutski agensi za koje se zna da su korisni ili da su ili se trenutno koriste u prevenciji, tretmanu, menadžmentu ili ublažavanju poremećaja ili jednog ili više njegovih simptoma. U skladu sa ovim izvedbama, kompozicija može dalje sadržati nosač, diluent ili ekscipijent.
[0181] ADC pronalaska se mogu inkorporirati u farmaceutske kompozicije koje su pogodne za admnistraciju nad subjektom. Obično, farmaceutska kompozicija obuhvata antitelo ili deo antitela pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kao što se ovde koristi, “farmaceutski prihvatljiv nosač” uključuje bilo kakve rastvarače, disperzione medije, premaze, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slične koji su
2
fiziološki kompatibilni. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju jedan ili više od vode, fiziološkog rastvora, fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom, dekstroze, glicerola, etanola i sličnih, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u kompoziciju. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu dalje sadržati manje količine pomoćnih supstanci kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje, konzervanse ili pufere, koji poboljšavaju rok trajanja ili efikasnost ADC.
[0182] Poznati su različiti sistemi isporuke i mogu se koristiti za primenu ADC pronalaska, na primer, inkapsulacija u lipozomima, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne za ekspresiju antitela ili fragmenta antitela, endocitoza posredovana receptorom (videti, na primer, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), konstrukcija nukleinske kiseline kao deo retrovirusnog ili drugog vektora, itd. Metode primene profilaktičkog ili terapeutskog agensa pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na, parenteralnu primenu (na primer, intradermalna, intramuskularna, intraperitonealna, intravenozna i subkutana), epiduralnu primenu, intratumoralnu primenu i mukozalnu primenu (na primer, intranazalni i oralni putevi). Dodatno, pulmonarna primena se može koristiti, na primer, upotrebom inhalatora ili nebulizatora, i formulacijom sa agensom za aerosolizovanje. Videti, na primer, patentne SAD pod brojevima: 6,019,968, 5,985, 320, 5,985,309, 5,934, 272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290, 540 i 4,880,078; i PCT publikacije pod brojevima: WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 i WO 99/66903. U jednoj izvedbi kompozicija pronalaska je primenjena korišćenjem Alkermes AIR® tehnologije pulmonarne isporuke leka (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). U specifičnoj izvedbi, profilaktički ili terapeutski agensi pronalaska su primenjeni intramuskularno, intravenozno, intratumoralno, oralno, intranazalno, pulmonarno ili subkutano. Profilaktički ili terapeutski agensi se mogu primeniti bilo kojim prikladnim načinom, na primer infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpcijom preko epitelnih ili mukokutanih obloga (na primer, oralna mukoza, rektalna ili intestinalna mukoza, itd.) i mogu se primeniti zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Primena može biti sistemska ili lokalna.
[0183] U specifičnoj izvedbi, može biti poželjno primeniti profilaktičke ili terapeutske agense pronalaska lokalno u oblast kojoj je potreban tretman, ovo se može postići, na primer, bez ograničavanja, lokalnom infuzijom, injekcijom, pomoću implanta, pomenuti implant poroznog ili neporoznog materijala, uključujući membrane i matrice, kao što su sialastične membrane, polimeri, fibrozne matrice (na primer, Tissuel®) ili kolagene matrice. U jednoj izvedbi, efikasna količina jednog ili više antitela pronalaska antagonista je primenjena lokalno u pogođenu oblast nad subjektom kako bi se sprečio, tretirao, upravljao i/ili ublažio poremećaj ili njegov simptom. U drugoj izvedbi, efikasna količina jednog ili više antitela pronalaska je primenjena lokalno u pogođenu oblast u kombinaciji sa efikasnom količinom jedne ili više terapija (na primer, jedan ili više profilaktičkih ili terapeutskih agenasa) koje nisu antitelo pronalaska, subjekta kako bi se sprečio, tretirao, upravljao i/ili ublažio poremećaj ili jedan ili više njegovih simptoma.
[0184] U sledećoj izvedbi, profilaktički ili terapeutski agens pronalaska se može isporučiti sistemom kontrolisanog oslobađanja ili sistemom neprekidnog oslobađanja. U jednoj izvedbi, može se koristiti pumpa kako bi se postiglo kontrolisano ili neprekidno oslobađanje (videti Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). U sledećoj izvedbi, mogu se koristiti polimerni materijali za postizanje kontrolisanog ili neprekidnog oslobađanja terapija pronalaska (videti, na primer, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); Patent SAD broj 5,679,377; Patent SAD broj 5, 916,597; Patent SAD broj 5,912,015; Patent SAD broj 5,989,463; Patent SAD broj 5,128,326; PCT publikacija broj WO 99/15154; i PCT publikacija broj WO 99/20253. Primeri polimera korišćenih u formulacijama kontinuiranog oslobađanja uključuju, ali se ne ograničavaju na, poli(2-hidroksi etil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(akrilna kiselina), poli(etilen-co-vinil acetat), poli(metakrilna kiselina), poliglikolidi (PLG), polianhidridi, poli(N-vinil pirolidon), poli(vinil alkohol), poliakrilamid, poli(etilen glikol), polilaktidi (PLA), poli(laktid-co-glikolidi) (PLGA) i poliortoestri. U preferiranoj izvedbi, polimer korišćen u formulaciji kontinuiranog oslobađanja je inertan, bez uklonjivih nečistoća, stabilan pri skladištenju, sterilan i biorazgradiv. U sledećoj izvedbi, sistem kontrolisanog ili kontinuiranog oslobađanja se može postaviti u neposrednu blizinu profilaktičkog ili terapeutskog cilja, time zahtevajući samo frakciju sistemske doze (videti, na primer, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp.115-138 (1984)).
[0185] Sistemi kontrolisanog oslobađanja su razmatrani u recenziji od strane Langera (1990, Science 249:1527-1533). Bilo koja tehnika koja je poznata stručnjaku se može koristiti za proizvodnju formulacija kontinuiranog oslobađanja koje sadrže jedan ili više terapeutskih agenasa pronalaska. Videti, na primer, Patent SAD broj 4,526, 938, PCT publikaciju WO 91/05548, PCT publikaciju WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.
[0186] Farmaceutska kompozicija pronalaska je formulisana tako da je kompatibilna sa svojim namenjenim načinom primene. Primeri načina primene uključuju, ali se ne ograničavaju na, parenteralnu, na primer, intravenoznu, intradermalnu, subkutanu, oralnu, intranazalnu (na primer, inhalacija), transdermalnu (na primer, topikalna), transmukozalnu i rektalnu primenu. U određenoj izvedbi, kompozicija je formulisana u skladu sa rutinskim procedurama kao farmaceutska kompozicija prilagođena za intravenoznu, subkutanu, intramuskularnu, oralnu, intranazalnu ili topikalnu primenu nad ljudima. Obično, kompozicije za intravenoznu primenu su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Tamo gde je neophodno, kompozicija može takođe uključivati agens za solubilizovanje i lokalni anestetik kao što je lignokain da olakša bol na mestu uboda.
[0187] Ukoliko metod pronalaska obuhvata intranazalnu primenu kompozicije, kompozicija se može formulisati u formi aerosoli, spreja, magle ili u formi kapi. Konkretno, profilaktički ili terapeutski agensi za upotrebu u skladu sa pronalaskom se mogu lagodno isporučiti u formi prezentacije spreja aerosoli iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, uz korišćenje odgovarajućeg propelanta (na primer, dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan, ugljen dioksid ili drugi pogodan gas). Kod slučaja aerosoli pod pritiskom dozna jedinica se može odrediti obezbeđivanjem ventila za isporuku izmerene količine. Kapsule i kertridži (sastavljeni od, na primer, želatina) za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru se mogu formulisati da sadrže mešavinu praha jedinjenja i odgovarajuću bazu praha kao što je laktoza ili skrob.
[0188] Ukoliko metod pronalaska obuhvata oralnu primenu, kompozicije se mogu formulisati oralno u formi tableta, kapsula, kašeta, gel kapica, rastvora, suspenzija i sličnih. Tablete ili kapsule se mogu pripremiti konvencionalnim načinima sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima kao što su agensi za vezivanje (na primer, preželatinizirani kukuruzni skrob, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza); punioci (na primer, laktoza, mikrokristalna celuloza ili kalcijum hidrogen fosfat); lubrikanti (na primer, magnezijum stearat, talk ili silicijum dioksid); dezintegranti (na primer, kromprirov skrob, skrob natrijum glikolata); ili agensi vlaženja (na primer, natrijum lauril sulfat). Tablete mogu biti obložene metodama koje su dobro poznate u struci. Tečni preparati za oralnu primenu mogu biti u formi, bez ograničavanja, rastvora, sirupa ili suspenzija, ili mogu biti prisutni kao suvi proizvodi za konstituciju sa vodom ili drugim pogodnim nosačem pre upotrebe. Takvi tečni preparati se mogu pripremati konvencionalnim načinima sa farmaceutski prihvatljivim aditivima kao što su agensi za suspendovanje (na primer, sorbitol sirup, derivati celuloze ili hidrogenizovane jestive masti); agensi za emulgovanje (na primer, lecitin ili akacija); nevodeni nosači (na primer, bademovo ulje, masni estri, etil alkohol ili frakcionisana biljna ulja); i konzervansi (na primer, metil ili propil-phidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparati mogu takođe sadržati pufer soli, agense arome, bojenja i zaslađivanja kao odgovarajuće. Preparati za oralnu primenu mogu biti pogodno formulisani za sporo oslobađanje, kontrolisano oslobađanje ili kontinuirano oslobađanje profilaktičkih ili terapeutskih agenasa.
[0189] Metod pronalaska može obuhvatati pulmonarnu primenu, na primer, upotrebom inhalatora ili nebulizatora, kompozicije formulisane sa aerosolnim agensom. Videti, na primer, patente SAD pod brojevima: 6,019, 968, 5,985, 320, 5, 985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540 i 4,880,078; i PCT publikacije pod brojevima WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 i WO 99/66903. U određenoj izvedbi, kompozicija pronalaska je primenjena upotrebom Alkermes AIR® tehnologije pulmonarne isporuke leka (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).
[0190] Metod pronalaska može obuhvatati primenu kompozicije formulisane za parenteralnu primenu injekcijom (na primer, bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom). Formulacije za injekciju se mogu predstaviti u jediničnoj doznoj formi (na primer, u ampulama ili višedoznim kontejnerima) sa dodatim konzervansom. Kompozicije mogu uzeti takve forme kao suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim nosačima, i mogu sadržati formulatorne agense kao što su agensi za suspendovanje, stabilizovanje i/ili dispergovanje. Alternativno, aktivni sastojak može biti u formi praška za konstituisanje sa odgovarajućim nosačem (na primer, sterilna voda bez pirogena) pre upotrebe.
[0191] Metode pronalaska mogu dodatno obuhvatati primenu kompozicija formulisanih kao depo preparati. Takve dugotrajne formulacije se mogu primeniti implantacijom (na primer, subkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Stoga, na primer, kompozicije se mogu formulisati sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili resini jonske razmene, ili kao teško rastvorljivi derivati (na primer, kao teško rastvorljiva so).
[0192] Metode pronalaska obuhvataju primenu kompozicija formulisanih kao neutralne ili slane forme. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju one formirane sa anjonima kao one dobijene iz hlorovodoničnih, fosfornih, acetatnih, oksalnih, vinskih kiselina, itd., i one formirane sa katjonima kao one dobijene iz natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, feričnih hidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina, itd.
[0193] Generalno, sastojci kompozicija se isporučuju ili odvojeno ili pomešani zajedno u jedničnoj doznoj formi, na primer, kao suv liofilizovan prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenom kontejneru kao što je ampula ili kašeta ukazujući na količinu aktivnog agensa. Tamo gde je način primene infuzija, kompozicija se može izdati sa infuzionom bočicom koja sadrži sterilnu vodu farmaceutskog kvaliteta ili fiziološki rastvor. Tamo gde je način primene injekcija, mogu se obezbediti ampula sterilne vode za injekciju ili fiziološki rastvor tako da se sastojci mogu pomešati pre primene.
[0194] Konkretno, pronalazak takođe obezbeđuje da je jedan ili više profilaktičkih ili terapeutskih agenasa, ili farmaceutskih kompozicija pronalaska upakovano u hermetički zapečaćen kontejner kao što je ampula ili kašeta ukazujući na količinu agensa. U jednoj izvedbi, jedan ili više profilaktičkih ili terapeutskih agenasa, ili farmaceutskih kompozicija pronalaska je isporučeno kao suv sterilisan liofilizovan prašak ili koncentrat bez vode u hermetički zapečaćenom kontejneru i može biti rekonstituisan (na primer, sa vodom ili fiziološkim rastvorom) na odgovarajuću koncentraciju za primenu nad subjektom. Preferirano, jedan ili više profilaktičkih ili terapeutskih agenasa ili farmaceutskih kompozicija pronalaska je isporučeno kao suv sterilan liofilizovan prah u hermetički zapečaćenom kontejneru u jedinicama doze od najmanje 5 mg, najmanje 10 mg, najmanje 15 mg, najmanje 25 mg, najmanje 35 mg, najmanje 45 mg, najmanje 50 mg, najmanje 75 mg ili najmanje 100 mg. Liofilizovani profilaktički ili terapeutski agensi ili farmaceutske kompozicije pronalaska se trebaju skladištiti na između 2° C i 8° C u svom originalnom kontejneru a profilaktički ili terapeutski agensi, ili farmaceutske kompozicije pronalaska se trebaju primeniti u roku od 1 nedelje, u roku od 5 dana, u roku od 72 sata, u roku od 48 sati, u roku od 24 sata, u roku od 12 sati, u roku od 6 sati, u roku od 5 sati, u roku do 3 sata ili u roku od 1 sata nakon rekonstitucije. U alternativnoj izvedbi, jedan ili više profilaktičkih ili terapeutskih agenasa ili farmaceutskih kompozicija pronalaska je isporučeno u tečnoj formi u hermetički zapečaćenom kontejneru ukazujući na količinu i koncentraciju agensa. Preferirano, tečna forma primenjene kompozicije je isporučena u hermetički zapečaćenom kontejneru od najmanje 0,25 mg/ml, najmanje 0,5
1
mg/ml, najmanje 1 mg/ml, najmanje 2,5 mg/ml, najmanje 5 mg/ml najmanje 8 mg/ml, najmanje 10 mg/ml, najmanje 15 mg/ml, najmanje 25 mg/ml, najmanje 50 mg/ml, najmanje 75 mg/ml ili najmanje 100 mg/ml. Tečnu formu treba skladištiti na između 2° C i 8° C u svom originalnom kontejneru.
[0195] Antitela i delovi antitela pronalaska se mogu inkorporirati u farmaceutsku kompoziciju pogodnu za parenteralnu primenu. Preferirano, antitelo ili delovi antitela će se pripremiti kao injektabilni rastvor koji sadrži 0,1-250 mg/ml antitela. Injektabilni rastvor može biti sastavljen ili od tečne ili od liofilizovane dozne forme u kremenoj ili jantarnoj bočici, ampuli ili prethodno napunjenom špricu. Pufer može biti L-histidin (1-50 mM), optimalno 5-10 mM, pri pH 5,0 do 7,0 (optimalna pH 6,0). Drugi pogodni puferi uključuju ali se ne ograničavaju na, natrijum sukcinat, natrijum citrat, natrijum fosfat ili kalijum fosfat. Natrijum hlorid se može koristiti za modifikovanje toksičnosti rastvora pri koncentraciji od 0-300 mM (optimalno 150 mM za tečnu doznu formu). Krioprotektanti se mogu uključiti za liofilizovanu doznu formu, uglavnom 0-10% saharoze (optimalno 0,5-1,0%). Drugi pogodni krioprotektanti uključuju trehalozu i laktozu. Agensi za punjenje se mogu uključiti za liofilizovanu doznu formu, obično 1-10% manitola (optimalno 2-4%). Stabilizatori se mogu koristiti i u tečnim i u liofilizovanim doznim formama, obično 1-50 mM L-metionina (optimalno 5-10 mM). Drugi pogodni agensi za punjenje uključuju glicin, arginin, mogu biti uključeni kao 0-0,05% polisorbata-80 (optimalno 0,005-0,01%). Dodatni surfaktanti uključuju ali se ne ograničavaju na polisorbat 20 i BRIJ surfaktante. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitela i delove antitela pronalaska pripremana kao injektabilni rastvor za parenteralnu primenu, može dodatno sadržati agens koristan kao ađuvans, kao oni korišćeni za povećavanje apsorpcije, ili disperzije terapeutskog proteina (na primer, antitela). Naročito koristan ađuvans je hijaluronidaza, kao što je Hylenex® (rekombinantna ljudska hijaluronidaza). Dodavanje hijaluronidaze u injektabilni rastvor poboljšava ljudsku biodostupnost nakon parenteralne primene, naročito subkutane primene. Takođe omogućuje veće zapremine mesta ubrizgavanja (to jest, veće od 1 ml) sa manje bola i nelagode, i minimalnom učestalošću reakcija na mestu uboda. (videti WO2004078140, US2006104968 ovde inkorporirano referencom).
[0196] Kompozicije pronalaska mogu biti u raznim formama. One uključuju, na primer, tečne, polučvrste i čvrste dozne forme, kao što su tečni rastvori (na primer, injektabilni i infuzibilni rastvori), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškovi, lipozomi i supozitorije. Preferirana forma zavisi od namenjenog načina primene i terapeutske aplikacije. Obično preferirane kompozicije su u formi injektabilnih ili infuzibilnih rastvora, kao što su kompozicije slične onima korišćenim za pasivnu imunizaciju ljudi sa drugim antitelima. Preferiran način primene je parenteralni (na primer, intravenozno, subkutano, intraperitonealno, intramuskularno). U poželjnoj izvedbi, antitelo je primenjeno intravenoznom infuzijom ili injekcijom. U drugoj preferiranoj izvedbi, antitelo je primenjeno intramuskularnom ili subkutanom injekcijom.
[0197] Terapeutske kompozicije obično moraju biti sterilne i stabilne pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Sterilni injektabilni rastvori se mogu pripremati inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u zahtevanu količinu u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih u prethodnom tekstu, prema potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju ikorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži bazični disperzioni medijum i zahtevane druge sastojke od onih nabrojanih u prethodnom tekstu. U slučaju sterilnih, liofilizovanih praškova za pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora, preferirane metode pripreme su sušenje vakuumom i sprejom čime se dobija prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno-filtriranog rastvora. Može se održavati odgovarajuća fluidnost, na primer, upotrebom obloga kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestice u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanta. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija se može postići uključivanjem, u kompoziciju, agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želatin.
[0198] ADC pronalaska se mogu primeniti raznim metodama poznatim u struci, iako za mnoge terapeutske aplikacije, preferiran način primene je subkutana injekcija, intravenozna injekcija ili infuzija. Stručnjak sa iskustvom će razumeti da će način primene zavisiti od željenih rezultata. U određenim izvedbama, aktivno jedinjenje se može pripremati sa nosačem koji će štititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane sisteme isporuke. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktička kiselina. Mnoge metode za pripremanje takvih formulacija su patentirane i opšte poznate stručnjacima. Videti, na primer, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0199] U određenim izvedbama, ADC pronalaska se mogu primeniti oralno, na primer, sa inertnim diluentom ili asimilabilnim jestivim nosačem. Jedinjenje (i drugi sastojci, po želji) se takođe može zatvoriti u tvrdu ili meku kapsulu želatinske ljuske, kompresovanu u tablete, ili inkorporiranu direktno u ishranu subjekta. Za oralnu terapeutsku primenu, jedinjenja mogu biti inkorporirana sa ekscipijentima i korišćena u formi jestivih tableta, bukalnih tableta, lozenga, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, oblandi i sličnih. Da bi se jedinjenje pronalaska primenilo na drugačiji način od parenteralne primene, može biti neophodno da se jedinjenje obloži sa, ili primeni zajedno sa, materijalom koji sprečava njegovu inaktivaciju.
[0200] U drugim izvedbama, ADC pronalaska se mogu konjugovati za vrste bazirane na polimeru tako da pomenute vrste bazirane na polimeru mogu dati dovoljnu veličinu navedenom antitelu ili delu antitela pronalaska tako da pomenuto antitelo ili deo antitela pronalaska ima koristi od poboljšane propusnosti retencionog efekta (EPR efekat) (videti takođe PTC publikaciju broj WO2006/042146A2 i publikacije SAD pod brojevima 2004/0028687A1, 2009/0285757A1 i 2011/0217363A1, i Patent SAD broj 7,695,719.
[0201] Suplementarno aktivna jedinjenja takođe mogu biti inkorporirana u kompozicije. U određenim izvedbama, ADC pronalaska je formulisan sa i/ili zajedno primenjen sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa koji su korisni za tretiranje poremećaja kod kojih je aktivnost B7-H3 detrimentalna. Na primer, ADC pronalaska se može formulisati i/ili zajedno primeniti sa jednim ili više dodatnih antitela koja vezuju druge ciljeve (na primer, antitela koja vezuju
2
citokine ili koja vezuju molekule ćelijske površine). Dalje, jedno ili više antitela pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa dva ili više prethodno pomenuta terapeutska agensa. Takve kombinacione terapije mogu kao prednost koristiti manje doze primenjenih terapeutskih agenasa, time izbegavajući moguće toksičnosti ili komplikacije povezane sa raznim monoterapijama.
[0202] U određenim izvedbama, ADC do B7-H3 ili njegovog fragmenta je povezan sa nosačem koji produžava poluživot koji je poznat u struci. Takvi nosači uključuju, ali se ne ograničavaju na, Fc domen, polietilen glikol i dekstran. Takvi nosači su opisani, na primer, u Aplikaciji SAD serijskog broja 09/428,082 i objavljenoj PCT aplikaciji broj WO 99/25044.
PRIMERI
Primer 1: Sinteza primernih inhibitora Bcl-xL
[0203] Ovaj primer obezbeđuje sintetičke metode za primerna Bcl-xL inhibitorna jedinjenja. Inhibitori Bcl-xL i sintoni su nazvani korišćenjem ACD/naziv 2014 izdanje (Build 56084, 05 April 2012, Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Ontario), ACD/Name 2014 release (Build 66687, 25 October 2013, Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Ontario), ChemDraw® Ver. 9.0.7 (CambridgeSoft, Cambridge, MA), ChemDraw® Ultra Ver. 12.0 (CambridgeSoft, Cambridge, MA), ili ChemDraw® Professional Ver.15.0.0.106. Inhibitor Bcl-xL i sinton intermedijeri su nazvani sa ACD/Name 2012 izdanjem (Build 56084, 05 April 2012, Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Ontario), ACD/Name 2014 release (Build 66687, 25 October 2013, Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Ontario), ChemDraw® Ver. 9.0.7 (CambridgeSoft, Cambridge, MA), ChemDraw® Ultra Ver. 12.0 (CambridgeSoft, Cambridge, MA) ili ChemDraw® Professional Ver.15.0.0.106.
1.1.1 3-bromo-5,7-dimetiladamantankarboksilna kiselina
[0204] U bocu od 50 mL sa okruglim dnom na 0 °C je dodat bromin (16 mL). Dodato je gvožđe u prahu (7 g) i reakcija je mešana na 0 °C 30 minuta. Dodat je 3,5-dimetiladamantan-1-karboksilna kiselina (12 g). Smeša je zagrejana na sobnu temperaturu i mešana 3 dana. Mešavina leda i koncentrovanog HCl je sipana u reakcionu smešu. Dobijena suspenzija je tretirana dva puta sa Na2SO3(50 g u 200 mL vode) i ekstraktovana tri puta sa dihlorometanom. Spojene organske materije su isprane sa IN vodenim HCl, isušene nad natrijum sulfatom, filtrirane i koncentrovane kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
1.1.2 3-bromo-5,7-dimetiladamantanmetanol
[0205] Rastvoru Primera 1.1.1 (15,4 g) u tetrahidrofuranu (200 mL) je dodat BH3(1M u tetrahidrofuranu, 150 mL), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša je zatim pažljivo gašena dodavanjem metanola ukapavanjem. Smeša je zatim koncentrovana pod vakuumom i ostatak je izbalansiran između etil acetata (500 mL) i 2N vodenog HCl (100 mL). Vodeni sloj je dalje ekstraktovan dva puta sa etil acetatom i spojeni organski ekstrakti su isprani sa vodom i fiziološkim rastvorom, isušeni nad natrijum sulfatom i filtrirani. Uparavanjem rastvarača je dobijeno naslovno jedinjenje.
1.1.3 1-((3-bromo-5,7-dimetiltriciklo[3.3.1.13,7]dek-1-il)metil)-1H-pirazol
[0206] Rastvoru Primera 1.1.2 (8,0 g) u toluenu (60 mL) je dodat 1H-pirazol (1,55 g) i cijanometilentributilfosforan (2,0 g), i smeša je mešana na 90 °C tokom noći. Reakciona smeša je koncentrovana, i ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (10:1 heptan:etil acetat) kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 324,2 (M+H)<+>.
1.1.4 2-{[3,5-dimetil-7-(1H-pirazol-1-ilmetil)triciklo[3.3.1.13,7] dek-1-il]oksi}etanol
[0207] Rastvoru Primera 1.1.3 (4,0 g) u etan-1,2-diolu (12 mL) je dodat trietilamin (3 mL). Smeša je mešana na 150 °C pod mikrotalasnim uslovima (Biotage Initiator) tokom 45 minuta. Smeša je sipana u vodu (100 mL) i ekstraktovana tri puta sa etil acetatom. Spojeni organski ekstrakti su isprani sa vodom i slanim rastvorom, isušeni nad natrijum sulfatom i filtrirani. Uparavanjem rastvarača je dobijen ostatak koji je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa 20% etil acetata u heptanu, a zatim sa 5% metanola u dihlorometanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 305,2 (M+H)<+>.
1.1.5 2-({3,5-dimetil-7-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]triciklo[3.3.1.13,7]dek-1-il}oksi)etanol
[0208] Ohlađenom (-78 °C) rastvoru Primera 1.1.4 (6,05 g) u tetrahidrofuranu (100 mL) je dodat n-BuLi (40 mL, 2,5M u heksanu), i smeša je mešana na -78 °C sat i po vremena. Jodometan (10 mL) je dodat špricem, i smeša je mešana na -78 °C tokom 3 sata. Reakciona smeša je zatim ugašena sa vodenim NH4Cl i ekstraktovana dva puta sa etil acetatom, a spojeni organski ekstrakti su isprani sa vodom i slanim rastvorom. Nakon sušenja nad natrium sulfatom, rastvor je filtriran i koncentrovan, a ostatak je prečišćen kolonskom hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa 5% metanola u dihlorometanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 319,5 (M+H)<+>.
1.1.6 1-({3,5-dimetil-7-[2-(hidroksi)etoksi]triciklo [3.3.1.13,7]dek-1-il}metil)-4-jodo-5-metil-1H-pirazol
[0209] Rastvoru Primera 1.1.5 (3,5 g) u N,N-dimetilformamidu (30 mL) je dodat N-jodosukcinimid (3,2 g) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom sat i po vremena. Reakciona smeša je razblažena sa etil acetatom (600 mL) i isprana sa vodenim NaHSO3, vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pristikom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa 20% etil acetata u dihlorometanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 445,3 (M+H)<+>.
1.1.9 6-fluoro-3-bromopikolinska kiselina
[0210] Talog 6-amino-3-bromopikolinska kiselina (25 g) u 400 mL 1:1 dihlorometan/hloroform je dodavan nitrozonijum tetrafluoroboratu (18,2 g) u dihlorometanu (100 mL) na 5 °C tokom 1 sata. Dobijena smeša je mešana dodatnih 30 minuta a zatim zagrejana na 35 °C i mešana preko noći. Reakcija je ohlađena na sobnu temperaturu i zatim prilagođena na pH 4 sa vodenim NaH2PO4rastvorom. Dobijen rastvor je ekstraktovan tri puta sa dihlorometanom, i spojeni ekstrakti su isprani sa slanim rastvorom, isušeni nad natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
1.1.10 Terc-butil 3-bromo-6-fluoropikolinat
[0211] Para-toluensulfonil hlorid (27,6 g) je dodat rastvoru Primera 1.1.9 (14,5 g) a piridin (26,7 mL) u dihlorometanu (100 mL) i terc-butanol (80 mL) na 0 °C. Reakcija je mešana 15 minuta nakon čega je zagrejana na sobnu temperaturu i mešana tokom noći. Rastvor je koncentrovan i podeljen na etil acetat i vodeni Na2CO3rastvor. Slojevi su razdvojeni, vodeni sloj je ekstraktovan sa etil acetatom. Organski slojevi su spojeni, isprani sa vodenim Na2CO3rastvorom i slanim rastvorom, isušeni nad natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
1.1.11 metil 2-(5-bromo-6-(terc-butoksikarbonil)piridin-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-8-karboksilat
[0212] Rastvoru metil 1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-8-karboksilat hidrohlorid (12,37 g) i Primeru 1.1.10 (15 g) u dimetil sulfoksidu (100 mL) je dodat N,N-diizopropiletilamin (12 mL), i smeša je mešana na 50 °C tokom 24 sata. Smeša je zatim razblažena sa etil acetatom (500 mL) i isprana sa vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa 20% etil acetata u heksanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 448,4 (M+H)<+>.
1.2.1 metil 2-(6-(terc-butoksikarbonil)-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)piridin-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-8-karboksilat
[0213] Rastvoru Primera 1.1.11 (2,25 g) i [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijum(II) (205 mg) u acetonitrilu (30 mL) je dodat trietilamin (3 mL) i pinakolboran (2 mL), i smeša je mešana na refluksu 3 sata. Smeša je razblažena sa etil acetatom (200 mL) i isprana sa vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Prečišćavanjem ostatka hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa 20% etil acetata u heksanu, je dobijeno naslovno jedinjenje.
1.2.2 metil 2-(6-(terc-butoksikarbonil)-5-(1-((3-(2-hidroksietoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)piridin-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-8-karboksilat
[0214] Rastvoru Primera 1.2.1 (2,25 g) u tetrahidrofuranu (30 mL) i vodi (10 mL) su dodati Primer 1.1.6 (2,0 g), 1,3,5,7-tetrametil-6-fenil-2,4,8-trioksa-6-fosfaadamantan (329 mg), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (206 mg) i tribazni kalijum fosfat (4,78 g). Smeša je refluksovana tokom noći, ohlađena i razblažena sa etil acetatom (500 mL). Dobijena smeša je isprana sa vodom i slanim rastvorom, i organski sloj je isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom, eluiranjem sa 20% etil acetata u heptanima a zatim sa 5% metanola u dihlorometanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
1.2.3 metil 2-(6-(terc-butoksikarbonil)-5-(1-((3,5-dimetil-7-(2-((metilsulfonil)oksi)etoksi)adamantan-1- il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)piridin-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-8-karboksilat
[0215] Hladnom rastvoru Primera 1.2.2 (3,32 g) u dihlorometanu (100 mL) u ledenoj kadi su sekvencijalno dodati trietilamin (3 mL) i metansulfonil hlorid (1,1 g). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi sat i po vremena i razblažena sa etil acetatom, i isprana sa vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
1.2.4 metil 2-(5-(1-((3-(2-azidoetoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)-6-(tertbutoksikarbonil)piridin-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-8-karboksilat
[0216] Rastvoru Primera 1.2.3 (16,5 g) u N,N-dimetilformamidu (120 mL) je dodat natrijum azid (4,22 g). Smeša je zagrevana na 80 °C tokom 3 sata, ohlađena, razblažena sa etil acetatom i isprana sa vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom, eluiranjem sa 20% etil acetata u heptanima, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
4
1.2.5 2-(5-(1-((3-(2-azidoetoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)-6-(tercbutoksikarbonil)piridin-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-8-karboksilna kiselina
[0217] Rastvoru Primera 1.2.4 (10 g) u smeši tetrahidrofuran (60 mL), metanol (30 mL) i voda (30 mL) je dodat litijum hidroksid monohidrat (1,2 g). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći i neutralizovana sa 2% vodenog HCl. Dobijena smeša je koncentrovana, a ostatak je rastvoren u etil acetatu (800 mL) i ispran sa slanim rastvorom. Organski sloj je isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
1.2.6 terc-butil 3-(1-((3-(2-azidoetoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)- 6-(8-(benzo[d]tiazol-2-ilkarbamoil)-3,4-dihidroizohinolin-2(1H)-il)pikolinat
[0218] Smeša Primera 1.2.5 (10 g), benzo[d]tiazol-2-amin (3,24 g), fluoro-N,N,N’,N’-tetrametilformamidinijum heksafluorofosfat (5,69 g) i N,N-diizopropiletilamin (5,57 g) u N,N-dimetilformamidu (20 mL) je zagrevana na 60 °C tokom 3 sata, ohlađena i razblažena sa etil acetatom. Dobijena smeša je isprana sa vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom, eluiranjem sa 20% etil acetata u dihlorometanu kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
1.2.7 terc-butil 3-(1-((3-(2-aminoetoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)- 6-(8-(benzo[d]tiazol-2-ilkarbamoil)-3,4-dihidroizohinolin-2(1H)-il)pikolinat
[0219] Rastvoru Primera 1.2.6 (2,0 g) u tetrahidrofuranu (30 mL) je dodat Pd/C (10%, 200 mg). Smeša je mešana pod atmosferom vodonika tokom noći. Nerastvorljiv materijal je isfiltriran i filtrat je koncentrovan kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
1.2.8 terc-butil 6-[8-(1,3-benzotiazol-2-ilkarbamoil)-3,4-dihidroizohinolin-2(1H)-il]-3-[1-({3,5-dimetil7-[(2,2,7,7-tetrametil-10,10-dioksido-3,3-difenil-4,9-dioksa-10λ<6>-tia-13-aza-3-silapentadekan-15-il)oksi]triciklo[3.3.1.13,7]dek-1-il}metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il]piridin-2-karboksilat
[0220] Rastvoru Primera 1.2.7 (500 mg) u N,N-dimetilformamidu (8 mL) je dodat 4-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-dimetilbutil etensulfonat (334 mg). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći i metilamin (0,3 mL) je dodat da bi se ugasila reakcija. Dobijena smeša je mešana 20 minuta i prečišćena reverzno faznom hromatografijom korišćenjem Analogix sistema (C18 kolona), eluiranjem sa 50-100% acetonitrila u vodi koja sadrži 0,1% v/v trifluoroacetatne kiseline, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
1.2.9 6-[8-(1,3-benzotiazol-2-ilkarbamoil)-3,4-dihidroizohinolin-2(1H)-il]-3-{1-[(3,5-dimetil-7-{2-[(2-sulfoetil)amino]etoksiltriciklo[3.3.1.13,7]dek-1-il)metil]-5-metil-1H-pirazol-4-il}piridin-2-karboksilna kiselina
[0221] Primer 1.2.8 (200 mg) u dihlorometanu (5 mL) je tretiran sa trifluoroacetatnom kiselinom (2,5 mL) tokom noći. Reakciona smeša je koncentrovana i prečišćena reverzno faznom hromatografijom (C18 kolona), eluiranjem sa 20-60% acetonitrila u vodi koja sadrži 0,1% v/v trifluoroacetatne kiseline, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.<1>H NMR (500 MHz, dimetil sulfoksid-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 8,32 (s, 2H), 8,02 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,51 (d, 1H), 7,40-7,49 (m, 2H), 7,31-7,39 (m, 2H), 7,27 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 4,94 (s, 2H), 3,87 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,15-3,25 (m, 2H), 3,03-3,13 (m, 2H), 3,00 (t, 2H), 2,79 (t, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,39 (s, 2H), 1,22-1,34 (m, 4H), 0,94-1,18 (m, 6H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) m/e 854,1 (M+H)<+>.
1.20.1 2-((3,5-dimetil-7-((5-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-il)metil)adamantan-1-il)oksi)etanol
[0222] Rastvoru Primera 1.1.6 (9 g) i [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijum(II) dihlorometan (827 mg) u acetonitrilu (60 mL) je dodat trietilamin (10 mL) i pinakolboran (6 mL). Smeša je mešana na refluksu tokom noći, ohlađena i korišćena direktno u sledećem koraku. MS (ESI) m/e 445,4 (M+H)<+>
1.20.2 terc-butil 6-hloro-3-(1-((3-(2-hidroksietoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol4-il)pikolinat
[0223] Rastvoru terc-butil 3-bromo-6-hloropikolinat (5,92 g) u tetrahidrofuranu (60 mL) i vodi (30 mL) je dodat sirov Primer 1.20.1 (4,44 g), 1,3,5,7-tetrametil-6-fenil-2,4,8-trioksa-6-fosfaadamant (1,5 g), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (927 mg) i K3PO4(22 g). Smeša je mešana na refluksu tokom noći, ohlađena, razblažena sa etil acetatom (800 mL) i isprana sa vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom, eluiranjem sa 20% etil acetata u heptanu a zatim sa 5% metanola u dihlorometanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 531,1 (M+H)<+>.
1.43.1 terc-butil 3-(1-((3-(2-hidroksietoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)- 6-(8-(metoksikarbonil)naftalen-2-il)pikolinat
[0224] Rastvoru metil 7-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1-naftoat (2,47 g) u 1,4-dioksanu (40 mL) i vodi (20 mL) je dodat Primer 1.20.2 (4,2 g), bis(trifenilfosfin)paladijum(II)dihlorid (556 mg) i cezijum fluorid (3,61 g), i reakcija je mešana na refluksu tokom noći. Smeša je razblažena sa etil acetatom (400 mL) i isprana sa vodom i slanim rastvorom, i isušena nad natrijum sulfatom. Filtracija i evaporacija rastvarača je dala ostatak koji je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa 20% etil acetata u heptanu a zatim sa 5% metanola u dihlorometanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 680,7 (M+H)<+>.
1.43.2 terc-butil 3-(1-((3,5-dimetil-7-(2-((metilsulfonil)oksi)etoksi)adamantan-1-il)metil)-5-metil-1Hpirazol-4-il)-6-(8-(metoksikarbonil)naftalen-2-il)pikolinat
[0225] Ohlađenom (0 °C) rastvoru Primera 1.43.1 (725 mg) u dihlorometanu (10 mL) i trietilaminu (0,5 mL) je dodat metansulfonil hlorid (0,249 mL), i smeša je mešana 4 sata. Reakciona smeša je razblažena sa etil acetatom (200 mL) i isprana sa vodom i slanim rastvorom, i isušena nad natrijum sulfatom. Filtracija i evaporacija rastvarača je dala naslovni proizvod, koji je korišćen u sledećoj reakciji bez dodatnog prečišćavanja. MS (ESI) m/e 759,9 (M+H)<+>.
1.43.3 terc-butil 3-(1-(((3-(2-azidoetoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)- 6-(8-(metoksikarbonil)naftalen-2-il)pikolinat
[0226] Rastvoru Primera 1.43.2 (4,2 g) u N,N-dimetilformamidu (30 mL) je dodat natrijum azid (1,22 g), i smeša je mešana tokom 96 sati. Reakciona smeša je razblažena sa etil acetatom (600 mL), isprana sa vodom i slanim rastvorom, i isušena nad natrijum sulfatom. Filtracija i evaporacija rastvarača je dala naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 705,8 (M+H)<+>.
1.43.4 7-(5-(1-((3-(2-azidoetoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)-6-(tercbutoksikarbonil)piridin-2-il)-1-naftoična kiselina
[0227] Rastvoru Primera 1.43.3 (3,5 g) u tetrahidrofuran/metanol/vodi (2:1:1, 30 mL) je dodat litijum hidroksid monohidrat (1,2 g), i smeša je mešana tokom noći. Reakciona smeša je zakiseljena sa 1N vodenog HCl i razblažena sa etil acetatom (600 mL), isprana sa vodom i slanim rastvorom, i isušena nad natrijum sulfatom. Filtracija i evaporacija rastvarača je dala naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 691,8 (M+H)<+>
1.43.5 terc-butil 3-(1-((3-(2-azidoetoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)- 6-(8-(benzo[d]tiazol-2-ilkarbamoil)naftalen-2-il)pikolinat
[0228] Rastvoru Primera 1.43.4 (870 mg) u N,N-dimetilformamidu (10 mL) su dodati benzo[d]tiazol-2-amin (284 mg), fluoro-N,N,N’,N’- tetrametilformamidinijum heksafluorofosfat (499 mg) i N,N-diizopropiletilamin (488 mg). Smeša je mešana na 60 °C tokom 3 sata. Reakciona smeša je razblažena sa etil acetatom (200 mL) i isprana sa vodom i slanim rastvorom, i isušena nad natrijum sulfatom. Filtracijom i evaporacijom rastvarača je dobijeno naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 824,1 (M+H)<+>.
1.43.6 terc-butil 3-(1-((3-(2-aminoetoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)- 6-(8-(benzo[d]tiazol-2-ilkarbamoil)naftalen-2-il)pikolinat
[0229] Rastvoru Primera 1.43.5 (890 mg) u tetrahidrofuranu (30 mL) je dodat Pd/C (90 mg). Smeša je mešana pod 1 atmosferom vodonika tokom noći. Reakciona smeša je filtrirana, i katalizator je ispran sa etil acetatom. Rastvarač je uparen kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 798,1 (M+H)<+>.
1.43.7 6-[8-(1,3-benzotiazol-2-ilkarbamoil)naftalen-2-il]-3-{1-[(3,5-dimetil-7-{2-[(2-sulfoetil)amino]etoksi}triciklo[3.3.1.13,7]dek-1-il)metil]-5-metil-1H-pirazol-4-il}piridin-2-karboksilna kiselina
[0230] Rastvoru Primera 1.43.6 (189 mg) u N,N-dimetilformamidu (6 mL) je dodat 4-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-dimetilbutil etensulfonat (106 mg). Smeša je mešana 4 dana. Smeša je razblažena sa etil acetatom (300 mL) i isprana sa vodom i slanim rastvorom i isušena nad natrijum sulfatom. Nakon filtracije i evaporacije rastvarača, ostatak je rastvoren u trifluoroacetatnoj kiselini (10 mL) i zasićen tokom noći. Trifluoroacetatna kiselina je uparena pod vakuumom i ostatak je rastvoren u dimetil sulfoksid/metanolu (1:1, 6 mL). Smeša je prečišćena reverzno faznom HPLC (Gilson sistem), eluiranjem sa 10-85% acetonitrila u vodi koja sadrži 0,1% v/v trifluoroacetatnu kiselinu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.<1>H NMR (400 MHz, dimetil sulfoksid-d6) δ ppm 13,09 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 8,31-8,43 (m, 3H), 8,16-8,26 (m, 3H), 7,93-8,08 (m, 3H), 7,82 (d, 1H), 7,66-7,75 (m, 1H), 7,46-7,55 (m, 2H), 7,37 (t, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,17-3,28 (m, 2H), 3,07-3,16 (m, 2H), 2,82 (t, 2H), 2,24 (s, 3H), 1,44 (s, 2H), 0,99-1,37 (m, 12H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) m/e 849,1 (M+H)<+>.
1.85 Sinteza 6-[8-(1,3-benzotiazol-2-ilkarbamoil)-3,4-dihidroizohinolin-2(1H)-il]-3-(1-{[3-(2-{[(3S)-3,4-dihidroksibutil]amino}etoksi)-5,7-dimetiltriciklo[3.3.1.13,7]dek-1-il]metil}-5-metil-1H-pirazol-4-il)piridin-2-karboksilna kiselina (W2.85)
[0231] Rastvoru Primera 1.2.7 (213 mg) u dihlorometanu (2 mL) je dodat (S)-2-(2,2-dimetil-1,3-dioksolan4-il)acetaldehid (42 mg). Nakon mešanja na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, dodat je natrijum triacetoksiborohidrid (144 mg). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći. Dodata je trifluoroacetatna kiselina (2 mL) i mešanje je nastavljeno tokom noći. Reakciona smeša je koncentrovana i ostatak je prečišćen reverzno faznom HPLC upotrebom Gilson sistema, eluiranjem sa 5-85% acetonitrila u vodi koja sadrži 0,1% v/v trifluoroacetatne kiseline. Željene frakcije su spojene isušene zamrzavanjem kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.<1>H NMR (400 MHz, dimetil sulfoksid-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 8,22 (d, 2H), 8,05 - 8,01 (m, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,53 - 7,41 (m, 3H), 7,36 (td, 2H), 7,28 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 4,95 (s, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,26 - 2,94 (m, 7H), 2,10 (s, 3H), 1,84 - 1,75 (m, 1H), 1,52-1,63 (m, 1H), 1,45 - 1,23 (m, 6H), 1,19 - 0,96 (m, 7H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) m/e 834,3 (M+H)<+>.
Primer 2: Sinteza primernih sintona
[0232] Ovaj primer obezbeđuje sintetičke metode za primerne sintone korisne za pravljenje ADC.
2.49.1 3-(1-(((1r,3r)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi)karbonil) (2-sulfoetil)amino)etoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)-6-(8-(benzo[d]tiazol-2-ilkarbamoil)-3,4-dihidroizohinolin-2(1H)-il)pikolinska kiselina
[0233] Rastvor Primera 1.2.9 (0,045 g) (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-((((4-nitrofenoksi)karbonil)oksi)metil)fenil)amino)-1-okso-5-ureidopentan-2-il)amino)-1-oksobutan-2-il)karbamat (0,043 g) i N,N-diizopropiletilamin (0,041 mL) su mešani zajedno u N,N-dimetilformamidu (1 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon mešanja tokom noći, reakciji je dodat dietilamin (0,024 mL) i mešanje je nastavljeno tokom 2 sata. Reakcija je ugašena sa trifluoroacetatnom kiselinom a zatim prečišćena reverzno faznom HPLC upotrebom Gilson sistema, eluiranjem sa 10-75% acetonitrila u vodi koja sadrži 0,1% v/v trifluoroacetatne kiseline. Željene frakcije su spojene i isušene smrzavanjem kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
2.119.1 (3R,7aS)-3-feniltetrahidropirolo[1,2-c]oksazol-5(3H)-jedno
[0234] Smeša (S)-5-(hidroksimetil)pirolidin-2-jedno (25g), benzaldehid (25,5g) i para-toluensulfonska kiselina monohidrat (0,50 g) u toluenu (300 mL) je zagrevana do refluksa korišćenjem Dean-Stark trap ispod cevi za sušenje tokom 16 sati. Reakcija je ohlađena na sobnu temperaturu i rastvarač je proceđen iz nerastvorljivih materijala. Organski sloj je ispran sa zasićenim vodenom smešom natrijum bikarbonata (2x) i slanim rastvorom (1x). Organski sloj je isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa 35/65 heptan/etil acetat, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (DCI) m/e 204,0 (M+H)<+>.
2.119.2 (3R,6R,7aS)-6-bromo-3-feniltetrahidropirolo[1,2-c]oksazol-5(3H)-jedno
[0235] Hladnoj (-77 °C) smeši Primera 2.119.1 (44,6 g) u tetrahidrofuranu (670 mL) je ukapavanjem dodavan litijum bis(trimetilsilil)amid (1,0M u heksanima, 250 mL) tokom 40 minuta, održavajući Trxn< -73 °C. Reakcija je mešana na -77 °C 2 sata i ukapavanjem je dodavan bromin (12,5 mL) tokom 20 minuta, održavajući Trxn< -64 °C. Reakcija je mešana na -77 °C tokom 75 minuta i ugašena je dodavanjem 150 mL hladne smeše 10% vodeni natrijum tiosulfata reakciji od -77 °C. Reakcija je zagrejana na sobnu temperaturu i podeljena na smešu poluzasićenog vodenog amonijum hlorida i etil acetat. Slojevi su razdvojeni, i organski sloj je ispran sa vodom i slanim rastvorom, isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa gradijentom od 80/20, 75/25 i 70/30 heptan/etil acetat kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (DCI) m/e 299,0 i 301,0 (M+NH3+H)<+>.
2.119.4 (3R,6S,7aS)-6-azido-3-feniltetrahidropirolo[1,2-c]oksazol-5(3H)-jedno
[0236] Smeši Primera 2.119.2 (19,3 g) u N,N-dimetilformamidu (100 mL) je dodat natrijum azid (13,5 g). Reakcija je zagrevana do 60 °C tokom 2 i po sata. Reakcija je ohlađena na sobnu temperaturu i ugašena dodavanjem vode (500 mL) i etil acetata (200 mL). Slojevi su razdvojeni i organski sloj je ispran sa slanim rastvorom. Spojeni vodeni slojevi su povratno ekstraktovani sa etil acetatom (50 mL). Spojeni organski slojevi su isušeni nad natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa 78/22 heptan/etil acetat, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (DCI) m/e 262,0 (M+NH3+H)<+>.
2.119.5 (3R,6S,7aS)-6-amino-3-feniltetrahidropirolo[1,2-c]oksazol-5(3H)-jedno
[0237] Smeši Primera 2.119.4 (13,5 g) u tetrahidrofuranu (500 mL) i vodi (50 mL) je dodat trifenilfosfin (55 g) podržan polimerom. Reakcija je mehanički mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Reakcija je filtrirana kroz dijatomejsku zemlju, eluiranjem sa etil acetatom i toluenom. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, rastvorena u dihlorometanu (100 mL), isušena natrijum sulfatom, zatim filtrirana i koncentrovana kako bi se dobilo naslovno jedinjenje, koje je korišćeno u kasnijem koraku bez daljeg prečišćavanja. MS (DCI) m/e 219,0 (M+H)<+>.
2.119.6 (3R,6S,7aS)-6-(dibenzilamino)-3-feniltetrahidropirolo[1,2-c] oksazol-5(3H)-jedno
[0238] Smeši Primera 2.119.5 (11,3 g) u N,N-dimetilformamidu (100 mL) su dodati kalijum karbonat (7,0 g), kalijum jodid (4,2 g) i benzil bromid (14,5 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći i ugašena dodavanjem vode i etil acetata. Slojevi su razdvojeni, i organski sloj je ispran sa slanim rastvorom. Spojeni vodeni slojevi su povratno ekstraktovani sa etil acetatom. Spojeni organski slojevi su isušeni sa natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa gradijentom od 10 do 15% etil acetata u heptanu kako bi se dobila čvrsta supstanca koja je triturisana sa heptanom kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (DCI) m/e 399,1 (M+H)<+>
2.119.7 (3S,5S)-3-(dibenzilamino)-5-(hidroksimetil)pirolidin-2-jedno
[0239] Smeši Primera 2.119.6 (13 g) u tetrahidrofuranu (130 mL) su dodati paratoluen sulfonska kiselina monohidrat (12,4 g) i voda (50 mL), i reakcija je zagrevana do 65 °C tokom 6 dana. Reakcija je ohlađena na sobnu temperaturu i ugašena dodavanjem zasićenog vodenog natrijum bikarbonata i etil acetata. Slojevi su razdvojeni, i organski sloj je ispran sa slanim rastvorom. Spojeni vodeni slojevi su povratno ekstraktovani sa etil acetatom. Spojeni organski slojevi su isušeni natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Voštane čvrste supstance su triturisane sa heptanom (150 mL) kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (DCI) m/e 311,1 (M+H)<+>.
2.119.8 (3S,5S)-5-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-3-(dibenzilamino)pirolidin-2-jedno
[0240] Smeši Primera 2.119.7 (9,3 g) i 1H-imidazol (2,2 g) u N,N-dimetilformamidu je dodat tercbutilhlorodimetilsilan (11,2 mL, 50 masenog % u toluenu) i reakciona smeša je mešana tokom noći. Reakciona smeša je ugašena dodavanjem vode i etil etra. Slojevi su razdvojeni, organski sloj je ispran sa slanim rastvorom. Spojeni vodeni slojevi su povratno ekstraktovani sa dietil etrom. Spojeni organski slojevi su isušeni natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa 35% etil acetata u heptanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (DCI) m/e 425,1 (M+H)<+>.
2.119.9 terc-butil 2-((3S,5S)-5-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-3-(dibenzilamino)-2-oksopirolidin-1-il)acetat [0241] Hladnoj (0 °C) smeši Primera 2.119.8 (4,5 g) u tetrahidrofuranu (45 mL) je dodat 95% natrijum hidrid (320 mg) u dva dela. Hladna smeša je mešana 40 minuta i dodat je terc-butil 2-bromoacetat (3,2 mL). Reakcija je zagrejana na sobnu temperaturu i mešana tokom noći. Reakcija je ugašena dodavanjem vode i etil acetata. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je ispran sa slanim rastvorom. Spojeni vodeni slojevi su povratno ekstraktovani sa etil acetatom. Spojeni organski slojevi su isušeni nad natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa gradijentom od 5-12% etil acetata u heptanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (DCI) m/e 539,2 (M+H)<+>.
2.119.10 terc-butil 2-((3S,5S)-3-(dibenzilamino)-5-(hidroksimetil)-2-oksopirolidin-1-il)acetat
[0242] Smeši Primera 2.119.9 (5,3 g) u tetrahidrofuranu (25 mL) je dodat tetrabutilammonijum fluorid (11 mL, 1,0M u 95/5 tetrahidrofuran/voda). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi sat vremena a zatim je ugašena dodavanjem smeše zasićenog vodenog amonijum hlorida, vode i etil acetata. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je ispran sa slanim rastvorom. Spojeni vodeni slojevi su povratno ekstraktovani sa etil acetatom. Spojeni organski slojevi su isušeni natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa 35% etil acetata u heptanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (DCI) m/e 425,1 (M+H)<+>.
2.119.11 terc-butil 2-((3S,5S)-5-((2-((4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2,2-dimetilbutoksi)sulfonil)etoksi)metil)-3-(dibenzilamino)-2-oksopirolidin-1-il)acetat
[0243] Smeši Primera 2.119.10 (4,7 g) u dimetil sulfoksidu (14 mL) je dodata smeša 4-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-dimetilbutil etensulfonat (14,5 g) u dimetil sulfoksidu (14 mL). Dodati su kalijum karbonat (2,6 g) i voda (28 mL) i reakcija je zagrevana na 60 °C pod azotom tokom jednog dana. Reakcija je ohlađena na sobnu temperaturu a zatim ugašena dodavanjem smeše slanog rastvora, vode i dietil etra. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je ispran sa slanim rastvorom. Spojeni vodeni slojevi su povratno ekstraktovani sa dietil etrom. Spojeni organski slojevi su isušeni sa natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pristikom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa gradijentom od 15-25% etil acetata u heptanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI+) m/e 871,2 (M+H)<+>.
2.119.12 terc-butil 2-((3S,5S)-3-amino-5-((2-((4-((tertbutildimetilsilil)oksi)-2,2-dimetilbutoksi)sulfonil)etoksi)metil)-2-oksopirolidin-1-il)acetat
[0244] Primer 2.119.11 (873 mg) je rastvoren u etil acetatu (5 mL) i metanolu (15 mL) i dodat je paladijum hidroksid na ugljeniku, 20% od wt (180 mg). Reakciona smeša je mešana pod atmosferom vodonika (30 psi) na sobnoj temperaturi tokom 30 sati, a zatim na 50 °C tokom jednog sata. Reakcija je ohlađena na sobnu temperaturu, filtrirana i koncentrovana kako bi se dobio željeni proizvod. MS (ESI+) m/e 691,0 (M+H)<+>.
2.119.13 4-(((3S,5S)-1-(2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)-5-((2-((4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2,2-dimetilbutoksi)sulfonil)etoksi)metil)-2-oksopirolidin-3-il)amino)-4-oksobut-2-enoična kiselina
[0245] Maleinski anhidrid (100 mg) je rastvoren u dihlorometanu (0,90 mL) i smeša Primera 2.119.12 (650 mg) u dihlorometanu (0,90 mL) je dodata ukapavanjem a zatim zagrevana na 40 °C tokom 2 sata. Reakciona smeša je direktno prečišćena hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa gradijentom od 1,0-2,5% metanola u dihlorometanu koji sadrži 0,2% acetatne kiseline. Nakon koncentrovanja frakcija koje nose proizvod, dodat je toluen (10 mL) i smeša je ponovo koncentrovana kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI-) m/e 787,3 (M-H)<->.
2.119.14 terc-butil 2-((3S,5S)-5-((2-((4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2,2-dimetilbutoksi)sulfonil)etoksi)metil)-3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-2-oksopirolidin-1-il)acetat
[0246] Primer 2.119.13 (560 mg) je zamućen u toluenu (7 mL) i dodati su trietilamin (220 mL) i natrijum sulfat (525 mg). Reakcija je zagrevana na refluksu pod atmosferom azota 6 sati i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći. Reakcija je filtrirana i čvrste supstance su isprane sa etil acetatom. Eluent je koncentrovan pod redukovanim pritiskom i ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa 45/55 heptana/etil acetata kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
2.119.15 2-((3S,5S)-3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-2-okso-5-((2-sulfoetoksi)metil)pirolidin-1-il)acetatna kiselina
[0247] Primer 2.119.14 (1,2 g) je rastvoren u trifluoroacetatnoj kiselini (15 mL) i zagrevan do 65-70 °C pod azotom tokom noći. Trifluoroacetatna kiselina je uklonjena pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u acetonitrilu (2,5 mL) i prečišćen preparativnom reverzno faznom tečnom hromatografijom na Luna C18(2) AXIA koloni (250 x 50 mm, 10mm veličina čestice) korišćenjem gradijenta od 5-75% acetonitrila koji sadrži 0,1% trifluoroacetatne kiseline u vodi tokom 30 minuta, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI-) m/e 375,2 (M-H)<->.
2.119.16 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi)karbonil)(2-sulfoetil)amino)etoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)-6-(8-(benzo[d]tiazol-2-ilkarbamoil)naftalen-2-il)pikolinska kiselina
[0248] Naslovno jedinjenje je pripremano supstituisanjem Primera 1.43.7 sa Primerom 1.2.9 u Primeru 2.49.1. MS (ESI-) m/e 1252,4 (M-H)<->.
2.119.17 N-({(3S,5S)-3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-2-okso-5-[(2-sulfoetoksi)metil]pirolidin-1- il}acetil)-L-valil-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-benzotiazol-2-ilkarbamoil)naftalen-2-il]-2-karboksipiridin-3-il}-5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-5,7-dimetiltriciklo[3.3.1.13,7]dek-1-il}oksi)etil](2-sulfoetil)karbamoil}oksi)metil]fenil}-N5-karbamoil-L-ornitinamid
[0249] Primer 2.119.15 (7 mg) je rastvoren u N,N-dimetilformamidu (0,15 mL) i dodati su O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (9 mg) i N,N-diizopropiletilamin (7 mL). Smeša je mešana 3 minuta na sobnoj temperaturi i dodata je smeši Primera 2.119.16 (28 mg) i N,Ndiizopropiletilamin (15 mL) u N,N-dimetilformamidu (0,15 mL). Nakon 1 sata, reakcija je razblažena sa N,Ndimetilformamidom/vodom 1/1 (1,0 mL) i prečišćena reverzno faznom hromatografijom (C18 kolona), eluiranjem sa 5-75% acetonitrila u 0,1% TFA vode, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.<1>H NMR (500 MHz, dimetil sulfoksid-d6) δ ppm 9,95 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 8,37 (d, 1H), 8,22 (m, 2H), 8,18 (m, 2H), 8,08 (m, 2H), 8,03 (m, 1H), 7,96 (br d, 1H), 7,81 (d, 1H), 7,70 (t, 1H), 7,61 (br m, 3H), 7,48 (m, 2H), 7,37 (t, 1H), 7,27 (br m, 2H), 7,08 (s, 2H), 4,99 (br d, 3H), 4,68 (t, 1H), 4,39 (m, 1H), 4,20 (m, 2H), 4,04 (m, 1H), 3,87 (br d, 2H), 3,74 (br m, 1H) 3,65 (br t, 2H), 3,48 (br m, 4H), 3,43 (br m, 2H), 3,26 (br m, 2H), 3,00 (br m, 2H), 2,80 (m, 1H), 2,76 (m, 1H), 2,66 (br m, 2H), 2,36 (br m, 1H), 2,22 (s, 3H), 2,00 (m, 1H), 1,87 (m, 1H), 1,69 (br m, 1H), 1,62 (br m, 1H), 1,40 (br m, 4H), 1,31-1,02 (m, 10 H), 0,96 (m, 2H), 0,85 (m, 12H). MS (ESI-) m/e 1610,3 (M-H)-.
2.123 Sinteza (6S)-2,6-anhidro-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-benzotiazol-2-ilkarbamoil)-3,4-dihidroizohinolin-2(1H)-il]-2-karboksipiridin-3-il}-5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-5,7-dimetiltriciklo[3.3.1.13,7]dek1-il}oksi)etil](2-sulfoetil)karbamoil}oksi)metil]-5-({N-[(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)acetil]-L-valil-L-alanil}amino)fenil}etil)-L-gulonske kiseline (Sinton SZ)
2.123.1 (3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benziloksi)-6-(benziloksimetil)-tetrahidropiran-2-jedno
[0250] Smeši (3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benziloksi)-6-((benziloksi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-ol (75 g) u dimetil sulfoksidu (400 mL) na 0 °C je dodat acetatni anhidrid (225 mL). Smeša je mešana 16 sati na sobnoj temperaturi pre nego što je ohlađena do 0 °C. Dodata je velika zapremina vode i mešanje je prekinuto na 3 sata da bi se reakciona smeša slegla (sirov lakton je migrirao na dno boce). Supernatant je uklonjen i sirova smeša je razblažena sa etil acetatom i isprana tri puta sa vodom, neutralizovana sa zasićenom vodenom smešom NaHCO3i isprana ponovo dva puta sa vodom. Organski sloj je zatim isušen nad magnezijum sulfatom, filtriran i koncentrovan kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 561 (M+Na)<+>.
2.123.2 (3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benziloksi)-6-(benziloksimetil)-2-etinil-tetrahidro-2H-piran-2-ol
[0251] Smeši etiniltrimetilsilan (18,23 g) u tetrahidrofuranu (400 mL) pod azotom ohlađenoj u kadi suvog leda/acetona (unutrašnja temperatura -65 °C) je ukapavanjem dodat 2,5M BuLi u heksanu (55,7 mL), održavajući temperaturu ispod -60 °C. Smeša je mešana u hladnoj kadi 40 minuta, a zatim u ledenoj kadi (unutrašnja temperatura se popela do 0,4°C) 40 minuta, nakon čega je konačno ohlađena do -75°C ponovo. Smeša Primera 2.123.1 (50 g) in tetrahydrofuran (50 mL) je dodata ukapavanjem, održavajući unutrašnju temperaturu ispod -70 °C. Smeša je mešana u kadi suvog leda/acetona tokom dodatna 3 sata. Reakcija je ugašena zasićenom vodenom NaHCO3smešom (250 mL). Smeši je omogućeno da se zagreje na sobnu temperaturu, ekstraktovana je sa etil acetatom (3 x 300 mL), isušena nad MgSO4, filtrirana i koncentrovana in vacuo kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 659 (M+Na)<+>.
2.123.3 trimetil(((3S,4R,5R,6R)-3,4,5-tris(benziloksi)-6-(benziloksimetil)-tetrahidro-2H-piran-2-il)etinil)silan
[0252] Izmešanoj smeši Primera 2.123.2 (60 g) u acetonitrilu (450 mL) i dihlorometanu (150 mL) na -15 °C u ledeno slanoj kadi je ukapavanjem dodat trietilsilan (81 mL), a zatim je dodat kompleks boron trifluorid dietil etra (40,6 mL) pri takvoj brzini da unutrašnja temperatura nije prešla -10 °C. Smeša je zatim mešana na -15 °C do -10 °C tokom 2 sata. Reakcija je ugašena zasićenom vodenom NaHCO3smešom (275 mL) i mešana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Smeša je zatim ekstraktovana sa etil acetatom (3 x 550 mL). Ekstrakti su isušeni nad MgSO4, filtrirani i koncentrovani. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem sa gradijentom od 0% do 7% etil acetata/petrol etra kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 643 (M+Na)<+>.
2.123.4 (2R,3R,4R,5S)-3,4,5-tris(benziloksi)-2-(benziloksimetil)-6-etinil-tetrahidro-2H-piran
[0253] Izmešanoj smeši Primera 2.123.3 (80 g) u dihlorometanu (200 mL) i metanolu (1000 mL) je dodata IN vodena NaOH smeša (258 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 sata. Rastvarač je uklonjen. Ostatak je zatim podeljen na vodu i dihlorometan. Ekstrakti su isprani sa slanim rastvorom, isušeni nad Na2SO4, filtrirani i koncentrovani kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 571 (M+Na)<+>.
2.123.5 (2R,3R,4R,5S)-2-(acetoksimetil)-6-etinil-tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triil triacetat
[0254] Smeši Primera 2.123.4 (66 g) u acetatnom anhidridu (500 mL) ohlađenom kadom leda/vode je ukapavanjem dodat kompleks boron trifluorid dietil etar (152 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 16 sati, ohlađena sa kadom leda/vode i neutralizovana sa zasićenom vodenom NaHCO3smešom. Smeša je ekstraktovana sa etil acetatom (3 x 500 mL), isušena nad Na2SO4, filtrirana i koncentrovana in vacuo. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem sa gradijentom od 0% do 30% etil acetat/petrol etar kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 357 (M+H)<+>.
2.123.6 (3R,4R,5S,6R)-2-etinil-6-(hidroksimetil)-tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triol
[0255] Smeši Primera 2.123.5 (25 g) u metanolu (440 mL) je dodat natrijum metanolat (2,1 g). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 sata a zatim neutralizovana sa 4 M HCl u dioksanu. Rastvarač je uklonjen i ostatak je adsorbovan na silika gel i nanet na kolonu silika gela. Kolona je eluirana sa gradijentom od 0 do 100% etil acetat/petrol etar a zatim 0% do 12% metanol/etil acetat kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 211 (M+Na)<+>.
2.123.7 (2S,3S,4R,5R)-6-etinil-3,4,5-trihidroksi-tetrahidro-2H-piran-2-karboksilna kiselina
[0256] Trogrla boca sa okruglim dnom je napunjena sa Primerom 2.123.6 (6,00 g), KBr (0,30 g), tetrabutilamonijum bromidom (0,41 g) i 60 mL zasićene vodene NaHCO3smeše. Dodat je TEMPO ((2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il)oksil, 0,15 g) u 60 mL dihlorometanu. Smeša je mešana energično i ohlađena u ledeno slanoj kadi do -2 °C unutrašnje temperature. Smeša slanog rastvora (12 mL), vodene NaHCO3smeše (24 mL) i NaOCl (154 mL) je ukapavanjem dodata tako da je unutrašnja temperatura održana ispod 2 °C. pH reakcione smeše je održavana u opsegu 8,2-8,4 uz dodavanje čvrstog Na2CO3. Nakon ukupno 6 sati, reakciona smeša je ohlađena do 3 °C unutrašnje temperature i etanol (~20 mL) je dodat ukapavanjem. Smeša je mešana tokom ~ 30 minuta. Smeša je prebačena u levak za odvajanje, i sloj dihlorometana je odbačen. pH vodenog sloja je prilagođena na 2-3 korišćenjem 1 M vodenog HCl. Vodeni sloj je zatim koncentrovan do suvog kako bi se dobila čvrsta supstanca. Metanol (100 mL) je dodat čvrstoj supstanci i talog je mešan ~30 minuta. Smeša je filtrirana preko podloge dijatomejske zemlje i ostatak u levku je ispran sa ~100 mL metanola. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
2.123.8 (2S,3S,4R,5R)-metil 6-etinil-3,4,5-trihidroksitetrahidro-2H-piran-2-karboksilat
[0257] Trogrla boca od 500 mL sa okruglim dnom je napunjena sa suspenzijom Primera 2.123.7 (6,45 g) u metanolu (96 mL) i ohlađena je kadi leda i soli sa unutrašnjom temperaturom od -1 °C. Uredan tionil hlorid (2,79 mL) je pažljivo dodat. Unutrašnja temperatura je nastavila da raste dodavanjem ali nije prešla 10 °C. Reakciji je omogućeno da se polako zagreje do 15-20 °C tokom dva i po sata. Nakon dva i po sata, reakcija je koncentrovana kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
2.123.9 (3S,4R,5S,6S)-2-etinil-6-(metoksikarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triil triacetat
[0258] Primeru 2.123.8 (6,9 g) kao smeši u N,N-dimetilformamidu (75 mL) su dodati 4-(dimetilamino)piridin (0,17 g) i acetatni anhidrid (36,1 mL). Suspenzija je ohlađena u ledenoj kadi i špricom je dodavan piridin (18,04 mL) tokom 15 minuta. Reakciji je omogućeno da se zagreje na sobnu temperaturu tokom noći. Dodati su dodatni acetatni anhidrid
4
(12 mL) i piridin (6 mL) i mešanje je nastavljeno tokom dodatnih 6 sati. Reakcija je ohlađena u ledenoj kadi i dodato je 250 mL zasićene vodene NaHCO3 smeše i mešano je tokom sat vremena. Dodata je voda (100 mL) i smeša je ekstraktovana sa etil acetatom. Organski ekstrakt je ispran dva puta sa zasićenom CuSO4 smešom, isušen, filtriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom, eluiranjem sa 50% etil acetat/petrol etar kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.<1>H NMR (500 MHz, metanol-d4) δ ppm 5,29 (t, 1H), 5,08 (td, 2H), 4,48 (dd, 1H), 4,23 (d, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,04 (d, 1H), 2,03 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 1,98 (s, 4H).
2.123.10 2-jodo-4-nitrobenzoeva kiselina
[0259] Potpuno obložena boca od 3L opremljena sa mehaničkom mešalicom, temperaturnom sondom i dodatnim levkom pod atmosferom azota, je napunjena sa 2-amino-4-nitrobenzoeva kiselina (69,1 g, Combi-Blocks) i sumpornom kiselinom, 1,5 M vodeno (696 mL). Dobijena suspenzija je ohlađena do 0 °C unutrašnje temperature i ukapavanjem je dodavana smeša natrijum nitrita (28,8 g) u vodi (250 mL) tokom 43 minuta a temperatura je držana ispod 1 °C. Reakcija je mešana na oko 0 °C sat vremena. Ukapavanjem je dodavana smeša kalijum jodida (107 g) u vodi (250 mL) tokom 44 minuta a unutrašnja temperatura je držana ispod 1 °C (Inicijalno dodavanje je bilo egzotermno i došlo je do evolucije gasa). Reakcija je mešana sat vremena na 0 °C. Temperatura je povećana na 20 °C a zatim je mešano na sobnoj temperaturi tokom noći. Reakciona smeša je postala suspenzija. Reakciona smeša je filtrirana i sakupljena čvrsta supstanca je isprana sa vodom. Vlažna čvrsta supstanca (~108 g) je mešana u 10% natrijum sulfita (350 mL, sa ~200 mL vode korišćene za pranje u čvrstoj supstanci) 30 minuta. Suspenzija je zakiseljena sa koncentrovanom hlorovodoničnom kiselinom (35 mL), i čvrsta supstanca je prikupljena filtracijom i isprana vodom. Čvrsta supstanca je zamućena u vodi (1L) i ponovo filtrirana, i čvrsta supstanca je ostavljena u levku da se osuši tokom noći. Čvrsta supstanca je zatim isušena u vakuum peći tokom 2 sata na 60 °C. Dobijena čvrsta supstanca je triturisana sa dihlorometanom (500 mL) i suspenzija je filtrirana i isprana sa dodatnim dihlorometanom. Čvrsta supstanca je osušena vazduhom kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
2.123.11 (2-jodo-4-nitrofenil)metanol
[0260] Plamenom osušena trogrla boca od 3 L je napunjena sa Primerom 2.123.10 (51,9 g) i tetrahidrofuranom (700 mL). Smeša je ohlađena u ledenoj kadi do 0,5 °C i ukapavanjem (evolucija gasa) je dodavan borantetrahidrofuran kompleks (443 mL, 1M u THF) tokom 50 minuta, dostizanjem konačne unutrašnje temperature od 1,3 °C. Reakciona smeša je mešana 15 minuta i ledena kada je uklonjena. Reakcija je ostavljena da se zagreje do sobne temperature tokom 30 minuta. Instaliran je grejni omotač i reakcija je zagrevana do unutrašnje temperature od 65,5 °C tokom 3 sata a zatim je ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu mešanjem tokom noći. Reakciona smeša je ohlađena u ledenoj kadi na 0 °C i ugašena ukapavanjem metanola (400 mL). Nakon kratkog inkubacionog perioda, temperatura se brzo popela na 2.5 °C sa evolucijom gasa. Nakon što je prvih 100 mL dodato tokom ~30 minuta, dodavanje više nije bilo egzotermno i evolucija gasa je prestala. Ledena kada je uklonjena, i smeša je mešana na temperaturi okruženja pod azotom tokom noći. Smeša je koncentrovana u čvrstu supstancu, rastvorena u dihlorometanu/metanolu i adsorbovana na silika gel (~ 150 g). Ostatak je nanet na čep silika gela (3000 mL) i eluiran sa dihlorometanom kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.
2.123.12 (4-amino-2-jodofenil)metanol
[0261] Boca od 5 L opremljena sa mehaničkom mešalicom, grejnim omotačem kontrolisanim sa JKEM temperaturnom sondom i kondenzerom je napunjena sa Primerom 2.123.11 (98,83 g) i etanolom (2 L). Reakcija je mešana energično i dodato je gvožđe (99 g) a zatim smeša amonijum hlorida (20,84 g) u vodi (500 mL). Reakcija je zagrevana tokom perioda od 20 minuta na unutrašnju temperaturu od 80,3 °C, gde je počela snažno da refluksuje. Omotač je spušten dok se refluks nije smirio. Posle toga, smeša je zagrevana do 80 °C tokom sat i po vremena. Reakcija je filtrirana vruća kroz membranski filter i gvozdeni ostatak je ispran sa vrućih 50% etil acetata/metanola (800 mL). Eluent je propušten kroz dijatomejsku zemljanu podlogu i filtrat je koncentrovan. Ostatak je podeljen na 50% slanog rastvora (1500 mL) i etil acetat (1500 mL). Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstraktovan sa etil acetatom (400 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isušeni nad natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani kako bi se dobilo naslovno jedinjenje, koje je korišćeno bez daljeg prečišćavanja.
2.123.13 4-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-3-jodoanilin
[0262] Boca od 5 L sa mehaničkom mešalicom je napunjena sa Primerom 2.123.12 (88 g) i dihlorometanom (2 L). Suspenzija je ohlađena u ledenoj kadi na unutrašnju temperaturu od 2,5 °C i terc-butilhlorodimetilsilan (53,3 g) je dodavan u delovima tokom 8 minuta. Nakon 10 minuta, 1H-imidazol (33,7 g) je dodat u delovima u hladnu reakciju. Reakcija je mešana 90 minuta dok se unutrašnja temperatura nije popela na 15 °C. Reakciona smeša je razblažena sa vodom (3 L) i dihlorometanom (1 L). Slojevi su razdvojeni i organski sloj je isušen nad natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan u ulje. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (1600 g silika gela), eluiranjem sa gradijentom od 0-25% etil acetata u heptanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje kao ulje.
2.123.14 (S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanoična kiselina
[0263] Smeši (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-metilbutanska kiselina (6,5 g) u dimetoksietanu (40 mL) je dodata (S)-2-aminopropanoična kiselina (1,393 g) i natrijum bikarbonat (1,314 g) u vodi (40 mL). Dodat je tetrahidrofuran (20 mL) kako bi doprineo rastvorljivosti. Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 16 sati. Dodata je vodena citrična kiselina (15%, 75 mL) i smeša je ekstraktovana sa 10% 2-propanol u etil acetatu (2 x 100 mL). Precipitat je formiran u organskom sloju. Spojeni organski slojevi su isprani sa vodom (2 x 150 mL). Organski sloj je koncentrovan pod redukovanim pritiskom i zatim triturisan sa dietil etrom (80 mL). Nakon kratke sonikacije, naslovno jedinjenje je prikupljeno filtracijom. MS (ESI) m/e 411 (M+H)<+>.
2.123.15 (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-(((tertbutildimetilsilil)oksi)metil)-3-jodofenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat
[0264] Smeši Primera 2.123.13 (5,44 g) i Primera 2.123.14 (6,15 g) u smeši dihlorometana (70 mL) i metanola (35,0 mL) je dodat etil 2-etoksihinolin-1(2H)-karboksilat (4,08 g), i reakcija je mešana tokom noći. Reakciona smeša je koncentrovana i naneta na silika gel, eluiranjem sa gradijentom od 10% do 95% heptana u etil acetatu a zatim sa 5% metanola u dihlorometanu. Frakcije koje sadrže proizvod su koncentrovane, rastvorene u 0,2% metanola u dihlorometanu (50 mL), nanete na silika gel i eluirane sa gradijentom od 0,2% do 2% metanola u dihlorometanu. Frakcije koje sadrže proizvod su prikupljene kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 756,0 (M+H)<+>.
2.123.16 (2S,3S,4R,5S,6S)-2-((5-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)-2-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)fenil)etinil)-6-(metoksikarbonil)tetrahidro-2Hpiran-3,4,5-triil triacetat
[0265] Smeša Primera 2.123.9 (4,500 g), Primera 2.123.15 (6,62 g), bakar(I) jodida (0,083 g) i bis(trifenilfosfin)paladijum(II) dihlorida (0,308 g) su spojene u boci i degazirane. Dodati su N,N-dimetilformamid (45 mL) i N-etil-N-izopropilpropan-2-amin (4,55 mL) i reakciona posuda je isprana sa azotom i mešano na sobnoj temperaturi tokom noći. Reakcija je podeljena na vodu (100 mL) i etil acetat (250 mL). Slojevi su razdvojeni, organski sloj je isušen nad magnezijum sulfatom, filtriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa gradijentom od 5% do 95% etil acetata u heptanu. Frakcije koje sadrže proizvod su prikupljene, koncentrovane i prečišćene hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa gradijentom od 0,25% do 2,5% metanola u dihlorometanu kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 970,4 (M+H)<+>.
2.123.17 (2S,3S,4R,5S,6S)-2-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)-2-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)fenetil)-6-(metoksikarbonil)tetrahidro-2H-piran3,4,5-triil triacetat
[0266] Primer 2.123.16 (4,7 g) i tetrahidrofuran (95 mL) su dodati u 5% Pt/C (2,42 g, vlažno) u bocu pod pritiskom od 50 mL i trešeni 90 minuta na sobnoj temperaturi pod 50 psi vodonika. Reakcija je filtrirana i koncentrovana kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 974,6 (M+H)<+>.
2.123.18 (2S,3S,4R,5S,6S)-2-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-yl)metoksi)karbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)-2-(hidroksimetil)fenetil)-6-(metoksikarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triil triacetat
[0267] Smeša Primera 2.123.17 (5,4 g) u tetrahidrofuranu (7 mL), vodi (7 mL) i glacijalnoj acetatnoj kiselini (21 mL) je mešana tokom noći na sobnoj temperaturi. Reakcija je razblažena sa etil acetatom (200 mL) i isprana sa vodom (100 mL), zasićenom vodenom NaHCO3smešom (100 mL), slanim rastvorom (100 mL), isušena nad magnezijum sulfatom, filtrirana i koncentrovana. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa gradijentom od 0,5% do 5% metanola u dihlorometanu, kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 860,4 (M+H)<+>.
2.123.19 (2S,3S,4R,5S,6S)-2-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)-2-((((4-nitrofenoksi)karbonil)oksi)metil)fenetil)-6-(metoksikarbonil)tetrahidro-2Hpiran-3,4,5-triil triacetat
[0268] Smeši Primera 2.123.18 (4,00 g) i bis(4-nitrofenil) karbonat (2,83 g) u acetonitrilu (80 mL) je dodat N-etil-N-izopropilpropan-2-amin (1,22 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon mešanja tokom noći, reakcija je koncentrovana, rastvorena u dihlorometanu (250 mL) i isprana sa zasićenom vodenom NaHCO3smešom (4 x 150 mL). Organski sloj je isušen nad magnezijum sulfatom, filtriran i koncentrovan. Dobijena pena je prečišćena hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa gradijentom od 5% do 75% etil acetata u heksanima kako bi se dobilo naslovno jedinjenje. MS (ESI) m/e 1025,5 (M+H)<+>.
2.166 Sinteza 6-(8-(benzo[d]tiazol-2-ilkarbamoil)-3,4-dihidroizohinolin-2(1H)-il)- 3-(1-((3-(2-((((2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-karboksi-3,4,5-trihidroksitetrahidro-2H-piran-2-il)etil)-4-((S)-2-((S)- 2-(2-((3S,5S)-3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-2-okso-5-((2-sulfoetoksi)metil)pirolidin-1-il)acetamido)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil)oksi)karbonil)((S)-3,4-dihidroksibutil)amino)etoksi)-5,7- dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)pikolinska kiselina (Sinton AAA)
[0269] Naslovno jedinjenje je pripremano supstituisanjem Primera 2.167.1 sa Primerom 2.119.16 u Primeru 2.119.17.
<1>H NMR (500 MHz, dimetil sulfoksid-d6) δ ppm 9,86 (br d, 1H), 8,17 (br d, 1H), 8,04 (m, 2H), 7,78 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,51 (br d, 1H), 7,49-7,39 (m, 4H), 7,36 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,21 (d, 1H), 7,07 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,00 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,64 (t, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 4,16 (d, 1H), 4,01 (d, 1H), 3,88 (br t, 2H), 3,82 (br m, 3H), 3,75 (br m, 1H), 3,64 (t, 2H), 3,54 (d, 2H), 3,47 (m, 4H), 3,43 (br m, 4H), 3,23 (br m, 5H), 3,13 (t, 1H), 3,10 (br m, 1H), 3,01 (br m, 2H), 2,93 (t, 1H), 2,83-2,68 (m, 3H), 2,37 (m, 1H), 2,08 (s, 3H), 1,99 (br m, 2H), 1,85 (m, 1H), 1,55 (br m, 1H), 1,37 (br m, 1H), 1,28 (br m, 6H), 1,10 (br m, 7H), 0,93 (br m, 1H), 0,88-0,69 (m, 12H). MS (ESI) m/e 1713,6 (M-H)-.
Alternativna sinteza 6-(8-(benzo[d]tiazol-2-ilkarbamoil)-3,4-dihidroizohinolin-2(1H)-il)- 3-(1-((3-(2-((((2-(2-((2S,3R,4R,SS,6S)-6-karboksi-3,4,5-trihidroksitetrahidro-2H-piran-2-il)etil)-4-((S)-2-((S)- 2-(2-((3S,5S)-3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-2-okso-5-((2-sulfoetoksi)metil)pirolidin-1-il)acetamido)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil)oksi)karbonil)((S)-3,4-dihidroksibutil)amino)etoksi)-5,7- dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)pikolinska kiselina (Sinton 0AAA)
2.167.1 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)propanamido)-2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-karboksi-3,4,5-trihidroksitetrahidro-2H-piran-2-il)etil)benzil)oksi)karbonil)((S)-3,4-dihidroksibutil)amino)etoksi)-5,7-dimetiladamantan-1-il)metil)-5-metil-1H-pirazol-4-il)-6-(8-(benzo[d]tiazol-2-ilkarbamoil)-3,4-dihidroizohinolin-2(1H)-il)pikolinska kiselina
[0270] Primer 2.167.1 je pripreman supstituisanjem Primera 2.123.19 sa (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-3-metil1-(((S)-1-((4-((((4-nitrofenoksi)karbonil)oksi)metil)fenil)amino)-1-okso-5-ureidopentan-2-il)amino)-1-oksobutan-2-il)karbamat i supstituisanjem Primera 1.85 sa Primerom 1.2.9 u Primeru 2.49.1. MS (ESI) m/e 1355,5 (M-H)<->.
Primer 3: Generisanje mišjih anti-B7-H3 monoklonalnih antitela tehnologijom hibridoma miša
[0271] B7-H3 specifična antitela su podignuta primenom tehnologije hibridoma miša. Specifično, mišja fibroblastna ćelijska linija (3T12) koja eksprimira ljudski B7-H3 pune dužine kao i rekombinantani ljudski ili mišji B7-H3-EDC-ljudski Fc fuzioni proteini su korišćeni kao imunogeni, čije su sekvence date u Tabeli 1. Ljudske HCT116 ćelijske linije koje eksprimiraju ljudski B7-H3 su korišćene za utvrđivanje anti-sera titera i za skrining antigenski specifičnih antitela. Ćelijske linije su bile izložene na približno 3000 mREM zračenja gama izvora pre imunizacije. Dva različita soja miševa su imunizovana u skočni zglob sa dozama koje sadrže 5 x 10<6>ćelija/miš/injekcija ili 10 ug proteina/miš/injekcija u prisustvu Gerbu MM ađuvanta (Cooper-Casey Corporation, Valley Center, CA, US) i za primarnu i za podsticajnu imunizaciju. Kako bi se povećao imuni odgovor na mišji B7-H3, miševi su dodatno pojačani sa smešom ljudskog i mišjeg B7-H3-ECD-ljudski Fc proteini za finalno pojačavanje. Ukratko, antigeni su pripremani u PBS kao što sledi: 200 x 10<6>ćelijla/mL ili 400 ug/mL protein. Izračunata zapremina antitela je prebačena u sterilnu mikrocentrifugalnu tubu i zatim je dodata jednaka zapremina Gerbu MM. Rastvor je pomešan blagim vorteksovanjem tokom 1 minuta. Ađuvansantigen rastvor je zatim uvučen u odgovarajuć špric za životinjsku injekciju. Ukupno 25 uL smeše je ubrizgano u skočni zglob svake noge miša. Svaka životinja je podstaknuta 3 puta pre nego što je titar seruma određen za sve grupe. Sve životinje su dobile 2 dodatna podsticaja sa jednakom smešom mišjih B7-H3-ECD-ljudskih Fc i ljudskih B7-H3-ECD-ljudskih Fc proteina u ađuvansu pre infuzije.
Tabela 1: Aminokiselinske sekvence rekombinantnih proteina korišćene za imunizaciju ili skrining
4
Fuzija i skrining hibridoma
[0272] Ćelije murina ćelijske linije mijeloma (NS-0, ECACC broj 85110503) su kultivisane da dostignu stadijum log faze neposredno pre fuzije. Poplitealni i ingvinalni limfni čvorovi su uklonjeni iz svakog miša suspenzije pojedinačnih ćelija su pripremane sterilno. Limfociti su fuzionisani sa ćelijama mijeloma (E. Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998); Kohler G. and Milstein C., "Continuous cultures of fused cell secreting antibody of predefined specificity," Nature, 256:495-497 (1975); BTX Harvard Apparatus (Holliston, MA, US) ECM 2001 technical manual). Fuzionisane hibridne ćelije su raspodeljene u ploče sa 96 otvora u DMEM/10% FBS/HAT medijumu. Supernatanti iz preživelih kolonija hibridoma su podvrgnuti skriningu na bazi ćelija korišćenjem ljudskih ćelijskih linija koje eksprimiraju rekombinantni ljudski B7-H3. Ukratko, ljudska ćelijska linija koja eksprimira ljudski B7-H3 je odmrznuta i direktno raspodeljena u ploče sa 96 otvora (crni sa prozirnim dnom za snimanje) sa 50.000 ćelija/otvor u medijumu rasta i inkubirane 2 dana na 37 °C kako bi dostiglo 50% konfluenciju. Supernatanti hibridoma (50 uL/well) su prebačeni u odgovarajuće ploče i inkubirani na sobnoj temperaturi 30 minuta. Medijum je uklonjen iz svakog otvora i za detekciju je korišćen kozji anti-mišji IgG-AF488 (Invitrogen, No. A11029, Grand Island, NY, US) upotrebom InCell Analyzer 2000 (GE). Pogoci su prošireni i vezivanje je potvrđeno sa FACS upotrebom različite ljudske ćelijske linije ili mišje ćelijske linije koja eksprimira ljudski B7-H3 i kozje anti-mišjeg IgG-PE za detekciju. Specifičnost vrsta je utvrđena korišćenjem ELISA formata u skladu sa sledećom procedurom. ELISA ploče su obložene sa ljudskim B7-H3-ECD-humanim Fc, cinomolgusni B7-H3-ECD-his, ili mišji B7-H3-ECD-humani Fc proteinima tokom noći na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i hibridoma supes (100 uL) su dodate svakom otvoru, i inkubirane na sobnoj temperaturi sat vremena. Ploče su isprane, za detekciju je korišćen majmunsko anti-mišje IgG-HRP (Jackson Immunochemicals, No. 115-035-071, West Grove, PA, US) i vezivanje OD je uočeno pri 650 nm.
[0273] Selekcija pogodaka je subkloniran upotrebom MoFlo (Beckman, Indianapolis, IN, US) deponovanjem jedne ćelije po otvoru na ploče ćelijske kulture od 96 otvora kako bi se osigurala klonalnost ćelijske linije. Dobijene kolonije su ispitane na specifičnost sa FACS upotrebom mišjih 3T12 fibroblastnih ćelijskih linija koje eksprimiraju ljudski B7-H3, majmunskog B7-H3 ili mišjeg B7-H3. Izotip svakog monoklonalnog antitela je utvrđen korišćenjem kompleta za mišje monoklonsko isostyping (Roche, No. 11-493-027-001, Indianapolis, IN, USA). Klonovi hibridoma koji proizvode antitela koja su prikazala visoku specifičnu aktivnost vezivanja za ljudski i majmunski B7-H3 antigen su subklonirani i prečišćeni (Tabela 2).
Tabela 2: Lista anti-B7-H3 antitela enerisanih u otrebom tehnolo i e hibridoma miša
Primer 4: In Vitro karakterizacija anti-B7-H3 mišjih monoklonskih antitela
[0274] Afinitet vezivanja prečišćenih anti-B7-H3 monoklonskih antitela je utvrđen površinskom plazmonskom rezonancom. Tabela 3 pokazuje konstante brzine asocijacije (ka) konstante brzine disocijacije (kd) i konstante disocijacije ekvilibrijuma (KD) za serije hibridoma miša izvedenih anti-B7-H3 monoklonskih antitela (mAbs) koja se vezuju za rastvorljive ECD ljudskog B7-H3 i cino B7-H3. Kinetike vezivanja su dobijene iz SPR merenja korišćenjem instrumenta Biacore T200 i pristupa hvatanja mAb (kao što je opisano u materijalima i metodama u nastavku).
Tabela 3: Biacore kinetike antitela hibridoma miša anti-B7-H3 koja se vezuju za ljudski i cinomolgus majmunski B7-H3
4
[0275] Izvršeni testovi vezivanja u paru na Biacore T200 SPR instrumentima su korišćeni za određivanje relativnog epitopnog grupisanja za murinski anti-B7-H3 mAb kao što je opisano u metodama u nastavku. Slika 1 daje prikaz grupisanja epitopa, što opisuje relativnu raznolikost ljudskog B7-H3 epitopa i preklapanje za serije ovde identifikovanih anti-B7-H3 mAb. Grupe epitopa su predstavljene kao pojedinačni ovali, od kojih se neki međusobno preklapaju. Antitela u različitim grupama epitopa se mogu vezati za B7-H3 simultano i verovatno vezati za različite epitope dok se antitela unutar date grupe epitopa ne mogu vezati za B7-H3 simultano i verovatno će se vezati za preklapajuće epitope. Ova informacija grupisanja je dobijena iz testa simultanog vezivanja kao što je opisano u materijalima i metodama. Ab3, Ab4, Ab5, Ab11, Ab12 i Ab8 grupisanja su nejasna.
Materijali i metode: Kinetika vezivanja
[0276] Biacore T200 SPR instrumenti su korišćeni za merenje kinetike vezivanja ljudskog B7-H3 (analit) vezivanja za razne mAb (ligande). Format testa je kaptiranje na osnovu Fc preko imobilisanog anti-mišjeg (Fc) (Pierce 31170) ili imobilisanog anti-ljudskog (Fc) (Pierce 31125). Primenjen je standardni protokol kuplovanja amina za imobilizaciju kaptiranja reagenasa preko primarnih amina na površinu karboksi-metil (CM) dekstrana CM5 sensorchips (Biacore); kapitarajuća antitela su kuplovana na nivo od približno 5000RU. Za merenje kinetike vezivanja pufer testa je bio HBSEP+ (Biacore): 10 mM Hepes, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% polisorbate 20. Tokom testa, sva merenja su referencirana samo na površinu hvatanja. Svaki krug testa se sastojao od sledećih koraka: 1) kaptiranje liganda do približno 50RU; 2) injekcija analita preko referentne i testne površine, 240 uL pri 80 uL/min, nakon čega je disocijacija praćena tokom 900 sekundi pri 80 uL/min; 3) Regeneracija površine kaptiranja sa niskim pH glicinom. Za kinetička određivanja injekcije analita su bile 3 tačke, 9 puta dilucione serije 900 nM, 100 nM i 11,11 nM, injekcije samo pufera su bile uključene u sekundarno referenciranje. Podaci su obrađeni i uklopljeni u 1:1 model vezivanja korišćenjem Biacore T200 softvera evaluacije za utvrđivanje konstanti kinetičke brzine vezivanja, ka(on-rate) i kd(offrate) i konstante disocijacije ekvilibrijuma (afinitet, KD).
Materijali i metode: Grupisanje epitopa
[0277] Testovi vezivanja u paru sprovedeni na Biacore T200 SPR instrumentima su korišćeni za određivanje relativnog grupisanja epitopa za serije anti-B7-H3 mAb. Format testa je bio kaptiranje na bazi Fc preko imobilisanih anti-mišjih (Fc) (Pierce 31170) ili imobilisanih anti-ljudskih (Fc) (Pierce 31125). Standardan protokol kuplovanja amina je primenjen za imobilisanje kaptirajućih reagenasa preko primarnih amina na karboksi-metil (CM) dekstran površinu CM5 sensorchips (Biacore); kaptirajuća antitela su kuplovana za nivo od približno 2000RU. Merenja grupisanja epitopa su završena na 12 °C (niska temperatura omogućava grupisanje informacija o brzim off-rate mAb), pufer testa je bio HBS-EP+ (Biacore): 10 mM Hepes, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% polisorbate 20. Svaki krug testa se sastojao od sledećih koraka u sistemu četiri protočne ćelije: 1) odvojeni test mAb su kaptirani u protočnim ćelijama 2, 3 & 4 (protočna ćelija 1 je bila referenca, bez testa mAb); 2) sve 4 protočne ćelije su zatim blokirane injekcijom sa izotipom za kontrolu mAb ili izotipom mAb koktelom pri 50 ug/mL; 3) sve 4 protočne ćelije su zatim injektovane sa antigenom ili samo puferom (samo pufer je za duplo referenciranje, urađen za svaki mAb par pojedinačno); 4) sve 4 protočne ćelije su zatim injektovane sa drugim mAb testom pri 10 ug/mL; 5) sve 4 protočne ćelije su zatim regenerisane sa glicinom, pH 1,5. Test je urađen za svaki testni mAb par u recipročnim orijentacijama. Simultano vezivanje je procenjeno ispitivanjem odnosa drugog testa mAb odgovora i odgovora Ag (RUmAb2/RUAg); ukoliko je ovaj odnos bio jednak ili veći od 0,2 interakcija je ocenjena kao simultano vezivo. Iz ovih podataka testa vezivanja u paru ručno je konstruisan dijagram “venn” stila za prikaz relativnog grupisanja epitopa.
Primer 5: Generisanje anti-hB7-H3 himernih antitela
[0278] Nakon identifikacije mišjih anti-B7-H3 hibridomnih antitela, varijabilni regioni teškog i lakog lanca (VH i VL) koji odgovaraju sekretovanim antitelima su određeni iz ćelija korišćenjem reverzne transkriptaza-polimeraza lančane reakcije (RT-PCR). Murinski varijabilni regioni su eksprimirani kod sisarskih ćelija domaćina u kontekstu konstantnog regiona humanog imunoglobulina kako bi se dobila himerna antitela. Tabela 4 u nastavku daje aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona za mišje himerizovane hibridome.
T - -
4
4
4
4
Primer 6: Karakterizacija vezivanja himernih anti-B7-H3 antitela
[0279] Za generisanje prečišćenih himernih antitela, ekspresioni vektori su privremeno transfektovani u HEK293 6E suspenzione ćelijske kulture u odnosu od 60% do 40% konstrukcije lakog do teškog lanca. 1 mg/ml polietilenimina (PEI) ili 2,6 mL/mL expifektamina je korišćeno za transfektovanje ćelija. Ćelijski supernatanti su prikupljeni nakon pet dana u tresućim bocama, spun down do ćelija peleta, i filtrirani kroz 0,22 um filtere kako bi odvojili IgG od kontaminanata kulture. Supernatanti koji sadrže antitela su prečišćeni sa Akta Pure upotrebom proteina A mAb SelectSure. Kolone su uravnotežene u PBS, pH 7,4, supernatanti su zatim provučeni kroz kolonu i sprovedeno je ispiranje sa PBS pH 7,4. IgG su eluirana sa 0,1 M acetatne kiseline pH 3,5 i prikupljena u nekoliko alikvota. Frakcije koje sadrže IgG su objedinjene i dijalizovane u PBS tokom noći na 4 °C. Anti-B7-H3 himerna antitela koja su uspešno eksprimirana su karakterisana na mogućnost da se vežu za B7-H3 koji prekomerno eksprimiraju ljudsku ćelijsku liniju nesitnoćelijskog karcinoma pluća NCI-H1650 (ATCC® No. CRL-5883) sa FACS korišćenjem metoda opisanih u nastavku. Tabela 5 rezimira svojstva vezivanja himernih anti-B7-H3 antitela.
1
Tabela 5 I r k r k riz i B -H him rnih n i l
FACS metode vezivanja
[0280] Ćelije su prikupljene iz bočica kada je približno 80% konfluentno korišćenjem Gibco® Cell Dissociation Buffer. Ćelije su isprane jednom u PBS/1% FBS (FACS puferu) a zatim ponovo suspendovane pri 2,5x10<6>ćelije/mL u FACS puferu. 100 ul ćelija/otvor je dodato na ploču sa okruglim dnom sa 96 otvora. 10 uL od 10x koncentracije mAb/ADC (konačne koncentracije su naznačene na slikama). Otvori su isprani dva puta sa FACS puferom i ponovo suspendovani u 50 uL sekundarnog Ab (AlexaFluor 488) razblaženog u FACS puferu. Ploča je inkubirana na 4°C tokom sat vremena i isprana dva puta sa FACS puferom. Ćelije su ponovo suspendovane u 100 uL PBS/1% formaldehida i analizirane sa Becton Dickinson LSRII protočnim cistometrom. Podaci su analizirani upotrebom WinList sotvera za analizu protočne cistometrije.
Primer 7: Karakterizacija himernih anti-B7-H3 antitela kao Bcl-xL koji inhibiraju konjugate antitelnog leka
[0281] Devet anti-B7-H3 himernih antitela je konjugovano za Bcl-xL koji inhibira (Bcl-xLi) sinton CZ (Primer 2.1) korišćenjem konjugacionog metoda A opisanog u nastavku. Dobijeni ADC (anti-B7-H3 antitela konjugovana za sinton CZ) su testirani na vezivanje za ćelijsku površinu ljudskog B7-H3 sa FACS (kao što je opisano u Primeru 6) i na ćelijsku citotoksičnost u ćelijskim linijama koje eksprimiraju B7-H3. Od devet antitela, tri antitela (chAb2, chAb6 i chAb16) su precipitirala sledeću konjugaciju za sinton CZ i pokazala slabu citotoksičnost u ćelijama koje eksprimiraju ljudski B7-H3. Tabela 6 pruža vezivanje ćelijske površine i aktivnost citotoksičnosti anti-B7-H3 himernih ADC naspram ćelije karcinoma dojke HCC38 koja eksprimira ljudski B7-H3.
Tabel I r k r k riz i B -H him rnih Z k n
Materijali i metode: Konjugacija Bcl-xL inhibitornih ADC
[0282] ADC su sintetizovani korišćenjem jednog od metoda opisanih u nastavku. Primerni ADC su sintetizovani korišćenjem jednog od devet primernih metoda, opisanih u nastavku.
[0283] Metoda A. Rastvor Bond-Breaker™ tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) rastvor (10 mM, 0,017 mL) je dodat rastvoru antitela (10 mg/mL, 1 mL) prethodno zagrejanom do 37 °C. Reakciona smeša je držana na 37 °C sat vremena. Rastvor redukovanog antitela je dodat rastvoru sintona (3,3 mM, 0,160 mL u DMSO) i blago mešan 30 minuta. Reakcioni rastvor je nanet na desalinizirajuću kolonu (PD10, ispranu sa Dulbecco’s fiziološkim rastvorom puferovanim sa fosfatom [DPBS] 3x pre upotrebe), a zatim DPBS (3 mL). Prečišćen ADC rastvor je filtriran kroz 0,2 mikron, špric filter od 13 mm sa slabim proteinskim vezivanjem i čuvan na 4 °C.
[0284] Metoda B. Rastvor Bond-Breaker™ tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) rastvor (10 mM, 0,017 mL) je dodat rastvoru antitela (10 mg/mL, 1 mL) prethodno zagrejanom do 37 °C. Reakciona smeša je držana na 37 °C tokom sat vremena. Rastvor redukovanog antitela je prilagođen na pH=8 dodavanjem bornog pufera (0,05 mL, 0,5 M, pH 8), dodato rastvoru sintona (3,3 mM, 0,160 mL u DMSO) i nežno mešano 4 sata. Reakcioni rastvor je nanet na desalinizirajuću kolonu (PD10, isprana sa DPBS 3x pre upotrebe), a zatim DPBS (1,6 mL) i eluiran sa dodatnih DPBS (3 mL). Prečišćen ADC rastvor je filtriran kroz 0,2 mikron, špric filter od 13 mm sa slabim proteinskim vezivanjem i čuvan na 4 °C.
[0285] Metoda C. Konjugacije su izvršene pomoću PerkinElmer Janus (deo AJL8M01) robotskog sistema za rukovanje
2
tečnošću opremljenog sa 1235/96 tip ModuLar Dispense Technology (MDT), glavom za jednokratnu upotrebu (deo 70243540) koja sadrži krak za hvatanje (deo 7400358) i osmokraku Varispan pipetirajuću ruku (deo 7002357) na proširenoj platformi. PerkinElmer Janus sistem se kontroliše korišćenjem softvera WinPREP verzije 4.8.3.315.
[0286] A Pall Filter ploča 5052 prethodno navlažena sa 100 uL 1x DPBS korišćenjem MDT. Na filter ploču je primenjen vakuum tokom 10 sekundi a zatim ventilacija tokom 5 sekundi kako bi se uklonilo DPBS sa filter ploče. 50% taloga smole proteina A (GE MabSelect Sure) u DPBS je sipano u rezervoar sa 8 otvora opremljen sa magnetnom kuglicom, i smola je promešana propuštanjem putujućeg magneta ispod ploče rezervoara. Osmokraka Varispan ruka, opremljena provodljivim vrhovima od 1 mL, je korišćena za aspiriranje smole (250 uL) i prebacivanje na filter ploču sa 96 otvora. Vakuum je primenjen tokom 2 ciklusa da bi se uklonio veći deo pufera. Korišćenjem MDT, 150 uL 1xPBS je aspirirano i raspodeljeno na filter ploču sa 96 otvora koja drži smolu. Primenjen je vakuum, uklanjajući pufer iz smole. Ciklus ispiranja/vakuuma je ponovljen 3 puta. Ploča za sakupljanje sa 96 otvora i 2 mL je postavljena na Janus platformu, i MDT je prebacio 450 uL 5x DPBS na ploču za sakupljanje za kasniju upotrebu. Redukovano antitelo (2 mg) kao rastvor u (200 uL) DPBS je pripremano kao što je prethodno opisano za uslove A i prethodno naneto na ploču sa 96 otvora. Rastvori redukovanog antitela su prebačeni u otvore filter ploče koji sadrže smolu, i smeša je mešana sa MDT ponavljanom aspiracijom/dispenzacijom 100 uL zapremine unutar otvora tokom 45 sekundi po ciklusu. Ciklus asipiracije/dispenzacije je ponavljan ukupno 5 puta tokom vremenskog perioda od 5 minuta. Primenjen je vakuum na filter ploču tokom 2 ciklusa, time uklanjajući višak antitela. MDT vrhovi su isprani sa vodom tokom 5 ciklusa (200 uL, 1 mL ukupna zapremina). MDT je aspirirao i dispenzirao 150 uL DPBS u otvore filter ploče koji sadrže antitelo vezano smolom, i vakum je primenjen tokom 2 ciklusa. Sekvenca ispiranja i vakuuma je ponovljena još dva puta. Nakon poslednjeg vakuum ciklusa, 100 uL 1x DPBS je dispenzovano u otvore koji sadrže antitelo vezano smolom. MDT je zatim sakupilo 30 uL svakog od 3,3 mM dimetil sulfoksid rastvora sintona postavljenih u format 96 otvora i dispenzovao ih na filter ploču koja sadrži antitela vezana smolom u DPBS. Otvori koji sadrže konjugacionu smešu su pomešani sa MDT ponavljanom aspiracija/dispenzacija 100 uL zapremine unutar otvora 45 sekundi po ciklusu. Sekvenca aspiracija/dispenzacija je ponavljana ukupno 5 puta tokom vremenskog perioda od 5 minuta. Vakuum je primenjen tokom 2 ciklusa kako bi se višak sintona uklonio u otpad. MDT vrhovi su isprani sa vodom tokom 5 ciklusa (200 uL, 1 mL ukupne zapremine). MDT je aspirirao i dispenzovao DPBS (150 uL) u konjugacionu smešu, i vakuum je primenjen tokom 2 ciklusa. Sekvenca ispiranja i vakuuma je ponovljena još dva puta. MDT hvataljka je zatim pomerila filter ploču i ogrlicu do stanice za zadržavanje. MDT je postavio ploču za sakupljanje od 2 mL koja sadrži 450 uL 10x DPBS unutar vakuum razvodnika. MDT je ponovo sastavio vakuumski kolektor postavljanjem filter ploče i ogrlice. MDT vrhovi su isprani sa vodom u 5 ciklusa (200 uL, 1 mL ukupne zapremine). MDT je aspirirao i dispenzovao 100 uL IgG elucionog pufera 3,75 (Pierce) u konjugacionu smešu. Nakon jednog minuta, vakuum je primenjen za 2 ciklusa, i eluent je kaptiran u prijemnoj ploči koja sadrži 450 uL od 5x DPBS. Sekvenca aspiracije/dispenzacije je ponavljana 3 dodatna puta kako bi se isporučili ADC uzorci sa koncentracijama u opsegu od 1,5-2,5 mg/mL sa pH 7,4 u DPBS.
[0287] Metoda D. Konjugacije su izvršene pomoću PerkinElmer Janus (deo AJL8M01) robotskog sistema za rukovanje tečnošću opremljenog sa 1235/96 tip ModuLar Dispense Technology (MDT), glavom za jednokratnu upotrebu (deo 70243540) koja sadrži krak za hvatanje (deo 7400358) i osmokraku Varispan pipetirajuću ruku (deo 7002357) na proširenoj platformi. PerkinElmer Janus sistem se kontroliše korišćenjem softvera WinPREP verzije 4.8.3.315.
[0288] A Pall Filter ploča 5052 prethodno navlažena sa 100 uL 1x DPBS korišćenjem MDT. Na filter ploču je primenjen vakuum tokom 10 sekundi a zatim ventilacija tokom 5 sekundi kako bi se uklonilo DPBS sa filter ploče. 50% taloga smole proteina A (GE MabSelect Sure) u DPBS je sipano u rezervoar sa 8 otvora opremljen sa magnetnom kuglicom, i smola je promešana propuštanjem putujućeg magneta ispod ploče rezervoara. Osmokraka Varispan ruka, opremljena provodljivim vrhovima od 1 mL, je korišćena za aspiriranje smole (250 uL) i prebacivanje na filter ploču sa 96 otvora. Vakuum je primenjen na filter ploči tokom 2 ciklusa kako bi se uklonila većina pufera. MDT je aspirirao i dispenzovao 150 uL DPBS u otvore filter ploče koji sadrže smolu. Sekvenca pranja i vakuuma je ponavljana još dva puta. Ploča za prikupljanje za 96 otvora od 2 mL je montirana na Janus platformu, i MDT je prebacio 450 uL od 5x DPBS na ploču za prikupljanje za kasniju upotrebu. Redukovana antitela (2 mg) kao rastvor u (200 uL) DPBS je pripremano kao što je prethodno opisano u uslovima A i dispenzovano na ploču sa 96 otvora. MDT je zatim sakupio 30 uL svakog od 3,3 mM dimetil sulfoksid rastvora sintona postavljenih format od 96 otvora i dispenzovao ih na ploču napunjenu sa redukovanim antitelom u DPBS. Smeša je pomešana sa MDT dva puta ponovljenom aspiracijom/dispenzacijom 100 uL zapremine unutar otvora. Nakon pet minuta, konjugaciona reakciona smeša (230 uL) je prebačena na filter ploču sa 96 otvora koja sadrži smolu. Otvori koji sadrže konjugacionu smešu i smolu su pomešani sa MDT ponovljenom aspiracijom/dispenzacijom 100 uL zapremine unutar otvora 45 sekundi po ciklusu. Sekvenca aspiracije/dispenzacije je ponavljana ukupno 5 puta tokom vremenskog perioda od 5 minuta. Vakuum je primenjen tokom 2 ciklusa kako bi se uklonio višak sintona i proteina u otpad. MDT vrhovi su isprani sa vodom tokom 5 ciklusa (200 uL, 1 mL ukupne zapremine). MDT je aspirirao i dispenzovao DPBS (150 uL) u konjugacionu smešu, i vakuum je primenjen tokom dva ciklusa. Sekvenca pranja i vakuuma je ponavljana još dva puta. MDT hvataljka je zatim pomerila filter ploču i ogrlicu do stanice za zadržavanje. MDT je postavio ploču za sakupljanje od 2 mL koja sadrži 450 uL 10x DPBS unutar vakuum razvodnika. MDT je ponovo sastavio vakuumski kolektor postavljanjem filter ploče i ogrlice. MDT vrhovi su isprani sa vodom u 5 ciklusa (200 uL, 1 mL ukupne zapremine). MDT je aspirirao i dispenzovao 100 uL IgG elucionog pufera 3,75 (P) u konjugacionu smešu. Nakon jednog minuta, vakuum je primenjen za 2 ciklusa, i eluent je kaptiran u prijemnoj ploči koja sadrži 450 uL od 5x DPBS. Sekvenca aspiracije/dispenzacije je ponavljana 3 dodatna puta kako bi se isporučili ADC uzorci sa koncentracijama u opsegu od 1,5-2,5 mg/mL sa pH 7,4 u DPBS.
[0289] Metoda E. Rastvor Bond-Breaker™ tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) rastvor (10 mM, 0,017 mL) je dodat rastvoru antitela (10 mg/mL, 1 mL) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zagrevana do 37 °C tokom 75 minuta. Rastvor redukovanog antitela je ohlađen na sobnu temperaturu i dodat rastvoru sintona (10 mM, 0,040 mL u DMSO) praćeno sa dodavanjem bornog pufera (0,1 mL, 1M, pH 8). Reakcioni rastvor je ostavljen da miruje 3 dana na sobnoj temperaturi, nanet na desalinizirajuću kolonu (PD10, ispran sa DPBS 3x5mL pre upotrebe), a zatim praćeno sa DPBS (1,6 mL) i eluirano sa dodatnim DPBS (3 mL). Prečišćen ADC rastvor je filtriran kroz 0,2 mikron, špric filter od 13 mm sa slabim proteinskim vezivanjem i čuvan na 4 °C.
[0290] Metoda F. Konjugacije su izvršene korišćenjem Tecan Freedom Evo robotskog sistema za rukovanje tečnošću. Rastvor antitela (10 mg/mL) je prethodno zagrejan do 37 °C i alikvotovan na zagrejanu ploču sa 96 dubokih otvora u količinama od 3 mg po otvoru (0,3 mL) i držano na 37°C. Rastvor Bond-Breaker™ tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) rastvor (1 mM, 0,051 mL/otvor) je dodat antitelima, i reakciona smeša je održavana na 37 °C 75 minuta. Rastvor redukovanog antitela je prebačen na nezagrejanu ploču sa 96 dubokih otvora. Odgovarajući rastvori sintona (5 mM, 0,024 mL u DMSO) su dodati u otvore sa redukovanim antitelima i tretirani 15 minuta. Reakcioni rastvori su naneti na platformu (8 x 12) desaliniziranih kolona (NAP5, isprano sa DPBS 4x pre upotrebe), praćeno sa DPBS (0,3 mL) i eluirano sa dodatnim DPBS (0,8 mL). Prečišćeni ADC rastvori su dalje alikvotovani zbog analitike i čuvani na 4 °C.
[0291] Metoda G. Konjugacije su izvršene korišćenjem Tecan Freedom Evo robotskog sistema za rukovanje tečnošću. Rastvor antitela (10 mg/mL) je prethodno zagrejan do 37 °C i alikvotovan na zagrejanu ploču sa 96 dubokih otvora u količinama od 3 mg po otvoru (0,3 mL) i držano na 37°C. Rastvor Bond-Breaker™ tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) rastvor (1 mM, 0,051 mL/otvor) je dodat antitelima, i reakciona smeša je održavana na 37 °C 75 minuta. Rastvori redukovanog antitela su prebačeni na nezagrejanu ploču sa 96 dubokih otvora. Odgovarajući rastvori sintona (5 mM, 0,024 mL u DMSO) su dodati u otvore sa redukovanim antitelima a zatim je dodat borni pufer (pH=8, 0,03 mL/otvor) i tretirano 3 dana. Reakcioni rastvori su naneti na platformu (8 x 12) desaliniziranih kolona (NAP5, isprano sa DPBS 4x pre upotrebe), praćeno sa DPBS (0,3 mL) i eluirano sa dodatnim DPBS (0,8 mL). Prečišćeni ADC rastvori su dalje alikvotovani zbog analitike i čuvani na 4 °C.
[0292] Metoda H. Rastvor Bond-Breaker™ tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) rastvor (10 mM, 0,17 mL) je dodat rastvoru antitela (10 mg/mL, 10 mL) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zagrevana do 37 °C tokom 75 minuta. Rastvor sintona (10 mM, 0,40 mL u DMSO) je dodat rastvoru redukovanog antitela ohlađenom na sobnu temperaturu. Reakcioni rastvor je ostavljen da miruje 30 minuta na sobnoj temperaturi. Rastvor ADC je tretiran sa zasićenim rastvorom amonijum sulfata (~2-2,5 mL) sve dok se nije formirao blago zamućen rastvor. Ovaj rastvor je nanet na kolonu butil sefaroze (5 mL butil sefaroze) ekvilibriranu sa 30% faze B u fazi A (faza A: 1,5 M amonijum sulfat, 25 mM fosfata; faza B: 25 mM fosfata, 25% izopropanola v/v). Pojedinačne frakcije sa DAR2 (takođe nazvane “E2”) i DAR4 (takođe nazvane “E4”) su eluirale nakon primene gradijenta A/B do 75% faze B. Svaki ADC rastvor je koncentrovan i zamenjen puferom korišćenjem koncentratora za centrifugu ili TFF za veće skale. Prečišćeni ADC rastvori su filtrirani kroz 0,2 mikron, špric filter od 13 mm sa slabim proteinskim vezivanjem i čuvani na 4 °C.
[0293] Metoda I. Rastvor Bond-Breaker™ tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) rastvor (10 mM, 0,17 mL) je dodat rastvoru antitela (10 mg/mL, 10 mL) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zagrevana do 37 °C tokom 75 minuta. Rastvor sintona (10 mM, 0,40 mL u DMSO) je dodat rastvoru redukovanog antitela ohlađenom na sobnu temperaturu. Reakcioni rastvor je ostavljen da miruje 30 minuta na sobnoj temperaturi. Rastvor ADC je tretiran sa zasićnim rastvorom amonijum sulfata (~2-2,5 mL) sve dok se nije formirao blago mutan rastvor. Ovaj rastvor je nanet na kolonu butil sefaroze (5 mL butil sefaroze) ekvilibriranu sa 30% faze B u Fazi A (faza A: 1,5 M amonijum sulfat, 25 mM fosfata; faza B: 25 mM fosfata, 25% izopropanola v/v). Pojedinačne frakcije sa DAR2 (takođe nazvane “E2”) i DAR4 (takođe nazvane “E4”) su eluirale nakon primene gradijenta A/B do 75% faze B. Svaki ADC rastvor je koncentrovan i zamenjen puferom korišćenjem koncentratora za centrifugu ili TFF za veće skale. ADC rastvori su tretirani sa bornim puferom (0,1 mL, 1M, pH 8). Reakcioni rastvor je ostavljen da miruje 3 dana na sobnoj temperaturi, a zatim nanet na desalinizirajuću kolonu (PD10, isprano sa DPBS 3x5mL pre upotrebe), a zatim DPBS (1,6 mL) i eluiran sa dodatnim DPBS (3 mL). Prečišćen ADC rastvor je filtriran kroz 0,2 mikron, špric filter od 13 mm sa slabim proteinskim vezivanjem i čuvan na 4 °C.
DAR i agregacija ADC
[0294] DAR i procenat agregacije sintetizovanih ADC je utvrđen sa LC-MS i hromatografijom koja isključuje veličinu (SEC), respektivno.
LC-MS generalna metodologija
[0295] LC-MS analiza je sprovedena korišćenjem Agilent 1100 HPLC sistema povezanog sa Agilent LC/MSD TOF 6220 ESI masenim spektrometrom. ADC je redukovan sa 5 mM (konačna koncentracija) Bond-Breaker® TCEP solution (Thermo Scientific, Rockford, IL), nanet na Protein Microtrap (Michrom Bioresorces, Auburn, CA) desalinizirajući kertridž, i eluiran sa gradijentom od 10% B do 75% B u 0,2 minuta na temperaturi okruženja. Mobilna faza A je bila H2O sa 0,1% mravlje kiseline (FA), mobilna faza B je bila acetonitril sa 0,1% FA, i brzina protoka je bila 0,2 mL/min. Maseni spektri elektrosprej-jonizacije-vremena-leta koeluirajućih lakih i teških lanaca su stečeni korišćenjem Agilent MassHunter™ akvizicionog softvera. Ekstraktovan intenzitet u odnosu na m/z spektar je dekonvoluisan korišćenjem Maximum Entropy opcije MassHunter softvera za utvrđivanje mase svakog redukovanog antitelnog fragmenta. DAR je izračunat iz dekonvoluisanog spektra zbrajanjem intenziteta golih i modifikovanih pikova za laki lanac i teški lanac, normalizovano množenjem intenziteta brojem prikačenih lekova. Sumirani, normalni intenziteti su podeljeni zbirom intenziteta, i rezultati zbrajanja za dva laka lanca i dva teška lanca su proizveli konačnu prosečnu DAR vrednost za pun ADC.
[0296] Tiosukcinimidna hidroliza biokonjugata se može pratiti elektrosprejnom masenom spektrometrijom, obzirom da dodavanje vode konjugatu dovodi do povećanja od 18 daltona do vidljive molekularne težine konjugata. Kada je konjugat pripreman potpuno redukujući interlančane disulfide ljudskog IgG1 antitela i konjugujući maleimidne derivate za svaki od nastalih cisteina, svaki laki lanac antitela će sadržati jednu maleimidnu modifikaciju i svaki teški lanac će sadržati tri maleimidne modifikacije, kao što je opisano na Slici 2. Nakon završetka hidrolize dobijenih
4
tiosukcinimida, masa lakog lanca će se zbog toga povećati za 18 Daltona, dok će se masa teškog lanca povećati za 54 Daltona. Ovo je ilustrovano na Slici 5 sa konjugacijom i daljom hidrolizom primernog maleimidnog povezivača leka (sinton TX, molekularna težina 1736 Da) do potpuno redukovanog huAb13v1 antitela.
Opšta metodologija hromatografije koja isključuje veličinu
[0297] Hromatografija koja isključuje veličinu je sprovedena korišćenjem Shodex KW802.5 kolone u 0,2 M kalijum fosfatu pH 6,2 sa 0,25 mM kalijum hlorida i 15% IPA pri brzini protoka od 0,75 ml/min. Pik apsorbancije površine na 280 nm je određen za svaku od većih molekulskih težina i monomernih eluenata integracijom oblasti ispod krive. % agregatne frakcije konjugatnog uzorka je utvrđen deljenjem pika apsorbancije površine na 280 nm za visoku molekulsku težinu eluenta sa zbirom pika apsorbancija površine na 280 nm visoke molekulske težine i monomernih eluenata pomnoženih sa 100%.
Metode ispitivanja ćelijske vijabilnosti in vitro
[0298] Ćelijske linije tumora HCC38 (karcinom dojke), NCI-H1650 (NSCLC) i NCI-H847 (ćelijska linija sitnoćelijskog karcinoma pluća) su dobijene od Američke zbirke tipa kulture (ATCC). Ćelije su uzgajane na pločama kulture sa 96 otvora korišćenjem preporučenog medijuma rasta preko noći pri gustini od 5 x 10<3>(HCC38) ili 20 x 10<3>(NCI-H847) ili 40 x 10<3>(NCI-H1650) po otvoru. Sledećeg dana, tretmani su dodati u svežem medijumu kako bi utrostručili otvore. Ćelijska vijabilnost je utvrđena 5 dana kasnije upotrebom CellTiter-Glo kompleta za ispitivanje vijabilnosti luminiscentnih ćelija (Promega), kao što je naznačeno protokolom proizvođača. Ćelijska vijabilnost je procenjena kao procenat kontrolnih netretiranih ćelija.
Primer 8: In vivo efikasnost anti-B7-H3 konjugata antitelnog leka
[0299] Od devet testiranih himernih antitela testiranih in vitro konjugovanih za CZ sintone, četiri su pokazala subnanomolarnu toksičnost (Tabela 6). chAb3-CZ, chAb18-CZ i chAb13-CZ su postigli DARS u opsegu od 2,6 do 4,2 (videti Tabelu 7) i procenjena su na antitumorsku aktivnost u mišjoj ćelijskoj liniji sitnoćelijskog karcinoma pluća ksenograft modela NCI-H146, ljudskog porekla, upotrebom metoda opisanih u nastavku. Antitelo MSL109 (IgG1 antitelo koje se vezuje za citomegalovirus (CMV) glikoprotein H) je korišćeno kao kontrola, i kao golo antitelo i kao ADC (konjugovano za isti sinton (CZ) kao chAb3, chAb18 i chAb13 antitela). MSL109 je izotip podudarajuća neciljajuća kontrola. Metode ovog ksenograft testa su opisane u nastavku. Rezultati su predstavljeni u Tabeli 7. Rezultati pokazuju da je svaki od ADC koji inhibira anti-B7-H3 Bcl-xL uspeo značajno da inhibira rast tumora u odnosu na kontrolu golog antitela (MSL109) ili neciljanu specifičnu Bcl-xL ADC kontrolu (MSL109-CZ).
Tabela - - -
Evaluacija efikasnosti u metodama ksenograftskih modela
[0300] NCI-H146 ćelije, NCI-1650 ćelije i EBC-1 ćelije su dobijene iz Američke zbirke tipa kulture (ATCC, Manassas, VA). Ćelije su kultivisane kao monoslojevi u RPMI-1640 (NCI-H146, NCI-H1650) ili MEM (EBC1) medijumu kulture (Invitrogen, Carlsbad, CA) koji je dopunjen sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Hyclone, Logan, UT). Za generisanje ksenograftova, 5x10<6>vijabilnih ćelija je inokulisano subkutano u desni bok imuno deficijentnih ženki SCID/bg miševa (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) respektivno. Injekciona zapremina je bila 0,2 mL i stastavljena od 1:1 smeše S MEM i Matrigel (BD, Franklin Lakes, NJ). Veličine tumora su bile približno 200 mm<3>. Antitela i konjugati su formulisani u 0,9% natrijum hlorida za injekciju i ubrizgani intraperitonealno. Injekciona zapremina nije prešla 200 uL. Terapija je počela u roku od 24 sata nakon podudaranja veličine tumora. Miševi su imali težinu od približno 22 g na početku terapije. Zapremina tumora je procenjivana dva do tri puta nedeljno. Merenja dužine (L) i širine (W) tumora su sprovođena pomoću elektronskog kalipera a zapremina je računata prema sledećoj jednačini V = L x W<2>/2. Miševi su eutanazirani kada je zapremina tumora dostigla 3,000 mm<3>ili su se pojavile ulceracije na koži. Osam miševa je držano po kavezu. Hrana i voda su bili dostupni ad libitum. Miševi su aklimatizovani u objektima za životinje tokom perioda od najmanje nedelju dana pre početka eksperimenata. Životinje su testirane u svetloj fazi od 12 časova svetla: 12 časova mraka raspored (svetla se pale u 06:00 sati). Kao što je opisano u prethodnom tekstu, ljudsko IgG kontrolno antitelo (MSL109) je korišćeno kao agens negativne kontrole.
[0301] Da bi se uputilo na efikasnost terapeutskih agenasa, koriste se parametri amplitude (TGImax), trajnosti (TGD) terapeutskog odgovora. TGImaxje maksimalna inhibicija rasta tumora tokom eksperimenta. Inhibicija rasta tumora se izračunava sa 100∗(1-Tv/Cv) pri čemu Tvi Cvsu srednje zapremine tumora tretirane i kontrolne grupe, respektivno. TGD ili odlaganje rasta tumora je produženo vreme tretiranog tumora potrebno da bi dostigao zapreminu od 1 cm<3>u odnosu na kontrolu grupu. TGD se izračunava sa 100∗(Tt/Ct-1) pri čemu Tti Ctsu srednji vremenski periodi za dostizanje 1 cm<3>tretirane i kontrolne grupe, respektivno.
Primer 9: Humanizacija anti-B7-H3 antitela chAb18
[0302] Anti-B7-H3 himerno antitelo chAb18 je izabrano za humanizaciju na osnovu svojih karakteristika vezivanja i povoljnih svojstava kao ADC, uključujući svoja svojstva kada je konjugovano za inhibitor Bcl-xL (opisano u prethodnom tekstu kao primerni konjugat CZ).
[0303] Humanizovana anitela su generisana na osnovu varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) CDR sekvenci chAb18. Specifično, sekvence ljudske klice su izabrane za konstruisanje CDR graftovanih, humanizovanih chAb18 antitela, gde su CDR domeni VH i VL lanaca graftovani na različite ljudske akceptorske sekvence teškog i lakog lanca. Na osnovu poravnanja sa VH i VL sekvencama monoklonskog antitela chAb18, sledeće ljudske sekvence su izabrane kao akceptori:
! IGHV1-69∗06 i IGHJ6∗01 za konstruisanje akceptorskih sekvenci teškog lanca
! IGKV1-9∗01 i IGKJ2∗01 za konstruisanje akceptorskih sekvenci lakog lanca
! IGKV6-21∗01 i IGKJ2∗01 kao rezervni akceptor za konstruisanje lakog lanca
[0304] Stoga, VH i VL CDR od chAb18 su graftovani u pomenute akceptoske sekvence.
[0305] Da bi se generisala humanizovana antitela, identifikovane su okvirne povratne mutacije i uvedene u CDR-graftovane sekvence antitela de novo sintezom varijabilnog domena, ili mutagenim oligonukleotidnim prajmerima i polimeraznim lančanim reakcijama, ili oba putem dobro poznatih metoda u struci. Različite kombinacije povratnih mutacija i drugih mutacija su konstruisane za svaki od CDR-graftova kao što je opisano u nastavku teksta. Brojevi ostatka za ove mutacije su bazirani na Kabat sistemu numerisanja.
[0306] Za teške lance huAb 18VH.1, jedan ili više od sledećih Vernier i VH/VL međusobno povezanih ostataka su povratno mutirani kao što sledi: L46P, L47W, G64V, F71H. Dodatne mutacije uključuju sledeće: Q1E, N60A, K64Q, D65G. Za lake lance huAb18VL.1, jedan ili više od sledećih Vernier i VH/VL međusobno povezanih ostataka su povratno mutirani kao što sledi: A43S, L46P, L47W, G64V, G66V, F71H. Za lake lance huAb18VL.2, jedan ili više od sledećih Vernier i VH/VL međusobno povezanih ostataka su povratno mutirani kao što sledi: L46P, L47W, K49Y, G64V, G66V, F71H.
[0307] Varijabilni region i CDR aminokiselinske sekvence humanizovanih antitela su opisane u Tabeli 8 u nastavku.
T l H i L min ki lin k k n h m niz nih rzi hA 1
[0308] Humanizovani varijabilni regioni murinskog monoklonskog Ab18 (opisani u prethodnom tekstu) su klonirani u IgG ekspresione vektore radi funkcionalne karakterizacije:
! Humanizovan Ab18VH.1 (huAb 18VH.1) je CDR-graftovan, humanizovan Ab18VH koji sadrži IGHV1-69∗06 i IGHJ6∗01 okvirne sekvence. Takođe sadrži promenu Q1E radi sprečavanja stvaranja piroglutamata. Varijabilna i CDR sekvence f huAb18VH.1 su opisane u Tabeli 8.
! Humanizovan Ab18VH1.a (huAb18VH.1a) je humanizovan dizajn baziran na huAb 18VH.1 i sadrži 4 predložene okvirne povratne mutacije: M48I, V67T, L69I, K73R. Varijabilna i CDR sekvence huAb18VH.1a su opisane u Tabeli 8. ! Humanizovan Ab18VH1.b (huAb 18VH.1b) je humanizovan dizajn baziran na huAb 18VH.1 i huAb18VH.1a i sadrži 1 predloženu okvirnu povratnu mutaciju L69I i 3 HCDR2 promene klijanja N60A, K64Q, D65G. Varijabilna i CDR sekvence huAb18VH.1b su opisane u Tabeli 8.
! Humanizovan Ab18VL.1 (huAb 18VL.1) je CDR graftovan, humanizovan Ab18 VL koji sadrži IGKV1-9∗01 i IGKJ2∗01 okvirne sekvence. Varijabilna i CDR sekvence huAb18VL.1 su opisane u Tabeli 8.
! Humanizovan Ab18VL.1a (huAb 18VL.1a) je humanizovan dizajn baziran na huAb 18VL.1 i sadrži 6 predloženih okvirnih povratnih mutacija: A43S, L46P, L47W, G64V, G66V, F71H. Varijabilni i CDR sekvence huAb18VL.11 su opisane u Tabeli 8.
! Humanizovan Ab18VL.1b (huAb 18VL.1b) je humanizovan dizajn baziran na huAb 18VL.1 i huAb18VL.1a i sadrži 4 predložene okvirne povratne mutacije: L46P, L47W, G64V, F71H. Varijabilni i CDR sekvence huAb18VL.1b su opisane u Tabeli 8.
! Humanizovan Ab18VL.2 (huAb18VL.2) je CDR-graftovan, humanizovan Ab18 VL koji sadrži IGKV6-21∗01 i IGKJ2∗01 okvirne sekvence. Varijabilna i CDR sekvence huAb18VL.2 su opisane u Tabeli 8.
! Humanizovan Ab18VL.2a (huAb18VL.2a) je humanizovan dizajn baziran na huAb18VL.2 i sadrži 6 predloženih okvirnih povratnih mutacija: L46P, L47W, K49Y, G64V, G66V, F71H. Varijabilni i CDR sekvence huAb18VL.2a su opisane u Tabeli 8.
[0309] Stoga, humanizacija chAb18 je imala za rezultat 10 humanizovanih antitela, uključujući huAb18v1, huAb18v2, huAb18v3, huAb18v4, huAb18v5, huAb18v6, huAb18v7, huAb18v8, huAb18v9 i huAb18v10. Varijabilni i teški laki lanci za svaku od ovih humanizovanih verzija Ab18 su dati u nastavku:
Tabela 9: Anti-B7-H3 Ab18 hum niz n n i l
Primer 10: In vitro karakterizacija anti-B7-H3 chAb18 humanizovanih varijanti
[0310] Humanizacija chAb18 je generisala 10 varijanti (opisane u prethodnom tekstu u Tabeli 9) koje su zadržale vezivanje za ljudski i cino B7-H3 kako je procenjeno sa FACS (metoda koja je opisana u prethodnom tekstu u Primeru 6). Ove varijante su dodatno karakterisane za vezivanje sa SPR i uspešno su konjugovane za inhibitor Bcl-xL sinton CZ korišćenjem metode A (opisana u prethodnom tekstu) i procenjene na ćelijsku citotoksičnost kao što je opisano u Primeru 7. Tabela 10 sumira in vitro karakteristike različitih humanizovanih varijanti Ab18. Parentalni chAb18 iz kog su varijante izvedene je takođe testiran kao komparator. Sve humanizovane varijante su imale slična svojstva vezivanja procenjena sa biacore, i zadržale aktivnost vezivanja za ćelijsku površinu eksprimirano kao konjugati sa CZ sintonom. Citotoksičnost svih varijanti kao CZ sintona je bila slična sa chAb18 iz koje su izvedene.
- -
[0311] Humanizovane chAb18 varijante su konjugovane za CZ sinton i testirane na citotoksičnost u HCC38 ćelijskoj liniji. Kao što je opisano u Tabeli 10, većina humanizovanih antitela je pokazala potentnu citotoksičnost, sličnu onoj uočenoj sa kontrolnim antitelom chAb18.
Primer 11: In vivo efikasnost humanizovanih Ab18 varijanti kao Bcl-xL Inhibitora ADC
[0312] Šest humanizovanih chAb18 varijanti je izabrano na osnovu rezultata in vitro citotoksičnosti opisanih u Primeru 10. Specifično, antitela huAb18v1, huAb18v3, huAb18v4, huAb18v6, huAb18v7 i huAb18v9 su svako konjugovano za CZ sinton (kako bi formiralo anti-B7-H3 CZ ADC) radi evaluacije u in vivo modelu ksenografta sitnoćelijskog karcinoma pluća (korišćenje NCI-H146 ćelija), kao što je opisano u Primeru 8. Jedan dozni tretman miševa koji nose tumor je imao za rezultat inhibiciju rasta tumora i odlaganje rasta tumora i rezultati su objedinjeni u Tabeli 11. Ab095 je korišćen kao negativna kontrola za efekat primenjenog IgG, jer je izotipski podudarno neciljano specifično antitelo podignuto protiv tetanusnog toksoida. Videti Larrick et al., 1992, Immunological Reviews 69-85. Miševi su administrirani sa 6 mg/kg ADC intraperitonealno QDx1.
Tabela 11 - - -
[0313] Kao što je opisano u Tabeli 11, svako od testiranih humanizovanih antitela je uspelo da inhibira rast tumora u mišjem ksenograft modelu.
Primer 12: Humanizacija anti-B7-H3 antitela chAb3
[0314] Anti-B7-H3 himerno antitelo chAb3 je izabrano za humanizaciju na osnovu svojih povoljnih svojstava kao konjugat (Bcl-xLi) koji inhibira Bcl-xL. Humanizovana antitela su generisana na osnovu varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) CDR sekvenci chAB3. Specifično, sekvence ljudske klice su izabrane za konstruisanje CDR-graftovanih, humanizovanih chAb3 antitela gde su CDR domeni VH i VL lanaca chAb3 graftovani na različite ljudske akceptorske sekvence teškog i lakog lanca. Na osnovu poravnanja sa VH i VL sekvencama monoklonskog antitela chAb3 sledeće ljudske sekvence su izabrane kao akceptori:
! IGHV1-69∗06 i IGHJ6∗01 za konstruisanje akceptorskih sekvenci teškog lanca
! IGKV2-28∗01 i IGKJ4∗01 za konstruisanje akceptorskih sekvenci lakog lanca
IGHV1-69 ∗ 06 IGHJ6
gde xxxxxxxx predstavlja CDR-H3 region.
IGKV2-28 ∗ 01 IGKJ4
gde xxxxxxxxx predstavlja CDR-L3 region.
[0315] Graftovanjem odgovarajućih VH i VL CDR chAb3 na odgovarajuće akceptorske sekvence, pripremane su CDR-graftovane, humanizovane i modifikovane VH i VL sekvence. Za generisanje humanizovanih antitela sa potencijalnim okvirnim povratnim mutacijama, mutacije su identifikovane i uvedene u CDR-graftovane antitelne sekvence de novo sintezom varijabilnog domena, ili mutagenim oligonukleotidnim prajmerima i polimeraznim lančanim reakcijama, ili sa oba. Različite kombinacije povratnih mutacija i drugih mutacija su konstruisane za svaki od CDR-graftova kao što sledi. Brojevi ostataka za ove mutacije su bazirani na Kabat sistemu numerisanja.
[0316] Aminokiselinske sekvence različitih humanizovanih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca su opisane u Tabeli 12 u nastavku.
[0317] Za teške lance huAb3VH.1, jedan ili više od sledećih Vernier i VH/VL međusobno povezanih ostataka su povratno mutirani kao što sledi: M48I, V67A, I69L, A71V, K73R, M80V, Y91F, R94G. Za lake lance huAb31 VL.1, jedan ili više od sledećih Vernier i VH/VL međusobno povezanih ostataka su povratno mutirani kao što sledi: 12V, Y87F.
[0318] Sledeći humanizovani varijabilni regioni murinskog monoklonskog chAb3 antitela su klonirani u IgG ekspresione vektore radi funkcionalne karakterizacije:
! Humanizovan Ab3 VH.1 (huAb3VH.1) je CDR-graftovan, humanizovan Ab3 VH koji sadrži IGHV1-69∗06 i IGHJ6∗01 okvirne sekvence. Takođe sadrži promenu Q1E za sprečavanje stvaranja piroglutamata.
! Humanizovan Ab3 VH.1a (huAb3VH.1a) je humanizovan dizajn baziran na huAb3VH.1 i sadrži 8 predloženih okvirnih povratnih mutacija: M48I, V67A, I69L, A71V, K73R, M80V, Y91F, R94G.
! Humanizovan Ab3 VH.1b (huAb3VH.1b) je humanizovan dizajn između huAb3VH.1 and huAb3VH.1a i sadrži 6 predloženih okvirnih povratnih mutacija: M48I, V67A, I69L, A71V, K73R, R94G.
! Humanizovan Ab3 VL.1 (huAb3VL.1) je CDR-graftovan, humanizovan Ab3 VL koji sadrži IGKV2-28∗01 i IGKJ4∗01 okvirne sekvence.
! Humanizovan Ab3 VL.1a (huAb3VL.1a je humanizovan dizajn baziran na huAb3VL.1 i sadrži 2 predložene okvirne povratne mutacije: I2V, Y87F.
! Humanizovan Ab3 VL.1b (huAb3VL.1b) je humanizovan dizajn koji sadrži samo 1 predloženu okvirnu povratnu mutaciju: I2V.
[0319] Varijabilni region i CDR aminokiselinska sekvenca prethodno navedenih humanizovanih antitela su opisani u Tabeli 12 u nastavku.
Tab l 12 H i L k n h m niz nih rzi hA
1
[0320] Humanizacija chAb3 je rezultirala sa 6 humanizovanih antitela, uključujući huAb3v1, huAb3v2, huAb3v3, huAb3v4, huAb18v5 i huAb3v6. Varijabilni i teški laki lanci za svaku od ovih humanizovanih verzija Ab18 su dati u
2
Tabeli 13 u nastavku.
Tabela 13: Humanizovana Ab3 n i l
Primer 13: In vitro karakterizacija chAb3 humanizovanih varijanti
[0321] Humanizacija chAb3 generisanih 6 varijanti (opisano u Tabeli 13) koje su zadržale vezivanje za ljudski B7-H3 je procenjena sa FACS (kao što je opisano u Primeru 6). Ove varijante su dodatno karakterisane na vezivanje sa SPR i kao ADC konjugovani za sinton (povezna bojeva glava) CZ inhibitora Bcl-xL. Humanizovana Ab3 antitela su takođe procenjena na ćelijsku citotoksičnost (korišćenjem testa opisanog u prethodnom tekstu u Primeru 7). Tabela 14 zbraja in vitro karakteristike chAb3 humanizovanih varijanti. Kao kontrola je korišćen ADC koji obuhvata chAb3 konjugovan za sinton CZ.
T
Primer 14: In vivo efikasnost chAb3 humanizovanih varijanti kao Bcl-xL ADC
[0322] Dve humanizovane varijante (huAb3v2 i huAb3v6) su izabrane na osnovu potentnosti in vitro citotoksičnosti kao CZ konjugati i prihvatljivih agregacionih svojstava za evaluaciju kod in vivo murinskog ksenograft modela ćelija sitnoćelijskog karcinoma pluća (NCI-H146 ćelije) kao što je opisano u materijalima i metodama u Primeru 8. Jedan dozni tretman miševa koji nose tumor ima za rezultat inhibiciju rasta tumora i odlaganje rasta tumora kod oba humanizovana antitela konjugovana za primerni inhibitor Bcl-xL, a rezultati su sumirani u Tabeli 15.
T l 1 I fik n h m niz nih hA - Z ri n i
Primer 15: Modifikacije CDR humanizovanih varijanti antitela huAb3v2
[0323] huAb3v2 je prikazao povoljna svojstva vezivanja i uništavanja ćelije. Ispitivanje varijabilnog regiona aminokiselinske sekvence huAb3v2, ipak, je otkrilo potencijalna mesta za deamidaciju i/ili izomerizaciju.
[0324] Aminokiselinske sekvence huAb3 varijabilnih regiona su opisane u nastavku teksta, uključujući laki lanac (huAb3VL1) i teški lanac (huAb3VH1b). Potencijalna mesta deamidacije i/ili izomerizacije u CDR VH (CDR2 na aminokiselinskom "ds" i VL (CDR1 na aminokiselinskom "ng") su u kurzivu i tako su projektovana da poboljšaju proizvodnju antitela. CDR su opisani sa malim slovima u sekvencama u nastavku.
[0325] Da bi se napravile huAb3v2 varijante kojima nedostaju ova potencijalna mesta deamidacije i/ili izomerizacije, svaka od aminokiselina navedenih u nastavku (x i z; predstavljaju potencijalna mesta u CD1 VL i CDR VH) je mutagenizovana. Dobijene 30 VL varijanti su uparene sa originalnim huAb3v2 VH i testirane na vezivanje. Dobijenih 29 VH varijanti je upareno sa originalnim huAb3v2 VL i testirano na vezivanje. Uspešne VH varijante su spojene i testirane sa produktivnim VL varijantama koje sadrže promene u LCDR1 kako bi se napravile konačne humanizovane varijante bez potencijalnih mesta deamidacije i/ili izomerizacije u CDR. Aminokiselinske sekvence varijanti su date u Tabeli 16 u nastavku teksta. Aminokiselinske sekvence pune dužine teškog lanca i lakog lanca huAb3v2 varijante, huAb3v2.5 su date u sekvencama identifikacionih brojeva: 170 i 171, respektivno. Aminokiselinske sekvence pune dužine teškog i lakog lanca huAb3v2 varijante, huAb3v2.6 su date u sekvencama identifikacionih brojeva: 172 i 173, respektivno.
huAb3 VL1
xg (15 varijanti) (sekvenca identifikacionog broja: 178)
nz (15 varijanti) (sekvenca identifikacionog broja: 179)
huAb3 VHlb
(15 varijanti) xs (sekvenca identifikacionog broja: 180)
(14 varijanti) dz (sekvenca identifikacionog broja: 181)
gde (i za VL i za VH),
x= sve aminokiseline, izuzev: M, C, N, D ili Q.
z= sve aminokiseline, izuzev: M, C, G, S, N ili P.
Predložene okvirne povratne mutacije su podvučene (videti Primer 12).
Tabe
4
Primer 16: In vitro karakterizacija huAb3v2 varijanti
[0326] Uklanjanje potencijalnih mesta deamidacije i/ili izomerizacije (opisano u Primeru 15) je generisalo samo 6 varijanti koje su zadržale vezivanje i za ljudski i za cino B7-H3 egzogeno eksprimiran kod mišjih 3T12 fibroblasta kako je procenjeno FACS (kao što je opisao u metodama Primera 6).
[0327] Ova nova anti-B7-H3 antitela su dalje karakterisana za vezivanje sa SPR i konjugovana za Bcl-xL sinton CZ i procenjena radi ćelijske citotoksičnosti (korišćenjem metoda opisanih u Primeru 7). Tabela 17 pruža in vitro karakteristike za šest huAb3v2 humanizovanih varijanti.
Tabela 17: In vitro karakterizacija humanizovanih huAb3v2 varijanti, uključujući gola antitela i ADC
[0328] Kao što je opisano u Tabeli 17, rezultati pokazuju da svih šest huAb3v2 varijanti ima slična svojstva vezivanja za ćelije koje eksprimiraju ljudski ili cinoB7-H3 u poređenju sa parentalnim huAb3v2. Od šest huAb3v2 varijanti, četiri antitela (huAb3v2.5, huAb3v2.6, huAb3v2.8, huAb3v2.9) su pokazala potentnu citotoksičnost u H847 ćelijama kada se konjuguju za primerni Bcl-xL sinton CZ.
Primer 17: Humanizacija anti-B7-H3 antitela chAb13
[0329] Anti-B7-H3 himerno antitelo chAb13 je izabrano za humanizaciju na osnovu svojih karakteristika vezivanja i pogodnih svojstava kao ADC (konjugovano za inhibitor Bcl-xL).
[0330] Pre humanizacije, chAb13 je modifikovano kako bi se minimizovala potencijalna deamidacija u lakom lancu CDR3 (QQYNSYPFT (sekvenca identifikacionog broja: 182); potencijalno mesto deamidacije je naznačeno kao ostaci “NS” (kurziv). Uvedene su tačkaste mutacije u aminokiselinskoj poziciji koje odgovaraju “N” i/ili “S” unutar lakog lanca CDR3 chAb13, rezultirajući sa 30 varijanti. Antitela koja sadrže ove varijante lakog lanca CDR3 su zatim ispitane na njihovu mogućnost da zadrže karakteristike vezivanja chAb13. Varijante koje obuhvataju CDR3 koji ima triptofan (W) tačkastu mutaciju umesto serina “S” u “NS” motivu (to jest, QQYNWYPFT (sekvenca identifikacionog broja: 39)) su zadržale vezujuća svojstva parentalnog chAb13 antitela. Supstitucija S ostatka sa W ostatkom unutar CDR3 je bila iznenađujuća obzirom na date strukturne razlike između serina i triptofana kao i na značajnu ulogu koju ima CDR3 u vezivanju antigena.
[0331] Humanizovana antitela su generisana na osnovu varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) CDR sekvenci chAb13, uključujući “NW” lakog lanca CDR3. Specifično, sekvence ljudskih klica su izabrane za konstruisanje CDR-graftovanih, humanizovanih chAb13 antitela, gde su CDR domeni VH i VL lanaca graftovani na različite ljudske akceptorske sekvence teškog i lakog lanca. Na osnovu poravnanja sa VH i VL sekvencama monoklonskog antitela chAb13, sledeće ljudske sekvence su izabrane kao akceptori:
! IGHV4-b∗01(0-1) i IGHJ6∗01 za konstruisanje akceptorskih sekvenca teškog lanca
! IGKV1-39∗01 i IGKJ2∗01 za konstruisanje akceptorskih sekvenca lakog lanca
! IGHV4-b_IGHJ6
gde xxxxxxx predstavlja CDR-H3 region
IGKV1-39_IGKJ2
gde xxxxxxxxx predstavlja CDR-L3 region.
[0332] Graftovanjem “NW” lakog lanca CDR3 i preostalih pet odgovarajućih VH i VL CDR od chAb13 na pomenute akceptorske sekvence, pripremljene su CDR-graftovane, humanizovane i modifikovane VH i VL sekvence. Za generisanje humanizovanih antitela sa potencijalnim okvirnim povratnim mutacijama, mutacije su identifikovane i uvedene u CDR-graftovane antitelne sekvence de novo sintezom varijabilnog domena, ili mutagenim oligonukleotidnim prajmerima i polimeraznim lančanim reakcijama, ili sa oba, metodama koje su dobro poznate u struci. Različite kombinacije povratnih mutacija i drugih mutacija su konstruisane za svaki od CDR-grafta kao što sledi. Brojevi ostataka ovih mutacija se baziraju na Kabat sistemu numerisanja.
[0333] Sledeći humanizovani varijabilni regioni murinskih monoklonskih chAb13 antitela su klonirani u IgG ekspresione vektore radi funkcionalne karakterizacije:
! Humanizovan Ab13 VH.1 (huAb13VH.1) je CDR-graftovan, humanizovan Ab13 VH koji sadrži IGHV4-b∗01(0-1) i IGHJ6∗01 okvirne sekvence. Takođe sadrži promenu Q1E za sprečavanje stvaranja piroglutamata.
! Humanizovan Ab13 VH.1 (huAb13 VH.1a) je humanizovan dizajn baziran na huAb13VH.1 i sadrži 9 predloženih okvirnih povratnih mutacija: S25T, P40F, K43N, I48M, V67I, T68S, V71R, S79F, R94G.
! Humanizovan Ab13 VH.1b (huAb13VH.1b) je intermedijerni dizajn između huAb13VH.1 i huAb13VH.1a i sadrži 4 predložene okvirne povratne mutacije: K43N, I48M, V67I, V71R.
! Humanizovan Ab13 VL.1 (huAb13VL.1) je CDR-graftovan, humanizovan Ab13 VL koji sadrži IGKV1-39∗01 i IGHJ6∗01 okvirne sekvence.
! Humanizovan Ab13 VL.1a (huAb13VL.1a) je humanizovan dizajn baziran na huAb13VL.1 i sadrži 4 predložene okvirne povratne mutacije: A43S, L46A, T85E, Y87F.
! Humanizovan Ab13 VL.1b (huAb13VL.1b) je intermedijerni dizajn između huAb13VL.1 i huAb13VL.1a i sadrži 1 predloženu okvirnu povratnu mutaciju: Y87F.
[0334] Varijabilni region i prethodno navedena CDR aminokiselinska sekvenca su opisani u Tabeli 18 u nastavku.
1
Tab
2
Primer 18: Generisanje varijanti huAb13
[0335] 3 VH i 3 VL regiona aminokiselinske sekvence humanizovanih Ab13 varijanti opisanih u Tabeli 18 je upareno da bi se generisalo 9 huAb13 varijanti opisanih u Tabeli 19. Aminokiselinske sekvence pune dužine teškog lanca i lakog lanca huAb13v1 varijante, huAb13v1 su date u sekvencama identifikacionih brojeva: 168 i 169, respektivno.
Ta
4
Primer 19: Karakterizacija huAb13 VL.1a humanizovanih varijanti
[0336] Devet huAb13 varijanti opisanih u Primerima 17 i 18 su generisane i testirane na vezivanje za B7-H3 sa FACS (u skladu sa metodama opisanim u Primeru 6). Šest varijanti se nije vezalo za ljudski B7-H3. Preostale tri varijante su dalje karakterisane na vezivanje sa SPR i konjugovane (putem metode A) za inhibitor Bcl-xL (specifično bojna glava povezivača (ili sinton) CZ) i procenjena na ćelijsku citotoksičnost (prema metodama opisanim u Primeru 7). Tabela 20 pruža in vitro karakteristike ovih varijanti.
[0337] HuAb13v1 je izabrana za dalju studiju delom zbog svoje potentne i superiorne citotoksičnosti protiv H847 ćelija i sličnih karakteristika vezivanja kao chAb13 iz kog je izveden. Suprotno tome, huAb13v5 i huAb13v6 su pokazale lošu kinetiku uklapanja u Biacore eksperimentima što ukazuje da su njihova vezujuća svojstva divergentnija od parentalnog chAb13 u odnosu na huAb13v1 i da imaju redukovanu aktivnost u testu uništavanja ćelije.
Primer 20: In vitro potencija izabranih humanizovanih B7-H3 antitela sa primernim bojnim glavama povezivača inhibitora Bcl-xL (sintoni)
[0338] Humanizovana antitela huAb13v1, huAb3v2.5 i huAb3v2.6 su izabrana da budu konjugovana sa nekoliko Bcl-xL inhibitora nosivosti (ili sintona) na 3 mg skali korišćenjem metoda A, E i G, kao što je opisano u Primeru 7. Antitumorska aktivnost ovih ADC je testirana testovima citotoksičnosti korišćenjem NCI-H1650 ćelijske linije nesitnoćelijskog karcinoma pluća kao što je opisano u Primeru 7. Kao kontrola, takođe je evaluirana in vitro antitumorska aktivnost ADC koji sadrže neciljano antitelo MSL109 (monoklonsko antitelo koje se vezuje za CMV glikoprotein H konjugovan za Bcl-xL inhibitor opterećenja (ili sintona)). Rezultati su opisani u Tabeli 21.
Tabela 21. In vitro citotoksičnost tumorske ćelije izabranih humanizovanih B7-H3 ADC sa primernim bojnim glavama (sintoni) pov -
[0339] Suprotno niskoj antitumorskoj aktivnosti ispoljenoj od strane ADC koje sadrže neciljano antitelo MSL109 konjugovano za Bcl-xL inhibitor opterećenja, B7-H3 koje ciljaju ADC su ispoljile veće uništavanje tumorske ćelije, što odražava isporuku zavisnu od antigena ADC koji ciljaju B7-H3 ka tumorskim ćelijama koje ekprimiraju B7-H3.
[0340] Testirana je antitumorska aktivnost kod dva od ovih ADC u testovima citotoksičnosti korišćenjem NCI-H146 ćelijske linije sitnoćelijskog karcinoma pluća kao što je opisano u Primeru 7. Rezultati su opisani u Tabeli 22.
Tabela 22. In vitro citotoksičnost tumorske ćelije izabranih humanizovanih B7-H3 ADC sa primernim sintonima
-
[0341] huAb13v1-AAA E2 i huAb13v1-WD E2 su testirane na citotoksičnost korišćenjem H146 ćelija. Oba konjugata su pokazala potentnost uporedivu citotoksičnost.
Primer 21: In vivo analiza anti-B7-H3 ADC
[0342] Humanizovana anti-B7-H3 antitela huAb13v1, huAb3v2.5 i huAb3v2.6 su izabrana da budu konjugovana sa nekoliko Bcl-xL inhibitora opterećenja i evaluirana su u modelima ksenografta sitnoćelijskog karcinoma pluća (H146) kao konjugati korišćenjem broja bojnih glava (sintona) inhibitora Bcl-xL upotrebom metoda opisanih u Primeru 7 i Primeru 8. Rezultati su sumirani u Tabeli 23 i Tabeli 24.
Tabela 23: - -
Tabela 24: In v - -
[0343] Humanizovano anti-B7-H3 antitelo huAb13v1 je konjugovano sa WD sintonom inhibitora Bcl-xL i evaluirano u modelu ksenografta sitnoćelijskog karcinoma pluća pozitivnog na B7-H3 (H1650) kao konjugati korišćenjem metoda opisanih u Primeru 7 i Primeru 8. Kao kontrola, takođe je evaluirana in vivo antitumorska aktivnost neciljanog IgG izotipa koja se podudara sa antitelom (AB095). Rezultati su sumirani u Tabeli 25.
Tabela 25. - - -
[0344] Nasuprot uočenom manjku aktivnosti upotrebom neciljanog antitela Ab095 podudarenog sa IgG izotipom, BclxL ADC koji ciljaju B7-H3 su ispoljili inhibiciju rasta tumora (TGI) i odlaganje rasta tumora (TGD), kao što je prikazano u Tabelama 24 i 25, što odražava isporuku zavisnu od antigena ADC koji ciljaju B7-H3 koji isporučuju inhibitor Bcl-xL u ćelije tumora koje eksprimiraju B7-H3 u ovom mišjem modelu ksenografta. Kao dodatna kontrola, procenjena je in
1
vivo antitumorska aktivnost ADC koji sadrže neciljano antitelo MSL109 konjugovano sa sintonima inhibitora Bcl-xL u modelu ksenografta sitnoćelijskog karcinoma pluća (H1650) pozitivnog na B7-H3. Aktivnost ovih ADC je poređena sa antitelom podudarenim sa neciljanim IgG izotipom, AB095, kao kontrola. Kao što je prikazano u Tabeli 26, ADC koji sadrže neciljano antitelo MSL109 konjugovano za sintone inhibitora Bcl-xL ispoljavaju veoma skromnu inhibiciju rasta tumora i nisko ili bez odlaganja rasta tumora. Nasuprot tome, Bcl-xL ADC koji ciljaju B7-H3 (kao što je prikazano u Tabeli 25) su ispoljili mnogo veću inhibiciju rasta tumora (TGI) i odlaganje rasta tumora (TGD), što odražava isporuku zavisnu od antigena ovih ADC ka ćelijama koje eksprimiraju B7-H3 u mišjem modelu ksenografta.
Tabela 26. In vivo efikasn lu NSCLC
Primer 22: Kombinaciona terapija B7-H3
[0345] Antitumorska aktivnost huAb13v1 kao CZ ili TX konjugata kao prečišćeno DAR2 (E2) konjugati je karakterisana u modelima ksenografta nesitnoćelijskog karcinoma pluća (H1650, H1299, H1975 i EBC1) ljudskog porekla korišćenjem metoda opisanih u Primeru 8. Antitumorska aktivnost je procenjena kao monoterapija i u kombinaciji sa docetakselom (H1650, H1299, H1975 i EBC1). Rezultati su predstavljeni u Tabeli 27.
Tabela 27: In vivo efikasnost humanizovanih huAb13v1 anti-B7-H3 konjugata kao monoterapija i u kombinaciji sa docetaksel m
2
[0346] Rezultati predstavljeni u Tabeli 27 pokazuju da gore pomenuti, huAb13v1 kao CZ, TX, WD ili AAA prečišćeni DAR2 (E2) konjugati inhibiraju rast sva četiri NSCLC modela ksenografta kao monoterapija. Dodatno, huAb13v1 kao CZ, TX, WD ili AAA prečišćeni DAR2 (E2) konjugati efikasno kombinovani sa docetakselom kako bi se proizvela održivija inhibicija rasta tumora. Ovo je najdramatičnije ilustrovano u H1650 modelu ksenografta gde je kombinovana terapija imala za rezultat TGD od između 467% i >717%, dok su pojedinačne monoterapije imale rezultat TGD u opsegu 67% -158%. Ovi rezultati podržavaju kliničku korisnost ADC (Bcl-xLi) inhibitora Bcl-xL da se dozira u kombinaciji sa hemoterapijom.
SUMIRANJE SEKVENCI
[0347]
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
�
1
�
�
1
�
11
��
1
14
�
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
�
1
1
�
1
11
��
�
14
1
1
1
1
1
1
11

Claims (3)

  1. Patentni zahtevi 1. Anti-humani B7H3 (hB7-H3) antitelni konjugat leka (ADC) sadrži sledeću strukturu:
    pri čemu m je 2 a Ab je anti-hB7-H3 antitelo, gde antitelo Ab obuhvata teški lanac CDR3 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 35, teški lanac CDR2 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 34 i teški lanac CDR1 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 33; i laki lanac CDR3 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 39, laki lanac CDR2 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 38 i laki lanac CDR1 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci identifikacionog broja: 37.
  2. 2. Antitelni konjugat leka prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu identifikacionog broja: 147 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu identifikacionog broja: 144.
  3. 3. Antitelni konjugat leka prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo obuhvata teški lanac koji sadrži sekvencu identifikacionog broja: 168 i laki lanac koji sadrži sekvencu identifikacionog broja: 169.
RS20210139A 2016-06-08 2017-06-07 Anti-b7-h3 antitela i antitelske konjugacije lekova RS61828B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662347476P 2016-06-08 2016-06-08
US201662366511P 2016-07-25 2016-07-25
EP17732657.6A EP3458479B1 (en) 2016-06-08 2017-06-07 Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
PCT/US2017/036445 WO2017214335A1 (en) 2016-06-08 2017-06-07 Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61828B1 true RS61828B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=59153289

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210139A RS61828B1 (sr) 2016-06-08 2017-06-07 Anti-b7-h3 antitela i antitelske konjugacije lekova

Country Status (34)

Country Link
US (2) US10640563B2 (sr)
EP (3) EP3835322A3 (sr)
JP (2) JP6751165B2 (sr)
KR (1) KR102434626B1 (sr)
CN (2) CN109963870B (sr)
AU (2) AU2017279550A1 (sr)
CA (1) CA3027045A1 (sr)
CL (2) CL2018003520A1 (sr)
CO (1) CO2018013471A2 (sr)
CR (1) CR20180603A (sr)
CY (1) CY1123783T1 (sr)
DK (1) DK3458479T3 (sr)
DO (1) DOP2018000276A (sr)
EC (1) ECSP19000282A (sr)
ES (1) ES2861499T3 (sr)
HR (1) HRP20210170T1 (sr)
HU (1) HUE053356T2 (sr)
IL (2) IL300274A (sr)
LT (1) LT3458479T (sr)
MX (2) MX2018015271A (sr)
MY (1) MY199278A (sr)
PE (1) PE20190177A1 (sr)
PH (1) PH12018502601A1 (sr)
PL (1) PL3458479T4 (sr)
PT (1) PT3458479T (sr)
RS (1) RS61828B1 (sr)
RU (1) RU2764651C2 (sr)
SG (2) SG10201914119TA (sr)
SI (1) SI3458479T1 (sr)
TW (2) TW202304996A (sr)
UA (1) UA124198C2 (sr)
UY (1) UY37278A (sr)
WO (1) WO2017214335A1 (sr)
ZA (1) ZA201900059B (sr)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019526529A (ja) * 2016-06-08 2019-09-19 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｂ７−ｈ３抗体及び抗体薬物コンジュゲート
CN109963591B (zh) * 2017-08-04 2023-04-04 江苏恒瑞医药股份有限公司 B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途
WO2019225787A1 (ko) * 2018-05-24 2019-11-28 에이비엘바이오 주식회사 항-b7-h3 항체 및 그 용도
AU2019277094B2 (en) 2018-05-29 2025-12-18 Bristol-Myers Squibb Company Modified self-immolating moieties for use in prodrugs and conjugates and methods of using and making
CN112789291A (zh) * 2018-08-08 2021-05-11 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和肿瘤相关抗原的蛋白质
CN115141279B (zh) * 2018-09-26 2025-08-19 福州拓新天成生物科技有限公司 抗b7-h3的单克隆抗体及其在细胞治疗中的应用
CA3117102A1 (en) * 2018-10-26 2020-04-30 Janssen Biotech, Inc. Type i interferon signatures and methods of use
CN113330034A (zh) * 2018-11-16 2021-08-31 阿尔伯特爱因斯坦医学院 针对B7-H3的IgV结构域的单克隆抗体及其用途
CN112533955B (zh) * 2018-11-22 2023-06-09 苏州鑫康合生物医药科技有限公司 抗b7-h3抗体
WO2020140094A1 (en) * 2018-12-27 2020-07-02 Gigagen, Inc. Anti-b7-h3 binding proteins and methods of use thereof
CN109912718B (zh) * 2019-03-20 2020-12-11 北京善科生物科技有限公司 B7-h3抗原结合结构域的分离的结合蛋白、核酸、载体、car-t细胞及其应用
CN111808057B (zh) * 2019-04-10 2023-05-09 四川大学 利用α-O-烯基砜作为亲电试剂的铃木反应及其应用
PY2020118A (es) 2019-05-20 2022-10-27 Servier Lab Conjugados de anticuerpo-fármaco inhibidores de mcl-1 y sus métodos de uso
CN114173813A (zh) 2019-07-03 2022-03-11 晶体生物科学股份有限公司 抗b7-h3抗体及其使用方法
KR102732027B1 (ko) * 2019-07-09 2024-11-20 주식회사 와이바이오로직스 B7-h3(cd276)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
CN111454357B (zh) * 2019-08-14 2022-03-15 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种含有抗体的肿瘤治疗剂的开发和应用
CN110893236A (zh) * 2019-10-09 2020-03-20 中山大学 溶酶体靶向的抗体药物偶联物及其应用
AU2020387401A1 (en) * 2019-11-18 2022-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-B7-H3 monoclonal antibody and methods of use thereof
WO2021127428A1 (en) * 2019-12-18 2021-06-24 Albert Einstein College Of Medicine Chimeric antigen receptors targeting b7-h3 (cd276) and associated methods
CN115298198A (zh) 2020-01-21 2022-11-04 上海盟科药业股份有限公司 用于肾相关癌症靶向治疗的新型化合物和组合物
MX2022011780A (es) 2020-04-09 2022-11-10 Cytomx Therapeutics Inc Composiciones que contienen anticuerpos activables.
CN117024590A (zh) * 2020-04-22 2023-11-10 复星凯特生物科技有限公司 抗人b7-h3的单克隆抗体及其应用
EP4171655A4 (en) * 2020-06-26 2025-05-28 Intocell, Inc. Antibody-drug conjugates with anti-B7-H3 antibodies
CN112961242B (zh) * 2020-06-30 2022-01-04 广州百暨基因科技有限公司 抗b7h3抗体及其应用
WO2022104692A1 (en) * 2020-11-20 2022-05-27 Bliss Biopharmaceutical (Hangzhou) Co., Ltd. Engineered antibody, antibody-drug conjugate, and use thereof
EP4251209A1 (en) 2020-11-24 2023-10-04 Novartis AG Bcl-xl inhibitor antibody-drug conjugates and methods of use thereof
EP4265274B1 (en) * 2020-12-18 2025-03-19 Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. B7-h3 targeting antibody-drug conjugate, and preparation method therefor and use thereof
AU2021407023B2 (en) * 2020-12-23 2025-12-04 Fortvita Biologics (Singapore) Pte.Ltd. Anti-b7-h3 antibody and uses thereof
CN114763388B (zh) * 2021-01-13 2024-12-17 博生吉医药科技(苏州)有限公司 靶向b7-h3的car-t细胞及其在急性髓系白血病治疗中的应用
CN114763381B (zh) * 2021-01-13 2025-01-28 博生吉医药科技(苏州)有限公司 B7-h3嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用
CN114763382B (zh) * 2021-01-13 2024-12-17 博生吉医药科技(苏州)有限公司 靶向人cd276的单克隆抗体及其应用
AR124681A1 (es) 2021-01-20 2023-04-26 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr
KR20230145038A (ko) * 2021-02-09 2023-10-17 메디링크 테라퓨틱스 (쑤저우) 컴퍼니, 리미티드 생물활성 물질 접합체, 이의 제조방법 및 이의 용도
CN113358866B (zh) * 2021-04-22 2023-06-23 四川大学华西医院 基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法及应用
EP4329819A4 (en) * 2021-04-26 2025-09-24 Univ California COMBINATION THERAPY FOR THE TREATMENT OF GLIOBLASTOMA
CN113274502B (zh) * 2021-05-05 2023-01-03 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 用于特定型三阴乳腺癌免疫治疗的组合物
CN115894689A (zh) * 2021-09-30 2023-04-04 百奥泰生物制药股份有限公司 抗b7-h3抗体及其应用
JP2025508606A (ja) * 2022-02-25 2025-03-26 ナンジン、プロビオ、バイオテック、カンパニー、リミテッド ヒトｂ７－ｈ３に対する抗体及びその変異体
CN115073311B (zh) * 2022-03-23 2023-05-23 河南大学 一种高效制备n,n′-二（2羟乙基）苯胺的合成方法
TW202345904A (zh) * 2022-04-14 2023-12-01 瑞士商德彪製藥研究暨製造股份有限公司 具有改良之藥物動力學及藥物釋放特性之配體藥物結合物
IL316653A (en) 2022-05-20 2024-12-01 Novartis Ag Antibody drug conjugates
US20250387504A1 (en) 2022-05-20 2025-12-25 Novartis Ag Antibody-drug conjugates of antineoplastic compounds and methods of use thereof
CN118434454A (zh) * 2022-08-19 2024-08-02 北京三秀生物医药科技有限公司 一种抗衰老相关疾病的前药及其使用方法
WO2024114318A1 (zh) * 2022-11-29 2024-06-06 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 药物连接子化合物及其制备方法和用途
CN120787161A (zh) * 2023-01-30 2025-10-14 德克萨斯大学体系董事会 对B7-H3的4Ig同种型具有选择性的抗体及其使用方法
EP4676540A1 (en) 2023-03-10 2026-01-14 Novartis AG Panras inhibitor antibody-drug conjugates and methods of use thereof
CN121240890A (zh) 2023-04-18 2025-12-30 阿斯利康(瑞典)有限公司 包含可裂解接头的缀合物
US20240376212A1 (en) * 2023-04-25 2024-11-14 Targetthera Llc Alpha v-integrin targeted small molecule drug conjugates
AU2024332119A1 (en) * 2023-08-25 2026-03-12 Macrogenics, Inc. B7-h3 antibody-drug conjugates

Family Cites Families (264)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1726514A (en) 1926-11-01 1929-08-27 Firm Ferd Liebschner & Sohn Picker for looms
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4434150A (en) 1981-10-19 1984-02-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Immunological reagents employing polymeric backbone possessing reactive functional groups
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4486414A (en) 1983-03-21 1984-12-04 Arizona Board Of Reagents Dolastatins A and B cell growth inhibitory substances
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
DE3588239T3 (de) 1985-03-30 2007-03-08 Kauffman, Stuart A., Santa Fe Verfahren zum Erhalten von DNS, RNS, Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen durch DMS-Rekombinant-Verfahren
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
FR2601675B1 (fr) 1986-07-17 1988-09-23 Rhone Poulenc Sante Derives du taxol, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US5763192A (en) 1986-11-20 1998-06-09 Ixsys, Incorporated Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US4816444A (en) 1987-07-10 1989-03-28 Arizona Board Of Regents, Arizona State University Cell growth inhibitory substance
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Acylhydrazone derivatives of anthracycline and methods for their preparation
US5157049A (en) 1988-03-07 1992-10-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Method of treating cancers sensitive to treatment with water soluble derivatives of taxol
US4942184A (en) 1988-03-07 1990-07-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Water soluble, antineoplastic derivatives of taxol
EP0428534B1 (en) 1988-06-14 1995-03-29 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
FI903489A0 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Ligander med en enda sektion, receptorer innehaollande naemnda ligander, foerfaranden foer deras framstaellning samt anvaendning av liganderna och receptorerna.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US4960790A (en) 1989-03-09 1990-10-02 University Of Kansas Derivatives of taxol, pharmaceutical compositions thereof and methods for the preparation thereof
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
FI915411A0 (fi) 1989-05-16 1991-11-15 Scripps Research Inst Samexpression av heteromeriska receptorer.
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2071867A1 (en) 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US5124471A (en) 1990-03-26 1992-06-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Bifunctional dtpa-type ligand
US5407683A (en) 1990-06-01 1995-04-18 Research Corporation Technologies, Inc. Pharmaceutical solutions and emulsions containing taxol
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JP3306063B2 (ja) 1990-08-24 2002-07-24 イグジス， インコーポレイテッド ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを合成する方法
US5278324A (en) 1990-08-28 1994-01-11 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Water soluble derivatives of taxol
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
NZ241119A (en) 1990-12-20 1993-06-25 Ixsys Inc Manipulating nucleic acid to optimize the binding characteristics of the encoded binding protein
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
CA2109528A1 (en) 1991-05-01 1992-11-02 Gregory A. Prince A method for treating infectious respiratory diseases
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US6287792B1 (en) 1991-06-17 2001-09-11 The Regents Of The University Of California Drug delivery of antisense oligonucleotides and peptides to tissues in vivo and to cells using avidin-biotin technology
FR2678833B1 (fr) 1991-07-08 1995-04-07 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouvelles compositions pharmaceutiques a base de derives de la classe des taxanes.
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
ATE181571T1 (de) 1991-09-23 1999-07-15 Medical Res Council Methoden zur herstellung humanisierter antikörper
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
GB9126094D0 (en) 1991-12-09 1992-02-12 Immune Systems Ltd In vitro antibody production
EP1291360A1 (en) 1991-12-13 2003-03-12 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
GB9201755D0 (en) 1992-01-28 1992-03-11 British Bio Technology Compounds
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
DE69329073T2 (de) 1992-03-23 2001-01-18 Georgetown University, Washington In liposomen verkapseltes taxol und verwendungsverfahren
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
GB9213077D0 (en) 1992-06-19 1992-08-05 Erba Carlo Spa Polymerbound taxol derivatives
CA2086874E (en) 1992-08-03 2000-01-04 Renzo Mauro Canetta Methods for administration of taxol
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
FR2696458B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé de préparation de dérivés du taxane.
FR2697752B1 (fr) 1992-11-10 1995-04-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Compositions antitumorales contenant des dérivés du taxane.
FR2698543B1 (fr) 1992-12-02 1994-12-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouvelles compositions à base de taxoides.
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5380751A (en) 1992-12-04 1995-01-10 Bristol-Myers Squibb Company 6,7-modified paclitaxels
US5410024A (en) 1993-01-21 1995-04-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1994016729A1 (en) 1993-01-28 1994-08-04 Neorx Corporation Targeted nitric oxide pathway or nitric oxide synthase modulation
US5750106A (en) 1993-01-28 1998-05-12 Novartis Ag Human monoclonal antibodies to cytomegalovirus
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
WO1994018219A1 (en) 1993-02-02 1994-08-18 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US5433364A (en) 1993-02-19 1995-07-18 Dynetics Engineering Corporation Card package production system with burster and carrier verification apparatus
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5415869A (en) 1993-11-12 1995-05-16 The Research Foundation Of State University Of New York Taxol formulation
WO1995015770A1 (en) 1993-12-09 1995-06-15 Neorx Corporation Pretargeting methods and compounds
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
IT1275043B (it) 1994-07-21 1997-07-29 Agerbioss Snc Di Zanin R & C Metodo e relativo prodotto per la difesa delle piante dai parassiti vegetali
US5504191A (en) 1994-08-01 1996-04-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide methyl esters
US5530097A (en) 1994-08-01 1996-06-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory peptide amides
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5599902A (en) 1994-11-10 1997-02-04 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Cancer inhibitory peptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
CA2207961A1 (en) 1995-01-05 1996-07-11 Robert J. Levy Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US5840929A (en) 1995-04-14 1998-11-24 Bristol-Myers Squibb Company C4 methoxy ether derivatives of paclitaxel
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
US5705503A (en) 1995-05-25 1998-01-06 Goodall; Brian Leslie Addition polymers of polycycloolefins containing functional substituents
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
AU710347B2 (en) 1995-08-31 1999-09-16 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US6331431B1 (en) 1995-11-28 2001-12-18 Ixsys, Inc. Vacuum device and method for isolating periplasmic fraction from cells
ATE234635T1 (de) 1995-12-22 2003-04-15 Bristol Myers Squibb Co Verzweigte hydrazongruppen enthaltende kuppler
DE122004000004I1 (de) 1996-02-09 2004-08-12 Abott Biotechnology Ltd Humane Antikörper welche an Humanen TNFalpha binden.
US6440733B1 (en) * 1996-02-15 2002-08-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibodies recognizing antigens on the surface of endothelial cells of tumor vessel
IT1282692B1 (it) 1996-02-27 1998-03-31 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per l'uso in terapia
DK0885002T3 (da) 1996-03-04 2011-08-22 Penn State Res Found Materialer og fremgangsmåder til forøgelse af cellulær internalisering
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
AU3740997A (en) 1996-08-26 1998-03-19 Bristol-Myers Squibb Company Sulfenamide taxane derivatives
US5773464A (en) 1996-09-30 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company C-10 epoxy taxanes
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
WO1998022451A1 (en) 1996-11-19 1998-05-28 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Taxol derivatives
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US5977386A (en) 1996-12-24 1999-11-02 Bristol-Myers Squibb Company 6-thio-substituted paclitaxels
CA2277801C (en) 1997-01-16 2002-10-15 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
CA2279590A1 (en) 1997-02-13 1998-08-20 Bone Care International, Inc. Targeted therapeutic delivery of vitamin d compounds
EP0973540B1 (en) 1997-02-25 2005-11-02 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear and cyclo-depsipeptides dolastatin 16, dolastatin 17, and dolastatin 18
SI0970126T1 (en) 1997-04-14 2001-08-31 Micromet Ag Novel method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU8691398A (en) 1997-08-04 1999-02-22 Ixsys, Incorporated Methods for identifying ligand specific binding molecules
US7288665B1 (en) 1997-08-18 2007-10-30 Florida State University Process for selective derivatization of taxanes
JPH1192468A (ja) 1997-09-17 1999-04-06 Yakult Honsha Co Ltd 新規なタキサン誘導体
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
AU741433B2 (en) 1997-10-08 2001-11-29 Bio Research Corporation Of Yokohama Taxoid derivatives and process for producing the same
WO1999019500A1 (en) 1997-10-10 1999-04-22 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Healt H And Human Services Complex of biotinylated viral vector and ligand for targeted gene delivery
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
CA2336139C (en) 1998-06-24 2008-10-14 Advanced Inhalation Research, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
CN1269087C (zh) 1999-07-31 2006-08-09 朴奎珍 使用数字音频和字幕数据的学习方法和装置
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
WO2001090198A1 (en) 2000-05-24 2001-11-29 Ludwig Institute For Cancer Research Multicomponent conjugates which bind to target molecules and stimulate cell lysis
AU2001276842B2 (en) 2000-06-28 2007-04-26 Glycofi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
WO2003016466A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company ANTI-Aβ ANTIBODIES
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040028687A1 (en) 2002-01-15 2004-02-12 Waelti Ernst Rudolf Methods and compositions for the targeted delivery of therapeutic substances to specific cells and tissues
JP2005538049A (ja) 2002-05-01 2005-12-15 トレリス バイオサイエンス、インク． ２元的ないし多元的ターゲティング及びその使用
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
MXPA04012664A (es) * 2002-06-19 2005-08-15 Raven Biotechnologies Inc Objetivo de superficie celular raag10 novedoso y una familia de anticuerpos que reconocen ese objetivo.
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
DE60336149D1 (de) 2002-08-16 2011-04-07 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
WO2004019993A1 (en) 2002-08-30 2004-03-11 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Self-immolative dendrimers releasing many active moieties upon a single activating event
WO2004043493A1 (en) 2002-11-14 2004-05-27 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
US7388079B2 (en) 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
ATE472338T1 (de) 2003-02-20 2010-07-15 Seattle Genetics Inc Anti-cd70 antikörper-arzneimittelkonjugate und ihre verwendung zur behandlung von krebs
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
AU2004218354B2 (en) 2003-03-05 2009-10-01 Halozyme, Inc. Soluble hyaluronidase glycoprotein (sHASEGP), process for preparing the same, uses and pharmaceutical compositions comprising thereof
WO2005035575A2 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
CN107213469A (zh) 2003-11-06 2017-09-29 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
EP2392586A1 (en) 2004-02-20 2011-12-07 The Trustees of The University of Pennsylvania Binding peptidomimetics and uses of the same
EP1718667B1 (en) 2004-02-23 2013-01-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
CA2558195C (en) 2004-03-01 2012-11-06 Spirogen Limited 11-hydroxy-5h-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-one derivatives as key intermediates for the preparation of c2 substituted pyrrolobenzodiazepines
US20050226882A1 (en) 2004-04-08 2005-10-13 Awdalla Essam T Method and multicomponent conjugates for treating cancer
JP2007535317A (ja) 2004-04-15 2007-12-06 グライコフィ， インコーポレイテッド 下等真核生物におけるガラクトシル化された糖タンパク質の産生
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
JP2008515915A (ja) 2004-10-07 2008-05-15 エモリー ユニバーシティー 多機能性ナノ粒子結合体およびそれらの使用
US7632497B2 (en) 2004-11-10 2009-12-15 Macrogenics, Inc. Engineering Fc Antibody regions to confer effector function
EP1695717A1 (en) 2005-02-23 2006-08-30 Ludwig-Maximilians-Universität Transport of nano-and macromolecular structures into cytoplasm and nucleus of cells
US7964089B2 (en) 2005-04-15 2011-06-21 Agamatrix, Inc. Analyte determination method and analyte meter
NZ563136A (en) 2005-04-21 2009-11-27 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
DK1912671T3 (da) 2005-07-18 2017-11-27 Seattle Genetics Inc Beta-glucuronid-linker-lægemiddelkonjugater
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1800695A1 (en) 2005-12-21 2007-06-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Immuno-RNA-constructs
CN101415679A (zh) 2006-02-02 2009-04-22 辛塔佳有限公司 水溶性cc-1065类似物及其缀合物
CA2690973A1 (en) 2006-06-23 2007-12-27 Paul M. Simon Targeted immune conjugates
GB0615662D0 (en) 2006-08-07 2006-09-13 Affitech As Antibody
JP5601836B2 (ja) * 2006-11-08 2014-10-08 マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド Ｔｅｓ７およびｔｅｓ７に結合する抗体
US7598028B2 (en) 2006-11-28 2009-10-06 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for detecting and treating prostate disorders
CN101679508B (zh) 2007-02-02 2014-11-05 贝勒研究院 基于靶向抗原至抗原呈递细胞上表达的dcir的疫苗
TWI422594B (zh) 2007-02-02 2014-01-11 Baylor Res Inst 經由樹狀細胞去唾液酸糖蛋白受體（ｄｃ-ａｓｇｐｒ）接合抗原呈現細胞之藥劑
PL2129396T3 (pl) 2007-02-16 2014-02-28 Merrimack Pharmaceuticals Inc Przeciwciała przeciw ERBB3 i ich zastosowania
JP2010519313A (ja) 2007-02-23 2010-06-03 ベイラー リサーチ インスティテュート Ｃｌｅｃ−６を介したヒト抗原提示細胞の活性化
US8481314B2 (en) 2007-02-23 2013-07-09 Baylor Research Institute Activation of human antigen-presenting cells through dendritic cell lectin-like oxidized LDL receptor-1 (LOX-1)
DK2141997T3 (da) 2007-03-30 2013-02-11 Sloan Kettering Inst Cancer Konstitutiv ekspression af co-stimulatoriske ligander på adoptivt overførte t-lymfocytter
DK2208737T3 (en) 2007-05-03 2017-09-18 Lysomab Gmbh Complement factor H-derived short-consensus repeat antibody constructs
US8399512B2 (en) 2007-11-28 2013-03-19 Mersana Therapeutics, Inc. Biocompatible biodegradable fumagillin analog conjugates
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
JP5646457B2 (ja) 2008-04-29 2014-12-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
CN102083461B (zh) 2008-04-30 2014-09-17 伊缪诺金公司 有效的偶联物和亲水性连接体
HUE034763T2 (en) 2008-04-30 2018-02-28 Immunogen Inc Crosslinkers and their use
US20090285757A1 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Northeastern University Methods of targeting cells for diagnosis and therapy
EP4032552B1 (en) 2008-08-26 2023-10-04 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
US20100152725A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Angiodynamics, Inc. Method and system for tissue treatment utilizing irreversible electroporation and thermal track coagulation
CA2747170C (en) 2008-12-19 2017-07-18 Abbott Laboratories Tetrahydroisoquinoline derivatives and their uses to treat cancers and autoimmune disorders
EP2403524A4 (en) 2009-03-06 2012-09-26 Agensys Inc CONJUGATES ANTIBODY-DRUG (ADC) BINDING PROTEINS 24P4C12
US8444983B2 (en) 2009-03-23 2013-05-21 Quark Pharmaceuticals, Inc. Composition of anti-ENDO180 antibodies and methods of use for the treatment of cancer and fibrotic diseases
KR20120057588A (ko) 2009-05-28 2012-06-05 메르사나 테라퓨틱스, 인코포레이티드 가변 속도 방출 링커를 포함하는 폴리알 약물 접합체
DE102009026075A1 (de) 2009-06-30 2011-01-05 Röhm Gmbh Bohrvorrichtung
US20110076232A1 (en) 2009-09-29 2011-03-31 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
US9149544B2 (en) 2009-11-06 2015-10-06 The Penn State Research Foundation Bioconjugation of calcium phosphosilicate nanoparticles for selective targeting of cells in vivo
GB0919751D0 (en) 2009-11-11 2009-12-30 King S College Hospital Nhs Fo Conjugate molecule
PT2504364T (pt) * 2009-11-24 2017-11-14 Medimmune Ltd Agentes de ligação direcionados contra b7-h1
PH12012501751A1 (en) 2010-03-04 2012-11-12 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
DK2542256T3 (da) 2010-03-04 2019-08-26 Macrogenics Inc Antistoffer reagerende med b7-h3, immunologisk aktive fragmenter deraf og anvendelser deraf
US20110217363A1 (en) 2010-03-05 2011-09-08 Bionanox Two-step targeted tumor therapy with prodrug encapsulated in nanocarrier
WO2011120053A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Mersana Therapeutics, Inc. Modified polymers for delivery of polynucleotides, method of manufacture, and methods of use thereof
WO2011130598A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
KR101772354B1 (ko) 2010-04-15 2017-08-28 시애틀 지네틱스, 인크. 표적화된 피롤로벤조디아제핀 접합체
WO2012027494A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Regents Of The University Of Minnesota Bispecific targeting reagents
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
DE102010064282B4 (de) 2010-12-28 2012-09-06 GLOBALFOUNDRIES Dresden Module One Ltd. Liability Company & Co. KG Transistor mit eingebetteten sigma-förmigen sequenziell hergestellten Halbleiterlegierungen
ES2667568T3 (es) * 2011-04-25 2018-05-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Anticuerpo anti-B7-H3
TWI571466B (zh) * 2011-10-14 2017-02-21 艾伯維有限公司 用於治療癌症及免疫與自體免疫疾病之細胞凋亡誘發劑
CN104302669A (zh) 2011-11-23 2015-01-21 伊格尼卡生物治疗公司 抗cd98抗体及其使用方法
MX2014006739A (es) 2011-12-05 2015-06-05 Igenica Biotherapeutics Inc Conjugados de anticuerpo-farmaco y compuestos relacionados, composiciones , y metodos.
WO2013096901A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Mersana Therapeutics, Inc. Pharmaceutical formulations for fumagillin derivative-phf conjugates
CN104583194A (zh) 2012-05-11 2015-04-29 艾伯维公司 作为nampt抑制剂的哒嗪和吡啶衍生物
US9504756B2 (en) 2012-05-15 2016-11-29 Seattle Genetics, Inc. Self-stabilizing linker conjugates
HK1207388A1 (en) 2012-05-15 2016-01-29 Seattle Genetics, Inc. Self-stabilizing linker conjugates
US20140017265A1 (en) 2012-07-05 2014-01-16 Mersana Therapeutics, Inc. Terminally Modified Polymers and Conjugates Thereof
IL294622B2 (en) * 2012-10-11 2023-10-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Antibody-drug conjugates and methods for their preparation
AU2013359506B2 (en) 2012-12-10 2018-05-24 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates
WO2014093379A1 (en) 2012-12-10 2014-06-19 Mersana Therapeutics, Inc. Auristatin compounds and conjugates thereof
EP2931316B1 (en) 2012-12-12 2019-02-20 Mersana Therapeutics, Inc. Hydroxyl-polymer-drug-protein conjugates
US20140199319A1 (en) 2012-12-14 2014-07-17 Abbvie, Inc. Methods for increasing the efficiency of hybridoma generation
AR094280A1 (es) 2012-12-21 2015-07-22 Bioalliance Cv Enlazantes hidrofilicos auto-inmolantes y conjugados de los mismos
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
PL2958943T3 (pl) 2013-02-20 2020-04-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Leczenie nowotworu złośliwego za pomocą humanizowanego chimerycznego receptora antygenowego anty-egfrviii
HK1219056A1 (zh) 2013-03-15 2017-03-24 艾伯维公司 抗体药物偶联物(adc)纯化
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
TWI731535B (zh) 2014-03-21 2021-06-21 美商艾伯維有限公司 抗-egfr抗體及抗體藥物結合物
JP2017114763A (ja) 2014-03-26 2017-06-29 第一三共株式会社 抗ｃｄ９８抗体−薬物コンジュゲート
EP3209334A2 (en) 2014-10-20 2017-08-30 Igenica Biotherapeutics, Inc. Novel antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods of use
US20170182179A1 (en) * 2014-12-09 2017-06-29 Abbvie Inc. Antibody Drug Conjugates with Cell Permeable BCL-XL Inhibitors
MX2017007629A (es) 2014-12-09 2018-05-17 Abbvie Inc Compuestos inhibidores de bcl-xl que tienen una baja permeabilidad en las celulas y conjugados de anticuerpo-farmaco que los incluyen.
CA2970161A1 (en) 2014-12-09 2016-06-16 Abbvie Inc. Bcl-xl inhibitory compounds and antibody drug conjugates including the same
AU2017277534A1 (en) 2016-06-08 2019-01-03 Abbvie Inc. Anti-EGFR antibody drug conjugates
AU2017277914A1 (en) 2016-06-08 2019-01-03 Abbvie Inc. Anti-CD98 antibodies and antibody drug conjugates
CN109641962A (zh) * 2016-06-08 2019-04-16 艾伯维公司 抗b7-h3抗体和抗体药物偶联物
BR112018075644A2 (pt) 2016-06-08 2019-04-09 Abbvie Inc. anticorpos anti-cd98 e conjugados de anticorpo e fármaco
JP2019526529A (ja) * 2016-06-08 2019-09-19 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｂ７−ｈ３抗体及び抗体薬物コンジュゲート
CR20180614A (es) 2016-06-08 2019-07-29 Abbvie Inc Conjugados de anticuerpo y fármaco anti-egfr
CA3027173A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 Abbvie Inc. Anti-egfr antibody drug conjugates
AU2017277920A1 (en) 2016-06-08 2019-01-03 Abbvie Inc. Anti-CD98 antibodies and antibody drug conjugates
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
US20170355769A1 (en) 2017-12-14
JP2021006527A (ja) 2021-01-21
CA3027045A1 (en) 2017-12-14
LT3458479T (lt) 2021-02-25
PE20190177A1 (es) 2019-02-01
HUE053356T2 (hu) 2021-06-28
CL2019002250A1 (es) 2019-10-25
ECSP19000282A (es) 2019-01-31
KR20190015755A (ko) 2019-02-14
BR112018075626A2 (pt) 2019-03-19
IL263600B2 (en) 2023-07-01
PH12018502601A1 (en) 2019-09-30
EP4364754A3 (en) 2025-02-12
TW202304996A (zh) 2023-02-01
IL263600B1 (en) 2023-03-01
MY199278A (en) 2023-10-24
MX2024001190A (es) 2024-02-27
RU2764651C2 (ru) 2022-01-19
DOP2018000276A (es) 2018-12-31
CN109963870A (zh) 2019-07-02
PL3458479T3 (pl) 2021-07-26
US20210171637A1 (en) 2021-06-10
CR20180603A (es) 2019-07-29
RU2018146948A (ru) 2020-07-14
SG10201914119TA (en) 2020-02-27
PT3458479T (pt) 2021-03-01
CN116284404A (zh) 2023-06-23
MX2018015271A (es) 2019-08-12
EP3458479B1 (en) 2020-11-04
WO2017214335A4 (en) 2018-03-08
KR102434626B1 (ko) 2022-08-24
IL300274A (en) 2023-04-01
AU2024205665A1 (en) 2024-10-31
SI3458479T1 (sl) 2021-08-31
UY37278A (es) 2018-01-31
RU2018146948A3 (sr) 2021-06-17
US10640563B2 (en) 2020-05-05
CY1123783T1 (el) 2022-05-27
EP3835322A2 (en) 2021-06-16
WO2017214335A1 (en) 2017-12-14
EP3458479A1 (en) 2019-03-27
AU2017279550A1 (en) 2019-01-03
CL2018003520A1 (es) 2019-03-15
UA124198C2 (uk) 2021-08-04
EP3835322A3 (en) 2021-10-06
IL263600A (en) 2019-01-31
PL3458479T4 (pl) 2021-07-26
HRP20210170T1 (hr) 2021-03-19
DK3458479T3 (da) 2021-02-08
ES2861499T3 (es) 2021-10-06
CN109963870B (zh) 2023-07-28
JP2019528240A (ja) 2019-10-10
JP6751165B2 (ja) 2020-09-02
EP4364754A2 (en) 2024-05-08
SG11201811193TA (en) 2019-01-30
TW201809003A (zh) 2018-03-16
CO2018013471A2 (es) 2018-12-28
TWI762487B (zh) 2022-05-01
ZA201900059B (en) 2022-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2861499T3 (es) Anticuerpos anti-B7-H3 y conjugados anticuerpo-fármaco
TWI646106B (zh) 催乳激素受體結合蛋白質及其用途
US20200338209A1 (en) Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
US20200002421A1 (en) Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
TW201623332A (zh) 抗－ｅｇｆｒ抗體及抗體藥物結合物
CA3223942A1 (en) Anti-ox40 monoclonal antibody and methods of use thereof
KR20240058146A (ko) 항체-약물 접합체, 이의 제조 방법 및 의약적 용도
HK1262614B (en) Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
HK1262614A1 (en) Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
JP2025516434A (ja) 抗ｃｄ７３抗体およびその使用
HK40052903A (en) Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
NZ788873A (en) Anti-B7-H3 antibodies and antibody drug conjugates
HK1249409B (en) 5-bromo-2,6-di-(1h-pyrazol-l-yl)pyrimidin-4-amine for use in the treatment of cancer