ES2434961T5

ES2434961T5 - Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo

Info

Publication number: ES2434961T5
Application number: ES09014605.1T
Authority: ES
Inventors: Pablo Umaña; Joël JEAN-MAIRET; James E. Bailey
Original assignee: Roche Glycart AG
Current assignee: Roche Glycart AG
Priority date: 1998-04-20
Filing date: 1999-04-20
Publication date: 2018-01-18
Anticipated expiration: 2019-04-20
Also published as: JP4334141B2; EP2261229A2; DK2180007T4; US20090304690A1; US20110142825A1; US8623644B2; EP2180007A3; US9718885B2; US20050074843A1; AU3657899A; EP1071700B1; US8629248B2; JP2018038431A; ATE458007T1; JP2009100748A; JP2015051017A; JP2017108747A; JP2012210209A; EP1071700A1; US20050079605A1

Description

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sintetizar su secuencia de aminoácidos totalmente o en parte. Por ejemplo, pueden sintetizarse péptidos por técnicas de fase sólida, escindirse de la resina, y purificarse por cromatografía líquida preparativa de alta resolución.

V.g. Véase Creighton, 1983, Protein Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y. pp. 50-60. La composición de los péptidos sintéticos puede confirmarse por análisis o secuenciación de aminoácidos (v.g., el procedimiento de degradación de Edman; Véase Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles,

W.H. Freeman and Co., N.Y., pp. 34-49).

Se describen en esta memoria métodos para la generación y uso de sistemas de células hospedadoras para la producción de glicoformas de anticuerpos o anticuerpo. Se describen en esta memoria fragmentos o proteínas de fusión que incluyen fragmentos de anticuerpo con citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos aumentada. La identificación de epítopes diana y generación de anticuerpos que tienen valor terapéutico potencial, para los cuales se desea la modificación del patrón de glicosilación, y el aislamiento de su secuencia de ácidos nucleicos codificantes respectiva está dentro del alcance de la invención.

Diversos procedimientos conocidos en la técnica pueden utilizarse para la producción de anticuerpos para epítopes diana de interés. Tales anticuerpos incluyen, pero sin carácter limitante, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. Tales anticuerpos pueden ser útiles, v.g., como agentes diagnósticos o terapéuticos. Como agentes terapéuticos, son de interés especialmente preferido anticuerpos neutralizantes, es decir, aquéllos que compiten por la fijación con un ligando, sustrato o molécula adaptadora.

Para la producción de anticuerpos, diversos animales hospedadores no humanos se inmunizan por inyección con la proteína diana de interés con inclusión, pero sin carácter limitante, de conejos, ratones, ratas, etc. Para aumentar la respuesta inmunológica pueden utilizarse diversos adyuvantes, dependiendo de la especie hospedadora, con inclusión, pero sin carácter limitante, de adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como isolecitina, polioles Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa bocallave, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Anticuerpos monoclonales para la diana de interés se pueden preparar utilizando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas de células continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero sin carácter limitante, la técnica del hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein, 1975, Nature 256: 495-497, la técnica del hibridoma de las células B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) y la técnica del hibridoma EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Adicionalmente, pueden utilizarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) por remodelación de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto con genes procedentes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Alternativamente, técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (Patente U.S. No. 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios que tienen una especificidad deseada.

Fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de fijación específicos de la proteína diana de interés pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero sin carácter limitante, fragmentos F(ab')2 que pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse por reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab (Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de los fragmentos monoclonales Fab con la especificidad deseada para la proteína diana de interés.

Una vez que se ha identificado un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para el cual se desea modificación en el patrón de glicosilación, la secuencia de ácido nucleico codificante se identifica y se aísla utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Véase arriba.

C. Generación de Líneas de Células para la Producción de Proteínas Con Patrón de Glicosilación Alterado

La presente invención proporciona sistemas de expresión de células hospedadoras para la generación de proteínas que tienen patrones de glicosilación modificados. En particular, la presente invención proporciona sistemas de células hospedadoras para la generación de glicoformas de proteínas que tienen un valor terapéutico aumentado.

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las glicoproteínas y el gen informador se transcriben en una molécula de RNA que sufre alternativamente remodelación en dos moléculas de RNA mensajero (mRNA) separadas; uno de los mRNAs resultantes se traduce en dicha proteína informadora, y el otro se traduce en dicha glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas.

Si se expresan varios ácidos nucleicos diferentes que codifican una glicosil-transferasa modificadora de glicoproteínas, los mismos pueden disponerse de tal manera que se transcriban como una sola o como varias moléculas de mRNA. Si los mismos se transcriben como una sola molécula de mRNA, sus secuencias codificantes respectivas pueden estar enlazadas sea por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) o por un intensificador de la traducción independiente de la cápsula (CITE). Aquéllos pueden transcribirse a partir de un solo promotor en una molécula de RNA que sufre remodelación alternativamente en varias moléculas de RNA mensajero (mRNA) separadas, cada una de las cuales se traduce luego en su respectiva glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas codificada.

Se describen también en esta memoria sistemas de expresión de la célula hospedadora para la generación de proteínas terapéuticas, por ejemplo anticuerpos, que tienen una citotoxicidad celular aumentada dependiente de anticuerpos, y células que presentan la región Fc de IgG en la superficie para promover la citotoxicidad mediada por Fc. Generalmente, los sistemas de expresión de células hospedadoras se han modificado por ingeniería y/o seleccionado para expresar ácidos nucleicos que codifican la proteína para la cual se desea la producción de glicoformas alteradas, junto con al menos un ácido nucleico que codifica una glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas. El sistema de la célula hospedadora se transfecta con al menos un gen que codifica una glicosiltransferasa modificadora de las glicoproteínas. Típicamente, las células transfectadas se seleccionan para identificar y aislar clones que expresan de manera estable la glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas. La célula hospedadora se ha seleccionado para expresión de glicosil-transferasa endógena. Por ejemplo, pueden seleccionarse células que llevan mutaciones que desencadenan la expresión de glicosil-transferasas modificadoras de las glicoproteínas silenciosas en otro caso. Por ejemplo, se sabe que las células CHO transportan un gen GnT-III silencioso que es activo en ciertos mutantes, v.g., en el mutante Lec10. Adicionalmente, pueden utilizarse métodos conocidos en la técnica para activar genes de glicosil-transferasa silenciosos modificadores de las glicoproteínas, que incluyen la inserción de un promotor regulado o constitutivo, el uso de transposones, elementos retrovirales, etc.

Asimismo, puede hacerse uso de tecnologías de desactivación de genes o uso de métodos de ribozima para adaptar los niveles de expresión de glicosil-transferasas y/o glicosidasas de la célula hospedadora, y por consiguiente está dentro del alcance de la invención.

Cualquier tipo de línea de células cultivada puede utilizarse como sustrato para modificar por ingeniería las líneas de células hospedadoras de la presente invención. En una realización preferida, células CHO, células BHK, células NSO y células SP2/0. Típicamente, tales líneas de células se modifican por ingeniería para comprender adicionalmente al menos un ácido nucleico transfectado que codifica una molécula de anticuerpo entera, un fragmento de anticuerpo, o una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina. En una realización alternativa, se utiliza una línea de células de hibridoma que expresa un anticuerpo particular de interés como línea de células sustrato a fin de generar las células hospedadoras modificadas por ingeniería de la invención.

Típicamente, al menos un ácido nucleico en el sistema de la célula hospedadora codifica GnT-III. Sin embargo, pueden emplearse asimismo otros tipos de glicosil-transferasas modificadoras de glicoproteínas en el sistema hospedador, típicamente además de GnT-III, con inclusión de GalT, y Man II. Típicamente, al menos un ácido nucleico en el sistema de la célula hospedadora codifica GnT-III. Sin embargo, pueden emplearse asimismo otros tipos de glicosil-transferasas modificadoras de glicoproteínas en el sistema hospedador, típicamente además de GnT-III, con inclusión de GalT, y Man II.

Uno o varios ácidos nucleicos codificantes de una glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas puede(n) expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, o alternativamente, un sistema de expresión regulado.

Sistemas de expresión regulados adecuados incluyen, pero sin carácter limitante, un sistema de expresión regulado por tetraciclina, un sistema de expresión inducible por ecdisona, un sistema de expresión con conmutador lac, un sistema de expresión inducible por glucocorticoides, un sistema promotor inducible por temperatura, y un sistema de expresión de metalotioneína inducible por metal. Si varios ácidos nucleicos diferentes codificadores de glicosiltransferasas modificadoras de glicoproteínas están comprendidos dentro del sistema de la célula hospedadora, algunos de ellos pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otros se expresan bajo el control de un promotor regulado. Los niveles óptimos de expresión serán diferentes para cada proteína de interés, y se determinarán utilizando experimentación de rutina. Los niveles de expresión se determinan por métodos conocidos generalmente en la técnica, con inclusión de análisis por transferencia western utilizando un anticuerpo

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las células hospedadoras pueden transformarse con los ácidos nucleicos codificantes respectivos controlados por elementos de control de la expresión apropiados (v.g., promotor, intensificador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Después de la introducción del DNA extraño, las células modificadas por ingeniería pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, después de lo cual se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite la selección de células que tienen integrado de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crecen para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas de células.

Pueden utilizarse varios sistemas de selección que incluyen, pero sin carácter limitante, los genes de timidinaquinasa del virus del herpes simple (Wigler et al,, 1977, Cell 11:223), fosforribosiltransferasa hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, 1962. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:817), que pueden emplearse en células tk-, hgprt-o aprt -, respectivamente. Asimismo, puede utilizarse la resistencia a antimetabolitos como la base de la selección para los genes dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Recientemente, se han descrito genes seleccionables adicionales, a saber trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047); el sistema glutamina-sintasa; y ODC (ornitina-descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de ornitina-descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).

2. Identificación De Transfectantes O Transformantes Que Expresan La Proteína Que Tiene Un Patrón De Glicosilación Modificado

Las células hospedadoras que contienen la secuencia codificante y que expresan los productos génicos biológicamente activos pueden identificarse por al menos cuatro enfoques generales; (a) hibridación DNA-DNA o DNA-RNA; (b) presencia o ausencia de funciones de genes "marcadores"; (c) evaluación del nivel de transcripción tal como se mide por la expresión de los transcritos respectivos de mRNA en la célula hospedadora; y (d) detección del producto génico como se mide por inmunoensayo o por su actividad biológica.

En el primer enfoque, la presencia de la secuencia codificante de la proteína de interés y la secuencia codificante de la o las glicosil-transferasas modificadoras de las glicoproteínas insertada(s) en el vector de expresión puede detectarse por sondas de hibridación DNA-DNA o DNA-RNA que comprenden secuencias de nucleótidos que son homólogas a las secuencias codificantes respectivas, respectivamente, o porciones o derivados de las mismas.

En el segundo enfoque, el sistema vector de expresión recombinante/hospedador puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones de genes "marcadores" (v.g., actividad de timidina-quinasa, resistencia a antibióticos, resistencia a metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, su la secuencia codificante de la proteína de interés y la secuencia codificante de la glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas se insertan en una secuencia de genes marcadores del vector, los recombinantes que contienen las secuencias codificantes respectivas pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, un gen marcador puede disponerse en tándem, con las secuencias codificantes bajo el control del mismo o diferente promotor utilizado para controlar la expresión de las secuencias codificantes. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o selección indica la expresión de la secuencia codificante de la proteína de interés y la secuencia codificante de la glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas.

En el tercer enfoque, la actividad de transcripción para la región codificante de la proteína de interés y la secuencia codificante de la glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas puede evaluarse por ensayos de hibridación.

Por ejemplo, puede aislarse y analizarse el RNA por transferencia northern utilizando una sonda homóloga a las secuencias codificantes de la proteína de interés y la secuencia codificante de la glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas o porciones particulares de la misma. Alternativamente, los ácidos nucleicos totales de la célula hospedadora pueden extraerse y ensayarse respecto a la hibridación de dichas sondas.

En el cuarto enfoque, la expresión de los productos proteínicos de la proteína de interés y la secuencia codificante de la glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas pueden evaluarse inmunológicamente, por ejemplo por transferencias western, inmunoensayos tales como radioinmunoprecipitación, inmunoensayos enlazados a enzimas

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En el camino de glicosilación enlazado a N, una GlcNAc bisectante es añadida por la enzima β(1,4)-Nacetilglucosaminiltransferasa III (GnT-III). Schachter, 1996, Biochem. Cell. Biol. 64:163-181. Lifely et al., 1995, arriba, obtuvieron patrones de glicosilación diferentes del mismo anticuerpo produciendo el anticuerpo en líneas de células diferentes con maquinarias de glicosilación distintas pero no modificadas por ingeniería, que incluían una línea de células de mieloma de rata que expresaba GnT-III a un nivel endógeno constante. En contraste, los autores de la presente invención utilizaron una sola línea de células CHO productora de anticuerpos, que se había modificado previamente por ingeniería para expresar, de una manera regulada externamente, diferentes niveles de un gen GnT-III clonado. Este enfoque permitió a los autores de la presente invención establecer por primera vez una correlación rigurosa entre la expresión de GnT-III y la actividad de ADCC del anticuerpo modificado.

Como se demuestra en esta memoria, Véase el EJEMPLO 4 más adelante, el anticuerpo C2E8 modificado de acuerdo con el método expuesto tenía una actividad de ADCC aproximadamente dieciséis veces mayor que el anticuerpo estándar C2B8 sin modificar producido en condiciones idénticas de cultivo de células y purificación.

Resumidamente, una muestra del anticuerpo C2B8 expresada en células CHO-tTA-C2B8 que no exhiben expresión de GnT-III exhibía una actividad citotóxica de aproximadamente 31% (a concentración de 1 μg/ml de anticuerpo), medida como lisis in vitro de células SB (CD20+) por linfocitos humanos. En contraste, el anticuerpo C2B8 derivado de un cultivo de células CHO que expresaban GnT-III a un nivel basal reprimido en gran parte exhibía a una concentración de anticuerpo de 1 μg/ml, un aumento de 33% en la actividad de ADCC contra el control para la misma concentración de anticuerpo. Además, el aumento de la expresión de GnT-III producía un gran aumento de casi 80% en la actividad de ADCC máxima (para concentración de anticuerpo de 1 μg/ml) comparado con el control para la misma concentración de anticuerpo (véase el Ejemplo 4 más adelante).

Se describen asimismo en esta memoria anticuerpos que tienen una citotoxicidad celular incrementada dependiente de anticuerpos con inclusión de, pero sin carácter limitante, el anticuerpo monoclonal anti-neuroblastoma humano (chCE7), un anticuerpo monoclonal quimérico anti-carcinoma de las células renales humano (ch-G250), un anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado, un anticuerpo monoclonal quimérico anti-carcinoma de colon, pulmón y mama humano (ING-1), un anticuerpo monoclonal humanizado anti-antígeno 17-1 A humano (3622W94), un anticuerpo humanizado anti-tumor colorrectal humano (A33), un anticuerpo anti-melanoma humano (R24) dirigido contra el gangliósido GD3, y un anticuerpo monoclonal quimérico anti-carcinoma de células escamosas humano (SF-25).

2. Generación Y Uso De Proteínas De Fusión Que Comprenden Una Región Equivalente A Una Región Fc De Una Inmunoglobulina Que Promueven Citotoxicidad Mediada Por Fc

Como se ha expuesto anteriormente, y se describe en esta memoria un método para mejora de la actividad de ADCC de anticuerpos terapéuticos. Esto se consigue modificando por ingeniería el patrón de glicosilación de la región Fc de tales anticuerpos, en particular por maximización de la proporción de moléculas de anticuerpo que llevan oligosacáridos complejos biseccionados enlazados en N a los sitios de glicosilación conservados en sus regiones Fc. Esta estrategia puede aplicarse para mejorar la citotoxicidad celular mediada por Fc contra células indeseables mediadas por cualquier molécula que lleve una región que es equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina, no sólo por anticuerpos terapéuticos, dado que los cambios introducidos por la modificación mediante ingeniería de la glicosilación afectan únicamente a la región Fc y por consiguiente a sus interacciones con los receptores Fc en la superficie de las células efectoras implicadas en el mecanismo de la ADCC. Las moléculas que contienen Fc a las que se pueden aplicar los métodos expuestos en esta memoria incluyen, pero sin carácter limitante, (a) proteínas de fusión solubles constituidas por un dominio de proteína de direccionamiento fusionado al término N de una región Fc (Chamov y Ashkenazi, 1996 TIBTECH 14:52) y (b) proteínas de fusión ancladas a la membrana plasmática constituidas por un dominio transmembranal tipo II que está localizado en la membrana plasmática fusionada al término N de una región Fc (Stabila, P.F., 1998, Nature Biotech. 16: 1357).

En el caso de las proteínas de fusión solubles (a), el dominio de direccionamiento dirige la fijación de la proteína de fusión a células indeseables tales como células de cáncer, es decir, de una manera análoga a los anticuerpos terapéuticos. La aplicación del método expuesto en esta memoria para mejorar la actividad citotóxica celular mediada por Fc mediada por estas moléculas sería por tanto idéntica al método aplicado para anticuerpos terapéuticos.

En el caso de las proteínas de fusión ancladas a la membrana (b), las células indeseables en el cuerpo tienen que expresar el gen que codifica la proteína de fusión. Esto puede conseguirse sea por enfoques de terapia génica, es decir, por transfección de las células in vivo con un plásmido o vector viral que dirige la expresión del gen codificante de la proteína de fusión a células indeseables, o por implantación en el cuerpo de células modificadas genéticamente por ingeniería para expresar la proteína de fusión en su superficie. Las últimas células se

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implantarían normalmente en el cuerpo dentro de una cápsula de polímero (terapia de células encapsuladas) donde las mismas no pueden ser destruidas por un mecanismo de citotoxicidad celular mediado por Fc. Sin embargo, en caso de que el dispositivo de cápsula falle y las células que se escapan lleguen a hacerse indeseables, entonces las mismas pueden eliminarse por citotoxicidad celular mediada por Fc. Stabila et al., 1998, Nature Biotech. 16: 1357.

En este caso, el método expuesto en esta memoria podría aplicarse sea por incorporación en el vector de terapia génica de una casete de expresión génica adicional que dirija los niveles de expresión adecuados u óptimos de GnT-III o por manipulación mediante ingeniería de las células a implantar para expresar niveles adecuados u óptimos de GnT-III. En ambos casos, la finalidad del método expuesto es aumentar o maximizar la proporción de regiones Fc presentadas en la superficie que lleven oligosacáridos complejos biseccionados.

Los ejemplos que siguen explican la invención con mayor detalle. Las preparaciones y ejemplos siguientes se dan a fin de permitir a los expertos en la técnica comprender y practicar más claramente la presente invención.

VII.: EJEMPLOS

A.: Ejemplo 1: Sobreexpresión De Glicosil-Transferasas Regulada Por Tetraciclina En Células De Ovario De Hámster Chino

Para establecer una línea de células en la cual la expresión de GnT-III pudiera controlarse externamente, se utilizó un sistema de expresión regulado por tetraciclina. Gossen, M. y Bujard, H. 1992, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551. La cantidad de GnT-III en estas células podía controlarse simplemente por manipulación de la concentración de tetraciclina en el medio de cultivo. Utilizando este sistema, se encontró que la sobreexpresión de GnT-III a niveles altos conducía a inhibición del crecimiento y era tóxica para las células. Otra línea de células CHO con sobreexpresión de GnT V reguladas por tetraciclina, una glicosil-transferasa distinta modificadora de las glicoproteínas, exhibía el mismo efecto inhibidor, lo que indicaba que ésta puede ser una característica general de la sobreexpresión de glicosil-transferasas modificadoras de glicoproteínas. Este fenómeno no ha sido publicado previamente, debido probablemente al hecho de que los investigadores han utilizado por regla general promotores constitutivos para experimentos afines. El efecto de crecimiento establece un límite superior al nivel de la sobreexpresión de glicosil-transferasas modificadoras de glicoproteínas, y puede limitar también por tanto la extensión máxima de la modificación de sitios de glicosilación difícilmente accesibles.

1. Materiales y Métodos

Establecimiento De Células CHO Con Regulación Por Tetraciclina

Expresión De Glicosiltransferasas. En un primer paso, se generó inicialmente una línea de células CHO intermedia (CHO-tTA) que expresa constitutivamente un transactivador (tTA) controlado por tetraciclina a un nivel para el adecuado para el sistema de regulación. Usando el reactivo Lipofectamina (Gibco, Eggenfelden, Alemania), las células CHO (DUKX) se co-transfectaron con pUHD15-1, un vector para expresión constitutiva del gen tTA (Gossen y Bujard, 1992, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551), y pSV2Neo, un vector para expresión constitutiva de un gen de resistencia a neomicina (Clontech, Palo alto, CA). Se seleccionaron clones estables, resistentes a los fármacos y se cribaron respecto a niveles adecuados de expresión de tTA por transfecciones transitorias con un vector de expresión de β-galactosidasa regulado por tetraciclina, pUHG16-3. Se añadió DNA codificante del epítope C-myc al extremo 3' del cDNA de GnT-III de rata (Nishikawa et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:18199-18204) por amplificación PCR. Nilsson et al., 1993, J. Cell Biol. 120: 5-13. El producto se secuenció y se subclonó en pUHD103, un vector para expresión regulada por tetraciclina (Gossen y Bujard, arriba) para generar el vector pUHD10-3-GnTIIIm. El cDNA de GnT V humano (Saito et al., 1995, Eur. J. Biochem. 233: 18-26), se subclonó directamente en pUHD10-3 para generar el vector de plásmido pUHD10-3-GnT V. Las células CHO-tTA se co-transfectaron utilizando un método de transfección con fosfato de calcio (Jordan y Wurm, 1996, Nucleic Acids Res. 24: 596-601), con pPUR, un vector para expresión constitutiva de resistencia a la puromicina (Clontech, Palo Alto, CA), y el vector pUHD10-3-GnTIIIm o el vector pUHD10-3-GnTV. Los clones resistentes a la puromicina se seleccionaron en presencia de tetraciclina, se aislaron y se analizaron luego respecto a expresión regulada por tetraciclina de GnT-III

o GnT V por análisis mediante transferencias western. Véase más adelante.

Transferencias Western Y De Lectina. Para el análisis por transferencia western de GnT-III o GnT V, se separaron lisados de células por SDS-PAGE y se pasaron por electrotransferencia a membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MA). GnT-III se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal anti-c-myc 9E10 (Nilsson et al., 1993, J. Cell Biol. 120: 513) y GnT V utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-GnT V (Chen et al., 1995, Glycoconjugate J. 12: 813823). Como anticuerpo secundario se utilizó peroxidasa de rábano picante anti-IgG de ratón o anti-IgG de conejo

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Se seleccionaron integrantes estables por resistencia a la puromicina, manteniendo tetraciclina en el medio durante toda la selección de los clones a fin de mantener la expresión de glicosil-transferasas a niveles basales. Para cada glicosil-transferasa se cultivaron 16 clones resistentes a puromicina en presencia y ausencia de tetraciclina, y se analizaron 8 en cada caso por análisis mediante transferencia western (FIGURA 4). La mayoría de los clones exhibían una regulación satisfactoria de la expresión de glicosil-transferasa. Uno de los clones que expresaban GnT-III exhibía un nivel basal relativamente alto en presencia de tetraciclina (FIGURA 4B, clon 3), lo que sugiere la integración de la casete de expresión próxima a un intensificador endógeno de las células CHO; mientras que dos clones resistentes a puromicina no exhibían expresión alguna de GnT-III en ausencia de tetraciclina (FIGURA 4B, clones 6 y 8). Entre los clones que exhibían regulación satisfactoria de la expresión, se observaron niveles máximos diferentes de glicosil-transferasa. Esto puede ser debido a variaciones en el sitio de integración o el número de copias integradas. La actividad de las glicosil-transferasas se verificó por fijación de las lectinas E-PHA y L-PHA a glicoproteínas celulares endógenas derivadas de diversos clones que se dejaron crecer en presencia y ausencia de tetraciclina (FIGURA 5). Las lectinas son proteínas que se fijan a estructuras de oligosacáridos específicas. La lectina E-PHA se fija a oligosacáridos biseccionados, los productos de reacciones catalizadas por GnT-III, y L-PHA se fija a oligosacáridos tri-y tetra-antenarios producidos por reacciones catalizadas por GnT V (Merkle y Cummings, 1987, Methods Enzymol. 138: 232-259). Para cada glicosil-transferasa, un clon con expresión elevada en ausencia, pero con expresión indetectable en presencia de tetraciclina (clon 6, FIGURA 4A, CHO-tet-GnT V, y clon 4, FIGURA 4B, CHO-tet-GnT-IIIm) se seleccionó para el trabajo ulterior.

B. Ejemplo 2: Inhibición Del Crecimiento Celular Efectuada Por La Sobreexpresión De Glicosil-Transferasas

Durante el cribado de los clones que expresaban GnT-III y GnT V en ausencia de tetraciclina, véase el Ejemplo 1, arriba, aproximadamente la mitad de cada serie de clones exhibían una fuerte inhibición del crecimiento. La magnitud de inhibición del crecimiento variaba entre los clones, y la comparación con los niveles de expresión estimados a partir de análisis por transferencia western (FIGURA 4) sugería una correlación entre el grado de inhibición del crecimiento y la sobreexpresión de glicosil-transferasas. Esta correlación se estableció firmemente por cultivo de los clones finales, CHO-tet-GnT-IIIm y CHO-tet-GnT V, en concentraciones diferentes de tetraciclina. Una fuerte inhibición del crecimiento era evidente después de dos días de cultivo a niveles bajos de tetraciclina (FIGURA 6). Las células cuyo crecimiento se veía inhibido presentaban una morfología pequeña y redondeada en lugar de la forma típica extendida de las células CHO adherentes. Después de unos cuantos días, era evidente una muerte celular significativa por la morfología de las células con crecimiento inhibido.

La inhibición del crecimiento debida a la sobreexpresión de glicosil-transferasas no ha sido publicada hasta ahora en la bibliografía, debido probablemente al uso muy extendido de promotores constitutivos. Dichos clones que aportan una expresión constitutiva de una glicosil-transferasa a niveles que inhiben el crecimiento, se perderían durante el procedimiento de selección. Esto se evitó en este caso por mantenimiento de tetraciclina en el medio, es decir, niveles de expresión basal, durante toda la selección. Antes de la selección, se podía expresar que la frecuencia de clones capaces de expresar glicosil-transferasas a niveles inhibidores del crecimiento utilizando vectores tradicionales de mamífero basados en el promotor/intensificador constitutivo hCMV fuera menor. Esto se debe al hecho de que, para cualquier gen dado, el vector pUHD10-3 en las líneas de células CHO seleccionadas para niveles constitutivos altos de tTA, produce niveles de expresión significativamente mayores que los vectores basados en el promotor/intensificador constitutivo hCMV, como ha sido observado por otros. Yin et al., 1996, arriba.

La inhibición del crecimiento celular podría ser debida a un efecto directo de sobreexpresión de glicosil-transferasas residentes en Golgi ancladas a la membrana, con independencia de su actividad catalítica in vivo, v.g., por plegamiento erróneo en el retículo endoplásmico (ER) causante de la saturación de elementos que ayudan al plegamiento de la proteína en el ER. Esto podría afectar posiblemente al plegamiento y la secreción de otras proteínas celulares esenciales. Alternativamente, la inhibición del crecimiento podría relacionarse con una actividad incrementada in vivo de la glicosil-transferasa que conduce a un cambio del patrón de glicosilación, de una manera disruptora de la función, de una serie de glicoproteínas endógenas necesarias para el crecimiento en condiciones estándar de cultivo in vitro.

Con independencia del mecanismo subyacente, el efecto de inhibición del crecimiento tiene dos consecuencias para la modificación por ingeniería de la glicosilación de células animales. En primer lugar, implica que la cotransfección de vectores de expresión constitutivos de glicosil-transferasa junto con vectores para el producto glicoproteínico diana es una estrategia deficiente. Deberían evitarse también otras vías de enlace de la expresión de estas dos clases de proteínas, v.g., por el uso de promotores constitutivos múltiples de fuerza similar o el uso de vectores de expresión constitutivos multicistrónicos. En estos casos, clones con expresión constitutiva muy fuerte de la glicoproteína diana, un requisito previo para un bioproceso económico, podrían tener también expresión elevada de la glicosil-transferasa y se eliminarían durante el proceso de selección. La expresión enlazada e inducible podría ser

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aminoácidos. Los mismos deberían hacer posible el intercambio simple de las regiones variables de ratón, para la producción de otros anticuerpos quiméricos ratón-humano. Reff et al., 1994, arriba. La secuenciación del DNA confirmó que los genes deseados estaban ensamblados adecuadamente, y la producción del anticuerpo quimérico en células CHO transfectadas se comprobó con un ensayo Fc humano-ELISA.

Células CHO-tet-GnT-IIIm-chCE7, con expresión estable de GnT-III regulada por tetraciclina y expresión constitutiva estable de chCE7 se establecieron y se aumentaron a escala para producción de una serie de muestras de chCE7.

Durante el aumento a escala, se dejaron crecer 4 cultivos paralelos derivados del mismo clon CHO, cada uno a un nivel diferente de tetraciclina y que diferían por tanto solamente en el nivel de expresión del gen GnT-III. Este procedimiento elimina cualesquiera efectos clonales de otras variables que afecten a la biosíntesis de las glicoformas enlazadas a N, permitiendo que se establezca una correlación rigurosa entre la expresión del gen GnT-III y la actividad biológica del anticuerpo glicosilado. La concentración de tetraciclina estaba comprendida entre 2000 ng/ml, es decir, el nivel basal de expresión de GnT-III, hasta 15 ng/ml, para el cual se observó una inhibición significativa del crecimiento y toxicidad debida a la sobreexpresión de glicosil-transferasas (véase arriba). De hecho, únicamente pudo recuperarse una pequeña cantidad de anticuerpo del último cultivo. El segundo nivel más alto de expresión de GnT-III, utilizando tetraciclina a una concentración de 30 ng/ml, produjo únicamente una inhibición suave del crecimiento. El rendimiento de anticuerpo purificado de este cultivo era aproximadamente 70% del correspondiente a los dos niveles inferiores restantes de sobreexpresión del gen GnT-III.

Las 4 muestras de anticuerpo, CE7-2000t, -60t, -30t, y -15t, números que designan la concentración de tetraciclina asociada, se purificaron por cromatografía de afinidad sobre Proteína A y se cambiaron de tampón a PBS utilizando una columna de intercambio de catión. La pureza era mayor que 95% a juzgar por SDS-PAGE con tinción por Azul Coomassie. Los ensayos de fijación a las células de neuroblastoma humano revelaron afinidad alta para las células y la ausencia de diferencias importantes en la fijación de antígeno entre las diferentes muestras (las constantes de disociación en equilibrio estimadas variaban entre 2,0 y 2,7 x 1010 M). Esto era de esperar, dado que no existen sitios de glicosilación potenciales enlazados a N en las regiones variables de CE7.

Distribuciones De Oligosacáridos Y Niveles De Complejo Biseccionado.

Oligosacáridos De Diferentes Muestras De chCE7. Se obtuvieron los perfiles de oligosacáridos por espectrometría de masas láser ionización/desorción asistida por matriz en un instrumento de tiempo de vuelo (MALDI/TOF/MS). Mixturas de oligosacáridos neutros enlazados a N derivados de cada una de las 4 muestras de anticuerpo producidas por CHO y de una muestra de chCE7 derivada del mieloma de ratón SP2/0 (CE7-SP2/0) se analizaron utilizando ácido 2,5-deshidrobenzoico (2,5-DHB) como la matriz (FIGURA 9). En estas condiciones, los oligosacáridos neutros aparecen esencialmente como iones [N+Na+] simples, que a veces van acompañados por iones [N+K+] más pequeños, dependiendo del contenido de potasio de la matriz. Bergweff et al., 1995, Glycoconjugate J. 12: 318-330.

Este tipo de análisis produce a la vez las proporciones relativas de oligosacáridos neutros de masa diferente, reflejada por la altura de pico relativa, y la composición isobárica de monosacáridos de cada pico. Küster et al., 1997, arriba; Naven y Harvey, 1996, Rapid Commun. Mass Spectrom. 10:1361-1366. Se asignan estructuras provisionales a los picos basadas en la composición de monosacáridos, el conocimiento del camino de biosíntesis, y en datos estructurales previos para oligosacáridos derivados de la misma glicoproteína producida por el mismo hospedador, dado que la cadena principal de la proteína y el tipo de célula pueden tener una influencia acusada en la distribución de oligosacáridos. Field et al., 1996, Anal. Biochem. 239: 92-98. En el caso de los oligosacáridos asociados a Fc, únicamente se han detectado oligosacáridos complejos bi-antenarios en IgGs presentes en suero humano o producido por cultivos de células de mamífero en condiciones normales. Wormald et al., 1997, Biochemistry 36: 1370-1380; Wright y Morrison, 1997, Tibtech 15: 26-31. El camino que conduce a estos compuestos se ilustra en FIGURA 10, que incluye la masa del ion [M+Na+] correspondiente a cada oligosacárido.

Se han detectado también oligosacáridos ricos en manosa en anticuerpos producidos en las fases estacionarias y de muerte de cultivos de células por lotes. Yu Ip et al., 1994, Arch. Biochem. Biophys. 308: 387-399.

Los dos picos principales en la muestra CE7-SP2/0 (FIGURA 9A) corresponden a masas de oligosacáridos fucosilados con cuatro N-acetilhexosaminas (HexNAcs) que contienen tres (m/z 1486) o cuatro (m/z 1648) hexosas. Véase la FIGURA 10, pero obsérvese que la notación resumida para los oligosacáridos en esta figura no tienen en cuenta las dos GlcNAcs del centro. Esta composición es coherente con estructuras de oligosacáridos complejos fucosilados en el centro y bi-antenarios que llevan cero o un residuo galactosa, respectivamente, típicos de los oligosacáridos asociados a Fc, y como se ha observado previamente en el análisis NMR de oligosacáridos Fc derivados de una IgG1 quimérica expresada en células SP2/0. Bergweff et al., 1995, arriba.

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perfiles de oligosacáridos demuestra que la actividad está correlacionada con el nivel de oligosacáridos complejos biseccionados asociados a Fc.

Dada la importancia de los oligosacáridos complejos biseccionados para la actividad de ADCC, podría ser útil modificar por ingeniería el camino para aumentar adicionalmente la proporción de estos compuestos. La sobreexpresión de GnT-III a niveles que se aproximan al utilizado para la muestra CE730t está dentro del rango biotecnológicamente práctico en el que no se observan toxicidad e inhibición del crecimiento significativas. A este nivel de expresión, los oligosacáridos complejos bi-antenarios no galactosilados y no biseccionados, es decir, los sustratos potenciales de GnT-III preferidos, se reducen a menos de 10% del total. Véase el pico m/z 1486, FIGURA 9D. Sin embargo, sólo el 50% se convierten en las estructuras complejas biantenarias biseccionadas deseadas. El resto, o bien se desvían a subproductos oligosacáridos híbridos biseccionados o son consumidos por la enzima competidora β1,4-galactosiltransferasa, GalT (FIGURA 11).

La resolución de los picos de oligosacáridos complejos híbridos biseccionados y los no biseccionados galactosilados por análisis estructurales complementarios podría determinar cuánto consume cada ruta potencial no deseada. El crecimiento de los picos m/z 1664 y 1810 a niveles de sobreexpresión de GnT-III elevados sugiere que al menos una fracción de estos picos corresponde a oligosacáridos híbridos biseccionados (FIGURA 11). En teoría, un flujo que pasa a compuestos híbridos biseccionados puede reducirse por co-sobreexpresión de enzimas anteriores en el camino tales como manosidasa II junto con GnT-III. Por otra parte, la competición entre GnT-III y GalT para sustratos de oligosacáridos complejos biseccionados podría polarizarse potencialmente hacia reacciones catalizadas por GnT-III, por aumento de la concentración intra-Golgi de UDP-GlcNAc mientras que se sobreexpresa GnT-III. GnT-III transfiere una GlcNAc del co-sustrato UDP-GlcNAc a los diferentes oligosacáridos. En caso de que la concentración intra-Golgi del co-sustrato UDP-GlcNAc sea sub-saturante para GnT-III, entonces el aumento de la misma, sea por manipulación de la composición del medio de cultivo o por manipulación genética del transporte de azúcar-nucleótidos al Golgi, podría favorecer GnT-III en una competición para oligosacáridos con GalT.

Queda por determinar si el aumento en la actividad de ADCC es resultado del aumento en ambos oligosacáridos complejos biseccionados galactosilados y no galactosilados, o sólo de una de etas formas. Véanse los picos a m/z 1689 y 1851 en la FIGURA 9. Si se encuentra que los oligosacáridos bi-antenarios complejos biseccionados y galactosilados son las estructuras óptimas para la actividad incrementada de ADCC, entonces la maximización de la fracción de estos compuestos en la región Fc requeriría la sobreexpresión tanto de GnT-III como de GalT. Dado el escenario competitivo expuesto previamente, los niveles de expresión de ambos genes tendrían que estar regulados cuidadosamente. Además, sería valioso intentar redistribuir GalT sobreexpresado tanto como fuera posible hacia la TGN en lugar de la cisterna trans-Golgi. La última estrategia puede realizarse por intercambio de las secuencias que codifican la región transmembranal de GalT con las de α-2,6-sialiltransferasa (Chege y Pfeffer, 1990, J. Cell Biol.

111:: 893-899).

D.: Ejemplo 4: Ingeniería De La Glicosilación Del Anticuerpo Monoclonal C2b8 Anti-CD20

C2B8 es un anticuerpo quimérico anti-humano CD20, Reff, M.E. et al., 1994, arriba. El mismo recibió la aprobación de la FDA en 1997 y está siendo utilizado actualmente, bajo el nombre comercial Rituxan™, para el tratamiento del linfoma No-Hodgkin en los Estados Unidos. El mismo se deriva de un cultivo de células CHO y por consiguiente no debería llevar oligosacáridos biseccionados. Véase arriba. Con objeto de producir una versión mejorada de este anticuerpo, se aplicó el método demostrado previamente para el anticuerpo anti-neuroblastoma chC7. Véase arriba. El anticuerpo C2B8 modificado de acuerdo con el método descrito tenía una actividad de ADCC mayor que el anticuerpo C2B8 estándar no modificado producido en condiciones idénticas de cultivo de células y purificación.

1. Material Y Métodos

Síntesis De Las Regiones De Cadena Ligera Variable Y Pesada Variable Del Anticuerpo Monoclonal Quimérico Anti-CD20 (C2B8). Los genes VH y VL del anticuerpo C2B8 se ensamblaron sintéticamente utilizando una serie de oligonucleótidos monocatenarios solapantes (cebadores) en un proceso de un solo paso utilizando PCR, Kobayashi et al, 1997, Biotechniques 23: 500-503. Los datos de la secuencia codificante para las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (VL y VH respectivamente) del anticuerpo anti-CD20 se obtuvieron de una solicitud de patente internacional publicada (Número de Publicación Internacional: WO 94/11026). Los fragmentos de DNA ensamblados se subclonaron en pBluescriptIIKS(+) y se secuenciaron por secuenciación cíclica de DNA para comprobar que no se había introducido mutación alguna.

Construcción De Vectores Para Expresión Del Anticuerpo Monoclonal Quimérico Anti-CD20 (C2B8). Las regiones codificantes VH y VL del anticuerpo monoclonal C2B8 se subclonaron en pchCE7H y pchCE7L, respectivamente. En la subclonación, las secuencias codificantes para las cadenas variables pesada y ligera del anti-neuroblastoma CE7

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(Véase arriba) se intercambiaron con las regiones de las cadenas pesada variable y ligera variable ensambladas sintéticamente de C2B8.

Generación De Células CHO-tet-GnT-IIIm Que Expresaban El Anticuerpo C2B8. El método para la generación de una línea de células CHO-tet-GntIIIm era exactamente el mismo que para CHO-tet-GnTIIIm-CE7. Véase arriba. El clon seleccionado para trabajo ulterior se designó CHO-tet-GnT-IIIm-C2B8.

Generación De CHO-tTA Que Expresa El Anticuerpo C2B8. CHO-tTA es la línea de células parental de CHO-tet-GnT-IIIm. Véase arriba. El método para la generación de una línea de células CHO-tTA que expresaba el anticuerpo C2B8 sin expresión de GnT-III era exactamente el mismo que para CHO-tet-GnT-IIIm-C2B8 y CHO-tet-GnT-IIIm chCE7. Véase arriba. El clon seleccionado para el trabajo ulterior se designó CHO-tTA-C2B8.

Producción De Muestras De Anticuerpo C2B8. Se derivaron dos muestras de anticuerpo C2B8 de cultivos paralelos de CHO-tet-GnT-IIIm-C2B8, conteniendo cada cultivo niveles diferentes de tetraciclina, por lo que se esperaba que expresaran GnT-III a niveles diferentes. Los niveles de tetraciclina eran 2000, 50, y 25 ng/ml. Las muestras de anticuerpo C2B8 derivadas de estos cultivos se designaron como C2B8-2000t, C2B8-50t, y C2B8-25t, respectivamente. En paralelo, una muestra de anticuerpo (C2B8-nt) se preparó a partir de un cultivo de CHO-tTA-C2B8, no expresando esta línea de células GnT-III. Se cultivaron células CH-TTA-C2B8 sin tetraciclina.

Análisis De La Expresión De GnT-III. Para análisis de GnT-III por transferencia western, se resolvieron lisados de células de cada uno de los cultivos de producción por SDS-PAGE y se sometieron a electrotransferencia a membranas de poli(difluoruro de vinilideno). Se utilizaron anticuerpo monoclonal 9E10 anti-cmyc y peroxidasa de rábano picante anti-IgG de ratón (Amersham, Arlington, IL) como anticuerpos primario y secundario respectivamente. El anticuerpo fijado se detectó utilizando un kit de quimioluminiscencia mejorado (Amersham, Arlington, IL).

Purificación De Las Muestras De Anticuerpo C2B8. Las muestras de anticuerpo se purificaron utilizando el mismo procedimiento que para las muestras de anticuerpo chCE7. Véase arriba. La concentración se midió utilizando un kit de Molecular Probes basado en fluorescencia (Leiden, Países Bajos).

Verificación De La Fijación Del Antígeno Específico C2B8. La especificidad de fijación de antígeno del anticuerpo monoclonal C2B8 anti-CD20 se verificó utilizando un ensayo de inmunofluorescencia indirecta con células en suspensión. Para este estudio, se utilizaron células CD20 positivas (células SB; depósito ATCC No. ATCC CCL120) y células negativas CD20 (células HSB; depósito ATCC No. ATCC CCL 120.1). Las células de cada tipo se incubaron con anticuerpo C2B8 producido a 25 ng/ml de tetraciclina, como anticuerpo primario. Los controles negativos incluían HBSB en lugar de anticuerpo primario. Se utilizó un anticuerpo anti-IgG humana específico de Fc, policlonal y conjugado a FITC para todas las muestras como anticuerpo secundario (SIGMA, St. Louis, MO). Los cultivos se examinaron utilizando un microscopio de fluorescencia Leica (Bensheim, Alemania).

Ensayo De Actividad ADCC. La lisis de las células SB (células diana CD20+; depósito ACC No. ATCC CCL120) por células mononucleares de sangre periférica humana empobrecida en monocitos (células efectoras) en presencia de concentraciones diferentes de muestras C2B8 se realizó siguiendo básicamente el mismo procedimiento descrito en Blunner et al., 1968, Immunology 14: 181-189. La ratio de células efectoras a células diana era 100:1.

2. Resultados y Discusión

GnT-III Se Expresa A Niveles Diferentes En Diferentes Líneas Y Cultivos De Células. Las células de los cultivos paralelos CHO-tet-GnT-IIIm-C2B8, cada uno de los cuales contenía niveles diferentes de tetraciclina (2000, 50, y 25 ng/ml), por lo que se esperaba que expresaran GnT-III a niveles diferentes se lisaron, y los lisados de células se resolvieron por SDS-PAGE y se detectaron por transferencia western. Los lisados del cultivo que se dejó crecer a 25 ng/ml de tetraciclina exhibían una banda intensa para el peso molecular correspondiente de GnT-III, mientras que los cultivos que se dejaron crecer a 50 y a 2000 ng/ml exhibían una expresión mucho menor de GnT-III, como se muestra en la FIGURA 13.

Verificación De La Fijación Específica Del Antígeno C2B8. Las muestras de C2B8 producidas a partir de cultivos paralelos de células que expresaban niveles diferentes de GnT-III se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo por cromatografía de afinidad y se cambiaron de tampón a PBS en una columna de intercambio de catión. Se estimó que la pureza era mayor que 95% por tinción con Azul Coomassie de una SDS-PAGE en condiciones reductoras. Estas muestras de anticuerpo se derivaban de la expresión de genes de anticuerpos cuyas regiones variables se sintetizaron por un método de ensamblaje PCR. La secuenciación de los fragmentos sintéticos de cDNA no reveló diferencia alguna respecto a las secuencias de región variable de C2B8 originales publicadas previamente

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