KR101528013B1 - 친화성-성숙된 인간화된 항-ｃｅａ 단일클론 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항원 결합 분자(ABM)에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 세포 표면 또는 막 결합된 인간 CEA에 특이적인 재조합 단일클론 항체, 예컨대 키메라성의 영장류화된 또는 인간화된 항체 또는 이의 변형체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 ABM을 코딩하는 핵산 분자, 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 ABM을 생산하는 방법, 및 질환의 치료에 있어서 이들 ABM을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 증가된 Fc 수용체 결합 및 증가된 효과자 기능을 갖는 항체를 비롯하여, 개선된 치료 특성을 갖는, 글리코실화가 변형된 ABM에 관한 것이다.

Description

친화성-성숙된 인간화된 항-ＣＥＡ 단일클론 항체{AFFINITY-MATURED HUMANIZED ANTI CEA MONOCLONAL ANTIBODIES}

본 발명은 항원 결합 분자(ABM: antigen binding molecule)에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 인간 발암배아성 항원(CEA: carcinoembryonic antigen)에 특이적인 키메라성(chimeric)의 영장류화된(primatized) 또는 인간화된 항체를 비롯한 재조합 단일클론 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 ABM을 코딩하는 핵산 분자, 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 ABM을 생산하는 방법, 및 질병의 치료에 이들 ABM을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Fc 수용체 결합력이 증가되고 효과자 기능이 증가된 항체, 예컨대 ADCC를 비롯하여, 개선된 치료 특성을 갖는 글리코실화 변형된 ABM에 관한 것이다.

발암배아성 항원(CEA) 및 항-CEA 항체

발암배아성 항원(CEA, 또한 CEACAM-5 또는 CD66e로 공지됨)은 약 180 kDa의 분자 중량을 갖는 당단백질이다. CEA는 면역글로불린 상위계열(superfamily)의 구성원이고, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI: glycosylphosphatidylinositol) 고정자를 통해 세포 막에 연결된 7개의 도메인을 포함한다(Thompson J.A., J Clin Lab Anal. 5:344-366, 1991). 7개의 도메인은 하나의 N-말단 Ig 가변 도메인, 및 Ig 불변 도메인에 상동성인 6개의 도메인(A1-B1-A2-B2-A3-B3)을 포함한다(Hefta L.J., et al, Cancer Res. 52:5647-5655, 1992).

인간 CEA 계열은 29개의 유전자를 포함하고, 이중 18개가 발현된다: 7개는 CEA 하위군에 속하고 11개는 임신-특이적 당단백질 하위군에 속한다. 몇몇의 CEA 하위군 구성원은 세포 접착 특성을 소유하는 것으로 생각된다. CEA는 선천적인 면역원성에서 역할을 담당하는 것으로 생각된다(Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)). CEA에 밀접하게 관련된 단백질의 존재로 인하여, 다른 밀접하게 관련된 단백질에 최소한의 교차-반응성을 가지면서 CEA에 특이성인 항-CEA 항체를 상승시키는 것은 어려울 수 있다.

CEA는 종양-연관된 항원으로서 오랫동안 확인되어 왔다(Gold and Freedman, J Exp Med., 727:439-462, 1965; Berinstein N.L., J Clin Oncol, 20:2197-2207, 2002). 태아 조직에서만 발현되는 단백질로서 고유적으로 분류되었지만, CEA는 이제 몇몇의 정상적인 성인 조직에서 확인되었다. 이들 조직은, 위장, 호흡계 및 비뇨생식관 세포, 및 결장, 자궁, 땀샘 및 전립선의 세포를 비롯하여, 고유적으로 주로 상피성이다(Nap et al., Tumour Biol, 9(2-3):145-53,1988; Nap et al, Cancer Res., 52(8):2329-23339,1992).

상피 기원의 종양, 뿐만 아니라 이들의 전이는 종양 회합된 항원으로서 CEA를 포함한다. CEA의 존재는 그 자체로 발암 세포로의 변형을 나타내지 않지만, CEA의 분포는 이를 지시한다. 정상적인 조직에서, CEA는 세포의 선단(apical) 표면상에서 일반적으로 발현되어(Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)), 이것이 혈류중의 항체에 접근하지 못하도록 한다. 정상 조직과 대조적으로, CEA는 발암 세포의 전체 표면에 대해 발현되는 경향이 있다(Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)). 발현 패턴의 이러한 변화는 발암 세포에서 결합하는 항체에 CEA를 접근가능하도록 만든다. 또한, CEA 발현은 발암 세포에서 증가한다. 게다가, 증가된 CEA 발현은 세포간 접착을 증가시키고, 이는 전이를 유도할 것이다(Marshall J., Semin Oncol., 30(a Suppl. 8):30-6, 2003).

CEA는 세포 표면으로부터 용이하게 분리되고 종양으로부터 혈류내로 직접적으로 또는 림프관을 통해 흐른다. 이러한 특성으로 인해, 혈청 CEA의 수준은 암의 진단, 및 암, 특히 결장직장 암의 재발에 대한 스크리닝을 위한 임상 마커로서 사용되어 왔다(Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau L, et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 72(2^:6985-6988, 2006). 이러한 특성은 또한 표적으로서 CEA를 사용하는데 대한 어려움중 하나를 나타내는데, 이는 혈청 CEA가 대부분의 현재 이용가능한 항-CEA 항체에 결합하여, 이들이 세포 표면 상의 이들의 표적에 도달하는 것을 막고 잠재적인 임상적 효과를 제한하기 때문이다.

다중 단일클론 항체는 연구 목적을 위해, 진단 도구로서, 및 치료 목적을 위해 CEA에 대하여 발생되었다(예를 들어, Nap et al., Cancer Res ., 52(8):2329-23339, 1992; Sheahan et al., Am . J. Clin . Path. 94:157-164, 1990; Sakurai et al., J. Surg . Oncol., 42:39-46, 1989; Goldenberg D.M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Ledermann J.A., Br . J. Cancer, 58:654, 1988; Ledermann J.A., Br . J. Cancer, 68:69-73, 1993; Pedley RB, et al., Br .J Cancer, 68:69-73, 1993; Boxer GM, et al., Br . J Cancer, 65:825-831, 1992). 체스터(Chester) 등은 방사선면역검출 및 방사선면역치료법에서 사용된 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)로부터 단일 쇄 항-CEA 항체를 단리하였고(미국 특허 제5,876,691호), 항체는 후속적으로 인간화되었다(미국 특허 제7,232,888호). 항-CEA 항체는 또한 인간 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리되었다(미국 특허 제5,872,215호).

마우스 단일클론 항체 PR1A3은 정상적인 결장직장 상피로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포와 NS1(P3/NS1/I-Ag-4-1) 골수종 세포의 융합에 의해 발생되었다(Richman P. I. and Bodmer W. F., Int . J. Cancer, 59:317-328, 1987). PR1A3은 양호하게 분화되거나 불량하게 분화된 결장직장 암종 둘 다에 강하게 반응하고, 다른 결장직장 상피-반응성 항체에 비해 유리한데, 이는 그의 항원이 종양에 고착되는 것으로 보이지만 종양을 배수하는 림프관 또는 정상 림프절에서 나타나지 않는 것으로 보이기 때문이다(Granowska M. et al., Eur . J. Nucl . Med ., 20:690-698, 1989). 예를 들면, PR1A3은 59/60 결장직장 종양과 반응하는 반면(Richman P.I. and Bodmer W. F., Int . J. Cancer, 39:317-328, 1987), CEA 반응성 항체 B72.3은 결장직장 종양의 단지 75%와 반응하였다(Mansi L., et al. Jnt J Rad Appl Instrum B., 16(2):127-35, 1989).

PR1A3의 에피토프 매핑(mapping)은, 항체가 CEA 분자의 B3 도메인 및 GPI 고정자를 표적화함을 보여준다(Durbin H. et al, Proc . Natl . Scad . Sci USA, 91 :4313-4317, 1994). 결과적으로, PR1A3 항체는 단지 막-결합된 CEA에 결합하고, 암 환자의 혈류에서 발견될 수 있는 가용성 CEA 형태는 결합하지 않는다. 이러한 결합 특성으로 인해, PR1A3 항체는 혈청 CEA에 의해 격리되기 어렵고; 그 대신, 이는 발암 세포 상에서 발현된 CEA를 표적화한다. PR1A3에 결합된 에피토프는 입체형태 에피토프로서, 선형 에피토프가 아니고, 이는 PR1A3의 가용성 CEA로의 결합을 손실시키는데 기여하는 것으로 생각된다(Stewart et al., Cancer Immunol Immunother, 47:299-06, 1999).

PR1A3 항체는 이전에 뮤린(뮤린) 모 항체의 CDR을 인간 항체 RF-TS3'CL의 중쇄 골격구조 영역 1-3(PR1A3의 뮤린 골격구조 4를 보유함) 및 REI 항체의 경쇄 골격구조 영역에 이식시킴으로써 이전에 인간화되었다(Stewart et al., Cancer Immunol Immunother, 47:299-06, 1999). PR1A3의 이러한 인간화된 형태는 뮤린 항체의 인간화된 형태와 유사한 친화도를 가지면서 표면-발현된 CEA에 대해 특이성을 보유하였다(Stewart et al, Cancer Immunol Immunother, 47:299-06, 1999; 미국 특허 제5,965,710호). 인간화된 PR1A3(hPR1A3) 항체는 결장직장 암 세포주의 표적화된 사멸을 유도하는 것으로 보여졌다(Conaghhan P.J., et al, Br . J. Cancer, 98(7):1217-1225). 그러나, CEA에 대한 hPRlA3의 친화도는 비교적 낮다.

방사선동위원소-표지된 항-CEA 항체는 결장직장 암을 앓는 환자의 임상적 시험에서 사용되었다. 예를 들면, ¹²³I-표지된 키메라성 미니바디(minibody) T84.66(cT84.66)은 결장직장 암을 앓는 환자의 파일럿 임상 연구에서 사용되었다. 방사선동위원소-표지된 미니바디는 암 세포를 표적화할 수 있었다(Wong J.Y. et al, Clin Cancer Res. 10(15):5014-21, (2004)). 또 다른 예에서, ⁽¹³¹⁾I-라베투추맵(labetuzumab), 방사선동위원소-표지된 인간화된 항-CEA 항체는 결장직장 암의 간 전이를 앓는 환자의 보조적 방사선면역치료에서 시험되었고, 탁월한 생존 이점을 제공하는 것으로 밝혀졌다(Liersch T., et al, Ann . Surg . Oncol . 14(9):2577-90, (2007)).

항체 글리코실화

올리고당 성분은 물리적 안정성, 프로테아제 공격에 대한 저항성, 면역 시스템과의 상호작용, 약물동력학, 및 특정 생물학적 활성을 비롯한 치료학적 당단백질의 효능에 관한 특성에 크게 영향을 미칠 수 있다. 이러한 특성은 올리고당의 존재 또는 부재에 따라, 뿐만 아니라 특정 구조에 따라 달라질 수 있다. 올리고당 구조 및 당단백질 기능 사이의 몇몇 일반화가 이루어질 수 있다. 예를 들면, 특정 올리고당 구조는 특정 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통해 혈류로부터 당단백질의 신속한 소거를 매개하는 한편, 나머지는 항체에 결합될 수 있고 원치않는 면역 반응을 개시할 수 있다(Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81, 1996).

포유동물 세포는 인간 적용을 위해 가장 화합성인 형태인 글리코실레이트 단백질로의 이들의 수용력에 기인하여 치료 당단백질의 생산에 바람직한 숙주였다(Cumming et al., Glycobiology 1:115-30, 1991; Jenkins et al, Nature Biotechnol. 14:975-981, 1996). 박테리아는 단백질을 거의 글리코실화하지 않고, 보편적인 숙주의 유사한 다른 유형, 예컨대 효모, 곰팡이, 곤충 및 식물 세포는 혈류로부터의 신속한 소거, 원치않는 면역 상호작용, 및 몇몇 특정 경우 감소된 생물학적 활성과 연관된 글리코실화 패턴을 나타낸다. 포유동물 세포들 중에서, 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포는 지난 20년 동안 가장 흔히 사용되어 왔다. 적합한 글리코실화 패턴을 제공함에 더하여, 이들 세포는 유전적으로 안정한 매우 생산적인 클론성 세포주의 일관된 발생을 허용한다. 이들은 혈청-부재 매질을 사용하는 단일 생물반응기에서 높은 밀도로 배양될 수 있고, 안전성의 증진 및 재현가능한 생물공정을 허용한다. 다른 흔히 사용되는 동물 세포는 아기 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, NSO- 및 SP2/0-마우스 골수종 세포를 포함한다. 보다 최근에, 유전자이식 동물로부터의 생산이 또한 시험되었다(Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81, 1996).

모든 항체는 중쇄 불변 영역중 보존적 위치에서 탄수화물 구조를 포함하고, 각각의 이소형은 N-연결된 탄수화물 구조의 개별적 배열을 갖는데, 이는 단백질 조립, 분비 또는 기능적 활성에 다양하게 영향을 준다(Wright A. and Morrison S.L., Trends Biotech. 15:26-32, 1997). 결합된 N-연결된 탄수화물의 구조는, 가공도에 따라서 상당히 다르고, 다중-분지화된 고-만노스, 뿐만 아니라 2중촉각(biantennary) 착체 올리고당을 포함할 수 있다(Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32, 1997). 전형적으로, 균일한 단일클론 항체가 다중 당형태(glycoforms)의 군집으로서 존재하도록 특정 글리코실화 부위에 결합된 핵심 올리고당 구조물의 이종성 가공이 존재한다. 유사하게, 항체 글리코실화에서의 주된 차이가 세포주 사이에 초래되는 것으로 보이고, 상이한 배양 조건하에 성장하는 소정의 세포주에 대해 더 부수적인 차이가 발견된다(Lifely, M.R. et al., Glycobiology 5(8):813-22, 1995).

단일 생산 과정을 유지하고 상당한 원치않는 부작용을 잠재적으로 방지하면서 효능의 큰 증가를 수득하는 한가지 방식은, 문헌[Umana, P. et al, Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999)] 및 미국 특허 제6,602,684호(이의 전체 내용은 본원에 참고로 이의 전체가 인용됨)에 기재된 바와 같이 이들의 올리고당 성분을 조작함으로써 단일클론 항체의 천연, 세포-매개 효과자 기능을 증진시키는 것이다. 암 면역치료에서 가장 흔히 사용되는 항체인 IgG1-유형 항체는 각각의 CH2 도메인중 Asn297에서 보존된 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 결합된 2개의 착체 2중촉각 올리고당은 CH2 도메인 사이에 매립되어, 폴리펩티드 주쇄와 광범위한 접촉부를 형성하고, 이들의 존재는 항체가 효과자 기능, 예컨대 항체 의존성 세포독성(ADCC: antibody dependent cellular cytotoxicity)을 매개하는데 필수적이다(Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., et al, Immunol Rev. 163:59-16 (1998); Wright, A. and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 75:26-32 (1997)).

우마나(Umana) 등은, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 이등분된 올리고당의 형성을 촉매화하는 글리코실전이효소, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전달효소(acetylglucosaminyltransferase) III("GnTIII")의 과발현이, 조작된 CHO 세포에 의해 생산된 항-신경아세포종 키메라성 단일클론 항체(chCE7)의 생체내 ADCC 활성을 크게 증가시킴을 이전에 보여주었다(문헌[Umana, P. et al, Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999)]; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 99/54342호 참조; 이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용됨). 항체 chCE7은 높은 종양 친화도 및 특이성을 갖지만 GnTIII 효소 결핍된 표준 산업 세포주에서 생산될 경우 임상적으로 유용하기에는 효능이 너무 낮은 공액되지 않은 mAb의 큰 부류에 속한다(Umana, P., et al, Nature Biotechnol. 77: 176- 180 (1999)). 이 연구는 ADCC 활성의 큰 증가가 GnTIII를 발현하는 항체-생산 세포를 조작함으로써 수득될 수 있고, 이는 불변 영역(Fc)-회합된 이등분된 올리고당, 예컨대 이등분된 푸코실화되지 않은 올리고당의 비율을 천연-발생 항체에서 발견된 수준 이상으로 증가시킴을 유도한 것을 최초로 보여주었다.

제한되지 않지만 인간을 비롯한 영장류에서 암을 치료하기 위해 CEA, 특히, 막-결합된 CEA를 표적화하는 증진된 치료학적 방안이 필요하다.

PR1A3 항체의 결합 특이성을 갖고 Fc 수용체 결합 친화도 및/또는 효과자 기능을 증진시키기 위해 친화성-성숙되고/되거나 글리코조작된(glycoengineered) 항원 결합 분자(ABM)의 큰 치료학적 잠재성을 인식하여, 본 발명자들은 이러한 ABM을 제공하였다. 한 양태에서, 본 발명은 항원 결합에 대해 PR1A3 항체와 경쟁할 수 있는 변형 ABM 및/또는 친화성-성숙된 ABM에 관한 것이다. 이들 ABM의 효능은 항체 Fc 영역의 글리코실화 프로파일을 조작함으로써 추가로 증진된다.

한 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)을 포함하는 인간화되고, 친화성-성숙된 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자(ABM)에 관한 것으로, 이때 상기 항원 결합 도메인은 특이적으로 막-결합된 인간 발암배아성 항원(CEA)에 결합하고, 상기 항원 결합 도메인은 뮤린 단일클론 항체 PR1A3와 동일한 에피토프에 결합하거나 결합을 위해 이와 경쟁할 수 있다. 본 발명은 추가로 변형된 올리고당을 갖는 본 발명의 ABM에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 변형된 올리고당은 변형되지 않은 올리고당에 비해 푸코실화가 감소된다. 다른 실시태양에서, 변형된 올리고당은 하이브리드(hybrid)이거나 착체이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 ABM에 연관된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 숙주 세포, 및 발현 벡터에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 ABM의 제조 방법에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 ABM을 사용하는 방법, 구체적으로 CEA의 비정상적인 발현과 관련된 질환, 예컨대 암의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.

도 1은 CEA(CEACAM-5, CD66e) 항원의 개략적 다이어그램을 도시한다. PR1A3 항체는 이것이 세포 막에 결합될 경우 항원의 B3 도메인에 특이적으로 결합한다.
도 2는 효과자로서 인간 PBMC를 갖는 글리코조작된 키메라성 PR1A3 항체의 증진된 ADCC 활성을 도시한다.
도 3은 중쇄 가변 영역 작성물, CH7A, 및 경쇄 가변 영역 작성물, CL1A를 포함하는 인간화된 PR1A3 항체의 항원 결합 활성을 도시한다.
도 4는 인간화된 PR1A3 항체 경쇄의 친화성-성숙에 대한 항체 라이브러리를 생성하기 위한 랜덤화 부위를 도시한다. X로 표시된 위치는 무작위적이었다.
도 5는 인간화된 PR1A3 항체 중쇄의 친화성-성숙에 대한 항체 라이브러리를 생성하기 위한 랜덤화 부위를 도시한다. X로 표시된 위치는 무작위적이었다.
도 6은 중쇄 가변 영역 작성물 CH7ArF9 및 경쇄 가변 영역 작성물 CL1ArH11을 포함하는 인간화된 PR1A3 항체로부터 유도된 친화성-성숙된 항-CEA 항체의 결합 활성을 도시한다.
도 7은 정위이식(orthotopic) 종양 모델을 갖기 위해 LS174T 인간 결장직장 암종 세포가 비장내(intrasplenically) 투여된 SCID/bg 마우스에서의 효능 연구에 따른 결과를 도시한다. 항체 치료법은 25 ㎎/㎏ 체중의 투약량으로 항체를 주입한지 7일째에 시작되고, 이후 매주 2회 추가의 주사가 뒤따른다. "CH7A"는 본원에 기재된 바와 같은 PR1A3의 CDR을 포함하는 인간화된 항체를 나타낸다. "SM3E"는 이전에 생성된 항-CEA 항체를 지칭한다. "GA201"은 양성 대조군으로서 사용된 인간화된 항-EGF 항체를 나타낸다. "PBS"는 포스페이트 완충된 염수를 지칭하고, 이는 음성 대조군으로서 사용되었다. 생존은 스위스 규제 기관(Swiss regulatory authority)에 의해 정의된 터미네이션(termination) 기준에 따라 측정되었다.
도 8은 A549 폐 암종 세포가 정맥내 주입된 SCID/bg 마우스에서의 효능 연구에 대한 결과를 도시하고, 이때 종양은 동물의 폐에 이식된다. 항체 치료법은 25 ㎎/㎏ 체중의 투야량으로 항체를 주사한지 7일 째에 시작되고, 이후 매주 2회 추가의 주사가 뒤따른다. "CH7A," "SM3E," 및 "GA201"은 상기 도 7에 대해 제시된 바와 같다. 표시 "CH7ArF9 CL1ArH11"은 친화성-성숙된 중쇄 및 경쇄를 갖는 CH7A 항체 변형체를 나타낸다. 표시 "ge"는, Fc 영역중의 푸코실화된 올리고당의 수가 감소되도록 글리코조작됨을 지시한다. "비히클"은 음성 대조군을 지칭한다. A549 폐 암종 세포는 EGFR 발현에 대해 매우 양성이고 CEA 발현에 대해 약하게 양성이다.
도 9는 동물의 간에 종양 전이를 생성하는 MKN45 위 암종 세포가 비장내로 투여된 SCID/bg 마우스에서의 효능 연구에 대한 결과를 도시한다. 표시 "CH7ArF9 CL1A rH11", "SM3E", "ge" 및 "PBS"는 상기 도 7 및 8에 대해 제시된 바와 같다.
도 10은 친화성-성숙된 클론의 동력학적 분석을 도시한다: (a)는 미성숙된 경쇄 CL1A(서열 번호 105)와 함께의 친화성-성숙된 중쇄 CH7A H4E9(서열 번호 199); 미성숙된 중쇄 CH7A와 조합된 친화성-성숙된 경쇄 CL1A pAC18(서열 번호 209); 및 이의 조합물, CH7A H4E9 및 CL1A pAC18(서열 번호 199 및 209)을 갖는 항-CEA Fab의 센서그램(sensorgram)을 도시하고; (b)는 친화성-성숙된 클론의 동력학적 분석을 요약한다.
도 11은 인간화된 CH7A 항-CEA 항체 중쇄의 CDR1 및 CDR2 랜덤화에 대한 개략도를 도시한다.
도 12는 인간화된 CL1A 항-CEA 항체 경쇄의 CDR1 및 CDR2 랜덤화에 대한 개략도를 도시한다.
도 13은 인간화된 CH7A 항-CEA 항체 중쇄의 CDR3 랜덤화에 대한 개략도를 도시한다.
도 14는 인간화된 CL1A 항-CEA 항체 경쇄의 CDR3 랜덤화에 대한 개략도를 도시한다.
도 15는 MKN45 표적 세포 상의 막-결합된 CEA에 대한 항-CEA 항체의 결합 친화도를 도시한다. IgG로 전환되어진 친화성-성숙된 경쇄(패널 A, CH7A, CL1ArH7 또는 CH7A, CL1ArH11) 또는 친화성-성숙된 중쇄 및 경쇄(패널 B, CH7ArB9, CL1ArH11 G2(1))를 갖는 인간화된 항-CEA 항체는 대조 항체(CH7A,CL1A)에 비해 개선된 결합을 보여준다.
도 16은 대조 항체(CH7A, CL1A G2(R2)에 비교된 친화성-성숙된 항체(CH7ArB9, CL1ArH11G2(1), CH7Arf9, CL1ArH1 1G2(1), 및 CH7A, CL1ArH11G2(1))에 의한 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 시험하는 검정에 대한 결과를 도시한다.

정의

용어는 하기와 같이 별도로 정의되지 않는다면 당분야에 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.

본원에 사용될 경우, "항원 결합 분자"라는 용어는 가장 광범위한 의미로 항원 결정자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 비제한적 예는 항원-특이적 결합을 보유하는 항체 또는 이의 단편이다. 보다 구체적으로, 본원에 사용될 경우, 막-결합된 인간 발암배아성 항원(CEA)에 결합하는 항원 결합 분자는 CEA, 보다 구체적으로 세포 표면 또는 막-결합된 CEA에 특이적으로 결합하지만 세포 표면으로부터 분리된 가용성 CEA에 결합하지 않는 ABM이다. "특이적으로 결합하는"은, 결합이 항원에 선택적이고 원치않거나 비특이적인 상호작용으로부터 구별될 수 있음을 의미한다.

본원에 사용될 경우, "항체"라는 용어는 전체 항체 분자, 예컨대 단일클론, 다중클론 및 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체, 뿐만 아니라 Fc 영역을 갖고 결합 특이성을 보유하는 항체 단편, 및 면역글로불린의 Fc 영역과 동일한 영역을 포함하고 결합 특이성을 보유하는 융합 단백질을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 제한되지 않지만, VH 단편, VL 단편, Fab 단편, F(ab')₂ 단편, scFv 단편, Fv 단편, 미니바디, 다이아바디(diabody), 트라이아바디(triabody), 및 테트라바디(tetrabody)를 비롯한 결합 특이성을 보유하는 항체 단편이다(예를 들어, 문헌[Hudson and Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)] 참조).

본원에 사용될 경우, "항원 결합 도메인"이라는 용어는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 상보성인 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 부분을 지칭한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있고, 이 부분은 에피토프로 칭해진다. 항원 결합 도메인은, 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.

본원에 사용될 경우, 항원 결합 분자(예를 들어, 항체)와 관련하여 "친화성-성숙된"이라는 용어는 기준 항원 결합 분자로부터, 예를 들어, 돌연변이에 의해 유도되어 기준 항체와 동일한 항원에 결합하고, 바람직하게는 동일한 에피토프에 결합하고; 기준 항원 결합 분자의 친화도에 비해 더 높은 항원에 대한 친화도를 갖는 항원 결합 분자를 지칭한다. 친화성-성숙은 일반적으로 항원 결합 분자의 하나 이상의 CDR에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형을 포함한다. 전형적으로, 친화성-성숙된 항원 결합 분자는 기준 항원 결합 분자와 동일한 에피토프에 결합한다.

본원에 사용될 경우 "결합 친화도"는 평형 회합 또는 해리 상수(각각 K_a 또는 K_d)로 일반적으로 표현되고, 이는 다시 해리 및 회합 속도 상수의 반비(각각 K_d 또는 K_a)이다. 이와 같이, 동등한 친화도는 속도 상수의 비율이 동일하게 유지되는 한 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다.

본원에 사용될 경우, "Fc 영역"이라는 용어는 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 다를 지라도, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터 카복시-말단으로 연장되는 것으로 규정된다.

본원에 사용될 경우, "면역글로불린의 Fc 영역에 동등한 영역"이라는 용어는 면역글로불린의 Fc 영역의 천연 발생 대립유전자 변형체, 뿐만 아니라 치환, 첨가 또는 결실을 생성하지만 효과자 기능(예컨대 항체-의존성 세포독성)을 매개하는 면역글로불린의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 변형체를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 하나 이상의 아미노산은 생물학적 기능의 실질적인 손상 없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있다. 이러한 변형체는 활성에 최소 영향을 주기 위해 당분야에 공지된 일반적 규칙에 따라 선택될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-10 (1990)] 참조).

본원에 사용될 경우, "막-결합된 인간 CEA"라는 용어는 세포 또는 세포의 표면, 특히 종양 세포의 표면의 막-부위에 결합된 인간 발암배아성 항원(CEA)을 지칭한다. "막-결합된 인간 CEA"라는 용어는, 특정 환경에서, 세포의 막에 결합하지 않지만 PR1A3 항체가 결합하는 에피토프를 보존하기 위해 작성된 CEA를 지칭한다. "가용성 CEA"라는 용어는 세포 막 또는 세포 표면(예를 들어, 종양 세포 표면)에 결합하지 않거나 이로부터 분할되고/되거나, 전형적으로, PR1A3 항체에 의해 결합된 입체형태 에피토프를 보존하지 않는 인간 발암배아성 항원을 지칭한다. 가용성 CEA는, 예를 들면, 암을 앓는 환자의 혈류 또는 림프관에서 발견될 수 있다.

본원에 사용될 경우, "가용성 CEA에 대해 실질적인 교차-반응성이 없는"이라는 용어는, 분자(예를 들어, 항원 결합 분자)가, 특히 막-결합된 CEA와 비교될 경우, 가용성 CEA를 인식하거나 이에 특이적으로 결합하지 않음을 의미한다. 예를 들면, 항원 결합 분자는 약 10% 미만 내지 약 5% 미만의 가용성 CEA에 결합하거나, 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만, 바람직하게는 약 2%, 1%, 또는 0.5% 미만의 가용성 CEA, 가장 바람직하게는 약 0.2% 또는 0.1% 미만의 가용성 CEA로 구성된 군에서 선택된 양으로 가용성 CEA에 결합할 수 있다.

본원에 사용될 경우, "융합" 및 "키메라성"이라는 용어는, 폴리펩티드, 예컨대 ABM에 관하여 사용될 경우, 2종 이상의 이종성 폴리펩티드, 예컨대 상이한 종으로부터의 항체 부분으로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 키메라성 ABM의 경우, 예를 들면, 비-항원 결합 성분은 영장류, 예컨대 침팬지 및 인간을 비롯한 다양한 종으로부터 유도될 수 있다. 키메라성 ABM의 불변 영역은 일반적으로 실질적으로 천연 인간 항체의 불변 영역에 실질적으로 동일하고; 키메라성 항체의 가변 영역은 일반적으로 뮤린 PR1A3 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 재조합 항-CEA 항체로부터 유도된 서열을 포함한다. 인간화된 항체는 융합 또는 키메라성 항체의 특히 바람직한 형태이다.

본원에 사용될 경우, "인간화된"이라는 용어는, 모 분자의 항원-결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유하지만 인간에서 덜 면역원성인, 인간 이외의 항원-결합 분자, 예를 들면, 뮤린 항체로부터 부분적으로 유도된,항원-결합 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 이는, 제한되지 않지만 (a) 전체 인간 이외의 가변 도메인을 인간 불변 영역에 이식하여 키메라성 항체를 생성함, (b) 단지 인간 이외의(예를 들어, 공여자 항원 결합 분자) CDR을 인간(예를 들어, 수용자 항원 결합 분자) 골격구조 및 중요한 골격구조 잔기(예를 들어, 항원 결합 친화도 및 항체 기능을 보유하기 위해 중요함)를 보유하거나 하지 않은 불변 영역 상으로 이식함, 또는 (c) 전체 인간 이외의 가변 도메인을 이식하지만, 이들을 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 구간으로 "은폐함(cloaking)"을 비롯한 다양한 방법(본원에서 "인간화"로 지칭됨)에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Jones et al., Morrison et al., Proc . Natl. Acad . Sci., 81 :6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv . Immunol, 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec . Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec . Immun ., 31(3):169-217 (1994)]에 개시되어 있고, 이들 모두는 본원에 참고로 전체가 인용되어 있다. 일반적으로 3종의 상보성 결정 영역, 또는 CDR(CDR1 , CDR2 및 CDR3)이 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 각각에 존재하고, 이는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 각각에서 4종의 골격구조 하위영역(즉 FR1, FR2, FR3, 및 FR4)이 측면 배치된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 인간화된 항체에 대한 논의는 무엇보다도, 미국 특허 제6,632,927호, 및 공개된 미국 특허출원 제2003/0175269호에서 찾아볼 수 있고, 이들 둘 다는 본원에 참고로 전체가 인용된다. 인간화는 또한 소정의 CDR에 대한 특이성-결정 아미노산 잔기만을 포함하는 절단된 CDR을 선택된 골격구조상으로 이식함으로써 달성될 수 있다. "특이성-결정 잔기"는 항원과의 특이적 상호작용에 직접 관여하고/하거나 항원-특이적 결합에 필수적인 잔기를 의미한다. 일반적으로, 소정의 CDR에서 잔기의 약 1/5 내지 1/3만이 항원으로의 결합에 참여한다. 특정 CDR에서 특이성-결정 잔기는, 예를 들면, 3차원 모델링으로부터의 원자간 접촉에 대한 컴퓨터화 및 문헌[Padlan et al., FASEB J. 9(%):133-139 (1995)](이의 내용은 본원에 참고로 전체가 인용됨)에 기재된 방법에 따라 소정의 잔기 위치에서 서열 다양성의 결정화에 의해 식별될 수 있다.

몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 골격구조 영역(FR) 잔기는 상응하는 인간 이외의 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화된 항원 결합 분자는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항원 결합 분자 성능을 추가로 정련하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항원 결합 분자는 적어도 1종, 전형적으로 2종의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 이때 적어도 1종, 또는 실질적으로 모든, 또는 모든 과가변 영역은 인간 이외의 면역글로불린의 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR과 상응한다. 인간화된 항원 결합 분자는 임의적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986)]; [Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr . Op . Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

유사하게, 본원에 사용될 경우, "영장류화"라는 용어는 모 분자의 항원-결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유하지만 영장류에서 면역원성이 더 적은, 비-영장류 항원-결합 분자, 예를 들면, 뮤린 항체로부터 유도된 항원-결합 분자를 지칭한다.

본원에 사용될 경우, "변형(또는 유사) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드"라는 용어는, 예를 들어, 재조합 DNA 기법을 사용하여 생성된 삽입, 결실, 및 치환에 의해, 본 발명의 구체적으로 인용된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 상이한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 구체적으로, 이러한 동일하거나 유사한 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 변형체는 유전적 코드에서 "여분(redundancy)"을 사용함으로써 합성되거나 선택될 수 있다. 다양한 코돈 치환, 예컨대 다양한 제한 부위를 생산하는 사일런트 변화(silent change)는 플라스미드 또는 바이러스성 벡터로의 클로닝 또는 특정 원핵 또는 진핵계에서의 발현을 최적화하기 위해 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이는 폴리펩티드의 임의의 부분의 특성을 변형시키고, 특징, 예컨대 리간드-결합 친화도, 쇄간 친화도 또는 분해/교체 속도를 바꾸기 위해 폴리펩티드 또는 폴리펩티드에 첨가되는 다른 펩티드의 도메인에 반영될 수 있다.

본원에 사용될 경우, "변형 항-CEA 항원 결합 분자"라는 용어는 모 항체 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 첨가, 결실 및/또는 치환에 의해 "모" 항-CEA 항원 결합 분자 아미노산 서열로부터의 아미노산 서열이 상이한 분자를 지칭한다. 특정 실시태양에서, 변형체는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 모 항원 결합 분자의 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상의 과가변 영역(들) 또는 CDR에 포함한다. 예를 들면, 변형체는 적어도 1개, 예를 들어 약 1 내지 약 10개(즉, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개), 및 바람직하게는 약 2 내지 약 5개의 치환을 모 항원 결합 분자의 하나 이상의 과가변 영역 또는 CDR(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 과가변 영역 또는 CDR)에 포함할 수 있다. 변형 항-CEA 항원 결합 분자는 또한 하나 이상의 첨가, 결실 및/또는 치환을 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 골격구조 영역에 포함할 수 있다. 통상적으로, 변형체는 모 항원 결합 분자 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 서열과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 전형적으로 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 본원에서, 서열에 관련하여 동일성은, 서열을 정렬하고 필요할 경우 갭(gab)을 도입하여 서열 동일성의 최대 퍼센트를 달성한 후, 모 항체 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. N-말단, C-말단, 또는 항체 서열로의 내부 연장부, 결실, 또는 삽입중 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 주는 것으로 고려되지 않는다. 변형 항원 결합 분자는 막-결합된 인간 CEA에 결합, 예를 들면, 모 항원 결합 분자의 경우와 동일한 에피토프에 결합하는 능력을 보유하고, 바람직하게는 모 항원 결합 분자에 비해 더 우수한 특성을 갖는다. 예를 들면, 변형체는 더 강한 결합 친화도, 시험관내 및 생체내에서 항체-매개된 세포독성을 유도할 수 있는 향상된 능력을 가질 수 있다. 이러한 특성을 분석하기 위해, 변형 항원 결합 분자와 모 항원 결합 분자를 동일한 형식으로 일반적으로 비교해야 한다; 예를 들면, 모 항원 결합 분자의 Fab 형태에 대한 변형 항원 결합 분자의 Fab 형태, 또는 모 항원 결합 분자의 전장 형태에 대한 변형 항원 결합 분자의 전장 형태. 본원에서 특히 관심있는 변형 항원 결합 분자는 모 항원 결합 분자에 비교될 경우 생물 활성이 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 또는 20배 향상된 분자이다.

"모 항원 결합 분자"라는 용어는 변형체의 제조를 위한 출발점 또는 기초로 사용되는 ABM을 지칭한다. 특정 실시태양에서, 모 항원 결합 분자는 인간 골격구조 영역 및, 존재한다면, 인간 항체 불변 영역(들)을 갖는다. 예를 들면, 모 항체는 인간화되거나 인간 항체일 수 있다.

아미노산 "치환"은 한 아미노산을 유사한 구조 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산과 대체, 예를 들어, 보존적 아미노산 대체할 수 있다. "보존적" 아미노산 치환은 관여된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질에서의 유사성에 기초하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 로이신, 이소로이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; 양성으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함하고; 음성으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. "삽입" 또는 "결실"은 일반적으로 약 1개 내지 약 20개 아미노산, 보다 특히는 약 1개 내지 약 10개 아미노산, 보다 더욱 특히는 약 2개 내지 약 5개 아미노산의 범위에 있다. 비보존적 치환은 이들 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환함을 수반할 것이다. 예를 들면, 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체함, 예를 들면, 하나의 군(예를 들어 극성)으로부터의 아미노산을 상이한 군(예를 들어 염기성)으로부터의 또 다른 아미노산으로 대체함을 초래할 수 있다. 허용되는 변형은 재조합 DNA 기법을 사용하여 폴리펩티드 분자중의 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환을 체계적으로 만들고, 생성된 재조합 변형체를 활성에 대해 검정함으로써 실험적으로 결정될 수 있게 된다.

본원에 사용될 경우, "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv"라는 용어는 VH 도메인 및 VL 도메인을 단일 폴리펩티드 쇄로서 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 전형적으로, VH 및 VL 도메인은 연결기 서열에 의해 연결된다. 예를 들어, 문헌[Pluckthun, in: The PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.

본원에 사용될 경우, "미니바디"라는 용어는 불변 영역, 전형적으로 면역글로불린의 CH3 영역, 바람직하게는 IgG, 더 바람직하게는 IgG1을 결정 영역으로서 포함하는 2가 동종이량체성 scFv 유도체를 지칭한다. 일반적으로, 불변 영역은 힌지(hinge) 영역 및/또는 연결기 영역을 통해 scFv에 연결된다. 미니바디 단백질의 예는 문헌[Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-61]에서 발견된다.

본원에 사용될 경우, "다이아바디"라는 용어는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하고, 이러한 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍 형성을 허용하기에 너무 짧은 연결기를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 다이아바디는 보다 상세히, 예를 들면, 유럽 특허 제EP 404,097호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 93/11161호; 및 문헌[Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재되어 있다. 트라이아바디는 3개의 scFv의 3가 삼량체의 형성으로부터 생성되어, 3개의 결합 부위를 산출하고, 테트라바디는 4개의 결합 부위를 생성하는 4개의 scFv의 4가 사량체이다.

당분야에서 사용되고/되거나 허용되는 용어의 2개 이상의 정의가 존재하는 경우, 본원에 사용되는 용어의 정의는 분명히 달리 지시되지 않는 한 모든 이러한 의미를 포함하고자 한다. 특정 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다의 가변 영역내에서 발견되는 비-인접성 항원 조합 부위(항원 결합 영역으로서도 공지됨)를 설명하는 "상보성 결정 영역"("CDR")이라는 용어의 사용이다. CDR은 또한 "과가변 영역"을 지칭하고, 이 용어는 본원에서 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분에 관하여 용어 "CDR"과 상호교환적으로 사용된다. 이러한 특정 영역은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) and by Chothia et al., J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)](이는 본원에 참고로 인용됨)에 기재되어 있고, 이때 정의는 서로에 대해 비교될 경우 아미노산의 중첩부 및 하위집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변형체의 CDR을 지칭하는 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 바와 같은 용어의 범주내에 속하고자 한다. 상기 인용된 각각의 문헌에 정의된 바와 같이 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에 제시된 바와 같다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당분야의 숙련가라면 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 제공하는 특정 CDR을 어느 잔기가 포함하는지를 통상적으로 결정할 수 있다.

카밧 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링(numbering) 시스템을 또한 정의한다. 당분야의 숙련가는 서열 자체를 넘는 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고 임의의 가변 도메인 서열에 "카밧 넘버링"의 이러한 시스템을 분명히 부여할 수 있다. 본원에 사용될 경우, "카밧 넘버링"은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 특정되지 않는 한, ABM에서 특정 아미노산 잔기의 넘버링에 대한 지칭은 카밧 넘버링 시스템을 따른다. 서열 목록의 서열(즉, 서열 번호 1 내지 서열 번호 216)은 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링되지 않는다. 그러나, 당분야의 숙련가는 서열 목록중의 서열을 카밧 넘버링으로 전환시키는 방법에 익숙하다.

본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열에 적어도, 예를 들면, 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드라 함은, 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각각의 100개의 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있음을 제외하고, 폴리뉴클레오티드의 서열 뉴클레오티드가 기준 서열과 동일함을 나타낸다. 달리 말하면, 기준 뉴클레오티드에 적어도 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열에서 5% 이하의 뉴클레오티드는 결실되거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 기준 서열중의 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 다수의 뉴클레오티드는 기준 서열내로 삽입될 수 있다.

실제로, 임의의 특정 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지의 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 관례적으로 결정될 수 있다. 전반적 서열 정렬로서 지칭되기도 하는, 질의(query) 서열(본 발명의 서열)과 해당 서열 사이의 최적의 전체 부합성을 결정하기 위한 하나의 방법은 문헌[Brutlag et al., Comp . App . Biosci. (5:237-245 (1990)]의 알고리즘을 기준으로 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에서, 질의 및 해당 서열은 둘 다 DNA 서열이다. RNA 서열은 U를 T로 전환시킴으로써 비교될 수 있다. 상기 전반적 서열 정렬의 결과는 동일성 퍼센트이다. 동일성 퍼센트를 계산하기 위해 DNA 서열의 FASTDB 정렬에 사용되는 바람직한 매개변수는 다음과 같다: 매트릭스=일원화됨(Unitary), k-튜플(tuple)=4, 부정합 페널티=1, 연결 페널티=30, 랜덤화 기 길이=O, 컷오프 스코어(Cutoff Score)=1, 갭 페널티=5, 갭 크기 페널티 0.05, 창(Window) 크기=500 또는 해당 뉴클레오티드 서열의 길이(어느 쪽이든 더 짧음).

해당 서열이 내부 결실 때문이 아니라 5' 또는 3' 결실 때문에 질의 서열보다 더 짧다면, 결과에 수동 보정이 이루어져야 한다. 이는 FASTDB 프로그램이 동일성 퍼센트를 계산할 경우 해당 서열의 5' 및 3' 절단을 해명하지 않기 때문이다. 질의 서열에 비하여, 5' 또는 3' 말단에서 절단된 해당 서열의 경우, 동일성 퍼센트는 해당 서열의 5' 및 3'인 질의 서열의 염기 수를 계산함으로써 보정되고, 이는 질의 서열의 총 염기의 퍼센트로서 부합/정렬되지 않는다. 뉴클레오티드가 부합/정렬되는지의 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정된다. 이어서 이러한 백분율은 최종 퍼센트 동일성 스코어에 도달하기 위해 특정화된 매개변수를 사용하는 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 퍼센트로부터 차감된다. 이러한 보정된 스코어는 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. FASTDB 정렬에 의해 표시될 경우, 질의 서열에 부합/정렬되지 않은 해당 서열의 5' 및 3' 염기 밖의 염기만이 동일성 퍼센트 스코어를 수동으로 조정하기 위해 계산된다.

예를 들면, 90개 염기 해당 서열은 동일성 퍼센트를 결정하기 위해 100개의 질의 서열로 정렬된다. 결실은 해당 서열의 5' 말단에서 초래되고, 따라서, FASTDB 정렬은 5' 말단에서 처음의 10개 염기의 부합/정렬을 보이지 않는다. 10개의 쌍을 이루지 않은 염기는 서열의 10%를 나타내고(5' 및 3' 말단에서의 염기의 수는 질의 서열에서 염기의 총 수와 부합하지 않음), 따라서 10%가 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 퍼센트 스코어로부터 차감된다. 남은 90개의 염기가 완전히 부합된다면, 최종 동일성 퍼센트는 90%일 것이다. 또 다른 실시예에서, 90개 염기의 해당 서열은 100개 염기의 질의 서열과 비교된다. 이 때 결실은 내부 결실이므로 질의 서열과 부합/정렬되지 않은 해당 서열의 5' 또는 3' 상에는 염기가 존재하지 않는다. 이러한 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성 퍼센트는 수동으로 보정되지 않는다. 다시, 질의 서열과 부합/정렬되지 않은 해당 서열의 염기 5' 또는 3'만이 수동으로 보정된다. 다른 수동 보정은 본 발명의 목적을 위해 이루어지지 않는다.

본 발명의 질의 아미노산 서열에 적어도, 예를 들면 95% "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드라 함은, 해당 폴리펩티드 서열이 질의 아미노산 서열의 각각의 100개 아미노산 당 5개 이하의 아미노산 변형을 포함할 수 있음을 제외하고 해당 폴리펩티드의 아미노산 서열이 질의 서열에 동일함을 의도한다. 달리 말하면, 질의 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해, 해당 서열중 5% 이하의 아미노산 잔기는 삽입되거나, 결실되거나, 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 기준 아미노산 서열의 이들 변형은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치에서 초래되거나, 기준 서열내의 잔기들 중에서 또는 기준 서열내의 하나 이상의 인접 기에 개별적으로 배치된 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 초래될 수 있다.

실제로, 임의의 특정 폴리펩티드가 기준 폴리펩티드 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지의 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 관례적으로 결정될 수 있다. 전반적 서열 정렬로서 지칭되기도 하는, 질의 서열(본 발명의 서열)과 해당 서열 사이의 최적의 전체 부합성을 결정하기 위한 하나의 방법은 문헌[Brutlag et al., Comp . App . Biosci. (5:237-245 (1990)]의 알고리즘을 기준으로 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에서, 질의 및 해당 서열은 둘 다 뉴클레오티드 서열 또는 둘 다 아미노산 서열이다. 상기 전반적 서열 정렬의 결과는 동일성 퍼센트이다. FASTDB 아미노산 정렬에 사용되는 바람직한 매개변수는 다음과 같다: 매트릭스=PAM, k-튜플=4, 부정합 페널티=1, 연결 페널티=30, 랜덤화 기 길이=O, 컷오프 스코어=1, 창 크기=서열 길이, 갭 페널티=5, 갭 크기 페널티=0.05, 창 크기=500 또는 해당 아미노산 서열의 길이(어느 쪽이든 더 짧음).

해당 서열이 내부 결실 때문이 아니라 N- 또는 C-말단 결실 때문에 질의 서열보다 더 짧다면, 결과에 수동 보정이 이루어져야 한다. 이는 FASTDB 프로그램이 전반적 동일성 퍼센트를 계산할 경우 해당 서열의 N- 또는 C-말단 절단을 해명하지 않기 때문이다. 질의 서열에 비하여, N- 또는 C-말단에서 절단된 해당 서열의 경우, 동일성 퍼센트는 해당 서열의 N- 또는 C-말단인 질의 서열의 잔기 수를 계산함으로써 보정되고, 이는 질의 서열의 총 염기의 퍼센트로서 상응하는 해당 잔기와 부합/정렬되지 않는다. 잔기가 부합/정렬되는지의 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정된다. 이러한 백분율은 최종 퍼센트 동일성 스코어에 도달하기 위해 특정화된 매개변수를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 퍼센트로부터 차감된다. 이러한 최종 동일성 퍼센트 스코어는 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. 질의 서열에 부합/정렬되지 않은 해당 서열의 N- 또는 C-말단으로의 잔기만이 동일성 퍼센트 스코어를 수동으로 조정하는 목적을 위해 고려된다. 즉, 단지 질의 잔기는 해당 서열의 가장 먼 N- 또는 C-말단 잔기 밖에 위치한다.

예를 들면, 90개 아미노산 잔기의 해당 서열은 동일성 퍼센트를 결정하기 위해 100개의 질의 서열과 정렬된다. 결실은 해당 서열의 N-말단에서 초래되고, 따라서, FASTDB 정렬은 N-말단에서 처음의 10개 잔기의 부합/정렬을 보이지 않는다. 10개의 쌍을 이루지 않은 잔기는 서열의 10%를 나타내고(N- 및 C-말단에서의 잔기의 수는 질의 서열에서 잔기의 총 수와 부합하지 않음), 따라서 10%가 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 퍼센트 스코어로부터 차감된다. 남은 90개의 잔기가 완전히 부합된다면, 최종 동일성 퍼센트는 90%일 것이다. 또 다른 실시예에서, 90개 잔기의 해당 서열은 100개 잔기의 질의 서열과 비교된다. 이 때 결실은 내부 결실이므로 질의 서열과 부합/정렬되지 않은 해당 서열의 N- 또는 C-말단에는 잔기가 존재하지 않는다. 이러한 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성 퍼센트는 수동으로 보정되지 않는다. 다시, 질의 서열과 부합/정렬되지 않고, FASTDB로 표시될 경우 해당 서열의 N- 및 C-말단 밖에 존재하는 잔기 위치만이 수동으로 보정된다. 다른 수동 보정은 본 발명의 목적을 위해 이루어지지 않는다.

폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 동일성 퍼센트는 또한 미국 국립 생물공학 정보센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information)를 통해 입수가능한 BLAST 프로그램을 사용하여 결정될 수 있고, 프로그램에 디폴트(default) 매개변수가 지시된다.

본원에 사용될 경우, 본 발명의 핵산 서열에 "엄격한 조건하에 하이브리드화하는" 핵산은, 특정 조건하에, 예를 들어, 50% 포름아미드, 5xSSC(750 mM NaCl, 75 mM 시트르산 나트륨), 50 mM 인산 나트륨(pH 7.6), 5x덴하르트 용액(Denhardt's solution), 10% 황산 덱스트란, 및 20 ㎍/㎖의 변성되고 전단된 연어 정자 DNA가 포함된 용액중에서 42℃에서 하룻밤 항온처리하에 하이브리드화되고, 이후 O.1xSSC에서 약 65℃하에 여액을 세척하여 생성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

본원에 사용될 경우, "GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드"라는 용어는 β-1-4 연결기중의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 N-연결된 올리고당의 트리만노실 코어의 β-연결된 만노시드로 부가함을 촉매화할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 이는, 국제 생화학 및 분자 생물학 연합의 명명 위원회(NC-IUBMB: Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)에 따라 β-1,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코사미닐-전달효소(EC 2.4.1.144)로서도 공지된 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전달효소 III의 활성과, 투약량 의존성의 존재 또는 부재하에, 특정 생물학적 검정에서 측정될 경우, 유사하지만 동일할 필요는 없는 효소 활성을 나타내는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 투약량 의존성이 존재하는 경우, GnTIII과 동일할 필요는 없고, 오히려 GnTIII과 비교시 소정의 활성에서 투약량-의존성과 실질적으로 유사하다(즉, 후보 폴리펩티드는 GnTIII과 비교하여 더 크거나 약 25배 미만, 바람직하게는, 약 10배 미만의 활성, 가장 바람직하게는, 약 3배 미만의 활성을 나타낼 것이다).

본원에 사용될 경우, "골지(Golgi) 편재화 도메인"이라는 용어는 폴리펩티드를 골지 착체내의 위치에 고정시키는데에 책임이 있는 골지 주거 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 편재화 도메인은 효소의 아미노 말단 "테일(tail)"을 포함한다.

본원에 사용될 경우, "효과자 기능"은 항체의 Fc 영역(고유 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변형체 Fc 영역)에 기여할 수 있는 이들의 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과자 기능의 예로는, 제한되지 않지만, Fc 수용체 결합 친화도, 항체-의존성 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP), 사이토킨 분비, 항원-제공 세포에 의한 면역-착체-매개된 항원 채택, 세포 표면 수용체의 하향-조절 등이 포함된다.

본원에 사용될 경우, 특히 접두어 "글리코-"와 연관되어 "조작하다, 조작되는, 조작하는"이라는 용어, 뿐만 아니라 "글리코실화 조작"이라는 용어는 천연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 글리코실화 패턴의 임의의 조작을 포함하는 것으로 고려된다. 글리코실화 조작은 세포에서 발현된 당단백질의 변형된 글리코실화를 달성하기 위한 올리고당 합성 경로의 유전적 조작을 비롯하여, 세포의 글리코실화 체계의 대사적 조작을 포함한다. 게다가, 글리코실화 조작은 글리코실화에 대한 돌연변이 및 세포 환경의 효과를 포함한다. 한 실시태양에서, 글리코실화 조작은 글리코실전달효소 활성에서의 변화이다. 특정 실시태양에서, 조작으로 인해 글루코사미닐전달효소 활성 및/또는 푸코실전달효소 활성이 바뀐다.

본원에 사용될 경우, "숙주 세포"라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드 및 항원-결합 분자를 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 포함한다. 한 실시태양에서, 숙주 세포는 변형된 글리코형태를 갖는 항원 결합 분자의 생산을 허용하도록 조작된다. 바람직한 실시태양에서, 항원 결합 분자는 항체, 항체 단편, 또는 융합 단백질이다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 GnTIII 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 증가된 수준으로 발현하도록 추가로 조정되었다. 숙주 세포로 배양된 세포, 예를 들어, 몇 개 예를 들자면, 포유동물의 배양된 세포, 예컨대 CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마(hybridoma) 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포, 뿐만 아니라 유전자이식 동물, 유전자이식 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포가 포함된다

본원에 사용될 경우, "Fc-매개된 세포독성"이라는 용어는 항체-의존성 세포독성(ADCC) 및 인간 Fc-영역을 포함하는 가용성 Fc-융합 단백질에 의해 매개된 세포독성을 포함한다. 이는 "인간 면역 효과자 세포"에 의한 "표적화된 세포"의 용해를 유도하는 면역 기작이다.

본원에 사용될 경우, "인간 면역 효과자 세포"라는 용어는 이들 표면 상에 Fc 수용체(이를 통해 이들은 항원 결합 분자의 Fc-영역 또는 Fc-융합 단백질에 결합함)를 나타내고 효과자 기능을 수행하는 백혈구의 군집을 지칭한다. 이러한 군집으로는, 제한되지 않지만, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell) 및/또는 중성 킬러(NK: natural killer) 세포가 포함된다.

본원에 사용될 경우, "표적화된 세포"라는 용어는 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자(예를 들어, Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편) 또는 Fc-융합 단백질이 특이적으로 결합되는 세포를 지칭한다. 항원 결합 분자 또는 Fc 융합-단백질은 Fc 영역에 N-말단인 단백질 부분을 경유하여 표적 세포에 결합한다.

본원에 사용될 경우, "증가된 Fc-매개된 세포독성"이라는 용어는 소정의 시간내에, 표적 세포를 둘러싼 매질중의 항원 결합 분자 또는 Fc-융합 단백질의 소정의 농도에서, 상기 정의된 Fc-매개된 세포독성의 기작에 의해 용해된 "표적화된 세포"의 수의 증가, 및/또는 소정의 시간내에 Fc-매개된 세포독성의 기작에 의해 "표적화된 세포"의 소정의 수의 용해를 달성하기 위해 필요한, 표적 세포를 둘러싼 매질중의 항원 결합 분자 또는 Fc-융합 단백질의 농도의 감소로서 정의된다. Fc-매개된 세포독성의 증가는 동일한 표준 생산, 정제, 제형화 및 저장 방법(이는 당분야의 숙련가에게 공지됨)을 사용하여, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생산되지만, 본원에 기재된 방법에 의해 변형된 패턴의 글리코실화를 갖도록(예를 들어, 글리코실전달효소, GnTIII 또는 다른 글리코실전달효소를 발현하도록) 조작된 숙주 세포에 의해 생산되지 않은 동일한 항원 결합 분자 또는 Fc-융합 단백질에 의해 매개된 세포독성에 관련된다.

"증가된 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 갖는 항원 결합 분자"라 함은, 당분야의 숙련가에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 경우 증가된 ADCC를 갖는 항원 결합 분자(이 용어는 본원에 정의된 바와 같음)를 의미한다. 1가지 허용되는 시험관내 ADCC 검정은 다음과 같다:

1) 검정은 항체의 항원-결합 영역에 의해 인식된 표적 항원을 발현하는 것으로 공지된 표적 세포를 사용하고;

2) 검정은 랜덤하게 선택된 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 효과자 세포로서 사용하고;

3) 검정은 하기 프로토콜에 따라 수행되며:

i) 표준 밀도 원심분리 절차를 사용하여 PBMC를 단리하고 RPMI 세포 배양 배지중 5x10⁶ 세포/㎖로 현탁하고;

ii) 표적 세포를 표준 조직 배양 방법에 의해 성장시키고, 90% 보다 높은 생존력을 갖는 기하급수적 성장 상으로부터 수거하고, RPMI 세포 배양 배지에서 세척하고, 100 마이크로-퀴리의 51 Cr로 표지화하고, 세포 배양 배지로 2회 세척하고, 세포 배양 배지에서 10⁵ 세포/㎖의 밀도로 재현탁시키고;

iii) 100 마이크로리터의 상기 최종 표적 세포 현탁액을 96-웰 마이크로역가 플레이트의 각각의 웰에 전달시키고;

iv) 항체를 세포 배양 배지중 4000 ng/㎖에서 0.04 ng/㎖로 연속적으로 희석하고, 50 마이크로리터의 생성된 항체 용액을 96-웰 마이크로역가 플레이트중의 표적 세포에 첨가하여, 상기 전체 농도 범위를 포함하는 다양한 항체 농도를 3중으로 시험하고;

v) 최대 방출(MR: maximum release) 조절을 위해, 표지된 표적 세포를 포함하는 플레이트중 3개의 추가의 웰에 항체 용액(상기 iv) 대신 비이온성 세정제[노니뎃(Nonidet), 시그마(Sigma), 세인트 루이스 소재]의 50 마이크로리터의 2%(V/V) 용액을 제공하고;

vi) 자발적 방출(SR: spontaneous release) 조절을 위해, 표지된 표적 세포를 포함하는 플레이트중 3개의 추가의 웰에 항체 용액(상기 iv) 대신 50 마이크로리터의 RPMI 세포 배양 배지를 제공하고;

vii) 이어서 96-웰 마이크로역가 플레이트를 1분 동안 50×g에서 원심분리하고 1시간 동안 4℃에서 항온처리하고;

viii) 50 마이크로리터의 PBMC 현탁액(상기 i)을 각각의 웰에 첨가하여 25:1의 효과자:표적 세포 비율을 수득하고, 플레이트를 5% CO₂ 분위기하에 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이터에 넣어 두고;

ix) 각각의 웰로부터의 세포-부재 상청액을 수거하고 실험적으로 방출된 방사능(ER: experimentally released radioactivity)을 감마 계수기로 정량하고;

x) 특정 용해의 백분율을 식 (ER-MR)/(MR-SR)×100에 따라 각각의 항체 농도에 대해 계산하고, 이때 ER은 항체 농도에 대해 정량화된 평균 방사능이고(상기 ix 참조), MR은 MR 대조군(상기 v 참조)에 대해 정량화된 평균 방사능(상기 ix 참조)이고, SR은 SR 대조군(상기 vi 참조)에 대해 정량화된 평균 방사능(상기 ix 참조)이고;

4) "증가된 ADCC"는 상기 시험된 항체 농도 범위내에서 관찰되는 특정 용해의 최대 백분율의 증가로서, 및/또는 상기 시험된 항체 농도 범위내에서 관찰되는 특정 용해의 최대 백분율의 절반에 도달하는데 필요한 항체의 농도의 감소로서 정의된다. ADCC의 증가는 당분야의 숙련가에게 공지된 동일한 표준 생산, 정제, 제형화 및 저장 방법을 사용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생산되지만 GnTIII를 과발현하도록 조작된 숙주 세포에 의해서는 생산되지 않는, 동일한 항체에 의해 매개된 상기 검정에 의해 측정된 ADCC에 관련된다.

항-CEA 항원 결합 분자

CEA는 진단 목적을 위해 암 마커로서 사용되어 왔다. 이는 동일한 세포 유형의 비-종양 조직과 비교하여 많은 종양 조직에서 비정상적으로 발현된다(예를 들어, 세포에서 상이한 패턴으로 분포되고/되거나 과발현된다). 그러나, CEA가 일반적으로 종양 세포 표면으로부터 분할되고 대부분의 이용가능한 항-CEA 항체가 또한 가용성 CEA에 결합하므로, CEA에 공액되지 않은 항체는 일반적으로 치료 목적을 위해 사용되지 않는다. 예를 들면, 현재 파일럿 실험중인 항-CEA 항체는 방사성공액(radioconjugate)으로서 투여된다(Wong et al., 2004; Liersch et al., 2007).

몇몇의 기작은 항체 의존성 세포독성(ADCC) 및 상보성-의존성 세포독성(CDC)을 비롯한 항-CEA 항체의 치료 효능에 관여된다. 증가된 CEA 발현은 증가된 세포간 접착을 촉진시키고, 이는 발암 세포의 전이를 유도할 수 있다(Marshall J., Semin Oncol. 30(3) Suppl. 8:30-36). 이와 같이, 항-CEA 항원 결합 분자는 또한 CEA-매개된 세포 접착 및 발암 세포의 전이를 억제하는데 일정 역할을 담당할 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 뮤린 PR1A3 항체의 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개) CDR을 포함하는 항원 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)에 관한 것으로, 이때 적어도 하나의 CDR은 PR1A3의 상응하는 CDR에 비해 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환을 갖고, 항원 결합 분자는 CEA, 바람직하게는 막-결합된 CEA에 대해 모 PR1A3 항원 결합 분자에 비해 개선된 친화도를 갖는다. 이러한 하나 이상의 CDR은 절단된 CDR일 수 있고, 소정의 CDR에 대하여 특이성-결정 잔기(SDR)(이 용어는 본원에 정의된 바와 같음)를 포함할 것이다. 한 실시태양에서, 항원 결합 분자는 특정 결합을 보유하는 CDR의 잔기를 포함하는, 하기 표 2에 제시된 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 항원 결합 분자는 하기 표 2에 제시된 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 CDR, 또는 상기 CDR에 대한 특이성-결정 잔기를 함유하고 이종성 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 포함하는 변형체 또는 이로부터 절단된 형태를 포함한다. 항원 결합 분자가 PR1A3의 중쇄 CDR1 변형체를 포함하는 특정 실시태양에서, HCDR1은 카밧 위치 31에서 발린 대신 치환된 글루타메이트를 갖는다. 한 실시태양에서, 항원 결합 분자는 표 2로부터의 3개의 중쇄 CDR(예를 들어, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및/또는 3개의 경쇄 CDR(예를 들어 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3), 또는 상기 3개의 CDR 각각에 대한 특이성-결정 잔기를 적어도 포함하는 변형체 또는 이의 절단된 형태를 포함한다. 보다 구체적인 실시태양에서, 항원 결합 분자는 표 2로부터의 3개의 중쇄 CDR(예를 들어, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 CDR(예를 들어, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 항원 결합 분자는 항체 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 영역(들), 바람직하게는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 다를 포함한다. 더 특별한 실시태양에서 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 표 4의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 이의 조합으로부터 선택되고, 이때 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 서열 번호 99 및 서열 번호 103 또는 서열 번호 100 및 서열 번호 104의 조합이 아니다. 한 실시태양에서, 항원 결합 분자는 키메라성 항체, 보다 구체적으로, 인간화된 항체이다. 또 다른 실시태양에서, 항원 결합 분자는 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 항원 결합 분자는 친화성-성숙된다. 또 다른 실시태양에서, 항원 결합 분자는 PR1A3와 비교하여 증가된 ADCC 활성을 갖는다. 한 실시태양에서, 항원 결합 분자의 증가된 ADCC는, 예를 들면 친화성-성숙 또는 친화도를 개선시키는 다른 방법에 의한, 막-결합된 CEA에 대한 항원 결합 분자의 친화도의 증가에 기인한다(문헌[Tang et al, J. Immunol. 2007, 179:2815-2823] 참조; 이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용됨). 또 다른 실시태양에서, 항원 결합 분자는 글리코조작된 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 이러한 항원 결합 분자를 제조하는 방법, 및 질환, 특히 CEA가 발현되고, 특별히 CEA가 동일한 세포 유형의 정상 조직과 비교하여 비정상적으로 발현(예를 들어, 과발현되거나 세포에서 상이한 패턴으로 발현)되는 세포 증식 질환의 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 이러한 질병으로는, 제한되지 않지만 결장직장암, 비소 세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer), 위암, 췌장암 및 유방암이 포함된다. CEA 발현 수준은 당분야에 공지된 방법, 및 본원에 기재된 방법에 의해(예를 들어, 면역조직화학 검정, 면역형광 검정, 면역효소 검정, ELISA, 유세포분석(flow cytometry), 방사면역검정, 웨스턴 블롯(Western blot), 리간드 결합, 키나아제(kinase) 활성 등을 통해) 결정될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 뮤린 PR1A3 항체의 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 상보성 결정 영역을 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 상보성 결정 영역에 대한 특이성-결정 잔기를 적어도 포함하는 이의 변형체 또는 절단된 형태를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 전형적으로, 이러한 단리된 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 분자를 형성하는 하나 이상의 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 특정 결합을 보유하는 CDR의 잔기를 포함하는, 하기 표 2에 제시된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 CDR을 코딩하는 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 표 2로부터의 적어도 3개의 중쇄 CDR(예를 들어, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및/또는 3개의 경쇄 CDR(예를 들어 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3), 또는 상기 3개의 상보성 결정 영역 각각에 대한 특이성-결정 잔기를 적어도 포함하는 변형체 또는 이의 절단된 형태를 코딩하는 서열을 포함한다. 보다 구체적인 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 표 2로부터의 3개의 중쇄 CDR(예를 들어, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 CDR(예를 들어, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 영역(들)을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 벡터에서 발현될 수 있다. 더 특별한 실시태양에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 표 5에 제시된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되고, 이때 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 서열 번호 11 및 서열 번호 115 또는 서열 번호 112 및 서열 번호 116의 조합에 의해 코딩되지 않는다. 한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 폴리펩티드는 조합되어 키메라성 항체, 보다 구체적으로, 인간화된 항체를 형성한다. 특정 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드가 PR1A3의 중쇄 CDR1 또는 이의 변형체를 코딩하는 서열을 포함하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 카밧 위치 31에서 발린 대신 치환된 글루타메이트를 코딩한다. 또 다른 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 Fc 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 본 발명은 추가로 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 전술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드는 Fc 영역을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드는 Fc 영역에서 글리코실화의 변형된 패턴을 갖도록 글리코조작된다. 특별한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 막-결합된 CEA에 대한 친화도는 모 PR1A3 항체에 비해 증가된다. 또 다른 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드는 증가된 ADCC 활성을 갖는다. 한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 증가된 ADCC는, 예를 들면 친화성-성숙 또는 친화도를 향상시키는 다른 방법에 의해 막-결합된 CEA에 대한 폴리펩티드의 친화도의 증가에 기인한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 질환, 특히 CEA가 발현되고, 특별히 CEA가 동일한 세포 유형의 정상 조직과 비교하여 비정상적으로 발현(예를 들어, 과발현되거나 세포에서 상이한 패턴으로 발현)되는 세포 증식 질병의 치료에서의, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드(예를 들어, 항원 결합 분자)의 용도에 관한 것이다. 이러한 질병으로는, 제한되지 않지만 결장직장암, 비소 세포 폐암(NSCLC), 위암, 췌장암 및 유방암이 포함된다. CEA 발현 수준은 당분야에 공지된 방법, 및 본원에 기재된 방법에 의해(예를 들어, 면역조직화학 검정, 면역형광 검정, 면역효소 검정, ELISA, 유세포분석, 방사면역검정, 웨스턴 블롯, 리간드 결합, 키나아제 활성 등을 통해) 결정될 수 있다.

특별한 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 101, 107, 또는 188 내지 206중 임의의 하나의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 막-결합된 CEA에 대해 특이적인 인간화된 항원 결합 분자 또는 이의 일부 또는 단편에 관한 것이다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 105, 108, 또는 207 내지 216중 임의의 하나의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 막-결합된 CEA에 대해 특이적인 인간화된 항원 결합 분자 또는 이의 일부 또는 단편에 관한 것이다. 특별한 실시태양에서, 막-결합된 CEA에 특이적인 인간화된 항원 결합 분자 또는 이의 부분 또는 단편은 서열 번호 101, 107, 또는 188 내지 206중 임의의 하나의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 105, 108, 또는 207 내지 216중 임의의 하나의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시태양에서, 인간화된 항원 결합 분자는 인간 중쇄 불변 영역 및/또는 인간 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 이러한 불변 영역은 본원에 기재되고 당분야에 공지되어 있다. 더 특별한 실시태양에서 인간화된 항원 결합 분자는 Fc 영역, 보다 구체적으로, 글리코조작된 Fc 영역을 포함한다.

인간 이외의 항체를 인간화하기 위한 방법이 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 인간화된 ABM은 윈터(Winter)에게 허여된 미국 특허 제5,225,539호, 퀸(Queen) 등에게 허여된 미국 특허 제6,180,370호, 또는 아데어(Adair)에게 허여된 미국 특허 제6,632,927호(이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 인용됨)의 방법에 따라 제조될 수 있다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 인간 이외의 공급원으로부터 이에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 인간 이외의 아미노산 잔기는 종종 전형적으로 "임포트(import)" 가변 도메인으로부터 취해진 "임포트" 잔기로 종종 지칭된다. 인간화는 본질적으로 윈터 및 공동 연구가의 방법에 따라 (Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), 인간 항체의 상응하는 서열 대신 과가변 영역 서열을 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 키메라성 항체(미국 특허 제4,816,567호)이고, 이때 고유 인간 가변 도메인은 인간 이외의 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 실질적으로 치환된다. 전형적으로, 인간화된 항체는 몇몇 과가변 영역 잔기 및 가능하게는 몇몇 FR 잔기가 인간 이외의(예를 들어, 설치류) 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다. 해당 인간화된 항-CEA 항체는 임의적으로 인간 면역글로불린으로부터의 불변 영역을 포함할 것이다.

인간화된 항체를 제조하기 위한 경쇄 및 중쇄 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기는데 매우 중요하다. 소위 "최적-정합" 방법에 따라, 공여자(예를 들어, 설치류) 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 선별된다. 이어서 공여자(예를 들어, 설치류)의 서열과 가장 가까운 인간 서열이 인간화된 항체를 위한 인간 골격구조 영역(FR)으로 인정된다(Sims et al., J. Immunol, 151 :2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol, 196:901 (1987)). 인간 골격구조 서열을 선택하는 또 다른 방법은 전체 공여자(예를 들어, 설치류) 골격구조의 각각의 개별 하위영역의 서열(즉, FR1, FR2, FR3, 및 FR4) 또는 개별 하위영역의 조합(예를 들어, FR1 및 FR2)을 골격구조 하위영역에 상응하는 공지된 인간 가변 영역 서열의 라이브러리에 대해 비교하고(예를 들어, 카밧 넘버링에 의해 결정됨), 설치류와 가장 가까운 각각의 하위영역 또는 조합에 대한 인간 서열을 선택하는 것이다(렁(Leung)의 미국 특허출원 공개공보 제2003/0040606A1호; 2003년 2월 27일자로 공개됨). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스(consensus) 서열로부터 유도된 특정 골격구조 영역을 사용한다(Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151 :2623 (1993)). 한 실시태양에서, 인간 골격구조 영역은 인간 생식계열 서열의 수집으로부터 선택된다. 인간 생식계열 서열의 이러한 수집은 데이터베이스, 예컨대 IMGT 또는 VBase에서 찾아볼 수 있다. 골격구조 영역은 개별적으로(예를 들어, 인간화된 항-CEA ABM의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역에 대한 수용체를 위해 선택된 FR1-3은 상이한 생식계열 유전자에 의해 코딩될 수 있음) 또는 동일한 생식계열 유전자의 부분으로서 수득될 수 있다. 더 구체적인 실시태양에서, 중쇄 FR1-3은 IGHV7_4_1*02 인간 면역글로불린 생식계열 유전자 서열(수납 번호 X62110, 서열 번호 114)에 의해 코딩된다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 경쇄 FR1-3은 IMGT_hVK_1_39 인간 면역글로불린 생식계열 유전자 서열(수납 번호 X59315, 서열 번호118)에 의해 코딩된다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 중쇄 FR4는 JH6 생식계열 유전자 서열(젠뱅크(GenBank) 수납 번호 M63030 참조)에 의해 코딩된다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 경쇄 FR4는 JK2 생식계열 유전자 서열(젠뱅크 수납 번호X61584)에 의해 코딩된다.

일반적으로 항원 결합 분자, 예컨대 항체 및 이의 단편이 항원에 대한 높은 친화도를 보유하고 다른 바람직한 생물학적 특성을 갖도록 인간화되는 것이 요망된다. 따라서, 한 실시태양에서, 인간화된 항체는 모 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양하게 구상된 인간화된 생성물을 분석함으로써 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 흔히 입수가능하고 당분야의 숙련가에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 나타내는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 표시에 대한 분석은 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할을 밝혀냄을 돕고, 예를 들어, 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석이다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 및 임포트 서열로부터 선택되고 조합되어 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성된다. 일반적으로, 과가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 주는데에 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여된다.

한 양태에서, 본 발명은, 제한되지 않지만 하기와 같은 바람직한 특성 및 특징을 갖는 인간화되고 친화성-성숙된 및/또는 변형된 항-CEA 항원 결합 분자에 관한 것이다: 가용성 CEA에 대해 교차 반응성을 실질적으로 갖지 않으면서 CEA 항원--특히, 막-결합된 CEA--에 대한 강한 결합 친화도; 시험관내 및 생체외에서, 바람직하게는 투약량-의존성 방식으로 CEA-발현 세포의 세포 용해를 유도하는 능력; 시험관내에서 CEA-매개된 세포 접착을 억제하는 능력; 종양 조직 성장을 억제하고/하거나 종양 조직 감소를 유도하는 능력(예를 들면, 종양 모델(예를 들어 이종이식 마우스)에서 입증된 바와 같음).

본원에 기재된 바와 같이, 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 예를 들면, PR1A3 항체의 하나 이상의 CDR을 포함하는 모 항체의 친화성-성숙에 기인하여 증가된 결합 친화도를 갖는다. 본 발명의 항원 결합 분자의 친화도는 당분야에 공지된 방법에 의해 및 본원에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 인간화된 또는 변형 항-CEA 항원 결합 분자는 인간 CEA, 바람직하게는 막-결합된 CEA에, 약 1 μM 내지 약 0.001 nM 이하, 보다 구체적으로 약 800 nM 내지 약 1 nM 이하, 더욱 더 구체적으로 약 550 nM 내지 약 10 nM 이하의 1가 친화도 상수(K_D) 값을 갖고 결합한다. 특정 실시태양에서, 변형 항-CEA 항원 결합 분자는 막-결합된 CEA에 약 100 nM 내지 약 10 nM 이하의 1가 친화도 상수(K_D) 값을 갖고 결합하는 친화성-성숙된 항체 또는 이의 단편이다.

한 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 전형적으로 마우스 항체 PR1A3에 의해 인식되는 바와 동일한 에피토프에 결합하거나, 막-결합된 CEA에 결합하기 위해 PR1A 항체와 경쟁할 수 있다. 관심있는 항체에 의해 결합된 인간 CEA 상의 에피토프에 결합하는 항체를 선별하기 위해(예를 들어, PR1A3 항체의 인간 CEA로의 결합을 차단하는 것들), 예컨대 문헌[ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane eds. (1988)]에 기재된 통상의 교차-차단 검정이 수행될 수 있다. 다르게는, 예를 들어 문헌[Champe et al, J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)]에 기재된 바와 같은 에피토프 매핑이, 항체가 관심있는 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있다.

한 실시태양에서, 인간 CEA에 특이적인 변형 항원 결합 분자는 단일클론 항체 PR1A3의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 모 항-CEA 항원 결합 분자로부터 제조되고, 이때 모 항-CEA 항체는 PR1A3 항체와 동일한 에피토프에 결합하고 항원 결합을 위해 PR1A3와 경쟁할 수 있다. 한 실시태양에서, 모 항원 결합 분자는 PR1A3 항체의 적어도 1, 2 또는 전형적으로 3개의 중쇄 CDR을 포함하고; 또 다른 실시태양에서, 모 항원 결합 분자는 PR1A3 항체의 적어도 1, 2, 또는 전형적으로 3개의 경쇄 CDR을 포함하고; 또 다른 실시태양에서, 모 항원 결합 분자는 PR1A3 항체의 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. 바람직하게는, 항원 결합 분자가 PR1A3의 HCDR1을 포함하는 경우, 상기 HCDR1은 카밧 위치 31에서 발린을 위한 글루타메이트의 치환을 포함한다. 변형 ABM은 전형적으로 부모에 비해 CEA에 대해 더 큰 친화도를 갖는다. 한 실시태양에서, 변형 ABM은 Fc 영역을 포함한다. 한 실시태양에서, 변형 ABM은 글리코조작된다. 한 실시태양에서, 변형 ABM은 모 ABM에 비해 증가된 ADCC 활성을 갖는다. 특별한 실시태양에서, 증가된 ADCC는, 예를 들면 변형 ABM을 생성하기 위한 모 ABM의 친화성-성숙에 의해 달성된 증가된 친화도의 결과이다. 더 특별한 실시태양에서 ADCC의 증가는 상기 모 항원 결합 분자에 비해 적어도 약 40% 내지 약 100%이다. 또 다른 특별한 실시태양에서, 변형 ABM은 시험관내 세포독성 검정에서 ADCC를 적어도 약 10% 내지 약 100% 증가시킨다. 더 특별한 실시태양에서, 변형 ABM은 뮤린 PR1A3 항체에 비교하여 소정의 농도에서 ADCC를 유도하는데에 적어도 약 10배 내지 약 1,000배 강력하다. 또 다른 특별한 실시태양에서, 증가된 ADCC 활성은 Fc 영역의 글리코조작의 결과이다. 또 다른 특별한 실시태양에서, 증가된 ADCC 활성은 증가된 친화도 및 글리코조작의 조합의 결과이다.

한 실시태양에서, 본 발명의 변형 항원 결합 분자는 적어도 하나의 CDR에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 아미노산 치환(들)의 수는 1 내지 10개(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개), 바람직하게는 2 내지 5개(예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개)의 범위일 수 있다. 한 실시태양에서, 적어도 하나의 중쇄 CDR은 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 적어도 하나의 경쇄 CDR은 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 적어도 하나의 중쇄 CDR은 하나 이상의 치환을 포함하고, 적어도 하나의 경쇄 CDR은 하나 이상의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 항원 결합 분자는 PR1A3의 HCDR1을 포함하고, 상기 HCDR1은 카밧 위치 31에서 발린 대신의 글루타메이트의 치환을 포함한다.

항원 결합 분자의 생물학적 특성에서의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면, 시이트 또는 나선형 입체형태, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크(bulk)를 유지시키는데 대한 이들의 영향에서 크게 차이나는 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산 치환을 포함하는 변형 항원 결합 분자는 모 항원 결합 분자에 비해 증진된 생물학적 활성, 예를 들면, 증진된 항원 결합 친화도 및 향상된 ADCC를 갖는다. 아미노산 치환은, 제한되지 않지만, 부위 유도된 돌연변이 생성 및/또는 예를 들어 파지 디스플레이(phage display)에 의한 모 항원 결합 분자의 친화성-성숙을 비롯한 당분야에 공지된 다양한 기법에 의해 도입될 수 있다.

변형을 위한 후보 부위, 예를 들어, 과가변 영역 잔기를 식별하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성이 수행되어 항원 결합에 크게 기여하는 잔기를 찾을 수 있다. 다르게는, 또는 부가적으로, 항체와 인간 CEA 사이의 접촉 지점을 식별하기 위해 항원-항체 착체의 결정 구조를 분석하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 당분야에 공지되고/되거나 본원에 기재된 방법에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 변형체가 생성되면, 변형체의 패널은 당분야에 공지되고/되거나 본원에 기재된 방법에 의해 선별되고, 하나 이상의 관련 검정에서 탁월한 특성을 갖는 항체가 추가의 개발을 위해 선택될 수 있다.

파지 디스플레이는 랜덤 아미노산 돌연변이(들)를 포함하는 모 항원 결합 분자로부터의 과가변 영역 서열의 모든 목록(repertoire)을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 몇몇의 과가변 영역 부위(예를 들어 6 내지 7개 부위)는 돌연변이되어 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 다르게는, 랜덤 돌연변이는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역에서 수행될 수 있다. 돌연변이는 제한되지 않지만 돌연변이생성 프라이머의 사용, 주기 수의 조절, 및 PCR 증폭 동안의 돌연변이 뉴클레오티드 유사체 8-옥소-dGTP 및 dPTP의 사용을 비롯한 당분야에 공지된 기법에 의해 생성될 수 있다. 이와 같이 항체 변형체는 각각의 입자내에 패키지된 M13의 유전자 III 생성물에 융합물로서의 사상(絲狀) 파지 입자로부터 1가 형식으로 표시된다. 이어서 파지-표시된 변형체는 본원에 개시된 바와 같이 이들의 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝되고, 하나 이상의 증진된 활성을 갖는 후보는 추가의 개발을 위해 사용될 것이다. 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는 방법은 문헌[Huse et al, Science, 246:1275-1281 (1989); Proc . Nat'lAcad . Sci., USA, 88:4363-4366 (1991)]에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 인용되어 있다. 친화성-성숙된 항원 결합 분자를 식별하기 위한 대안의 방법은, 예를 들면, 발린트(Balint) 등에게 허여된 미국 특허 제7,432,063호에서 찾아볼 수 있고, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용되어 있다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 Fc 영역, 바람직하게는 인간 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역의 서열 및 구조는 당분야에 공지되어 있고 특정화되었다. 특정 실시태양에서, 인간 불변 영역은 서열 번호 121 및 122에 제시된 바와 같이 IgG1이고, 하기 제시되어 있다:

그러나, 인간 Fc 영역의 변형체 및 이소형은 또한 본 발명에 의해 내포된다. 예를 들면, 본 발명에 사용하기에 적합한 변형체 Fc 영역은 프레스타(Presta)에게 허여된 미국 특허 제6,737,056호(하나 이상의 아미노산 변형에 기인하여 변형된 효과자 기능을 갖는 Fc 영역 변형체); 또는 미국 특허출원 제60/439,498호; 제60/456,041호; 제60/514,549호; 또는 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/063351호(아미노산 변형에 의해 결합 친화도가 증가된 변형체 Fc 영역); 또는 미국 특허출원 제10/672,280호 또는 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/099249호(아미노산 변형에 의해 FcγR로의 변형된 결합을 갖는 Fc 변형체)에 교시된 방법에 따라 생산될 수 있고, 이들 각각의 내용은 본원에 참고로 전체가 인용되어 있다. 특별한 실시태양에서, 항-CEA ABM 및 변형 ABM은 ABM의 효과자 기능 활성을 변경(예를 들어, 푸코실화 감소, Fc 수용체 결합 친화도 증진, ADCC 증가 등)하도록 글리코조작된 Fc 영역을 포함한다. 사용될 수 있는 글리코조작 방법은 이후 본원에 상세히 기재되어 있고 당분야에 공지되어 있다.

한 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 추가의 잔기, 예컨대 방사능표지 또는 독소에 공액된다. 이러한 공액된 항원 결합 분자는 당분야에 공지된 다수의 방법에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 항-CEA ABM 공액은 "항-CEA 항원 결합 분자 공액"이라는 명칭의 구간에서 이후 본원에 상세히 설명된다.

항-CEA ABM의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드

한 양태에서, 본 발명은 뮤린 PR1A3 항체의 동일한 결합 특이성(예를 들어, 막-결합된 CEA의 동일한 에피토프로의 결합)을 갖고, 필적할만하거나 증진된 생물학적 활성(예를 들어, 막-결합된 CEA에 대한 증진된 친화도 및/또는 향상된 ADCC)을 갖는 항원 결합 분자 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 항원 결합 분자는 하기 표 2에 제시된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 항원 결합 분자는 하기 표 2의 3개의 중쇄 CDR을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 항원 결합 분자는 하기 표 2의 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 및 서열 번호 12로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR1 서열; (b) 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 및 서열 번호 24로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR2 서열: 및 (c) 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 및 서열 번호 35로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 막-결합된 인간 CEA에 특이적인 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 및 서열 번호 45로 구성된 군에서 선택된 경쇄 CDR1 서열; (b) 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 및 서열 번호 55로 구성된 군에서 선택된 경쇄 CDR2 서열; 및 (c) 서열 번호 56의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 막-결합된 인간 CEA에 특이적인 항원 결합 분자에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 분자는 가용성 인간 CEA에 대해 실질적인 교차-반응성을 갖지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 항원 결합 분자는 인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 예를 들면, 한 실시태양에서, 항원 결합 분자는 Fc 영역을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 항원 결합 분자는 글리코조작된 Fc 영역을 포함한다. 본 발명은 또한 막-결합된 인간 CEA에 특이적인 본 발명의 항원 결합 분자중 임의의 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 막-결합된 인간 CEA에 특이적인 항원 결합 분자에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 101의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 101의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시태양에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 105의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 105의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 번호 105의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

한 실시태양에서, 막-결합된 인간 CEA에 특이적인 항원 결합 분자는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시태양에서, 중쇄 가변 영역은 하기와 같은 서열 번호 4의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다:

상기에서, X¹은 Y 또는 F이고; X²는 S 또는 G이고; X³은 N 또는 S이고; X⁴는 W 또는 Y이고; X⁵는 N, T 또는 S이고; X⁶은 T 또는 N이고; X⁷은 V 또는 I이고; X⁸은 F 또는 A이고; X⁹는 Y, A, V, F 또는 S이고; X¹⁰은 D, H, W, E, 또는 Y이고; X¹¹은 V, L 또는 F이고; X¹²는 E, K 또는 Q이고; X¹³은 A 또는 T이고; X¹⁴는 M 또는 L이다.

특정 실시태양에서, 경쇄 가변 영역은 하기와 같은 서열 번호 11의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다:

상기에서, X¹⁵는 Q, A, K, 또는 H이고; X¹⁶은 N, A, Y, I, K, T, 또는 F이고; X¹⁷은 V, A, G, 또는 M이고; X¹⁸은 G, S, T, 또는 L이고; X¹⁹는 T, N, P, 또는 A이고; X²⁰은 N 또는 Y이고; X²¹은 P 또는 L이고; X²²는 S, L, 또는 W이고; X²³은 Y, N, 또는 H이고; X²⁴는 R, L, P, 또는 H이고; X²⁵는 Y, S, Q, K, E, F, 또는 P이고; X²³은 S, G, I, 또는 R이다.

또 다른 구체적인 실시태양에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 107의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 107의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 항원 경쇄 가변 영역은 서열 번호 108의 서열을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 108에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 항원 결합 분자는 서열 번호 101, 107, 및 188 내지 206으로 구성된 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 폴리펩티드, 및 서열 번호 105, 108 및 207 내지 216으로 구성된 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 CEA, 특히 막-결합된 CEA에 특이적이다. 한 실시태양에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 가용성 CEA에 대해 실질적인 교차-반응성을 갖지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 중쇄는 추가로 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시태양에서, Fc 영역은 이후 상세히 기재된 바와 같이 N-연결된 올리고당의 푸코실화가 감소되도록 글리코 조작되었다.

한 양태에서, 본 발명은 표 2에 제시된 하나 이상의 CDR을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 단리된 폴리펩티드는: (a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 및 서열 번호 12로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR1 서열; (b) 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 및 서열 번호 24로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR2 서열: 및 (c) 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 및 서열 번호 35로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 107의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 및 서열 번호 45로 구성된 군에서 선택된 경쇄 CDR1 서열; (b) 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 및 서열 번호 55로 구성된 군에서 선택된 경쇄 CDR2 서열; 및 (c) 서열 번호 56의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 108에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 이들 폴리펩티드중 임의의 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이들 폴리펩티드중 임의의 하나를 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다. 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 분자는 CEA, 특히 막-결합된 CEA에 특이적이다. 한 실시태양에서, 항원 결합 분자는 가용성 인간 CEA에 대한 실질적인 교차-반응성을 갖지 않는다. 한 실시태양에서, 폴리펩티드는 추가로 인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 Fc 영역, 보다 구체적으로 글리코조작된 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시태양에서, Fc 영역은 본원에 기재된 바와 같이 N-연결된 올리고당의 푸코실화가 감소되도록 글리코조작된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 추가로 막-결합된 인간 CEA에 특이적인 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 하기 표 3에 제시된 하나 이상의 CDR 서열, 또는 이의 조합을 포함하고, 이때 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 분자의 일부로서, CEA, 특히 막-결합된 CEA에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시태양에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 표 5에 제시된 하나 이상의 가변 영역 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 113, 119, 및 159 내지 177로 구성된 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제1 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 117, 120, 및 178 내지 187로 구성된 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제2 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 가변 영역 및 불변 영역(예를 들어, IgG 불변 영역 또는 이의 단편, 특히 Fc 영역를 포함하는 IgG 불변 영역)을 포함하는 중쇄를 코딩한다. 한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 가변 영역 및 불변 영역(예를 들어, 카파 또는 람다 불변 영역)을 포함하는 경쇄를 코딩한다. 한 실시태양에서, 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 항원 결합 분자는 가용성 인간 CEA에 대한 실질적인 교차-반응성을 갖지 않는다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 101, 105, 107, 108, 및 188 내지 216으로 구성된 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 내포하고, 이때 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 분자(예를 들면, 서열 번호 101, 107, 및 188 내지 206으로 구성된 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드: 및 서열 번호 105, 108, 및 207 내지 216으로 구성된 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 분자)는 CEA, 특히 막-결합된 CEA에 특이적으로 결합한다. 한 실시태양에서, 폴리펩티드는 추가로 인간 불변 영역을 포함한다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 인간 Fc 영역을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, Fc 영역은 글리코조작된 IgG Fc 영역이다.

한 실시태양에서, 본 발명은: (a) 서열 번호 57 내지 59 및 61로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR1을 코딩하는 서열, (b) 서열 번호 62 내지 66으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR2 서열, 및 (c) 서열 번호 67 내지 77로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 78 내지 88로 구성된 군에서 선택된 경쇄 CDR1 서열, (b) 서열 번호 89 내지 97로 구성된 군에서 선택된 경쇄 CDR2 서열, 및 (c) 서열 번호 98의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

발현 벡터 및 숙주 세포

한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및/또는 숙주 세포에 관한 것이다. 예를 들면, 숙주 세포 또는 발현 벡터는 "항-CEA 항원 결합 분자" 및 "항-CEA ABM의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드"란 명칭의 구간에서 상기 기재된 폴리펩티드, ABM 및/또는 변형 ABM을 코딩하는 임의의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 막-결합된 인간 CEA에 특이적으로 결합하는 ABM을 생산하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 본 발명의 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포, 또는 본 발명의 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하는 조건하에 배지에서 배양하는 단계(이때, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 ABM의 일부를 형성하는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩함); 및 상기 ABM을 회수하는 단계(이때, 상기 ABM 또는 이의 일부는 뮤린 단일클론 항체 PR1A3와 동일한 에피토프에 결합하거나, 이와 결합을 위해 경쟁할 수 있음)를 포함한다.

일반적으로, 임의의 유형의 배양된 세포주를 사용하여 본 발명의 ABM을 발현시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 다른 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포가 배경 세포주로 사용되어 본 발명의 조작된 숙주 세포를 생성할 수 있다.

특정 실시태양에서, 숙주 세포 또는 발현 벡터는 뮤린 PR1A3 항체의 결합 특이성을 갖는 변형 항체 또는 이의 단편인 ABM을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 예를 들면, ABM은 PR1A3와 동일한 에피토프에 결합하거나 항원으로의 결합을 위해 PR1A3 항체와 경쟁할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 친화성-성숙된다. 친화성-성숙된 항체는 일반적으로 친화성-성숙된 항체가 유도되는 기준 항체에 비해 증진된 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 항체는 제한되지 않지만: 가용성 CEA에 대해 실질적으로 교차-반응성을 갖지 않으면서 CEA 항원, 특히 막-결합된 CEA에 대한 강한 결합 친화도; 시험관내 및 생체외에서, 바람직하게는 투약량-의존성 방식으로 CEA-발현 세포의 세포 용해를 유도하는 능력; 시험관내에서 CEA-매개된 세포 접착을 억제하는 능력; 마우스(예를 들어 이종이식 마우스)의 종양 모델에서 종양 조직 성장을 억제하고/하거나 종양 조직 감소를 유도하는 능력을 비롯한 원하는 치료학적 특성을 갖는다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 변형 항체 또는 이의 단편은 인간 Fc를 포함한다.

한 실시태양에서, 본 발명의 ABM을 코딩하는 하나 또는 몇몇의 폴리뉴클레오티드는 구성 프로모터의 조절하에, 또는 다르게는 규제된 발현 시스템하에 발현될 수 있다. 적합한 규제된 발현 시스템으로는, 제한되지 않지만, 테트라사이클린-규제된 발현 시스템, 엑디손(ecdysone)-유도성 발현 시스템, lac-스위치 발현 시스템, 글루코코르티코이드-유도성 발현 시스템, 온도-유도성 프로모터 시스템, 및 메탈로티오네인(metallothionein) 금속-유도성 발현 시스템이 포함된다. 본 발명의 ABM을 코딩하는 몇몇의 상이한 핵산이 숙주 세포 시스템내에 포함된다면, 이들중 몇몇은 구성 프로모터의 조절하에 발현되는 반면, 나머지는 규제된 프로모터의 조절하에 발현된다. 최대 발현 수준은 세포 성장 속도에 상당한 역효과를 주지 않는 안정한 폴리펩티드 발현의 가장 높은 가능한 수준으로 고려되고, 이는 통상적인 실험에 의해 결정될 것이다. 발현 수준은 일반적으로 ABM에 특이적인 항체 또는 ABM에 융합된 펩티드 태그에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석; 및 노던 블롯 분석을 비롯한 당분야에 공지된 방법에 의해 결정된다. 추가의 대안으로, 폴리뉴클레오티드는 리포터(reporter) 유전자에 작동적으로 연결되고; 본원에 개시된 ABM의 발현 수준은 리포터 유전자의 발현 수준과 관련된 신호를 측정함으로써 결정된다. 리포터 유전자는 단일 mRNA 분자로서 상기 ABM을 코딩하는 핵산(들)과 함께 전사될 수 있고; 이들 각각의 코딩 서열은 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site) 또는 캡-독립성 번역 인헨서(CITE: cap-independent translation enhancer)에 의해 연결될 수 있다. 리포터 유전자는 단일 폴리펩티드 쇄가 형성되도록 본원에 개시된 ABM을 코딩하는 적어도 하나의 핵산과 함께 번역될 수 있다. 본 발명의 ABM을 코딩하는 핵산은 단일 프로모터의 조절하에 리포터 유전자에 작동적으로 연결되어, ABM을 코딩하는 핵산 및 리포터 유전자가 2개의 별도의 메신저 RNA(mRNA) 분자로 달리 분할되는 RNA 분자로 전사되고; 생성된 mRNA중 하나는 상기 리포터 단백질로 번역되고, 나머지는 ABM으로 번역된다.

당분야에 공지된 방법은 적절한 전사/번역 조절 신호에 따라 뮤린 PR1A3 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 ABM의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 작성하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다. 예를 들면, 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)] 및 [Ausubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)]에 기재된 기법을 참조한다.

다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 본 발명의 ABM의 코딩 서열을 발현하기 위해 이용될 수 있다. 바람직하게는, 포유동물 세포는 융합 폴리펩티드의 코딩 서열 및 관심있는 단백질의 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포 시스템으로서 사용된다. 가장 바람직하게는, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 다른 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포는 숙주 세포 시스템으로서 사용된다. 발현 시스템 및 선택 방법의 몇몇 예는 하기 문헌 및 이에 인용된 문헌에 기재되어 있다: 문헌[Borth et al, Biotechnol . Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001)], [Werner et al., Arzneimittelforschung / Drug Res. 48(8):870-80 (1998)], [Andersen and Krummen, Curr . Op . Biotechnol. 13:117-123 (2002)], [Chadd and Chamow, Curr . Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001)], 및 [Giddings, Curr . Op . Biotechnol . 12: 450-454 (2001)].

대안의 실시태양에서, 다른 진핵 숙주 세포 시스템이 사용될 수 있고, 본 발명의 ABM의 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 세포, 예컨대 미국 특허출원 제60/344,169호 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 03/056914호(인간 이외의 진핵 숙주 세포에서 인간-유사 당단백질을 생산하는 방법)(각각의 이의 내용은 본원에 참고로 전체가 인용됨)에 교시된 발현 시스템; 뮤린 PR1A3 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 항원 결합에 대해 PR1A3과 경쟁할 수 있는 ABM의 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터[예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus); 담배 모자이크 바이러스(TMV: tobacco mosaic virus)]로 감염되거나 본 발명의 ABM의 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템, 예컨대 제한되지 않지만, 미국 특허 제6,815,184호(유전적으로 조작된 좀개구리밥으로부터 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 발현 및 분비하는 방법); 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/057002호(글리코실 전달효소 유전자의 도입에 의한 선태식물 세포에서의 글리코실화 단백질의 생산) 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/024927호(이끼 원형질체에서 세포외 이종성 비-식물 단백질의 생성 방법); 및 미국 특허출원 제60/365,769호, 제60/368,047호, 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/078614호(기능성 포유동물 GnTIII 효소를 포함하는 유전자이식 식물에서의 당단백질 소유)에 교시된 발현 시스템(각각의 이의 내용은 본원에 참고로 전체가 인용됨); 또는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 백신 바이러스), 예컨대 미소쌍(double-minute) 염색체에서 안정하게 증폭되거나(CHO/dhfr) 불안정하게 증폭된 뮤린 PR1A3 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 키메라성 ABM을 코딩하는 DNA의 다중 복사물을 포함하도록 조작된 세포주(예를 들어, 뮤린 세포주)로 형질감염된 동물 세포 시스템이 포함된다. 한 실시태양에서, 본 발명의 ABM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 벡터는 다시트론성(polycistronic)이다. 또한, 한 실시태양에서, 상기 논의된 ABM은 항체 또는 이의 단편이다. 바람직한 실시태양에서, ABM은 친화성-성숙된 항체이다.

안정한 발현은 일반적으로 일시적 발현에 바람직하데, 이는 전형적으로 더 재현가능한 결과를 달성하고 또한 큰-규모 생산에 더욱 적합하기 때문인데; 일시적 발현이 특정 상황에 더 나은지의 여부는 당분야의 숙련가가 결정할 일이다. 복제의 바이러스 기원을 포함하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인헨서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등), 및 선택가능한 마커에 의해 조절되는 각각의 코딩 핵산으로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA 도입을 수행하면, 조작된 세포는 강화 배지에서 1 내지 2일 동안 성장될 수 있고, 이어서 선택 배지로 스위칭된다. 재조합 플라스미드에서 선택가능한 마커는 선택에 내성을 부여하고, 플라스미드를 그들의 염색체내로 안전하게 조립하는 세포의 선택을 가능하게 하고, 성장하여 포커스를 형성하도록 하는데, 이는 반대로 세포주로 클로닝되고 팽창될 수 있다.

다수의 선택 시스템, 예컨대 제한되지 않지만, 단순포진(herpes simplex) 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler et al, Cell 77:223 (1977)), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실전달효소(Szybalska & Szybalski, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 48:2026 (1962)), 및 아데닌 포스포리보실전달효소(Lowy et al, Cell 22:817 (1980)) 유전자(이는 각각 tk^-, hgprt^- 또는 aprt^- 세포로 사용될 수 있음)가 사용될 수 있다. 또한 대사길항물질 내성은 메토트렉세이트(methotrexate)에 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., Natl . Acad . Sci. USA 77:3567 (1989); O'Hare et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1521 (1981)); 미코페놀산에 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418에 내성을 부여하는 neo(Colberre-Garapin et al, J. Mol Biol . 150:1 (1981)); 및 하이그로마이신에 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al, Gene 50:147 (1984)) 유전자에 대한 선택의 기준으로 사용될 수 있다. 최근에, 추가의 선택가능한 유전자, 즉 세포가 트립토판 대신 인돌을 이용할 수 있도록 허용하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 이용할 수 있도록 허용하는 hisD(Hartman & Mulligan, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 55:8047 (1988)); 글루타민 합성 시스템; 및 오르니틴 탈카복시효소(ODC: ornithine decarboxylase) 억제제에 내성을 부여하는 오르니틴 탈카복시효소, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO(McConlogue, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987))가 기재되었다.

본 발명은 추가로 본 발명의 ABM을 코딩하는 핵산 및 글리코실전달효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 이러한 핵산을 포함하는 벡터를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포에 의해 생산되는 본 발명의 ABM의 글리코실화 프로파일을 변경하는 방법에 관한 것이다. 글리코실전달효소 활성을 갖는 유전자는 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전달효소 III(GnTII), α-만노시다아제 II(ManII), β(1,4)-갈락토실전달효소(GalT), β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐전달효소 I(GnTI), 및 β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐전달효소 II(GnTII)를 포함한다. 한 실시태양에서, 글리코실전달효소 활성을 갖는 유전자의 조합물이 숙주 세포에서 발현된다(예를 들어, GnTIII 및 ManII). 유사하게, 이 방법은 또한 글리코실전달효소 유전자가 파열되거나 달리는 실활된 숙주 세포(예를 들어, α1-6 코어 푸코실전달효소를 코딩하는 유전자의 활성이 넉아웃된 숙주 세포)에서 ABM을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)를 발현시킴을 내포한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 ABM은 글리코실화 패턴을 바꾸도록 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 발현하는 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 특정 실시태양에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 골지 주거 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 숙주 세포에서 본 발명의 ABM을 발현시키면 Fc 수용체 결합 친화도가 증가되고 효과자 기능이 증가된 ABM이 생성된다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 (a) GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산; 및 (b) 본 발명의 ABM을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 예컨대 인간 CEA에 결합하는 키메라성의 영장류화된 또는 인간화된 항체를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 GnTIII의 촉매성 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이고 골지 편재화 도메인은 만노시다아제II의 편재화 도메인이다. 이러한 융합 폴리펩티드를 생성하고 이들을 사용하여 효과자 기능이 증가된 항체를 생산하는 방법은 미국 가특허출원 제60/495,142호 및 미국 특허출원 공개공보 제2004/0241817호(이의 전체 내용은 분명히 본원에 참고로 인용됨)에 개시되어 있다. 특별한 실시태양에서, 숙주 세포에 의해 생산된 변형된 ABM은 Fc 영역을 포함하는 IgG 불변 영역 또는 이의 단편을 갖는다. 또 다른 특별한 실시태양에서 ABM은 Fc 영역을 포함하는 인간화된 항체 또는 단편이다.

본 발명의 숙주 세포에 의해 생산된 글리코실화가 변경된 ABM은 전형적으로 증가된 Fc 수용체 결합 친화도 및/또는 증가된 효과자 기능을 숙주 세포의 변형(예를 들어, 글리코실전달효소 유전자의 발현에 의해)의 결과로서 나타낸다. 바람직하게는, 증가된 Fc 수용체 결합 친화도는 Fcγ 활성화 수용체, 예컨대 FcγRIIIa 수용체로의 증가된 결합이다. 증가된 효과자 기능은 바람직하게는 다음 중 하나 이상의 증가이다: 증가된 항체-의존성 세포독성, 증가된 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP), 증가된 사이토킨 분비, 항원-제공 세포에 의한 증가된 면역-착체-매개된 항원 채택, 증가된 Fc-매개된 세포독성, NK 세포로의 증가된 결합, 대식세포로의 증가된 결합, 다형핵 세포(PMN: polymorphonuclear cell)로의 증가된 결합, 단핵세포로의 증가된 결합, 표적-결합된 항체의 증가된 가교결합, 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 증가된 직접적인 신호, 증가된 수지상 세포 성숙, 및 증가된 T 세포 프라이밍(priming).

항체-의존성 세포독성을 포함하는 증가된 효과자 기능을 갖는 ABM의 생성 및 용도

한 양태에서, 본 발명은 뮤린 PR1A3 항체와 동일한 에피토프에 결합하고 항체-의존성 세포독성을 비롯한 증가된 효과자 기능을 갖는 ABM(예를 들어, 변형 ABM)의 당형태를 제공한다. 항체의 글리코실화 조작은 이전에 기재된 바와 같다. 예를 들어, 본원에 참고로 전체가 인용된 미국 특허 제6,602,684호를 참조한다. 글리코실화에 관여된 유전자의 변경된 활성을 갖는 숙주 세포로부터 ABM을 생산하는 방법은 또한 본원에 상세히 기재되어 있다(예를 들어, "발현 벡터 및 숙주 세포"란 명칭의 선행 구간 참조). 본 발명의 ABM의 ADCC에서의 증가는 또한 막-결합된 CEA에 대한 항원 결합 분자의 친화도를 증가시킴으로써, 예를 들면 친화성-성숙 또는 친화도를 개선시키는 다른 방법에 의해 달성될 수 있다(문헌[Tang et al., J. Immunol. 2007, 179:2815-2823] 참조). 이들 방안의 조합은 또한 본 발명에 의해 내포된다.

몇몇 유형의 암의 치료를 위한 공액되지 않은 단일클론 항체(mAb)에 대한 임상 실험은 최근 고무적인 결과를 나타내었다(Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 72:223-25 (1997); Deo et al, Immunology Today 18:121 (1997)). 키메라성의 공액되지 않은 IgG1은 저등급 또는 여포성 B-세포 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)에 대해 승인된 한편(Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 72:223-25 (1997)), 고형 유방 암종을 표적화하는 또 다른 공액되지 않은 mAb, 인간화된 IgG1은 또한 상 III 임상 실험에서 유망한 결과를 나타내었다(Deo et al., Immunology Today 18:121 (1997)). 이들 2개의 mAb의 항원은 이들 개개의 종양 세포에서 고도로 발현되고 항체는 시험관내 및 생체내에서 효과자 세포에 의해 강력한 종양 파괴를 매개한다. 대조적으로, 우수한 종양 특이성을 갖는 많은 다른 공액되지 않은 mAb는 임상적으로 유용한 충분한 효능의 효과자 기능을 개시할 수 없다(Frost et al, Cancer 80:311-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 79:184-91 (1996)). 이들 더 약한 mAb중 몇몇의 경우, 부가적 사이토킨 치료법이 현재 시험중이다. 사이토킨의 첨가는 활성 및 순환 림프구의 수를 증가시킴으로써 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 자극할 수 있다(Frost et al., Cancer 80:311-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 79:184-91 (1996)). 표적화된 세포 상의 용해성 공격인 ADCC는 백혈구 수용체가 항체의 불변 영역(Fc)으로 결합될 때 개시된다(Deo et al., Immunology Today 18:121 (1997)).

공액되지 않은 IgG1의 ADCC 활성을 증가시키기 위한 상이하나 보완적인 방안은 항체의 Fc 영역을 조작하는 것이다. 단백질 조작 연구는 FcγR이 IgG CH2 도메인의 더 낮은 힌지 영역과 상호작용함을 보여주었다(Lund et al., J. Immunol. 757:4963-69 (1996)). 그러나, FcγR 결합은 또한 CH2 영역중의 보존된 Asn 297에 공유 결합된 올리고당의 존재를 필요로 하고(Lund et al, J. Immunol . 757:4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech. 75:26-31 (1997)), 이는 올리고당 및 폴리펩티드 둘 다 상호작용 부위에 직접 기여하거나 올리고당이 활성 CH2 폴리펩티드 입체형태를 유지하기 위해 필요함을 제안한다. 따라서 올리고당 구조의 변형은 상호작용의 친화도를 증가시키기 위한 수단으로서 조사될 수 있다.

IgG 분자는 2개의 N-연결된 올리고당을 그의 Fc 영역에서 각각의 중쇄에 하나씩 수반한다. 임의의 당단백질로서, 항체는 동일한 폴리펩티드 주쇄를 공유하지만 글리코실화 부위에 결합된 상이한 올리고당을 갖는 글리코형태의 군집으로서 생산된다. 혈청 IgG의 Fc 영역에서 일반적으로 발견되는 올리고당은 2중촉각 유형의 착체이고(Wormald et al., Biochemistry 56:130-38 (1997)), 저 수준의 말단 시알산 및 2등분 N-아세틸글루코사민(GlcNAc), 및 말단 갈락토실화 및 코어 포코실화의 다양한 정도를 갖는다 몇몇 연구는 FcγR 결합을 위해 필요한 최소 탄수화물 구조가 올리고당 코어내에 있음을 제안한다(Lund et al., J. Immunol. 757:4963-69 (1996)).

공액되지 않은 치료학적 mAb의 생산하여 산업 및 학계에서 사용되는 마우스- 또는 햄스터-유도된 세포주는 Fc 부위에 필요한 올리고당 결정자를 정상적으로 결합시킨다. 그러나, 이들 세포주에서 발현되는 IgG는 낮은 양으로 혈청 IgG에서 발견되는 2등분된 GlcNAc가 부족하다(Lifely et al., Glycobiology 575:813-22 (1995)). 대조적으로, 래트 골수종-생산된, 인간화된 IgG1(CAMPATH-1H)이 2등분된 GlcNAc를 그의 몇몇 글리코형태로 운반하는 것으로 최근에 관찰되었다(Lifely et al., Glycobiology 575:813-22 (1995)). 래트 세포-유도된 항체는 매우 낮은 항체 농도에서 표준 세포주에서 생산되는 CAMPATH-1H 항체와 유사한 최대 시험관내 ADCC 활성에 도달하였다.

CAMPATH 항원은 림프종 세포 상에서 일반적으로 높은 수준으로 존재하지만, 이러한 키메라성 mAb는 2등분된 GlcNAc의 부재하에 높은 ADCC 활성을 갖는다(Lifely et al., Glycobiology 575:813-22 (1995)). N-연결된 글리코실화 경로에서, 2등분 GlcNAc는 GnTIII에 의해 첨가된다(Schachter, Biochem . Cell Biol . (54:163-81 (1986)).

이전의 연구는 외부적으로-규제된 양식으로 상이한 수준의 클로닝된 GnTIII 효소 유전자를 발현하도록 이전에 조작된 단일한 항체-생산 CHO 세포주를 사용하였다(Umana, P., et al, Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999)). 이러한 방안은 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII)의 발현과 변형된 항체의 ADCC 활성 사이의 엄격한 상관관계를 최초로 달성하였다. 이와 같이, 본 발명은 Fc 영역 또는 ABM-생산 숙주 세포에서 글리코실전달효소 유전자의 발현 수준을 변화시킴으로부터 초래되는 변경된 글리코실화를 갖는 Fc 영역에 해당하는 영역을 포함하는 뮤린 PR1A3 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 변형 ABM(예를 들어, 친화성-성숙된 ABM)을 고려한다. 특정 실시태양에서, 유전자 발현 수준의 변화는 GnTIII 활성의 증가이다. 증가된 GnTIII 활성은 ABM의 Fc 영역에서 2등분된 올리고당 백분율의 증가, 뿐만 아니라 푸코스 잔기 백분율의 감소를 일으킨다. 이러한 항체, 또는 이의 단편은 증가된 Fc 수용체 결합 친화도 및 증가된 효과자 기능을 갖는다.

본 발명은 (a) 글리코실전달효소 활성를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 발현하도록 조작된 숙주 세포를, 본 발명에 따른 ABM의 생산을 허용하는 조건하에 배양하는 단계(이때, 글리코실전달효소 활성을 갖는 상기 폴리펩티드는 상기 숙주 세포에 의해 생산된 상기 ABM의 Fc 영역에서 올리고당을 변형시키기에 충분한 양으로 발현됨); 및 (b) 상기 ABM을 단리하는 단계를 포함하는, 변형된 올리고당을 갖는 본 발명의 ABM을 생산하는 방법에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 글리코실전달효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 GnTIII이다. 또 다른 실시태양에서, 글리코실전달효소 활성을 갖는 2종의 폴리펩티드가 존재한다. 특별한 실시태양에서, 글리코실전달효소 활성을 갖는 2종의 폴리펩티드는 GnTIII 및 ManII이다. 또 다른 실시태양에서, 글리코실전달효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 GnTIII의 촉매 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 더 구체적인 실시태양에서, 융합 폴리펩티드는 추가로 골기 주거 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 골지 편재화 도메인은 만노시다아제 II 또는 GnTI의 편재화 도메인이다. 다르게는, 골지 편재화 도메인은 만노시다아제 I의 편재화 도메인, GnTII의 편재화 도메인, 및 α 1-6 코어 푸코실전달효소의 편재화 도메인으로 구성된 군에서 선택된다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 ABM은 증가된 Fc 수용체 결합 친화도 및/또는 증가된 효과자 기능을 갖는다. 일반적으로, 증가된 효과자 기능은 다음 중 하나 이상의 기능이다: 증가된 Fc-매개된 세포독성(증가된 항체-의존성 세포독성 포함), 증가된 항체-의존성 세포 식균 작용(ADCP), 증가된 사이토킨 분비, 항원-제공 세포에 의한 증가된 면역-착체-매개된 항원 채택, NK 세포로의 증가된 결합, 대식세포로의 증가된 결합, 단핵세포로의 증가된 결합, 다형핵 세포로의 증가된 결합, 세포사멸을 유도하는 증가된 직접적인 신호, 표적-결합된 항체의 증가된 가교결합, 증가된 수지상 세포 성숙, 또는 증가된 T 세포 프라이밍. 증가된 Fc 수용체 결합 친화도는 바람직하게는 Fc 활성화 수용체, 예컨대 FcγRIIIa로의 증가된 결합이다. 특히 바람직한 실시태양에서, ABM은 인간화된 항체 또는 이의 단편이다.

한 실시태양에서, ABM의 Fc 영역에서 2등분된 N-연결된 올리고당의 백분율은 총 올리고당의 적어도 약 10% 내지 약 100%, 구체적으로 적어도 약 50%, 보다 구체적으로, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90 내지 95%이다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 방법에 의해 생산되는 항원 결합 분자는 본 발명의 방법에 의해 그의 올리고당의 변형의 결과로서 Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖는다. 한 실시태양에서, 푸코실화되지 않은 올리고당의 백분율은 적어도 약 20% 내지 약 100%, 구체적으로 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 내지 약 70%, 및 보다 구체적으로, 적어도 약 75%이다. 푸코실화되지 않은 올리고당은 하이브리드 또는 착체 유형일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 항원 결합 분자는 본 발명의 방법에 의해 그의 올리고당의 변형의 결과로서 Fc 영역에서 2등분된 올리고당의 증가된 비율을 갖는다. 한 실시태양에서, 2등분된 올리고당의 백분율은 적어도 약 20% 내지 약 100%, 구체적으로 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 내지 약 70%, 보다 구체적으로, 적어도 약 75%이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법 및 숙주 세포에 의해 생산되는 ABM은 Fc 영역에서 2등분된 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖는다. 2등분된 푸코실화되지 않은 올리고당은 하이브리드 또는 착체일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 항원 결합 분자의 Fc 영역에서 올리고당의 적어도 약 10% 내지 약 100%, 구체적으로 적어도 약 15%, 보다 구체적으로 적어도 약 20% 내지 약 50%, 보다 구체적으로 적어도 약 20% 내지 약 25%, 및 보다 구체적으로 적어도 약 30% 내지 약 35%가 2등분되고 푸코실화되지 않은 항원 결합 분자를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 ABM은 ABM의 Fc 영역에서 올리고당의 적어도 약 10% 내지 약 100%, 구체적으로 적어도 약 l5%, 보다 구체적으로 적어도 약 20% 내지 약 25%, 및 보다 구체적으로 적어도 약 30% 내지 약 35%가 2등분된 푸코실화되지 않은 하이브리드인 Fc 영역을 포함할 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 의해 생산된, 증가된 효과자 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합 친화도를 갖도록 조작된, 막-결합된 인간 CEA에 대해 PR1A3 항체와 경쟁할 수 있는 항원 결합 분자(예를 들어, 변형 ABM)에 관한 것이다. 증가된 효과자 기능은, 제한되지 않지만 하나 이상의 하기 특성을 포함할 수 있다: 증가된 Fc-매개된 세포독성(증가된 항체-의존성 세포독성을 포함함), 증가된 항체-의존성 세포 식균 작용(ADCP), 증가된 사이토킨 분비, 항원-제공 세포에 의한 증가된 면역-착체-매개된 항원 채택, NK 세포로의 증가된 결합, 대식세포로의 증가된 결합, 단핵세포로의 증가된 결합, 다형핵 세포로의 증가된 결합, 세포사멸을 유도하는 증가된 직접적인 신호, 표적-결합된 항체의 증가된 가교결합, 증가된 수지상 세포 성숙, 또는 증가된 T 세포 프라이밍. 바람직한 실시태양에서, 증가된 Fc 수용체 결합 친화도는 Fc 활성화 수용체, 가장 바람직하게는 FcγRIIIa로의 증가된 결합이다. 한 실시태양에서, 항원 결합 분자는 항체, Fc 영역을 포함하는 항체 단편, 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 해당하는 영역을 포함하는 융합 단백질이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 항원 결합 분자는 인간화된 친화성-성숙된 항체이다.

본 발명은 증가된 Fc 수용체 결합 친화도, 바람직하게는 Fc 활성화 수용체로의 증가된 결합을 갖고/갖거나 증가된 효과자 기능, 예컨대 항체-의존성 세포독성을 갖는 본 발명의 ABM의 글리코형태의 생산을 위한 숙주 세포 시스템의 생성 방법 및 용도를 추가로 제공한다. 본 발명의 ABM에 의해 사용될 수 있는 글리코조작 방법은 보다 상세히 미국 특허 제6,602,684호, 미국 특허출원 공개공보 제2004/0241817 A1호, 미국 특허출원 공개공보 제2003/0175884 A1호, 미국 가특허출원 제60/441,307호 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/065540호에 기재되어 있고, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 그의 전체가 인용되어 있다. 본 발명의 ABM은 다르게는 미국 특허출원 공개공보 제2003/0157108호[제네테크(Genentech)], 또는 유럽 특허출원 제EP 1 176 195 A1호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 03/084570호, 제WO 03/085119호 및 미국 특허출원 공개공보 제2003/0115614호, 제2004/093621호, 제2004/110282호, 제2004/110704호, 제2004/132140호[교와(Kyowa)]에 개시된 기법에 따라 Fc 영역에서 감소된 푸코스 잔기를 갖도록 글리코조작될 수 있다. 이들 각각의 문헌의 내용은 본원에 참고로 전체가 인용되어 있다. 본 발명의 글리코조작된 ABM은 또한 변형된 당단백질을 생산하는 발현 시스템에서 생산될 수 있고, 예컨대 미국 특허출원 공개공보 제60/344,169호 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 03/056914호[글리코피 인크.(GlycoFi, Inc.)] 또는 제WO 2004/057002호 및 제WO 2004/024927호[그리노베이션(Greenovation)]에 교시된 것이고, 이들 각각의 내용은 본원에 참고로 전체가 인용되어 있다.

글리코실화 패턴이 변형된 단백질의 생산을 위한 세포주의 생산

한 양태에서, 본 발명은 글리코실화 패턴이 변형된 본 발명의 ABM의 생성을 위한 숙주 세포 발현 시스템을 제공한다. 특히, 본 발명은 개선된 치료값을 갖는 본 발명의 ABM의 글리코형태의 생성을 위한 숙주 세포 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명은 글리코실전달효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 선택되거나 조작된 숙주 세포 발현 시스템을 제공한다. 특정 실시태양에서, 글리코실전달효소 활성은 GnTIII 활성이다. 한 실시태양에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 이종성 골지 주거 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 구체적으로, 이러한 숙주 세포 발현 시스템은 구성 프로모터 또는 규제된 프로모터 시스템에 작동적으로 연결된, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하도록 조작될 수 있다.

한 특정 실시태양에서, 본 발명은 이종성 골지 주거 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하고 GnTIII 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 발현하도록 조작된 숙주 세포를 제공한다. 한 양태에서, 숙주 세포는 이종성 골지 주거 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하고 GnTIII 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 핵산 분자로 조작된다.

일반적으로, 상기 논의된 세포주를 비롯한 임의의 유형의 배향된 세포주는 본 발명의 숙주 세포주를 조작하기 위한 배경으로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 다른 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포는 본 발명의 조작된 숙주 세포를 생성하기 위한 배경 세포주로서 사용된다.

본 발명은 글리코실전달효소 활성, 예를 들어, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드, 예컨대 본원에 정의된 바와 같은 이종성 골지 주거 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 발현하는 임의의 조작된 숙주 세포를 포함하는 것으로 고려된다.

글리코실전달효소 활성, 예를 들어, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 또는 몇몇의 핵산은, 구성 프로모터 또는, 다르게는 규제된 발현 시스템의 조절하에 발현될 수 있다. 이러한 시스템은 당분야에 잘 공지되어 있고, 상기 논의된 시스템을 포함한다. 이종성 골지 주거 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하고 글리코실전달효소 활성, 예를 들어 GnTIII 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 상이한 핵산이 숙주 세포 시스템내에 포함된다면, 이들 중 몇몇은 구성 프로모터 조절하에 발현될 수 있는 반면, 다른 것들은 규제된 프로모터의 조절하에 발현된다. 글리코실전달효소 활성, 예를 들어, GnTIII 활성을 갖는 융합 폴리펩티드의 발현 수준은 일반적으로 당분야에 공지된 방법, 예컨대 웨스턴 블롯 분석, 노던 블롯 분석, 리포터 유전자 발현 분석 또는 글리코실전달효소 활성, 예를 들어, GnTIII 활성의 측정에 의해 결정된다. 다르게는, GnTIII의 생합성 생성물에 결합하는 렉틴, 예를 들면 E₄-PHA 렉틴이 사용될 수 있다. 다르게는, 글리코실전달효소 활성, 예를 들어, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 조작된 세포에 의해 생산된 항체에 의해 매개되는 증가된 Fc 수용체 결합 또는 증가된 효과자 기능을 측정하는 기능성 검정이 사용될 수 있다.

변형된 글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 발현하는 형질감염체 또는 형질전환체의 식별

항원 결합에 대해 PR1A3 항체와 경쟁할 수 있고 생물학적 활성 유전자 생성물을 발현하는 변형 ABM(예를 들어, 인간화되고 친화성-성숙된 ABM)의 코딩 서열을 포함하는 숙주 세포는 적어도 4가지 일반적 방안에 의해 식별될 수 있다; (a) DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화; (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재; (c) 숙주 세포에서 각각의 mRNA 전사물의 발현에 의해 측정되는 전사 수준의 평가; 및 (d) 면역검정 또는 생물학적 활성에 의해 측정된 유전자 생성물의 검출.

제1 방안에서, PR1A3 항체와 경쟁할 수 있는 변형 ABM의 코딩 서열 및/또는 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII) 활성을 갖는 폴리펩티드의 코딩 서열의 존재는 각각의 코딩 서열에 상동성인 뉴클레오티드 서열 각각, 또는 이의 일부 및 유도체를 포함하는 탐침자를 사용하여 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화에 의해 검출될 수 있다.

제2 방안에서, 재조합 발현 벡터/숙주 시스템은 특정 "마커" 유전자 기능(예를 들어, 티미딘 키나아제 활성, 항생물질에 대한 내성, 메토트렉세이트(methotrexate)에 대한 내성, 형질전환 표현형, 바큘로바이러스에서의 폐색체(occlusion body) 형성 등)의 존재 또는 부재에 기초하여 식별 및 선택될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 ABM의 코딩 서열, 또는 이의 단편, 및/또는 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII) 활성을 갖는 폴리펩티드의 코딩 서열이 벡터의 마커 유전자 서열내로 삽입된다면, 각각의 코딩 서열을 포함하는 재조합체는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 식별될 수 있다. 다르게는, 마커 유전자는 코딩 서열의 발현을 조절하기 위해 사용되는 동일하거나 상이한 프로모터의 조절하에 코딩 서열과 일렬로 위치될 수 있다. 유도 또는 선택에 반응하는 마커의 발현은 본 발명의 ABM의 코딩 서열, 및/또는 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII) 활성을 갖는 폴리펩티드의 코딩 서열의 발현을 지시한다.

제3 방안에서, 본 발명의 ABM의 코딩 영역, 또는 이의 단편, 및/또는 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII) 활성을 갖는 폴리펩티드의 코딩 서열을 위한 전사 활성은 하이브리드화 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, RNA는 본 발명의 ABM의 코딩 서열, 또는 이의 단편, 및/또는 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII) 활성을 갖는 폴리펩티드의 코딩 서열에 또는 이의 특정 부분에 상동성인 탐침자를 사용하여 노던 블롯에 의해 단리되고 분석될 수 있다. 다르게는, 숙주 세포의 총 핵산은 추출되어 이러한 탐침자로의 하이브리드화에 대해 검정될 수 있다.

제4 방안에서, 단백질 생성물의 발현은 면역학적으로, 예를 들면 웨스턴 블롯, 면역검정 예컨대 방사능면역-침전, 효소-연결된 면역검정 등에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 발현 시스템의 성공에 대한 궁극적 시험은 생물학적 활성 유전자 생성물의 검출을 포함한다.

항원 결합 분자의 항-CEA의 사용 방법 및 치료학적 용도

본 발명은 또한 생체내 또는 시험관내 세포 발현 CEA를 표적화하는 방법에 관한 것이다. CEA를 발현하는 세포는 치료 목적을 위해(예를 들어, 면역 시스템에 의한 파괴를 위해 CEA-발현 세포를 표적화함으로써 질병을 치료하기 위해) 표적화될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 ABM을 포함하는 조성물을 피험체에게 투여함을 포함하는, 피험체에서 CEA 발현 세포를 표적화하는 방법에 관한 것이다. CEA를 발현하는 세포는 진단 목적을 위해(예를 들어, 이들이 CEA를 정상적으로 또는 비정상적으로 발현하는지를 결정하기 위해) 표적화될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 생체내 또는 시험관내에서 CEA를 발현하는 세포 또는 CEA의 존재를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CEA 발현을 검출하기 위한 한 방법은, ABM과 CEA 사이에 착체를 형성하도록 허용하는 조건하에, 시험될 샘플을 임의적으로 조절 샘플과 함께 본 발명의 ABM과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이어서 착체 형성을 검출한다(예를 들어, ELISA 또는 당분야에 공지된 다른 방법에 의해). 시험 샘플과 함께 대조 샘플을 사용하는 경우, ABM-CEA 착체 형성에 있어서 임의의 통계적으로 유의한 차이는 시험 및 대조 샘플 비교시 시험 샘플의 CEA의 존재를 지시한다.

한 양태에서, 본 발명의 ABM은 생체내 또는 시험관내에서 CEA를 발현하는 표적 세포로 사용될 수 있다. CEA를 발현하는 세포는 진단학적 또는 치료학적 목적을 위해 표적화될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 ABM은 샘플중 CEA의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. CEA는 동일한 세포 유형의 비종양 조직과 비교하여 많은 인간 종양에서 비정상적으로 발현(예를 들어, 과발현)된다. 이와 같이, 본 발명의 ABM은 종양 형성의 예방, 종양의 근절, 및 종양 성장 또는 전이의 억제에 특히 유용하다. 본 발명의 ABM은 세포 주기를 억제하고, 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)의 세포사멸을 초래하며, 표적 세포의 혈관형성 및/또는 분화를 억제하는 작용을 한다. 본 발명의 ABM은 CEA를 발현하는 임의의 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 ABM으로 치료될 수 있는 특정 악성종양으로는, 제한되지 않지만, 결장직장 암, 비소세포 폐암, 위암, 췌장암 및 유방암이 포함된다.

본원에 개시된 항-CEA ABM은 종양 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸시키기 위해 단독으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 항-CEA ABM은 발암 세포의 막 또는 세포 표면 상에 존재하는 CEA에 결합하여, 예를 들어, ADCC 또는 다른 효과자 매개된 발암 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 항-CEA ABM은 인간화될 수 있고, 구체적으로, 친화성-성숙될 수 있으며, 보다 구체적으로, 글리코조작되고 친화성-성숙될 수 있다.

ABM은 다르게는 CEA 항원의 활성을, 특히 또 다른 화합물과 그의 결합을 물리적으로 간섭함으로써 차단하기 위해 단독으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 분자는 CEA 매개된 세포-접착을 차단하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 항-CEA ABM은 포유동물, 바람직하게는 인간에게 약학적으로 허용되는 투여형으로, 예컨대 인간에게 일시 정맥 주사로 또는 일정 기간에 걸쳐 연속적인 주입으로, 근육내로, 복강내로, 뇌척수내로, 피하로, 관절내로, 활액내로, 척수관내로, 경구로, 국소적으로, 또는 흡인 경로를 통해 하기 논의된 형태로 투여된다. ABM은 또한 종양내, 종양주변, 병변내 또는 병변주변 경로에 의해 국소적 또는 전신적 치료 효과를 부여하도록 적절히 투여된다. 복강내 경로가, 예를 들면 결장직장 종양의 치료에 특히 유용한 것으로 예상된다.

질환의 치료를 위해, ABM의 적절한 투여량은 치료된 질환의 유형, 질환의 위중성 및 경로, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 소견에 좌우될 것이다. ABM은 한번에 또는 일련의 치료로 환자에게 적절히 투여된다.

본 발명은 CEA를 발현하는 종양 세포를 선택적으로 사멸시키기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본 발명의 항원 결합 분자 또는 공액체(예를 들어, 면역독소)를 상기 종양 세포와 반응시킴을 포함한다. 이들 종양 세포는 결장직장 암종, 비소세포 폐 암종(NSCLC), 위 암종, 췌장 암종 및 유방 암종을 비롯한 인간 암종으로부터일 수 있다.

한 실시태양에서, 본 발명은 종양 세포의 CEA-매개된 세포 접착을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본 발명의 항원 결합 분자 또는 공액체를 상기 종양 세포와 접촉시킴을 포함한다. 이들 종양 세포는 결장직장암 세포, 비소세포 폐암 세포(NSCLC), 위암 세포, 췌장암 세포 및 유방암 세포를 비롯한 인간 세포로부터일 수 있다.

추가적으로, 본 발명은 생체내 암종(예를 들면, 인간 암종)을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 적어도 1종의 본 발명의 항원 결합 분자 또는 면역공액체(예를 들어, 면역독소)를 포함하는 약학적으로 허용되는 양의 조성물을 피험체에게 투여함을 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 치료 효과량의 인간화되고 친화성-성숙된 항원 결합 분자 또는 변형 항원 결합 분자를 투여함으로써, 제한되지 않지만 결장직장암 세포, NSCLC(비소세포 폐암), 위암 세포, 췌장암 세포 및 유방암 세포를 비롯한 CEA 과발현을 특징으로 하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 본원에 개시된 인간화되고 친화성-성숙된 항원 결합 분자 또는 변형 항원 결합 분자를 사용하여 피험체에서 종양 조직의 감소를 유도하는 방법에 관한 것이다. 종양 조직의 비제한적인 예로는 결장직장 종양, 비소세포 폐 종양, 췌장 종양 및 유방 종양이 포함된다. 특별한 실시태양에서, 종양 조직은 결장직장 종양이다.

본 발명의 실행에 따라서, 피험체는 인간, 말, 돼지, 소, 뮤린, 개, 고양이 및 조류일 수 있다. 다른 항온 동물 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명은 추가로 종양 세포의 성장을 억제하고, 피험체에서 종양을 치료하고, 피험체에서 증식 유형 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 본 발명의 효과량의 조성물을 피험체에게 투여함을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 비정상적 CEA 발현과 연관된 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 개시된 인간화되고 친화성-성숙된 항원 결합 분자 또는 변형 항원 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 특별한 실시태양에서, 질병은, 제한되지 않지만 결장직장 종양, 비소세포 폐 종양, 췌장 종양 및 유방 종양을 비롯한 CEA를 과발현하는 암이다. 특별한 실시태양에서, 종양은 결장직장 종양이다.

조성물, 제제, 투여량 및 투여 경로

한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 ABM 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 질병, 예컨대 암의 치료 방법에 있어서, 또는 질병, 예컨대 암의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 이러한 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 본 발명의 치료 효과량의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 질환의 치료, 보다 구체적으로, 암의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 인간 암종, 예를 들면 결장직장 암종을 치료하기 위한 약학 조성물, 배합물 및 방법을 내포한다. 예를 들면, 본 발명은 본 발명의 약학적으로 효과적인 양의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 인간 암종의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물을 포함한다.

본 발명의 ABM 조성물은, 제한되지 않지만, 정맥내, 복강내, 경구, 림프내 또는 종양으로의 직접적인 투여를 비롯한 종래의 투여 방식을 사용하여 투여될 수 있다. 정맥내 투여가 바람직하다.

본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 ABM을 포함하는 치료 제제는 원하는 순도의 항체를 임의적인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와, 동결건조된 제제 또는 수성 용액의 형태로 혼합함으로써 저장을 위해 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이다.

생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통해 쉽게 달성된다.

본 발명의 약학 조성물을 위해 가장 효과적인 투여 방식 및 투여 요법은 질병의 위중성 및 경과, 환자의 건강 및 치료에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 따라 좌우된다. 따라서, 조성물의 투여량은 개별 환자에게 적정되어야 한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 조성물의 효과적인 투약량은 일반적으로 약 0.01 내지 약 2000 ㎎/㎏의 범위이다.

본원에 기재된 분자는, 제한되지 않지만, 액체 용액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 좌제, 중합체성 마이크로캡슐 또는 마이크로소낭(microvesicle), 리포솜, 및 주사가능하거나 주입가능한 용액을 비롯한 다양한 투여형으로 존재할 수 있다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료 분야에 따라 좌우된다.

본 발명의 ABM을 포함하는 조성물은 양호한 의학적 실행과 일치하는 양식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려되는 인자로는 치료되는 특정 질환 및 질병, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 증상, 질환 또는 질병의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 전문의에게 공지된 다른 인자가 포함된다. 투여되는 길항물질의 치료 효과량은 이러한 고려사항에 의해 조정될 것이다.

이후 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명할 것이다. 당분야의 숙련가가 본 발명을 더욱 명확히 이해하고 실행할 수 있도록 하기 제조예 및 실시예가 제공된다. 그러나, 본 발명은, 단지 본 발명의 단일 양태를 나타내고자 의도된 예시된 실시양태에 의해 범주가 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범주내에 속한다. 사실, 본원에 기재된 사항에 더하여 본 발명의 다양한 변경이 상기 설명 및 수반된 도면으로부터 명백할 것이다. 이러한 변경은 첨부된 특허청구범위의 범주내에 속한다.

실시예

별도의 지시가 없는 한, 하기 실시예에서 특정 아미노산 잔기 위치에 대한 넘버링은 카밧 넘버링 시스템을 따른다.

실시예 1

친화성-성숙 라이브러리의 생성

H1/H2 라이브러리

HCDR1 및 HCDR2 영역에서 랜덤화된 친화성-성숙 라이브러리의 생성을 위해, CDR1에서의 위치 F32 G33 및 CDR2 에서의 위치 W50 N52 T52a K52b T54 E56 T58을 코딩하는 트리플렛(triplet)을 랜덤화하였다. 제1 단계에서, 주형으로서의 pMS22, 및 프라이머 MS-43 및 EAB-679(이는 랜덤화된 CDR1 위치를 포함함)를 사용하여 DNA 단편(단편 1)을 증폭시켰다(도 11 및 표 6). 동일한 주형을 사용하여, 프라이머 MS-56 및 MS-52는 단편 1의 3' 말단과 중첩 영역을 갖는 제2 단편(단편 2)을 증폭시켰다. 증폭 조건은 초기 5분간 94℃에서의 항온처리 단계 이후 25 주기를 포함하고, 각각은 단편 1 및 단편 2 각각에 대하여 1-분간 94℃에서의 변성, 1-분간 55℃에서의 어닐링(annealing), 및 20-초 및 50-초간 72℃에서의 신장 단계로 구성되었다. 최종적인 10-분간 72℃에서의 항온처리 단계를 마지막에 수행하였다. 두 단편 모두 아가로스 겔 상에서 정제하였다. CDR2의 랜덤화된 위치를 포함하는 프라이머 MS-43 및 EAB-680를 사용하는 단편 1 및 2에 의한 중첩 연장 PCR은 랜덤화된 CDR 둘 다를 갖는 단편(단편 3)을 생성하였다. 단편 1 및 2의 조립을 위해, 동몰량의 단편 1 및 단편 2를 사용하였다. 증폭 조건은 초기 5-분간 94℃에서의 항온처리 단계, 이후 프라이머가 없는 5 주기를 포함하고, 각각의 주기는 1-분간 94℃에서의 변성, 1-분간 55℃에서의 어닐링, 및 40-초간 72℃에서의 신장 단계로 구성되었다. 외부 프라이머의 첨가 후, 20회의 추가의 주기를 동일한 매개변수로 수행하였다. 단편 3의 3' 영역과 중첩된 제4 단편(단편 4)을, 다시 주형으로서의 pMS22, 및 프라이머 MS-55 및 MS-52를 사용하여 PCR-증폭시켰다. 겔 정제후, 주형으로서의 단편 3 및 4, 및 프라이머 MS-43 및 MS-52를 사용하는 최종 중첩 연장 PCR은 CL 및 VH의 부분을 포함하는 단편을 생성하였다. 이를 위해 동몰량의 단편 3 및 단편 4를 사용하였다. 증폭 조건은 초기 5-분간 94℃에서의 항온처리 단계, 이후 프라이머가 없는 5 주기를 포함하고, 각각의 주기는 1-분간 94℃에서의 변성, 1-분간 55℃에서의 어닐링, 및 80-초간 72℃에서의 신장 단계로 구성되었다. 외부 프라이머를 첨가한 후, 20회의 추가의 주기를 동일한 매개변수로 수행하였다. 이어서 생성된 단편을 겔-정제하고, NcoI/NheI 분해후 pMS22와 결찰시켰다.

L1/L2 라이브러리

LCDR1 및 LCDR2 영역에서 랜덤화된 친화성-성숙 라이브러리의 생성을 위해, CDR1에서의 위치 Q27, N28, V29, G30 T31 N32 및 CDR2에서의 위치 Y49 S50 Y53 R54 Y55 S56을 코딩하는 트리플렛을 랜덤화하였다. 제1 단계에서, 주형으로서의 pMS22, 및 프라이머 EAB-685 및 EAB-681(이는 랜덤화된 CDR1 위치를 포함함)을 사용하여 DNA 단편(단편 1)을 증폭시켰다(도 12 및 표 6). 동일한 주형을 사용하여, 프라이머 EAB-686 및 EAB-687은 단편 1의 3' 말단과 중첩 영역을 갖는 제2 단편(단편 2)을 증폭시켰다. 증폭 조건은 초기 5분간 94℃에서 항온처리 이후 25 주기를 포함하고, 각각은 단편 1 및 단편 2 각각에 대하여 1-분간 94℃에서의 변성, 1-분간 55℃에서의 어닐링, 및 60-초간 72℃에서의 신장 단계로 구성되었다. 최종적인 10-분간 72℃에서의 항온처리 단계를 마지막에 수행하였다. 두 단편 모두 아가로스 겔 상에서 정제하였다. CDR2의 랜덤화된 위치를 포함하는, 프라이머 EAB-685 및 EAB-682를 사용하는 단편 1 및 2에 의한 중첩 연장 PCR은 랜덤화된 CDR 둘 다를 갖는 단편(단편 3)을 생성하였다. 단편 1 및 2의 조립을 위해, 동몰량의 단편 1 및 단편 2를 사용하였다. 증폭 조건은 초기 5-분간 94℃에서의 항온처리 단계, 이후 프라이머가 없는 5 주기를 포함하고, 각각의 주기는 1-분간 94℃에서의 변성, 1-분간 55℃에서의 어닐링, 및 60-초간 72℃에서의 신장 단계로 구성되었다. 외부 프라이머의 첨가 후, 20회의 추가의 주기를 동일한 매개변수로 수행하였다. 단편 3의 3' 영역과 중첩된 제4 단편(단편 4)을, 다시 주형으로서의 pMS22, 및 프라이머 EAB-688 및 EAB-687을 사용하여 PCR-증폭시켰다. 겔 정제후, 주형으로서의 단편 3 및 4, 및 프라이머 EAB-685 및 EAB-687을 사용하는 최종 중첩 연장 PCR은 VL 및 CL의 부분을 포함하는 단편을 생성하였다. 이를 위해, 동몰량의 단편 3 및 단편 4를 사용하였다. 증폭 조건은 초기 5-분간 94℃에서의 항온처리 단계, 이후 프라이머가 없는 5 주기를 포함하고, 각각의 주기는 1-분간 94℃에서의 변성, 1-분간 55℃에서의 어닐링, 및 80-초간 72℃에서의 신장 단계로 구성되었다. 외부 프라이머를 첨가한 후, 20회의 추가의 주기를 동일한 매개변수로 수행하였다. 이어서 이러한 단편을 HindIII/SacI 분해후 pMS22와 결찰시켰다.

H3 라이브러리

HCDR3 영역에서 랜덤화된 친화성-성숙 라이브러리의 생성을 위해, 위치 W95, D96, F97, Y98, D99, Y1OO, V1OOa, E1OOb, A1OOc, 및 M1OOd를 코딩하는 트리플렛을 2가지 상이한 방안으로 랜덤화하였다: (1) 전체 분절(H3 전체 라이브러리)의 랜덤화 또는 (2) 10개의 하위라이브러리를 생성하는 각각의 위치에서의 개별적 랜덤화. 개별적으로 랜덤화된 위치를 갖는 클론을 포함하는 하위라이브러리를 박테리아내로 형질전환시킨 후 푸울링하였다(pooled)(H3 푸울링된 라이브러리). HCDR3 영역을 랜덤화하기 위해, HCDR3의 랜덤화된 서열을 갖는 프라이머 및 CL의 3' 말단에서 어닐링된 프라이머를 사용하여 단편을 PCR-증폭시켰다(도 13). 이어서 단편 1의 3' 말단과 중첩되고 CH1의 5' 영역 및 VH의 말단을 포함하는 제2 단편으로 중첩 연장 PCR을 수행하였다. 이어서 조립된 단편을 SacI/NheI 분해 후 pMS22로 결찰시켰다. H3 푸울링된 라이브러리의 생성을 위해, 프라이머 EAB-749와 함께 프라이머 AC7-AC16 각각을 사용하여 10개의 DNA 단편을 별도로 PCR-증폭시켰다. L3 전체 라이브러리의 생성을 위해, 프라이머 AC17 및 EAB-749를 사용하였다. 플라스미드 pMS22를 주형으로 사용하였다. 증폭 조건은 초기 5-분간 94℃에서의 항온처리 단계, 이후 25회 주기를 포함하고, 각각은 1-분간 94℃에서의 변성, 1-분간 55℃에서의 어닐링, 및 36-초간 72℃에서의 신장 단계로 구성되고, 이후 최종적인 10-분간 72℃에서의 항온처리 단계가 수반되었다. 이로써 약 580 bp의 긴 단편이 생성되었고, 이를 아가로스 겔 상에서 정제하였다. 중첩 연장 PCR을 위해, EAB-752과 함께 프라이머 EAB-750 또는 EAB-751을 사용하여 제2 단편을 증폭시켰다. 프라이머 EAB-750이 랜덤화 프라이머 AC7-11과의 중첩 서열을 갖는 반면, EAB-751은 랜덤화 프라이머 AC12-17과 서열 상동성을 공유하였다. 증폭 조건은 초기 5-분간 94℃ 항온처리 단계 이후 25회 주기를 포함하고, 각각은 1-분간 94℃에서의 변성, 1-분간 55℃에서의 어닐링, 및 12-초간 72℃에서의 신장 단계로 구성되고, 이후 최종적인 10-분간 72℃에서의 항온처리 단계가 수반되었다. 생성 단편은 약 180bp의 길이였다. 두 단편 모두의 조립을 위해, 동몰량의 단편 1 및 상응하는 단편 2를 사용하였다. 증폭 조건은 초기 5-분간 94℃에서의 항온처리 단계 이후 프라이머가 없는 5회 주기를 포함하고, 각각의 주기는 1-분간 94℃에서의 변성, 1-분간 55℃에서의 어닐링, 및 60-초간 72℃에서의 신장 단계로 구성되었다. 외부 프라이머 EAB-749 및 EAB-752의 첨가 이후, 20회의 추가의 주기를 동일한 매개변수로 수행하였다. 마지막에, 최종적인 10-분간 72℃에서의 항온처리 단계를 수행하였다. 이어서 겔-정제된 단편을 SacI/NheI-분해 이후 pMS22내로 결찰시키고, 정제된 결찰물을 전기천공법에 의해 TG1 박테리아내로 형질전환시켰다.

L3 라이브러리

경쇄의 CDR3 영역에서 랜덤화된 친화성-성숙 라이브러리의 생성을 위해, 위치 Y91, Y92, T93, Y94, 및 L95a를 코딩하는 트리플렛을 분절(L3 전체 라이브러리)을 통해 랜덤화하거나, 또는 개별적으로 랜덤화하여 5개의 하위라이브러리를 생성하였다. 개별적으로 랜덤화된 위치를 갖는 클론을 포함하는 하위라이브러리를 박테리아로의 형질전환 후 푸울링하였다(L3 푸울링된 라이브러리). 5개의 하위라이브러리의 생성을 위해, 프라이머 MS43과 함께 프라이머 AC1-AC5 각각을 사용하여 5개의 DNA 단편을 PCR-증폭시켰다. L3 전체 라이브러리의 생성을 위해, AC6 및 MS43의 프라이머 조합을 사용하였다(도 14). 플라스미드 pMS22를 주형으로 사용하였다. 증폭 조건은 초기 5-분간 94℃에서의 항온처리 단계 이후 25회의 주기를 포함하고, 각각은 1-분간 94℃에서의 변성, 1-분간 55℃에서의 어닐링, 및 25-초간 72℃에서의 신장 단계로 구성되고, 이후 최종적인 10-분간 72℃에서의 항온처리 단계가 수반된다. VL 도메인의 위치 1-104를 내포하는 생성된 단편을 아가로스 겔 상에서 정제하고, 추가의 PCR 증폭을 위해 주형으로 사용하였다. 랜덤화 프라이머 및 MS43과 중첩 서열을 갖는 프라이머 EAB-746에 의해 상기 기재된 동일한 조건을 사용하여 모든 반응을 수행하였다. 정제된 단편 뿐만 아니라 pMS22를 NcoI/XhoI로 분해하였다. 모든 5개의 하위라이브러리의 경우, 0.5 ㎍의 삽입부를 0.5 ㎍의 pAC16과 결찰시켰다. L3 전체 라이브러리의 경우, 결찰을 9.8 ㎍의 삽입물 및 9.8 ㎍의 pMS22로 수행하였다. 정제된 결찰물을 전기천공에 의해 TG1 박테리아내로 형질전환시켰다.

항원의 생성

뮤린 및 인간화된 PR1A3 항체는 둘 다 가용성 인간 CEA에 결합하지만 이탈되지 않는 막만을 인식하므로, PR1A3의 에피토프를 포함하는 재조합 키메라성 단백질을 인간화된 PR1A3의 시험관내 친화성-성숙에 대해 생성하였다(서열 번호 7 및 8). 이러한 하이브리드 단백질의 생성을 문헌[Steward et al., 1999]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히, 인간 담즙 당단백질(BGP: biliary glycoprotein)의 B 도메인의 DNA 서열을 PR1A3의 에피토프를 포함하는 인간 CEA-B3 도메인의 서열로 대체하였다. 결과로서, 서열은 BGP의 N 및 A1 도메인, CEA의 B3 도메인 및 BGP의 A2 도메인을 포함하는 하이브리드 단백질(N-A1-B3-A2, huNABA)을 코딩한다. 이어서 이러한 융합 생성물을 인간 IgG1(huNABA-Fc)의 Fc 부분에 연결시키거나(Steward et al., Cancer Immunol Immunother, 47:299-306, 1999) 정확한 프로테아제 분할 부위, avi 태그 및 (His)6 태그를 코딩하는 서열(huNABA-avi-his)(서열 번호 158)에 융합시켰다. huNABA-Fc를 단백질 A 칼럼을 사용하여 안전하게 형질감염된 CHO 세포주의 상청액으로부터 정제하였다. huNABA-avi-his를 일시적으로 HEK 293 세포로 형질감염시키고, EBV-유도된 단백질 EBNA를 안정하게 발현시켰다. 비오틴 리가아제(ligase)를 코딩하는 동시적으로 공동-형질감염된 플라스미드는 생체내 avi 태그-특이적 비오틴화를 허용하였다. 이어서 단백질을 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)로 정제하고, 이후 겔 여과하였다.

서열 번호 158(huNABA-avi-his) pETR6592

인간화된 PR1A3의 친화성-성숙

친화성-성숙된 인간화 PR1A3 Fab의 생성을 표준 프로토콜을 사용하여 파지 디스플레이에 의해 수행하였다(Silacci et al, Proteomics, 5(9):2340-2350, 2005). 모든 친화성-성숙 라이브러리에 의한 선택을 하기 절차에 따라 용액에서 수행하였다: 1. 1 ㎖의 총 부피에서 0.5 시간 동안 10OnM의 비오틴화된 huNABA-avi-his로의 친화성-성숙 라이브러리 각각의 ∼1012 파지미드 입자의 결합, 2. 10분 동안 5.4 x 10⁷ 스트렙타비딘-코팅된 자기 비이드의 첨가에 의한, 특이적으로 결합된 파지 입자 및 비오틴화 huNABA-avi-his의 포획, 3. 5-10x 1 ㎖의 PBS/트윈20 및 5-10x 1 ㎖의 PBS를 사용하는 비이드의 세척, 4. 10분 동안 1 ㎖의 10OmM TEA(트리에틸아민)의 첨가에 의한 파지 입자의 용출 및 500ul의 1M 트리스/HCl(pH 7.4)의 첨가에 의한 중화, 5. 기하급수적으로 증가하는 이. 콜라이(E. coli) TG1 박테리아의 재감염, 헬퍼 파지 VCSM13에 의한 감염, 및 후속적인 선택 라운드(round)에 사용되는 파지미드(phagemid) 입자의 후속적인 PEG/NaCl 침전. 일정한 또는 감소하는(10^-7M에서 2x10^-9M으로) 항원 농도를 사용하여 3 내지 5 라운드에 걸쳐 선택을 수행하였다. 라운드 2에서, 스트렙타비딘 비이드 대신 뉴트라비딘(neutravidin) 플레이트를 사용하여 항원:파지 착체의 포획을 수행하였다. 특이적 결합제를 다음과 같이 ELISA로 확인하였다: 웰당 100 ul의 1OnM 비오틴화 huNABA-avi-his를 뉴트라비딘 플레이트 상에 코팅하였다. Fab-포함 박테리아 상청액을 첨가하고, 항-Flag/HRP 2차 항체를 사용하여 Fab 결합을 이들의 Flag-태그를 통해 검출하였다. ELISA-양성 클론을 96-웰 포맷에서 가용성 Fab 단편으로서 박테리아적으로 발현시키고, 비아코어(BIACORE) T100을 사용하여 SPR-분석에 의해 상청액을 동력학적으로 선별 시험하였다. 가장 높은 친화도 상수를 갖는 Fab를 발현하는 클론을 식별하고 상응하는 파지미드(phagemid)를 서열화하였다.

Fab의 정제 및 동력학적 매개변수의 측정

동력학적 매개변수의 정확한 분석을 위해, Fab를 박테리아 배양액으로부터 정제하였다. 500 ㎖의 배양액을 접종하고 1mM IPTG로 OD600 0.9에서 유도하였다. 박테리아를 25℃에서 하룻밤 항온처리하고 원심분리하여 수거하였다. 재현탁된 펠릿을 20분 동안 25 ㎖의 PPB 완충액(30 mM 트리스-HCl(pH 8), 1mM EDTA, 20% 수크로스)에서 항온처리한 후, 박테리아를 다시 원심분리하고 상청액을 수거하였다. 이러한 항온처리 단계를 25 ㎖의 5 mM MgSO₄ 용액에 의해 1회 반복하였다. 두 항온처리 단계의 상청액을 모으고, 여과하고, IMAC 칼럼(히스 그래비트랩(His gravitrap), GE 헬쓰케어) 상에 적재하였다. 후속적으로, 칼럼을 40 부피로 세척하였다. 용출 후(500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, 20 mM NaH₂PO₄ pH 7.4), PDlO 칼럼(GE 헬쓰케어)을 사용하여 용출액을 재완충시켰다. 이어서 정제된 Fab의 동력학적 매개변수를 200 nM에서 6.25 nM까지 범위의 일련의 희석률로 SPR-분석에 의해 연구하였다.

실시예 2

PR1A3 항체를 인간 IgG1/카파 불변 영역을 갖도록 키메라화하고, Fc중 푸코실화되지 않은 당의 높은 비율을 갖도록 글리코맵(GylcoMab) 기술을 사용하여 발현시켰다. 글리코조작된 항체 및 글리코조작되지 않은 항체를 25:1의 표적에 대한 효과자 비율에서 비교하였다. 항체 의존성 표적 세포 사멸의 최대량은 Fc 영역의 글리코조작에 의해 2배가 되었다(도 2). 표적에 대한 효과자 비율을 증가시킴으로써 세포 사멸의 추가의 증가를 달성하였다(도 2).

PR1A3을 인간 생식계열 서열과 동일한 골격구조를 사용하여 인간화시켰다. IMGT 서열 IGHV7-4-1*02(수납 번호 X62110)는 인간화된 VH에 대한 수용체이고 IMGT_hVK_1_39(수납 번호 X59315)는 VL 인간화를 위한 수용체이다. 중쇄 가변 영역 작성물 CH7A 및 경쇄 가변 영역 작성물 CLlA를 포함하는 인간화된 PR1A3 항체는 유세포분석법으로 측정될 경우 인간 결장 암종 세포로의 만족스러운 결합을 나타내었다(도 3).

파지 디스플레이에 의한 PR1A3의 친화성-성숙을 본원 실시예 1에서 상세히 설명된 바와 같은 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 친화성-성숙을 위해 사용되는 모 인간화된 PR1A3 항체는 중쇄 가변 영역 작성물 CH7A 및 경쇄 가변 영역 작성물 CL1A을 포함한다. 이후 표 3 내지 6은 친화성-성숙을 위해 사용되는 라이브러리를 보여준다. L1/L2 라이브러리를 위해, CRD내의 위치 발린 29, 알라닌 50, 또는 세린 51을 일정하게 유지시켰다. H1/H2 라이브러리를 위해, CDR내의 위치 이소로이신 51 , 글리신 55, 또는 알라닌 57을 일정하게 유지시켰다(도 4 및 5).

친화성-성숙된 중쇄 가변 영역 작성물, CH7A rF9, 및 친화성-성숙된 경쇄 가변 영역 작성물, CL1A rH11은, 각각 모 경쇄 가변 영역 작성물 및 중쇄 가변 영역 작성물과 서로 쌍을 이루었다. 모든 항체를 인간 IgG1/카파로 전환시키고CEA-양성 세포주 MKN45로의 결합을 유세포분석법에 의해 측정하였다. 하나의 친화성-성숙된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 또는 친화성-성숙된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 둘 다를 포함하는 항체는 인간화된 모 항체에 비해 증진된 결합 특징을 나타내었다(도 6). 도 6, 10 및 15는 성숙된 경쇄 및 중쇄가 증가된 친화도에 독립적으로 기여하는 몇몇의 예를 도시한다. 도 6 및 15에서 모 항체 CH7A CL1A는 가장 낮은 신호 강도, 뿐만 아니라 가장 높은 EC50 값을 갖는다. 성숙된 경쇄는 EC50 값을 더 낮은 수로 전이시키는 반면, 성숙된 중쇄(도 6에서 rF9, 및 도 15에서 rB9)는 유세포분석 측정시 총 형광 신호 강도를 전이시킨다. 도 10은 비아코어 방법에 의해 측정된 중쇄 및 경쇄의 개별적 기여도를 보여준다. 이들 2개 쇄의 조합은 더욱 더 친화도를 증가시킨다.

친화성-성숙된 중쇄 및 경쇄 CDR의 결합 친화도를 비아코어에 의해 측정하였고 하기 표 10에 열거하였다.

하기 표 11은, 다양한 친화성-성숙된 항체 서열의 친화도 상수를 요약한다. 모 항체 PR1A3, 뿐만 아니라 성숙되고 미성숙된 서열의 몇몇의 경쇄 및 중쇄 조합이 열거되어 있다. 고정화된 NABA-avi-his 시약(서열 번호 158)을 항원으로서 갖는 비아코어 칩 상에서 Fab 형식의 다양한 가용성 항체 작성물의 회합(k_온) 및 해리(k_오프) 속도 상수를 측정함으로써 모든 값을 비아코어 기술에 의해 수득하였다. 친화도 상수는 KD로 표지된다.

SEQUENCE LISTING <110> Roche Glycart AG <120> AFFINITY-MATURED HUMANIZED ANTI CEA MONOCLONAL ANTIBODIES <130> 26372 <140> PCT/EP2010/062527 <141> 2010-08-27 <150> US 61/238,505 <151> 2009-08-31 <160> 216 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Kabat <400> 1 Glu Phe Gly Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Kabat <400> 2 Glu Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Kabat <400> 3 Glu Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable Region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa = Tyr or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa = Asn or ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa = Trp or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa = Thr, Ser, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa = Thr or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa = Val or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> Xaa = Phe or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102)..(102) <223> Xaa = Val, Phe, Ser, Tyr, or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (103)..(103) <223> Xaa = Asp, His, Trp, Glu or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> Xaa = Val, Phe, or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> Xaa = Glu, Lys or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa = Ala or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(108) <223> Xaa = Met or Leu <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Xaa 20 25 30 Xaa Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Xaa Ile Asn Thr Lys Xaa Gly Glu Ala Xaa Tyr Xaa Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Kabat <400> 5 Glu Phe Gly Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Chothia <400> 6 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Chothia <400> 7 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 AbM <400> 8 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe Gly Met Asn 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 AbM <400> 9 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gly Met Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 AbM <400> 10 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ser Met Asn 1 5 10 <210> 11 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain Variable Region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa = Gln, Ala, Lys, or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa = Asn, Ala, Tyr, Ile, Lys, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa = Val, Ala, Gly, or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa = Gly, Ser, Thr, or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa = Thr, Asn, Pro, or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa = Asn or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa = Pro or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa = Ser, Leu, or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa = Tyr, Asn, or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa = Arg, Leu, Pro, or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa = Tyr, Ser, Gln, Lys, Phe, Pro, or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa = Ser, Gly, Ile, or Arg <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 AbM <400> 12 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe Gly Met Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Kabat <400> 13 Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Kabat <400> 14 Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Ile Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Kabat <400> 15 Trp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Kabat <400> 16 Tyr Ile Asn Thr Lys Asn Gly Glu Ala Asn Tyr Val Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Kabat <400> 17 Trp Ile Asn Thr Lys Asn Gly Glu Ala Thr Tyr Ile Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Chothia <400> 18 Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Chothia <400> 19 Asn Thr Lys Ser Gly Glu Ala Thr 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Chothia <400> 20 Asn Thr Lys Asn Gly Glu Ala Asn 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 AbM <400> 21 Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 AbM <400> 22 Trp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Glu Ala Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 AbM <400> 23 Tyr Ile Asn Thr Lys Asn Gly Glu Ala Asn 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 AbM <400> 24 Trp Ile Asn Thr Lys Asn Gly Glu Ala Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 25 Trp Asp Phe Tyr Asp Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 26 Trp Asp Phe Tyr His Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 27 Trp Asp Phe Val Asp Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 28 Trp Asp Phe Tyr Trp Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 29 Trp Asp Ala Phe Glu Tyr Val Lys Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 30 Trp Asp Phe Phe Glu Tyr Phe Lys Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 31 Trp Asp Phe Phe Tyr Tyr Val Gln Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 32 Trp Asp Phe Ser Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 33 Trp Asp Phe Ala His Tyr Phe Gln Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 34 Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Phe Gln Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 35 Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Leu Glu Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 36 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 37 Lys Ala Ser Ala Asn Val Gly Asn Asn Val Ala 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 38 Lys Ala Ser Lys Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 39 Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala 1 5 10 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 40 Lys Ala Ser Gln Tyr Ala Ser Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 41 Lys Ala Ser His Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 42 Lys Ala Ser Gln Ile Met Gly Pro Asn Val Ala 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 43 Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 44 Lys Ala Ser Gln Lys Val Leu Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 45 Lys Ala Ser Gln Thr Val Ser Ala Asn Val Ala 1 5 10 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 46 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 47 Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ser Gly 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 48 Tyr Leu Ala Ser Tyr Pro Gln Ile 1 5 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 49 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 50 Tyr Trp Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 51 Tyr Ser Ala Ser His Arg Tyr Ser 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 52 Tyr Leu Ala Ser Tyr His Glu Ser 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 53 Tyr Ser Ala Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 54 Tyr Leu Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 55 Tyr Leu Ala Ser Tyr Arg Tyr Arg 1 5 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR3 <400> 56 His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr 1 5 10 <210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 <400> 57 ggatacacct tcactgagtt tggaatgaac 30 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 <400> 58 ggatacacct tcactgagta tggtatgaac 30 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 <400> 59 ggatacacct tcactgagta ttctatgaac 30 <210> 60 <211> 0 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BLANK <400> 60 000 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 <400> 61 ggatacacct tcactgagtt tggaatgagc 30 <210> 62 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 <400> 62 tggataaaca ccaaaactgg agaggcaaca tatgttgaag agtttaaggg a 51 <210> 63 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 <400> 63 tggataaaca ccaaaactgg agaggcaaca tatattgaag agtttaaggg a 51 <210> 64 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 <400> 64 tggataaaca ccaaaagtgg agaggcaaca tatgttgaag agtttaaggg a 51 <210> 65 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 <400> 65 tatataaaca ccaaaaatgg agaggcaaac tatgttgaag agtttaaggg a 51 <210> 66 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 <400> 66 tggataaaca ccaaaaatgg agaggcaaca tatattgaag agtttaaggg a 51 <210> 67 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 67 tgggacttct atgattacgt ggaggctatg gactac 36 <210> 68 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 68 tgggacttct atcattacgt ggaggctatg gactac 36 <210> 69 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 69 tgggacttcg tggattacgt ggaggctatg gactac 36 <210> 70 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 70 tgggacttct attggtacgt ggaggctatg gactac 36 <210> 71 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 71 tgggacgcct ttgagtacgt gaaggcgctg gactac 36 <210> 72 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 72 tgggatttct ttgagtattt taagactatg gactac 36 <210> 73 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 73 tgggactttt tttattacgt gcagactatg gactac 36 <210> 74 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 74 tgggattttt cttattacgt tgaggcgatg gactac 36 <210> 75 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 75 tgggactttg ctcattactt tcagactatg gactac 36 <210> 76 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 76 tgggacttcg cttattactt tcagactatg gactac 36 <210> 77 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 <400> 77 tgggatttcg cgtattacct tgaggctatg gactac 36 <210> 78 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 78 aaggccagtc agaatgtggg tactaatgtt gcc 33 <210> 79 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 79 aaggccagtg ccaatgtggg taataatgtt gcc 33 <210> 80 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 80 aaggccagta agaatgtggg gactaatgtt gcg 33 <210> 81 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 81 aaggccagtg cggctgtggg tacgtatgtt gcg 33 <210> 82 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 82 aaggccagtc agatagcgag tactaatgtt gcc 33 <210> 83 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 83 aaggccagtc acaatgtggg taccaacgtt gcg 33 <210> 84 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 84 aaggccagtc agattatggg tcctaatgtt gcg 33 <210> 85 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 85 aaggccagtc aaattgtggg tactaatgtt gcg 33 <210> 86 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 86 aaggccagtc agaaggtgct tactaatgtt gcg 33 <210> 87 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR1 <400> 87 aaggccagtc agactgtgag tgctaatgtt gcg 33 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 88 tattcggcat cctaccgcta cagt 24 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 89 tatttggcct ccaacctctc cggt 24 <210> 90 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 90 tacctggcat cctaccccca gatt 24 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 91 tattcggcat cctaccgcaa aagg 24 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 92 tattgggcat cctaccgcta tagt 24 <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 93 tattcggcat cccaccggta cagt 24 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 <400> 94 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Primer EAB-679 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> w is a or t <400> 127 caggggcctg tcgcacccag ttcatmnnaw actcagtgaa ggtgtatcca gaagcc 56 <210> 128 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EAB-680 <400> 128 ccgtccctta aactcttcaa cataggttgc ctctccagtt ttggtgttta tccatcccat 60 ccactcaagc ccttgtccag g 81 <210> 129 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EAB-685 <400> 129 cagctatgac catgattacg ccaagcttgc atgcaaattc tatttcaagg 50 <210> 130 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EAB-686 <400> 130 gttgcgtggt atcagcagaa accaggg 27 <210> 131 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EAB-687 <400> 131 gctctttgtg acgggcgagc tcaggccctg atgg 34 <210> 132 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer EAB-688 <400> 132 ggagtcccat caaggttcag tggcagtgga tctgg 35 <210> 133 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EAB-681 <400> 133 cctggtttct gctgatacca cgcaacatta gtacccacat tctgactggc cttgcaagtg 60 atggtgactc 70 <210> 134 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EAB-682 <400> 134 ctgccactga accttgatgg gactccactg tagcggtagg atgccgaata gatcaggagc 60 ttaggtgctt tccctgg 77 <210> 135 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC7 <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> n is a, c, g, or t <400> 135 ccagtagtcc atagcctcca cgtaatcata gaagtcmnnt ctcgcacagt aatacacggc 60 agtg 64 <210> 136 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC8 <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <400> 136 ccagtagtcc atagcctcca cgtaatcata gaamnnccat ctcgcacagt aatacacggc 60 agtg 64 <210> 137 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC9 <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n is a, c, g, or t <400> 137 ccagtagtcc atagcctcca cgtaatcata mnngtcccat ctcgcacagt aatacacggc 60 agtg 64 <210> 138 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC10 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <400> 138 ccagtagtcc atagcctcca cgtaatcmnn gaagtcccat ctcgcacagt aatacacggc 60 agtg 64 <210> 139 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC11 <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 139 ccagtagtcc atagcctcca cgtamnnata gaagtcccat ctcgcacagt aatacacggc 60 agtg 64 <210> 140 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC12 <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> n is a, c, g, or t <400> 140 cgtggtccct tggccccagt agtccatagc ctccacmnna tcatagaagt cccatctcgc 60 acag 64 <210> 141 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC13 <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <400> 141 cgtggtccct tggccccagt agtccatagc ctcmnngtaa tcatagaagt cccatctcgc 60 acag 64 <210> 142 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC14 <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n is a, c, g, or t <400> 142 cgtggtccct tggccccagt agtccatagc mnncacgtaa tcatagaagt cccatctcgc 60 acag 64 <210> 143 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC15 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <400> 143 cgtggtccct tggccccagt agtccatmnn ctccacgtaa tcatagaagt cccatctcgc 60 acag 64 <210> 144 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC16 <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 144 cgtggtccct tggccccagt agtcmnnagc ctccacgtaa tcatagaagt cccatctcgc 60 acag 64 <210> 145 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC17 <400> 145 cgtggtccct tggccccagt agtccatagc ctccacgtaa tcatagaagt cccatctcgc 60 acagtaatac acggcag 77 <210> 146 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EAB-749 <400> 146 ccatcagggc ctgagctcgc ccgtc 25 <210> 147 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EAB-750 <400> 147 cgtggaggct atggactact ggggccaagg 30 <210> 148 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EAB-751 <400> 148 gactactggg gccaagggac cacggtcac 29 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EAB-752 <400> 149 ggtcagggcg cctgagttcc acg 23 <210> 150 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC1 <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> n is a, c, g, or t <400> 150 ggtgccctgg ccaaacgtga atagaggata ggtgtamnnt tggtgacagt agtaagttgc 60 <210> 151 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC2 <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <400> 151 ggtgccctgg ccaaacgtga atagaggata ggtmnnatat tggtgacagt agtaagttgc 60 <210> 152 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC3 <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n is a, c, g, or t <400> 152 ggtgccctgg ccaaacgtga atagaggata mnngtaatat tggtgacagt agtaagttgc 60 <210> 153 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC4 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <400> 153 ggtgccctgg ccaaacgtga atagaggmnn ggtgtaatat tggtgacagt agtaagttgc 60 <210> 154 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AC5 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n is a, c, g, or t <400> 154 ggtgccctgg ccaaacgtga amnnaggata ggtgtaatat tggtgacagt agtaagttgc 60 <210> 155 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequences <220> <223> Primer AC6 <400> 155 ggtgccctgg ccaaacgtga atagaggata ggtgtaatat tggtgacagt agtaagttgc 60 <210> 156 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EAB-746 <400> 156 cgcttgatct cgagcttggt gccctggcca aacgtg 36 <210> 157 <211> 0 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BLANK <400> 157 000 <210> 158 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pETR6592 <400> 158 Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15 Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Gln Leu Phe Gly Tyr Ser 20 25 30 Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Val Gly Tyr 35 40 45 Ala Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser Gly Arg 50 55 60 Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln 65 70 75 80 Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp Leu Val 85 90 95 Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110 Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125 Met Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140 Trp Ile Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn Asp Thr 165 170 175 Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Val Ser Ala Asn Arg Ser 180 185 190 Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Pro Thr Ile 195 200 205 Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser 210 215 220 Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn 225 230 235 240 Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr 245 250 255 Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr 260 265 270 Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Leu Ser 275 280 285 Pro Val Val Ala Lys Pro Gln Ile Lys Ala Ser Lys Thr Thr Val Thr 290 295 300 Gly Asp Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp Thr Gly 305 310 315 320 Ile Ser Ile Arg Trp Phe Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser Ser Glu 325 330 335 Arg Met Lys Leu Ser Gln Gly Asn Ile Thr Leu Ser Ile Asn Pro Val 340 345 350 Lys Arg Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Glu Val Phe Asn Pro Ile 355 360 365 Ser Lys Asn Gln Ser Asp Pro Ile Met Leu Asn Val Asn Tyr Asn Ala 370 375 380 Leu Pro Gln Glu Asn Leu Ile Asn Val Asp Leu Glu Val Leu Phe Gln 385 390 395 400 Gly Pro Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 405 410 415 Trp His Glu Ala Arg Ala His His His His His His 420 425 <210> 159 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMS22 <400> 159 caggtgcaat tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gagtttggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ataaacacca aaactggaga ggcaacatat 180 gttgaagagt ttaagggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaagac actgccgtgt attactgtgc gagatgggac 300 ttctatgatt acgtggaggc tatggactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 160 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1C8 <400> 160 caggtgcaat tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gagtttggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ataaacacca aaactggaga ggcaacatat 180 gttgaagagt ttaagggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaagac actgccgtgt attactgtgc gagatgggac 300 ttctatcatt acgtggaggc tatggactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 161 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3E1 <400> 161 caggtgcaat tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gagtttggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ataaacacca aaactggaga ggcaacatat 180 gttgaagagt ttaagggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaagac actgccgtgt attactgtgc gagatgggac 300 ttcgtggatt acgtggaggc tatggactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 162 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2D7 <400> 162 caggtgcaat tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gagtttggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ataaacacca aaactggaga ggcaacatat 180 gttgaagagt ttaagggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaagac actgccgtgt attactgtgc gagatgggac 300 ttctattggt acgtggaggc tatggactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 163 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affinity Matured Heavy Chain <400> 163 caggtgcaat tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gagtttggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ataaacacca aaactggaga ggcaacatat 180 gttgaagagt ttaagggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaagac actgccgtgt attactgtgc gagatgggac 300 tttgctcatt actttcagac tatggactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 164 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affinity Matured Heavy Chain <400> 164 caggtgcaat tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gagtttggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ataaacacca aaactggaga ggcaacatat 180 gttgaagagt ttaagggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaagac actgccgtgt attactgtgc gagatgggac 300 ttcgcttatt actttcagac tatggactac tggggccaag ggaccacggt 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Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Phe Tyr Tyr Val Gln Thr Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 198 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H3 Full (5) 27 <400> 198 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Ser Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 199 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4E9 Heavy Chain <400> 199 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Ile Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Tyr Asp Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 200 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAC14 (B9) <400> 200 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Tyr Asp Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 201 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAC15 (F9) <400> 201 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Tyr Asp Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 202 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1/H2 (5) 2 <400> 202 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Ser Met Asn 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100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 204 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1/H2 (5) 13 <400> 204 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Thr Lys Asn Gly Glu Ala Asn Tyr Val Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Ala Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Tyr Asp Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 205 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1/H2 (5) 14 <400> 205 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Thr Lys Asn Gly Glu Ala Asn Tyr Val Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Tyr Asp Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 206 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H3 Full (5) 19 <400> 206 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Ala Phe Glu Tyr Val Lys Ala Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 207 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAC21 (3A1) <400> 207 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Asn Val Gly Asn Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Ser Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 208 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAC19 (2C6) <400> 208 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Tyr Pro Gln Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 209 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAC18 (2F1) <400> 209 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 210 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAC23 (2F11) <400> 210 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Ala Ser Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 211 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4E9 light chain <400> 211 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 212 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2D2 <400> 212 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser His Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 213 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAC6 (C1) <400> 213 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Met Gly Pro Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Tyr His Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 214 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAC7 (E10) <400> 214 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 215 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAC12 (H7) <400> 215 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Lys Val Leu Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 216 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAC13 (H11) <400> 216 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Thr Val Ser Ala Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Tyr Arg Tyr Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110

Claims (97)

1. 친화성-성숙되고 인간화된 항원 결합 도메인을 포함하고, 이때 상기 항원 결합 도메인이 막-결합된 인간 발암배아성 항원(CEA: carcinoembryonic antigen)에 특이적으로 결합하고, 상기 항원 결합 도메인이 서열 번호 99 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 갖는 뮤린 단일클론 항체 PR1A3과 동일한 에피토프에 결합하거나 결합을 위해 상기 뮤린 단일클론 항체 PR1A3과 경쟁할 수 있으며,
   상기 항원 결합 도메인이 서열 번호 2의 중쇄 CDR1, 서열 번호 15의 중쇄 CDR2 및 서열 번호 25의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 45의 경쇄 CDR1, 서열 번호 55의 경쇄 CDR2 및 서열 번호 56의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는
   항원 결합 분자(ABM: antigen binding molecule).
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 중쇄 가변 영역이 서열 번호 107의 서열을 포함하는, 항원 결합 분자.
6. 제1항에 있어서,
   상기 경쇄 가변 영역이 서열 번호 108의 서열을 포함하는, 항원 결합 분자.
7. 제1항에 있어서,
   상기 항원 결합 도메인이 서열 번호 107의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 108의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항원 결합 분자.
8. 삭제
9. 제1항에 있어서,
   Fc 영역을 포함하는, 항원 결합 분자.
10. 제9항에 있어서,
    상기 Fc 영역이 인간 IgG Fc 영역인, 항원 결합 분자.
11. 제9항에 있어서,
    상기 Fc 영역이 글리코조작(glycoengineering)된 Fc 영역인, 항원 결합 분자.
12. 제11항에 있어서,
    상기 Fc 영역중 N-연결된 올리고당의 20% 내지 100%가 푸코실화되지 않은, 항원 결합 분자.
13. 제11항에 있어서,
    상기 Fc 영역중 N-연결된 올리고당의 20% 내지 100%가 이등분된, 항원 결합 분자.
14. 제11항에 있어서,
    상기 Fc 영역중 N-연결된 올리고당의 20% 내지 50%가 이등분되고 푸코실화되지 않은, 항원 결합 분자.
15. 제11항에 있어서,
    서열 번호 99 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 갖는 뮤린 단일클론 항체 PR1A3에 비해 하나 이상의 증가된 효과자 기능을 갖는, 항원 결합 분자.
16. 제15항에 있어서,
    상기 하나 이상의 증가된 효과자 기능이 증가된 Fc 수용체 결합 친화도, 증가된 항체-매개된 세포독성(ADCC: 항체 의존성 세포독성), NK 세포로의 증가된 결합, 대식세포로의 증가된 결합, 단핵세포로의 증가된 결합, 다형핵 세포로의 증가된 결합, 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 직접적인 신호, 증가된 수지상 세포 성숙 및 증가된 T 세포 프라이밍(priming)으로 구성된 군에서 선택되는, 항원 결합 분자.
17. 제16항에 있어서,
    상기 증가된 효과자 기능이 증가된 ADCC 또는 NK 세포로의 증가된 결합인, 항원 결합 분자.
18. 제1항에 있어서,
    전체 항체, scFv 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디 및 테트라바디로 구성된 군에서 선택되는 항체 또는 이의 단편인, 항원 결합 분자.
19. 제1항에 있어서,
    서열 번호 99 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 갖는 뮤린 단일클론 항체 PR1A3에 비해 소정의 농도에서 ADCC를 유도하는데 있어서 10배 내지 1,000배 이상 더 강력한, 항원 결합 분자.
20. 서열 번호 2, 서열 번호 15 및 서열 번호 25를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열 번호 45, 서열 번호 55 및 서열 번호 56을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항-CEA 항체.
21. 제20항에 있어서,
    (a) 서열 번호 107의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인;
    (b) 서열 번호 108의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인; 또는
    (c) 상기 중쇄 가변 도메인 (a) 및 상기 경쇄 가변 도메인 (b)
    를 포함하는, 항체.
22. 제20항에 있어서,
    서열 번호 107의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체.
23. 제20항에 있어서,
    서열 번호 108의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체.
24. 제20항에 있어서,
    서열 번호 107의 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 108의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체.
25. 서열 번호 107의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 108의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 번호 99 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 갖는 뮤린 단일클론 항체 PR1A3에 비해 증가된 ADCC를 갖는,
    막-결합된 CEA에 특이적으로 결합하는 항체.
26. 제20항에 있어서,
    글리코조작된 Fc 영역을 포함하는, 항체.
27. 제26항에 있어서,
    시험관내 세포독성 검정에서 ADCC를 10% 내지 100% 증가시키는, 항체.
28. 제1항, 제5항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 제20항 내지 제27항중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
29. 제28항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
30. 제29항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
31. (a) 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하는 조건하에 제30항에 따른 숙주 세포를 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 폴리뉴클레오티드가 막-결합된 인간 CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자의 부분을 형성하는 폴리펩티드를 코딩하는 단계; 및
    (b) 상기 항원 결합 분자를 회수하는 단계
    를 포함하고, 이때 상기 항원 결합 분자 또는 이의 일부가 서열 번호 99 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 갖는 뮤린 단일클론 항체 PR1A3과 동일한 에피토프에 결합하거나, 결합을 위해 상기 뮤린 단일클론 항체 PR1A3과 경쟁할 수 있는,
    막-결합된 인간 CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 생산하는 방법.
32. 제1항, 제5항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 제20항 내지 제27항중 어느 한 항에 따른 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 종양 세포의 세포 용해를 유도하기 위한 조성물.
33. 제32항에 있어서,
    상기 종양 세포가 결장직장암 세포, 비소세포 폐암(NSCLC) 세포, 위암 세포, 췌장암 세포 및 유방암 세포로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
34. 제33항에 있어서,
    상기 세포 용해를 상기 항원 결합 분자 또는 변형 항원 결합 분자의 항체 의존성 세포독성에 의해 유도하는, 조성물.
35. 제1항, 제5항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 제20항 내지 제27항중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 진단제; 및
    상기 진단제 및 CEA의 착체의 검출을 가능하게 하는 표지
    를 포함하는 진단 키트.
36. 제35항에 있어서,
    표지가 영상화제(imaging agent)인, 진단 키트.
37. 제1항, 제5항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 제20항 내지 제27항중 어느 한 항에 따른 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, CEA를 비정상적으로 발현하는 암을 치료하기 위한 조성물.
38. 제1항, 제5항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 제20항 내지 제27항중 어느 한 항에 따른 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, CEA를 비정상적으로 발현하는 암을 앓는 피험체에서 생존 기간을 증가시키기 위한 조성물.
39. 제37항에 있어서,
    상기 암이 결장직장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 위암, 췌장암 및 유방암으로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
40. 제1항, 제5항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 제20항 내지 제27항중 어느 한 항에 따른 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, CEA를 비정상적으로 발현하는 종양의 감소를 유도하기 위한 조성물.
41. 제40항에 있어서,
    상기 종양이 결장직장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 위암, 췌장암 및 유방암으로 구성된 군에서 선택되는 암인, 조성물.
42. 제37항에 있어서,
    화학치료법 또는 방사선 치료법과 조합하여 투여되는, 조성물.
43. 제37항에 있어서,
    화학치료제와 함께 투여되는, 조성물.
44. 제38항에 있어서,
    상기 피험체가 인간인, 조성물.
45. 제1항, 제5항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 제20항 내지 제27항중 어느 한 항에 따른 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, CEA를 비정상적으로 발현하는 종양 세포의 CEA-매개된 세포 접착을 억제하기 위한 조성물.
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