TWI738713B

TWI738713B - Fabs串聯免疫球蛋白及其用途

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Publication number: TWI738713B
Application number: TW106103839A
Authority: TW
Inventors: 辰冰吳
Original assignee: 開曼群島商岸邁生物科技有限公司
Priority date: 2016-02-06
Filing date: 2017-02-06
Publication date: 2021-09-11
Also published as: IL260937A; MX2018009581A; RU2767329C2; US20230220080A1; CU24613B1; CA3011746A1; RU2018129878A3; AU2017214692B2; AU2017214692A1; US11421028B2; CN109195993A; NZ743881A; BR112018015485A2; EP3411412A4; KR102185867B1; JP2019514839A; CN109195993B; RU2018129878A; TW201731873A; EP3411412A2

Abstract

本發明提供能夠結合兩個或更多個抗原或者兩個或更多個抗原決定基之多價及多特異性結合蛋白質。本發明亦提供製造及使用此種多價及多特異性結合蛋白質之方法，包括使用此種結合蛋白質用於預防或治療多種疾病，或用於在活體外或活體內偵測特定抗原之方法。

Description

FABS串聯免疫球蛋白及其用途

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2016年2月6日申請之國際專利申請案序號PCT/CN2016/073722之優先權及權益，該案出於所有目的以引用的方式併入本文中。

本發明係關於多價及多特異性結合蛋白質，以及製造及使用多價及多特異性結合蛋白質之方法。

以電子方式提交之正文檔案之描述

與本文一起以電子方式提交之正文檔案的內容以全文引用之方式併入本文中：序列表之電腦可讀形式複本(檔案名稱：EPBI_002_01WO_SeqList_ST25.txt，記錄日期：2017年2月3日，檔案大小510KB)。

已產生雙特異性或多特異性抗體以試圖製備適用於治療多種炎性疾病、癌症及其他病症之分子。

已使用四源雜交瘤技術(參見Milstein,C.及A.C.Cuello,Nature,1983.305(5934)：第537-40頁)，基於表現具有雙特異性抗體之所要特異性之鼠類單株抗體的兩種不同的雜交瘤細胞株之體細胞融合來產生雙特異性抗體。雙特異性抗體亦可藉由兩種不同的mAb之化學結合來產生(參見Staerz,U.D.等人，Nature,1985.314(6012)：第628-31頁)。其他方法已使用兩種不同的單株抗體或較小抗體片段的化學結合(參見Brennan,M.等人，Science,1985.229(4708)：第81-3頁)。

另一方法為利用異雙功能交聯劑使兩個親本抗體偶合。特定言之，兩個不同的Fab片段已依定點方式在其鉸鏈半胱胺酸殘基處化學交聯(參見Glennie,M.J.等人，J Immunol,1987.139(7)：第2367-75頁)。

在最近的過去已開發其他重組雙特異性抗體形式(參見Kriangkum,J.等人，Biomol Eng,2001.18(2)：第31-40頁)。其中，串聯單鏈Fv分子及雙功能抗體及其各種衍生物已用於構築重組雙特異性抗體。通常，此等分子之構築始於兩個識別不同的抗原的單鏈Fv(scFv)片段(參見Economides,A.N.等人，Nat Med,2003.9(1)：第47-52頁)。串聯scFv分子(taFv)代表用另一肽連接子簡單地連接兩個scFv分子之直接形式。此等串聯scFv分子中所存在之兩個scFv片段形成獨立之摺疊實體。多種連接子可用於連接兩個scFv片段且連接子具有至多63個殘基之長度(參見Nakanishi,K.等人，Annu Rev Immunol,2001.19：第423-74頁)。

在最新研究中，報導由轉殖基因兔及牛在活體內表現針對CD28及黑色素瘤相關蛋白聚糖之串聯scFv(參見Gracie,J.A.等人，J Clin Invest,1999.104(10)：第1393-401頁)。在此構築體中，兩個scFv分子由CH1連接子連接，且發現雙特異性抗體之血清濃度高達100mg/L。數項研究現已報導使用極短Ala3連接子或長富甘胺酸/絲胺酸連接子在細菌中表現可溶性串聯scFv分子(參見Leung,B.P.等人，J Immunol,2000.164(12)：第6495-502頁；Ito,A.等人，J Immunol,2003.170(9)：第4802-9頁；Karni,A.等人，J Neuroimmunol,2002.125(1-2)：第134-40頁)。

在最新研究中，含有3或6個殘基長之隨機中間連接子之串聯scFv譜系的噬菌體呈現使在細菌中以可溶性及活性形式產生之彼等分子得以富集。此方法得以分離具有6個胺基酸殘基之連接子之較佳串聯scFv分子(參見Arndt,M.及J.Krauss,Methods Mol Biol,2003.207：第305-21頁)。

雙特異性雙功能抗體(Db)利用雙功能抗體形式來表現。藉由將連接VH與VL域之連接子之長度減至約5個殘基而由scFv片段產生雙功能抗體(參見Peipp,M.及T.Valerius,Biochem Soc Trans,2002.30(4)：第507-11頁)。此連接子尺寸減小有助於藉由VH與VL域之交叉配對而使兩個多肽鏈二聚。藉由在同一細胞內表現具有結構VHA-VLB及VHB-VLA(VH-VL組態)或VLA-VHB及VLB-VHA(VL-VH組態)之兩個多肽鏈來產生雙特異性雙功能抗體。最新比較研究證實，可變域之取向可影響活性結合位點之表現及形成(參見Mack,M.,G.Riethmuller及P.Kufer,Proc Natl Acad Sci U S A,1995.92(15)：第7021-5頁)。

一種促使雙特異性雙功能抗體產生之方法為產生杵入臼型雙功能抗體(參見Holliger,P.,T.Prospero及G.Winter,Proc Natl Acad Sci U S A,1993.90(14)：第6444-8.18頁)。此對於針對HER2及CD3之雙特異性雙功能抗體得到證實。藉由用Phe交換Val37及用Trp交換Leu45而將大杵狀結構引入VH域中，並且藉由在抗HER2或抗CD3可變域中使Phe98突變至Met且使Tyr87突變至Ala而在VL域中產生互補臼狀結構。藉由使用此方法，雙特異性雙功能抗體之產生可自親本雙功能抗體之72%增至杵入臼型雙功能抗體之超過90%。

單鏈雙功能抗體(scDb)代表改良雙特異性雙功能抗體樣分子之形成的替代策略(參見Holliger,P.及G.Winter,Cancer Immunol Immunother,1997.45(3-4)：第128-30頁；Wu,A.M.等人，Immunotechnology,1996.2(1)：第21-36頁)。藉由用約15個胺基酸殘基長之另一中間連接子連接兩個形成雙功能抗體之多肽鏈來產生雙特異性單鏈雙功能抗體。因此，具有對應於單體單鏈雙功能抗體之分子量(50-60kDa)之所有分子均具雙特異性。若干研究已證實，雙特異性單鏈雙功能抗體以可溶性及活性形式表現於細菌中，其中大多數經純化之分子呈單體形式(參見Holliger,P.及G.Winter,Cancer Immunol Immunother,1997.45(3-4)：第128-30頁；Wu,A.M.等人，Immunotechnology,1996.2(1)：第21-36頁；Pluckthun,A.及P.Pack,Immunotechnology,1997.3(2)：第83-105頁；Ridgway,J.B.等人，Protein Eng,1996.9(7)：第617-21頁)。

已使雙功能抗體與Fc融合以產生更多Ig樣分子，稱為雙雙功能抗體(參見Lu,D.等人，J Biol Chem,2004.279(4)：第2856-65頁)。另外，已描述在IgG之重鏈中包含兩個Fab重複單元且能夠結合四個抗原分子之多價抗體構築體(參見美國專利8,722,859 B2；及Miller,K.等人，J Immunol,2003.170(9)：第4854-61頁)。

最近之實例為四價IgG單鏈可變片段(scFv)融合體(Dong J等人，2011 MAbs 3：273-288；Coloma MI,Morrison SL 1997 Nat Biotechnol 15：159-163；Lu D等人，2002 J Immunol Methods 267：213-226)、三功能大鼠/小鼠雜交雙特異性上皮細胞黏附分子CD3抗體卡妥索單抗(catumaxomab)(Lindhofer H等人，1995 J Immunol 155：219-225)、雙特異性CD19-CD3 scFv抗體蘭妥莫單抗(blinatumomab)(Bargou R等人，2008 Science 321：974-977)、「雙重作用Fab」(DAF)抗體(BostromJ等人，2009 Science 323：1610-1614)、與催化抗體共價連接之藥效團肽(Doppalapudi VR等人，2010 Proc Natl Acad Sci USA 107：22611-22616)、使用半IgG4分子之間的動態交換來產生雙特異性抗體(van der Neut Kolfschoten M等人，2007 Science 317：1554-1557；Stubenrauch K等人，2010 Drug Metab Dispos 38：84-91)，或藉由一半雙特異性抗體之抗原結合片段(Fab)內之重鏈及輕鏈結構域之交換(CrossMab形式)(Schaefer W等人，2011Proc Natl Acad Sci 108：11187-92)。

此項技術中需要具有雙重抗原結合功能之單一分子實體，及產生此種多價及多特異性結合蛋白質之方法。本發明解決此等及其他需要。

本發明提供多價及多特異性結合蛋白質，以及製造及使用此種結合蛋白質之方法。在一個實施例中，本文中所提供之多價及多特異性結合蛋白質為Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)，且能夠結合兩個或更多個抗原，或同一抗原之兩個或更多個抗原決定基，或同一抗原決定基之兩個或更多個複本。本文中所提供之多價及多特異性結合蛋白質適用於治療及/或預防急性及慢性發炎性疾病及病症、自體免疫疾病、癌症、脊髓損傷、敗血症，以及其他疾病、病症及病狀。本文提供包含多價及多特異性結合蛋白質之醫藥組成物。另外，本文提供用於製造此種FIT-Ig之核酸、重組表現載體及宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本發明之FIT-Ig在活體內或活體外偵測特定抗原之方法。

本發明提供能夠結合兩個或更多個抗原(例如，以高親和力)之結合蛋白質家族。在一個態樣中，本發明提供一種使用以下兩個親本單株抗體構築雙特異性結合蛋白質之方法：結合抗原A之mAb A及結合抗原B之mAb B。在一個實施例中，本文所揭示之結合蛋白質能夠結合抗原、細胞因子、趨化因子、細胞因子受體、趨化因子受體、細胞因子或趨化因子相關分子，或細胞表面蛋白質。

因此，在一個態樣中，提供能夠結合兩個或更多個抗原之結合蛋白質。在一個實施例中，本發明提供一種包含至少兩個多肽鏈之結合蛋白質，其中該等多肽鏈配對以形成能夠結合兩個或更多個抗原之類IgG分子。在一個實施例中，結合蛋白質包含兩個、三個、四個、五個或更多個多肽鏈。在一個實施例中，結合蛋白質包含至少一個VL_A、至少一個VL_B、至少一個VH_A、至少一個VH_B、至少一個CL及至少一個CH1，其中VL為輕鏈可變域，VH為重鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，CH1為重鏈之第一恆定域，A為第一抗原，且B為第二抗原。在另一實施例中，第一多肽鏈包含VL_A、CL、VH_B及CH1。在另一實施例中，結合蛋白質進一步包含Fc。在另一實施例中，Fc區為變異Fc區。在另一實施例中，變異Fc區展現經調節之效應功能，諸如ADCC或CDC。在另一實施例中，變異Fc區對一或多個FcγR展現經調節之親和力或親合力。

在一個實施例中，結合蛋白質包含三個多肽鏈，其中第一多肽鏈包含VL_A、CL、VH_B及CH1，第二多肽鏈包含VH_A及CH1，且第三多肽鏈包含VL_B及CL。在另一實施例中，結合蛋白質之第一多肽鏈進一步包含Fc。在另一實施例中，結合蛋白質包含兩個多肽鏈，其中第一多肽鏈包含VL_A、CL、VH_B及CH1，第二多肽鏈包含VH_A、CH1、VL_B及CL。在另一實施例中，第一多肽鏈進一步包含Fc。

在一個實施例中，結合蛋白質包含三個多肽鏈，且其相應cDNA在共轉染期間以1：1：1、1：1.5：1、1：3：1、1：1：1.5、1：1：3、1：1.5：1.5、1：3：1.5、1：1.5：3或1：3：3之第一多肽鏈：第二多肽鏈：第三多肽鏈莫耳比存在。在另一實施例中，結合蛋白質包含兩個多肽鏈，且其相應cDNA在共轉染期間以1：1、1：1.5或1：3之第一多肽鏈：第二多肽鏈莫耳比或任何其他比率存在，藉由最佳化，以致力於使任何指定轉染中之單體FIT-Ig分數達到最大。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質不包含肽連接子。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質包含至少一個胺基酸或多肽連接子。在另一實施例中，連接子選自由以下組成之群：G、GS、SG、GGS、GSG、 SGG、GGG、GGGS(SEQ ID NO：489)、SGGG(SEQ ID NO：490)、GGGGS(SEQ ID NO：491)、GGGGSGS(SEQ ID NO：492)、GGGGSGGS(SEQ ID NO：493)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：494)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：495)、AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO：496)、AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：497)、AKTTPKLGG(SEQ ID NO：498)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO：499)、SAKTTP(SEQ ID NO：500)、RADAAP(SEQ ID NO：501)、RADAAPTVS(SEQ ID NO：502)、RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO：503)、RADAAAA(G₄S)₄(SEQ ID NO：504)、SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：505)、ADAAP(SEQ ID NO：506)、ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO：507)、TVAAP(SEQ ID NO：508)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：509)、QPKAAP(SEQ ID NO：510)、QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO：511)、AKTTPP(SEQ ID NO：512)、AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO：513)、AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO：514)、ASTKGP(SEQ ID NO：515)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO：516)、GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO：517)、GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO：518)、GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO：519)及AKTTAP(SEQ ID NO：80)。連接子亦可為活體內可裂解肽連接子、蛋白酶(諸如MMP)敏感性連接子、如先前所描述之可藉由還原等而裂解之基於二硫鍵之連接子(Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals：A pplications and Challenges,Stefan R.Schmidt編)，或此項技術中已知的任何可裂解連接子。此種可裂解連接子可出於多種目的而用於在活體內釋放最高Fab，以便改良組織/細胞滲透及分佈、增強與標靶之結合、減少潛在副作用，以及調節2個不同的Fab區之活體內功能及物理半衰期。

在一個實施例中，結合蛋白質包含：第一多肽，其自胺基至羧基端包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc；第二多肽鏈，其自胺基至羧基端包含VH_A-CH1；及第三多肽鏈，其自胺基至羧基端包含VL_B-CL；其中VL為輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VH為重鏈可變域，CH1為重鏈之第一恆定域，A為第一抗原決定基或抗原，且B為第二抗原決定基或抗原。在一個實施例中，Fc區為人類IgG1。在另一實施例中，Fc區為變異Fc區。在另一實施例中，Fc區之胺基酸序列與SEQ ID NO：20具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%一致性。在另一實施例中，第一多肽鏈之CL直接融合至VH_B。在另一實施例中，第一多肽鏈之CL經由胺基酸或寡肽連接子而連接至VH_B。在另一實施例中，連接子為GSG(SEQ ID NO：26)或GGGGSGS(SEQ ID NO：28)。

在另一實施例中，結合蛋白質包含：第一多肽，其自胺基至羧基端包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc；第二多肽鏈，其自胺基至羧基端包含VH_A-CH1；及第三多肽鏈，其自胺基至羧基端包含VL_B-CL；其中VL為輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VH為重鏈可變域，CH1為重鏈之第一恆定域，A為第一抗原決定基或抗原，且B為第二抗原決定基或抗原。在一個實施例中，Fc區為人類IgG1。在另一實施例中，Fc區為變異Fc區。在另一實施例中，Fc區之胺基酸序列與SEQ ID NO：20具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%一致性。在一個實施例中，第一多肽鏈之CH1直接融合至VL_A。在另一實施例中，第一多肽鏈之CH1經由胺基酸或寡肽連接子而連接至VL_A。在另一實施例中，連接子為GSG(SEQ ID NO：26)或GGGGSGS(SEQ ID NO：28)。

在另一實施例中，結合蛋白質包含：第一多肽，其自胺基至羧基端包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc；及第二多肽鏈，其自胺基至羧基端包含VH_A-CH1-VL_B-CL；其中VL為輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VH為重鏈可變域，CH1為重鏈之第一恆定域，A為第一抗原決定基或抗原，且B為第二抗原決定基或抗原。在一個實施例中，Fc區為人類IgG1。在另一實施例中，Fc區為變異Fc區。在另一實施例中，Fc區之胺基酸序列與SEQ ID NO：20具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%一致性。在另一實施例中，第一多肽鏈之CL直接融合至VH_B。在另一實施例中，第一多肽鏈之CL經由胺基酸或寡肽連接子而連接至VH_B。在另一實施例中，連接子為GSG(SEQ ID NO：26)或GGGGSGS(SEQ ID NO：28)。

在另一實施例中，結合蛋白質包含：第一多肽，其自胺基至羧基端包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc；及第二多肽鏈，其自胺基至羧基端包含VL_B-CL-VH_A-CH1；其中VL為輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VH為重鏈可變域，CH1為重鏈之第一恆定域，A為第一抗原決定基或抗原，且B為第二抗原決定基或抗原。在一個實施例中，Fc區為人類IgG1。在另一實施例中，Fc區為變異Fc區。在另一實施例中，Fc區之胺基酸序列與SEQ ID NO：20具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%一致性。在一個實施例中，第一多肽鏈之CH1直接融合至VL_A。在另一實施例中，第一多肽鏈之CH1經由胺基酸或寡肽連接子連接至VL_A。在另一實施例中，連接子為GSG(SEQ ID NO：26)或GGGGSGS(SEQ ID NO：28)。

本發明之結合蛋白質能夠結合細胞因子對。舉例而言，本發明之結合蛋白質能夠結合選自由以下組成之群的細胞因子對：IL-1α與IL-1β；IL-12與IL-18、TNFα與IL-23、TNFα與IL-13；TNF與IL-18；TNF與IL-12；TNF與IL-1β；TNF與MIF；TNF與IL-6、TNF與IL-6受體、TNF與IL-17；IL-17與IL-20；IL-17與IL-23；TNF與IL-15；TNF與VEGF；VEGFR與EGFR；PDGFR與VEGF、IL-13與IL-9；IL-13與IL-4；IL-13與IL-5；IL-13與IL-25；IL-13與TARC；IL-13與MDC；IL-13與MIF；IL-13與TGF-β；IL-13與LHR促效劑；IL-13與CL25；IL-13與SPRR2a；IL-13與SPRR2b；IL-13與ADAM8；與TNFα與PGE4、IL-13與PED2、TNF與PEG2。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合IL-17及IL-20。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合IL-17及IL-20且包含來源於抗IL-17抗體LY及抗IL-20抗體15D2之可變重鏈及輕鏈。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合IL-17及TNF。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合IL-17及TNF且包含來源於抗IL-17抗體LY及TNF抗體戈利木單抗(golimumab)之可變重鏈及輕鏈。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合IL-17及IL-20且包含：第一多肽，其包含選自由SEQ ID NO：15、25及27組成之群的胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：21之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：23之序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。在另一實施例中，本發明之結合蛋白質結合IL-27及IL-20且包含：第一多肽鏈，其包含選自由SEQ ID NO：15、25及27組成之群的胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第二多肽鏈，其包含選自由SEQ ID NO：29、30及31組成之群的胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合TNF及IL-17且包含：第一多肽，其包含根據SEQ ID NO：87之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：89之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：91之序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合選自由以下組成之群的標靶對：CD137與CD20、CD137與EGFR、CD137與Her-2、CD137與PD-1、CD137與PDL-1、VEGF與PD-L1、Lag-3與TIM-3、OX40與PD-1、TIM-3與PD-1、TIM-3與PDL-1、EGFR與DLL-4、CD138與CD20；CD138與CD40；CD19與CD20；CD20與CD3；CD3與CD33；CD3與CD133；CD47與CD20、CD38與CD138；CD38與CD20；CD20與CD22；CD38與CD40；CD40與CD20；CD-8與IL-6；CSPG與RGM A；CTLA-4與BTNO2；IGF1與IGF2；IGF1/2與Erb2B；IGF-1R與EGFR；EGFR與CD13；IGF-1R與ErbB3；EGFR-2與IGFR；VEGFR-2與Met；VEGF-A與血管生成素-2(Ang-2)；IL-12與TWEAK；IL-13與IL-1β；PDGFR與VEGF、EpCAM與CD3、Her2與CD3、CD19與CD3、EGFR與Her3、CD16a與CD30、CD30與PSMA、EGFR與CD3、CEA與CD3、TROP-2與HSG、TROP-2與CD3、MAG與RGM A；NgR與RGM A；NogoA與RGM A；OMGp與RGM A；PDL-1與CTLA-4；CTLA-4與PD-1；PD-1與TIM-3；RGM A與RGM B；Te38與TNFα；TNFα與Blys；TNFα與CD-22；TNFα與CTLA-4結構域；TNFα與GP130；TNFα與IL-12p40；與TNFα 與RANK配位體、因子IXa與因子X；EGFR與PD-L1；EGFR與cMet；Her3與IGF-IR；DLL-4與VEGF；PD-1與PD-L1；以及Her3與PD-1。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD3及CD20。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD3及CD20且包含來源於抗CD3抗體OKT3或U.S.2009/0252683(該案以全文引用之方式併入本文中)中所揭示之抗CD3抗體及抗CD20抗體奧法木單抗(ofatumumab)的可變重鏈及輕鏈。在一些實施例中，來源於CD3抗體之多肽處於上部結構域中且來源於CD20抗體之多肽處於下部結構域。如本文中所使用，在存在時，上部結構域為N末端或「胺基近端」結構域，而下結構域為C末端結構域或更接近Fc之結構域。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為CD3，且抗原B為CD20。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為CD3，且抗原A為CD20。在一些實施例中，來源於CD3抗體之多肽處於下部結構域且來源於CD20抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為CD20，且抗原B為CD-3。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為CD20，且抗原A為CD3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD3及CD20且包含：第一多肽鏈，其包含選自由SEQ ID NO：41及48組成之群的胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：44之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：46之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。在另一實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD20及CD3且包含：第一多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：114之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：115之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：116之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白FIT018a結合CD20之同一抗原決定基及CD3之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT018a包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：316之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：325之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：330之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD3及CD20且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：318之VL_A CDR1、SEQ ID NO：319之VL_A CDR2及SEQ ID NO：320之VL_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD3及CD20且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：322之VH_B CDR1、SEQ ID NO：323之VH_B CDR2及SEQ ID NO：324之VH_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD3及CD20且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：327之VH_A CDR1、SEQ ID NO：328之VH_A CDR2及SEQ ID NO：329之VH_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD3及CD20且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：332之VL_B CDR1、SEQ ID NO：333之VL_B CDR2及SEQ ID NO：334之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD3及CD20且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：318之VL_A CDR1、SEQ ID NO：319之VL_A CDR2及SEQ ID NO：320之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：322之VH_B CDR1、SEQ ID NO： 323之VH_B CDR2及SEQ ID NO：324之VH_B CDR3，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：327之VH_A CDR1、SEQ ID NO：328之VH_A CDR2及SEQ ID NO：329之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：332之VL_B CDR1、SEQ ID NO：333之VL_B CDR2及SEQ ID NO：334之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD3及CD20且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：317之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：321之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：326之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：331之序列之VL_B。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD3及CD20且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：316之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：325之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：330之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD3及CD20，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合CTLA-4與PD-1。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合CTLA-4與PD-1且包含來源於CTLA-4抗體伊匹單抗(ipilimumab)及PD-1抗體尼沃魯單抗(nivolumab)之可變重鏈及輕鏈。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA-4及PD-1且包含：第一多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。在一個實施例中，本文中所提供之結合蛋白質能夠結合CTLA-4上之一或多個抗原決定基。在一個實施例中，本文中所提供之結合蛋白質能夠結合PD-1上之一或多個抗原決定基。在一些實施例中，來源於CTLA-4抗體之多肽處於上部結構域中且來源於PD-1抗體之多肽處於下部結構域。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為CTLA-4，且抗原B為PD-1。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為CTLA-4，且抗原A為PD-1。在一些實施例中，來源於CTLA-4抗體之多肽處於下部結構域且來源於PD-1抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為PD-1，且抗原B為CTLA-4。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為PD-1，且抗原A為CTLA-4。

在一個實施例中，如本文中所描述，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質NBS3、NBS3R、NBS3-C或NBS3R-C結合CTLA-4之同一抗原決定基及PD-1之同一抗原決定基。

雙特異性結合蛋白質NBS3包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列。

雙特異性結合蛋白質NBS3R包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：145之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：154之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：159之胺基酸序列。

雙特異性結合蛋白質NBS3-C包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：164之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：173之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：178之胺基酸序列。

雙特異性結合蛋白質NBS3R-C包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：183之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：192之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：128之VL_A CDR1、SEQ ID NO：129之VL_A CDR2及SEQ ID NO：130之VL_A CDR3(例如，NBS3上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：147之VL_A CDR1、SEQ ID NO：148之VL_A CDR2及SEQ ID NO：149之VL_A CDR3(例如NBS3R上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：166之VL_A CDR1、SEQ ID NO：167之VL_A CDR2及SEQ ID NO：168之VL_A CDR3(例如NBS3-C上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：185之VL_A CDR1、SEQ ID NO：186之VL_A CDR2及SEQ ID NO：187之VL_A CDR3(例如NBS3R-C上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：132之VH_B CDR1、SEQ ID NO：133之VH_B CDR2及SEQ ID NO：134之VH_B CDR3(例如，NBS3上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：151之VH_B CDR1、SEQ ID NO：152之VH_B CDR2及SEQ ID NO：153之VH_B CDR3(例如，NBS3R上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：166之VH_B CDR1、SEQ ID NO：167之VH_B CDR2及SEQ ID NO：168之VH_B CDR3(例如，NBS3-C上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：185 之VH_B CDR1、SEQ ID NO：186之VH_B CDR2及SEQ ID NO：187之VH_B CDR3(例如，NBS3R-C上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：137之VH_A CDR1、SEQ ID NO：138之VH_A CDR2及SEQ ID NO：139之VH_A CDR3(例如，NBS3上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：156之VH_A CDR1、SEQ ID NO：157之VH_A CDR2及SEQ ID NO：158之VH_A CDR3(例如NBS3R上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：175之VH_A CDR1、SEQ ID NO：176之VH_A CDR2及SEQ ID NO：177之VH_A CDR3(例如NBS-C上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：194之VH_A CDR1、SEQ ID NO：195之VH_A CDR2及SEQ ID NO：196之VH_A CDR3(例如NBS3R-C上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：142之VL_B CDR1、SEQ ID NO：143之VL_B CDR2及SEQ ID NO：144之VL_B CDR3(例如，NBS3上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：161之VL_B CDR1、SEQ ID NO：162之VL_B CDR2及SEQ ID NO：163之VL_B CDR3(例如NBS3R上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：180之VL_B CDR1、SEQ ID NO：181之VL_B CDR2及SEQ ID NO：182之VL_B CDR3(例如NBS3-C上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：199之VL_B CDR1、SEQ ID NO：200之VL_B CDR2及SEQ ID NO：201之VL_B CDR3(例如NBS3R-C上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VHA及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：128之VL_A CDR1、SEQ ID NO：129之VL_A CDR2及SEQ ID NO：130之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：132之VH_B CDR1、SEQ ID NO：133之VH_B CDR2及SEQ ID NO：134之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：137之VH_A CDR1、SEQ ID NO：138之VH_A CDR2及SEQ ID NO：139之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：142之VL_B CDR1、SEQ ID NO：143之VL_B CDR2及SEQ ID NO：144之VL_B CDR3(例如NBS3上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：147之VL_A CDR1、SEQ ID NO：148之VL_A CDR2及SEQ ID NO：149之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：151之VH_B CDR1、SEQ ID NO：152之VH_B CDR2及SEQ ID NO：153之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：156之VH_A CDR1、SEQ ID NO：157之VH_A CDR2及SEQ ID NO：158之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：161之VL_B CDR1、SEQ ID NO：162之VL_B CDR2及SEQ ID NO：163之VL_B CDR3(例如NBS3R上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：166之VL_A CDR1、SEQ ID NO：167之VL_A CDR2及SEQ ID NO：168之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：170之VH_B CDR1、SEQ ID NO：171之VH_B CDR2及SEQ ID NO：172之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：175之VH_A CDR1、SEQ ID NO：176之VH_A CDR2 及SEQ ID NO：177之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：180之VL_B CDR1、SEQ ID NO：181之VL_B CDR2及SEQ ID NO：182之VL_B CDR3(例如NBS3-C上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：166之VL_A CDR1、SEQ ID NO：167之VL_A CDR2及SEQ ID NO：168之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：170之VH_B CDR1、SEQ ID NO：171之VH_B CDR2及SEQ ID NO：172之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：175之VH_A CDR1、SEQ ID NO：176之VH_A CDR2及SEQ ID NO：177之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：180之VL_B CDR1、SEQ ID NO：181之VL_B CDR2及SEQ ID NO：182之VL_B CDR3(例如NBS3R-C上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：127之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：131之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：136之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：141之序列之VL_B(例如NBS3上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：146之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：150之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：155之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：160之序列之VL_B(例如NBS3R上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：165之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：169之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：174之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：179之序列之VL_B(例如NBS3-C上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：184之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：188之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：193之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：198之序列之VL_B(例如NBS3R-C上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列(例如NBS3上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：145之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：154之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：159之胺基酸序列(例如NBS3R上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：164之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：173之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：178之胺基酸序列(例如NBS3-C上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：183之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：192之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列(例如NBS3R-C上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CTLA4及PD-1，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合EGFR與PD-L1。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合EGFR與PD-L1且包含來源於EGFR抗體帕尼單抗(panitumumab)及PD-L1抗體1B12之可變重鏈及輕鏈。在一些實施例中，來源於EGFR抗體之多肽處於上部結構域中且來源於PD-L1抗體之多肽處於下部結構域。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為EGFR，且抗原B為PD-L1。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為EGFR，且抗原A為PD-L1。在一些實施例中，來源於EGFR抗體之多肽處於下部結構域中且來源於PD-L1抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為PD-L1，且抗原B為EGFR。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為PD-L1，且抗原A為EGFR。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含：第一多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：99之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：100之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：101之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT012a結合EGFR之同一抗原決定基及PD-L1之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT012a包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列(例如FIT012a上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT012b結合EGFR之同一抗原決定基及PD-L1之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT012b包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列(例如FIT012b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT012d結合EGFR之同一抗原決定基及PD-L1之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT012d包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：221之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：230之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：235之胺基酸序列(例如FIT012d上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：204之VL_A CDR1、SEQ ID NO：205之VL_A CDR2及SEQ ID NO：206之VL_A CDR3(例如，FIT012b上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：223之VL_A CDR1、SEQ ID NO：224之VL_A CDR2及SEQ ID NO：225之VL_A CDR3(例如，FIT012d上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：208之VH_B CDR1、SEQ ID NO：209之VH_B CDR2及SEQ ID NO：210之VH_B CDR3(例如，FIT012b上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：227之VH_B CDR1、SEQ ID NO：228之VH_B CDR2及SEQ ID NO：229之VH_B CDR3(例如，FIT012d上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：213之VH_A CDR1、SEQ ID NO：214之VH_A CDR2及SEQ ID NO：215之VH_A CDR3(例如，FIT012b上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：232之VH_A CDR1、SEQ ID NO：233之VH_A CDR2及SEQ ID NO：234之VH_A CDR3(例如，FIT012d上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：218之VL_B CDR1、SEQ ID NO：219之VL_B CDR2及SEQ ID NO：220之VL_B CDR3(例如，FIT012b上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：237之VL_B CDR1、SEQ ID NO：238之VL_B CDR2及SEQ ID NO：239之VL_B CDR3(例如，FIT012d上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：204之VL_A CDR1、SEQ ID NO：205之VL_A CDR2及SEQ ID NO：206之VL_A CDR3，該VH_B包含SEQ ID NO：208之VH_B CDR1、SEQ ID NO：209之VH_B CDR2及SEQ ID NO：210之VH_B CDR3，該VH_A包含SEQ ID NO：213之VH_A CDR1、SEQ ID NO：214之VH_A CDR2及SEQ ID NO：215之VH_A CDR3，且該VL_B包含SEQ ID NO：218之VL_B CDR1、SEQ ID NO：219之VL_B CDR2及SEQ ID NO：220之VL_B CDR3(例如FIT012b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：223之VL_A CDR1、SEQ ID NO：224之VL_A CDR2及SEQ ID NO：225之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：227之VH_B CDR1、SEQ ID NO：228之VH_B CDR2及SEQ ID NO：229之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：232之VH_A CDR1、SEQ ID NO：233之VH_A CDR2及SEQ ID NO：234之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：237之VL_B CDR1、SEQ ID NO：239之VL_B CDR2及SEQ ID NO：239之VL_B CDR3(例如FIT012d上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：203之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：207之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：212之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：217之序列之VL_B(例如FIT012b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：222之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：226之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：231之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：236之序列之VL_B(例如FIT012d上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列(例如FIT012b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：221之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：230之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：235之胺基酸序列(例如FIT012d上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合EGFR及PD-L1，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合cMet與EGFR。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合cMet與EGFR，且包含來源於cMet抗體(h1332(13.3.2L-A91T,H-42K,S97T))及EGFR抗體帕尼單抗之可變重鏈及輕鏈。在一些實施例中，來源於cMet抗體之多肽處於上部結構域中且來源於EGFR抗體之多肽處於下部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為cMet，且抗原B為EGFR。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為cMet，且抗原A為EGFR。在一些實施例中，來源於cMet抗體之多肽處於下部結構域中且來源於EGFR抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為EGFR，且抗原B為cMet。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為EGFR，且抗原A為cMet。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及EGFR且包含：第一多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：102之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：103之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：104之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT013a結合cMet之同一抗原決定基及EGFR之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT013a包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：240之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：249之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：254之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及EGFR且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：242之VL_A CDR1、SEQ ID NO：243之VL_A CDR2及SEQ ID NO：244之VL_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及EGFR且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：246之VH_B CDR1、SEQ ID NO：247之VH_B CDR2及SEQ ID NO：248之VH_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及EGFR且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：251之VH_A CDR1、SEQ ID NO：252之VH_A CDR2及SEQ ID NO：253之VH_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及EGFR且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：256之VL_B CDR1、SEQ ID NO：257之VL_B CDR2及SEQ ID NO：258之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及EGFR且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：242之VL_A CDR1、SEQ ID NO：243之VL_A CDR2及SEQ ID NO：244之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：246之VH_B CDR1、SEQ ID NO：247之VH_B CDR2及SEQ ID NO：248之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：251之VH_A CDR1、SEQ ID NO：252之VH_A CDR2及SEQ ID NO：253之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：256之VL_B CDR1、SEQ ID NO：257之VL_B CDR2及SEQ ID NO：258之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及EGFR且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：241之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：245之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：250之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：255之序列之VL_B。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及EGFR且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：240之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：249之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：254之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及EGFR，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合因子IXa與因子X。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合因子IXa與因子X，且包含來源於抗因子IXa抗體之可變重鏈及輕鏈以及來源於抗因子X抗體之可變輕鏈及重鏈。在一些實施例中，來源於因子IXa抗體之多肽處於上部結構域中且來源於因子X抗體之多肽處於下部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為因子IXa，且抗原B為因子X。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為因子IXa，且抗原A為因子X。在一些實施例中，來源於因子IXa抗體之多肽處於下部結構域中且來源於因子X抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為因子X，且抗原B為因子IXa。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為因子X，且抗原A為因子IXa。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合因子IXa及因子X且包含：第一多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：105之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：106之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：107之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT014a結合因子IXa之同一抗原決定基及因子X之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT014a包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：259之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：268之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：273之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合因子IXa及因子X且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：261之VL_A CDR1、SEQ ID NO：262之VL_A CDR2及SEQ ID NO：263之VL_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合因子IXa及因子X且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：265之VH_B CDR1、SEQ ID NO：266之VH_B CDR2及SEQ ID NO：267之VH_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合因子IXa及因子X且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：270之VH_A CDR1、SEQ ID NO：271之VH_A CDR2及SEQ ID NO：272之VH_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合因子IXa及因子X且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：275之VL_B CDR1、SEQ ID NO：276之VL_B CDR2及SEQ ID NO：277之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合因子IXa及因子X且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：261之VL_A CDR1、SEQ ID NO：262之VL_A CDR2及SEQ ID NO：263之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：265之VH_B CDR1、SEQ ID NO：266之VH_B CDR2及SEQ ID NO：267之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：270之VH_A CDR1、SEQ ID NO：271之VH_A CDR2及SEQ ID NO：272之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：275之VL_B CDR1、SEQ ID NO：276之VL_B CDR2及SEQ ID NO：277之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合因子IXa及因子X且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：260之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：264之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：269之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：274之序列之VL_B。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合因子IXa及因子X且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：259之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：268之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：273之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合因子IXa及因子X，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合Her3與IGF-1R。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合Her3與IGF-1R且包含來源於Her3抗體帕曲土單抗(patritumab)及IGF-1R抗體芬妥木單抗(芬妥木單抗)之可變重鏈及輕鏈。在一些實施例中，來源於Her3抗體之多肽處於上部結構域中且來源於IGF-1R抗體之多肽處於下部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為Her3，且抗原B為IGF-1R。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為Her3，且抗原A為IGF-1R。在一些實施例中，來源於Her3抗體之多肽處於下部結構域中且來源於IGF-1R抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為IGF-1R，且抗原B為Her3。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為IGF-1R，且抗原A為Her3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及IGF-1R且包含：第一多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：108之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：109之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：110之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT016a結合Her3之同一抗原決定基及IGF-1R之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT016a包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：278之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：287之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：292之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及IGF-1R且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：280之VL_A CDR1、SEQ ID NO：281之VL_A CDR2及SEQ ID NO：282之VL_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及IGF-1R且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：284之VH_B CDR1、SEQ ID NO：285之VH_B CDR2及SEQ ID NO：286之VH_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及IGF-1R且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：289之VH_A CDR1、SEQ ID NO：290之VH_A CDR2及SEQ ID NO：291之VH_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及IGF-1R且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：294之VL_B CDR1、SEQ ID NO：295之VL_B CDR2及SEQ ID NO：296之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及IGF-1R且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：280之VL_A CDR1、SEQ ID NO：281之VL_A CDR2及SEQ ID NO：282之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：284之VH_B CDR1、SEQ ID NO：285之VH_B CDR2及SEQ ID NO：286之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：289之VH_A CDR1、SEQ ID NO：290之VH_A CDR2及SEQ ID NO：291之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：294之VL_B CDR1、SEQ ID NO：295之VL_B CDR2及SEQ ID NO：296之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及IGF-1R且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：279之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：283之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：288之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：293之序列之VL_B。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及IGF-1R且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：278之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：287之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：292之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及IGF-1R，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合DLL-4與VEGF。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合DLL-4與VEGF且包含來源於DLL-4抗體登西珠單抗(demcizumab)及VEGF抗體貝伐珠單抗(bevicizumab)之可變重鏈及輕鏈。在一些實施例中，來源於DLL-4抗體之多肽處於上部結構域中且來源於VEGF抗體之多肽處於下部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為DLL-4，且抗原B為VEGF。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為DLL-4，且抗原A為VEGF。在一些實施例中，來源於DLL-4抗體之多肽處於下部結構域中且來源於VEGF抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為VEGF，且抗原B為DLL-4。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為VEGF，且抗原A為DLL-4。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合DLL-4及VEGF且包含：第一多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：111之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：112之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：113之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT017a結合DLL-4之同一抗原決定基及VEGF之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT017a包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：297之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：306之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：311之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合DLL-4及VEGF且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：299之VL_A CDR1、SEQ ID NO：300之VL_A CDR2及SEQ ID NO：301之VL_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合DLL-4及VEGF且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：303之VH_B CDR1、SEQ ID NO：304之VH_B CDR2及SEQ ID NO：305之VH_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合DLL-4及VEGF且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：308之VH_A CDR1、SEQ ID NO：309之VH_A CDR2及SEQ ID NO：310之VH_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合DLL-4及VEGF且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：313之VL_B CDR1、SEQ ID NO：314之VL_B CDR2及SEQ ID NO：315之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合DLL-4及VEGF且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：299之VL_A CDR1、SEQ ID NO：300之VL_A CDR2及SEQ ID NO：301之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：303之VH_B CDR1、SEQ ID NO：304之VH_B CDR2及SEQ ID NO：305之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：308之VH_A CDR1、SEQ ID NO：309之VH_A CDR2及SEQ ID NO：310之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：313之VL_B CDR1、SEQ ID NO：314之VL_B CDR2及SEQ ID NO：315之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合DLL-4及VEGF且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：298之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：302之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：307之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：312之序列之VL_B。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合DLL-4及VEGF且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：297之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：306之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：311之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合DLL-4及VEGF，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合Her3與EGFR。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合Her3與EGFR且包含來源於Her3抗體帕曲土單抗及EGFR抗體帕尼單抗之可變重鏈及輕鏈。在一些實施例中，來源於Her3抗體之多肽處於上部結構域中且來源於EGFR抗體之多肽處於下部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為Her3，且抗原B為EGFR。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為Her3，且抗原A為EGFR。在一些實施例中，來源於Her3抗體之多肽處於下部結構域中且來源於EGFR抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為EGFR，且抗原B為Her3。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為EGFR，且抗原A為Her3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含：第一多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：117之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：118之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：119之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT019a結合Her3之同一抗原決定基及EGFR之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT019a包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：335之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：344之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：349之胺基酸序列。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT019b結合Her3之同一抗原決定基及EGFR之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT019b包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：354之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：363之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：368之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO： 337之VL_A CDR1、SEQ ID NO：338之VL_A CDR2及SEQ ID NO：339之VL_A CDR3(例如，FIT019a上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：356之VL_A CDR1、SEQ ID NO：357之VL_A CDR2及SEQ ID NO：358之VL_A CDR3(例如，FIT019b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：341之VH_B CDR1、SEQ ID NO：342之VH_B CDR2及SEQ ID NO：343之VH_B CDR3(例如，FIT019a上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：360之VH_B CDR1、SEQ ID NO：361之VH_B CDR2及SEQ ID NO：362之VH_B CDR3(例如，FIT019b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：346之VH_A CDR1、SEQ ID NO：347之VH_A CDR2及SEQ ID NO：348之VH_A CDR3(例如，FIT019a上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：365之VH_A CDR1、SEQ ID NO：366之VH_A CDR2及SEQ ID NO：367之VH_A CDR3(例如，FIT019b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：351之VL_B CDR1、SEQ ID NO：352之VL_B CDR2及SEQ ID NO：353之VL_B CDR3(例如，FIT019a上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：370之VL_B CDR1、SEQ ID NO：371之VL_B CDR2及SEQ ID NO：372之VL_B CDR3(例如，FIT019b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：337之VL_A CDR1、SEQ ID NO：338之VL_A CDR2及SEQ ID NO：339之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：341之VH_B CDR1、SEQ ID NO：342之VH_B CDR2及SEQ ID NO：343之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：346之VH_A CDR1、SEQ ID NO：347之VH_A CDR2及SEQ ID NO：348之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：351之VL_B CDR1、SEQ ID NO：352之VL_B CDR2及SEQ ID NO：353之VL_B CDR3(例如FIT019a上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：356之VL_A CDR1、SEQ ID NO：357之VL_A CDR2及SEQ ID NO：358之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：360之VH_B CDR1、SEQ ID NO：361之VH_B CDR2及SEQ ID NO：362之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：365之VH_A CDR1、SEQ ID NO：366之VH_A CDR2及SEQ ID NO：367之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：370之VL_B CDR1、SEQ ID NO：371之VL_B CDR2及SEQ ID NO：372之VL_B CDR3(例如FIT019b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：336之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：340之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：345之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：350之序列之VL_B(例如FIT019a上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：355之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：359之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：364之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：369之序列之VL_B(例如FIT019b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：335之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：344之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：349之胺基酸序列(例如FIT019a上之彼等)。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：354之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：363之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：368之胺基酸序列(例如FIT019b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及EGFR，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合PD-1與PD-L1。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合PD-1與PD-L1且包含來源於PD-1抗體尼沃魯單抗及PD-L1抗體1B12之可變重鏈及輕鏈。在一些實施例中，來源於PD-1抗體之多肽處於上部結構域中且來源於PD-L1抗體之多肽處於下部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為PD-1，且抗原B為PD-L1。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為PD-1，且抗原A為PD-L1。在一些實施例中，來源於PD-1抗體之多肽處於下部結構域中且來源於PD-L1抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為PD-L1，且抗原B為PD-1。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為PD-L1，且抗原A為PD-1。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含：第一多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：120之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：121之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：122之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT020a結合PD-1之同一抗原決定基及PD-L1之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT020a包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT020b結合PD-1之同一抗原決定基及PD-L1之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT020b包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：297之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：306之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：311之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：389之VL_A CDR1、SEQ ID NO：390之VL_A CDR2及SEQ ID NO：391之VL_A CDR3(例如，FIT020a上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含SEQ ID NO：375之VL_A CDR1、SEQ ID NO：376之VL_A CDR2及SEQ ID NO：377之VL_A CDR3(例如，FIT020b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：384之VH_B CDR1、SEQ ID NO：385之VH_B CDR2及SEQ ID NO：386之VH_B CDR3(例如，FIT020a上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含SEQ ID NO：379之VH_B CDR1、SEQ ID NO：380之VH_B CDR2及SEQ ID NO：381之VH_B CDR3(例如，FIT020b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：379之VH_A CDR1、SEQ ID NO：380之VH_A CDR2及SEQ ID NO：381之VH_A CDR3(例如，FIT020a上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：384之VH_A CDR1、SEQ ID NO：385之VH_A CDR2及SEQ ID NO：386之VH_A CDR3(例如，FIT020b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：375之VL_B CDR1、SEQ ID NO：376之VL_B CDR2及SEQ ID NO：377之VL_B CDR3(例如，FIT020a上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：389之VL_B CDR1、SEQ ID NO：390之VL_B CDR2及SEQ ID NO：391之VL_B CDR3(例如，FIT020b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：389之VL_A CDR1、SEQ ID NO：390之VL_A CDR2及SEQ ID NO：391之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：384之VH_B CDR1、SEQ ID NO：385之VH_B CDR2及SEQ ID NO：386之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：379之VH_A CDR1、SEQ ID NO：380之VH_A CDR2及SEQ ID NO：381之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：375之VL_B CDR1、SEQ ID NO：376之VL_B CDR2及SEQ ID NO：377之VL_B CDR3(例如FIT020a上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：375之VL_A CDR1、SEQ ID NO：376之VL_A CDR2及SEQ ID NO：377之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：379之VH_B CDR1、SEQ ID NO：380之VH_B CDR2及SEQ ID NO：381之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：384之VH_A CDR1、SEQ ID NO：385之VH_A CDR2及SEQ ID NO：386之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：389之VL_B CDR1、SEQ ID NO：390之VL_B CDR2及SEQ ID NO：391之VL_B CDR3(例如FIT020b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：388之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：383之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：378之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：374之序列之VL_B(例如FIT020a上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：374之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：378之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：383之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：388之序列之VL_B(例如FIT020b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列(例如FIT020a上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：373之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列(例如FIT020b上之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合PD-1及PD-L1，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合Her3與PD-1。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合Her3與PD-1且包含來源於Her3抗體帕曲土單抗及EGFR抗體尼沃魯單抗之可變重鏈及輕鏈。在一些實施例中，來源於Her3抗體之多肽處於上部結構域中且來源於PD-1抗體之多肽處於下部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為Her3，且抗原B為PD-1。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為Her3，且抗原A為PD-1。在一些實施例中，來源於Her3抗體之多肽處於下部結構域中且來源於PD-1抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為PD-1，且抗原B為Her3。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為PD-1，且抗原A為Her3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及PD-1且包含：第一多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：123之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；第二多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：124之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：125之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT022a結合Her3之同一抗原決定基及PD-1之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT022a包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：411之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：420之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：425之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：413之VL_A CDR1、SEQ ID NO：414之VL_A CDR2及SEQ ID NO：415之VL_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及PD-1且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：417之VH_B CDR1、SEQ ID NO：418之VH_B CDR2及SEQ ID NO：419之VH_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及PD-1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：422之VH_A CDR1、SEQ ID NO：423之VH_A CDR2及SEQ ID NO：424之VH_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及PD-1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之VL_B包含SEQ ID NO：427之VL_B CDR1、SEQ ID NO：428之VL_B CDR2及SEQ ID NO：429之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：413之VL_A CDR1、SEQ ID NO：414之VL_A CDR2及SEQ ID NO：415之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：417之VH_B CDR1、SEQ ID NO：418之VH_B CDR2及SEQ ID NO：419之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該 VH_A包含SEQ ID NO：422之VH_A CDR1、SEQ ID NO：423之VH_A CDR2及SEQ ID NO：424之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：427之VL_B CDR1、SEQ ID NO：428之VL_B CDR2及SEQ ID NO：429之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及PD-1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：412之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：416之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：421之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：426之序列之VL_B。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及PD-1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：411之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：420之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：425之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合Her3及PD-1，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合cMet與PD-L1。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合cMet與PD-L1且包含來源於cMet抗體h1332及PD-L1抗體1B12之可變重鏈及輕鏈。在一些實施例中，來源於cMet抗體之多肽處於上部結構域中且來源於PD-L1抗體之多肽處於下部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為cMet，且抗原B為PD-L1。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為cMet，且抗原A為 PD-L1。在一些實施例中，來源於cMet抗體之多肽處於下部結構域中且來源於PD-L1抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為PD-L1，且抗原B為cMet。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為PD-L1，且抗原A為cMet。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT023a結合cMet之同一抗原決定基及PD-L1之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT023a包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：430之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：439之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：444之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及PD-L1且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：432之VL_A CDR1、SEQ ID NO：433之VL_A CDR2及SEQ ID NO：434之VL_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及PD-L1且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：436之VH_B CDR1、SEQ ID NO：437之VH_B CDR2及SEQ ID NO：438之VH_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及PD-L1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：441之VH_A CDR1、SEQ ID NO：442之VH_A CDR2及SEQ ID NO：443之VH_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及PD-L1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：446之VL_B CDR1、SEQ ID NO：447之VL_B CDR2及SEQ ID NO：448之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及PD-L1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：432之VL_A CDR1、SEQ ID NO：433之VL_A CDR2及SEQ ID NO：434之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：436之VH_B CDR1、SEQ ID NO：437之VH_B CDR2及SEQ ID NO：438之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：441之VH_A CDR1、SEQ ID NO：442之VH_A CDR2及SEQ ID NO：443之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：446之VL_B CDR1、SEQ ID NO：447之VL_B CDR2及SEQ ID NO：448之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及PD-L1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：431之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：435之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：440之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：445之序列之VL_B。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及PD-L1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：430之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：439之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：444之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合cMet及PD-L1，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合BTLA與PD-1。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合BTLA與PD-1且包含來源於BTLA抗體6A5及PD-1抗體尼沃魯單抗之可變重鏈及輕鏈。在一些實施例中，來源於BTLA抗體之多肽處於上部結構域中且來源於PD-1抗體之多肽處於下部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為BTLA，且抗原B為PD-1。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VHA-CH1之第三多肽，其中抗原B為BTLA，且抗原A為PD-1。在一些實施例中，來源於BTLA抗體之多肽處於下部結構域中且來源於PD-1抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為PD-1，且抗原B為BTLA。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為PD-1，且抗原A為BTLA。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT024a結合BTLA之同一抗原決定基及PD-1之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT024a包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：449之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：458之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：463之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT024b結合BTLA之同一抗原決定基及PD-1之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT024b包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：468之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：477之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：482之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：451之VL_A CDR1、SEQ ID NO：452之VL_A CDR2及SEQ ID NO：453之VL_A CDR3(例如，FIT024a之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO： 470之VL_A CDR1、SEQ ID NO：471之VL_A CDR2及SEQ ID NO：472之VL_A CDR3(例如，FIT024b之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：455之VH_B CDR1、SEQ ID NO：456之VH_B CDR2及SEQ ID NO：457之VH_B CDR3(例如，FIT024a之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：474之VH_B CDR1、SEQ ID NO：475之VH_B CDR2及SEQ ID NO：476之VH_B CDR3(例如，FIT024b之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：460之VH_A CDR1、SEQ ID NO：461之VH_A CDR2及SEQ ID NO：462之VH_A CDR3(例如，FIT024a之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：479之VH_A CDR1、SEQ ID NO：480之VH_A CDR2及SEQ ID NO：481之VH_A CDR3(例如，FIT024b之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：465之VL_B CDR1、SEQ ID NO：466之VL_B CDR2及SEQ ID NO：467之VL_B CDR3(例如，FIT024a之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：484之VL_B CDR1、SEQ ID NO：485之VL_B CDR2及SEQ ID NO：486之VL_B CDR3(例如，FIT024b之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：451之VL_A CDR1、SEQ ID NO：452之VL_A CDR2及SEQ ID NO：453之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：455之VH_B CDR1、SEQ ID NO：456之VH_B CDR2及SEQ ID NO：457之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：460之VH_A CDR1、SEQ ID NO：461之VH_A CDR2及SEQ ID NO：462之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：465之VL_B CDR1、SEQ ID NO：466之VL_B CDR2及SEQ ID NO：467之VL_B CDR3(例如FIT024a之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：470之VL_A CDR1、SEQ ID NO：471之VL_A CDR2及SEQ ID NO：472之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：474之VH_B CDR1、SEQ ID NO：475之VH_B CDR2及SEQ ID NO：476之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：479之VH_A CDR1、SEQ ID NO：480之VH_A CDR2及SEQ ID NO：481之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：484之VL_B CDR1、SEQ ID NO：485之VL_B CDR2及SEQ ID NO：486之VL_B CDR3(例如FIT024b之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：450之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：454之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：459之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：464之序列之VL_B(例如FIT024a之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：469之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：473之序列之VH_B，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：478之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：483之序列之VL_B(例如FIT024b之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：449之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：458之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：463之胺基酸序列(例如FIT024a之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：468之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：477之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：482之胺基酸序列(例如FIT024b之彼等)。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合BTLA及PD-1，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合CD20與CD22。在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合CD20與CD22且包含來源於CD20抗體奧法木單抗及CD22抗體依帕珠單抗(Epratuzumab)之可變重鏈及輕鏈。在一些實施例中，來源於CD20抗體之多肽處於上部結構域中且來源於CD22抗體之多肽處於下部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為CD20，且抗原B為CD22。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為CD20，且抗原A為CD22。在一些實施例中，來源於CD20抗體之多肽處於下部結構域中且來源於CD22抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為CD22，且抗原B為CD20。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為CD22，且抗原A為CD20。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠與雙特異性結合蛋白質FIT021b結合CD20之同一抗原決定基及CD22之同一抗原決定基，其中該雙特異性結合蛋白質FIT021b包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：392之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：401之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD20及CD22且包含處於第一多肽上之VL_A，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：394之VL_A CDR1、SEQ ID NO：395之VL_A CDR2及SEQ ID NO：396之VL_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD20及CD22且包含處於第一多肽上之VH_B，其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：398之VH_B CDR1、SEQ ID NO：399之VH_B CDR2及SEQ ID NO：400之VH_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD20及CD22且包含處於第二多肽上之VH_A，其中該第二多肽之VH_A包含SEQ ID NO：403之VH_A CDR1、SEQ ID NO：404之VH_A CDR2及SEQ ID NO：405之VH_A CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD20及CD22且包含處於第三多肽上之VL_B，其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：408之VL_B CDR1、SEQ ID NO：409之VL_B CDR2及SEQ ID NO：410之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD20及CD22且包含處於第一多肽上之VL_A及VH_B、處於第二多肽上之VH_A及處於第三多肽上之VL_B，其中該第一多肽之該VL_A包含SEQ ID NO：394之VL_A CDR1、SEQ ID NO：395之VL_A CDR2及SEQ ID NO：396之VL_A CDR3；其中該第一多肽之該VH_B包含SEQ ID NO：398之VH_B CDR1、SEQ ID NO： 399之VH_B CDR2及SEQ ID NO：400之VH_B CDR3；其中該第二多肽之該VH_A包含SEQ ID NO：403之VH_A CDR1、SEQ ID NO：404之VH_A CDR2及SEQ ID NO：405之VH_A CDR3；且其中該第三多肽之該VL_B包含SEQ ID NO：408之VL_B CDR1、SEQ ID NO：409之VL_B CDR2及SEQ ID NO：410之VL_B CDR3。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD20及CD22且包含第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有SEQ ID NO：393之序列之VL_A及具有SEQ ID NO：397之序列之VH_B的第一多肽鏈，其中該結合蛋白質包含第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：402之序列之VH_A，且其中該結合蛋白質包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含具有SEQ ID NO：407之序列之VL_B。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD20及CD22且包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：392之胺基酸序列；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：401之胺基酸序列；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質結合CD20及CD22，且藉由在仍維持與無取代之相應結合蛋白質等效之活性的同時用保守胺基酸取代置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個(包括介於其之間的所有值)胺基酸而來源於本文中所描述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合PD-L1與TIM3。在一些實施例中，來源於PD-L1抗體之多肽處於上部結構域中且來源於TIM3抗體之多肽處於下部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為PD-L1，且抗原B為TIM3。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為PD-L1，且抗原A為TIM3。在一些實施例中，來源於PD-L1抗體之多肽處於下部結構域中且來源於TIM3抗體之多肽處於上部結構域中。舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc之第一多肽、VH_A-CH1之第二多肽及VL_B-CL之第三多肽，其中抗原A為TIM3，且抗原B為PD-L1。再舉例而言，在一些實施例中，結合蛋白質包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc之第一多肽、VL_B-CL之第二多肽及VH_A-CH1之第三多肽，其中抗原B為TIM3，且抗原A為PD-L1。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合T細胞上之一或多個免疫檢查點蛋白質上之一或多個抗原決定基，諸如TIM-3、Lag3、ICOS、BTLA、CD160、2B4、KIR、CD137、CD27、OX40、CD40L及A2aR。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合免疫檢查點路徑所涉及之一或多個腫瘤細胞表面蛋白質上之一或多個抗原決定基，諸如PD-L1、PD-L2、半乳糖凝集素9(Galectin9)、HVEM、CD48、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CD70及CD40。

在一個態樣中，本發明提供醫藥組成物，其包含本文中所描述之結合蛋白質。在一個實施例中，本文提供醫藥組成物，其包含前述申請專利範圍中任一項之結合蛋白質及一或多種醫藥學上可接受之載劑。

在另一態樣中，本發明提供治療或預防有需要之個體之發炎性疾病、自體免疫疾病、神經退化性疾病、癌症、敗血症或脊髓損傷之方法。在一個實施例中，該方法包括向個體投與有效量之一或多種本文中所提供之結合蛋白質，或者一或多種包含本文中所提供之結合蛋白質及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物。本文亦提供本文中所描述之結合蛋白質之用途，其用於製造用以治療或預防發炎性疾病、自體免疫疾病、神經退化性疾病、癌症、脊髓損傷或其他病狀之藥物。在一個實施例中，發炎性疾病、自體免疫疾病、癌症、神經退化性疾病及其他病狀包括但不限於氣喘、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化症、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、感染性疾病及病症，諸如牛皮癬、牛皮癬性關節炎、皮膚炎、全身性硬化、發炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、呼吸窘迫症候群、腦膜炎、腦炎、葡萄膜炎、腎小球性腎炎、濕疹、氣喘、動脈粥樣硬化、白血球黏附力缺乏、雷諾氏症候群(Raynaud's syndrome)、休格倫氏症候群(Sjögren's syndrome)、青少年發作性糖尿病、萊特爾氏病(Reiter's disease)、白塞氏病(Behçet's disease)、免疫複合物性腎炎、IgA腎病、IgM多發性神經病、免疫介導之血小板減少症，諸如急性特發性血小板減少性紫癜及慢性特發性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、重症肌無力、狼瘡性腎炎、異位性皮炎、天疱瘡、格雷夫斯氏病(Graves' disease)、嚴重急性呼吸窘迫症候群、脈絡膜視網膜炎、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、歐門氏症候群(Omenn's syndrome)、慢性腎衰竭、急性感染性單核細胞增多症、HIV、疱疹病毒相關疾病、1型糖尿病、移植物對抗宿主疾病(GVHD)；與移植物移植排斥反應相關之免疫病症；T細胞淋巴瘤、T細胞急性淋巴母細胞性白血病、睪丸血管中心T細胞淋巴瘤、良性淋巴細胞性血管炎、原發性黏液性水腫、惡性貧血、自體免疫性萎縮性胃炎、艾迪生氏病(Addison's disease)、胰島素依賴性糖尿病、古德帕斯徹氏症候群(good pasture's syndrome)、交感性眼炎、特發性血小板減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎、潰瘍性結腸炎、修格連氏症候群、變形性關節炎、多發性肌炎、硬皮病、混合性結締組織病、尋常天疱瘡、類天疱瘡、強直性脊椎炎、再生障礙性貧血、自體免疫性肝炎、腹腔病、皮膚肌炎、古德帕斯徹氏症候群、格林-巴利症候群(Guillain-Barré syndrome)、特發性白血球減少症、特發性血小板減少性紫癜、男性不育症、晶狀體源性葡萄膜炎、原發性黏液腺瘤病、萊特爾氏症候群、僵人症候群、甲狀腺毒症、潰瘍性結腸炎、乳癌、卵巢癌、肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、胰臟癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾臟癌、睪丸癌、胸腺癌、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胚細胞瘤、肉瘤、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚或眼內黑色素瘤、直腸癌、肛門周圍癌、食道癌、小腸癌、內分泌腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、男性/女性生殖道癌、神經癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、肝瘤、胃癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肝癌、肝腫瘤、結腸癌、大腸癌、子宮內膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎癌、陰門癌、甲狀腺癌、妊娠期糖尿病、與纖維蛋白形成相關之慢性血栓栓塞性疾病或病症，包括血管病症，諸如深靜脈血栓形成、動脈血栓形成、中風、腫瘤轉移、血栓溶解、動脈硬化及血管成形術後再狹窄、敗血性休克、敗血病、血壓過低、成人呼吸窘迫症候群(ARDS)、瀰散性血管內凝血病(DIC)、類肉瘤病、動脈硬化、胃潰瘍、胃灼熱、胰臟炎、多囊性卵巢病(POD)、子宮內膜異位症、子宮類纖維瘤、良性前列腺肥大、T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)、體染色體顯性腦動脈血管病變合併皮質下腦梗塞及腦白質病變(CADASIL)、法羅氏四畸形(tetralogy of Fallot，TOF)、Alagille症候群(AS)、黃斑變性及年齡相關黃斑變性病、發炎性纖維化(例如硬皮病、肺纖維化及硬化)、骨關節炎、骨質疏鬆症、氣喘(包括過敏性氣喘)、過敏、慢性阻塞性肺病(COPD)、青少年早發性I型糖尿病、移植物排斥反應及SLE。

在一個實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之類風濕性關節炎、牛皮癬、骨質疏鬆症、中風、肝病或口腔癌之方法，該方法包括向該個體投與本文中所描述之FIT-Ig結合蛋白質，其中該結合蛋白質能夠結合IL-17及IL-20。在另一實施例中，FIT-Ig結合蛋白質包含選自SEQ ID NO：15、25及27之胺基酸序列；及根據SEQ ID NO：21之胺基酸序列；及根據SEQ ID NO：23之胺基酸序列。在另一實施例中，FIT-Ig結合蛋白質包含選自SEQ ID NO：15、25及27之胺基酸序列；及選自SEQ ID NO：29、30及31之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之B細胞癌之方法，該方法包括向該個體投與FIT-Ig結合蛋白質，其中該FIT-Ig結合蛋白質能夠結合一或多個B細胞抗原。在另一實施例中，FIT-Ig結合蛋白質能夠結合CD20。在另一實施例中，FIT-Ig結合蛋白質能夠結合CD20及另一抗原。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合CD3及CD20。在另一實施例中，癌症為B細胞癌。在再另一實施例中，B細胞癌選自由以下組成之群：霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)[NHL]、前驅B細胞淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤、成熟B細胞贅瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤、B細胞前淋巴球性白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、皮膚濾泡中心淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、毛細胞白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、漿細胞瘤、漿細胞骨髓瘤、移植後淋巴增生性病症、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)及退行性大細胞淋巴瘤。在一個實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之B細胞癌之方法，該方法包括向該個體投與FIT-Ig結合蛋白質，其中該FIT-Ig結合蛋白質包含根據SEQ ID NO：41或48之胺基酸序列；及根據SEQ ID NO：44之胺基酸序列；及根據SEQ ID NO：46之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之自體免疫疾病、發炎性疾病或感染之方法，該方法包括向該個體投與本文中所描述之FIT-Ig結合蛋白質，其中該結合蛋白質能夠結合TNF及IL-17。在另一實施例中，FIT-Ig結合蛋白質包含根據SEQ ID NO：87、89及91之序列。在另一實施例中，本發明提供治療或預防自體免疫或發炎性疾病之方法，該方法包括向該個體投與FIT-Ig結合蛋白質，其中該結合蛋白質能夠結合TNF及IL-17，且其中該自體免疫或發炎性疾病選自由以下組成之群：克羅恩氏病、牛皮癬(包括斑塊狀牛皮癬)、關節炎(包括類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、骨關節炎或青少年特發性關節炎)、多發性硬化症、強直性脊椎炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡、葡萄膜炎、敗血症、神經退化性疾病、神經元再生、脊髓損傷、原發性及轉移性癌症、呼吸病症；氣喘；過敏性及非過敏性氣喘；因感染所致之氣喘；因感染呼吸道融合病毒(RSV)所致之氣喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及氣道發炎之病狀；嗜酸性球增多症；纖維化及過量黏液產生；囊腫性纖維化；肺纖維化；異位性病症；異位性皮炎；蕁麻疹；濕疹；過敏性鼻炎；過敏性腸胃炎；皮膚之發炎性及/或自體免疫病狀；胃腸器官之發炎性及/或自體免疫病狀；發炎性腸病(IBD)；潰瘍性結腸炎；肝臟之發炎性及/或自體免疫病狀；肝硬化；肝纖維化；及由B型及/或C型肝炎病毒引起之肝纖維化；硬皮病。在另一實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之癌症之方法，該方法包括向該個體投與本文中所描述之FIT-Ig結合蛋白質，其中該結合蛋白質能夠結合TNF及IL--17。在另一實施例中，癌症為肝細胞癌；膠質母細胞瘤；淋巴瘤；或霍奇金氏淋巴瘤。在另一實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之感染之方法，該方法包括向該個體投與本文中所描述之FIT-Ig結合蛋白質，其中該感染為病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染、HTLV-1感染。在一個實施例中，本發明提供抑制保護性1型免疫反應之表現及抑制接種疫苗期間保護性1型免疫反應之表現的方法。

在一個實施例中，本發明提供治療有需要之個體之類風濕性關節炎之方法，該方法包括向該個體投與FIT-Ig結合蛋白質，其中該結合蛋白質包含根據SEQ ID NO：87、89及91之序列。

在一個實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之癌症之方法，該方法包括向該個體投與本文中所描述之FIT-Ig結合蛋白質，其中該結合蛋白質能夠結合CTLA-4及PD-1。在另一實施例中，FIT-Ig結合蛋白質包含有包含SEQ ID NO：92、95及97之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之癌症之方法，其中結合蛋白質能夠結合CTLA-4及PD-1，且其中癌症為典型地對免疫療法有反應之癌症。在另一實施例中，癌症為尚未與免疫療法相關聯之癌症。在另一實施例中，癌症為難治性或復發性惡性癌症。在另一實施例中，結合蛋白質抑制腫瘤細胞之生長或存活。在另一實施例中，癌症選自由以下組成之群：黑色素瘤(例如轉移性惡性黑色素瘤)、腎癌(例如透明細胞癌)、前列腺癌(例如激素難治性前列腺腺癌)、胰臟腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、白血病、淋巴瘤及其他贅生性惡性病。

在一個實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之黑色素瘤之方法，該方法包括向該個體投與本文中所描述之FIT-Ig結合蛋白質，其中該結合蛋白質能夠結合CTLA-4及PD-1。在另一實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之黑色素瘤之方法，其中該方法包括向該個體投與FIT-Ig結合蛋白質，該結合蛋白質包含根據SEQ ID NO：92、95及97之胺基酸序列。

在另一實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之感染或感染性疾病之方法，該方法包括向該個體投與本文中所描述之FIT-Ig 結合蛋白質，其中該結合蛋白質能夠結合CTLA-4及PD-1。在一個實施例中，FIT-Ig結合蛋白質單獨或與疫苗組合投與，以刺激對病原體、毒素及自體抗原之免疫反應。因此，在一個實施例中，本文中所提供之結合蛋白質可用於刺激對可感染人類之病毒的免疫反應，該等病毒為諸如(但不限於)人類免疫缺乏病毒、A類、B類及C類肝炎病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus)、人類細胞巨大病毒、人類乳頭狀瘤病毒、疱疹病毒、細菌、寄生性真菌或其他病原體。

圖1A顯示由三個構築體構成之諸如FIT1-Ig、FIT2-Ig及FIT3-Ig之FIT-Ig之結構。圖1B顯示用於製備此種FIT1-Ig之三個構築體。

圖2A顯示由兩個構築體構成之FIT-Ig之基本結構。圖2B顯示用於製備此種FIT-Ig之兩個構築體。

圖3A及圖3B提供如藉由Biacore量測之FIT1-Ig之雙重特異性抗原結合。圖3A顯示Biacore結合分析法之結果，其中首先藉由IL-17、繼而藉由IL-20使FIT1-Ig飽和。圖3B顯示Biacore分析法之結果，其中首先藉由IL-20、繼而藉由IL-17使FIT1-Ig飽和。

圖4A及圖4B顯示如藉由PEG誘導之沈澱所量測之抗IL-17/IL-20 FIT Ig或單株抗體利妥昔單抗(rituximab)在一定範圍之pH值下之溶解度。

圖5A及圖5B顯示如藉由ELISA所評定之FIT10-Ig或親本抗體伊匹單抗及尼沃魯單抗與CTLA-4(圖5A)或PD-1(圖5B)之結合。

圖6顯示對針對CTLA-4及PD-1兩者之FIT10-Ig的多重結合研究。顯示依序與CTLA-4及PD-1結合以及依序與PD-1及CTLA-4結合如圖6中所指示。

圖7A至圖7I顯示FIT12a-Ig(EGFR/PD-L1；圖7A)、FIT13a-Ig(cMet/EGFR；圖7B)、FIT14-Ig(因子IXa/因子X；圖7C)、FIT16a-Ig(Her3/IGF-1R；圖7D)、FIT17a-Ig(DLL-4/VEGF；圖7E)、FIT18a-Ig(CD20/CD3；圖7F)、FIT19a-Ig(Her3/EGFR；圖7G)、FIT20a-Ig(PD-1/PD-L1；圖7H)及FIT22a-Ig(Her3/PD-1；圖7I)之SEC型態。

圖8顯示對針對cMet及EGFR兩者之FIT13a-Ig的多重結合研究。

圖9A及圖9B顯示如藉由ELISA所評定之NBSR或親本抗體尼沃魯單抗與PD-1(圖9A)或CTLA-4(圖9B)之結合。包括人類IgG1作為對照。

圖10顯示對針對CTLA-4及PD-1兩者之NBS3的多重結合研究。顯示依序與CTLA-4及PD-1結合以及依序由PD-1及CTLA-4結合兩者均如所指示。

圖11A顯示經靜脈內(IV)或皮下(SC)投與之5mg/kg NBS3之平均血清濃度-時間型態。圖11B提供此研究之詳細PK參數。

圖12顯示NBS3、NBS3-C、NBS3R-C與親本抗體尼沃魯單抗相比之基於細胞之受體阻斷分析。包括人類IgG4作為對照。

圖13A顯示NBS3、NBS3-C及NBS3R-C在MLR分析中在0、0.01、0.1、1或10μg/ml之濃度下當與親本抗體尼沃魯單抗相比時之功能活性。針對各抗體量測對IFN-γ之誘導。包括人類IgG作為對照。圖13B顯示此等抗體對IL-2之誘導。

圖14顯示NBS3、NBS3-C及NBS3R-C在PBMC SEB刺激分析中在0.016、0.08、0.4、2或10μg/mL之濃度下當與親本抗體伊匹單抗相比時之功能活性。藉由ELISA來偵測上清液中之IL-2細胞因子產生。

圖15顯示對針對EGFR及PD-L1兩者之FIT012b的多重結合研究。顯示依序與人類EGFR及人類PD-L1結合以及依序由人類PD-L1及人類EGFR結合兩者均如所指示。

圖16A及圖16B顯示對針對人類EGFR及人類PD-L1兩者之FIT012d之多重結合研究。顯示依序與人類EGFR及人類PD-L1結合(圖16A)以及依序由人類PD-L1及人類EGFR結合(圖16B)兩者均如所指示。

圖17顯示對針對cMet及EGFR兩者之FIT013a的多重結合研究。顯示依序與cMet及EGFR結合以及依序由EGFR及cMet結合兩者均如所指示。

圖18A至圖18C顯示測試FIT013a與膜c-Met及EGFR之結合活性的FACS分析。圖18A(右圖)顯示如藉由BD FACSVerse流式細胞儀所量測之與MKN-45細胞之雙重結合。圖18A(左圖)指示在MKN-45細胞中，c-Met之膜表現水準遠遠高於EGFR，故FIT013a及FIT013a-Fab之c-Met結合位點可被膜c-Met佔據，從而可藉由經生物素標記之EGFR來偵測FIT013a及FIT013a-Fab之游離EGFR結合位點。圖18B(右圖)顯示如藉由BD FACSVerse流式細胞儀所量測之與SGC-7901細胞之雙重結合。圖18B(左圖)指示在SGC-7901細胞中，EGFR之膜表現水準遠遠高於c-Met，故FIT013a及FIT013a-Fab之EGFR結合位點可被膜EGFR佔據，從而可藉由經生物素標記之c-Met來偵測FIT013a及FIT013a-Fab之游離c-Met結合位點。圖18C(右圖)顯示如藉由BD FACSVerse流式細胞儀所量測之與NCI-H1975細胞之雙重結合。圖18C(左圖)指示在NCI-H1975細胞中，c-Met之膜表現水準等於EGFR，因此FIT013a及FIT013a-Fab之c-Met結合位點及EGFR結合位點同時被佔據，且無法偵測到FIT013a及FIT013a-Fab之游離EGFR結合位點或c-Met結合位點。

圖19顯示FIT013a在NCI-H292細胞中抑制HGF誘導之AKT磷酸化之能力。將FIT013a、h1332、帕尼單抗、h1332/帕尼單抗之組合及人類IgG1添加至細胞中且培育30分鐘，接著向分析盤中添加40ng/mlHGF後維持5分鐘。使細胞溶解且藉由ERK磷酸化T202/Y204套組來偵測AKT磷酸化。

圖20顯示如藉由AKT磷酸化所量測之FIT013a在不存在HGF之情況下的促效劑效應。將連續稀釋之FIT013a或其他Ab(h1332、h1332/帕尼單抗之組合、恩妥珠單抗(emibetuzumab)、9.1.2及人類IgG1)添加至細胞中且培育30分鐘。使細胞溶解且藉由ERK磷酸化T202/Y204套組來偵測AKT磷酸化。

圖21A顯示5mg/kg之靜脈內劑量之後FIT013a(c-met/EGFR)在雄性SD大鼠(N=4/時間點，c-met盤)中之個別血清濃度-時間型態。圖21B顯示5mg/kg之皮下劑量之後FIT013a(c-met/EGFR)在雄性SD大鼠(N=4/時間點，c-met盤)中之個別血清濃度-時間型態。圖21C顯示 5mg/kg之靜脈內劑量之後FIT013a(c-met/EGFR)在雄性SD大鼠(N=4/時間點，EGFR盤)中之個別血清濃度-時間型態。圖21D顯示5mg/kg之皮下劑量之後FIT013a(c-met/EGFR)在雄性SD大鼠(N=4/時間點，EGFR盤)中之個別血清濃度-時間型態。

圖22顯示FIT013a、帕尼單抗及H1332在接種NCI-H1975-HGF腫瘤細胞之裸BALB/c小鼠(N=3隻動物/組)中之血清及腫瘤中之分佈。

圖23顯示FIT013a、帕尼單抗、H1332、媒劑在抑制接種NCI-H1975-HGF腫瘤細胞之裸BALB/c小鼠(N=8隻動物/組)中之腫瘤尺寸方面之效力。每週兩次經腹膜內給與該等抗體，持續三週。FIT013a之劑量為16mg/kg，H1332或帕尼單抗之劑量為10mg/kg。

圖24顯示使用BIOPHEN FVIII：C套組(Hyphen-Biomed)對因子VIIIa樣活性之酶分析。對含有mAb FIX、mAb FX、mAb FIX與mAb FX之組合、恩西珠單抗(Emicizumab)、FIT014a及經純化FVIIIa之樣品進行分析。

圖25顯示對針對FIX及FX兩者之FIT014a的多重結合研究。顯示依序與FIX及FX結合以及依序由FX及FIX結合兩者均如所指示。

圖26顯示經靜脈內(IV)或皮下(SC)投與之5mg/kg FIT014a在hIgG盤或因子X盤上之平均血清濃度-時間型態。藉由ELISA以62.5ng/mL之LLOQ偵測大鼠血清樣品中之抗體濃度。在hIgG盤上，塗佈蛋白質為抗hIgG Fc，且偵測抗體為抗hIgG Fab。在因子X盤上，塗佈蛋白質為因子X，而偵測抗體為抗人類IgG Fc。

圖27顯示對針對Her3及IGF1R兩者之FIT016a之多重結合研究。顯示依序與Her3及IGF1R結合以及依序由IGF1R及Her3結合兩者均如所指示。

圖28顯示對針對DLL4及VEGF兩者之FIT017a之多重結合研究。顯示依序與DLL4及VEGF結合以及依序由VEGF及DLL4結合兩者均如所指示。

圖29A及圖29B顯示對FIT018a與其相關親本抗體(CD3 mAb、奧法木單抗及CD3 mAb與奧法木單抗之組合)及人類IgG1相比與人類B細胞及人類T細胞上之CD20及CD3結合之能力進行的基於細胞之FACS結合分析。在圖29A之分析中，使用人類B細胞株Raji。在圖29B之分析中，使用人類T細胞株Jurkat。

圖30A顯示對FIT018a與奧法木單抗(CD20)及抗RAC人類IgG1相比與石蟹瀰猴CD20細胞結合之能力進行的基於細胞之FACS結合分析。圖30B顯示對FIT018a與奧法木單抗(CD20)、CD3 mAb相比與石蟹瀰猴T細胞結合之能力進行的基於細胞之FACS結合分析。

圖31A及圖31B顯示如在B細胞耗竭分析中所量測之FIT018a、奧法木單抗、CD3 mAb及奧法木單抗與CD3 mAb之組合(1：1)在第2天(圖31A)及第3天(圖31B)在誘導人類B細胞(Raji)之細胞凋亡方面的能力。

圖32顯示對針對Her3及EGFR兩者之FIT019a之多重結合研究。顯示依序與Her3及EGFR結合以及依序由EGFR及Her3結合兩者均如所指示。

圖33A及圖33B顯示對針對Her3及hEGFR兩者之FIT019b之多重結合研究。顯示依序與EGFR及Her3結合(圖33A)以及依序由Her3及EGFR結合(圖33B)兩者均如所指示。

圖34A顯示如由所誘導之IL-2之水準所度量之FIT020b當與親本抗體尼沃魯單抗、1B12及尼沃魯單抗與1B12之組合(1：1)相比時在0、0.01、0.1、1、10或100nM之濃度下在MLR分析中之功能活性。圖34B顯示此等抗體在0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30及100nM之濃度下的IL-2誘導。

圖35顯示對針對PD-L1及PD-1兩者之FIT020b之多重結合研究。顯示依序與PD-L1及PD-1結合以及依序由PD-1及PD-L1結合兩者均如所指示。

圖36A及圖36B顯示對FIT021b與其相關親本抗體(奧法木單抗、依帕珠單抗及奧法木單抗與依帕珠單抗之組合(1：1))及人類IgG1相比與人類B細胞結合之能力進行的基於細胞之FACS結合分析。在圖36A之分析中，使用人類B細胞株Raji。在圖36B之分析中，使用人類B細胞株Daudi。

圖37顯示對針對Her3與人類PD-1兩者之FIT022a之多重結合研究。顯示依序與Her3及人類PD-1結合以及依序由人類PD-1及Her3結合兩者均如所指示。

圖38A顯示FIT022a當與親本抗體尼沃魯單抗及帕曲土單抗相比時在0、0.01、0.1、1或10μg/ml之濃度下在MLR分析中之功能活性。量測各抗體之LI-2誘導。包括人類IgG1及人類IgG4作為對照。圖38B顯示此等抗體對IFN-γ之誘導。

圖39A及圖39B顯示對針對cMet-his與PD-L1-his兩者之FIT023a之多重結合研究。顯示依序與cMet-his及PD-L1-his結合(圖39A)以及依序由PD-L1-his及cMet-his結合(圖39B)兩者均如所指示。

圖40A及圖40B顯示對針對BTLA-his與PD1-his兩者之FIT024a之多重結合研究。顯示依序與BTLA-his及PD1-his結合(圖40A)以及依序由PD1-his及BTLA-his結合(圖40B)兩者均如所指示。

圖41A及圖41B顯示對針對BTLA-his與PD1-his兩者之FIT024b之多重結合研究。顯示依序與BT：A-his及PD1-his結合(圖41A)以及依序由PD1-his及BTLA-his結合(圖41B)兩者均如所指示。

圖42A顯示如由所誘導之IL-2之水準所量度之FIT024a及FIT024b當與親本抗體尼沃魯單抗相比時在0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30或100nM之濃度下在MLR分析中之功能活性。包括人類IgG1作為對照。圖42B顯示此等抗體在0、0.01、0.1、1、10或100之濃度下的IL-2誘導。

本發明係關於多價及多特異性結合蛋白質、製造該等結合蛋白質之方法，及其預防及/或治療急性及慢性發炎性疾病及病症、癌症及其他疾病之用途。本發明有關能夠結合兩個或更多個抗原之多價及/或多特異性結合蛋白質。特定言之，本發明係關於Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)及其醫藥組成物，以及用於製造此種FIT-Ig之核酸、重組表現載體及宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本發明之FIT-Ig在活體外或活體內偵測特定抗原之方法。

本文所提供之結合蛋白質之新穎家族能夠結合兩個或更多個抗原，例如，以高親和力。特定言之，本發明提供一種使用以下2個親本單株抗體來構築雙特異性結合蛋白質之方法：結合抗原a之mAb A；及結合抗原b之mAb B。

在一個態樣中，本發明提供一種結合蛋白質，其包含對第一抗原或抗原決定基具特異性之可變輕鏈、第一輕鏈恆定域、對第二抗原或抗原決定基具特異性之可變重鏈、第一重鏈CH1、對第一抗原或抗原決定基具特異性之可變重鏈、第二重鏈CH1、對第二抗原或抗原決定基具特異性之可變重鏈，及第二輕鏈恆定域。在一個實施例中，結合蛋白質進一步包含Fc區。結合蛋白質可進一步包含連接結合蛋白質之組分中之兩種或更多種之一或多個胺基酸或多肽連接子。舉例而言，結合蛋白質可包含將輕鏈可變區連接至輕鏈恆定區之多肽連接子。

在一個實施例中，本發明提供一種包含多肽鏈之結合蛋白質，該多肽鏈包含VL_A-CL-(X1)n-VH_B-CH1-(X2)n，其中VLA為mAb A之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，X1表示胺基酸或寡肽連接子，VH_B為mAb B之重鏈可變域，CH1為重鏈之第一恆定域，X2表示Fc區或不同的二聚域，且n為0或1。

在一個實施例中，本發明提供一種包含三個不同的多肽鏈之結合蛋白質(圖1A及圖1B)，其中第一多肽鏈(1號構築體)包含VL_A-CL-(X1)n-VH_B-CH1-(X2)n，其中VLA為mAb A之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，X1表示胺基酸或寡肽連接子，VH_B為mAb B之重鏈可變域，CH1為重鏈之第一恆定域，X2表示Fc區或不同的二聚域，且n為0或1。第二多肽鏈(2號構築體)包含VH_A-CH1，其中VH_A為mAb A之重鏈可變域，且CH1為重鏈之第一恆定域。第三多肽鏈(3號構築體)包含VL_B-CL，其中VL_B為mAb B之輕鏈可變域，且CL為輕鏈之恆定域。

在另一實施例中，本發明提供一種結合蛋白質，其包含整體分子設計類似於先前實施例但可變域之次序被逆轉的三個不同的多肽鏈。在該實施例中，第一多肽鏈包含VH_B-CH1-(X1)n-VL_A-CL-(X2)n，其中VL_A為mAb A之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，X1表示胺基酸或寡肽連接子，VH_B為mAb B之重鏈可變域，CH1為重鏈之第一恆定域，X2表示Fc區或不同的二聚域，且n為0或1。第二多肽鏈包含VH_A-CH1，其中VH_A為mAb A之重鏈可變域且CH1為重鏈之第一恆定域。第三多肽鏈包含VL_B-CL，其中VL_B為mAb B之輕鏈可變域且CL為輕鏈之恆定域。

在另一實施例中，本發明提供一種包含兩個不同的多肽鏈之結合蛋白質(圖2A及圖2B)，其中第一多肽鏈(1號構築體)包含VL_A-CL-(X1)n-VH_B-CH1-(X2)n，其中VL_A為mAb A之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，X1表示胺基酸或寡肽連接子，VH_B為mAb B之重鏈可變域，CH1為重鏈之第一恆定域，X2表示Fc區或不同的二聚域，且n為0或1。第二多肽鏈(4號構築體)包含VH_A-CH1-(X3)n-VL_B-CL，其中VH_A為mAb A之重鏈可變域，CH1為重鏈之第一恆定域，X3表示並非恆定域之胺基酸或多肽，n為0或1，VL_B為mAb B之輕鏈可變域，且CL為輕鏈之恆定域。

在另一實施例中，本發明提供一種結合蛋白質，其包含整體分子設計類似於先前實施例但可變域之次序被逆轉之兩個多肽鏈。在此實施例中，第一多肽鏈包含VH_B-CH1-(X1)n-VL_A-CL-(X2)n，其中VL_A為mAb A之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，X1表示胺基酸或寡肽連接子，VH_B為mAb B之重鏈可變域，CH1為重鏈之第一恆定域，X2表示Fc區或不同的二聚域，且n為0或1。第二多肽鏈包含VL_B-CL-(X3)n-VH_A-CH1，其中VH_A為mAb A之重鏈可變域，CH1為重鏈之第一恆定域，X3表示胺基酸或寡肽連接子，n為0或1，VL_B為mAb B之輕鏈可變域，且CL為輕鏈之恆定域。

在一個實施例中，結合蛋白質中之VH及VL域選自由以下組成之群：鼠類重/輕鏈可變域、完全人類重/輕鏈可變域、CDR接枝重/輕鏈可變域、人類化重/輕鏈可變域，及其混合物。在一較佳實施例中，VH_A/VL_A 及VH_B/VL_B能夠結合相同的抗原。在另一實施例中，VH_A/VL_A及VH_B/VL_B能夠結合不同的抗原。

在一個實施例中，第一多肽鏈包含VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc，且第一多肽鏈之CL及VH_B直接融合在一起。在另一實施例中，CL及VH_B係由胺基酸或寡肽連接子連接。在另一實施例中，第一多肽鏈包含VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc，且CH1及VL_A直接融合在一起。在另一實施例中，CH1及VL_A係由胺基酸或寡肽連接子連接。在另一實施例中，寡肽或多肽連接子包含1個或多個具有提供可撓性之任何合理序列之胺基酸。連接子較佳選自由以下組成之群：G、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS(SEQ ID NO：489)、SGGG(SEQ ID NO：490)、GGGGS(SEQ ID NO：491)、GGGGSGS(SEQ ID NO：492)、GGGGSGGS(SEQ ID NO：493)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：494)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：495)、AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO：496)、AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：497)、AKTTPKLGG(SEQ ID NO：498)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO：499)、SAKTTP(SEQ ID NO：500)、RADAAP(SEQ ID NO：501)、RADAAPTVS(SEQ ID NO：502)、RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO：503)、RADAAAA(G₄S)₄(SEQ ID NO：504)SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：505)、ADAAP(SEQ ID NO：506)、ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO：507)、TVAAP(SEQ ID NO：508)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：509)、QPKAAP(SEQ ID NO：510)、QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO：511)、AKTTPP(SEQ ID NO：512)、AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO：513)、AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO：514)、ASTKGP(SEQ ID NO：515)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO：516)、GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO：517)、GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO：518)、GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO：519)及AKTTAP(SEQ ID NO：80)。在一個實施例中，連接子之胺基酸序列可選自由SEQ ID NO.26、28及49-86組成之群。在一個實施例中，連接子為GSG(SEQ ID NO：26)或GGGGSGS(SEQ ID NO：28)。連接子亦可為活體內可裂解肽連接子、蛋白酶(諸如MMP)敏感性連接子、如先前所描述之可藉由還原等而裂解之基於二硫鍵之連接子(Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals： Applications and Challenges,Stefan R.Schmidt編)或此項技術中已知的任何可裂解連接子。該等可裂解連接子可用於在活體內釋放最高Fab以用於各種目的，以便改良組織/細胞穿透及分佈、增強與標靶之結合、減小潛在副作用，以及調節2個不同的Fab區之活體內功能及物理半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質包含Fc區。如本文所用，術語「Fc區」係指IgG重鏈之C端區。含有人類IgG1 Fc區之胺基酸序列之一實例為SEQ ID NO：20。IgG之Fc區包含兩個恆定域，即CH2及CH3。

在一個實施例中，Fc區為變異Fc區。在一個實施例中，變異Fc區相對於親本Fc區具有一或多個胺基酸修飾，諸如取代、缺失或插入。在另一實施例中，Fc區之胺基酸修飾相對於親本Fc區活性改變效應功能活性。舉例而言，在一個實施例中，變異Fc區可具有改變(亦即，增加或減小)之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體介導之細胞毒性(CDC)、吞噬作用、調理作用或細胞結合。在另一實施例中，Fc區之胺基酸修飾相對於親本Fc區可改變(亦即，增加或減小)變異Fc區對FcγR之親和力。舉例而言，變異Fc區可改變對FcγRI、FcγRII、FcγRIII之親和力。

在一個較佳實施例中，本文所提供之結合蛋白質能夠結合一或多個標靶。在一個實施例中，標靶選自由細胞因子、細胞表面蛋白質、酶及受體組成之群。結合蛋白質較佳能夠調節一或多個標靶之生物功能。結合蛋白質更佳能夠中和一或多個標靶。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合選自由淋巴因子、單核因子及多肽激素組成之群的細胞因子。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合選自由以下組成之群的細胞因子對：IL-1α與IL-1β；IL-12與IL-18、TNFα與IL-23、TNFα與IL-13；TNF與IL-18；TNF與IL-12；TNF與IL-1β；TNF與MIF；TNF與IL-6、TNF與IL-6受體、TNF與IL-17；IL-17與IL-20；IL-17與IL-23；TNF與IL-15；TNF與VEGF；VEGFR與EGFR；IL-13與IL-9；IL-13與IL-4；IL-13與IL-5；IL-13與IL-25；IL-13與TARC；IL-13與MDC；IL-13與MIF；IL-13與TGF-β；IL-13與LHR促效劑；IL-13與CL25；IL-13與SPRR2a；IL-13與SPRR2b；IL-13與ADAM8；與TNFα與PGE4、IL-13與PED2、TNF與PEG2。

在另一實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合選自由以下組成之群的標靶對：CD137與CD20、CD137與EGFR、CD137與Her-2、CD137與PD-1、CD137與PDL-1、VEGF與PD-L1、Lag-3與TIM-3、OX40與PD-1、TIM-3與PD-1、TIM-3與PDL-1、EGFR與DLL-4、VEGF與EGFR、HGF與VEGF、VEGF與VEGF(相同或不同的抗原決定基)、VEGF與Ang2、EGFR與cMet、PDGF與VEGF、VEGF與DLL-4、OX40與PD-L1、ICOS與PD-1、ICOS與PD-L1、Lag-3與PD-1、Lag-3與PD-L1、Lag-3與CTLA-4、ICOS與CTLA-4、CD138與CD20；CD138與CD40；CD19與CD20；CD20與CD3；CD3與CD33；CD3與CD133；CD38與CD138；CD38與CD20；CD20與CD22；CD38與CD40；CD40與CD20；CD47與CD20、CD-8與IL-6；CSPGs與RGM A；CTLA-4與BTNO2；CTLA-4與PD-1；IGF1與IGF2；IGF1/2與Erb2B；IGF-1R與EGFR；EGFR與CD13；IGF-1R與ErbB3；EGFR-2與IGFR；Her2與Her2(相同或不同的抗原決定基)；因子IXa與因子X、VEGFR-2與Met；VEGF-A與血管生成素-2(Ang-2)；IL-12與TWEAK；IL-13與IL-1β；MAG與RGM A；NgR與RGM A；NogoA與RGM A；OMGp與RGM A；PDL-1與CTLA-4；PD-1與CTLA-4、PD-1與TIM-3；RGM A與RGM B；Te38與TNFα；TNFα與Blys；TNFα與CD-22；TNFα與CTLA-4結構域；TNFα與GP130；TNFα與IL-12p40；TNFα與RANK配位體；EGFR與PD-L1；EGFR與cMet；Her3與IGF-IR；DLL-4與VEGF；PD-1與PD-L1；Her3與PD-1、Her3與EGFR、cMet與PD-L1及BTLA與PD-1。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於CD20抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於奧法木單抗、利妥昔單抗、碘i 131托西莫單抗(tositumomab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、伊妥莫單抗(ibritumomab)及美國專利第9228008號、第8206711號、第7682612號、第8562992號、第7799900號、第7422739號、第7850962號、第8097713號、第8057793號、第8592156號、第6652852號、第6893625號、第6120767號、第8084582號、第8778339號、第9184781號、第7381560號、第8101179號、第9382327號、第7151164號、第7435803號、第8529902號、第9416187號、第7812116 號、第8329181號、第8034902號、第9289479號、第9234045號、第4987084號、第9173961號、第9175086號、第6410319號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於CD3抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於莫羅單抗(muromonab)-CD3、奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab)及維西珠單抗(visilizumab)，以及美國專利第8569450號、第7635472號、第5585097號、第6706265號、第5834597號、第9056906號、第9486475號、第7728114號、第8551478號、第9226962號、第9192665號、第9505849號、第8394926號、第6306575號、第5795727號、第8840888號、第5627040號、第9249217號、第8663634號、第6491917號、第5877299號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於CTLA-4抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於伊匹單抗及美國專利第5434131號、第5968510號、第5844095號、第7572772號、第6090914號、第7311910號、第5885796號、第5885579號、第5770197號、第5851795號、第5977318號、第7161058號、第6875904號、第7504554號、第7034121號、第6719972號、第7592007號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於PD-1抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於噴羅珠單抗(pembrolizumab)、尼沃魯單抗、阿替珠單抗(atezolizumab)及美國專利第8741295號、第7029674號、第7722868號、第9243052號、第8927697號、第9181342號、第8552154號、第9102727號、第9220776號、第9084776號、第8008449號、第9387247號、第9492540號、第8779105號、第9358289號、第9492539號、第9205148號、第8900587號、第8952136號、第8460886號、第7414171號、第8287856號、第8580247號、第7488802號、第7521051號、第8088905號、第7709214號、第8617546號、第9381244號、第8993731號、第8574872號、第7432059號、第8216996號、第9499603號、第9102728號、第9212224號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於PD-L1抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於度伐魯單抗(durvalumab)、阿維魯單抗(avelumab)及美國專利第8741295號、第9102725號、第8168179號、第8952136號、第8552154號、第8617546號、第9212224號、第8217149號、第8383796號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於EGFR抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗、凡德他尼(vandetanib)、奈昔木單抗(necitumumab)、奧斯替尼(osimertinib)及美國專利第7723484號、第9044460號、第9226964號、第8658175號、第7618631號、第8748175號、第9499622號、第9527913號、第9493568號、第8580263號、第7514240號、第9314536號、第9051370號、第9233171號、第9029513號、第8592152號、第8597652號、第9327035號、第8628773號、第9023356號、第9132192號、第8637026號、第9283276號、第9540440號、第9545442號、第8758756號、第9120853號、第7981605號、第8546107號、第7598350號、第5212290號、第8017321號、第7589180號、第9260524號、第8790649號、第9125896號、第9238690號、第8071093號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於TIM3(CD366)抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於4C4G3、7D3、B8.2C12、F38-2E2及美國專利第8841418號、第8552156號、第9556270號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於cMet抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於h1332、71-8000、ab74217及美國專利第8673302號、第9120852號、第7476724號、第7892550號、第9249221號、第9535055號、第9487589號、第8329173號、第9101610號、第8101727號、第9068011號、第9260531號、第9296817號、第8481689號、第8546544號、第8563696號、第8871909號、第8889832號、第8871910號、第9107907號、第8747850號、第9469691號、第8765128號、第8729249號、第8741290 號、第8637027號、第8900582號、第9192666號、第9201074號、第9505843號、第8821869號、第8163280號、第7498420號、第8562985號、第8545839號、第9213031號、第9213032號、第8217148號、第8398974號、第9394367號、第9364556號、第8623359號、第9011865號、第9375425號、第9233155號、第9169329號、第9150655號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於因子IXa抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於ab97619、ab128048、ab128038及美國專利第7279161號、第7033590號、第4786726號、第6624295號、第7049411號、第7297336號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於因子X抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於PA5-22059、ab97632、B122M。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於Her3(ErbB3)抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於度利妥單抗(duligotumab)、依根妥單抗(elgemtumab)、盧瑞妥珠單抗(lumretuzumab)、帕曲土單抗、斯利班妥單抗(seribantumab)及美國專利第9346883號、第9321839號、第8859737號、第8362215號、第8828388號、第9220775號、第9217039號、第9527913號、第9085622號、第9192663號、第8735551號、第9011851號、第7846440號、第9284380號、第8791244號、第8691225號、第9487588號、第8961966號、第9034328號、第5968511號、第9346889號、第9217039號、第9346890號中所描述之抗體。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於IGF-1R(CD221)抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於西妥木單抗(cixutumumab)、達洛珠單抗(dalotuzumab)、芬妥木單抗(芬妥木單抗)、加尼妥單抗(ganitumab)、羅妥木單抗(robatumumab)、替妥木單抗(teprotumumab)及美國專利第7572897號、第7579157號、第7968093號、第7638605號、第7329745號、第7037498號、第7982024號、第8642037號、第7700742號、第9234041號、第7815907號、第8945871號、第8361461號、第9056907號、第8168410 號、第7241444號、第7914784號、第9150644號、第7985842號、第7538195號、第8268617號、第8034904號、第8344112號、第7553485號、第8101180號、第8105598號、第7824681號、第8124079號、第8420085號、第7854930號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於DLL4抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於登西珠單抗、依諾蘇單抗(enoticumab)、奈西珠單抗(navicixizumab)及美國專利第9469689號、第9115195號、第8623358號、第9132190號、第9469688號、第9403904號、第8663636號、第8192738號、第750124中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於VEGF抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於貝伐珠單抗、布洛珠單抗(Brolucizumab)、雷尼珠單抗及美國專利第8921537號、第7910098號、第7365166號、第7060269號、第7169901號、第6884879號、第7297334號、第7375193號、第9388239號、第8834883號、第8287873號、第7998931號、第8007799號、第7785803號、第9102720號、第8486397號、第6730489號、第6383484號、第9441034號、第7097986號、第9079953號、第8945552號、第8236312號、第7740844號、第6403088號、第9018357號、第8975381號、第7691977號、第7758859號、第8512699號、第8492527號、第9353177號、第8092797號、第7811785號、第8101177號、第8592563號、第9090684號、第8349322號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於CD22抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於貝妥莫單抗(bectumomab)、依帕珠單抗、伊妥珠單抗(inotuzumab)、莫妥莫單抗(moxetumomab)、皮那妥珠單抗(pinatuzumab)及美國專利第9181343號、第5484892號、第9279019號、第8591889號、第9499632號、第8481683號、第7355012號、第7777019號、第8809502號、第8389688號、第7829086號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有來源於BTLA(CD272)抗體之可變區或CDR，該等抗體包括但不限於MIH26、AAP44003、MA5-16843、6A5及美國專利第8563694號、第9346882號、第8580259號、第8247537號中所描述之抗體，各美國專利以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，結合蛋白質含有如WO2015103072中所描述之抗體，該案以全文引用之方式併入本文中。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合人類IL-17與人類IL-20。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合人類IL-17與人類IL-20且包含與選自由SEQ ID NO.15、25及27組成之群的序列具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.21具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.23具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合人類IL-17與人類IL-20且包含與選自由SEQ ID NO.15、25及27組成之群的序列具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；及與選自由SEQ ID NO.29、30及31組成之群的序列具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之4號多肽鏈。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合人類CD3與人類CD20。在另一實施例中，結合蛋白質包含與選自由SEQ ID NO.41、48及316組成之群的序列具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.325具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.46或SEQ ID NO.330具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合人類IL-17與人類TNF。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合人類IL-17與人類TNF且包含與SEQ ID NO.87具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.89具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.91具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合人類CTLA-4與人類PD-1。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合人類CTLA-4與人類PD-1且包含與SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.145、SEQ ID NO.164或SEQ ID NO.183具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.135、SEQ ID NO.154、SEQ ID NO.173或SEQ ID NO.192具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.140、SEQ ID NO.159、SEQ ID NO.178或SEQ ID NO.197具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合EGFR與PD-L1。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合EGFR與PD-L1且包含與SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.202或SEQ ID NO.221具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.211或SEQ ID NO.230具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.216或SEQ ID NO.235具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合cMet與EGFR。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合cMET與EGFR且包含與SEQ ID NO.102或SEQ ID NO.240具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.103或SEQ ID NO.249具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.104或SEQ ID NO.254具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合因子IXa與因子X。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合因子IXa與因子X且包含與SEQ ID NO.105或SEQ ID NO.259具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.106或SEQ ID NO.268具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.107或SEQ ID NO.273具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合Her3與IGF-1R。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合Her3與IGF-1R且包含與SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.278具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.109或SEQ ID NO.287具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.110或SEQ ID NO.292具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合DLL-4與VEGF。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合DLL-4與VEGF且包含與SEQ ID NO.111或SEQ ID NO.297具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.112或SEQ ID NO.306具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.113或SEQ ID NO.311具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合CD20與CD3。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合CD20與CD3且包含與SEQ ID NO.114或SEQ ID NO.316具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.115或SEQ ID NO.325具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.116或SEQ ID NO.330具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合Her3與EGFR。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合Her3與EGFR且包含與SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.335或SEQ ID NO.354具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.344或SEQ ID NO.363具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.349或SEQ ID NO.368具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合PD-1與PD-L1。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合PD-1與PD-L1且包含與SEQ ID NO.120或SEQ ID NO.373具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.121或SEQ ID NO.382具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.122或SEQ ID NO.387具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合Her3與PD-1。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合Her3與PD-1且包含與SEQ ID NO.123或SEQ ID NO.411具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.124或SEQ ID NO.420具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.125或SEQ ID NO.425具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合cMet與PD-L1。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合cMet與PD-L1且包含與SEQ ID NO.430具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.439具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.444具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合BTLA與PD-1。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合BTLA與PD-1且包含與SEQ ID NO.449或SEQ ID NO.468具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.458或SEQ ID NO.477具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.463或SEQ ID NO.482具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

在一個實施例中，結合蛋白質能夠結合CD20與CD22。在另一實施例中，結合蛋白質能夠結合CD20與CD22且包含與SEQ ID NO.392具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之FIT-Ig 1號多肽鏈序列；與SEQ ID NO.401具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之2號多肽鏈序列；及與SEQ ID NO.406具有約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%一致性之3號多肽鏈序列。

本文中所描述之例示性結合蛋白質之生物學活性變異體或功能變異體亦為本發明之一部分。如本文中所使用，片語「生物學活性變異體」或「功能變異體」就蛋白質而論係指相對於參考序列已改變一或多個胺基酸，同時仍維持參考序列之實質性生物學活性的胺基酸序列。變異體可具有「保守」變化，其中經取代之胺基酸具有類似結構或化學性質，例如，用異白胺酸置換白胺酸。下表顯示例示性保守胺基酸取代。在一些實施例中，變異體具有一或多個胺基酸取代，其中一或多個或所有取代均為酸性胺基酸，諸如天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸。

替代地，變異體可具有「非保守」變化，例如，用色胺酸置換甘胺酸。類似微小變化亦可包括胺基酸缺失或插入或兩者。可使用此項技術中熟知的電腦程式，例如DNASTAR軟體來發現在確定可在不消除生物學或免疫學活性之情況下加以取代、插入或缺失之胺基酸殘基方面的指導。

能夠與本文中所描述之例示性雙特異性結合蛋白質結合指定標靶群組上之相同抗原決定基的結合蛋白質亦為本發明之一部分。抗原決定基可為線性抗原決定基、構形抗原決定基或其混合物。在一些實施例中，此種相同抗原決定基可藉由適合之抗原決定基測繪技術(包括但不限於X射線共結晶、基於陣列之寡肽掃描、定點突變誘發、高通量突變誘發測繪、噬菌體表面呈現及氫-氘交換)加以鑑別。其他方法描述於美國專利第5955264號、第65796676號、第6984488號及第8802375號中，各美國專利出於所有目的以全文引用之方式併入。

在另一實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合選自由以下各項組成之群的一或兩種細胞因子、細胞因子相關蛋白質及細胞因子受體：BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNG、IFNW1、FIL1、FIL1(EPSILON)、FIL1(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、FGER1、FGFR2、FGFR3、EGFR、ROR1、2B4、KIR、CD137、CD27、OX40、CD40L、A2aR、CD48、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CD70、CD40、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA(TNF-b)、LTB、TNF(TNF-a)、TNFSF4(OX40配位體)、TNFSF5(CD40配位體)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配位體)、TNFSF8(CD30配位體)、TNFSF9(4-1BB配位體)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、FIGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、 IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN及THPO。

本發明之結合蛋白質能夠結合選自由以下各項組成之群的一或多種趨化因子、趨化因子受體及趨化因子相關蛋白質：CCL1(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜酸性球趨化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/淋巴球趨化因子-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性球趨化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性球趨化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1(GRO1)、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP 10)、CXCL11(I-TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴球趨化因子)、XCL2(SCM-1b)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HIF1A、IL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2及VHL。

在另一實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合細胞表面蛋白質，諸如整合素。在另一實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合選自由激酶及蛋白酶組成之群的酶。在另一實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合選自由淋巴因子受體、單核因子受體及多肽激素受體組成之群的受體。

在一個實施例中，結合蛋白質為多價的。在另一實施例中，結合蛋白質為多特異性的。尤其是自治療觀點來看，上文所描述之多價及或多特異性結合蛋白質具有理想特性。舉例而言，多價及或多特異性結合蛋白質可(1)與二價抗體相比由表現抗體所結合之抗原之細胞更快地內在化(及/或異化)；(2)為促效劑抗體；及/或(3)誘導表現多價抗體能夠結合之抗原之細胞的細胞死亡及/或細胞凋亡。提供多價及或多特異性結合蛋白質之至少一個抗原結合特異性之「親本抗體」可為由表現抗體所結合之抗原之細胞內在化(及/或異化)之抗體；及/或可為促效劑抗體、細胞死亡誘導抗體及/或細胞凋亡誘導抗體，且如本文中所描述之多價及或多特異性結合蛋白質可展現此等特性中之一或多種之改良。此外，親本抗體可缺乏此等特性中之任何一或多種，但當構築成如本文中所描述之多價結合蛋白質時可被賦有此等特性。

在另一實施例中，如藉由表面電漿子共振所量測，本發明之結合蛋白質對一或多個標靶具有選自由以下組成之群的締合速率常數(Kon)：至少約10²M^-1s^-1；至少約10³M^-1s^-1；至少約10⁴M^-1s^-1；至少約10⁵M^-1s^-1；及至少約10⁶M^-1s^-1(包括介於其之間的所有值)。如藉由表面電漿子共振所量測，本發明之結合蛋白質較佳對一或多個標靶具有以下締合速率常數(Kon)：介於10²M^-1s^-1至10³M^-1s^-1之間；介於10³M^-1s^-1至10⁴M^-1s^-1之間；介於10⁴M^-1s^-1至10⁵M^-1s^-1之間；或介於10⁵M^-1s^-1至10⁶M^-1s^-1之間(包括介於其之間的所有值)。

在另一實施例中，如藉由表面電漿子共振所量測，結合蛋白質對一或多個標靶具有選自由以下組成之群的解離速率常數(Koff)：至多約10^-3s^-1；至多約10^-4s^-1；至多約10^-5s^-1；及至多約10^-6s^-1(包括介於其之間的所有值)。如藉由表面電漿子共振所量測，本發明之結合蛋白質較佳對一或多個標靶具有以下解離速率常數(Koff)：10^-3s^-1至10^-4s^-1；10^-4s^-1至10^-5s^-1；或10^-5s^-1至10^-6s^-1(包括介於其之間的所有值)。

在另一實施例中，結合蛋白質對一或多個標靶具有選自由以下組成之群的解離常數(K_D)：至多約10^-7M；至多約10^-8M；至多約10^-9M；至多約10^-10M；至多約10^-11M；至多約10^-12M；及至多10^-13M(包括介於其之間的所有值)。本發明之結合蛋白質較佳對IL-12或IL-23具有以下解離常數(K_D)：10^-7M至10^-8M；10^-8M至10^-9M；10^-9M至10^-10M；10^-10至10^-11M；10^-11M至10^-12M；或10^-12M至10^-13M(包括介於其之間的所有值)。

在另一實施例中，本發明之結合蛋白質在使用粒徑排阻層析(SEC)-HPLC之一步式蛋白A純化中具有至少約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約80%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約99.1%、約99.2%、約99.3%、約99.4%、約99.5%、約99.6%、約99.7%、約99.8%、約99.9%以上或100%(包括介於其之間的所有值)的單體%。

在另一實施例中，本發明之結合蛋白質在最佳化條件下具有至少約0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、約0.2mg/L、約0.3mg/L、約0.4mg/L、約0.5mg/L、約0.6mg/L、約0.7mg/L、約0.8mg/L、約0.9mg/L、約1.0mg/L、約2mg/L、約3mg/L、約4mg/L、約5mg/L、約6mg/L、約7mg/L、約8mg/L、約9mg/L、約10mg/L、約11mg/L、約12mg/L、約13mg/L、約14mg/L、約15mg/L、約16mg/L、約17mg/L、約18mg/L、約19mg/L、約20mg/L、約21mg/L、約22mg/L、約23mg/L、約24mg/L、約25mg/L、約26mg/L、約27mg/L、約28mg/L、約29mg/L、約30mg/L、約40mg/L、約50mg/L、約60mg/L、約70mg/L、約80mg/L、約90mg/L、約100mg/L、約200mg/L、約300mg/L、約400mg/L、約500mg/L、約600mg/L、約700mg/L、約800mg/L、約900mg/L、約1000mg/L(包括介於其之間的所有值)之表現水準。在一些實施例中，本發明之結合蛋白質表現於293E細胞中或適用於該目的之任何其他細胞中。

在另一實施例中，如藉由差示掃描量熱術(DSC)所量測，本發明之結合蛋白質具有至少約50℃、約51℃、約52℃、約53℃、約54℃、約55℃、約56℃、約57℃、約58℃、約59℃、約60℃、約61℃、約62℃、約63℃、約64℃、約65℃、約66℃、約67℃、約68℃、約69℃、約70℃、約71℃、約72℃、約73℃、約74℃、約75℃、約76℃、約77℃、約78℃、約79℃、約80℃、約81℃、約82℃、約83℃、約84℃、約85℃、約86℃、約87℃、約88℃、約89℃、約90℃、約95℃、約99℃(包括介於其之間的所有值)以上之Tm1轉移溫度。

本發明之結合蛋白質在冷凍-解凍測試中具有較大穩定性。在一些實施例中，當將本發明之結合蛋白質樣品解凍且在4℃、25℃及40℃下培育1天、3天或7天時，如藉由SEC-HPLC所量測，由於聚集物所致之完整結合蛋白質減少率不到約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.5%、約0.1%、約0.05%、約0.01%(包括介於其之間的所有值)或更小。

在另一實施例中，當本發明之結合蛋白質經靜脈內投與時，其具有以下PK參數中之一或多個：(1)藥物自血漿之表觀總體清除率(CL，mL/天/kg)為約0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50(包括介於其之間的所有值)以上；(2)穩態分佈之表觀體積(Vss，mL/kg)為約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200(包括介於其之間的所有值)以上；(3)雙隔室模型中之中心隔室或血漿隔室之表觀體積(V1，mL/kg)為約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200(包括介於其之間的所有值)以上；(4)初始或配置半衰期(αt1/2，天)為約0.01、0.05、0.1、0.2 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30(包括介於其之間的所有值)以上；(5)終末消除半衰期(βt1/2，天)為約0.01、0.05、0.1、0.2 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30(包括介於其之間的所有值)以上；(6)血漿濃度-時間曲線下面積(AUC，天．μg/mL)為約10、20、30、40、50、60、 70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000(包括介於其之間的所有值)以上；及(6)平均滯留時間(MRT，天)為約0.01、0.05、0.1、0.2 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30(包括介於其之間的所有值)以上。在一些實施例中，以上參數與約1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg(包括介於其之間的所有值)以上之劑量相關。

在另一實施例中，當本發明之結合蛋白質經皮下投與時，其具有以下PK參數中之一或多個：(1)藥物投與後達到最大(峰值)血漿濃度之時間(Tmax，天)為約0.05、0.1、0.2 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30(包括介於其之間的所有值)以上；(2)最大(峰值)血漿藥物濃度(Cmax，μg/ml)為約0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50,55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500(包括介於其之間的所有值)以上；(3)消除半衰期(終末t_1/2，天)為約0.01、0.05、0.1、0.2 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30(包括介於其之間的所有值)以上；(4)自時間零點至最後可量測濃度之時間之血漿濃度-時間曲線下面積(AUClast，天．μg/ml)為約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000(包括介於其之間的所有值)以上；(5)自時間零點至無窮大處之血漿濃度-時間曲線下面積(AUC_inf，天．μg/ml)為約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000(包括介於其之間的所有值)以上；(6)藥物至代謝物之形成清除率(CL/F，mL/天/kg)為約0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50(包括介於其之間的所有值)以上；(7)生體可用率(F，%)為約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200(包括介於其之間的所有值)以上。在一些實施例中，以上參數與約1 mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg(包括介於其之間的所有值)以上之劑量相關。

在另一實施例中，上文所描述之結合蛋白質為結合物，其進一步包含選自由免疫黏附分子、成像劑、治療劑及細胞毒性劑組成之群的試劑。在一個實施例中，成像劑選自由以下組成之群：放射性標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記及生物素。在另一實施例中，成像劑為選自由以下組成之群的放射性標記：³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho及¹⁵³Sm。在一個實施例中，治療劑或細胞毒性劑選自由以下組成之群：免疫抑制劑、免疫刺激劑、抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞因子、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素、毒素及細胞凋亡劑。在一個實施例中，結合蛋白質直接與該試劑結合。在另一實施例中，結合蛋白質經由連接子與該試劑結合。適合之連接子包括但不限於本文所揭示之胺基酸及多肽連接子。連接子可為可裂解或非可裂解的。

在另一實施例，上文所描述之結合蛋白質為結晶之結合蛋白質且以晶體形式存在。晶體較佳為無載體之醫藥控制釋放晶體。結晶結合蛋白質更佳具有比該結合蛋白質之可溶性對應物更大之活體內半衰期。結晶結合蛋白質最佳保留生物活性。

在另一實施例中，上文所描述之結合蛋白質經糖基化。糖基化較佳為人類糖基化模式。

本發明之一個態樣有關一種經分離之核酸，其編碼上文所揭示之結合蛋白質中之任一者。另一實施例提供一種包含上文所揭示之經分離之核酸之載體，其中該載體選自由以下組成之群：pcDNA；pTT(Durocher等人、Nucleic Acids Research 2002，第30卷，第2期)；pTT3(具有其他多個選殖位點之pTT)；pEFBOS(Mizushima,S.及Nagata,S.,(1990)Nucleic acids Research第18卷，第17期)；pBV；pJV；pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO及pBJ。提供多特異性結合蛋白質及其製造方法。結合蛋白質可使用多種技術產生。產生結合蛋白質之表現載體、宿主細胞及方法提供於本發明中。

本發明之結合蛋白質之抗原結合可變域可獲自親本結合蛋白質，包括多株Ab、單株Ab及/或能夠結合相關抗原之受體。此等親本結合蛋白質可為天然存在的或可藉由重組技術產生。一般技術者充分熟習產生抗體及/或經分離之受體之許多方法，包括但不限於使用融合瘤技術、選擇淋巴細胞抗體法(SLAM)、使用噬菌體、酵母或RNA-蛋白質融合呈現或其他文庫、使包含至少一些人類免疫球蛋白基因座之非人類動物免疫，及製備嵌合、CDR接枝及人類化抗體。參見例如美國專利公開案第20090311253 A1號。可變域亦可使用親和力成熟技術製備。結合蛋白質之結合可變域亦可獲自藉由此項技術中已知的提取程序(例如使用溶劑、清潔劑及/或親和純化)獲得之經分離之受體分子，或藉由此項技術中已知的生物物理方法(例如X射線結晶法、NMR、干涉法及/或電腦建模)來測定。

提供包含選擇具有結合蛋白質分子中所需之至少一或多個特性之親本結合蛋白質之一實施例。在一實施例中，所需特性為用於表徵抗體參數之彼等特性中之一或多者，諸如抗原特異性、對抗原之親和力、效能、生物功能、抗原決定基識別、穩定性、溶解度、生產效率、免疫原性、藥物動力學、生物可用性、組織交叉反應性或異種同源抗原結合。參見例如美國專利公開案第20090311253號。

多特異性抗體亦可經設計以促使一或多個抗原結合域為非功能性的。可變域可使用重組DNA技術，由藉由本文中所描述之方法中之任一種產生之親本結合蛋白質獲得。在一實施例中，可變域為鼠類重鏈或輕鏈可變域。在另一實施例中，可變域為CDR移植或人類化可變重鏈或輕鏈域。在一實施例中，可變域為人類重鏈或輕鏈可變域。

在一實施例中，使用重組DNA技術將一或多個恆定域連接至可變域。在一實施例中，包含一或多個重鏈可變域之序列連接至重鏈恆定域且包含一或多個輕鏈可變域之序列連接至輕鏈恆定域。在一實施例中，恆定域分別為人類重鏈恆定域及人類輕鏈恆定域。在一實施例中，重鏈進一步連接至Fc區。Fc區可為原生序列Fc區或變異Fc區。在另一實施例中，Fc區為人類Fc區。在另一實施例中，Fc區包括來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD之Fc區。

另外，可採用本文所提供之結合蛋白質用於組織特異性遞送(靶向組織標記物及疾病介體用於增強局部PK，由此得到較高功效及/或較低毒性)，包括細胞內遞送(靶向內在化受體及細胞內分子)、遞送至腦內(靶向轉鐵蛋白受體及CNS疾病介體用於跨越血腦障壁)。結合蛋白質亦可充當載體蛋白以經由結合抗原之非中和抗原決定基將該抗原遞送至特定位置，而且增加抗原之半衰期。此外，結合蛋白質可經設計以物理連接至植入患者中之醫學裝置或靶向此等醫學裝置(參見Burke等人(2006)Advanced Drug Deliv.Rev.58(3)：437-446；Hildebrand等人(2006)Surface and Coatings Technol.200(22-23)：6318-6324；Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis,Wu(2006)Biomaterials 27(11)：2450-2467；Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices,Marques(2005)Biodegradable Systems in Tissue Engineer.Regen.Med.377-397)。將適當類型之細胞引導至醫學植入物之位點可促進治癒及恢復正常組織功能。替代地，亦提供在裝置植入後釋放由偶合至裝置或靶向裝置之受體抗體融合蛋白對介體(包括但不限於細胞因子)的抑制。

在一個態樣中，用上文所揭示之載體轉化宿主細胞。在一個實施例中，宿主細胞為原核細胞。在另一實施例中，宿主細胞為大腸桿菌(Escherecia coli)。在另一實施例中，宿主細胞為真核細胞。在另一實施例中，真核細胞選自由原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌細胞組成之群。在一個實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞，包括但不限於293、COS、NS0及CHO；或真菌細胞，諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或昆蟲細胞，諸如Sf9。

本發明之另一態樣提供一種產生上文所揭示之結合蛋白質之方法，其包含在培養基中於足以產生結合蛋白質之條件下培養上文亦揭示之宿主細胞中之任一者。較佳地，由此方法產生之結合蛋白質之50%-75%為雙重特異性四價結合蛋白質。更佳地，由此方法產生之結合蛋白質之75%-90%為雙重特異性四價結合蛋白質。最佳地，所產生之結合蛋白質之90%-95%為雙重特異性四價結合蛋白質。

另一實施例提供一種根據上文所揭示之方法產生之結合蛋白質。

一個實施例提供一種用於釋放結合蛋白質之組成物，其中該組成物包含調配物，該調配物又包含如上文所揭示之結晶結合蛋白質及成分；及至少一種聚合物載體。聚合物載體較佳為選自由以下組成之群中之一或多者的聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酸酐)、聚(酯肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(b-羥基丁酸酯)、聚(己內酯)、聚(二噁烷酮)、聚(乙二醇)、聚((羥丙基)甲基丙烯醯胺)、聚[(有機)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、順丁烯二酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、白蛋白、海藻酸鹽、纖維素及纖維素衍生物、膠原蛋白、纖維蛋白、明膠、玻糖醛酸、寡醣、醣胺聚糖、硫酸多醣、其摻合物及共聚物。該成分較佳選自由以下組成之群：白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明膠、羥丙基-β-環糊精、甲氧基聚乙二醇及聚乙二醇。另一實施例提供一種治療哺乳動物之方法，其包含向該哺乳動物投與有效量之上文所揭示之組成物之步驟。

本發明亦提供一種醫藥組成物，其包含如上文所揭示之結合蛋白質及醫藥學上可接受之載劑。醫藥學上可接受之載劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液或生理鹽水。其他常用非經腸媒劑包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏液或非揮發性油。靜脈內媒劑包括體液及營養補充劑、電解質補充劑，諸如基於林格氏右旋糖之彼等補充劑，及其類似物。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體，及其類似物。更特定言之，適合於注射使用之醫藥組成物包括無菌水溶液(在可溶於水時)或分散液及用於即時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。載劑可為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚二乙醇，及其類似物)，及其適合混合物。在一些情況下，較佳將在組成物中包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可注射組成物之延長吸收可藉由在組成物中包括延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鋁及明膠來實現。

在另一實施例中，醫藥組成物包含至少一種用於治療病症之其他治療劑。在一個實施例中，其他藥劑選自由以下組成之群：治療劑、成像劑、細胞毒性劑、血管生成抑制劑(包括但不限於抗VEGF抗體或VEGF阱)；激酶抑制劑(包括但不限於KDR及TIE-2抑制劑)；共刺激分子阻斷劑(包括但不限於抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗PD-1、抗CD20)；黏附分子阻斷劑(包括但不限於抗LFA-1 Ab、抗E/L選擇素(selectin)Ab、小分子抑制劑)；抗細胞因子抗體或其功能片段(包括但不限於抗IL-18、抗TNF、抗IL-6/細胞因子受體抗體)；胺甲蝶呤(methotrexate)；環孢素(cyclosporin)；雷帕黴素(rapamycin)；FK506；可偵測標記或報導體；TNF拮抗劑；抗風濕藥；肌肉鬆弛劑、麻醉藥、非類固醇消炎藥(NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬藥、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫劑、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥、放射性藥物、抗抑鬱劑、抗精神病藥、刺激劑、氣喘藥、β促效劑、吸入性類固醇、腎上腺素或類似物、細胞因子及細胞因子拮抗劑。

在另一態樣中，本發明提供一種治療罹患能夠由上文所揭示之結合蛋白質結合之標靶有害之病症之人類個體的方法，其包含向該人類個體投與上文所揭示之結合蛋白質以使得人類個體中該或該等標靶之活性受抑制且該病症之治療或預防得以達成。在一個實施例中，疾病或病症為發炎性病狀、自體免疫疾病或癌症。在一個實施例中，疾病或病症選自包含以下之群：關節炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、敗血性關節炎、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、牛皮癬性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、氣喘、過敏性疾病、牛皮癬、皮炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反應、與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病、類肉瘤病、動脈粥樣硬化、瀰散性血管內凝血、川崎氏病(Kawasaki's disease)、格雷氏病(Grave's disease)、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏肉芽腫病)、亨諾-許蘭氏紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、腎臟之顯微鏡下血管炎、慢性活動性肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休克症候群、敗血症候群、惡病質、感染性疾病、寄生蟲病、後天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病(Huntington's chorea)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、中風、原發性膽汁性硬化、溶血性貧血、惡性病、心臟衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病、散發性I型多腺缺乏及II型多腺缺乏、施密特氏症候群(Schmidt's syndrome)、成人(急性)呼吸窘迫症候群、脫髮、斑禿、血清陰性關節病、關節病、萊特爾氏病、牛皮癬性關節病、潰瘍性結腸炎關節病、腸病性滑膜炎、與披衣菌(chlamydia)、耶氏桿菌(yersinia)及沙門氏菌(salmonella)相關之關節病、脊椎關節病、動脈粥樣病/動脈硬化、異位性過敏、自體免疫大皰病、尋常天疱瘡、落葉型天疱瘡、類天疱瘡、線性IgA疾病、自體免疫溶血性貧血、庫氏陽性溶血性貧血(Coombs positive haemolytic anaemia)、後天惡性貧血、青少年惡性貧血、肌痛性腦炎/皇家自由病(Royal Free Disease)、慢性黏膜皮膚念珠菌病、巨細胞動脈炎、原發性硬化性肝炎、隱原性自體免疫肝炎、後天免疫缺乏疾病症候群、後天免疫缺乏相關疾病、B型肝炎、C型肝炎、常見變異型免疫缺乏(常見變異型低丙種球蛋白血症)、擴張性心肌病、女性不孕症、卵巢衰竭、卵巢早衰、纖維化肺病、隱原性纖維性肺泡炎、發炎後間質性肺病、間質性肺炎、結締組織疾病相關之間質性肺病、混合結締組織疾病相關之肺病、全身性硬化症相關之間質性肺病、類風濕性關節炎相關之間質性肺病、全身性紅斑狼瘡相關之肺病、皮肌炎/多肌炎相關之肺病、修格連氏病相關之肺病、強直性脊椎炎相關之肺病、血管炎瀰漫性肺病、含鐵血黃素沈著病相關之肺病、藥物誘發之間質性肺病、纖維化、放射性纖維化、閉塞性細支氣管炎、慢性嗜酸性球性肺炎、淋巴球性浸潤性肺病、感染後間質性肺病、痛風性關節炎、自體免疫肝炎、1型自體免疫肝炎(經典自體免疫或狼瘡樣肝炎)、2型自體免疫肝炎(抗LKM抗體肝炎)、自體免疫介導之低血糖症、伴有黑棘皮病之B型胰島素抵抗、副甲狀腺低能症、與器官移植相關之急性免疫疾病、與器官移植相關之慢性免疫疾病、骨關節病、原發性硬化性膽管炎、1型牛皮癬、2型牛皮癬、特發性白血球減少症、自體免疫嗜中性白血球減少症、NOS腎病、腎小球腎炎、腎臟微觀血管炎、萊姆病(lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡、特發性或NOS男性不育症、精子自體免疫、多發性硬化症(所有亞型)、交感性眼炎，繼發於結締組織疾病之肺高血壓、古德帕斯徹氏症候群、結節性多動脈炎之肺部表現、急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、斯蒂爾氏病(Still's disease)、全身性硬化症、修格連氏症候群、高安氏病(Takayasu's disease)/動脈炎、自體免疫血小板減少症、特發性血小板減少症、自體免疫甲狀腺病、甲狀腺機能亢進症、甲狀腺腫自體免疫甲狀腺機能減退症(橋本氏病(Hashimoto's disease))、萎縮性自體免疫甲狀腺機能減退症、原發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、原發性血管炎、白斑病、急性肝病、慢性肝病、酒精性硬化、酒精誘發之肝損傷、膽汁鬱積、特異質肝病、藥物誘發之肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、過敏及氣喘、B族鏈球菌(GBS)感染、精神病症(例如抑鬱及精神分裂症)、Th2型及Th1型介導之疾病、急性及慢性疼痛(不同形式之疼痛)、及癌症(諸如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌)及造血惡性病(白血病及淋巴瘤)、無β脂蛋白血症(Abetalipoprotemia)、手足發紺、急性及慢性寄生或感染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性或慢性細菌感染、急性胰臟炎、急性腎衰竭、腺癌、心房異位搏動、AIDS癡呆複合症、酒精誘發之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移植排斥反應、α-1抗胰蛋白酶缺乏、肌萎縮性側索硬化症、貧血、心絞痛、前角細胞退化、抗cd3療法、抗磷脂症候群、抗受體過敏反應、主動脈及周邊動脈瘤、主動脈夾層、動脈高血壓、動脈硬化、動靜脈瘺、共濟失調、心房顫動(持續性或陣發性)、心房撲動、房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植排斥反應、骨髓移植(BMT)排斥反應、束支傳導阻滯、伯基特氏淋巴瘤、燒傷、心臟心律不齊、心臟頓抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、心肺分流發炎反應、軟骨移植排斥反應、小腦皮質退化、小腦病症、紊亂性或多灶性房性心動過速、化學療法相關之病症、慢性髓細胞白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性發炎性病變、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水楊酸鹽中毒、結腸直腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮炎、肺原性心臟病、冠狀動脈疾病、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、培養陰性敗血症、囊腫性纖維化、細胞因子療法相關之病症、拳擊員癡呆、脫髓鞘疾病、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever)、皮炎、皮膚病狀、糖尿病(diabetes、diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬化病、瀰漫性路易體病(Diffuse Lewy body disease)、擴張性充血性心肌病、基底神經節之病症、中年唐氏症候群(Down's Syndrome)、由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘發之藥物誘發性運動障礙、藥物過敏、濕疹、腦脊髓炎、心內膜炎、內分泌病、會厭炎、埃-巴二氏病毒感染、紅斑性肢痛病、錐體束外及小腦病症、家族性噬血細胞淋巴組織細胞增生症、胎兒胸腺移植排斥反應、弗里德希氏共濟失調(Friedreich's ataxia)、功能性周邊動脈病症、真菌性敗血症、氣性壞疽、胃潰瘍、腎小球腎炎、任何器官或組織之移植排斥反應、革蘭氏陰性敗血症(gram negative sepsis)、革蘭氏陽性敗血症(gram positive sepsis)、因細胞內生物體所致之肉芽腫、毛細胞白血病、哈勒沃登-施帕茨病(Hallerrorden-Spatz disease)、橋本氏甲狀腺炎、花粉熱、心臟移植排斥反應、血色素沈著病、血液透析、溶血性尿毒症候群/溶解血栓性血小板減少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常(His bundle arrythmias)、HIV感染/HIV神經病、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、過動性運動障礙、過敏反應、過敏性肺炎、高血壓、運動功能減退性運動障礙、下丘腦-垂體-腎上腺軸評估、特發性阿狄森氏病、特發性肺纖維化、抗體介導之細胞毒性、衰弱、嬰兒脊髓性肌萎縮、主動脈發炎、A型流感、電離輻射暴露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、缺血再灌注損傷、缺血性中風、青少年類風濕性關節炎、青少年脊髓性肌萎縮、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、腎移植排斥反應、軍團病(legionella)、利什曼病(leishmaniasis)、麻瘋病、皮質脊髓系統之損害、脂肪水腫、肝移植排斥反應、淋巴水腫、瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多症、惡性黑色素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血症、代謝性/特發性偏頭痛、粒線體多系統病症、混合結締組織疾病、單株丙種球蛋白病、多發性骨髓瘤、多系統退化(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager及Machado-Joseph)、重症肌無力、鳥胞內分枝桿菌(mycobacterium avium intracellulare)、結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis)、脊髓發育不良症候群、心肌梗塞、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎病、神經退化性疾病、神經源性I型肌萎縮、嗜中性白血球減少性發熱、非霍奇金氏淋巴瘤、腹主動脈及其分支之阻塞、阻塞性動脈病、okt3療法、睪丸炎/附睪炎、睪丸炎/輸精管切除術逆轉程序、器官巨大症、骨質疏鬆症、胰臟移植排斥反應、胰臟癌、副腫瘤症候群/惡性病之高鈣血症、副甲狀腺移植排斥反應、骨盆發炎性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、周邊動脈粥樣硬化病、周邊血管病症、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺孢子蟲肺炎(pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群(多發性神經病、器官巨大症、內分泌病、單株丙種球蛋白病及皮膚變化症候群)、灌注後症候群、泵後症候群、MI心切開術後症候群、先兆子癇、進行性核上麻痹、原發性肺高血壓、放射線療法、雷諾氏現象及疾病(Raynaud's phenomenon and disease)、雷諾氏病(Raynoud's disease)、雷夫蘇姆氏病(Refsum's disease)、規律性窄QRS心動過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易體型老年性癡呆(Senile Dementia of Lewy body type)、血清陰性關節病、休克、鐮狀細胞貧血、皮膚同種異體移植排斥反應、皮膚變化症候群、小腸移植排斥反應、實體腫瘤、特殊心律失常、脊髓性共濟失調、脊髓小腦退化、鏈球菌肌炎、小腦之結構損害、亞急性硬化性全腦炎、暈厥、心血管系統之梅毒、全身過敏症、全身發炎反應症候群、全身發作型青少年類風濕性關節炎、T細胞或FAB ALL、毛細血管擴張症、血栓閉塞性脈管炎、血小板減少症、中毒、移植、創傷/出血、III型過敏反應、IV型過敏、不穩定型心絞痛、尿毒症、尿路敗血症、蕁麻疹、心臟瓣膜病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、靜脈血栓形成、心室纖維性顫動、病毒及真菌感染、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關之噬血細胞症候群、韋尼克-科羅薩科夫症候群(Wernicke-Korsakoff syndrome)、威爾森氏病(Wilson's disease)、任何器官或組織之異種移植排斥反應。

在另一態樣中，如上文所論述，本發明提供一種治療罹患病症之患者之方法，其包含在投與第二藥劑之前、同時或之後投與上文所揭示之結合蛋白質中之任一種的步驟。在一較佳實施例中，第二藥劑選自由以下組成之群：布地奈德(budenoside)、表皮生長因子、皮質類固醇、環孢素、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、胺基水楊酸鹽、6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲硝噠唑(metronidazole)、脂加氧酶抑制劑、美沙拉嗪(mesalamine)、奧沙拉嗪(olsalazine)、巴柳氮(balsalazide)、抗氧化劑、血栓素(thromboxane)抑制劑、IL-1受體拮抗劑、抗IL-1β單株抗體、抗IL-6單株抗體、生長因子、彈性蛋白酶抑制劑、吡啶基咪唑化合物；TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF之抗體或促效劑；CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配位體之抗體；甲胺蝶呤、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)、來氟米特(leflunomide)、NSAID、布洛芬(ibuprofen)、皮質類固醇、潑尼松龍(prednisolone)、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、IRAK、NIK、IKK、p38、MAP激酶抑制劑、IL-1β轉化酶抑制劑、TNFα轉化酶抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細胞因子受體、可溶性p55 TNF受體、可溶性p75 TNF受體、sIL-IRI、sIL-1RII、sIL-6R、消炎性細胞因子、IL-4、IL-10、IL-11、IL-13及TGFβ。

在一個實施例中，上文所揭示之醫藥組成物係由至少一個選自以下之模式投與個體：非經腸、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、團注、經陰道、經直腸、經頰、舌下、鼻內及經皮。

本發明之一個態樣提供針對本發明之至少一種結合蛋白質之至少一種抗獨特型抗體。抗獨特型抗體包括含有包含免疫球蛋白分子之至少一部分之分子的任何蛋白質或肽，該部分為諸如(但不限於)重鏈或輕鏈或其配位元體結合部分之至少一個互補決定區(CDR)、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、構架區，或其可併入本發明之結合蛋白質中之任何部分。

在另一實施例中，本發明之結合蛋白質能夠結合一或多個選自由以下組成之群的標靶：ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；聚集蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；ANGPT1；ANGPT2；ANGPTL3； ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；AZGP1(鋅-a-醣蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLR1(MDR15)；BlyS；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B；BMPR2；BPAG1(網蛋白)；BRCA1；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(I-309)；CCL11(嗜酸性球趨化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP-1d)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3b)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3a)；CCL21(MIP-2)；SLC；淋巴球趨化因子-2；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜酸性球趨化因子-2)；CCL25(TECK)；CCL26(嗜酸性球趨化因子-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MIP-1a)；CCL4(MIP-1b)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKR1/HM145)；CCR2(mcp-1RB/RA)；CCR3(CKR3/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD-22；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD47,CD48,CD52；CD69；CD70,CD72；CD74；CD79A；CD79B；CD8；CD80；CD81；CD83；CD86；CD137,CD138,B7-1,B7-2,ICOSL,B7-H3,B7-H4,CD137L,OX40L,CDH1(E-鈣黏蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21Wap1/Cip1)；CDKN1B(p27Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(p16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；甲殼質酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(密連蛋白-7)；CLN3；CLU(簇集蛋白)；cMet；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSF1(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)； CSF3(GCSF)；CTLA-4；CTNNB1(b-連環蛋白)；CTSB(組織蛋白酶B)；CX3CL1(SCYD1)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DLL-4；DNCL1；DPP4；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FGF；FGF1(aFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FIL1(EPSILON)；FIL1(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRT1(纖連蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNAS1；GNRH1；GPR2(CCR10)；GPR31；GPR44；GPR81(FKSG80)；GRCC10(C10)；GRP；GSN(凝溶膠蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HIP1；組織胺及組織胺受體；Her3；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOX1；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；ID2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；IFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-1；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；IL1F10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2 IL1RN；IL2；IL20；IL20RA；IL21R；IL22；IL22R；II22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29； IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(醣蛋白130)；IL7；IL7R；IL8；IL8RA；IL8RB；IL8RB；IL9；IL9R；ILK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整合素)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整合素)；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GC Box BP)；KLF6；KLK10；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KRTHB6(毛髮特異性II型角蛋白)；LAMA5；LEP(瘦素)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；MACMARCKS；MAG或Omgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MIB1；中期因子；MIF；MIP-2；MKI67(Ki-67)；MMP2；MMP9；MS4A1；MSMB；MT3(金屬硫黏連蛋白-III)；MTSS1；MUC1(黏蛋白)；MYC；MYD88；NCK2；神經蛋白聚糖；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR1I2；NR1I3；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZ1；OPRD1；PCSK9；P2RX7；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-1；PD-L1；α4β7、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDF8、CGRP、Lingo-1、因子IXa、因子X、ICOS、GARP、BTLA、CD160、ROR1、2B4、KIR、CD27、OX40、CD40L、A2aR、PDGFA；PDGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸蛋白聚糖(phosphacan)；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PPBP(CXCL7)；PPID；PR1；PRKCQ；PRKD1；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21Rac2)；RARB；RGS1；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(親脂素B)；SCGB2A1(乳房球蛋白2)；SCGB2A2(乳房球蛋白1)；SCYE1(內皮單核細胞活化細胞因子)；SDF2；SERPINA1；SERPINA3；SERPINB5(乳房絲抑蛋白)；SERPINE1(PAI-1)；SERPINF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2； SPP1；SPRR1B(Spr1)；ST6GAL1；STAB1；STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCP10；TDGF1；TEK；TGFA；TGFB1；TGFB1I1；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBR1；TGFBR2；TGFBR3；TH1L；THBS1(血小板反應蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TIMP3；組織因子；TLR10；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TNF；TNF-a；TNFAIP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSF11A；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(APO3L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配位體)；TNFSF5(CD40配位體)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配位體)；TNFSF8(CD30配位體)；TNFSF9(4-1BB配位體)；TOLLIP；類鐸(Toll)受體；TOP2A(拓撲異構酶Iia)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TRPC6；TSLP；TWEAK；VEGF；VEGFB；VEGFC；多能蛋白聚糖；VHL C5；VLA-4；XCL1(淋巴球趨化因子)；XCL2(SCM-1b)；XCR1(GPR5/CCXCR1)；YY1；及ZFPM2。

考慮到其結合兩個或更多個抗原之能力，本發明之結合蛋白質可用於使用習知免疫分析法偵測抗原(例如在生物樣品中，諸如血清或血漿)，該免疫分析法為諸如酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)或組織免疫組織化學。FIT-Ig用可偵測物質直接或間接作標記以有助於偵測已結合或未結合之抗體。適合之可偵測物質包括多種酶、輔基、螢光物質、發光物質及放射性物質。適合酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基複合物之實例包括鏈酶親和素/生物素及親和素/生物素；適合螢光物質之實例包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪胺螢光素、丹醯氯或藻紅素；發光物質之實例包括發光胺；且適合放射性物質之實例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。

在一個實施例中，本發明之結合蛋白質能夠在活體外與活體內中和抗原之活性。因此，該等FIT-Ig可用於抑制抗原活性，例如在含有抗原之細胞培養物中、在具有本發明之結合蛋白質交叉反應之抗原之人類個體中或其他哺乳動物個體中。在另一實施例中，本發明提供一種降低罹患抗原活性有害之疾病或病症之個體中之抗原活性的方法。可將本發明之結合蛋白質投與人類個體用於達成治療目的。

如本文所用之術語「抗原活性有害之病症」欲包括罹患病症之個體中存在抗原已顯示或疑似為病症之病理生理學之原因或為促使病症惡化之因素的疾病及其他病症。因此，抗原活性有害之病症為抗原活性之降低預期減輕病症之症狀及/或進展之病症。該等病症可例如由罹患病症之個體之生物流體中抗原濃度之增加(例如個體之血清、血漿、滑液等中抗原濃度之增加)來證實。可用本發明之結合蛋白質治療之病症之非限制性實例包括下文及有關本發明抗體之醫藥組成物之章節中所論述之彼等病症。

本發明之FIT-Ig可結合一個抗原或多個抗原。該等抗原包括但不限於以下資料庫中所列之標靶，該等資料庫以引用的方式併入本文中。此等標靶資料庫包括但不限於以下清單：●治療性標靶(http：//xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp)；●細胞因子及細胞因子受體(http：//www.cytokinewebfacts.com/、http：//www.copewithcytokines.de/cope.cgi及http：//cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html)；●趨化因子(http：//cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html)；●趨化因子受體及GPCR(http：//csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html,http：//www.gpcr.org/7tm/)；●嗅覺受體(http：//senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp)；●受體(http：//www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm)；●癌症標靶(http：//cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi)；●作為潛在抗體標靶之分泌蛋白質(http：//spd.cbi.pku.edu.cn/)；●蛋白激酶(http：//spd.cbi.pku.edu.cn/)；及 ●人類CD標記物(http：//content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf)及(Zola H,2005 CD molecules 2005：human cell differentiation molecules Blood,106：3123-6)。

FIT-Ig適用作治療劑以同時阻斷兩個不同標靶，從而增強功效/安全性及/或增加患者覆蓋率。該等標靶可包括可溶性標靶(IL-13及TNF)及細胞表面受體標靶(VEGFR及EGFR)。FIT-Ig亦可用於誘導腫瘤細胞與T細胞(Her2與CD3)之間的重定向細胞毒性用於癌症療法，或自體反應性細胞與效應細胞之間的重定向細胞毒性用於自體免疫/移植，或任何靶細胞與效應細胞之間的重定向細胞毒性以消除任何既定疾病中之致病細胞。

另外，FIT-Ig當經設計以靶向同一受體上之兩個不同抗原決定基時可用於觸發受體簇集及活化。此可有益於製造促效性及拮抗性抗GPCR治療劑。在此種情況下，FIT-Ig可用於靶向一個細胞上之兩個不同抗原決定基用於簇集/信號傳導(兩個細胞表面分子)或信號傳導(在一個分子上)。類似地，FIT-Ig分子可經設計以觸發CTLA-4接合，且藉由靶向CTLA-4胞外域之兩個不同抗原決定基(或相同抗原決定基之2個複本)而觸發負向信號，從而引起免疫反應下調。CTLA-4為用於許多免疫學病症之治療性治療的經臨床驗證之標靶。CTLA-4/B7相互作用藉由削弱細胞週期進程、IL-2產生及活化後之T細胞增殖來負向調控T細胞活化，且CTLA-4(CD152)嚙合可下調T細胞活化且促進免疫耐受性之誘導。然而，藉由CTLA-4之促效性抗體嚙合削弱T細胞活化之策略尚未成功，此係由於CTLA-4活化需要接合。CTLA-4/B7之分子相互作用處於「歪斜拉鏈」陣列中，如由晶體結構分析(Stamper 2001 Nature 410：608)所顯示。然而，當前可用之CTLA-4結合試劑中無一者具有接合特性，包括抗CTLA-4單株抗體。已若干次嘗試解決此問題。在一種情況下，產生細胞膜結合之單鏈抗體，且其顯著抑制小鼠中之同種異體排斥反應(Hwang 2002 JI 169：633)。在另一種情況下，產生針對CTLA-4之人工APC表面連接之單鏈抗體，且其顯示削弱T細胞反應(Griffin 2000 JI 164：4433)。在兩種情況下，CTLA-4接合係由人工系統中緊密定位之膜結合抗體來達成。儘管此等實驗提供藉由觸發CTLA-4負向信號傳導實現免疫下調之概念驗證，但此等報導中所用之試劑不適合於治療用途。為此，CTLA-4接合可藉由使用靶向CTLA-4胞外域之兩個不同抗原決定基(或相同抗原決定基之2個複本)之FIT-Ig分子來達成。基本原理為跨越IgG之兩個結合位點之距離，約150-170Å，對於CTLA-4之活性接合(在2個CTLA-4均二聚體之間30-50Å)而言過大。然而，FIT-Ig(一個臂)上之兩個結合位點之間的距離短得多，亦在30-50Å之範圍內，從而允許CTLA-4適當接合。

類似地，FIT-Ig可靶向細胞表面受體複合物之兩個不同成員(例如IL-12R α及β)。此外，FIT-Ig可靶向CR1及可溶性蛋白質/病原體以驅使標靶可溶性蛋白質/病原體快速清除。

另外，可採用本發明之FIT-Ig用於組織特異性遞送(靶向組織標記物及疾病介體用於增強局部PK，由此得到較高功效及/或較低毒性)，包括細胞內遞送(靶向內在化受體及細胞內分子)、遞送至腦內(靶向轉鐵蛋白受體及CNS疾病介體用於跨越血腦障壁)。FIT-Ig亦可充當載體蛋白以經由結合抗原之非中和抗原決定基將彼抗原遞送至特定位置，而且增加抗原之半衰期。此外，FIT-Ig可經設計以物理連接至植入患者中之醫學裝置或靶向此等醫學裝置(Burke,Sandra E.；Kuntz,Richard E.；Schwartz,Lewis B.Zotarolimus(ABT-578)eluting stents.Advanced Drug Delivery Reviews(2006),58(3),437-446；Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices.Hildebrand,H.F.；Blanchemain,N.；Mayer,G.；Chai,F.；Lefebvre,M.；Boschin,F.Surface and Coatings Technology(2006),200(22-23),6318-6324.；Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis.Wu,Peng；Grainger,David W.Biomaterials(2006),27(11),2450-2467.；Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices.Marques,A.P.；Hunt,J.A.；Reis,Rui L.Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine(2005),377-397；第52頁)。

Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices.Marques,A.P.；Hunt,J.A.；Reis,Rui L.Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine(2005),377-397。) 簡言之，將適當類型之細胞引導至醫學植入物之位點可促進治癒及恢復正常組織功能。或者，亦提供在裝置植入後釋放偶合至裝置或靶向裝置之FIT-Ig對介體(包括但不限於細胞因子)的抑制。舉例而言，支架已在介入性心臟病學中使用多年以清潔阻塞之動脈及改良血液至心肌之流動。然而，已知傳統裸金屬支架在一些患者中引起再狹窄(經治療區域中之動脈再變窄)且可導致血液凝塊。最近，已描述經抗CD34抗體塗佈之支架，其藉由捕獲在整個血液中循環之內皮祖細胞(EPC)而減少再狹窄且防止血液凝塊發生。內皮細胞為作為血管襯裡之細胞，從而允許血液平穩地流動。EPC黏附至支架之硬表面，形成平滑層，該平滑層不僅促進治癒，而且防止再狹窄及血液凝塊，先前與使用支架相關聯之併發症(Aoji等人，2005 J Am Coll Cardiol.45(10)：1574-9)。除改良需要支架之患者之結果以外，對於需要心血管旁路手術之患者亦存在併發症。舉例而言，經抗EPC抗體塗佈之修復性血管管道(人工動脈)將消除使用來自患者腿部或手臂之動脈用於旁路手術移植之需要。此將減少手術及麻醉時間，繼而將減少冠狀動脈手術死亡。FIT-Ig以如下方式設計：其結合已塗佈於經植入之裝置上以促進細胞募集之細胞表面標記物(諸如CD34)以及蛋白質(或任何種類之抗原決定基，包括但不限於脂質及多醣)。一般而言，該等方法亦可應用於其他醫學植入物。或者，FIT-Ig可塗佈於醫學裝置上，且在植入及自裝置釋放所有FIT後(或可能需要額外新鮮FIT-Ig之任何其他需要，包括已載入之FIT-Ig老化及變性)，該裝置可藉由將新鮮FIT-Ig全身投與患者來重新載入，其中FIT-Ig經設計以結合具有一組結合位點之相關標靶(細胞因子、細胞表面標記物(諸如CD34)等)且結合具有另一組結合位點之塗佈於裝置上之標靶(包括蛋白質、任何種類之抗原決定基，包括但不限於脂質、多醣及聚合物)。此技術具有延長經塗佈之植入物之有用性的優點。

本發明之FIT-Ig分子亦適用作治療性分子以治療多種疾病。該等FIT-Ig分子可結合一或多個涉及特定疾病之標靶。多種疾病中之該等標靶之實例描述於下文。

許多蛋白質已牽涉於一般自體免疫及發炎反應，包括C5、CCL1(I-309)、CCL11(嗜酸性球趨化因子)、CCL13(mcp-4)、CCL15 (MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19、CCL2(mcp-1)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性球趨化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(mcp-3)、CCL8(mcp-2)、CXCL1、CXCL10(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13(mcp-4)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CR1、IL8RA、XCR1(CCXCR1)、IFNA2、IL10、IL13、IL17C、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL22、IL5、IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、SCYE1(內皮單核細胞活化細胞因子)、SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、IL10RB、IL13、IL13RA1、IL5RA、IL9、IL9R、ABCF1、BCL6、C3、C4A、CEBPB、CRP、ICEBERG、IL1R1、IL1RN、IL8RB、LTB4R、TOLLIP、FADD、IRAK1、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、CNR1、CTLA-4、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1、AMH、AMHR2、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、C19orf10(IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、IL1A、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、 IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF11A、TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、VEGF、ZFPM2及RNF110(ZNF144)。亦涵蓋能夠結合上文所列標靶中之一或多者之FIT-Ig。

過敏性氣喘之特徵在於存在嗜酸性球增多症、杯狀細胞化生、上皮細胞改變、氣道高反應性(AHR)，以及Th2及Th1細胞因子表現，以及升高之血清IgE水準。現廣泛接受氣道發炎為構成氣喘發病機制之基礎之關鍵因素，其涉及諸如T細胞、B細胞、嗜酸性球、肥大細胞及巨噬細胞之發炎性細胞及其分泌介體(包括細胞因子及趨化因子)之複雜相互作用。皮質類固醇為當今用於氣喘之最重要之消炎治療，然而，其作用機制為非特異性的且存在安全問題，尤其在青少年患者群體中。因此有必要開發更具特異性及靶向之療法。愈來愈多證據表明，小鼠中之IL-13類比氣喘之許多特徵，包括AHR、黏液分泌過多及氣道纖維化，而與嗜酸性球性發炎無關(Finotto等人，International Immunology(2005),17(8),993-1007；Padilla等人，Journal of Immunology(2005),174(12),8097-8105)。

已暗示IL-13在引起與氣喘相關之病理反應中具有關鍵作用。開發抗IL-13單株抗體療法以減小肺中IL-13之作用為激動人心之新方法，其提供作為用於氣喘之新穎治療之相當大的前景。然而，分化免疫路徑之其他介體亦涉及氣喘發病機制，且除IL-13以外阻斷此等介體可提供額外治療效益。該等標靶對包括但不限於IL-13與促炎性細胞因子，諸如腫瘤壞死因子α(TNF-α)。TNF-α可放大氣喘中之發炎反應且可與疾病嚴重性相關聯(McDonnell等人，Progress in Respiratory Research(2001),31(New Drugs for Asthma,Allergy and COPD),247-250.)。此表明，阻斷IL-13與TNF-α可具有有益作用，尤其在嚴重氣道疾病中。在一較佳實施例中，本發明之FIT-Ig結合標靶IL-13與TNFα且用於治療氣喘。

諸如OVA誘發之氣喘小鼠模型(其中可評估發炎與AHR)之動物模型在此項技術中為已知的，且可用於確定多種FIT-Ig分子治療氣喘之能力。用於研究氣喘之動物模型揭示於以下文獻中：Coffman等人，Journal of Experimental Medicine(2005),201(12),1875-1879；Lloyd等人，Advances in Immunology(2001),77,263-295；Boyce等人，Journal of Experimental Medicine(2005),201(12),1869-1873；及Snibson等人，Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology(2005),35(2),146-52。除此等標靶對之常規安全性評估以外，免疫抑制程度之特異性測試可為有必要的且有助於選擇最佳標靶對(參見Luster等人，Toxicology(1994),92(1-3),229-43；Descotes等人，Developments in biological standardization(1992),77 99-102；Hart等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology(2001),108(2),250-257)。

基於上文所揭示之基本原理且使用功效及安全性之上述評估模型，可確定FIT-Ig分子可結合且適用於治療氣喘之其他標靶對。該等標靶較佳包括但不限於IL-13與IL-1β，此係由於IL-1β亦牽涉於氣喘中之發炎反應；IL-13與發炎所涉及之細胞因子及趨化因子，諸如IL-13與IL-9；IL-13與IL-4；IL-13與IL-5；IL-13與IL-25；IL-13與TARC；IL-13與MDC；IL-13與MIF；IL-13與TGF-β；IL-13與LHR促效劑；IL-13與CL25；IL-13與SPRR2a；IL-13與SPRR2b；及IL-13與ADAM8。本發明亦涵蓋能夠結合一或多個涉及氣喘之標靶的FIT-Ig，該一或多個標靶選自由以下組成之群：CSF1(MCSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、組織胺及組織胺受體、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、KITLG、PDGFB、IL2RA、IL4R、IL5RA、IL8RA、IL8RB、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、TSLP、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL22、CCL24,CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、XCL1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、 XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR及甲殼質酶。

全身性疾病類風濕性關節炎(RA)之特徵在於關節滑膜中之慢性發炎反應且與軟骨退化及鄰關節骨侵蝕相關聯。包括TNF、趨化因子及生長因子之許多促炎性細胞因子表現於患病關節中。將抗TNF抗體或sTNFR融合蛋白全身投與小鼠RA模型顯示消炎性及關節保護性。對用靜脈內投與之英利昔單抗(infliximab)(Harriman G,Harper LK,Schaible TF.1999 Summary of clinical trials in rheumatoid arthritis using infliximab,an anti-TNFalpha treatment.Ann Rheum Dis 58增刊1：I61-4.)，一種嵌合抗TNF單株抗體(mAB)，阻斷RA患者中TNF之活性之臨床研究已提供以下證據：TNF調控IL-6、IL-8、MCP-1及VEGF產生、免疫細胞及發炎性細胞募集至關節中、血管生成及基質金屬蛋白酶1及3之血液含量之降低。類風濕性關節炎中之發炎路徑之更好理解已得以鑑別涉及類風濕性關節炎之其他治療性標靶。在過去一年中，諸如介白素6拮抗劑(MRA)、CTLA4Ig(阿巴西普(abatacept)；Genovese Mc等人2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition.N Engl J Med.353：1114-23.)及抗B細胞療法(利妥昔單抗；Okamoto H,Kamatani N.2004 Rituximab for rheumatoid arthritis.N Engl J Med.351：1909)之具前景之治療已在隨機對照試驗中進行測試。已鑑別其他細胞因子且已顯示其在動物模型中具有益處，包括介白素15、介白素17及介白素18，且此等試劑之臨床試驗當前處於進行中。組合抗TNF與另一介體之雙重特異性抗體療法在增強臨床功效及/或患者覆蓋率方面具有極大潛力。舉例而言，阻斷TNF與VEGF可潛在地根除發炎及血管生成，該兩者均涉及RA之病理生理學。亦涵蓋用特定FIT-Ig Ig阻斷涉及RA之其他標靶對，包括但不限於TNF與IL-18；TNF與IL-12；TNF與IL-23；TNF與IL-1β；TNF與MIF；TNF與IL-17；及TNF與IL-15。除此等標靶對之常規安全性評估以外，免疫抑制程度之特異性測試可為有必要的且有助於選擇最佳標靶對(參見Luster等人，Toxicology(1994),92(1-3),229-43；Descotes等人，Developments in biological standardization(1992),7799-102；Hart等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology(2001),108(2),250-257)。FIT-Ig Ig分子是否將適用於治療類風濕性關節炎可使用臨床前動物RA模型來評估，諸如膠原蛋白誘發之關節炎小鼠模型。其他適用模型在此項技術中亦為熟知的(參見Brand DD.,Comp Med.(2005)55(2)：114-22)。

全身性紅斑狼瘡(SLE)之免疫病原性標記為多株B細胞活化，其導致高球蛋白血症、自體抗體產生及免疫複合物形成。根本異常似乎為由於廣泛性T細胞調控異常所致之T細胞無法抑制禁止之B細胞純系。另外，B細胞與T細胞相互作用係由諸如IL-10之若干細胞因子以及諸如CD40及CD40L、B7及CD28及CTLA-4之共刺激分子來促進，該等共刺激分子起始第二信號。此等相互作用連同免疫複合物及細胞凋亡物質之受損吞噬細胞清除一起維持免疫反應，結果導致組織損傷。以下標靶可涉及SLE且可潛在地用於治療性介入之FIT-Ig方法：B細胞靶向療法：CD-20、CD-22、CD-19、CD28、CD4、CD80、HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFSF5、TNFSF6、BLR1、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、SLA2、CD81、IFNB1、IL10、TNFRSF5、TNFRSF7、TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、INHBA、KLF6、TNFRSF7、CD28、CD38、CD69、CD80、CD83、CD86、DPP4、FCER2、IL2RA、TNFRSF8、TNFSF7、CD24、CD37、CD40、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、MS4A1、ST6GAL1、CD1C、CHST10、HLA-A、HLA-DRA及NT5E；共刺激信號：CTLA-4或B7.1/B7.2；抑制B細胞存活：BlyS、BAFF；補體滅活：C5；細胞因子調節：關鍵原理為任何組織中之淨生物反應為促炎性或消炎性細胞因子之局部含量之間平衡的結果(參見Sfikakis PP等人2005 Curr Opin Rheumatol 17：550-7)。SLE視為Th-2驅動之疾病，有文獻記載血清IL-4、IL-6、IL-10升高。亦涵蓋能夠結合一或多個選自由以下組成之群的標靶的FIT-Ig Ig：IL-4、IL-6、IL-10、IFN-a及TNF-a。上文所論述之標靶之組合將增強對SLE之治療功效，此可在許多狼瘡臨床前模型中測試(參見Peng SL(2004)Methods Mol Med.；102：227-72)。

多發性硬化症(MS)為具有主要未知之病源之複雜人類自體免疫型疾病。在整個神經系統中髓磷脂鹼性蛋白(MBP)之免疫破壞為多發性硬化症之主要病理。MS為複雜病理之疾病，其涉及由CD4+及CD8+ T細胞浸潤及在中樞神經系統內之反應。在CNS中細胞因子、反應性氮物質及共刺激分子之表現已在MS中均有描述。主要考慮有助於自體免疫發展之免疫機制。特定言之，抗原表現、細胞因子與白血球相互作用及幫助平衡/調節諸如Th1及Th2細胞之其他T細胞之調控性T細胞為鑑別治療性標靶之重要區域。

IL-12為由APC產生且促進Th1效應細胞分化之促炎性細胞因子。IL-12在MS患者之發展中病灶中以及受EAE影響之動物中產生。先前顯示，IL-12路徑中之干擾有效預防囓齒動物之EAE，且使用抗IL-12 mAb活體內中和IL-12p40在普通狨之髓磷脂誘發之EAE模型中具有有益作用。

TWEAK為TNF家族之成員，其組成性地表現於中樞神經系統(CNS)中，視細胞類型而定具有促炎性、增殖或細胞凋亡作用。其受體Fn14在CNS中由內皮細胞、反應性星形細胞及神經元表現。TWEAK及Fn14 mRNA表現在實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)期間在脊髓中有所增加。C57BL/6小鼠之髓磷脂寡樹突細胞醣蛋白(MOG)誘發之EAE的抗TWEAK抗體治療當在引發期之後治療小鼠時使得疾病嚴重性及白血球浸潤降低。

本發明之一個態樣有關能夠結合一或多個、較佳兩個選自由以下組成之群之標靶的FIT-Ig Ig分子：IL-12、TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、IL-18、VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200、IFNγ、GM-CSF、FGF、C5、CD52及CCR2。一較佳實施例包括雙重特異性抗IL-12/TWEAK FIT-Ig Ig作為有益於治療MS之治療劑。用於評估FIT-Ig分子治療MS之有用性之若干動物模型在此項技術中為已知的(參見Steinman L等人，(2005)Trends Immunol.26(11)：565-71；Lublin FD.等人，(1985)Springer Semin Immunopathol.8(3)：197-208；Genain CP等人，(1997)J Mol Med.75(3)：187-97；Tuohy VK等人，(1999)J Exp Med.189(7)：1033-42；Owens T等人，(1995)Neurol Clin.13(1)：51-73；及't Hart BA等人，(2005)J Immunol 175(7)：4761-8。除此等標靶對之常規安全性評估以外，免疫抑制程度之特異性測試可為有必要的且有助於選擇最佳標靶對(參見Luster等人，Toxicology(1994),92(1-3),229-43；Descotes等人，Developments in biological standardization(1992),77 99-102；Jones R.2000 Rovelizumab(ICOS Corp).IDrugs.3(4)：442-6)。

敗血症之病理生理學係由革蘭氏陰性生物體之外膜組分(脂多醣[LPS]、脂質A、內毒素)與革蘭氏陽性生物體之外膜組分(脂磷壁酸、肽聚糖)起始。此等外膜組分能夠結合單核細胞表面上之CD14受體。藉助於最近描述之類鐸受體，接著將信號傳輸至細胞，使得最終產生促炎性細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)及介白素1(IL-I)。壓製發炎反應及免疫反應為敗血性休克之基本特徵，且在敗血症誘發之組織損傷、多器官衰竭及死亡之發病機制中充當核心部分。細胞因子、尤其腫瘤壞死因子(TNF)及介白素(IL)-1已顯示為敗血性休克之關鍵介體。此等細胞因子對組織具有直接毒性作用；其亦活化磷脂酶A2。此等及其他作用使得血小板活化因子之濃度增加，促進一氧化氮合成酶活性，促進嗜中性白血球對組織之浸潤，及促進嗜中性白血球活性。

敗血症及敗血性休克之治療仍為臨床難題，且使用針對發炎反應之生物反應調節劑(亦即，抗TNF、抗MIF)之新近前瞻性實驗已顯示僅適度之臨床效益。最近，關注已轉向旨在逆轉免疫抑制之伴隨期的療法。在實驗動物及危重患者中之研究已證實，淋巴器官及一些實質組織之細胞凋亡增加有助於此免疫抑制、無反應性及器官系統功能障礙。在敗血症候群期間，淋巴細胞凋亡可藉由不存在IL-2或藉由釋放糖皮質激素、顆粒酶或以下所謂的『死亡』細胞因子來觸發：腫瘤壞死因子α或Fas配位體。細胞凋亡經由細胞溶質及/或粒線體半胱天冬酶之自體活化而進行，其可受Bcl-2家族之促細胞凋亡及抗細胞凋亡成員所影響。在實驗動物中，用細胞凋亡抑制劑治療不僅可防止淋巴樣細胞凋亡；而且可改良結果。儘管使用抗細胞凋亡劑之臨床試驗仍然遙遠，此大部分歸因於與其投藥及組織靶向相關之技術困難，但淋巴細胞凋亡之抑制表示敗血症患者之具吸引力之治療性標靶。同樣地，靶向發炎性介體與細胞凋亡介體之雙重特異性藥劑可具有附加效益。本發明之一個態樣有關能夠結合一或多個涉及敗血症之標靶、較佳兩個標靶之FIT-Ig Ig，該一或多個標靶選自由以下組成之群：TNF、IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、IL-12、IL-23、FasL、LPS、類鐸受體、TLR-4、組織因子、MIP-2、ADORA2A、CASP1、CASP4、IL10、IL1B、NFKB1、PROC、TNFRSF1A、CSF3、IL10、IL1B、IL6、ADORA2A、CCR3、IL10、IL1B、IL1RN、MIF、NFKB1、PTAFR、TLR2、TLR4、GPR44、HMOX1、中期因子、IRAK1、NFKB2、SERPINA1、SERPINE1及TREM1。該等FIT-Ig Ig對敗血症之功效可在此項技術中已知的臨床前動物模型中加以評估(參見Buras JA等人，(2005)Nat Rev Drug Discov.4(10)：854-65及Calandra T等人，(2000)Nat Med.6(2)：164-70)。

慢性神經退化性疾病通常為年齡依賴性疾病，其特徵在於神經元功能之進行性損失(神經元細胞死亡、髓鞘脫夫)、活動性損失及記憶損失。構成慢性神經退化性疾病(例如阿茲海默氏病)之基礎之機制的新興知識顯示複雜病源學，且已認識到多種因素促成其發展及進展，例如年齡、血糖狀態、澱粉樣蛋白產生及多聚、結合其受體RAGE(AGE之受體)之晚期糖基化終產物(AGE)之積聚、腦氧化應激增加、大腦血流量減少、包括釋放發炎性細胞因子及趨化因子之神經發炎、神經元功能障礙及小膠質細胞活化。因此，此等慢性神經退化性疾病表示多種細胞類型與介體之間的複雜相互作用。該等疾病之治療策略為有限的且主要在於用非特異性消炎劑(例如皮質類固醇、COX抑制劑)或藥劑阻斷發炎過程以防止神經元損失及/或突觸功能。此等治療無法停止疾病進展。新近研究表明，更具靶向性之療法，諸如針對可溶性A-β肽(包括A-b寡聚形式)之抗體，不僅可幫助停止疾病進展，而且亦可幫助維持記憶。此等初步觀測結果表明，靶向一個以上疾病介體(例如A-β及促炎性細胞因子，諸如TNF)之特異性療法與靶向單一疾病機制(例如單獨之可溶性A-β)所觀測之結果相比可提供對慢性神經退化性疾病甚至更佳之治療功效(參見C.E.Shepherd等人，Neurobiol Aging.2005年10月24日；Nelson RB.,Curr Pharm Des.2005；11：3335；William L.Klein.；Neurochem Int.2002；41：345；Michelle C Janelsins等人，J Neuroinflammation. 2005；2：23；Soloman B.,Curr Alzheimer Res.2004；1：149；Igor Klyubin等人，Nat Med.2005；11：556-61；Arancio O等人，EMBO Journal(2004)1-10；Bornemann KD等人，Am J Pathol.2001；158：63；Deane R等人，Nat Med.2003；9：907-13；及Eliezer Masliah等人，Neuron.2005；46：857)。

本發明之FIT-Ig分子可結合一或多個涉及慢性神經退化性疾病(諸如阿茲海默氏病)之標靶。該等標靶包括但不限於牽涉於AD發病機制中之任何可溶性或細胞表面介體，例如AGE(S100 A、兩性黴素)、促炎性細胞因子(例如IL-1)、趨化因子(例如MCP 1)、抑制神經再生之分子(例如Nogo、RGM A)、增強神經突生長之分子(神經營養蛋白)。FIT-Ig分子之功效可在臨床前動物模型中驗證，諸如過度表現澱粉樣蛋白前驅蛋白或RAGE且顯現類阿茲海默氏病症狀之轉殖基因小鼠。另外，可構築FIT-Ig分子且在動物模型中測試其功效，且可選擇最佳治療性FIT-Ig用於在人類患者中進行測試。亦可採用FIT-Ig分子治療其他神經退化性疾病，諸如帕金森氏病。α-突觸核蛋白涉及帕金森氏病理學。能夠靶向α-突觸核蛋白及發炎性介體(諸如TNF、IL-1、MCP-1)之FIT-Ig可證實為帕金森氏病之有效療法且涵蓋於本發明中。

儘管病理機制之知識增多，但脊髓損傷(SCI)仍為破壞性病狀且表示以高醫療需要為特徵之醫學適應症。大多數脊髓損傷為挫傷或壓迫損傷，且原發性損傷後通常為繼發性損傷機制(發炎性介體，例如細胞因子及趨化因子)，該等機制惡化初始損傷且使得病灶區域顯著擴大，有時超過10倍。SCI中之此等原發性及繼發性機制非常類似於由其他方式(例如中風)引起之腦損傷中之機制。不存在令人滿意之治療，且甲基潑尼松龍(MP)之高劑量團注為在損傷後8小時之窄時間窗內唯一使用之療法。然而，此治療僅欲預防繼發性損傷，而不會引起任何顯著功能恢復。缺乏明確功效及嚴重副作用倍受批評，如伴有後續感染及嚴重組織病理性肌肉改變之免疫抑制。並無刺激內源性再生潛力之其他藥物、生物劑或小分子獲批准，但具前景之治療原則及藥物候選物近年來已在動物SCI模型中顯示出功效。人類SCI中功能恢復之缺乏在很大程度上由抑制病灶部位處、瘢痕組織中、髓磷脂中以及損傷相關細胞上之神經突生長之因子引起。該等因子為髓磷脂相關蛋白NogoA、OMgp及MAG、RGM A、瘢痕相關CSPG(硫酸軟骨素蛋白聚糖)，及反應性星形細胞上之抑制因子(一些導向蛋白(semaphorin)及肝配蛋白(ephrin))。然而，在病灶部位處，不僅發現生長抑制分子，而且發現神經突生長刺激因子，如神經營養蛋白、層黏連蛋白(laminin)、L1及其他。神經突生長抑制及生長促進分子之此總體可說明，阻斷單一因子，如NogoA或RGM A，促成囓齒動物SCI模型中之顯著功能恢復，此係由於抑制性影響之降低可將平衡自生長抑制轉變至生長促進。然而，阻斷單一神經突外生抑制分子所觀測之恢復為不完全的。為達成更快且更明顯之恢復，可能需要阻斷兩個神經突外生抑制分子(例如Nogo及RGM A)，或阻斷神經突外生抑制分子且增強神經突外生增強分子之功能(例如Nogo及神經營養蛋白)，或阻斷神經突外生抑制分子(例如Nogo)及促炎性分子(例如TNF)(參見McGee AW等人，Trends Neurosci.2003；26：193；Marco Domeniconi等人，J Neurol Sci.2005；233：43；Milan Makwanal等人，FEBS J.2005；272：2628；Barry J.Dickson,Science.2002；298：1959；Felicia Yu Hsuan Teng等人，J Neurosci Res.2005；79：273；Tara Karnezis等人，Nature Neuroscience 2004；7,736；Gang Xu等人，J.Neurochem.2004；91；1018)。

所涵蓋之其他FIT-Ig為能夠結合以下標靶對之FIT-Ig：諸如NgR與RGM A；NogoA與RGM A；MAG與RGM A；OMGp與RGM A；RGM A與RGM B；CSPG與RGM A；聚集蛋白聚糖、中期因子、神經蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、Te38與TNF-a；與促進樹突及軸突出芽之抗體組合之Aβ球聚體特異性抗體。樹突病理為AD之極早期徵象，且已知NOGO A限制樹突生長。可組合該類型之ab與SCI候選物(髓磷脂蛋白)Ab中之任一種。其他FIT-Ig標靶可包括NgR-p75、NgR-Troy、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-Lingo、Lingo-Troy、Lingo-p75、MAG或Omgp之任何組合。另外，標靶亦可包括牽涉於神經突抑制中之任何可溶性或細胞表面介體，例如Nogo、Ompg、MAG、RGM A、導向蛋白、肝配蛋白、可溶性A-b、促炎性細胞因子(例如IL-1)、趨化因子(例如MIP 1a)、抑制神經再生之分子。抗nogo/抗RGM A或類似FIT-Ig分子之功效可在脊髓損傷之臨床前動物模型中驗證。另外，可構築此等FIT-Ig分子且在動物模型中測試其功效，且可選擇最佳治療性FIT-Ig用於在人類患者中進行測試。另外，可構築FIT-Ig分子，其靶向單一受體上之兩個不同配位體結合位點，該受體為例如結合三個配位體Nogo、Ompg及MAG之Nogo受體及結合A-b與S100 A之RAGE。此外，神經突外生抑制劑，例如nogo及nogo受體，亦在防止免疫疾病(如多發性硬化症)之神經再生中起作用。nogo-nogo受體相互作用之抑制已顯示增強多發性硬化症之動物模型之恢復。因此，可阻斷一個免疫介體(例如細胞因子，如IL-12)及神經突外生抑制劑分子(例如nogo或RGM)之功能之FIT-Ig分子與阻斷單獨之免疫或神經突外生抑制劑分子相比可提供更快且更高之功效。

單株抗體療法已成為癌症之重要治療模態(von Mehren M等人2003 Monoclonal antibody therapy for cancer.Annu Rev Med.；54：343-69)。抗體可藉由誘導細胞凋亡、重定向細胞毒性、干擾配位體-受體相互作用或防止對腫瘤表型而言關鍵之蛋白質表現來發揮抗腫瘤作用。另外，抗體可靶向腫瘤微環境之組分，從而擾亂重要結構，諸如腫瘤相關血管結構之形成。抗體亦可靶向配位體為生長因子之受體，諸如表皮生長因子受體。因此，抗體抑制刺激細胞生長之天然配位體結合經靶向之腫瘤細胞。或者，抗體可誘導抗獨特型網路、補體介導之細胞毒性或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。靶向兩個獨立腫瘤介體之雙重特異性抗體的使用與單特異性療法相比將可能產生額外效益。亦涵蓋能夠結合以下標靶對以治療腫瘤疾病之FIT-Ig Ig：IGF1與IGF2；IGF1/2與Erb2B；VEGFR與EGFR；CD20與CD3、CD138與CD20、CD38與CD20、CD38與CD138、CD40與CD20、CD138與CD40、CD38與CD40。其他標靶組合包括EGF/erb-2/erb-3家族之一或多個成員。FIT-Ig Ig可結合之涉及腫瘤疾病之其他標靶(一或多個)包括但不限於選自由以下組成之群的標靶：CD52、CD20、CD19、CD3、CD4、CD8、BMP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、FGF1、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GRP、IGF1、IGF2、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、VEGF、CDK2、 EGF、FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、IGF1、IGF1R、IL2、VEGF、BCL2、CD164、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、GNRH1、IGFBP6、IL1A、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、TGFB1I1、AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、E2F1、EGFR、ENO1、ERBB2、ESR1、ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、MYC、NOX5、NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、NR1H3、NR1I3、NR2F6、NR4A3、ESR1、ESR2、NR0B1、NR0B2、NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR5A1、NR5A2、NR6A1、PGR、RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT1、APOC1、BRCA1、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1、COL6A1、EGF、ERBB2、ERK8、FGF1、FGF10、FGF11、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GNRH1、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGFBP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、INSL3、INSL4、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1、PAP、PLAU、PRL、PSAP、SERPINA3、SHBG、TGFA、TIMP3、CD44、CDH1、CDH10、CDH19、CDH20、CDH7、CDH9、CDH1、CDH10、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH7、CDH8、CDH9、ROBO2、CD44、ILK、ITGA1、APC、CD164、COL6A1、MTSS1、PAP、TGFB1I1、AGR2、AIG1、AKAP1、AKAP2、CANT1、CAV1、CDH12、CLDN3、CLN3、CYB5、CYC1、DAB2IP、DES、DNCL1、ELAC2、ENO2、ENO3、FASN、FLJ12584、FLJ25530、GAGEB1、GAGEC1、GGT1、GSTP1、HIP1、HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、KRT2A、MIB1、PART1、PATE、PCA3、PIAS2、PIK3CG、PPID、PR1、PSCA、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、ECGF1、EREG、FGF1、FGF2、FIGF、FLT1、JAG1、KDR、LAMA5、NRP1、NRP2、 PGF、PLXDC1、STAB1、VEGF、VEGFC、ANGPTL3、BAI1、COL4A3、IL8、LAMA5、NRP1、NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINF1、TNFAIP2、CCL11、CCL2、CXCL1、CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IFNA1、IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CCL2、CDH5、COL18A1、EDG1、ENG、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、BAD、BAG1、BCL2、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CDH1(E-鈣黏蛋白)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN2A(p16INK4a)、COL6A1、CTNNB1(b-連環蛋白)、CTSB(組織蛋白酶B)、ERBB2(Her-2)、ESR1、ESR2、F3(TF)、FOSL1(FRA-1)、GATA3、GSN(凝溶膠蛋白)、IGFBP2、IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST(醣蛋白130)、ITGA6(a6整合素)、JUN、KLK5、KRT19、MAP2K7(c-Jun)、MKI67(Ki-67)、NGFB(NGF)、NGFR、NME1(NM23A)、PGR、PLAU(uPA)、PTEN、CTLA-4、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDF8、CGRP、Lingo-1、ICOS、GARP、BTLA、CD160、ROR1、SERPINB5(乳房絲抑蛋白)、SERPINE1(PAI-1)、TGFA、THBS1(血小板反應蛋白-1)、TIE(Tie-1)、TNFRSF6(Fas)、TNFSF6(FasL)、TOP2A(拓撲異構酶Iia)、TP53、AZGP1(鋅-a-醣蛋白)、BPAG1(網蛋白)、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CLDN7(密連蛋白-7)、CLU(簇集蛋白)、ERBB2(Her-2)、FGF1、FLRT1(纖連蛋白)、GABRP(GABAa)、GNAS1、ID2、ITGA6(a6整合素)、ITGB4(b4整合素)、KLF5(GC Box BP)、KRT19(角蛋白19)、KRTHB6(毛髮特異性II型角蛋白)、MACMARCKS、MT3(金屬硫黏連蛋白-III)、MUC1(黏蛋白)、PTGS2(COX-2)、RAC2(p21Rac2)、S10OA2、SCGB1D2(親脂素B)、SCGB2A1(乳房球蛋白2)、SCGB2A2(乳房球蛋白1)、SPRR1B(Spr1)、THBS1、THBS2、THBS4及TNFAIP2(B94)。

在一實施例中，可用本文所提供之組成物及方法治療或診斷之疾病包括但不限於原發性及轉移性癌症，包括乳房、結腸、直腸、肺、口咽、下嚥、食道、胃、胰臟、肝、膽囊及膽管、小腸、泌尿道(包括腎、膀胱及尿道上皮)、女性生殖道(包括子宮頸、子宮及卵巢以及絨毛膜癌及妊娠滋養細胞疾病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睪丸及生殖細胞腫瘤)、內分泌腺(包括甲狀腺、腎上腺及垂體腺)及皮膚之癌瘤，以及血管瘤，黑色素瘤，肉瘤(包括由骨骼及軟組織產生之肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，腦、神經、眼睛及腦膜之腫瘤(包括星形細胞瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神經母細胞瘤、許旺氏細胞瘤(Schwannoma)及腦膜瘤)，由造血惡性病(諸如白血病)產生之實體腫瘤，及淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤與非霍奇金氏淋巴瘤)。

在一實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合部分當單獨或與放射線療法及/或其他化學治療劑組合使用時用於治療癌症或預防本文中所描述之腫瘤轉移。

根據本發明之另一實施例，人類免疫效應細胞為人類淋巴樣細胞譜系之成員。在此實施例中，效應細胞宜為人類T細胞、人類B細胞或人類自然殺手(NK)細胞。有利地，該等細胞將對靶細胞具有細胞毒性或細胞凋亡作用。尤其有利地，人類淋巴樣細胞為細胞毒性T細胞，其當活化時對靶細胞發揮細胞毒性作用。根據此實施例，人類效應細胞之募集活性則為此細胞之細胞毒性活性。

根據一較佳實施例，細胞毒性T細胞之活化可經由用本發明之此實施例之雙特異性抗體結合細胞毒性T細胞表面上作為效應抗原之CD3抗原而發生。人類CD3抗原存在於輔助T細胞與細胞毒性T細胞上。人類CD3表示如下抗原：其作為多分子T細胞複合物之一部分表現於T細胞上且包含三個不同鏈：CD3-ε、CD3-δ及CD3-γ。

T細胞之細胞毒性潛力之活化為需要多個蛋白質之相互作用之複雜現象。T細胞受體(「TCR」)蛋白為由兩個不同的醣蛋白次單元組成之膜結合二硫鍵連接之雜二聚體。TCR識別並結合外來肽抗原，該抗原本身已由高度多樣化類別之主要組織相容性複合物(「MHC」)蛋白之成員結合且已呈與MHC結合之形式呈現於抗原呈現細胞(「APC」)之表面上。

儘管可變TCR結合如上文所概述之外來抗原，但向已發生此結合之T細胞進行信號傳導視與TCR締合之其他不變信號蛋白的存在而定。此等呈締合形式之信號蛋白統稱作CD3複合物，此處統稱作CD3抗原。

因而，T細胞細胞毒性之活化通常首先視TCR與MHC蛋白之結合而定，MHC蛋白本身結合位於獨立細胞上之外來抗原。僅當此初始TCR-MHC結合已發生時，CD3依賴性信號傳導級聯可負責T細胞純系擴張且最終隨之產生T細胞細胞毒性。

然而，人類CD3抗原由本發明之雙特異性抗體之第一或第二部分結合活化T細胞以在不存在非依賴性TCR-MHC結合之情況下對其他細胞發揮細胞毒性作用。此意謂T細胞可依純系非依賴性方式，即依不依賴於T細胞所帶有之特異性TCR純系之方式進行細胞毒性活化。此允許活化完整T細胞區室而非僅活化某種純系身分之特異性T細胞。

鑒於前述論述，因而，本發明之一尤其較佳實施例提供一種雙特異性抗體，其中效應抗原為人類CD3抗原。根據本發明之此實施例之雙特異性抗體可具有總共兩個或三個抗體可變域。

根據本發明之其他實施例，由本發明之雙特異性抗體結合之其他淋巴樣細胞相關效應抗原可為人類CD16抗原、人類NKG2D抗原、人類NKp46抗原、人類CD2抗原、人類CD28抗原或人類CD25抗原。

根據本發明之另一實施例，人類效應細胞為人類骨髓細胞譜系之成員。有利地，效應細胞可為人類單核細胞、人類嗜中性粒細胞或人類樹突狀細胞。有利地，該等細胞將對靶細胞具有細胞毒性或細胞凋亡作用。在此實施例內可由本發明之雙特異性抗體結合之有利抗原可為人類CD64抗原或人類CD89抗原。

根據本發明之另一實施例，靶抗原為在疾病狀態下獨特表現於靶細胞或效應細胞上，但在健康狀態中保持不表現、以低水準表現或不可及之抗原。可能由本發明之雙特異性抗體特異性結合之該等靶抗原之實例宜選自EpCAM、CCR5、CD19、HER-2 neu、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1(黏蛋白)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、βhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神經節苷脂GD3、9-O-乙醯基-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖基GM1、Poly SA、GD2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CD44v6、音蝟因子(Sonic Hedgehog；Shh)、Wue-1、漿細胞抗原、(膜結合)IgE、黑色素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、CCR8、TNF-α 前驅體、STEAP、間皮素(mesothelin)、A33抗原、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly-6、橋粒芯蛋白4(desmoglein 4)、E-鈣黏蛋白新抗原決定基、胎兒乙醯膽鹼受體、CD25、CA19-9標記物、CA-125標記物及穆勒氏抑制物質(Muellerian Inhibitory Substance；MIS)受體II型、sTn(唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(纖維母細胞活化抗原)、內皮唾液酸蛋白(endosialin)、EGFRvIII、LG、SAS及CD63。

根據一特定實施例，由雙特異性抗體特異性結合之靶抗原可為癌症相關抗原，其為與惡性病狀相關之抗原。此種抗原在惡性細胞上表現或可及，而該抗原在非惡性細胞上不存在、不明顯存在或不可及。因此，根據本發明之此實施例之雙特異性抗體為募集針對帶有靶抗原或促使靶抗原易接近之惡性靶細胞的人類免疫效應細胞之活性的雙特異性抗體。

基因療法：在一特定實施例中，投與編碼本文所提供之結合蛋白質或本文所提供之另一預防劑或治療劑之核酸序列以經由基因療法治療、預防、管理或改善病症或其一或多種症狀。基因療法係指藉由向個體投與經表現或可表現之核酸而進行之療法。在此實施例中，核酸產生其經編碼之抗體或本文所提供之預防劑或治療劑，該預防劑或治療劑介導預防或治療效應。

此項技術中可用於基因療法之方法中之任一種均可用於本文所提供之方法中。對於基因療法之方法之一般綜述，參見Goldspiel等人(1993)Clin.Pharmacy 12：488-505；Wu及Wu(1991)Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev(1993)Ann Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)Science 260：926-932；Morgan及Anderson(1993)Ann Rev.Biochem.62：191-217；及May(1993)TIBTECH 11(5)：155-215。可使用之重組DNA技術之此項技術中通常已知的方法描述於Ausubel等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley &Sons,NY(1993)；及Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)中。對基因療法之多種方法之詳細描述揭示於美國專利公開案第US20050042664號中。

診斷：本發明在本文中亦提供診斷應用，其包括但不限於診斷分析方法、含有一或多種結合蛋白質之診斷套組，及用於自動化及/或半自動化系統中之方法及套組的改適。可在偵測、監測及/或治療個體之疾病或病症中採用所提供之方法、套組及改適。此在下文進一步闡明。

A.分析方法：本發明亦提供一種使用如本文中所描述之至少一種結合蛋白質確定測試樣品中分析物或其片段之存在、量或濃度之方法。如此項技術中已知的任何適合分析法可在該方法中使用。實例包括但不限於免疫分析法及/或採用質譜法之方法。本發明所提供之免疫分析法尤其可包括夾心免疫分析法、放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、競爭抑制免疫分析法、螢光偏振免疫分析法(EPIA)、酶倍增免疫分析技術(EMIT)、生物發光共振能量轉移(BRET)及均相化學發光分析法。化學發光微粒子免疫分析法，尤其採用ARCHITECT®自動化分析儀(Abbott Laboratories，Abbott Park，Ill.)之免疫分析法，為免疫分析法之一實例。採用質譜法之方法由本發明提供，且包括但不限於基質輔助雷射脫附/電離(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)或表面增強雷射脫附/電離(surface-enhanced laser desorption/ionization，SELDI)。

提供熟習此項技術者將熟知的用於收集、操作、處理以及使用免疫分析法及質譜法分析生物測試樣品之方法以用於實施本發明(US 2009-0311253 A1)。

B.套組：亦提供一種用於分析測試樣品中分析物或其片段之存在、量或濃度之套組。該套組包含至少一種用於分析測試樣品之分析物或其片段之組分，及用於分析測試樣品之分析物或其片段之說明書。該至少一種用於分析測試樣品之分析物或其片段之組分可包括包含如本文所揭示之結合蛋白質及/或抗分析物結合蛋白質(或其片段、變異體或變異體片段)之組成物，該組成物視情況固定於固相上。視情況，套組可包含校準器或對照，其可包含經分離或純化之分析物。套組可包含至少一種用於藉由免疫分析法及/或質譜法分析測試樣品之分析物之組分。包括分析物、結合蛋白質及/或抗分析物結合蛋白質或其片段之套組組分可視情況使用任何技術已知的可偵測標記作標記。為了實施本發明而提供之材料及創造方法將為熟習此項技術者所知(US 2009-0311253 A1)。

C.對套組及方法之改適：藉由分析法，諸如本文中所描述之免疫分析法確定測試樣品中分析物之存在、量或濃度之套組(或其組分)以及方法可經改適用於多種自動化及半自動化系統(包括固相包含微粒子之系統)中，該等系統如例如美國專利第5,089,424號及第5,006,309號中所描述，且如例如由Abbott Laboratories(Abbott Park，Ill.)作為ARCHITECT®商業銷售。可獲自Abbott Laboratories之其他平台包括但不限於AxSYM®、IMx®(參見例如美國專利第5,294,404號)、PRISM®、EIA(珠粒)及Quantum^TM II，以及其他平台。另外，分析法、套組及套組組分可呈其他格式採用，例如，在電化學或其他掌上型或定點照護分析系統上。本發明例如可應用於執行夾心免疫分析法之市售Abbott定點照護(i-STAT®，Abbott Laboratories)電化學免疫分析系統。免疫感測器以及其製造及在單次使用測試裝置中操作之方法描述於例如美國專利第5,063,081號、第7,419,821號及第7,682,833號；以及美國公開案第20040018577號、第20060160164號及第US 20090311253號中。熟習此項技術者應易於瞭解，本文中所描述之方法之其他適合修改及改適為顯而易見的，且在不脫離本文所揭示之實施例之範疇的情況下可使用適合之等效物進行。現已詳細描述某些實施例，藉由參考以下實施例將更清楚地理解上述內容，該等實施例僅出於說明之目的而包括且不欲具限制性。

儘管出於清楚理解之目的已經由說明及舉例相當詳細地描述前述發明內容，但一般技術者鑒於本發明之教示應易於瞭解，在不脫離隨附白請專利範圍之精神或範疇的情況下可對其作出某些改變及修改。以下實施例僅作為說明且不作為限制而提供。熟習此項技術者應易於認識到可經改變或修改以得到基本上類似之結果的多種非關鍵參數。

實例

實例1. 抗IL17/IL-20 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之構築、表現、純化及分析

為了顯示FIT-Ig技術，吾等已產生一組抗IL-17/IL-20 FIT-Ig分子：FIT1-Ig、FIT2-Ig及FIT3-Ig，其全部含有3個不同多肽，如圖1A及圖1B中所示，其中抗原A為IL-17且抗原B為IL-20。用於產生能夠結合IL-17與IL-20之FIT-Ig之DNA構築體說明於圖1B中。簡言之，親本mAb包括兩個高親和力抗體，抗IL-17(純系LY)(美國專利第7,838,638號)及抗hIL-20(純系15D2)(美國專利申請公開案第US2014/0194599號)。為了產生FIT-Ig 1號構築體，使LY之VL-CL直接(FIT1-Ig)或經由具有3個胺基酸(FIT2-Ig)或7個胺基酸(FIT3-Ig)之連接子而融合至15D2重鏈之N端(如表1中所示)。2號構築體為LY之VH-CH1，且第三構築體為15D2之VL-CL。在293細胞中共轉染各FIT-Ig之3個構築體，從而表現並分泌FIT-Ig蛋白質。

吾等亦產生一組抗IL-17/IL-20 FIT-Ig分子：FIT4-Ig、FIT5-Ig及FIT6-Ig，其各自含有2個不同多肽，如圖2A及圖2B中所示。用於產生能夠結合IL-17與IL-20之FIT-Ig之DNA構築體說明於圖2B中，其中抗原A為IL-17且抗原B為IL-20。簡言之，親本mAb包括兩個高親和力抗體，抗IL-17(純系LY)及抗hIL-20(純系15D2)。為了產生FIT-Ig 1號構築體，使LY之VL-CL直接(FIT4-Ig)或經由具有3個胺基酸(FIT5-Ig)或7個胺基酸(FIT6-Ig)之連接子而融合至15D2重鏈之N端(如表1中所示)。為產生FIT-Ig 4號構築體，LY之VH-CH1直接(FIT4-Ig)，或經由3個胺基酸(FIT5-Ig)或7個胺基酸(FIT6-Ig)之連接子融合至15D2輕鏈之N端。在293細胞中共轉染各FIT-Ig之2個DNA構築體(1號及4號構築體)，從而表現並分泌FIT-Ig蛋白質。PCR選殖之詳細程序描述於下文。

實例1.1：抗IL-17/IL-20 FIT-Ig分子之分子選殖：

對於1號構築體選殖，藉由PCR使用黏接於輕鏈信號序列上之正向引子及黏接於輕鏈C端上之反向引子來擴增LY輕鏈。藉由PCR使用黏接於15D2 VH之N端上之正向引子及黏接於CH之C端上之反向引子來擴增15D2重鏈。對此2個PCR片段進行凝膠純化，且藉由重疊PCR使用信號肽及CH引子對加以組合。將經組合之PCR產物選殖至已含有人類Fc序列之293表現載體中。

對於2號構築體選殖，藉由PCR使用黏接於重鏈信號肽上之正向引子及黏接於CH1之C端上之反向引子來擴增LY VH-CH1。對PCR產物進行凝膠純化，隨後選殖至293表現載體中。

對於3號構築體，藉由PCR使用黏接於輕鏈信號肽之N末端上之正向引子及黏接於CL之末端上之反向引子來擴增15D2輕鏈。對PCR產物進行凝膠純化，隨後選殖至293表現載體中。

對於4號構築體選殖，藉由PCR使用黏接於重鏈信號肽之N端上之正向引子及黏接於CH1之末端上之反向引子來擴增LY VH-CH1。使用黏接於15D2 VL之末端上之引子來擴增15D2 VL。對兩種PCR產物進行凝膠純化，且藉由重疊PCR加以組合。對經組合之PCR產物進行凝膠純化，且選殖至293表現載體中。表2顯示用於上述分子選殖之PCR引子之序列。

hIL-17/hIL-20 FIT1-Ig、FIT2-Ig、FIT3-Ig、FIT4-Ig、FIT5-Ig及FIT6-Ig之最終序列列於表3中。

表3. 抗IL-17/IL-20 FIT-Ig分子之胺基酸序列

實例1.2：抗IL-17/IL-20 FIT-Ig蛋白質之表現、純化及分析：

將各FIT-Ig之所有DNA構築體次選殖至基於pBOS之載體中，且進行定序以確保準確性。使用聚乙烯亞胺(PEI)在293E細胞中短暫地共表現各FIT-Ig(1、2及3)之1號、2號及3號構築體或各FIT-Ig(4、5及6)之1號及4號構築體。簡言之，將FreeStyle^TM 293表現培養基中之DNA與PEI混合，最終濃度為1：2之DNA：PEI比率，在室溫下培育15分鐘(不超過20分鐘)，接著以60μg DNA/120ml培養物添加至293E細胞中(1.0-1.2×10⁶/ml，細胞活力>95%)。在震盪器中培養6-24小時後，在37℃、8% CO₂下，以125rpm/min震盪下將蛋白腖添加至經轉染之細胞中，最終濃度為5%。在第6天至第7天，藉由離心及過濾收集上清液，且根據製造商之說明書，使用蛋白A層析(Pierce，Rockford，IL)來純化FIT-Ig蛋白質。藉由SDS-PAGE來分析蛋白質，且藉由A280及BCA(Pierce，Rockford，IL)來測定其濃度。

對於FIT1-Ig、FIT2-Ig及FIT3-Ig之表現，使用3個構築體之不同DNA莫耳比，包括1號：2號：3號構築體=1：1：1、1號：2號：3號構築體=1：1.5：1.5及1號：2號：3號構築體=1：3：3(表4)。藉由蛋白A層析來純化FIT-Ig蛋白質。純化產量(7-16mg/L)與各蛋白質之表現培養基之hIgG定量一致。藉由SDS-PAGE在還原條件與非還原條件下分析經純化之FIT-Ig之組成及純度。在非還原條件下，FIT-Ig作為約250KDa之單一譜帶遷移。在還原條件下，FIT-Ig蛋白質中之每一者產生兩個譜帶，一個較高MW譜帶為約75KDa之1號構築體，且一個較低MW譜帶對應於在約25KDa處重疊之2號構築體與3號構築體。SDS-PAGE顯示，各FIT-Ig表現為單一物質，且3個多肽鏈有效配對以形成類IgG分子。鏈之大小以及FIT-Ig分子之全長蛋白質與其基於胺基酸序列之計算分子質量一致。

為了進一步研究溶液中FIT-Ig之物理特性，使用粒徑排阻層析(SEC)來分析各蛋白質。對於FIT-Ig之SEC分析，將含經純化之FIT-Ig之PBS施加於TSKgel SuperSW3000，300×4.6mm管柱(TOSOH)上。將HPLC儀器，型號U3000(DIONEX)用於SEC。在280nm及214nm下使用UV偵測來測定所有蛋白質。溶離為0.25mL/min流速之等度溶離。所有3個FIT-Ig蛋白質均展現單一主峰，從而證實作為單體蛋白質之物理同質性(表4)。對於所有3個FIT-Ig蛋白質，藉由SEC分析，1號：2號：3號構築體之比率=1：3：3顯示較佳單體型態(表4)。

表4亦顯示，所有FIT-Ig蛋白質之表現水準與常規mAb之表現水準相當，從而指示FIT-Ig可在哺乳動物細胞中有效表現。對於FIT4-Ig、FIT5-Ig及FIT6-Ig之表現，1號：4號構築體之DNA比率=1：1，且表現水準在1-10mg/L之範圍內，且如藉由SEC所測定之峰值單體分數%在58-76%之範圍內。基於此特定mAb組合(LY與15D2)，3-多肽FIT-Ig構築體(FIT1-Ig、FIT2-Ig及FIT3-Ig)顯示比2-多肽FIT-Ig構築體(FIT4-Ig、FIT5-Ig及FIT6-Ig)更佳之表現形態，因此，進一步分析FIT1-Ig、FIT2-Ig及FIT3-Ig之功能特性。

實例1.3 抗IL-17/IL-20 FIT-Ig之抗原結合親和力之測定

在25℃下，藉由利用Biacore X100儀器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)之表面電漿子共振(表5)，使用HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA及0.005%界面活性劑P20)測定FIT-Ig與rhIL-17與rhIL-20結合之動力學性質。簡言之，根據製造商之說明書，使用標準胺偶合套組將山羊抗人類IgG Fcγ片段特異性多株抗體(Pierce Biotechnology Inc，Rockford，IL)直接固定在CM5研究級生物感測器晶片上。將經純化之FIT-Ig樣品稀釋於HEPES緩衝生理鹽水中以用於在山羊抗人類IgG Fc特異性反應表面上進行捕獲，且以5μl/min之流速注射在反應基質上。在30μL/min之連續流速下測定締合速率常數及解離速率常數，kon(M-1s-1)及koff(s-1)。藉由在1.25至1000nM範圍內之十個不同的抗原濃度下進行動力學結合量測來得到速率常數。接著藉由下式：KD=koff/kon，由動力學速率常數計算FIT-Ig與靶蛋白之間的反應的平衡解離常數(M)。亦將抗原樣品之等分試樣同時注射於空白參考及反應CM表面上以記錄並減去任何非特異性結合背景，從而消除大部分折射率變化及注射雜訊。利用以10μL/min之流速進行10mM甘胺酸(pH 1.5)之兩次後續25ml注射使表面再生。使經抗Fc抗體固定之表面完全再生，且在十二個循環內保留其完全捕獲能力。

Biacore分析指示，三個FIT-Ig與hIL-17及hIL-20結合之總體結合參數類似，其中FIT-Ig之親和力非常接近親本mAb LY及15D2之親和力，且對任一抗原結合域之結合親和力均無損失(表5)。

另外，亦藉由Biacore分析FIT-Ig之四價雙重特異性抗原結合。首先經由山羊抗人類Fc抗體在Biacore感測器晶片上捕獲FIT1-Ig，且注射第一抗原，並且觀測結合信號。在第一抗原使FIT1-Ig飽和時，接著注射第二抗原，且觀測第二信號。對於FIT2-Ig而言，此係藉由首先注射IL-17、接著注射IL-20，或藉由首先注射IL-20、繼而注射IL-17來進行(圖3A及圖3B)。在任一順序中，偵測雙重結合活性，且在25-30RU下使兩個抗原結合飽和。對於FIT2-Ig及FIT3-Ig獲得類似結果。因此，各FIT-Ig作為雙重特異性四價分子能夠同時結合兩個抗原。

FIT-Ig之表現型態及雙重結合特性明確地顯示，在FIT-Ig分子內，兩個VL-CL與其相應VH-CH1正確配對以形成2個功能結合域，且表現為單一單體四價雙特異性全長FIT-Ig蛋白質。此與呈現四價但對一個靶抗原具有單特異性結合活性之多價抗體類型之分子(Miller及Presta，美國專利8722859)相反。

實例1.4 對抗IL-17/IL-20 FIT-Ig之生物學活性之測定

使用GROα生物分析法來量測FIT-Ig中和IL-17功能之生物學活性。簡言之，將Hs27細胞以10000個細胞/50μL/孔接種於96孔盤中。將FIT-Ig或抗IL-17對照抗體(25μL)添加至一式兩份之孔中，起始濃度為2.5nM，繼而進行1：2連續稀釋直至5pM。接著將IL-17A(25μL)添加至各孔中。IL-17A之最終濃度為0.3nM。在37℃下將細胞培育17小時，隨後收集細胞培養物上清液。根據製造商之方案(R&D systems)，藉由人類CACL1/GROα Quantikine套組來量測細胞培養物上清液中GRO-α之濃度。

使用IL-20R⁺ BAF3細胞增殖分析法來量測FIT-Ig中和IL-20功能之生物學活性。簡言之，將25μL 0.8nM重組人類IL-20添加至96孔盤之各孔中(IL-20之最終濃度為0.2nM)。將抗IL20抗體或FIT-Ig或其他對照抗體稀釋至400nM(工作濃度為100nM)，繼而進行5倍連續稀釋，且添加至96孔分析盤中(每孔25μL)。接著將經IL-20受體穩定轉染之BaF3細胞以10000個細胞/孔之濃度添加至各孔中之50μL體積之RPMI 1640加10% FBS、800μg/ml濃度之潮黴素B、800μg/ml濃度之G418中。培育48小時後，將100μL CellTiter-Glo發光緩衝液添加至各孔中。在定軌震盪器上將內含物混合2分鐘以誘導細胞溶解，且在室溫下將盤培育10分鐘以使發光信號穩定。藉由SpectraMax M5來記錄發光。

如表5中所示，所有FIT-Ig均能夠中和hIL-20與hIL-17，其親和力類似於親本抗體之親和力。基於使用Biacore與基於細胞之中和分析法的功能分析，似乎所有3個FIT-Ig均完全保留親本mAb之活性。在三個FIT-Ig之間不存在顯著功能差異，從而指示連接子為視情況存在的，且FIT-Ig構築體提供足夠可撓性及特殊尺寸以允許在2個Fab結合區之間不存在肽間隔基之情況下進行雙重結合。此與需要介於2個多肽鏈中之每一者上之2個可變域之間的連接子以保留下部(第二)可變域之活性的DVD-Ig類型分子相反。

實例1.5 抗IL-17/IL-20 FIT-Ig之穩定性研究

在恆定4℃、25℃及40℃下將含FIT1-Ig蛋白質樣品之檸檬酸鹽緩衝液(pH=6.0)個別地培育1天、3天或7天；類似地，將FIT1-Ig蛋白質樣品冷凍-解凍一次、兩次或三次。藉由SEC-HPLC偵測所有樣品之完整全單體蛋白質之分數，其中將10μg各蛋白質樣品以0.3mL/min之流速注射至配備Superdex200 5/150 GL之Utimate 3000 HPLC中，持續15分鐘，且記錄資料，且使用由製造商提供之Chromeleon軟體加以分析。表6顯示，FIT1-Ig及FIT3-Ig在此等熱攻擊條件下保持完全完整單體分子。

表6. 藉由以SEC量測完全單體分數%對FIT-Ig進行穩定性分析

實例1.6 抗IL-17/IL-20 FIT-Ig之溶解度研究

藉由在漸增濃度之PEG6000(PEG6000購自Shanghai lingfeng chemical reagent co.Ltd)存在下量測沈澱之跡象來分析FIT1-Ig之溶解度。簡言之，獲得在PEG6000存在下之蛋白質溶解度隨PEG6000濃度(0、5%、10%、15%、20%、25%及30%)變化之函數。在25℃之溫度下於6.0之溶液pH值下進行溶解度研究。簡言之，藉由混合適量之蛋白質緩衝儲備溶液、PEG及緩衝液以得到組分之所要濃度來使蛋白質沈澱。將最終體積補足至200μl，且蛋白質之濃度設定於1.0mg/mL。充分混合最終溶液且平衡16小時。平衡後，使溶液以13000rpm離心10分鐘以分離蛋白質沈澱物。在280nm下使用Spectra Max Plus384(Molecular Device)量測蛋白質溶解度且自上清液之吸光度獲得，且基於蛋白質濃度之標準曲線計算濃度(圖4A)。吾等亦在3種不同的pH值條件下使用相同實驗方法分析市售抗體美羅華(Rituxan)(圖4B)。似乎蛋白質溶解度視pH值條件而定，且FIT-Ig之預測溶解度將在單株抗體之範圍內。

實例1.7 抗IL-17/IL-20 FIT-Ig之藥物動力學研究

在雄性史泊格-多利(Sprague-Dawley；SD)大鼠中評定FIT1-Ig之藥物動力學特性。將FIT-Ig蛋白質以5mg/kg之單次靜脈內劑量經由頸靜脈插管投與雄性SD大鼠，或皮下投與背部皮膚下。經28天之時段在不同時間點收集血清樣品，其中在0、5、15及30分鐘；1、2、4、8 及24小時；以及2、4、7、10、14、21及28天經由尾靜脈連續放血而取樣，且藉由人類IL-17捕獲及/或人類IL-20捕獲ELISA進行分析。簡言之，將ELISA盤用山羊抗生物素抗體(5μg/ml，4℃，隔夜)塗佈，用Superblock(Pierce)阻斷，且與50ng/ml經生物素標記之人類IL-17(IL-17捕獲ELISA)或IL-20(IL-20捕獲ELISA)一起在室溫下於10% Superblock TTBS中培育2小時。連續稀釋血清樣品(0.5%血清，10% Superblock，於TTBS中)，且在室溫下於盤上培育30分鐘。用經HRP標記之山羊抗人類抗體進行偵測，且藉助於標準曲線，使用四參數邏輯擬合來測定濃度。若干動物，尤其在皮下組中，顯示FIT-Ig濃度在第10天後急劇下降，此可能係由於發展抗人類反應。將此等動物自最終計算中排除。藉由非區室模型，使用WinNonlin軟體(Pharsight Corporation，Mountain View，Calif.)測定藥物動力學參數之值。

大鼠PK研究，FIT1-Ig血清濃度當藉由兩種不同ELISA方法測定時非常類似，從而指示分子為完整的，且能夠在活體內結合兩個抗原。在IV給藥後，FIT1-Ig展現雙相藥物動力學型態，其由分佈相、繼之以消除相組成，類似於習知IgG分子之PK型態。基於兩種不同的分析方法計算之藥物動力學參數非常類似且示於表7中。FIT-Ig之清除率較低(~12mL/天//kg)，具有低分佈體積(Vss~130mL/kg)，從而得到長半衰期(T1/2>10天)。在皮下投與之後，FIT-Ig得以緩慢吸收，在給藥後4天達到約26.9μg/ml之最大血清濃度。終末半衰期為約11天，且皮下生體可用率接近100%。如此等結果所顯示，FIT1-Ig之特性在活體內非常類似於習知IgG分子，從而指示用於使用相當給藥方案之治療應用之潛力。

FIT-Ig之藥物動力學研究已在多特異性Ig樣生物劑開發領域中顯示驚人之突破。在醫藥行業中通常使用大鼠藥物動力學系統用於治療性mAb之臨床前評估，且其良好地預測mAb在人類中之藥物動力學型態。FIT-Ig之長半衰期及低清除率將使其能夠以較低頻率給藥用於慢性適應症之治療效用，類似於治療性mAb。另外，比IgG大100-kDa之FIT-Ig，基於PK研究得到之其類IgG分佈體積參數，似乎有效地穿透至組織中。

表7. 在SD大鼠中對FIT1-Ig進行藥物動力學分析

實例1.8 FIT-Ig之穩定CHO細胞株發展研究

已觀測到，FIT-Ig有效地表現於經短暫轉染之293E細胞中。為了進一步確定FIT-Ig之製造可行性，在CHO-DG44與CHO-S細胞株中進行穩定轉染，且進行後續純系選擇以及生產力分析。簡言之，藉由在400μl轉染溶液加次選殖於Freedom pCHO載體(Life Technologies)中之20μg DNA(對於CHO DG44細胞)或25μg DNA(對於CHO-S細胞)中用8×10⁶個細胞電穿孔來轉染CHO細胞。使用常規程序進行穩定細胞株選擇。簡言之，對於CHO-DG44選擇，在轉染後，選擇穩定彙集物(-HT/2P/400G，其中P為μg/mL嘌呤黴素，G為μg/mL G418)，且藉由IgG ELISA分析蛋白質產量。選擇頂部彙集物且用漸增濃度之MTX(50、100、200及500nM)進行數輪擴增，繼而藉由IgG ELISA分析蛋白質產量。接著選擇頂部彙集物用於次選殖。對於CHO-S細胞選擇，在含有10P/400G/100M(M為nM MTX)之培養基中進行第一階段選擇，繼而分析蛋白質產量。接著選擇頂部彙集物且在30P/400G/500M或50P/400G/1000M中進行第2階段選擇，繼而藉由ELISA量測蛋白質產量。接著選擇頂部彙集物用於次選殖。對於蛋白質生產力分析，在125-mL搖瓶中使用30mL新鮮培養基(補充有6mM L-麩醯胺酸之CD FortiCHO^TM培養基)以5×10⁵個活細胞/mL(CHO DG44)或3×10⁵個活細胞/mL(CHO-S)接種完全回收之細胞彙集物(活力>90%)。在37 ℃、80%相對濕度、8% CO2及130rpm下於震盪平台上培育細胞。每天或以規律間隔(例如第0天、第3天、第5天、第7天、第10天、第12天及第14天)獲取樣品培養物以測定細胞密度、活力及生產力，直至培養物活力降至50%以下或達到培養之第14天。在取樣之後，必要時用葡萄糖向培養物補料。

FIT1-Ig CHO穩定細胞株發展之總體過程顯示與CHO細胞中單株抗體發展之特徵類似之特徵。舉例而言，在2P/400G下分析DG44彙集物期間，VCD繼續增加直至第10-12天達到約1.3E7，而細胞活力保持高於80%直至第13-14天，且生產力在第14天幾乎達到40mg/mL。在5P/400G/50M下擴增後，生產力在第14天達到50mg/mL以上。對於CHO-S細胞選擇，效價在第1階段選擇期間達到200mg/mL以上，且在第2階段選擇中達到370mg/mL以上。此等生產力水準類似於先前在實驗室中對於常規人類mAb發展所觀測之水準，從而表明FIT-Ig展現用於商業應用之類mAb製造可行性。

實例2：抗CD3/CD20 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之構築、表現及純化

為了證實FIT-Ig是否可結合細胞表面抗原，吾等已產生抗CD3/CD20 FIT-Ig分子FIT7-Ig及FIT8-Ig，其呈3-多肽構築體形式，如圖1A及圖1B中所示。用於產生能夠結合細胞表面CD3與CD20之FIT-Ig之構築體說明於圖1B中。簡言之，親本mAb包括兩個高親和力抗體，抗CD3(OKT3)及抗CD20(奧法木單抗)。為了產生FIT7-Ig 1號構築體，使OKT3之VL-CL直接(FIT7-Ig)或經由7胺基酸連接子(FIT8-Ig)之連接子融合至奧法木單抗重鏈之N端(如表8中所示)。2號構築體為OKT3之VH-CH1且第三構築體為奧法木單抗之VL-CL。在293細胞中共轉染FIT-Ig之3個構築體，從而表現並分泌FIT-Ig蛋白質。PCR選殖之詳細程序描述於下文：

實例2.1 抗CD3/CD20 FIT-Ig之分子選殖：

分子選殖方法與用於抗hIL-17/hIL-20 FIT-Ig之方法類似。

表9顯示用於上述分子構築之PCR引子之序列。

抗CD3/CD20 FIT-Ig之最終序列描述於表10中。

實例2.2 抗CD3/CD20 FIT-Ig之表現及純化：

將各FIT-Ig之所有DNA構築體次選殖至基於pBOS之載體中，且進行定序以確保準確性。使用聚乙烯亞胺(PEI)在293E細胞中短暫地共表現各FIT-Ig之1號、2號及3號構築體。簡言之，將FreeStyle^TM 293表現培養基中之DNA與PEI混合，最終濃度為1：2之DNA與PEI比率，在室溫下培育15分鐘(不超過20分鐘)，接著以60μg DNA/120ml培養物添加至293E細胞中(1.0-1.2×10⁶個/ml，細胞活力>95%)。在震盪器中培養 6-24小時後，在37℃、8% CO₂下，以125rpm/min震盪下將蛋白腖添加至經轉染之細胞中，最終濃度為5%。在第6天至第7天，藉由離心及過濾收集上清液，且根據製造商之說明書，使用蛋白A層析(Pierce，Rockford，IL)來純化FIT-Ig蛋白質。藉由SDS-PAGE來分析蛋白質，且藉由A280及BCA(Pierce，Rockford，IL)來測定其濃度(表11)。

實例2.3 抗CD3/CD20 FIT-Ig分子之結合活性：

藉由FACS，使用在細胞表面上表現CD3之Jurkat細胞以及在細胞表面上表現CD20之Raji細胞來分析抗CD3/CD20 FIT-Ig與兩個標靶之結合。簡言之，在冰冷PBS中洗滌5×10⁵個細胞，且在冰上用2% FBS阻斷1小時。將細胞與抗體FIT-Ig(100nM)或同型對照一起在冰上培育1小時，且用PBS洗滌3次。添加二級抗體(經Alexa Fluor 488標記之山羊抗人類IgG，Invitrogen)，且與細胞一起在暗處在冰上培育1小時，繼而用PBS洗滌三次。在FAC流式細胞儀中分析樣品。細胞表面結合顯示，FIT7-Ig與FIT8-Ig均能夠以濃度依賴性方式結合兩個細胞表面抗原CD3與CD20。與親本mAb之結合活性相比，FIT-Ig顯示與Jurkat細胞上之CD3之結合強度降低，但與Raji細胞上之CD20之結合強度增強。在所有結合研究中，FIT7-Ig及FIT8-Ig對兩個抗原顯示類似之結合活性，從而指示連接子對FIT8-Ig之結合能力不產生顯著影響(表12)。

實例3：抗TNF/IL-17 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之構築、表現及純化

使用抗IL-17 mAb純系LY及抗TNF mAb戈利木單抗亦產生可結合人類IL-17與人類TNFα之另一FIT-Ig(FIT9-Ig)，其呈3-多肽構築體形式，如圖1A及圖1B中所示。為了產生FIT9-Ig 1號構築體，使戈利木單抗之VL-CL直接融合至LY重鏈之N端(如表13中所示)。2號構築體為戈利木單抗之VH-CH1且第三構築體為LY之VL-CL。在293細胞中共轉染FIT9-Ig之3個構築體，從而表現並分泌FIT9-Ig蛋白質。抗TNF/IL-17 FIT-Ig之最終序列描述於表14中。

實例3.1 抗TNF/IL-17 FIT-Ig之分子選殖：

分子選殖方法與用於抗17/hIL-20 FIT-Ig之方法類似。

實例3.2 抗TNF/IL-17 FIT-Ig蛋白質之表現、純化及分析：

將各FIT-Ig之所有DNA構築體次選殖至基於pBOS之載體中，且進行定序以確保準確性。如先前所描述使用聚乙烯亞胺(PEI)在293E細胞中短暫地共表現FIT9-Ig之1號、2號及3號構築體，且藉由蛋白A層析來純化FIT9-Ig蛋白質。表現水準為10-23mg/L。使用基於細胞之分析法針對IL-17(由Hs27細胞產生GROα)及TNF(由L929細胞產生IL-8)對經純化之蛋白質進行功能分析。FIT9-Ig針對人類TNF之中和效能為11.6pM(與相同實驗中戈利木單抗之15.9pM相比)，如針對人類IL-17之中和效能為122pM(與相同實驗中LY之51.5pM相比)。總體FIT9-Ig維持親本mAb之生物活性。

實例4：抗CTLA-4/PD-1 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之構築、表現及純化

使用抗CTLA-4 mAb伊匹單抗及抗PD-1 mAb尼沃魯單抗產生可結合人類CTLA-4與人類PD-1之另一FIT-Ig(FIT10-Ig)，其呈3-多肽構築體形式，如圖1A及圖1B中所示。為了產生FIT10-Ig 1號構築體，使伊匹單抗之VL-CL直接融合至尼沃魯單抗重鏈之N端(如表15中所示)。2號構築體為伊匹單抗之VH-CH1且第三構築體為尼沃魯單抗之VL-CL。在293細胞中共轉染FIT10-Ig之3個構築體，從而表現並分泌FIT10-Ig蛋白質。

實例4.1 抗CTLA-4/PD-1 FIT-Ig之分子選殖：

分子選殖方法與用於抗hIL-17/hIL-20 FIT-Ig之方法類似。抗CTLA-4/PD-1 FIT-Ig之最終序列描述於表16中。

實例4.2 抗CTLA-4/PD-1 FIT-Ig蛋白質之表現、純化及功能分析：

將各FIT-Ig之所有DNA構築體次選殖至基於pBOS之載體中，且進行定序以確保準確性。如先前所描述使用聚乙烯亞胺(PEI)在293E細胞中短暫地共表現FIT10-Ig之1號、2號及3號構築體，且藉由蛋白A層析將FIT9-Ig蛋白質純化至98%單體完整蛋白質。表現水準高達43mg/L。針對重組CTLA-4Ig及PD-1使用ELISA對經純化之蛋白質進行結合分析。簡言之，對於與CTLA-4結合，將人類CTLA-4Ig(R&D Systems)固定於96孔盤上，繼而進行常規洗滌及阻斷程序。接著將FIT-10-Ig或伊匹單抗以不同的濃度添加至盤中，繼而進行培育及多個洗滌步驟，且用抗人類Fab-HRP加以偵測。對於與PD-1之結合，將人類PD-1(具有his標籤)(R&D Systems)固定於96孔盤上，繼而進行常規洗滌及阻斷程序。接著將FIT-10-Ig或尼沃魯單抗以不同的濃度添加至盤中，繼而進行培育及多個洗滌步驟，且用抗人類Fc-HRP加以偵測(圖5A及圖5B)。似乎FIT10-Ig能夠分別以與親本mAb伊匹單抗及尼沃魯單抗類似之活性結合CTLA-4(A)與PD-1(B)。

另外，使用OctetRed進行多抗原結合研究以確定FIT10-Ig是否能夠同時結合重組CTLA-4與PD-1。簡言之，將FIT10-Ig以10μg/ml之濃度固定於AR2G感測器上，繼而在分析緩衝液(PBS pH 7.4，0.1% BSA，0.02% Tween)中以80nM之濃度結合CTLA-4Ig，接著結合PD-1(或首先PD-1，接著CTLA-4Ig)。在實驗結束時，用10mM甘胺酸(pH 1.5)使表面再生五次(圖6)。此實驗顯示，FIT10-Ig當其已與CTLA-4結合時能夠結合PD-1，反之亦然，從而指示FIT10-Ig能夠同時結合CTLA-4Ig與PD-1。

實例5：其他Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之構築、表現及純化

如上述實例中來構築對EGFR與PD-L1、cMet與EGFR、因子IXa與因子X、Her3與IGF-1R、DLL-4與VEGF、CD20與CD3、Her3與EGFR、PD-1與PD-L1及Her3與PD-1具有特異性之FIT-Ig。此等例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表17中。表18提供各FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

表17及表18之各FIT-Ig之SEC型態亦提供於圖7A至圖7I中。

FIT13a-Ig之功能結合資料提供於以下表19中。另外，進行多抗原結合研究以確定FIT13a-Ig是否能夠結合cMet與EGFR。研究結果示於圖8中，且顯示FIT13a-Ig能夠同時結合cMet與EGFR兩者。

FIT14-Ig之因子IXa結合活性之功能結合資料提供於以下表20中。

研究結果顯示可構築、表現並純化其他FIT-Ig，並且其將對靶蛋白質展現功能結合。

實例6：新抗CTLA-4/PD-1 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之構築、表現及純化

如上述實例中來構築對CTLA4與PD1具有特異性之新FIT-Ig。此等例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表21中。表21提供各FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

長鏈及短鏈包含前導序列，該前導序列可為MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(SEQ ID NO：487)或MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO：488)。

在未進行任何最佳化之情況下在小規模產生中評估表現水準，但NBS3除外。所有SEC樣品都進行一步式蛋白A純化。呈IgG1及IgG4形式之FIT-Ig可由293細胞產生為均質蛋白質。

功能研究

此等抗體之功能結合資料提供於以下表23中。資料表明親和力不因改變IgG恆定序列而受影響，但可藉由在上部結構域中置放某種Fab而加以改良。

ELISA結合研究：測試NBS3R之ELISA結合。簡言之，對於與CTLA-4結合，將人類CTLA-4Ig(R&D Systems)固定於96孔盤上，繼而進行常規洗滌及阻斷程序。接著將FIT-Ig或相關單株抗體以不同的濃度添加至盤中，繼而進行培育及多個洗滌步驟，且用抗人類Fab-HRP加以偵測。對於與PD-1結合，將人類PD-1(具有his標籤)(R&D Systems)固定於96孔盤上，繼而進行常規洗滌及阻斷程序。接著將NBS3R或尼沃魯單抗以不同的濃度添加至盤中，繼而進行培育及多個洗滌步驟，且用抗人類Fc-HRP加以偵測。似乎NBS3R能夠分別結合CTLA-4(A)與PD-1(B)兩者。結果示於圖9A及圖9B中。

多重結合研究：亦對NBS3進行多重結合研究。結果示於圖10中。

熱穩定性研究：亦對此等抗體進行熱穩定性測試，其結果示於表24中。藉由DSC來量測解鏈溫度。

儲存穩定性研究：藉由SEC-HPLC方法來評定NBS3之儲存穩定性，且結果示於表25中。藉由進行冷凍/解凍循環一次、兩次或三次來處理樣品，藉由SEC-HPLC型態未觀測到聚集或降解。在4℃、25℃或 40℃下將樣品處理1天、3天或7天，藉由SEC-HPLC型態未觀測到聚集或降解。

在大鼠PK研究中進一步測試NBS3，且結果示於圖11A及圖11B中。此研究之目的在於評估NBS3在單次靜脈內(IV)或皮下(SC)投與SD大鼠後之藥物動力學。經由足背靜脈注射投與IV劑量，且經由皮下注射投與SC劑量。在所指定之時間點，人工箝制動物，且經由尾靜脈穿刺或心臟穿刺收集約240μL血液/時間點至管中。將血液樣品在室溫下置放0.5小時。接著將血液樣品離心(10000g，5min，4℃)以獲得血清樣品。立即將血清樣品儲存在-80℃下直至分析。經由ELISA對樣品連同給藥溶液進行分析。所量測之給藥濃度用於PK參數計算。

在基於細胞之受體阻斷分析中測試NBS3、NBS3-C及NBS3R-C。簡言之，將PD1-Fc固定於96孔盤上，繼而進行常規洗滌及阻斷程序。接著向各孔添加經稀釋之FIT-Ig及經生物素標記之PD-L1-Fc，繼而進行培育及多個洗滌步驟，且用鏈黴親和素-HRP加以偵測。結果示於圖12中。

在MLR(混合淋巴球反應)分析及PBMC SEB刺激分析中進一步測試NBS3、NBS3-C及NBS3R-C之功能活性。

在MLR分析中，使用得自一個供體之單核細胞衍生之樹突狀細胞及得自另一供體之同種異體CD4 T細胞來進行混合淋巴球反應。自健康供體收集全血樣品，且使用Ficoll-Pague梯度離心自全血分離出PBMC。在第1天，自一個供體分離出PBMC且用無血清RPMI 1640以1×10⁶個/ml加以稀釋。將經稀釋之PBMC以3ml/孔接種至6孔組織培養盤中且培育3小時。移除上清液且洗去未附著之細胞。在含10% FBS之RPMI1640中用250U/ml IL-4及500U/ml GM-CSF使已附著之單核細胞極化成樹突狀細胞。在第4天將培養基替換為新鮮IL-4及GM-CSF。在第7天，收集不成熟DC且在含10% FBS之RPMI 1640中用1μg/ml LPS再處理24小時以達成成熟。在第8天，藉由負選擇自另一供體PBMC分離出CD4 T細胞且調節至最終濃度2×10⁶個細胞/ml。在37℃下將成熟DC用絲裂黴素C處理1.5小時。接著用PBS洗滌DC且調節至最終濃度1×10⁶個細胞/ml。將CD4 T細胞(反應細胞)以100μl/孔添加至96孔盤中且用測試抗體以經稀釋之濃度預處理30分鐘。接著將成熟DC(刺激細胞)以100μl/孔添加至孔中。各孔之最終體積為200μl。使用ELISA，在37℃下將MLR分別培育72小時(用於IL-2測試)及120小時(用於IFN-γ測試)。結果示於圖13A及圖13B中。

在PBMC SEB刺激分析中，藉由Ficoll-Pague梯度離心自健康供體血液分離出PBMC。將所分離之PBMC以1×10⁵個細胞/孔接種至96孔組織培養盤中。接著，用經稀釋之測試抗體將PBMC預處理30分鐘。將葡萄球菌腸毒素B(SEB)添加至細胞培養基中，最終濃度為100ng/ml。最終分析體積為200μl/孔。將細胞培養96小時且收集培養物上清液。藉由ELISA來偵測上清液中之IL-2細胞因子產生。結果示於圖14中。

實例7：其他抗EGFR/PD-L1 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之構築、表現及純化

如上述實例中來構築對EGFR與PD-L1具有特異性之新FIT-Ig。此等例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表26中。表27提供各FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

SEC型態及表現資料表明FIT012d藉由改變PD-L1抗體序列而展現比FIT012b更佳之純度。

此兩種抗體之功能結合資料提供於以下表28及表29中。資料表明親和力不因改變IgG恆定序列而受影響，但可藉由在上部結構域中置放某種Fab而加以改良。

表29.FIT012d之功能結合資料

亦對FIT012b及FIT012d進行多重結合研究。結果示於圖15(FIT012b)及圖16A至圖16B(FIT012d)中。

實例8：抗cMet/EGFR Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之構築、表現及純化

如上述實例中來構築對cMet與EGFR具有特異性之新FIT-Ig。此例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表30中。表31提供各FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

穩定性資料

藉由SEC-HPLC方法來評定FIT013a之儲存穩定性，且結果示於表32中。藉由進行冷凍/解凍循環一次、兩次或三次來處理樣品，藉由SEC-HPLC型態未觀測到聚集或降解。在4℃、25℃或40℃下將樣品處理1天、3天或7天，藉由SEC-HPLC型態未觀測到聚集或降解。

功能研究：FIT013a之基於蛋白質之結合資料提供於以下表33及表34中。

亦對FIT013a進行多重結合研究。結果示於圖17中。

此外，藉由流式細胞術使用BD FACSVerse來測定FIT013a在癌細胞株中之結合活性。用無胰蛋白酶培養基使培養物中生長之細胞自燒瓶脫離並加以收集。在含有2% FBS之PBS緩衝液中洗滌所收集之細胞。接著將細胞分成等分試樣且與經1：5連續稀釋之FIT013a一起在冰上培育1小時。FTI013a之起始工作濃度為20μg/ml。對細胞進行洗滌，再懸浮且與經1：100稀釋之經Alexa Fluor® 488標記之小鼠抗人類IgG1(Invitrogen，目錄號A-10631)一起在冰上避光培育1小時。對細胞進行洗滌且用BD FACSVerse流式細胞儀根據製造商之方案來偵測信號。

此等實驗顯示FIT013a可結合許多癌細胞株，如NCI-H1993、HCC827、MKN-45、SGC-7901、EBC-1、A549、KP4、NCI-H292、NCI-H1975等。各細胞株之幾何平均螢光強度(MFI)及EC50列於表35中。

另外，進行FACS分析以量測FIT013a與膜c-Met及EGFR之雙重結合，以顯示其多重結合活性。

此分析中使用若干細胞株。MKN-45(人類胃腺癌細胞)表現高水準之c-Met及低水準之EGFR。SGC-7901(人類胃癌)表現高水準之EGFR及低水準之c-Met。NCI-H1975(人類非小細胞肺癌)表現相等水準之c-Met與EGFR。

用無胰蛋白酶培養基使培養物中生長之細胞自燒瓶脫離並加以收集。在含有2% FBS之PBS緩衝液中洗滌所收集之細胞。接著將細胞分成等分試樣且與經連續稀釋之FIT013a或FIT013a-Fab一起在冰上培育1小時。接著對細胞進行洗滌且與1μg/ml經生物素標記之人類c-MET或經生物素標記之EGFR一起在冰上培育1小時。使細胞再懸浮且與4μg/ml經Alexa Fluor® 488標記之鏈黴親和素(Invitrogen，目錄號S32354)一起在冰上避光培育1小時。對細胞進行洗滌且用BD FACSVerse流式細胞儀根據製造商之方案來偵測信號。

當c-Met之細胞膜表現水準遠遠高於EGFR(例如，在MKN-45細胞上)時，FIT013a及FIT013a-Fab之c-Met結合位點可能被膜c-Met佔據，可藉由經生物素標記之EGFR來偵測FIT013a及FIT013a-Fab之游離EGFR結合位點。當EGFR之細胞膜表現水準遠遠高於c-Met(例如，在SGC-7901上)時，FIT013a及FIT013a-Fab之EGFR結合位點可能被膜EGFR佔據，可藉由經生物素標記之c-Met來偵測FIT013a及FIT013a-Fab之游離c-Met結合位點。當c-Met之細胞膜表現水準等於EGFR(例如，在NCI-H1975細胞上)時，FIT013a及FIT013a-Fab之c-Met及EGFR結合位點可能同時被佔據，無法偵測到FIT013a及FIT013a-Fab之游離EGFR或c-Met結合位點。如圖18A至圖18C中所顯示，FIT013a及FIT013a-Fab可在細胞表面上同時結合兩種受體c-Met及EGFR。

信號轉導分析：接下來，使用FIT013a來抑制細胞中之HGF誘導之AKT磷酸化。將NCI-H292細胞以2×10⁵個/孔接種於96孔盤中且進行血清饑餓隔夜。將經連續稀釋之FIT013a或其他相關Ab添加至盤中且培育30分鐘，接著向分析盤中添加40ng/ml HGF後維持5分鐘。使細胞溶解且藉由ERK磷酸化T202/Y204套組(Cisbio，目錄號：64AKSPEG)來偵測AKT磷酸化。該實驗顯示，FIT013a在中和NCI-H292細胞中之HGF誘導之AKT磷酸化方面顯示優於mAb組合之活性。FIT013a抑制80%之AKT磷酸化，而EGFR與c-Met抗體組合抑制60%之AKT磷酸化，參見圖19。

促效劑分析：藉由AKT磷酸化來測試c-Met、EGFR抗體對FIT013a之促效劑效應。將NCI-H441細胞以2×10⁵個/孔接種於96孔盤中且進行血清饑餓隔夜。將經連續稀釋之FIT013a或其他相關Ab添加至盤中且培育30分鐘。使細胞溶解且藉由ERK磷酸化T202/Y204套組(Cisbio，目錄號：64AKSPEG)來偵測AKT磷酸化。如圖20中所示，該實驗顯示，FIT013a在不存在HGF之情況下顯示弱促效劑效應。

受體耗竭研究：測試FIT013a以觀察其是否可使細胞膜上之c-Met與EGFR兩者耗竭。在37℃下將c-Met抗體、EGFR抗體及FIT013a與H441細胞一起培育超過16小時，接著藉由FACS來偵測保留在細胞表面上之EGFR及c-Met。結果指示，FIT013a可使細胞膜c-Met及EGFR耗竭近70%，高於c-Met抗體或EGFR抗體，參見表36。

大鼠PK研究：此研究之目的在於評估FIT013a(c-met/EGFR)在單次靜脈內(IV)或皮下(SC)投與SD大鼠後之藥物動力學。對於IV及SC給藥，將測試物品FIT013a(c-met/EGFR)以2.3mg/mL溶解於10mM檸檬酸鈉、50mM NaCl pH 6.0中(批次：160408001)。將購自SLAC Laboratory Animal Co.LTD.之體重約195-208g之總計8隻雄性SD大鼠(資格號：SCXK(SH)2008001659659)用於此研究。如表37來設計給藥及取樣。

經由足背靜脈注射投與IV劑量，且經由皮下注射投與SC劑量。在所指定之時間點，人工箝制動物，且經由尾靜脈穿刺或心臟穿刺收集約240μL血液/時間點至管中。將血液樣品在室溫下置放0.5小時。接著將血液樣品離心(10000g，5min，4℃)以獲得血清樣品。立即將血清樣品儲存在-80℃下直至分析。藉由ELISA，分別使用c-Met及EGFR蛋白質來偵測樣品。對於IV及SC研究，大鼠血清中之FIT013a(c-met/EGFR)之濃度-時間資料列於表38至表41中，且說明於圖21A至圖21D中。

NCI-H1975-HGF異種移植模型腫瘤分佈研究

在此研究中，在帶有NCI-H1975-HGF腫瘤之裸BALB/c小鼠中，在單次IP劑量之後24小時量測FIT013a之血清及腫瘤濃度。

將NCI-H1975-HGF細胞經皮下接種至裸BALB/c小鼠。當平均腫瘤體積達到200-250mm³時，將小鼠隨機分配至四組：FIT013a組、 H1332組、帕尼單抗組及媒劑組。FIT013a組為單次IP劑量16mg/kg；H1332組或帕尼單抗組為單次IP劑量10mg/kg。向媒劑組給與調配緩衝液10mM檸檬酸鈉、50mM NaCl，pH 6.0。給藥之後24小時，收集腫瘤及血清。使腫瘤均質化且收集上清液以用於隨後之ELISA研究。對於血清及腫瘤兩者，藉由使用通用hIgG ELISA方法對FIT013a、帕尼單抗及H1332進行定量。

該實驗顯示，FIT013a在血清及腫瘤中顯示與單株抗體相當之分佈活性，參見圖22。

NCI-H1975-HGF異種移植模型效力研究

在此研究中，在NCI-H1975-HGF異種移植模型中量測FIT013a之效力。

將NCI-H1975-HGF細胞經皮下接種至裸BALB/c小鼠。當平均腫瘤體積達到100-130mm³且最大腫瘤體積小於140mm³時，將小鼠隨機分配至四組：FIT013a組、H1332組、帕尼單抗組及媒劑組。每週兩次經腹膜內給與該等抗體，持續三週。FIT013a之劑量為16mg/kg，H1332或帕尼單抗之劑量為10mg/kg。向媒劑組給與調配緩衝液、10mM檸檬酸鈉、50mM NaCl，pH 6.0。每週兩次量測腫瘤體積及小鼠體重。腫瘤生長抑制百分比(TGI%)定義為在對照治療組平均腫瘤體積(MTV)與測試抗體治療組MTV之間的差異。

該實驗顯示，FIT013a顯示比EGFR或c-Met單株Ab更佳之效力，參見圖23。

實例9：對抗因子IXa/因子X Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之研究

如上述實例中來構築對因子IXa與因子X具有特異性之FIT-Ig。此例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表42中。表43提供各FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

表42.針對cMEt與EGFR之其他例示性FIT-Ig之胺基酸序列

表43.SEC型態/在293E細胞中之表現水準：

功能研究

藉由表面電漿子共振進行親和力量測：在25℃下，藉由利用Biacore X100儀器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)之表面電漿子共振，使用HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA及0.005%界面活性劑P20)來測定FIT-Ig與人類因子IX及人類因子X(Enzyme Research Laboratory)結合之動力學性質。簡言之，根據製造商之說明書，使用標準胺偶合套組將山羊抗人類IgG Fc片段特異性多株抗體(Pierce Biotechnology Inc，Rockford，IL)直接固定在CM5研究級生物感測器晶片上。將經純化之FIT-Ig樣品稀釋於HEPES緩衝生理鹽水中以用於在山羊抗人類IgG Fc特異性反應表面上進行俘獲，且以5μl/min之流速注射在反應基質上。在30μL/min之連續流速下測定締合及解離速率常數，kon(M-1s-1)及koff(s-1)。藉由在500nM抗原濃度下進行動力學結合量測來得到速率常數。接著藉由下式：KD=koff/kon，由動力學速率常數計算FIT-Ig與靶蛋白質之間的反應的平衡解離常數(M)。亦將抗原樣品之等分試樣同時注射在空白參考及反應CM表面上以記錄並減去任何非特異性結合背景，以便消除大多數折射率變化及注射雜訊。利用以10μL/min之流速進行10mM甘胺酸(pH 1.5)之兩次後續25ml注射使表面再生。經十二個循環，抗Fc抗體固定之表面得以完全再生且保留其完全俘獲容量。FIT014a之基於蛋白質之結合資料提供於以下表44中。

類因子VIIIa活性分析：根據BIOPHEN FVIII：C套組(Hyphen-Biomed，221402-RUO)之製造商說明書，藉由酶分析來評估FIT-Ig之類FVIIIa活性。結果指示，FIT014a具有與恩西珠單抗及經純化FVIIIa 相當之類FVIIIa活性，而因子IX及因子X之單株抗體以及其組合不具有活性，參見圖24。

多抗原結合研究：使用OctetRed進行此研究以確定FIT014a是否能夠同時結合人類因子IX與人類因子X。簡言之，將FIT014a以10μg/ml之濃度固定於AR2G感測器上，繼而在分析緩衝液(PBS pH 7.4、0.1% BSA、0.02% Tween)中依序結合人類因子IX與人類因子X(Enzyme Research Laboratory，濃度為500nM)。在實驗結束時，用10mM甘胺酸pH 1.5使表面再生五次。此實驗顯示，FIT014a當其已與人類因子IX結合時能夠結合人類因子X，從而指示FIT014a能夠同時結合人類因子IX與人類因子X兩者，參見圖25。

穩定性研究：在恆定4℃、25℃及40℃下將處於檸檬酸鹽緩衝液(pH=6.0)中之FIT014a蛋白質樣品個別地培育1天、3天或7天。類似地，將FIT014a蛋白質樣品冷凍-解凍一次、兩次或三次。藉由SEC-HPLC來偵測所有樣品之完整完全單體蛋白質分數，其中將10μg各蛋白質樣品以流速0.3mL/min注入至配備Superdex200 5/150 GL之Utimate 3000 HPLC中，持續15分鐘，且使用由製造商供應之Chromeleon軟體來記錄並分析資料。表45顯示FIT014a在此等熱攻擊條件下保留完全完整單體分子。

大鼠PK研究：在大鼠中對FIT014a進行PK研究，並且將結果示於圖26及表46中。藉由ELISA以62.5ng/mL之LLOQ偵測大鼠血清樣品中之抗體濃度。在hIgG盤上，塗佈蛋白質為抗hIgG Fc，且偵測抗體為抗hIgG Fab。在因子X盤上，塗佈蛋白質為人類因子X，而偵測抗體為抗人類IgG Fc。

實例10：對抗HER3/IGF-1R Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之研究

如上述實例中來構築對HER3與IGF-1R具有特異性之FIT-Ig。此例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表47中。表48提供該FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

功能研究

功能結合研究：FIT016a之功能結合資料提供於以下表49中。

多抗原結合研究：使用OctetRed進行此研究以確定FIT016a是否能夠同時結合Her3與IGF1R。此實驗顯示，FIT016a當其已與IGF1R結合時能夠結合Her3，從而指示FIT016a能夠同時結合Her3與IGF-1R兩者，參見圖27。

實例11：對抗DLL4/VEGF Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之研究

如上述實例中來構築對DLL4與IGF1R具有特異性之FIT-Ig。此例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表50中。表51提供該FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

功能研究

功能結合研究：FIT017a之功能結合資料提供於以下表52中。

多抗原結合研究：使用OctetRed進行此研究以確定FIT017a是否能夠同時結合DLL4與VEGF。此實驗顯示，FIT017a當其已與VEGF結合時能夠結合DLL4，從而指示FIT017a能夠同時結合DLL4與VEGF兩者，參見圖28。

實例12：對抗CD20/CD3 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之研究

如上述實例中來構築對CD20與CD3具有特異性之FIT-Ig。此例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表53中。表54提供該FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

功能研究

功能結合研究：FIT018a之功能結合資料提供於以下表55中。

基於細胞之結合研究：使用BD FACSVerse藉由流式細胞術來測定FIT018a與人類或石蟹獼猴B細胞及T細胞之結合活性。使用Raji細胞來偵測人類B細胞結合。使用Jurakt細胞來偵測人類T細胞結合。使用原代石蟹獼猴T細胞來偵測石蟹獼猴T細胞結合。使用經cynoCD20轉染之HEK 293細胞移行細胞來偵測石蟹獼猴B細胞結合。在含有2% FBS之PBS緩衝液中洗滌細胞。接著將細胞分成等分試樣且與經1：5連續稀釋之FIT018a一起在冰上培育1小時。FIT018a之起始工作濃度為20μg/ml。對細胞進行洗滌，再懸浮且與經1：100稀釋之經Alexa Fluor® 488標記之小鼠抗人類IgG1(Invitrogen，目錄號A-10631)一起在冰上避光培育1小時。對細胞進行洗滌且用BD FACSVerse流式細胞儀根據製造商之方案來偵測信號。此等實驗顯示，FIT018a可結合人類B細胞及T細胞(Raji為人類B細胞株且Jurkat為人類T細胞株)，參見圖29A及圖29B。FIT018a亦可結合石蟹獼猴CD20及CD3，參見圖30A及圖30B。

B細胞耗竭分析：藉由B細胞耗竭分析來量測FIT018a之活體外活性。藉由Ficoll Paque Plus(GE HEALTHCARE，目錄號GE17144002)根據製造商之說明書來分離人類PBMC。收集靶細胞Raji且以5×10⁴個/孔接種至分析盤。對抗體進行連續稀釋且添加至分析盤。將2.5×10⁵個/孔PBMC添加至分析盤且培育2天或3天。培育之後，使用FACS機器藉由抗CD19抗體來偵測B細胞。該等實驗顯示，FIT018a可誘導B細胞凋亡，參見圖31A及圖31B。

實例13：對抗HER3/EGFR Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之研究

如上述實例中來構築對HER3與EGFR具有特異性之FIT-Ig。此例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表56中。表57提供該FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

功能研究

功能結合研究：FIT019a及FIT019b之功能結合資料分別提供於以下表58及表59中。

多重結合研究：對FIT019a及FIT019b進行多重結合研究。結果分別示於圖32(FIT019a)及圖33A至圖33B(FIT019b)中。結果指示FIT019a及FIT019b兩者均可同時結合HER3與EGFR。

實例14：對抗PD-L1/PD-1 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之研究

如上述實例中來構築對PD-L1與PD-1具有特異性之FIT-Ig。此例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表60中。表61提供該FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

功能研究

藉由表面電漿子共振進行親和力量測：在25℃下，藉由利用Biacore X100儀器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)之表面電漿子共振，使用HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA及0.005%界面活性劑P20)來測定FIT-Ig與rhPD-L1及rhPD-1結合之動力學性質。簡言之，根據製造商之說明書，使用標準胺偶合套組將rhPD-L1及rhPD-1以40 RU直接固定於CM5研究級生物感測器晶片上。藉由在1至40nM範圍內之七個不同的抗原濃度下進行動力學結合量測來得到速率常數。接著藉由下式：KD=koff/kon，由動力學速率常數計算FIT-Ig與靶蛋白質之間的反應的平衡解離常數(M)。亦將FIT-Ig/Ab樣品之等分試樣同時注射在空白參考及反應CM表面上以記錄並減去任何非特異性結合背景，以便消除大多數折射率變化及注射雜訊。利用以10μL/min之流速進行10mM甘胺酸(pH 1.5)之兩次後續25ml注射使表面再生。FIT020b之功能結合資料提供於以下表62中。

藉由MLR分析進行功能活性測試：使用得自一個供體之單核細胞衍生之樹突狀細胞及得自另一供體之同種異體CD4 T細胞來進行混合淋巴球反應。自健康供體收集全血樣品，且使用Ficoll-Pague梯度離心自全血分離出PBMC。在第1天，自一個供體分離出PBMC且用無血清RPMI 1640以1×10⁶個/ml加以稀釋。將經稀釋之PBMC以3ml/孔接種至6孔組織培養盤中且培育3小時。移除上清液且洗去未附著之細胞。在含10% FBS之RPMI1640中用250U/ml IL-4及500U/ml GM-CSF使已附著之單核細胞極化成樹突狀細胞。在第4天將培養基替換為新鮮IL-4及GM-CSF。在第7天，收集不成熟DC且在含10% FBS之RPMI 1640中用1μg/ml LPS再處理24小時以達成成熟。在第8天，藉由負選擇自另一供體PBMC分離出CD4 T細胞且調節至最終濃度2×10⁶個細胞/ml。在37℃下將成熟DC用絲裂黴素C處理1.5小時。接著用PBS洗滌DC且調節至最終濃度1×10⁶個細胞/ml。將CD4 T細胞(反應細胞)以100μl/孔添加至96孔盤中且用測試抗體以經稀釋之濃度預處理30分鐘。接著將成熟DC(刺激細胞)以100μl/孔添加至孔中。各孔之最終體積為200μl。在37℃下將MLR培育72小時以用於IL-2測試。結果示於圖34A及圖34B中。

多重結合研究：對FIT020b進行多重結合研究。結果示於圖35中。結果指示FIT020b可同時結合PD-L1及PD-1。

實例15：對抗CD20/CD-22 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之研究

如上述實例中來構築對CD20與CD22具有特異性之FIT-Ig。此例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表63中。表64提供該FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

功能研究

基於細胞之結合研究：使用BD FACSVerse藉由流式細胞術來測定FIT021b與B淋巴瘤細胞株Raji或Daudi之結合活性。在含有2% FBS之PBS緩衝液中洗滌細胞。接著將細胞分成等分試樣且與經1：5連續稀釋之FIT021b一起在冰上培育1小時。FIT021b之起始工作濃度為20μg/ml。對細胞進行洗滌，再懸浮且與經1：100稀釋之經Alexa Fluor® 488標記之小鼠抗人類IgG1(Invitrogen，目錄號A-10631)一起在冰上避光培育1小時。對細胞進行洗滌且用BD FACSVerse流式細胞儀根據製造商之方案來偵測信號。此等實驗顯示，FIT021b可結合B淋巴瘤細胞株Raji或Daudi，參見圖36A及圖36B。

實例16：對抗HER3/PD-1 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之研究

如上述實例中來構築對HER3與PD1具有特異性之FIT-Ig。此例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表65中。表66提供FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

功能研究

藉由表面電漿子共振進行親和力量測：藉由表面電漿子共振來測定FIT022a-Ig與Her3-his及hPD-1-Fc結合之動力學性質。結果示於表67中。

多重結合研究：對FIT022a進行多重結合研究。結果示於圖37中。結果指示FIT022a可同時結合PD-L1及PD-1。

MLR功能分析：使用得自一個供體之單核細胞衍生之樹突狀細胞及得自另一供體之同種異體CD4 T細胞來進行混合淋巴球反應。自健康供體收集全血樣品，且使用Ficoll-Pague梯度離心自全血分離出PBMC。在第1天，自一個供體分離出PBMC且用無血清RPMI 1640以1×10⁶ 個/ml加以稀釋。將經稀釋之PBMC以3ml/孔接種至6孔組織培養盤中且培育3小時。移除上清液且洗去未附著之細胞。在含10% FBS之RPMI1640中用250U/ml IL-4及500U/ml GM-CSF使已附著之單核細胞極化成樹突狀細胞。在第4天將培養基替換為新鮮IL-4及GM-CSF。在第7天，收集不成熟DC且在含10% FBS之RPMI 1640中用1μg/ml LPS再處理24小時以達成成熟。在第8天，藉由負選擇自另一供體PBMC分離出CD4 T細胞且調節至最終濃度2×10⁶個細胞/ml。在37℃下將成熟DC用絲裂黴素C處理1.5小時。接著用PBS洗滌DC且調節至最終濃度1×10⁶個細胞/ml。將CD4 T細胞(反應細胞)以100μl/孔添加至96孔盤中且用測試抗體以經稀釋之濃度預處理30分鐘。接著將成熟DC(刺激細胞)以100μl/孔添加至孔中。各孔之最終體積為200μl。使用ELISA，在37℃下將MLR分別培育72小時(用於IL-2測試)及120小時(用於IFN-γ測試)。結果示於圖38A及圖38B中。

實例17：對抗cMet/PD-L1 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之研究

如上述實例中來構築對cMet與PD-L1具有特異性之FIT-Ig。此例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表68中。表69提供FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。

功能研究

藉由表面電漿子共振進行親和力量測：藉由表面電漿子共振來測定FIT023a-Ig與cMet及PD-L1結合之動力學性質。結果示於表70中。

多重結合研究：對FIT023a進行多重結合研究。結果示於圖39A及圖39B。結果指示FIT023a可同時結合cMet及PD-L1。

實例18：對抗BTLA/PD-1 Fab串聯免疫球蛋白(FIT-Ig)之研究

如上述實例中來構築對BTLA與PD-L1具有特異性之FIT-Ig。此例示性FIT-Ig及其相應序列提供於以下表71中。表72提供FIT-Ig在293E細胞中之表現水準及SEC型態。在一步式蛋白A純化之後，FIT024a與FIT024b兩者均具有良好純度。

功能研究

藉由表面電漿子共振進行親和力量測：藉由表面電漿子共振來測定FIT024a-Ig及FIT024b-Ig與BTLA4及PD-1結合之動力學性質。結果示於表73中。

多重結合研究：對FIT024a及FIT024b進行多重結合研究。結果示於圖40A至圖40B及圖41A至圖41B中。結果指示FIT024a與FIT024b兩者均可同時結合BTLA4及PD-1。

MLR功能分析：使用得自一個供體之單核細胞衍生之樹突狀細胞及得自另一供體之同種異體CD4 T細胞來進行混合淋巴球反應。自健康供體收集全血樣品，且使用Ficoll-Pague梯度離心自全血分離出PBMC。在第1天，自一個供體分離出PBMC且用無血清RPMI 1640以1×10⁶個/ml加以稀釋。將經稀釋之PBMC以3ml/孔接種至6孔組織培養盤中且培育3小時。移除上清液且洗去未附著之細胞。在含10% FBS之RPMI1640中用250U/ml IL-4及500U/ml GM-CSF使已附著之單核細胞極化成樹突狀細胞。在第4天將培養基替換為新鮮IL-4及GM-CSF。在第7天，收集不成熟DC且在含10% FBS之RPMI 1640中用1μg/ml LPS再處理24小時以達成成熟。在第8天，藉由負選擇自另一供體PBMC分離出CD4 T細胞且調節至最終濃度2×10⁶個細胞/ml。在37℃下將成熟DC用絲裂黴素C處理1.5小時。接著用PBS洗滌DC且調節至最終濃度1×10⁶個細胞/ml。將CD4 T細胞(反應細胞)以100μl/孔添加至96孔盤中且用測試抗體以經稀釋之濃度預處理30分鐘。接著將成熟DC(刺激細胞)以100μl/孔添加至孔中。各孔之最終體積為200μl。在37℃下將MLR培育72小時以用於IL-2測試。結果示於圖42A及圖42B中。與尼沃魯單抗相比，FIT024a與FIT024b兩者在MLR研究中均具有較高活性，從而增強T細胞活化。

本說明書中所引用之所有公開案、專利申請案及已頒佈專利均以引用的方式併入本文中，如同明確地且個別地指示各個別公開案、專利申請案或已頒佈專利以全文引用的方式併入一般。

除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解的含義相同的含義。儘管與本文中所描述之方法及材料類似或等效之任何方法及材料均可用於實施或測試本發明，但本文中描述較佳方法及材料。

本文中所論述之出版物僅僅由於其揭示內容在本申請案之申請日期之前而得以提供。在本文中不應被理解為承認本發明由於先前發明而無權先於此種出版物。

儘管已結合本發明之特定實施例來描述本發明，但應理解，一般能夠按照本發明之原理進行進一步修飾且本申請案意欲涵蓋本發明之任何變化方案、用途或改適，且包括在本發明所屬領域內之已知或慣用實務範圍內且可應用於上文所闡述之基本特徵並且在以下所附申請專利範圍範疇內的對本發明之背離。

<110> 岸邁生物科技有限公司(Epimab Bio Therapeutics Inc.)

<120> FABS串聯免疫球蛋白及其用途

<130> 068285-PI-1649

<150> PCT/CN2016/073722

<151> 2016-02-06

<160> 519

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 1

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 2

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 3

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 4

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 5

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 6

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 7

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 8

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 9

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 10

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 11

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 12

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 13

<210> 14

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 14

<210> 15

<211> 676

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL-17/IL-20 FIT1-Ig多肽

<400> 15

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

<210> 18

<211> 127

<212> PRT

<213> 小鼠屬

<400> 18

<210> 19

<211> 103

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

<210> 20

<211> 227

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

<210> 21

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL-17/IL-20 FIT1-Ig多肽

<400> 21

<210> 22

<211> 119

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

<210> 23

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL-17/IL-20 FIT1-Ig多肽

<400> 23

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠屬

<400> 24

<210> 25

<211> 679

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL-17/IL-20 FIT2-Ig多肽

<400> 25

<210> 26

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 26

<210> 27

<211> 683

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL-17/IL-20 FIT3-Ig多肽

<400> 27

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 28

<210> 29

<211> 436

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL-17/IL-20 FIT4-Ig多肽

<400> 29

<210> 30

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL-17/IL-20 FIT5-Ig多肽

<400> 30

<210> 31

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL-17/IL-20 FIT6-Ig多肽

<400> 31

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 32

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 33

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 34

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 35

<210> 36

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 36

<210> 37

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 37

<210> 38

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 38

<210> 39

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 39

<210> 40

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 40

<210> 41

<211> 665

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OKT3/奧法木單抗FIT7-Ig多肽

<400> 41

<210> 42

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠屬

<400> 42

<210> 43

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人

<400> 43

<210> 44

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OKT3/奧法木單抗FIT7-Ig多肽

<400> 44

<210> 45

<211> 119

<212> PRT

<213> 小鼠屬

<400> 45

<210> 46

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OKT3/奧法木單抗FIT7-Ig多肽

<400> 46

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 47

<210> 48

<211> 672

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OKT3/奧法木單抗FIT8-Ig多肽

<400> 48

<210> 49

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 49

<210> 50

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 50

<210> 51

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 51

<210> 52

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 52

<210> 53

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 53

<210> 54

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 54

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 55

<210> 56

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 56

<210> 57

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 57

<210> 58

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 58

<210> 59

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 59

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 60

<210> 61

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 61

<210> 62

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 62

<210> 63

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 63

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 64

<210> 65

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 65

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 66

<210> 67

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 67

<210> 68

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 68

<210> 69

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 69

<210> 70

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 70

<210> 71

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 71

<210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 72

<210> 73

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 73

<210> 74

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 74

<210> 75

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 75

<210> 76

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 76

<210> 77

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 77

<210> 78

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 78

<210> 79

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 79

<210> 80

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 80

<210> 81

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 81

<210> 82

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 82

<210> 83

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 83

<210> 84

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 84

<210> 85

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 85

<210> 86

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽連接子序列

<400> 86

<210> 87

<211> 664

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNF/IL-17 FIT9-Ig多肽

<400> 87

<210> 88

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 88

<210> 89

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNF/IL-17 FIT9-Ig多肽

<400> 89

<210> 90

<211> 126

<212> PRT

<213> 智人

<400> 90

<210> 91

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNF/IL-17 FIT9-Ig多肽

<400> 91

<210> 92

<211> 658

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTLA-4/PD-1 FIT10-Ig多肽

<400> 92

<210> 93

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 93

<210> 94

<211> 113

<212> PRT

<213> 智人

<400> 94

<210> 95

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTLA-4/PD-1 FIT10-Ig多肽

<400> 95

<210> 96

<211> 118

<212> PRT

<213> 智人

<400> 96

<210> 97

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTLA-4/PD-1 FIT10-Ig多肽

<400> 97

<210> 98

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 98

<210> 99

<211> 689

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR/PD-L1 FIT12a(帕尼單抗VL-hCk-1B12VH-hCg1)

<400> 99

<210> 100

<211> 241

<212> PRT

<213> 智人

<400> 100

<210> 101

<211> 235

<212> PRT

<213> 智人

<400> 101

<210> 102

<211> 685

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cMET/EGFR FIT13a多肽1(h1332 VL-hCk-帕尼單抗VH-hCg1)

<400> 102

<210> 103

<211> 239

<212> PRT

<213> 智人

<400> 103

<210> 104

<211> 236

<212> PRT

<213> 智人

<400> 104

<210> 105

<211> 680

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 因子IX/因子X FIT14多肽1(FIX VL-hCk-FX-VH-hCg4)

<400> 105

<210> 106

<211> 245

<212> PRT

<213> 智人

<400> 106

<210> 107

<211> 236

<212> PRT

<213> 智人

<400> 107

<210> 108

<211> 697

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Her3/IGF1R FIT16a多肽1(帕曲土單抗VL-hCk-芬妥木單抗VH-hCg1)

<400> 108

<210> 109

<211> 239

<212> PRT

<213> 智人

<400> 109

<210> 110

<211> 236

<212> PRT

<213> 智人

<400> 110

<210> 111

<211> 693

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DLL4/VEGF FIT17a多肽1(登西珠單抗VL-hCk-貝伐珠單抗VH-hCg1)

<400> 111

<210> 112

<211> 241

<212> PRT

<213> 智人

<400> 112

<210> 113

<211> 236

<212> PRT

<213> 智人

<400> 113

<210> 114

<211> 691

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20/CD3 FIT18a多肽1(奧法木單抗VL-hCk-CD3mAb VH-hCg1mut)

<400> 114

<210> 115

<211> 244

<212> PRT

<213> 智人

<400> 115

<210> 116

<211> 235

<212> PRT

<213> 智人

<400> 116

<210> 117

<211> 691

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Her3/EGFR FIT19a多肽1(帕曲土單抗VL-hCk-帕尼單抗VH-hCg1)

<400> 117

<210> 118

<211> 239

<212> PRT

<213> 智人

<400> 118

<210> 119

<211> 236

<212> PRT

<213> 智人

<400> 119

<210> 120

<211> 689

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1/PD-L1 FIT20a多肽1(尼沃魯單抗VL-hCk-1B12 VH-hCg1Mut)

<400> 120

<210> 121

<211> 235

<212> PRT

<213> 智人

<400> 121

<210> 122

<211> 235

<212> PRT

<213> 智人

<400> 122

<210> 123

<211> 685

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Her3/PD-1 FIT22a多肽1(帕曲土單抗VL-hCk-尼沃魯單抗VH-hCg1mut)

<400> 123

<210> 124

<211> 239

<212> PRT

<213> 智人

<400> 124

<210> 125

<211> 236

<212> PRT

<213> 智人

<400> 125

<210> 126

<211> 680

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(伊匹單抗VL-hCk-尼沃魯單抗VH-hCg1mut)

<400> 126

<210> 127

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL

<400> 127

<210> 128

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR1

<400> 128

<210> 129

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR2

<400> 129

<210> 130

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR3

<400> 130

<210> 131

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH

<400> 131

<210> 132

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR1

<400> 132

<210> 133

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR2

<400> 133

<210> 134

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR3

<400> 134

<210> 135

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(伊匹單抗VH-CH1)

<400> 135

<210> 136

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH

<400> 136

<210> 137

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR1

<400> 137

<210> 138

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR2

<400> 138

<210> 139

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR3

<400> 139

<210> 140

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(尼沃魯單抗VL-hCK)

<400> 140

<210> 141

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL

<400> 141

<210> 142

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR1

<400> 142

<210> 143

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR2

<400> 143

<210> 144

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR3

<400> 144

<210> 145

<211> 684

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(尼沃魯單抗VL-hCk-伊匹單抗VH-hCg1mut)

<400> 145

<210> 146

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL

<400> 146

<210> 147

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR1

<400> 147

<210> 148

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR2

<400> 148

<210> 149

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR3

<400> 149

<210> 150

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH

<400> 150

<210> 151

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR1

<400> 151

<210> 152

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR2

<400> 152

<210> 153

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR3

<400> 153

<210> 154

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(尼沃魯單抗VH-CH1)

<400> 154

<210> 155

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH

<400> 155

<210> 156

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR1

<400> 156

<210> 157

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR2

<400> 157

<210> 158

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR3

<400> 158

<210> 159

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(伊匹單抗VL-hCK)

<400> 159

<210> 160

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL

<400> 160

<210> 161

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR1

<400> 161

<210> 162

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR2

<400> 162

<210> 163

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR3

<400> 163

<210> 164

<211> 677

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(伊匹單抗VL-hCk-尼沃魯單抗VH-hCg4)

<400> 164

<210> 165

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL

<400> 165

<210> 166

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR1

<400> 166

<210> 167

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR2

<400> 167

<210> 168

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR3

<400> 168

<210> 169

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH

<400> 169

<210> 170

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR1

<400> 170

<210> 171

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR2

<400> 171

<210> 172

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR3

<400> 172

<210> 173

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(伊匹單抗VH-CH1)

<400> 173

<210> 174

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH

<400> 174

<210> 175

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR1

<400> 175

<210> 176

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR2

<400> 176

<210> 177

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR3

<400> 177

<210> 178

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(尼沃魯單抗VL-hCK)

<400> 178

<210> 179

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL

<400> 179

<210> 180

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR1

<400> 180

<210> 181

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR2

<400> 181

<210> 182

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR3

<400> 182

<210> 183

<211> 684

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(尼沃魯單抗VL-hCk-伊匹單抗VH-hCg1mut)

<400> 183

<210> 184

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL

<400> 184

<210> 185

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR1

<400> 185

<210> 186

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR2

<400> 186

<210> 187

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR3

<400> 187

<210> 188

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH

<400> 188

<210> 189

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR1

<400> 189

<210> 190

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR2

<400> 190

<210> 191

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VH-CDR3

<400> 191

<210> 192

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(尼沃魯單抗VH-IgG4-CH1)

<400> 192

<210> 193

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH

<400> 193

<210> 194

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR1

<400> 194

<210> 195

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR2

<400> 195

<210> 196

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR3

<400> 196

<210> 197

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(伊匹單抗VL-hCK)

<400> 197

<210> 198

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL

<400> 198

<210> 199

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR1

<400> 199

<210> 200

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR2

<400> 200

<210> 201

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊匹單抗VL-CDR3

<400> 201

<210> 202

<211> 689

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(帕尼單抗VL-hCk-1B12VH-hCg1)

<400> 202

<210> 203

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL

<400> 203

<210> 204

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR1

<400> 204

<210> 205

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR2

<400> 205

<210> 206

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR3

<400> 206

<210> 207

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12VH

<400> 207

<210> 208

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12VH-CDR1

<400> 208

<210> 209

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12VH-CDR2

<400> 209

<210> 210

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12VH-CDR3

<400> 210

<210> 211

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(帕尼單抗VH-CH1h)

<400> 211

<210> 212

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH

<400> 212

<210> 213

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR1

<400> 213

<210> 214

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR2

<400> 214

<210> 215

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR3

<400> 215

<210> 216

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(1B12 VL-hCk)

<400> 216

<210> 217

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VL

<400> 217

<210> 218

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VL-CDR1

<400> 218

<210> 219

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VL-CDR2

<400> 219

<210> 220

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VL-CDR3

<400> 220

<210> 221

<211> 684

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(帕尼單抗VL-hCk-10A5VH-hCg1)

<400> 221

<210> 222

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL

<400> 222

<210> 223

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR1

<400> 223

<210> 224

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR2

<400> 224

<210> 225

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR3

<400> 225

<210> 226

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A5VH

<400> 226

<210> 227

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A5VH-CDR1

<400> 227

<210> 228

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A5VH-CDR2

<400> 228

<210> 229

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A5VH-CDR3

<400> 229

<210> 230

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(帕尼單抗VH-CH1h)

<400> 230

<210> 231

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH

<400> 231

<210> 232

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR1

<400> 232

<210> 233

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR2

<400> 233

<210> 234

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR3

<400> 234

<210> 235

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(10A5 VL-hCk)

<400> 235

<210> 236

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A5 VL

<400> 236

<210> 237

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A5 VL-CDR1

<400> 237

<210> 238

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A5 VL-CDR2

<400> 238

<210> 239

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A5 VL-CDR3

<400> 239

<210> 240

<211> 685

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(h1332 VL-hCk-帕尼單抗VH-hCg1)

<400> 240

<210> 241

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VL

<400> 241

<210> 242

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VL-CDR1

<400> 242

<210> 243

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VL-CDR2

<400> 243

<210> 244

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VL-CDR3

<400> 244

<210> 245

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH

<400> 245

<210> 246

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR1

<400> 246

<210> 247

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR2

<400> 247

<210> 248

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR3

<400> 248

<210> 249

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(h1332 VH-CH1)

<400> 249

<210> 250

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VH

<400> 250

<210> 251

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VH-CDR1

<400> 251

<210> 252

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VH-CDR2

<400> 252

<210> 253

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VH-CDR3

<400> 253

<210> 254

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(帕尼單抗VL-hCk)

<400> 254

<210> 255

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL

<400> 255

<210> 256

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR1

<400> 256

<210> 257

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR2

<400> 257

<210> 258

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR3

<400> 258

<210> 259

<211> 680

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(FIX VL-hCk-FX-VH-hCg4)

<400> 259

<210> 260

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FIX VL

<400> 260

<210> 261

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FIX VL-CDR1

<400> 261

<210> 262

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FIX VL-CDR2

<400> 262

<210> 263

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FIX VL-CDR3

<400> 263

<210> 264

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FX-VH

<400> 264

<210> 265

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FX-VH-CDR1

<400> 265

<210> 266

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FX-VH-CDR2

<400> 266

<210> 267

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FX-VH-CDR3

<400> 267

<210> 268

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(F-IX VH-CH1h)

<400> 268

<210> 269

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F-IX VH

<400> 269

<210> 270

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F-IX VH-CDR1

<400> 270

<210> 271

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F-IX VH-CDR2

<400> 271

<210> 272

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F-IX VH-CDR3

<400> 272

<210> 273

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(F-X VL-hCk)

<400> 273

<210> 274

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F-X VL

<400> 274

<210> 275

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F-X VL-CDR1

<400> 275

<210> 276

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F-X VL-CDR2

<400> 276

<210> 277

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F-X VL-CDR3

<400> 277

<210> 278

<211> 697

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(帕曲土單抗VL-hCk-芬妥木單抗VH-hCg1)

<400> 278

<210> 279

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL

<400> 279

<210> 280

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL-CDR1

<400> 280

<210> 281

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL-CDR2

<400> 281

<210> 282

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL-CDR3

<400> 282

<210> 283

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 芬妥木單抗VH

<400> 283

<210> 284

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 芬妥木單抗VH-CDR1

<400> 284

<210> 285

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 芬妥木單抗VH-CDR2

<400> 285

<210> 286

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 芬妥木單抗VH-CDR3

<400> 286

<210> 287

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(帕曲土單抗VH-CH1)

<400> 287

<210> 288

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH

<400> 288

<210> 289

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR1

<400> 289

<210> 290

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR2

<400> 290

<210> 291

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR3

<400> 291

<210> 292

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(芬妥木單抗VL-hCk)

<400> 292

<210> 293

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 芬妥木單抗VL

<400> 293

<210> 294

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 芬妥木單抗VL-CDR1

<400> 294

<210> 295

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 芬妥木單抗VL-CDR2

<400> 295

<210> 296

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 芬妥木單抗VL-CDR3

<400> 296

<210> 297

<211> 693

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(登西珠單抗VL-hCk-貝伐珠單抗VH-hCg1)

<400> 297

<210> 298

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 登西珠單抗VL

<400> 298

<210> 299

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 登西珠單抗VL-CDR1

<400> 299

<210> 300

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 登西珠單抗VL-CDR2

<400> 300

<210> 301

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 登西珠單抗VL-CDR3

<400> 301

<210> 302

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 貝伐珠單抗VH

<400> 302

<210> 303

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 貝伐珠單抗VH-CDR1

<400> 303

<210> 304

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 貝伐珠單抗VH-CDR2

<400> 304

<210> 305

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 貝伐珠單抗VH-CDR3

<400> 305

<210> 306

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(登西珠單抗VH-CH1h)

<400> 306

<210> 307

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 登西珠單抗VH

<400> 307

<210> 308

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 登西珠單抗VH-CDR1

<400> 308

<210> 309

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 登西珠單抗VH-CDR2

<400> 309

<210> 310

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 登西珠單抗VH-CDR3

<400> 310

<210> 311

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(貝伐珠單抗VL-hCk)

<400> 311

<210> 312

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 貝伐珠單抗VL

<400> 312

<210> 313

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 貝伐珠單抗VL-CDR1

<400> 313

<210> 314

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 貝伐珠單抗VL-CDR2

<400> 314

<210> 315

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 貝伐珠單抗VL-CDR3

<400> 315

<210> 316

<211> 691

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(奧法木單抗VL-hCk-CD3mAb VH-hCg1mut)

<400> 316

<210> 317

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VL

<400> 317

<210> 318

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VL-CDR1

<400> 318

<210> 319

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VL CDR2

<400> 319

<210> 320

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VL-CDR3

<400> 320

<210> 321

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3mAb VH

<400> 321

<210> 322

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3mAb VH CDR1

<400> 322

<210> 323

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3mAb VH CDR2

<400> 323

<210> 324

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3mAb VH CDR3

<400> 324

<210> 325

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(奧法木單抗VH-CH1)

<400> 325

<210> 326

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VH

<400> 326

<210> 327

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VH-CDR1

<400> 327

<210> 328

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VH-CDR2

<400> 328

<210> 329

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VH-CDR3

<400> 329

<210> 330

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(CD3mAb VL-hCL)

<400> 330

<210> 331

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3mAb VL

<400> 331

<210> 332

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3mAb VL-CDR1

<400> 332

<210> 333

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3mAb VL-CDR2

<400> 333

<210> 334

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3mAb VL-CDR3

<400> 334

<210> 335

<211> 691

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(帕曲土單抗VL-hCk-帕尼單抗VH-hCg1)

<400> 335

<210> 336

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL

<400> 336

<210> 337

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL-CDR1

<400> 337

<210> 338

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL CDR2

<400> 338

<210> 339

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL-CDR3

<400> 339

<210> 340

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH

<400> 340

<210> 341

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR1

<400> 341

<210> 342

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR2

<400> 342

<210> 343

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR3

<400> 343

<210> 344

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(帕曲土單抗VH-CH1)

<400> 344

<210> 345

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH

<400> 345

<210> 346

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR1

<400> 346

<210> 347

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR2

<400> 347

<210> 348

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR3

<400> 348

<210> 349

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(帕尼單抗VL-hCk)

<400> 349

<210> 350

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL

<400> 350

<210> 351

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR1

<400> 351

<210> 352

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR2

<400> 352

<210> 353

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR3

<400> 353

<210> 354

<211> 683

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(帕尼單抗VL-hCk-帕曲土單抗-hCg1)

<400> 354

<210> 355

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL

<400> 355

<210> 356

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR1

<400> 356

<210> 357

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL CDR2

<400> 357

<210> 358

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VL-CDR3

<400> 358

<210> 359

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH

<400> 359

<210> 360

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR1

<400> 360

<210> 361

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR2

<400> 361

<210> 362

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR3

<400> 362

<210> 363

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(帕尼單抗VH-CH1)

<400> 363

<210> 364

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH

<400> 364

<210> 365

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR1

<400> 365

<210> 366

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR2

<400> 366

<210> 367

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕尼單抗VH-CDR3

<400> 367

<210> 368

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(帕曲土單抗VL-hCk)

<400> 368

<210> 369

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL

<400> 369

<210> 370

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL-CDR1

<400> 370

<210> 371

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL-CDR2

<400> 371

<210> 372

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL-CDR3

<400> 372

<210> 373

<211> 678

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(1B12 VL-hCk-尼沃魯單抗VH-hCg1Mut)

<400> 373

<210> 374

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I1B12 VL

<400> 374

<210> 375

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VL-CDR1

<400> 375

<210> 376

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VL-CDR2

<400> 376

<210> 377

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VL-CDR3

<400> 377

<210> 378

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH

<400> 378

<210> 379

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR1

<400> 379

<210> 380

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR2

<400> 380

<210> 381

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR3

<400> 381

<210> 382

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(1B12 VH-CH1)

<400> 382

<210> 383

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VH

<400> 383

<210> 384

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VH-CDR1

<400> 384

<210> 385

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VH-CDR2

<400> 385

<210> 386

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VH-CDR3

<400> 386

<210> 387

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(尼沃魯單抗VL-hCK)

<400> 387

<210> 388

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL

<400> 388

<210> 389

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR1

<400> 389

<210> 390

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR2

<400> 390

<210> 391

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR3

<400> 391

<210> 392

<211> 682

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(奧法木單抗VL-hCk-依帕珠單抗VH-hCg1)

<400> 392

<210> 393

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VL

<400> 393

<210> 394

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VL-CDR1

<400> 394

<210> 395

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VL-CDR2

<400> 395

<210> 396

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VL-CDR3

<400> 396

<210> 397

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 依帕珠單抗VH

<400> 397

<210> 398

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 依帕珠單抗VH-CDR1

<400> 398

<210> 399

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 依帕珠單抗VH-CDR2

<400> 399

<210> 400

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 依帕珠單抗VH-CDR3

<400> 400

<210> 401

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(奧法木單抗VH-CH1)

<400> 401

<210> 402

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VH

<400> 402

<210> 403

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VH-CDR1

<400> 403

<210> 404

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VH-CDR2

<400> 404

<210> 405

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧法木單抗VH-CDR3

<400> 405

<210> 406

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(依帕珠單抗VL-hCk)

<400> 406

<210> 407

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 依帕珠單抗VL

<400> 407

<210> 408

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 依帕珠單抗VL-CDR1

<400> 408

<210> 409

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 依帕珠單抗VL-CDR2

<400> 409

<210> 410

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 依帕珠單抗VL-CDR3

<400> 410

<210> 411

<211> 685

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(帕曲土單抗VL-hCk-尼沃魯單抗VH-hCg1mut)

<400> 411

<210> 412

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL

<400> 412

<210> 413

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL-CDR1

<400> 413

<210> 414

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL-CDR2

<400> 414

<210> 415

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VL-CDR3

<400> 415

<210> 416

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH

<400> 416

<210> 417

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR1

<400> 417

<210> 418

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR2

<400> 418

<210> 419

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR3

<400> 419

<210> 420

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(帕曲土單抗-CH1)

<400> 420

<210> 421

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH

<400> 421

<210> 422

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR1

<400> 422

<210> 423

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR2

<400> 423

<210> 424

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕曲土單抗VH-CDR3

<400> 424

<210> 425

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(尼沃魯單抗VL-hCK)

<400> 425

<210> 426

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL

<400> 426

<210> 427

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR1

<400> 427

<210> 428

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR2

<400> 428

<210> 429

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR3

<400> 429

<210> 430

<211> 689

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(h1332 VL-hCk-1B12 VH-hCg1)

<400> 430

<210> 431

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VL

<400> 431

<210> 432

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VL-CDR1

<400> 432

<210> 433

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VL-CDR2

<400> 433

<210> 434

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VL-CDR3

<400> 434

<210> 435

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VH

<400> 435

<210> 436

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VH-CDR1

<400> 436

<210> 437

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VH-CDR2

<400> 437

<210> 438

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VH-CDR3

<400> 438

<210> 439

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(h1332 VH-CH1)

<400> 439

<210> 440

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VH

<400> 440

<210> 441

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VH-CDR1

<400> 441

<210> 442

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VH-CDR2

<400> 442

<210> 443

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1332 VH-CDR3

<400> 443

<210> 444

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(1B12 VL-hCK)

<400> 444

<210> 445

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VL

<400> 445

<210> 446

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VL-CDR1

<400> 446

<210> 447

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VL-CDR2

<400> 447

<210> 448

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B12 VL-CDR3

<400> 448

<210> 449

<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(6A5 VL-hCk-尼沃魯單抗VH-hCg1mut)

<400> 449

<210> 450

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VL

<400> 450

<210> 451

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VL-CDR1

<400> 451

<210> 452

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VL-CDR2

<400> 452

<210> 453

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VL-CDR3

<400> 453

<210> 454

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH

<400> 454

<210> 455

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR1

<400> 455

<210> 456

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR2

<400> 456

<210> 457

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR3

<400> 457

<210> 458

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(6A5 VH-CH1)

<400> 458

<210> 459

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VH

<400> 459

<210> 460

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VH-CDR1

<400> 460

<210> 461

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VH-CDR2

<400> 461

<210> 462

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VH-CDR3

<400> 462

<210> 463

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(尼沃魯單抗VL-hCK)

<400> 463

<210> 464

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL

<400> 464

<210> 465

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR1

<400> 465

<210> 466

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR2

<400> 466

<210> 467

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR3

<400> 467

<210> 468

<211> 694

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 長鏈(尼沃魯單抗VL-hCk-6A5 VH-hCg1mut)

<400> 468

<210> 469

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL

<400> 469

<210> 470

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR1

<400> 470

<210> 471

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR2

<400> 471

<210> 472

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VL-CDR3

<400> 472

<210> 473

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VH

<400> 473

<210> 474

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VH-CDR1

<400> 474

<210> 475

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VH-CDR2

<400> 475

<210> 476

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VH-CDR3

<400> 476

<210> 477

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈1(尼沃魯單抗VH-CH1)

<400> 477

<210> 478

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH

<400> 478

<210> 479

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR1

<400> 479

<210> 480

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR2

<400> 480

<210> 481

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尼沃魯單抗VH-CDR3

<400> 481

<210> 482

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短鏈2(6A5 VL-hCK)

<400> 482

<210> 483

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VL

<400> 483

<210> 484

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VL-CDR1

<400> 484

<210> 485

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VL-CDR2

<400> 485

<210> 486

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6A5 VL-CDR3

<400> 486

<210> 487

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前導序列

<400> 487

<210> 488

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前導序列

<400> 488

<210> 489

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 489

<210> 490

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 490

<210> 491

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 491

<210> 492

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 492

<210> 493

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 493

<210> 494

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 494

<210> 495

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 495

<210> 496

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 496

<210> 497

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 497

<210> 498

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 498

<210> 499

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 499

<210> 500

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 500

<210> 501

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 501

<210> 502

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 502

<210> 503

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 503

<210> 504

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 504

<210> 505

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 505

<210> 506

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 506

<210> 507

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 507

<210> 508

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 508

<210> 509

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 509

<210> 510

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 510

<210> 511

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 511

<210> 512

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 512

<210> 513

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 513

<210> 514

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 514

<210> 515

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 515

<210> 516

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 516

<210> 517

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 517

<210> 518

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 518

<210> 519

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 519

Claims

一種雙特異性結合蛋白質，用以結合抗原A及抗原B，其包含三個多肽鏈，其中：第一多肽鏈從胺基末端到羧基末端包括(1)VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc或(2)VH_B-CH1-VL_A-CL-Fc，其中VL_A為結合所述抗原A的第一親本抗體的抗體輕鏈可變域，CL為抗體輕鏈恆定域，VH_B為來自結合所述抗原B的第二親本抗體的抗體重鏈可變域，CH1為抗體重鏈之第一恆定域，且在可變域和恆定域之間沒有插入連接子；第二多肽鏈從胺基末端到羧基末端包括VH_A-CH1，其中VH_A為結合所述抗原A的所述第一親本抗體的重鏈可變域，CH1為抗體重鏈之第一恆定域，且在VH_A和CH1之間沒有插入連接子；以及第三多肽鏈從胺基末端到羧基末端包括VL_B-CL，其中VL_B為結合所述抗原B的所述第二親本抗體的輕鏈可變域，CL為抗體輕鏈恆定域，且在VL_B和CL之間沒有插入連接子，其中兩個所述第一多肽鏈、兩個所述第二多肽鏈以及兩個所述第三多肽鏈能夠結合以提供雙特異性四價結合蛋白質，所述雙特異性四價結合蛋白質包含具有四個功能性Fab結合單元的六個多肽鏈，其中所述雙特異性結合蛋白質結合所述抗原A及所述抗原B，其中A為cMet且B為EGFR，其中VL_A包含三個CDR序列(CDR-1、CDR-2、CDR-3)，其中VL_A的CDR-1的序列為SEQ ID NO：242，VL_A的CDR-2的序列為SEQ ID NO：243，且VL_A的CDR-3的序列為SEQ ID NO：244，其中VH_A包含三個CDR序列(CDR-1、CDR-2、CDR-3)，其中VH_A的CDR-1的序列為SEQ ID NO：251，VH_A的CDR-2的序列為SEQ ID NO：252，且VH_A的CDR-3的序列為SEQ ID NO：253，其中VL_B包含三個CDR序列(CDR-1、CDR-2、CDR-3)，其中VL_B的CDR-1的序列為SEQ ID NO：256，VL_B的CDR-2的序列為SEQ ID NO：257，且VL_B的CDR-3的序列為SEQ ID NO：258，其中VH_B包含三個CDR序列(CDR-1，CDR-2，CDR-3)，其中VH_B的CDR-1的序列為SEQ ID NO：246，VH_B的CDR-2的序列為SEQ ID NO：247，且VH_B的CDR-3的序列為SEQ ID NO：248。
如申請專利範圍第1項所述之雙特異性結合蛋白質，其中所述雙特異性結合蛋白質結合cMet及EGFR，且包括可變域VL_A、VH_A、VL_B及VH_B，其中VL_A的序列為SEQ ID NO：241，VH_A的序列為SEQ ID NO：250，VL_B的序列為SEQ ID NO：255，且VH_B的序列為SEQ ID NO：245。
如申請專利範圍第2項所述之雙特異性結合蛋白質，其中所述雙特異性結合蛋白質結合cMet及EGFR，且包括所述第一多肽鏈、所述第二多肽鏈及所述第三多肽鏈，其中所述第一條多肽鏈的序列為SEQ ID NO：240的殘基23-685，所述第二條多肽鏈的序列為SEQ ID NO：249的殘基20-239，且所述第三條多肽鏈的序列為SEQ ID NO：254的殘基23-236。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之雙特異性結合蛋白質及醫藥學上可接受之載劑。
一種醫藥組成物的用途，所述醫藥組成物包含如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之雙特異性結合蛋白質，用於製備治療癌症的藥物。
一種雙特異性結合蛋白質的用途，所述雙特異性結合蛋白質包括如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之雙特異性結合蛋白質，其係用於製造用以治療病狀之藥物，其中所述病狀為癌症。