KR102185867B1 - Fabs-인-탠덤 면역글로불린 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2개 이상의 항원들, 또는 2개 이상의 에피토프들에 결합할 수 있는 다가 및 다중특이적 결합 단백질을 제공한다. 본 발명은 다양한 질환들의 예방 또는 치료를 위해, 또는 시험관내에서 또는 생체내에서 특정 항원을 검출하기 위해 이러한 결합 단백질을 사용하는 방법을 포함하는, 이러한 다가 및 다중특이적 결합 단백질을 제조하고 사용하는 방법도 제공한다.

Description

FABS-인-탠덤 면역글로불린 및 이의 용도
관련 출원의 교차참조
본원은 모든 목적을 위해 전체로서 본원에 참고로 도입되는, 2016년 2월 6일에 출원된 국제 특허출원 제PCT/CN2016/073722호의 우선권 및 이익을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 다가 및 다중특이적 결합 단백질, 및 다가 및 다중특이적 결합 단백질을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 설명
본원과 함께 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 전체로서 본원에 참고로 도입된다: 서열목록의 컴퓨터 판독가능한 포맷 복사본(파일명: EPBI_002_01WO_SeqList_ST25.txt, 기록일: 2017년 2월 3일, 파일 크기 510KB).
다양한 염증성 질환들, 암들 및 다른 장애들의 치료에 유용한 분자를 제조하기 위한 시도에서 이중특이적 또는 다중특이적 항체가 생성되었다.
이중특이적 항체는 이중특이적 항체의 원하는 특이성을 가진 뮤린 단일클론 항체를 발현하는 2개의 상이한 하이브리도마 세포주의 체세포 융합에 기반을 둔 쿠아드로마(quadroma) 기술(문헌(Milstein, C. and A.C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934): p. 537-40) 참조)을 이용함으로써 생성되었다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 mAb들의 화학적 접합에 의해서도 생성될 수 있다(문헌(Staerz, U.D., et al., Nature, 1985. 314(6012): p. 628-31) 참조). 다른 방법은 2개의 상이한 단일클론 항체들 또는 보다 더 작은 항체 단편들의 화학적 접합을 이용하였다(문헌(Brennan, M., et al., Science, 1985. 229(4708): p. 81-3) 참조).
또 다른 방법은 2개의 모 항체들과 이종이작용성 가교결합제의 커플링이다. 구체적으로, 2개의 상이한 Fab 단편들은 부위-지정된 방식으로 그들의 힌지 시스테인 잔기에서 화학적으로 가교결합된다(문헌(Glennie, M.J., et al., J Immunol, 1987. 139(7): p. 2367-75) 참조).
다른 재조합 이중특이적 항체 포맷은 최근에 개발되었다(문헌(Kriangkum, J., et al., Biomol Eng, 2001. 18(2): p. 31-40) 참조). 이들 중에서 탠덤(tandem) 단일 쇄 Fv 분자 및 디아바디(diabodies), 및 이들의 다양한 유도체들은 재조합 이중특이적 항체의 구축을 위해 사용되고 있다. 통상적으로, 이 분자들의 구축은 상이한 항원을 인식하는 2개의 단일 쇄 Fv(scFv) 단편들로부터 시작한다(문헌(Economides, A.N., et al., Nat Med, 2003. 9(1): p. 47-52) 참조). 탠덤 scFv 분자(taFv)는 2개의 scFv 분자들을 추가 펩타이드 링커로 단순히 연결하는 단순한 포맷을 대표한다. 이 탠덤 scFv 분자에 존재하는 2개의 scFv 단편들은 별개의 폴딩 독립체를 형성한다. 다양한 링커들이 2개의 scFv 단편들 및 최대 63개 잔기의 길이를 가진 링커를 연결하는 데 사용될 수 있다(문헌(Nakanishi, K., et al.. Annu Rev Immunol, 2001. 19: p. 423-74) 참조).
최근 연구에서, CD28 및 흑색종 관련 프로테오글리칸에 대해 유도된 탠덤 scFv의 형질전환 토끼 및 소에 의한 생체내 발현이 보고되었다(문헌(Gracie, J.A., et al., J Clin Invest, 1999. 104(10): p. 1393-401) 참조). 이 구축물에서, 2개의 scFv 분자들은 CH1 링커에 의해 연결되었고, 최대 100 mg/ℓ의 이중특이적 항체의 혈청 농도가 발견되었다. 몇몇 연구들은 현재 매우 짧은 Ala3 링커 또는 긴 글리신/세린 풍부 링커를 사용하여 세균에서 가용성 탠덤 scFv 분자를 발현하는 것을 보고하였다(문헌(Leung, B.P., et al., J Immunol, 2000. 164(12): p. 6495-502); 문헌(Ito, A., et al., J Immunol, 2003. 170(9): p. 4802-9); 문헌(Karni, A., et al., J Neuroimmunol, 2002. 125(1-2): p. 134-40) 참조).
최근 연구에서, 3개 또는 6개 잔기의 길이를 가진 무작위화된 중간 링커를 함유하는 탠덤 scFv 레퍼토리의 파지 디스플레이는 세균에서 가용성 및 활성 형태로 생성되는 분자들을 풍부하게 하였다. 이 방법은 6 아미노산 잔기 링커를 가진 바람직한 탠덤 scFv 분자의 단리라는 결과를 가져왔다(문헌(Arndt, M. and J. Krauss, Methods Mol Biol, 2003. 207: p. 305-21) 참조).
이중특이적 디아바디(Db)는 발현을 위해 디아바디 포맷을 사용한다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 링커의 길이를 대략 5개 잔기까지 감소시킴으로써 scFv 단편으로부터 생성된다(문헌(Peipp, M. and T. Valerius, Biochem Soc Trans, 2002. 30(4): p. 507-11) 참조). 링커 크기의 이 감소는 VH 및 VL 도메인의 교차 쌍 형성에 의한 2개의 폴리펩타이드 쇄들의 이량체화를 용이하게 한다. 이중특이적 항체는 동일한 세포 내에서 구조 VHA-VLB 및 VHB-VLA(VH-VL 배열) 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA(VL-VH 배열)를 가진 2개의 폴리펩타이드 쇄들을 발현시킴으로써 생성된다. 최근 비교 연구는 가변 도메인의 배향이 활성 결합 부위의 발현 및 형성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 입증한다(문헌(Mack, M., G. Riethmuller, and P. Kufer, Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(15): p. 7021-5) 참조).
이중특이적 디아바디의 생성을 강제하는 한 방법은 놉-인투-홀(knob-into-hole) 디아바디의 생성이다(문헌(Holliger, P., T. Prospero, and G. Winter, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(14): p. 6444-8.18) 참조). 이것은 HER2 및 CD3에 대해 유도된 이중특이적 디아바디의 경우 입증되었다. Val37을 Phe으로 교체하고 Leu45를 Trp으로 교체함으로써 큰 놉을 VH 도메인에 도입하였고, 항-HER2 또는 항-CD3 가변 도메인에서 Phe98을 Met으로 돌연변이시키고 Tyr87을 Ala으로 돌연변이시킴으로써 VL 도메인에서 상보적 홀을 생성하였다. 이 방법을 이용함으로써, 이중특이적 디아바디의 생성은 모 디아바디에 의한 72%부터 놉-인투-홀 디아바디에 의한 90% 초과 수준까지 증가될 수 있었다.
단일 쇄 디아바디(scDb)는 이중특이적 디아바디 유사 분자의 형성을 개선하는 대안적 방법을 대표한다(문헌(Holliger, P. and G. Winter, Cancer Immunol Immunother, 1997. 45(3-4): p. 128-30); 문헌(Wu, A.M., et al., Immunotechnology, 1996. 2(1): p. 21-36) 참조). 이중특이적 단일 쇄 디아바디는 대략 15개 아미노산 잔기의 길이를 가진 추가 중간 링커로 2개의 디아바디 형성 폴리펩타이드 쇄들을 연결함으로써 생성된다. 결과적으로, 단량체 단일 쇄 디아바디(50 내지 60 kDa)에 상응하는 분자량을 가진 모든 분자들은 이중특이적이다. 여러 연구들은 이중특이적 단일 쇄 디아바디가 단량체로서 존재하는 대다수의 정제된 분자들과 함께 세균에서 가용성 및 활성 형태로 발현된다는 것을 입증하였다(문헌(Holliger, P. and G. Winter, Cancer Immunol Immunother, 1997. 45(3-4): p. 128-30); 문헌(Wu, A.M., et al., Immunotechnology, 1996. 2(1): p. 21-36); 문헌(Pluckthun, A. and P. Pack, Immunotechnology, 1997. 3(2): p. 83-105); 문헌(Ridgway, J.B., et al., Protein Eng, 1996. 9(7): p. 617-21) 참조).
디아바디는 Fc에 융합되어 디-디아바디로서 명명된, Ig와 보다 더 유사한 분자를 생성하였다(문헌(Lu, D., et al., J Biol Chem, 2004. 279(4): p. 2856-65) 참조). 추가로, IgG의 중쇄에서 2개의 Fab 반복부들을 포함하고 4개의 항원 분자들에 결합할 수 있는 다가 항체 구축물이 기재되어 있다(미국 특허 제8,722,859 B2호 및 문헌(Miller, K., et al., J Immunol, 2003. 170(9): p. 4854-61) 참조).
가장 최근의 예는 4가 IgG-단일 쇄 가변 단편(scFv) 융합체(Dong J, et al. 2011 MAbs 3:273-288; Coloma MJ, Morrison SL 1997 Nat Biotechnol 15:159-163; Lu D, et al. 2002 J Immunol Methods 267:213-226), 삼작용성 래트/마우스 하이브리드 이중특이적 상피 세포 부착 분자-CD3 항체인 카투막소맙(catumaxomab)(Lindhofer H, et al 1995 J Immunol 155:219-225), 이중특이적 CD19-CD3 scFv 항체 블리나투모맙(blinatumomab)(Bargou R, et al. 2008 Science 321:974-977), "이중 작용 Fab"(DAF) 항체(BostromJ, et al. 2009 Science 323:1610-1614), 촉매 항체에 공유결합된 약물분자구조(pharmacophore) 펩타이드(Doppalapudi VR, et al. 2010 Proc Natl Acad Sci USA 107:22611-22616), 이중특이적 항체를 생성하기 위한 절반 IgG4 분자들 사이의 동적 교환의 이용(van der Neut Kolfschoten M, et al. 2007 Science 317:1554-1557; Stubenrauch K, et al. 2010 Drug Metab Dispos 38:84-91), 또는 이중특이적 항체의 절반의 항원 결합 단편(Fab) 내에서의 중쇄 및 경쇄 도메인의 교환(CrossMab 포맷)(Schaefer W, et al 2011 Proc Natl Acad Sci 108:11187-92)이다.
이중 항원 결합 기능을 가진 단일 분자 독립체, 및 이러한 다가 및 다중특이적 결합 단백질을 생성하는 방법에 대한 필요성이 당분야에 존재한다. 본 발명은 이 필요성 및 다른 필요성을 다룬다.
본 발명은 다가 및 다중특이적 결합 단백질, 및 이러한 결합 단백질을 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본원에서 제공된 다가 및 다중특이적 결합 단백질은 Fabs-인-탠덤(in-tandem) 면역글로불린(FIT-Ig)이고, 2개 이상의 항원들, 동일한 항원의 2개 이상의 에피토프들, 또는 동일한 에피토프의 2개 이상의 카피들에 결합할 수 있다. 본원에서 제공된 다가 및 다중특이적 결합 단백질은 급성 및 만성 염증성 질환 및 장애, 자가면역 질환, 암, 척수 손상, 패혈증, 및 다른 질환, 장애 및 질병의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 상기 다가 및 다중특이적 결합 단백질을 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 추가로, 이러한 FIT-Ig를 제조하기 위한 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포가 본원에서 제공된다. 생체내에서 또는 시험관내에서 특정 항원을 검출하기 위해 본 발명의 FIT-Ig를 사용하는 방법도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 예를 들면, 높은 친화성으로 2개 이상의 항원들에 결합할 수 있는 결합 단백질들의 과(family)를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 2개의 모 단일클론 항체들을 사용하여 이중특이적 결합 단백질을 구축하는 방법을 제공한다: 항원 A에 결합하는 mAb A, 및 항원 B에 결합하는 mAb B. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 항원, 사이토카인, 케모카인, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 사이토카인 또는 케모카인 관련 분자, 또는 세포 표면 단백질에 결합할 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 2개 이상의 항원들에 결합할 수 있는 결합 단백질이 제공된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 쌍을 이루어 2개 이상의 항원들에 결합할 수 있는 IgG 유사 분자를 형성하는 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 결합 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상의 폴리펩타이드 쇄들을 포함한다. 한 실시양태에서, 결합 단백질은 적어도 하나의 VLA, 적어도 하나의 VLB, 적어도 하나의 VHA, 적어도 하나의 VHB, 적어도 하나의 CL 및 적어도 하나의 CH1을 포함하고, 이때 VL은 경쇄 가변 도메인이고, VH는 중쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, A는 제1 항원이고, B는 제2 항원이다. 추가 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 VLA, CL, VHB 및 CH1을 포함한다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 Fc도 포함한다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역이다. 추가 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 변형된 이펙터 기능, 예컨대, ADCC 또는 CDC를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 하나 이상의 FcγR에 대한 변형된 친화성 또는 결합력(avidity)을 나타낸다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 3개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드 쇄는 VLA, CL, VHB 및 CH1을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 쇄는 VHA 및 CH1을 포함하고, 제3 폴리펩타이드 쇄는 VLB 및 CL을 포함한다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질의 제1 폴리펩타이드 쇄는 Fc를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 2개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드 쇄는 VLA, CL, VHB 및 CH1을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 쇄는 VHA, CH1, VLB 및 CL을 포함한다. 추가 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 Fc를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 3개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하고, 공-형질감염 동안 이들의 상응하는 cDNA는 1:1:1, 1:1.5:1, 1:3:1, 1:1:1.5, 1:1:3, 1:1.5:1.5, 1:3:1.5, 1:1.5:3 또는 1:3:3의 제1:제2:제3 몰 비로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 2개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하고, 공-형질감염 동안 이들의 상응하는 cDNA는 임의의 소정의 형질감염에서 단량체 FIT-Ig 비율을 최대화하기 위한 노력에서 최적화를 통해 1:1, 1:1.5 또는 1:3, 또는 임의의 다른 비의 제1:제2 몰 비로 존재한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 펩타이드 링커를 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 적어도 하나의 아미노산 또는 폴리펩타이드 링커를 포함한다. 추가 실시양태에서, 링커는 G, GS, SG, GGS, GSG, SGG, GGG, GGGS(서열번호 489), SGGG(서열번호 490), GGGGS(서열번호 491), GGGGSGS(서열번호 492), GGGGSGGS(서열번호 493), GGGGSGGGGS(서열번호 494), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 495), AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 496), AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 497), AKTTPKLGG(서열번호 498), SAKTTPKLGG(서열번호 499), SAKTTP(서열번호 500), RADAAP(서열번호 501), RADAAPTVS(서열번호 502), RADAAAAGGPGS(서열번호 503), RADAAAA(G4S)4(서열번호 504), SAKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 505), ADAAP(서열번호 506), ADAAPTVSIFPP(서열번호 507), TVAAP(서열번호 508), TVAAPSVFIFPP(서열번호 509), QPKAAP(서열번호 510), QPKAAPSVTLFPP(서열번호 511), AKTTPP(서열번호 512), AKTTPPSVTPLAP(서열번호 513), AKTTAPSVYPLAP(서열번호 514), ASTKGP(서열번호 515), ASTKGPSVFPLAP(서열번호 516), GENKVEYAPALMALS(서열번호 517), GPAKELTPLKEAKVS(서열번호 518), GHEAAAVMQVQYPAS(서열번호 519) 및 AKTTAP(서열번호 80)로 구성된 군으로부터 선택된다. 링커는 이전에 기재된 바와 같이(Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals: Applications and Challenges, edited by Stefan R. Schmidt) 생체내 절단가능한 펩타이드 링커, 프로테아제(예컨대, MMP) 민감성 링커, 환원에 의해 절단될 수 있는 디설파이드 결합-기반 링커 등, 또는 당분야에서 공지되어 있는 임의의 절단가능한 링커일 수도 있다. 이러한 절단가능한 링커는 조직/세포 침투 및 분포를 개선하고, 표적에의 결합을 향상시키고, 잠재적인 부작용을 감소시킬 뿐만 아니라 2개의 상이한 Fab 영역들의 생체내 기능적 및 물리적 반감기를 조절하기 위해 다양한 목적으로 생체내에서 상부 Fab를 방출하는 데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 아미노 말단부터 카복실 말단까지 VLA-CL-VHB-CH1-Fc를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 아미노 말단부터 카복실 말단까지 VHA-CH1을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄, 및 아미노 말단부터 카복실 말단까지 VLB-CL을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하고; 이때 VL은 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, VH는 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, A는 제1 에피토프 또는 항원이고, B는 제2 에피토프 또는 항원이다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1이다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역이다. 추가 실시양태에서, Fc 영역의 아미노산 서열은 서열번호 20과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 추가 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄의 CL은 VHB에 직접적으로 융합된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄의 CL은 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커를 통해 VHB에 연결된다. 추가 실시양태에서, 링커는 GSG(서열번호 26) 또는 GGGGSGS(서열번호 28)이다.
또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 아미노 말단부터 카복실 말단까지 VHB-CH1-VLA-CL-Fc를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 아미노 말단부터 카복실 말단까지 VHA-CH1을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄, 및 아미노 말단부터 카복실 말단까지 VLB-CL을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하고; 이때 VL은 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, VH는 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, A는 제1 에피토프 또는 항원이고, B는 제2 에피토프 또는 항원이다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1이다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역이다. 추가 실시양태에서, Fc 영역의 아미노산 서열은 서열번호 20과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄의 CH1은 VLA에 직접적으로 융합된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄의 CH1은 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커를 통해 VLA에 연결된다. 추가 실시양태에서, 링커는 GSG(서열번호 26) 또는 GGGGSGS(서열번호 28)이다.
또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 아미노 말단부터 카복실 말단까지 VLA-CL-VHB-CH1-Fc를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 아미노 말단부터 카복실 말단까지 VHA-CH1-VLB-CL을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고; 이때 VL은 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, VH는 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, A는 제1 에피토프 또는 항원이고, B는 제2 에피토프 또는 항원이다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1이다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역이다. 추가 실시양태에서, Fc 영역의 아미노산 서열은 서열번호 20과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 추가 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄의 CL은 VHB에 직접적으로 융합된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄의 CL은 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커를 통해 VHB에 연결된다. 추가 실시양태에서, 링커는 GSG(서열번호 26) 또는 GGGGSGS(서열번호 28)이다.
또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 아미노 말단부터 카복실 말단까지 VHB-CH1-VLA-CL-Fc를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 아미노 말단부터 카복실 말단까지 VLB-CL-VHA-CH1을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고; 이때 VL은 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, VH는 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, A는 제1 에피토프 또는 항원이고, B는 제2 에피토프 또는 항원이다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1이다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역이다. 추가 실시양태에서, Fc 영역의 아미노산 서열은 서열번호 20과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄의 CH1은 VLA에 직접적으로 융합된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄의 CH1은 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커를 통해 VLA에 연결된다. 추가 실시양태에서, 링커는 GSG(서열번호 26) 또는 GGGGSGS(서열번호 28)이다.
본 발명의 결합 단백질은 사이토카인 쌍에 결합할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 결합 단백질은 IL-1α 및 IL-1β; IL-12 및 IL-18, TNFα 및 IL-23, TNFα 및 IL-13; TNF 및 IL-18; TNF 및 IL-12; TNF 및 IL-1베타; TNF 및 MIF; TNF 및 IL-6, TNF 및 IL-6 수용체, TNF 및 IL-17; IL-17 및 IL-20; IL-17 및 IL-23; TNF 및 IL-15; TNF 및 VEGF; VEGFR 및 EGFR; PDGFR 및 VEGF, IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-13 및 IL-25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MIF; IL-13 및 TGF-β; IL-13 및 LHR 아고니스트; IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAM8; 및 TNFα 및 PGE4, IL-13 및 PED2, TNF 및 PEG2로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인 쌍에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-17 및 IL-20에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-17 및 IL-20에 결합할 수 있고 항-IL-17 항체 LY 및 항-IL-20 항체 15D2로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-17 및 TNF에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-17 및 TNF에 결합할 수 있고 항-IL-17 항체 LY 및 TNF 항체 골리무맙(golimumab)으로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-17 및 IL-20에 결합하고 서열번호 15, 25 및 27로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드; 서열번호 21에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 23에 따른 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-27 및 IL-20에 결합하고 서열번호 15, 25 및 27로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄, 및 서열번호 29, 30 및 31로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 TNF 및 IL-17에 결합하고 서열번호 87에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드; 서열번호 89에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 91에 따른 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 CD137 및 CD20, CD137 및 EGFR, CD137 및 Her-2, CD137 및 PD-1, CD137 및 PDL-1, VEGF 및 PD-L1, Lag-3 및 TIM-3, OX40 및 PD-1, TIM-3 및 PD-1, TIM-3 및 PDL-1, EGFR 및 DLL-4, CD138 및 CD20; CD138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD3 및 CD33; CD3 및 CD133; CD47 및 CD20, CD38 및 CD138; CD38 및 CD20; CD20 및 CD22; CD38 및 CD40; CD40 및 CD20; CD-8 및 IL-6; CSPGs 및 RGM A; CTLA-4 및 BTNO2; IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; IGF-1R 및 EGFR; EGFR 및 CD13; IGF-1R 및 ErbB3; EGFR-2 및 IGFR; VEGFR-2 및 Met; VEGF-A 및 안지오포이에틴(Angiopoietin)-2(Ang-2); IL-12 및 TWEAK; IL-13 및 IL-1베타; PDGFR 및 VEGF, EpCAM 및 CD3, Her2 및 CD3, CD19 및 CD3, EGFR 및 Her3, CD16a 및 CD30, CD30 및 PSMA, EGFR 및 CD3, CEA 및 CD3, TROP-2 및 HSG, TROP-2 및 CD3, MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; PDL-1 및 CTLA-4; CTLA-4 및 PD-1; PD-1 및 TIM-3; RGM A 및 RGM B; Te38 및 TNFα; TNFα 및 Blys; TNFα 및 CD-22; TNFα 및 CTLA-4 도메인; TNFα 및 GP130; TNFα 및 IL-12p40; 및 TNFα 및 RANK 리간드, 인자 IXa 및 인자 X; EGFR 및 PD-L1; EGFR 및 cMet; Her3 및 IGF-IR; DLL-4 및 VEGF; PD-1 및 PD-L1; 및 Her3 및 PD-1로 구성된 군으로부터 선택된 표적 쌍에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합할 수 있고 전체로서 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공보 제2009/0252683호에 개시된 항-CD3 항체 OKT3 또는 항-CD3 항체, 및 항-CD20 항체 오파투무맙(ofatumumab)으로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고, CD20 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 상부 도메인은 N-말단 또는 "아미노 인접" 도메인이고, 하부 도메인은 존재하는 경우 C-말단 도메인, 또는 Fc에 더 가까운 도메인이다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드, 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 CD3이고, 항원 B는 CD20이다. 또 다른 예에서, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드, 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 CD3이고, 항원 A는 CD20이다. 일부 실시양태에서, CD3 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고, CD20 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드, 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 CD20이고, 항원 B는 CD-3이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드, 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 CD20이고, 항원 A는 CD3이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합하고, 서열번호 41 및 48로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 44에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 46에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD20 및 CD3에 결합하고 서열번호 114에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 115에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 116에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT018a의 에피토프와 동일한 CD20의 에피토프 및 동일한 CD3의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT018a는 서열번호 316의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합하고, 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 318의 VLA CDR1, 서열번호 319의 VLA CDR2 및 서열번호 320의 VLA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합하고, 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 322의 VHB CDR1, 서열번호 323의 VHB CDR2 및 서열번호 324의 VHB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합하고, 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 327의 VHA CDR1, 서열번호 328의 VHA CDR2 및 서열번호 329의 VHA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합하고, 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 332의 VLB CDR1, 서열번호 333의 VLB CDR2 및 서열번호 334의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합하고, 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA, 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 318의 VLA CDR1, 서열번호 319의 VLA CDR2 및 서열번호 320의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 322의 VHB CDR1, 서열번호 323의 VHB CDR2 및 서열번호 324의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 327의 VHA CDR1, 서열번호 328의 VHA CDR2 및 서열번호 329의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 332의 VLB CDR1, 서열번호 333의 VLB CDR2 및 서열번호 334의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합하고, 서열번호 317의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 321의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 326의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 331의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합하고, 서열번호 316의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA-4 및 PD-1에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA-4 및 PD-1에 결합할 수 있고 CTLA-4 항체 이필리무맙(ipilimumab) 및 PD-1 항체 니볼루맙(nivolumab)으로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA-4 및 PD-1에 결합하고, 서열번호 92에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 95에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 97에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에서 제공된 결합 단백질은 CTLA-4의 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 제공된 결합 단백질은 PD-1의 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 PD-1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드, 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 CTLA-4이고, 항원 B는 PD-1이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드, 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 CTLA-4이고, 항원 A는 PD-1이다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고, PD-1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드, 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 PD-1이고, 항원 B는 CTLA-4이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드, 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 PD-1이고, 항원 A는 CTLA-4이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 본원에 기재된 바와 같이 이중특이적 결합 단백질 NBS3, NBS3R, NBS3-C 또는 NBS3R-C의 에피토프와 동일한 CTLA-4의 에피토프 및 동일한 PD-1의 에피토프에 결합할 수 있다.
이중특이적 결합 단백질 NBS3은 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
이중특이적 결합 단백질 NBS3R은 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
이중특이적 결합 단백질 NBS3-C는 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
이중특이적 결합 단백질 NBS3R-C는 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 192의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 128의 VLA CDR1, 서열번호 129의 VLA CDR2 및 서열번호 130의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고, 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 147의 VLA CDR1, 서열번호 148의 VLA CDR2 및 서열번호 149의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3R). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 166의 VLA CDR1, 서열번호 167의 VLA CDR2 및 서열번호 168의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3-C). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 185의 VLA CDR1, 서열번호 186의 VLA CDR2 및 서열번호 187의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3R-C).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 132의 VHB CDR1, 서열번호 133의 VHB CDR2 및 서열번호 134의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 151의 VHB CDR1, 서열번호 152의 VHB CDR2 및 서열번호 153의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3R). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 166의 VHB CDR1, 서열번호 167의 VHB CDR2 및 서열번호 168의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3-C). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 185의 VHB CDR1, 서열번호 186의 VHB CDR2 및 서열번호 187의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3R-C).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 137의 VHA CDR1, 서열번호 138의 VHA CDR2 및 서열번호 139의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 156의 VHA CDR1, 서열번호 157의 VHA CDR2 및 서열번호 158의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3R). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 175의 VHA CDR1, 서열번호 176의 VHA CDR2 및 서열번호 177의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS-C). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 194의 VHA CDR1, 서열번호 195의 VHA CDR2 및 서열번호 196의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3R-C).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 142의 VLB CDR1, 서열번호 143의 VLB CDR2 및 서열번호 144의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 161의 VLB CDR1, 서열번호 162의 VLB CDR2 및 서열번호 163의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3R). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고, 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 180의 VLB CDR1, 서열번호 181의 VLB CDR2 및 서열번호 182의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3-C). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 199의 VLB CDR1, 서열번호 200의 VLB CDR2 및 서열번호 201의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3R-C).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 128의 VLA CDR1, 서열번호 129의 VLA CDR2 및 서열번호 130의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 132의 VHB CDR1, 서열번호 133의 VHB CDR2 및 서열번호 134의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 137의 VHA CDR1, 서열번호 138의 VHA CDR2 및 서열번호 139의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 142의 VLB CDR1, 서열번호 143의 VLB CDR2 및 서열번호 144의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 147의 VLA CDR1, 서열번호 148의 VLA CDR2 및 서열번호 149의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 151의 VHB CDR1, 서열번호 152의 VHB CDR2 및 서열번호 153의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 156의 VHA CDR1, 서열번호 157의 VHA CDR2 및 서열번호 158의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 161의 VLB CDR1, 서열번호 162의 VLB CDR2 및 서열번호 163의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3R).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 166의 VLA CDR1, 서열번호 167의 VLA CDR2 및 서열번호 168의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 170의 VHB CDR1, 서열번호 171의 VHB CDR2 및 서열번호 172의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 175의 VHA CDR1, 서열번호 176의 VHA CDR2 및 서열번호 177의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 180의 VLB CDR1, 서열번호 181의 VLB CDR2 및 서열번호 182의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3-C).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 166의 VLA CDR1, 서열번호 167의 VLA CDR2 및 서열번호 168의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 170의 VHB CDR1, 서열번호 171의 VHB CDR2 및 서열번호 172의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 175의 VHA CDR1, 서열번호 176의 VHA CDR2 및 서열번호 177의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 180의 VLB CDR1, 서열번호 181의 VLB CDR2 및 서열번호 182의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, NBS3R-C).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 서열번호 127의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 131의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 136의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 141의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, NBS3).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 서열번호 146의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 150의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 155의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 160의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, NBS3R).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 서열번호 165의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 169의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 174의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 179의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, NBS3-C).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 서열번호 184의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 188의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 193의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 198의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, NBS3R-C).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, NBS3).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, NBS3R).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, NBS3-C).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 192의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, NBS3R-C).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CTLA4 및 PD-1에 결합하고, 치환을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합할 수 있고, EGFR 항체 파니투무맙(panitumumab) 및 PD-L1 항체 1B12로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 PD-L1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 EGFR이고, 항원 B는 PD-L1이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 EGFR이고, 항원 A는 PD-L1이다. 일부 실시양태에서, EGFR 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고, PD-L1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 PD-L1이고, 항원 B는 EGFR이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 PD-L1이고, 항원 A는 EGFR이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고, 서열번호 99에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 100에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 101에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT012a의 에피토프와 동일한 EGFR의 에피토프 및 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT012a는 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, FIT012a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT012b의 에피토프와 동일한 EGFR의 에피토프 및 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT012b는 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 211의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, FIT012b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT012d의 에피토프와 동일한 EGFR의 에피토프 및 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT012d는 서열번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 230의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 235의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, FIT012d).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 204의 VLA CDR1, 서열번호 205의 VLA CDR2 및 서열번호 206의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT012b). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 223의 VLA CDR1, 서열번호 224의 VLA CDR2 및 서열번호 225의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT012d).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 208의 VHB CDR1, 서열번호 209의 VHB CDR2 및 서열번호 210의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT012b). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 227의 VHB CDR1, 서열번호 228의 VHB CDR2 및 서열번호 229의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT012d).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 213의 VHA CDR1, 서열번호 214의 VHA CDR2 및 서열번호 215의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT012b). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 232의 VHA CDR1, 서열번호 233의 VHA CDR2 및 서열번호 234의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT012d).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 218의 VLB CDR1, 서열번호 219의 VLB CDR2 및 서열번호 220의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT012b). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 237의 VLB CDR1, 서열번호 238의 VLB CDR2 및 서열번호 239의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT012d).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 VLA는 서열번호 204의 VLA CDR1, 서열번호 205의 VLA CDR2 및 서열번호 206의 VLA CDR3을 포함하고, VHB는 서열번호 208의 VHB CDR1, 서열번호 209의 VHB CDR2 및 서열번호 210의 VHB CDR3을 포함하고, VHA는 서열번호 213의 VHA CDR1, 서열번호 214의 VHA CDR2 및 서열번호 215의 VHA CDR3을 포함하고, VLB는 서열번호 218의 VLB CDR1, 서열번호 219의 VLB CDR2 및 서열번호 220의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT012b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 223의 VLA CDR1, 서열번호 224의 VLA CDR2 및 서열번호 225의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 227의 VHB CDR1, 서열번호 228의 VHB CDR2 및 서열번호 229의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 232의 VHA CDR1, 서열번호 233의 VHA CDR2 및 서열번호 234의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 237의 VLB CDR1, 서열번호 239의 VLB CDR2 및 서열번호 239의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT012d).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 서열번호 203의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 207의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 212의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 217의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, FIT012b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고 서열번호 222의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 226의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 231의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 236의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, FIT012d).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고, 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 211의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, FIT012b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고, 서열번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 230의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 235의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, FIT012d).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합할 수 있고 cMet 항체(h1332(13.3.2L-A91T,H-42K,S97T)) 및 EGFR 항체 파니투무맙으로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, cMet 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 EGFR 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 cMet이고, 항원 B는 EGFR이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 cMet이고, 항원 A는 EGFR이다. 일부 실시양태에서, cMet 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고 EGFR 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 EGFR이고, 항원 B는 cMet이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 EGFR이고, 항원 A는 cMet이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합하고, 서열번호 102에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 103에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 104에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT013a의 에피토프와 동일한 cMet의 에피토프 및 동일한 EGFR의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT013a는 서열번호 240의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 242의 VLA CDR1, 서열번호 243의 VLA CDR2 및 서열번호 244의 VLA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 246의 VHB CDR1, 서열번호 247의 VHB CDR2 및 서열번호 248의 VHB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 251의 VHA CDR1, 서열번호 252의 VHA CDR2 및 서열번호 253의 VHA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 256의 VLB CDR1, 서열번호 257의 VLB CDR2 및 서열번호 258의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 242의 VLA CDR1, 서열번호 243의 VLA CDR2 및 서열번호 244의 VLA CDR3을 포함하고, 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 246의 VHB CDR1, 서열번호 247의 VHB CDR2 및 서열번호 248의 VHB CDR3을 포함하고, 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 251의 VHA CDR1, 서열번호 252의 VHA CDR2 및 서열번호 253의 VHA CDR3을 포함하고, 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 256의 VLB CDR1, 서열번호 257의 VLB CDR2 및 서열번호 258의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합하고 서열번호 241의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 245의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 250의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 255의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합하고, 서열번호 240의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합할 수 있고 항-인자 IXa 항체로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄, 및 항-인자 X 항체로부터 유래한 가변 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인자 IXa 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 인자 X 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 인자 IXa이고, 항원 B는 인자 X이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 인자 IXa이고 항원 A는 인자 X이다. 일부 실시양태에서, 인자 IXa 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고 인자 X 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 인자 X이고, 항원 B는 인자 IXa이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 인자 X이고, 항원 A는 인자 IXa이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합하고, 서열번호 105에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 106에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 107에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT014a의 에피토프와 동일한 인자 IXa의 에피토프 및 동일한 인자 X의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT014a는 서열번호 259의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 268의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 261의 VLA CDR1, 서열번호 262의 VLA CDR2 및 서열번호 263의 VLA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 265의 VHB CDR1, 서열번호 266의 VHB CDR2 및 서열번호 267의 VHB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 270의 VHA CDR1, 서열번호 271의 VHA CDR2 및 서열번호 272의 VHA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 275의 VLB CDR1, 서열번호 276의 VLB CDR2 및 서열번호 277의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 261의 VLA CDR1, 서열번호 262의 VLA CDR2 및 서열번호 263의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 265의 VHB CDR1, 서열번호 266의 VHB CDR2 및 서열번호 267의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 270의 VHA CDR1, 서열번호 271의 VHA CDR2 및 서열번호 272의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 275의 VLB CDR1, 서열번호 276의 VLB CDR2 및 서열번호 277의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합하고 서열번호 260의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 264의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 269의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 274의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합하고, 서열번호 259의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 268의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합할 수 있고 Her3 항체 파트리투맙(patritumab) 및 IGF-1R 항체 피기투무맙(figitumumab)으로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, Her3 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 IGF-1R 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 Her3이고, 항원 B는 IGF-1R이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 Her3이고 항원 A는 IGF-1R이다. 일부 실시양태에서, Her3 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고 IGF-1R 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 IGF-1R이고, 항원 B는 Her3이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 IGF-1R이고, 항원 A는 Her3이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합하고, 서열번호 108에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 109에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 110에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT016a의 에피토프와 동일한 Her3의 에피토프 및 동일한 IGF-1R의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT016a는 서열번호 278의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 287의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 292의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 280의 VLA CDR1, 서열번호 281의 VLA CDR2 및 서열번호 282의 VLA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 284의 VHB CDR1, 서열번호 285의 VHB CDR2 및 서열번호 286의 VHB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 289의 VHA CDR1, 서열번호 290의 VHA CDR2 및 서열번호 291의 VHA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 294의 VLB CDR1, 서열번호 295의 VLB CDR2 및 서열번호 296의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 280의 VLA CDR1, 서열번호 281의 VLA CDR2 및 서열번호 282의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 284의 VHB CDR1, 서열번호 285의 VHB CDR2 및 서열번호 286의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 289의 VHA CDR1, 서열번호 290의 VHA CDR2 및 서열번호 291의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 294의 VLB CDR1, 서열번호 295의 VLB CDR2 및 서열번호 296의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합하고 서열번호 279의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 283의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 288의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 293의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합하고, 서열번호 278의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 287의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 292의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합할 수 있고 DLL-4 항체 뎀시주맙(demcizumab) 및 VEGF 항체 베비시주맙(bevicizumab)으로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, DLL-4 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 VEGF 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 DLL-4이고, 항원 B는 VEGF이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 DLL-4이고 항원 A는 VEGF이다. 일부 실시양태에서, DLL-4 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고 VEGF 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 VEGF이고, 항원 B는 DLL-4이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 VEGF이고, 항원 A는 DLL-4이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합하고, 서열번호 111에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 112에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 113에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT017a의 에피토프와 동일한 DLL-4의 에피토프 및 동일한 VEGF의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT017a는 서열번호 297의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 306의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 311의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 299의 VLA CDR1, 서열번호 300의 VLA CDR2 및 서열번호 301의 VLA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 303의 VHB CDR1, 서열번호 304의 VHB CDR2 및 서열번호 305의 VHB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 308의 VHA CDR1, 서열번호 309의 VHA CDR2 및 서열번호 310의 VHA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 313의 VLB CDR1, 서열번호 314의 VLB CDR2 및 서열번호 315의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 299의 VLA CDR1, 서열번호 300의 VLA CDR2 및 서열번호 301의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 303의 VHB CDR1, 서열번호 304의 VHB CDR2 및 서열번호 305의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 308의 VHA CDR1, 서열번호 309의 VHA CDR2 및 서열번호 310의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 313의 VLB CDR1, 서열번호 314의 VLB CDR2 및 서열번호 315의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합하고 서열번호 298의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 302의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 307의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 312의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합하고, 서열번호 297의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 306의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 311의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합할 수 있고, Her3 항체 파트리투맙 및 EGFR 항체 파니투무맙으로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, Her3 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 EGFR 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 Her3이고, 항원 B는 EGFR이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 Her3이고 항원 A는 EGFR이다. 일부 실시양태에서, Her3 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고 EGFR 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 EGFR이고, 항원 B는 Her3이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 EGFR이고, 항원 A는 Her3이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고, 서열번호 117에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 118에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 119에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT019a의 에피토프와 동일한 Her3의 에피토프 및 동일한 EGFR의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT019a는 서열번호 335의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 344의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 349의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT019b의 에피토프와 동일한 Her3의 에피토프 및 동일한 EGFR의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT019b는 서열번호 354의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 363의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 368의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 337의 VLA CDR1, 서열번호 338의 VLA CDR2 및 서열번호 339의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT019a). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 356의 VLA CDR1, 서열번호 357의 VLA CDR2 및 서열번호 358의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT019b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 341의 VHB CDR1, 서열번호 342의 VHB CDR2 및 서열번호 343의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT019a). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 360의 VHB CDR1, 서열번호 361의 VHB CDR2 및 서열번호 362의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT019b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 346의 VHA CDR1, 서열번호 347의 VHA CDR2 및 서열번호 348의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT019a). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 365의 VHA CDR1, 서열번호 366의 VHA CDR2 및 서열번호 367의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT019b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 351의 VLB CDR1, 서열번호 352의 VLB CDR2 및 서열번호 353의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT019a). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 370의 VLB CDR1, 서열번호 371의 VLB CDR2 및 서열번호 372의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT019b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 337의 VLA CDR1, 서열번호 338의 VLA CDR2 및 서열번호 339의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 341의 VHB CDR1, 서열번호 342의 VHB CDR2 및 서열번호 343의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 346의 VHA CDR1, 서열번호 347의 VHA CDR2 및 서열번호 348의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 351의 VLB CDR1, 서열번호 352의 VLB CDR2 및 서열번호 353의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT019a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 356의 VLA CDR1, 서열번호 357의 VLA CDR2 및 서열번호 358의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 360의 VHB CDR1, 서열번호 361의 VHB CDR2 및 서열번호 362의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 365의 VHA CDR1, 서열번호 366의 VHA CDR2 및 서열번호 367의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 370의 VLB CDR1, 서열번호 371의 VLB CDR2 및 서열번호 372의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT019b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 서열번호 336의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 340의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 345의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 350의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, FIT019a). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고 서열번호 355의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 359의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 364의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 369의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, FIT019b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고, 서열번호 335의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 344의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 349의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, FIT019a). 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고, 서열번호 354의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 363의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 368의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, FIT019b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합할 수 있고, PD-1 항체 니볼루맙 및 PD-L1 항체 1B12로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, PD-1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 PD-L1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 PD-1이고, 항원 B는 PD-L1이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 PD-1이고 항원 A는 PD-L1이다. 일부 실시양태에서, PD-1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고 PD-L1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 PD-L1이고, 항원 B는 PD-1이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 PD-L1이고, 항원 A는 PD-1이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고, 서열번호 120에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 121에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 122에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT020a의 에피토프와 동일한 PD-1의 에피토프 및 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT020a는 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT020b의 에피토프와 동일한 PD-1의 에피토프 및 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT020b는 서열번호 297의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 306의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 311의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 389의 VLA CDR1, 서열번호 390의 VLA CDR2 및 서열번호 391의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT020a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고 서열번호 375의 VLA CDR1, 서열번호 376의 VLA CDR2 및 서열번호 377의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT020b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 384의 VHB CDR1, 서열번호 385의 VHB CDR2 및 서열번호 386의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT020a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고 서열번호 379의 VHB CDR1, 서열번호 380의 VHB CDR2 및 서열번호 381의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT020b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 379의 VHA CDR1, 서열번호 380의 VHA CDR2 및 서열번호 381의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT020a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 384의 VHA CDR1, 서열번호 385의 VHA CDR2 및 서열번호 386의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT020b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 375의 VLB CDR1, 서열번호 376의 VLB CDR2 및 서열번호 377의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT020a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 389의 VLB CDR1, 서열번호 390의 VLB CDR2 및 서열번호 391의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT020b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 389의 VLA CDR1, 서열번호 390의 VLA CDR2 및 서열번호 391의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 384의 VHB CDR1, 서열번호 385의 VHB CDR2 및 서열번호 386의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 379의 VHA CDR1, 서열번호 380의 VHA CDR2 및 서열번호 381의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 375의 VLB CDR1, 서열번호 376의 VLB CDR2 및 서열번호 377의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT020a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 375의 VLA CDR1, 서열번호 376의 VLA CDR2 및 서열번호 377의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 379의 VHB CDR1, 서열번호 380의 VHB CDR2 및 서열번호 381의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 384의 VHA CDR1, 서열번호 385의 VHA CDR2 및 서열번호 386의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 389의 VLB CDR1, 서열번호 390의 VLB CDR2 및 서열번호 391의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT020b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고, 서열번호 388의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 383의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 378의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 374의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, FIT020a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고, 서열번호 374의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 378의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 383의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 388의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, FIT020b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고, 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, FIT020a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고, 서열번호 373의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 382의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 387의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, FIT020b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합할 수 있고, Her3 항체 파트리투맙 및 EGFR 항체 니볼루맙으로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, Her3 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 PD-1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 Her3고, 항원 B는 PD-1이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 Her3이고 항원 A는 PD-1이다. 일부 실시양태에서, Her3 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고 PD-1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 PD-1이고, 항원 B는 Her3이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 PD-1이고, 항원 A는 Her3이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합하고, 서열번호 123에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 124에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 125에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT022a의 에피토프와 동일한 Her3의 에피토프 및 동일한 PD-1의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT022a는 서열번호 411의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 420의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 425의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 413의 VLA CDR1, 서열번호 414의 VLA CDR2 및 서열번호 415의 VLA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 417의 VHB CDR1, 서열번호 418의 VHB CDR2 및 서열번호 419의 VHB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 422의 VHA CDR1, 서열번호 423의 VHA CDR2 및 서열번호 424의 VHA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 427의 VLB CDR1, 서열번호 428의 VLB CDR2 및 서열번호 429의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 413의 VLA CDR1, 서열번호 414의 VLA CDR2 및 서열번호 415의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 417의 VHB CDR1, 서열번호 418의 VHB CDR2 및 서열번호 419의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 422의 VHA CDR1, 서열번호 423의 VHA CDR2 및 서열번호 424의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 427의 VLB CDR1, 서열번호 428의 VLB CDR2 및 서열번호 429의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합하고 서열번호 412의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 416의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 421의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 426의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합하고, 서열번호 411의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 420의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 425의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합할 수 있고, cMet 항체 h1332 및 PD-L1 항체 1B12로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, cMet 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 PD-L1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 cMet이고, 항원 B는 PD-L1이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 cMet이고 항원 A는 PD-L1이다. 일부 실시양태에서, cMet 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고 PD-L1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 PD-L1이고, 항원 B는 cMet이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 PD-L1이고, 항원 A는 cMet이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT023a의 에피토프와 동일한 cMet의 에피토프 및 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT023a는 서열번호 430의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 439의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 444의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 432의 VLA CDR1, 서열번호 433의 VLA CDR2 및 서열번호 434의 VLA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 436의 VHB CDR1, 서열번호 437의 VHB CDR2 및 서열번호 438의 VHB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 441의 VHA CDR1, 서열번호 442의 VHA CDR2 및 서열번호 443의 VHA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 446의 VLB CDR1, 서열번호 447의 VLB CDR2 및 서열번호 448의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 432의 VLA CDR1, 서열번호 433의 VLA CDR2 및 서열번호 434의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 436의 VHB CDR1, 서열번호 437의 VHB CDR2 및 서열번호 438의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 441의 VHA CDR1, 서열번호 442의 VHA CDR2 및 서열번호 443의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 446의 VLB CDR1, 서열번호 447의 VLB CDR2 및 서열번호 448의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합하고 서열번호 431의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 435의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 440의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 445의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합하고, 서열번호 430의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 439의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 444의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합할 수 있고, BTLA 항체 6A5 및 PD-1 항체 니볼루맙으로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, BTLA 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 PD-1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 BTLA이고, 항원 B는 PD-1이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 BTLA이고 항원 A는 PD-1이다. 일부 실시양태에서, BTLA 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고 PD-1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 PD-1이고, 항원 B는 BTLA이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 PD-1이고, 항원 A는 BTLA이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT024a의 에피토프와 동일한 BTLA의 에피토프 및 동일한 PD-1의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT024a는 서열번호 449의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 458의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 463의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT024b의 에피토프와 동일한 BTLA의 에피토프 및 동일한 PD-1의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT024b는 서열번호 468의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 477의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 482의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 451의 VLA CDR1, 서열번호 452의 VLA CDR2 및 서열번호 453의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT024a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 470의 VLA CDR1, 서열번호 471의 VLA CDR2 및 서열번호 472의 VLA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT024b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고, 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 455의 VHB CDR1, 서열번호 456의 VHB CDR2 및 서열번호 457의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT024a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 474의 VHB CDR1, 서열번호 475의 VHB CDR2 및 서열번호 476의 VHB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT024b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 460의 VHA CDR1, 서열번호 461의 VHA CDR2 및 서열번호 462의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT024a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 479의 VHA CDR1, 서열번호 480의 VHA CDR2 및 서열번호 481의 VHA CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT024b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 465의 VLB CDR1, 서열번호 466의 VLB CDR2 및 서열번호 467의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT024a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 484의 VLB CDR1, 서열번호 485의 VLB CDR2 및 서열번호 486의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT024b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 451의 VLA CDR1, 서열번호 452의 VLA CDR2 및 서열번호 453의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 455의 VHB CDR1, 서열번호 456의 VHB CDR2 및 서열번호 457의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 460의 VHA CDR1, 서열번호 461의 VHA CDR2 및 서열번호 462의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 465의 VLB CDR1, 서열번호 466의 VLB CDR2 및 서열번호 467의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT024a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 470의 VLA CDR1, 서열번호 471의 VLA CDR2 및 서열번호 472의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 474의 VHB CDR1, 서열번호 475의 VHB CDR2 및 서열번호 476의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 479의 VHA CDR1, 서열번호 480의 VHA CDR2 및 서열번호 481의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 484의 VLB CDR1, 서열번호 485의 VLB CDR2 및 서열번호 486의 VLB CDR3을 포함한다(예를 들면, FIT024b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고 서열번호 450의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 454의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 459의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 464의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, FIT024a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고 서열번호 469의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 473의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 478의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 483의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다(예를 들면, FIT024b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고, 서열번호 449의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 458의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 463의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, FIT024a).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고, 서열번호 468의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 477의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 482의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다(예를 들면, FIT024b).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합할 수 있고, CD20 항체 오파투무맙 및 CD22 항체 에프라투주맙(Epratuzumab)으로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD20 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 CD22 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 CD20이고, 항원 B는 CD22이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 CD20이고 항원 A는 CD22이다. 일부 실시양태에서, CD20 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고 CD22 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 CD22이고, 항원 B는 CD20이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 CD22이고, 항원 A는 CD20이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질 FIT021b의 에피토프와 동일한 CD20의 에피토프 및 동일한 CD22의 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 이중특이적 결합 단백질 FIT021b는 서열번호 392의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 401의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 406의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 394의 VLA CDR1, 서열번호 395의 VLA CDR2 및 서열번호 396의 VLA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VHB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 398의 VHB CDR1, 서열번호 399의 VHB CDR2 및 서열번호 400의 VHB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합하고 제2 폴리펩타이드의 VHA를 포함하고, 이때 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 403의 VHA CDR1, 서열번호 404의 VHA CDR2 및 서열번호 405의 VHA CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합하고 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 408의 VLB CDR1, 서열번호 409의 VLB CDR2 및 서열번호 410의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합하고 제1 폴리펩타이드의 VLA 및 VHB, 제2 폴리펩타이드의 VHA 및 제3 폴리펩타이드의 VLB를 포함하고, 이때 제1 폴리펩타이드의 VLA는 서열번호 394의 VLA CDR1, 서열번호 395의 VLA CDR2 및 서열번호 396의 VLA CDR3을 포함하고; 제1 폴리펩타이드의 VHB는 서열번호 398의 VHB CDR1, 서열번호 399의 VHB CDR2 및 서열번호 400의 VHB CDR3을 포함하고; 제2 폴리펩타이드의 VHA는 서열번호 403의 VHA CDR1, 서열번호 404의 VHA CDR2 및 서열번호 405의 VHA CDR3을 포함하고; 제3 폴리펩타이드의 VLB는 서열번호 408의 VLB CDR1, 서열번호 409의 VLB CDR2 및 서열번호 410의 VLB CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합하고 서열번호 393의 서열을 가진 VLA 및 서열번호 397의 서열을 가진 VHB를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때 상기 결합 단백질은 서열번호 402의 서열을 가진 VHA를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 결합 단백질은 서열번호 407의 서열을 가진 VLB를 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합하고, 서열번호 392의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 서열번호 401의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 406의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나, 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 본질적으로 구성되거나 이러한 폴리펩타이드 쇄들로 구성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합하고, 치환(들)을 갖지 않는 상응하는 결합 단백질과 동등한 활성을 여전히 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 아미노산을 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 본원에 기재된 결합 단백질로부터 유도된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 PD-L1 및 TIM3에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, PD-L1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있고 TIM3 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 PD-L1이고, 항원 B는 TIM3이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 PD-L1이고 항원 A는 TIM3이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 하부 도메인 내에 있고 TIM3 항체로부터 유래한 폴리펩타이드는 상부 도메인 내에 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VLA-CL-VHB-CH1-Fc의 제1 폴리펩타이드, VHA-CH1의 제2 폴리펩타이드 및 VLB-CL의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 A는 TIM3이고, 항원 B는 PD-L1이다. 또 다른 예를 들면, 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 VHB-CH1-VLA-CL-Fc의 제1 폴리펩타이드, VLB-CL의 제2 폴리펩타이드 및 VHA-CH1의 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 항원 B는 TIM3이고, 항원 A는 PD-L1이다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 T 세포의 하나 이상의 면역 체크포인트 단백질, 예를 들면, TIM-3, Lag3, ICOS, BTLA, CD160, 2B4, KIR, CD137, CD27, OX40, CD40L 및 A2aR의 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 면역 체크포인트 경로에 관여하는 하나 이상의 종양 세포 표면 단백질, 예를 들면, PD-L1, PD-L2, Galectin9, HVEM, CD48, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CD70 및 CD40의 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 결합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본원은 청구항들 중 어느 한 항의 결합 단백질 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 염증성 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환, 암, 패혈증 또는 척수 손상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이 질환들을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 이 방법은 유효량의 본원에서 제공된 하나 이상의 결합 단백질, 또는 본원에서 제공된 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 하나 이상의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 염증성 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환, 암, 척수 손상 또는 다른 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에 있어서 본원에 기재된 결합 단백질의 용도도 본원에서 제공된다. 한 실시양태에서, 염증성 질환, 자가면역 질환, 암, 신경퇴행성 질환 및 다른 질환은 천식, 류마티스성 관절염, 전신 홍반 루푸스, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 감염성 질환 및 장애, 예컨대, 건선, 건선성 관절염, 피부염, 전신 경화증, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 결장염, 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체신염, 습진, 천식, 죽상동맥경화증, 백혈구 부착 결핍, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 소아 발병 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 면역 복합 신염, IgA 신병증, IgM 다발신경병증, 면역 관련 혈소판감소증, 예컨대, 급성 특발성 혈소판감소성 자반증 및 만성 특발성 혈소판감소성 자반증, 용혈성 빈혈, 중증 근무력증, 루푸스 신염, 아토피성 피부염, 천포창, 그레이브스 병, 중증 급성 호흡 곤란 증후군, 무도망막염, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵증, HIV, 헤르페스 바이러스 관련 질환, 1형 당뇨병, 이식물 대 숙주 질환(GVHD); 이식물 이식 거부와 관련된 면역 장애; T 세포 림프종, T 세포 급성 림프모구성 백혈병, 정소 혈관중심성 T 세포 림프종, 양성 림프구성 혈관염, 일차 점액수종, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 애디슨병, 인슐린 의존적 진성 당뇨병, 굿파스처 증후군, 교감성 안염, 특발성 혈소판감소증, 원발성 담즙성 경변증, 만성 작용 간염, 궤양성 결장염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 관절염, 다발근염, 피부경화증, 혼합된 결합 조직 질환, 심상성 천포창, 유사천포창, 강직성 척추염, 재생불량성 빈혈, 자가면역 간염, 셀리악병, 피부근염, 굿파스처 증후군, 길랑-바레 증후군, 특발성 백혈구감소증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 남성 불임, 수정체성 포도막염, 원발성 점액부종, 라이터 증후군, 강직 인간 증후군, 갑상선중독증, 궤양성 결장염, 유방암, 난소암, 폐암, 대장암, 항문암, 전립선암, 신장암, 방광암, 두경부암, 췌장암, 피부암, 구강암, 식도암, 질암, 자궁경부암, 비장암, 정소암, 흉선암, 편평세포암종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 모세포종, 육종, 폐의 선암종, 폐의 편평세포암종, 복막암종, 피부암, 피부 또는 눈내 흑색종, 직장암, 주위항문암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 남성/여성 생식관암, 신경암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 림프종, 간세포종, 위암, 교모세포종, 난소암, 간암, 간 종양, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 타액선암, 신장암, 음문암, 갑상선암, 임신성 당뇨병, 혈관 장애, 예컨대, 심정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 졸중, 종양 전이, 혈전용해, 동맥경화증 및 혈관성형술 후 재협착증을 포함하는, 피브린 형성과 관련된 만성 혈전색전증성 질환 또는 장애, 패혈증성 쇼크, 패혈증, 저혈압, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 파종성 혈관내 응고병증(DIC), 사르코이드증, 동맥 동맥경화증, 소화성 궤양, 화상, 췌장염, 다낭성 난소 질환(POD), 자궁내막증, 자궁 유섬유종, 양성 전립선 비대증, T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL), 피질하 경색을 가진 뇌 상동염색체 우성 동맥병증 및 백색질뇌병증(CADASIL), 팔롯 사징증(TOF), 알라질 증후군(AS), 황반 변성 및 연령 관련 황반 변성 질환, 염증성 섬유증(예를 들면, 피부경화증, 폐 섬유증 및 경변증), 골관절염, 골다공증, 천식(알레르기성 천식을 포함함), 알레르기, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 소아 초기 발병 I형 당뇨병, 이식 거부 및 SLE를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 개시는 류마티스성 관절염, 건선, 골다공증, 졸중, 간 질환 또는 구강암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이 질환들을 치료하거나 예방하는 방법으로서, IL-17 및 IL-20에 결합할 수 있는, 본원에 기재된 FIT-Ig 결합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, FIT-Ig 결합 단백질은 서열번호 15, 25 및 27로부터 선택된 아미노산 서열; 서열번호 21에 따른 아미노산 서열; 및 서열번호 23에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, FIT-Ig 결합 단백질은 서열번호 15, 25 및 27로부터 선택된 아미노산 서열; 및 서열번호 29, 30 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시는 B 세포 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 B 세포 암을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 하나 이상의 B 세포 항원에 결합할 수 있는 FIT-Ig 결합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, FIT-Ig 결합 단백질은 CD20에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, FIT-Ig 결합 단백질은 CD20 및 또 다른 항원에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 CD3 및 CD20에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 암은 B 세포 암이다. 추가 실시양태에서, B 세포 암은 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종[NHL], 전구체 B 세포 림프모구성 백혈병/림프종, 성숙 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병/소림프구성 림프종, B 세포 전구림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 여포성 림프종, 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 모발 세포 백혈병, 미만성 B 대세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질세포 골수종, 이식 후 림프증식성 장애, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 역형성 대세포 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 본 개시는 B 세포 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 B 세포 암을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 서열번호 41 또는 48에 따른 아미노산 서열; 서열번호 44에 따른 아미노산 서열; 및 서열번호 46에 따른 아미노산 서열을 포함하는 FIT-Ig 결합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시는 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이들 질환 또는 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로서, TNF 및 IL-17에 결합할 수 있는, 본원에 기재된 FIT-Ig 결합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, FIT-Ig 결합 단백질은 서열번호 87, 89 및 91에 따른 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시는 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, TNF 및 IL-17에 결합할 수 있는 FIT-Ig 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 자가면역 또는 염증성 질환은 크론병, 건선(플라크 건선을 포함함), 관절염(류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 골관절염 또는 소아 특발성 관절염을 포함함), 다발성 경화증, 강직성 척추염, 척추증 관절병증, 전신 홍반 루푸스, 포도막염, 패혈증, 신경퇴행성 질환, 신경 재생, 척수 손상, 원발성 암 및 전이성 암, 호흡 장애; 천식; 알레르기성 천식 및 비알레르기성 천식; 감염으로 인한 천식; 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 의한 감염으로 인한 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD); 기도 염증을 수반하는 질환; 호산구증가증; 섬유증 및 과도한 점액 생성; 낭성 섬유증; 폐 섬유증; 아토피성 장애; 아토피성 피부염; 두드러기; 습진; 알레르기성 비염; 알레르기성 위장염; 피부의 염증성 및/또는 자가면역 질환; 위장 장기의 염증성 및/또는 자가면역 질환; 염증성 장 질환(IBD); 궤양성 결장염; 간의 염증성 및/또는 자가면역 질환; 간 경변증; 간 섬유증; 및 간염 B 및/또는 C 바이러스에 의해 야기된 간 섬유증; 및 피부경화증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시는 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법으로서, TNF 및 IL-17에 결합할 수 있는, 본원에 기재된 FIT-Ig 결합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 암은 간세포암종; 교모세포종; 림프종; 또는 호지킨 림프종이다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시는 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 FIT-Ig 결합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 감염은 바이러스 감염, 세균 감염, 기생충 감염, HTLV-1 감염이다. 한 실시양태에서, 본 개시는 보호 1형 면역 반응의 발현을 억제하는 방법 및 백신접종 동안 보호 1형 면역 반응의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시는 류마티스성 관절염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 류마티스성 관절염을 치료하는 방법으로서, 서열번호 87, 89 및 91에 따른 서열을 포함하는 FIT-Ig 결합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시는 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법으로서, CTLA-4 및 PD-1에 결합할 수 있는 본원에 기재된 FIT-Ig 결합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, FIT-Ig 결합 단백질은 서열번호 92, 95 및 97을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시는 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 이때 결합 단백질은 CTLA-4 및 PD-1에 결합할 수 있고, 상기 암은 전형적으로 면역요법에 반응하는 암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 면역요법과 관련되어 있지 않은 암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 불응성 또는 재발성 악성종양인 암이다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 종양 세포의 성장 또는 생존을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 암은 흑색종(예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들면, 투명 세포 암종), 전립선암(예를 들면, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 췌장 선암종, 유방암, 결장암, 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암), 식도암, 두경부의 편평세포암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 교모세포종, 신경교종, 백혈병, 림프종 및 다른 신생물성 악성종양으로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 개시는 흑색종의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 흑색종을 치료하거나 예방하는 방법으로서, CTLA-4 및 PD-1에 결합할 수 있는, 본원에 기재된 FIT-Ig 결합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 개시는 흑색종의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 흑색종을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 서열번호 92, 95 및 97에 따른 아미노산 서열을 포함하는 FIT-Ig 결합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시는 감염 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 감염 또는 감염성 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, CTLA-4 및 PD-1에 결합할 수 있는, 본원에 기재된 FIT-Ig 결합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, FIT-Ig 결합 단백질은 병원체, 독소 및 자가-항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 단독으로 또는 백신과 함께 투여된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에서 제공된 결합 단백질은 인간을 감염시키는 바이러스, 예컨대, 인간 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스 클래스 A, B 및 C, 엡스테인 바 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 헤르페스 바이러스, 세균, 진균 기생충 또는 다른 병원체(그러나, 이들로 한정되지 않음)에 대한 면역 반응을 자극하는 데 사용될 수 있다.
도 1a는 3개의 구축물들로 구성된 FIT-Ig, 예컨대, FIT1-Ig, FIT2-Ig 및 FIT3-Ig의 구조를 보여준다. 도 1b는 이러한 FIT1-Ig를 제조하는 데 사용된 3개의 구축물들을 보여준다.
도 2a는 2개의 구축물들로 구성된 FIT-Ig의 기본 구조를 보여준다. 도 2b는 이러한 FIT-Ig를 제조하는 데 사용된 2개의 구축물들을 보여준다.
도 3은 비아코어(Biacore)에 의해 측정된 FIT1-Ig의 이중특이적 항원 결합을 제공한다. 도 3의 상부 패널은 FIT1-Ig가 IL-17에 의해 먼저 포화된 후 IL-20에 의해 포화된 비아코어 결합 어세이의 결과를 보여준다. 도 3의 하부 패널은 FIT1-Ig가 IL-20에 의해 먼저 포화된 후 IL-17에 의해 포화된 비아코어 어세이의 결과를 보여준다.
도 4는 PEG-유도된 침전에 의해 측정될 때, 항-IL-17/IL-20 FIT Ig 또는 단일클론 항체 리툭시맙(rituximab)의 pH 범위에서의 가용성을 보여준다.
도 5는 ELISA에 의해 평가되었을 때, FIT10-Ig 또는 모 항체 이필리무맙 및 니볼루맙에 의한 CTLA-4(도 5a) 또는 PD-1(도 5b)에의 결합을 보여준다.
도 6은 CTLA-4 및 PD-1 둘 다에 대한 FIT10-Ig의 다중 결합 연구를 보여준다. CTLA-4에 이은 PD-1에의 결합; 및 PD-1에 이은 CTLA-4에의 결합 둘 다가 도 6에 표시되어 있다.
도 7a 내지 7i는 FIT12a-Ig(EGFR/PD-L1; 도 7a), FIT13a-Ig(cMet/EGFR; 도 7b), FIT14-Ig(인자 IXa/인자 X; 도 7c), FIT16a-Ig(Her3/IGF-1R; 도 7d), FIT17a-Ig(DLL-4/VEGF; 도 7e), FIT18a-Ig(CD20/CD3; 도 7f), FIT19a-Ig(Her3/EGFR; 도 7g), FIT20a-Ig(PD-1/PD-L1; 도 7h) 및 FIT22a-Ig(Her3/PD-1; 도 7i)에 대한 SEC 프로파일을 보여준다.
도 8은 cMet 및 EGFR 둘 다에 대한 FIT13a-Ig의 다중 결합 연구를 보여준다.
도 9a 및 도 9b는 ELISA에 의해 평가되었을 때, NBSR 또는 모 항체 니볼루맙과 PD-1(도 9a) 또는 CTLA-4(도 9b)의 결합을 보여준다. 인간 IgG1이 대조군으로서 포함되었다.
도 10은 CTLA-4 및 PD-1 둘 다에 대한 NBS3의 다중 결합 연구를 보여준다. CTLA-4에 이은 PD-1에의 결합; 및 PD-1에 이은 CTLA-4에의 결합 둘 다가 표시되어 있다.
도 11a는 정맥내(IV) 또는 피하(SC)로 투여된 5 mg/kg NBS3의 평균 혈청 농도-시간 프로파일을 보여준다. 도 11b는 이 연구의 상세한 PK 파라미터를 제공한다.
도 12는 모 항체 니볼루맙에 비해 NBS3, NBS3-C, NBS3R-C의 세포-기반 수용체 결합 어세이를 보여준다. 인간 IgG4는 대조군으로서 포함되었다.
도 13a는 0, 0.01, 0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖의 농도에서 모 항체 니볼루맙과 비교할 때, MLR 어세이에서 NBS3, NBS3-C 및 NBS3R-C의 기능적 활성을 보여준다. 각각의 항체에 대해 IFN-γ의 도입을 측정하였다. 인간 IgG는 대조군으로서 포함되었다. 도 13b는 이들 항체들에 의한 IL-2의 유도를 보여준다.
도 14는 0.016. 0.08, 0.4, 2 또는 10 ㎍/㎖의 농도에서 모 항체 이필리무맙과 비교할 때 PBMC SEB 자극 어세이에서 NBS3, NBS3-C 및 NBS3R-C의 기능적 활성을 보여준다. 상청액에서의 IL-2 사이토카인 생성을 ELISA로 검출하였다.
도 15는 EGFR 및 PD-L1 둘 다에 대한 FIT012b의 다중 결합 연구를 보여준다. 인간 EGFR에 이은 인간 PD-L1에의 결합; 및 인간 PD-L1에 이은 인간 EGFR에의 결합 둘 다가 표시되어 있다.
도 16a 및 도 16b는 인간 EGFR 및 인간 PD-L1 둘 다에 대한 FIT012d의 다중 결합 연구를 보여준다. 인간 EGFR에 이은 인간 PD-L1에의 결합(도 16a); 및 인간 PD-L1에 이은 인간 EGFR에의 결합(도 16b) 둘 다가 표시되어 있다.
도 17는 cMet 및 EGFR 둘 다에 대한 FIT013a의 다중 결합 연구를 보여준다. cMet에 이은 EGFR에의 결합; 및 EGFR에 이은 cMet에의 결합 둘 다가 표시되어 있다.
도 18a 내지 도 18c는 막 c-Met 및 EGFR에 대한 FIT013a의 결합 활성이 시험된 FACS 어세이를 보여준다. 도 18a(우측 패널)는 BD FACSVerse 유세포분석기에 의해 측정될 때 MKN-45 세포에의 이중 결합을 보여준다. 도 18a(좌측 패널)는 MKN-45 세포에서 막 발현 수준 c-Met가 EGFR보다 훨씬 더 높으므로, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 c-Met 결합 부위가 막 c-Met에 의해 점유될 수 있고, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 유리 EGFR 결합 부위가 바이오티닐화된 EGFR에 의해 검출될 수 있다는 것을 시사한다. 도 18b(우측 패널)는 BD FACSVerse 유세포분석기에 의해 측정될 때 SGC-7901 세포에의 이중 결합을 보여준다. 도 18b(좌측 패널)는 SGC-7901 세포에서 막 발현 수준 EGFR이 c-Met보다 훨씬 더 높으므로, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 EGFR 결합 부위가 막 EGFR에 의해 점유될 수 있고, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 유리 c-Met 결합 부위가 바이오티닐화된 c-Met에 의해 검출될 수 있다는 것을 시사한다. 도 18c(우측 패널)는 BD FACSVerse 유세포분석기에 의해 측정될 때 NCI-H1975 세포에의 이중 결합을 보여준다. 도 18c(좌측 패널)는 NCI-H1975 세포에서 막 발현 수준 c-Met가 EGFR과 동등하므로, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 c-Met 및 EGFR 결합 부위가 동시적으로 점유되고, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 유리 EGFR 또는 c-Met 결합 부위가 검출될 수 없다는 것을 시사한다.
도 19는 NCI-H292 세포에서 HGF-유도된 AKT 인산화를 억제하는 FIT013a의 능력을 보여준다. FIT013a, h1332, 파니투무맙, h1332/파니투무맙의 조합물, 및 인간 IgG1을 세포에 첨가하고 30분 동안 항온처리한 후, 40 ng/㎖ HGF를 5분 동안 어세이 플레이트에 첨가하였다. 세포를 용해시켰고, AKT 인산화를 ERK 인-T202/Y204 키트로 검출하였다.
도 20은 AKT 인산화에 의해 측정될 때 HGF의 부재 하에서 FIT013a의 아고니스트 효과를 보여준다. 연속적으로 희석된 FIT013a 또는 다른 항체들(h1332, h1332/파니투무맙의 조합물, 에미베투주맙(emibetuzumab), 9.1.2, 및 인간 IgG1)을 세포에 첨가하고 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 용해시켰고 AKT 인산화를 ERK 인-T202/Y204 키트로 검출하였다.
도 21a는 5 mg/kg의 IV 용량을 수컷 SD 래트에게 투여한 후 FIT013a(c-met/EGFR)의 개별 혈청 농도-시간 프로파일을 보여준다(N=4/시점, c-met 플레이트). 도 21b는 5 mg/kg의 SC 용량을 수컷 SD 래트에게 투여한 후 FIT013a(c-met/EGFR)의 개별 혈청 농도-시간 프로파일을 보여준다(N=4/시점, c-met 플레이트). 도 21c는 5 mg/kg의 IV 용량을 수컷 SD 래트에게 투여한 후 FIT013a(c-Met/EGFR)의 개별 혈청 농도-시간 프로파일을 보여준다(N=4/시점, EGFR 플레이트). 도 21d는 5 mg/kg의 SC 용량을 수컷 SD 래트에게 투여한 후 FIT013a(c-met/EGFR)의 개별 혈청 농도-시간 프로파일을 보여준다(N=4/시점, EGFR 플레이트).
도 22는 NCI-H1975-HGF 종양 세포로 접종된 누드 BALB/c 마우스(N=3 동물/군)의 혈청 및 종양에서 FIT013a, 파니투무맙 및 H1332의 분포를 보여준다.
도 23은 NCI-H1975-HGF 종양 세포로 접종된 누드 BALB/c 마우스(N=8 동물/군)에서 종양 크기를 억제하는 데 있어서 FIT013a, 파니투무맙, H1332, 비히클의 효능을 보여준다. 항체를 3주 동안 주마다 2회 복강내로 투약하였다. FIT013a에 대한 투약은 16 mg/kg이었고, H1332 또는 파니투무맙에 대한 투약은 10 mg/kg이었다.
도 24는 BIOPHEN FVIII:C 키트(하이펜-바이오메드(Hyphen-Biomed))를 사용한 인자 VIIIa 유사 활성에 대한 효소 어세이를 보여준다. mAb FIX, mAb FX, mAb FIX와 mAb FX의 조합물, 에미시주맙(Emicizumab), FIT014a, 및 정제된 FVIIIa를 함유하는 샘플을 분석하였다.
도 25는 FIX 및 FX 둘 다에 대한 FIT014a의 다중 결합 연구를 보여준다. FIX에 이은 FX에의 결합; 및 FX에 이은 FIX에의 결합 둘 다가 표시되어 있다.
도 26은 hIgG 플레이트 또는 인자 X 플레이트에서 정맥내(IV) 또는 피하(SC)로 투여된 5 mg/kg FIT014a의 평균 혈청 농도-시간 프로파일을 보여준다. 62.5 ng/㎖의 LLOQ를 이용하여 ELISA로 래트 혈청 샘플에서 항체 농도를 검출하였다. hIgG 플레이트에서, 코팅 단백질은 항-hIgG Fc이고, 검출 항체는 항-hIgG Fab이다. 인자 X 플레이트에서, 코팅 단백질은 인자 X인 반면, 검출 항체는 항-인간-IgG Fc이다.
도 27은 Her3 및 IGF1R 둘 다에 대한 FIT016a의 다중 결합 연구를 보여준다. Her3에 이은 IGF1R에의 결합; 및 IGF1R에 이은 Her3에의 결합 둘 다가 표시되어 있다.
도 28은 DLL4 및 VEGF 둘 다에 대한 FIT017a의 다중 결합 연구를 보여준다. DLL4에 이은 VEGF에의 결합; 및 VEGF에 이은 DLL4에의 결합 둘 다가 표시되어 있다.
도 29a 및 도 29b는 인간 B 세포 및 인간 T 세포의 CD20 및 CD3에 결합하는 능력에 대한 FIT018a의 세포 기반 FACS 결합 어세이를 그의 관련 모 항체(CD3 mAb, 오파투무맙, 및 CD3 mAb와 오파투무맙의 조합물) 및 인간 IgG1과 비교하여 보여준다. 도 29a의 어세이에서, 인간 B 세포주 Raji를 사용하였다. 도 29b의 어세이에서, 인간 T 세포주 Jurkat를 사용하였다.
도 30a는 사이노몰구스 CD20 세포에 결합하는 능력에 대한 FIT018a의 세포 기반 FACS 결합 어세이를 오파투무맙(CD20) 및 항-RAC-인간 IgG1과 비교하여 보여준다. 도 30b는 사이노몰구스 T 세포에 결합하는 능력에 대한 FIT018a의 세포 기반 FACS 결합 어세이를 오파투무맙(CD20) 및 CD3 mAb와 비교하여 보여준다.
도 31a 및 31b는 B 세포 고갈 어세이에서 측정되었을 때 2일째 날(도 31a) 및 3일째 날(도 31b) 인간 B 세포(Raji)의 아폽토시스를 유도하는 데 있어서 FIT018a, 오파투무맙, CD3 mAb, 및 오파투무맙과 CD3 mAb의 조합물(1:1)의 능력을 보여준다.
도 32는 Her3 및 EGFR 둘 다에 대한 FIT019a의 다중 결합 연구를 보여준다. Her3에 이은 EGFR에의 결합, 및 EGFR에 이은 Her3에의 결합 둘 다가 표시되어 있다.
도 33a 및 도 33b는 Her3 및 hEGFR 둘 다에 대한 FIT019b의 다중 결합 연구를 보여준다. EGFR에 이은 Her3에의 결합(도 33a); 및 Her3에 이은 EGFR에의 결합(도 33b) 둘 다가 표시되어 있다.
도 34a는 유도된 IL-2의 수준에 의해 측정될 때 0, 0.01, 0.1, 1, 10 또는 100 nM의 농도에서 모 항체 니볼루맙, 1B12, 및 니볼루맙과 1B12의 조합물(1:1)과 비교되었을 때 MLR 어세이에서 FIT020b의 기능적 활성을 보여준다. 도 34b는 0, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 및 100 nM의 농도에서 이 항체들에 의한 IL-2의 유도를 보여준다.
도 35는 PD-L1 및 PD-1 둘 다에 대한 FIT020b의 다중 결합 연구를 보여준다. PD-L1에 이은 PD-1에의 결합; 및 PD-1에 이은 PD-L1에의 결합 둘 다가 표시되어 있다.
도 36a 및 도 36b는 인간 B 세포에 결합하는 능력에 대한 FIT021b의 세포 기반 FACS 결합 어세이를 그의 관련된 모 항체(오파투무맙, 에프라투주맙, 및 오파투무맙과 에프라투주맙의 조합물(1:1))와 비교하여 보여준다. 도 36a의 어세이에서, 인간 B 세포주 Raji를 사용하였다. 도 36b의 어세이에서, 인간 B 세포주 Daudi를 사용하였다.
도 37은 Her3 및 인간 PD-1 둘 다에 대한 FIT022a의 다중 결합 연구를 보여준다. Her3에 이은 인간 PD-1에의 결합; 및 인간 PD-1에 이은 Her3에의 결합 둘 다가 표시되어 있다.
도 38a는 0, 0.01, 0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖의 농도에서 모 항체 니볼루맙 및 파트리투맙과 비교되었을 때 MLR 어세이에서 FIT022a의 기능적 활성을 보여준다. 각각의 항체에 대해 LI-2의 유도를 측정하였다. 인간 IgG1 및 인간 IgG4는 대조군으로서 포함되었다. 도 38b는 이 항체들에 의한 IFN-γ의 유도를 보여준다.
도 39a 및 도 39b는 cMet-his 및 PD-L1-his 둘 다에 대한 FIT023a의 다중 결합 연구를 보여준다. cMet-his에 이은 PD-L1-his에의 결합(도 39a); 및 PD-L1-his에 이은 cMet-his에의 결합(도 39b) 둘 다가 표시되어 있다.
도 40a 및 도 40b는 BTLA-his 및 PD1-his 둘 다에 대한 FIT024a의 다중 결합 연구를 보여준다. BTLA-his에 이은 PD1-his에의 결합(도 40a); 및 PD1-his에 이은 BTLA-his에의 결합(도 40b) 둘 다가 표시되어 있다.
도 41a 및 41b는 BTLA-his 및 PD1-his 둘 다에 대한 FIT024b의 다중 결합 연구를 보여준다. BT:A-his에 이은 PD1-his에의 결합(도 41a); 및 PD1-his에 이은 BTLA-his에의 결합(도 41b) 둘 다가 표시되어 있다.
도 42a는 유도된 IL-2의 수준에 의해 측정될 때 0, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 또는 100 nM의 농도에서 모 항체 니볼루맙과 비교되었을 때 MLR 어세이에서 FIT024a 및 FIT024b의 기능적 활성을 보여준다. 인간 IgG1은 대조군으로서 포함되었다. 도 42b는 0, 0.01, 0.1, 1, 10 또는 100의 농도에서 이 항체들에 의한 IL-2의 유도를 보여준다.
본 발명은 다가 및 다중특이적 결합 단백질, 이 결합 단백질을 제조하는 방법, 및 급성 및 만성 염증성 질환 및 장애, 암 및 다른 질환의 예방 및/또는 치료에 있어서 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 2개 이상의 항원들에 결합할 수 있는 다가 및/또는 다중특이적 결합 단백질에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig) 및 이의 약학 조성물뿐만 아니라, 이러한 FIT-Ig를 제조하기 위한 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 시험관내에서 또는 생체내에서 특정 항원을 검출하기 위해 본 발명의 FIT-Ig를 사용하는 방법도 본 발명에 포함된다.
본원에서 제공된 신규 과의 결합 단백질들은 예를 들면, 높은 친화성으로 2개 이상의 항원들에 결합할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 2개의 모 단일클론 항체들, 즉 항원 a에 결합하는 mAb A, 및 항원 b에 결합하는 mAb B를 사용하여 이중특이적 결합 단백질을 구축하는 방법을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 제1 항원 또는 에피토프에 특이적인 가변 경쇄, 제1 경쇄 불변 도메인, 제2 항원 또는 에피토프에 특이적인 가변 중쇄, 제1 중쇄 CH1, 제1 항원 또는 에피토프에 특이적인 가변 중쇄, 제2 중쇄 CH1, 제2 항원 또는 에피토프에 특이적인 가변 중쇄, 및 제2 경쇄 불변 도메인을 포함하는 결합 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 결합 단백질은 Fc 영역을 추가로 포함한다. 결합 단백질은 결합 단백질의 성분들 중 2개 이상의 성분들을 연결하는 하나 이상의 아미노산 또는 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 결합 단백질은 경쇄 가변 영역을 경쇄 불변 영역에 연결하는 폴리펩타이드 링커를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시는 VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)n를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질을 제공하고, 이때 VLA는 mAb A의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, X1은 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커를 나타내고, VHB는 mAb B의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, X2는 Fc 영역 또는 상이한 이량체화 도메인을 나타내고, n은 0 또는 1이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 3개의 상이한 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 결합 단백질을 제공하고(도 1), 이때 제1 폴리펩타이드 쇄(구축물 #1)는 VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)n을 포함하고, 이때 VLA는 mAb A의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, X1은 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커를 나타내고, VHB는 mAb B의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, X2는 Fc 영역 또는 상이한 이량체화 도메인을 나타내고, n은 0 또는 1이다. 제2 폴리펩타이드 쇄(구축물 #2)는 VHA-CH1을 포함하고, 이때 VHA는 mAb A의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이다. 제3 폴리펩타이드 쇄(구축물 #3)는 VLB-CL을 포함하고, 이때 VLB는 mAb B의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄의 불변 도메인이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 가변 도메인들의 순서가 역전되어 있다는 점을 제외하고 이전 실시양태와 유사한 전체 분자 디자인을 가진 3개의 상이한 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 결합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 VHB-CH1-(X1)n-VLA-CL-(X2)n을 포함하고, 이때 VLA는 mAb A의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, X1은 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커를 나타내고, VHB는 mAb B의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, X2는 Fc 영역 또는 상이한 이량체화 도메인을 나타내고, n은 0 또는 1이다. 제2 폴리펩타이드 쇄는 VHA-CH1을 포함하고, 이때 VHA는 mAb A의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이다. 제3 폴리펩타이드 쇄는 VLB-CL을 포함하고, 이때 VLB는 mAb B의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄의 불변 도메인이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 2개의 상이한 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 결합 단백질을 제공하고(도 2), 이때 제1 폴리펩타이드 쇄(구축물 #1)는 VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)n을 포함하고, 이때 VLA는 mAb A의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, X1은 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커를 나타내고, VHB는 mAb B의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, X2는 Fc 영역 또는 상이한 이량체화 도메인을 나타내고, n은 0 또는 1이다. 제2 폴리펩타이드 쇄(구축물 #4)는 VHA-CH1-(X3)n-VLB-CL을 포함하고, 이때 VHA는 mAb A의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, X3은 불변 도메인이 아닌 아미노산 또는 폴리펩타이드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. VLB는 mAb B의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄의 불변 도메인이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 가변 도메인들의 순서가 역전되어 있다는 점을 제외하고 이전 실시양태와 유사한 전체 분자 디자인을 가진 2개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 결합 단백질을 제공한다. 이 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 VHB-CH1-(X1)n-VLA-CL-(X2)n을 포함하고, 이때 VLA는 mAb A의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, X1은 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커를 나타내고, VHB는 mAb B의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, X2는 Fc 영역 또는 상이한 이량체화 도메인을 나타내고, n은 0 또는 1이다. 제2 폴리펩타이드 쇄는 VLB-CL-(X3)n-VHA-CH1을 포함하고, 이때 VHA는 mAb A의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄의 제1 불변 도메인이고, X3은 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커를 나타내고, n은 0 또는 1이고, VLB는 mAb B의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄의 불변 도메인이다.
한 실시양태에서, 결합 단백질에서 VH 및 VL 도메인은 뮤린 중쇄/경쇄 가변 도메인, 전체 인간 중쇄/경쇄 가변 도메인, CDR 이식된 중쇄/경쇄 가변 도메인, 인간화된 중쇄/경쇄 가변 도메인, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, VHA/VLA 및 VHB/VLB는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, VHA/VLA 및 VHB/VLB는 상이한 항원에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 VLA-CL-VHB-CH1-Fc를 포함하고, 제1 폴리펩타이드 쇄의 CL과 VHB는 함께 직접적으로 융합된다. 또 다른 실시양태에서, CL과 VHB는 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커에 의해 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 VHB-CH1-VLA-CL-Fc를 포함하고, CH1과 VLA는 함께 직접적으로 융합된다. 또 다른 실시양태에서, CH1과 VLA는 아미노산 또는 올리고펩타이드 링커에 의해 연결된다. 추가 실시양태에서, 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커는 유연성을 제공하는 임의의 합리적인 서열의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 링커는 G, GS, SG, GGS, GSG, SGG, GGG, GGGS(서열번호 489), SGGG(서열번호 490), GGGGS(서열번호 491), GGGGSGS(서열번호 492), GGGGSGGS(서열번호 493), GGGGSGGGGS(서열번호 494), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 495), AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 496), AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 497), AKTTPKLGG(서열번호 498), SAKTTPKLGG(서열번호 499), SAKTTP(서열번호 500), RADAAP(서열번호 501), RADAAPTVS(서열번호 502), RADAAAAGGPGS(서열번호 503), RADAAAA(G4S)4(서열번호 504), SAKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 505), ADAAP(서열번호 506), ADAAPTVSIFPP(서열번호 507), TVAAP(서열번호 508), TVAAPSVFIFPP(서열번호 509), QPKAAP(서열번호 510), QPKAAPSVTLFPP(서열번호 511), AKTTPP(서열번호 512), AKTTPPSVTPLAP(서열번호 513), AKTTAPSVYPLAP(서열번호 514), ASTKGP(서열번호 515), ASTKGPSVFPLAP(서열번호 516), GENKVEYAPALMALS(서열번호 517), GPAKELTPLKEAKVS(서열번호 518), GHEAAAVMQVQYPAS(서열번호 519) 및 AKTTAP(서열번호 80)로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 링커의 아미노산 서열은 서열번호 26, 28, 및 49 내지 86으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 링커는 GSG(서열번호 26) 또는 GGGGSGS(서열번호 28)이다. 링커는 이전에 기재된 바와 같이(Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals: Applications and Challenges, edited by Stefan R. Schmidt) 생체내 절단가능한 펩타이드 링커, 프로테아제(예컨대, MMP) 민감성 링커, 환원에 의해 절단될 수 있는 디설파이드 결합-기반 링커 등, 또는 당분야에서 공지되어 있는 임의의 절단가능한 링커일 수도 있다. 이러한 절단가능한 링커는 조직/세포 침투 및 분포를 개선하고, 표적에의 결합을 향상시키고, 잠재적인 부작용을 감소시키고 2개의 상이한 Fab 영역들의 생체내 기능적 및 물리적 반감기를 조절하기 위해 다양한 목적으로 생체내에서 상부 Fab를 방출시키는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 단백질은 Fc 영역을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 인간 IgG1 Fc 영역을 함유하는 아미노산 서열의 일례는 서열번호 20이다. IgG의 Fc 영역은 2개의 불변 도메인인 CH2 및 CH3을 포함한다.
한 실시양태에서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역이다. 한 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 변형, 예컨대, 치환, 결실 또는 삽입을 가진다. 추가 실시양태에서, Fc 영역의 아미노산 변형은 모 Fc 영역 활성에 비해 이펙터 기능 활성을 변경시킨다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 변경된(즉, 증가되거나 감소된) 항체 의존적 세포독성(ADCC), 보체-매개된 세포독성(CDC), 식세포작용, 옵소닌화(opsonization) 또는 세포 결합을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역의 아미노산 변형은 모 Fc 영역에 비해 FcγR에 대한 변이체 Fc 영역의 친화성을 변경시킬 수 있다(즉, 증가시키거나 감소시킬 수 있다). 예를 들면, 변이체 Fc 영역은 FcγRI, FcγRII, FcγRIII에 대한 친화성을 변경시킬 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본원에서 제공된 결합 단백질은 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적은 사이토카인, 세포 표면 단백질, 효소 및 수용체로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 결합 단백질은 하나 이상의 표적의 생물학적 기능을 조절할 수 있다. 보다 바람직하게는, 결합 단백질은 하나 이상의 표적을 중화시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 림포카인, 모노카인 및 폴리펩타이드 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 IL-1α 및 IL-1β; IL-12 및 IL-18; TNFα 및 IL-23; TNFα 및 IL-13; TNF 및 IL-18; TNF 및 IL-12; TNF 및 IL-1베타; TNF 및 MIF; TNF 및 IL-6; TNF 및 IL-6 수용체; TNF 및 IL-17; IL-17 및 IL-20; IL-17 및 IL-23; TNF 및 IL-15; TNF 및 VEGF; VEGFR 및 EGFR; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-13 및 IL-25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MIF; IL-13 및 TGF-β; IL-13 및 LHR 아고니스트; IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAM8; TNFα 및 PGE4; IL-13 및 PED2; 및 TNF 및 PEG2로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인 쌍에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD137 및 CD20; CD137 및EGFR; CD137 및 Her-2; CD137 및 PD-1; CD137 및 PDL-1; VEGF 및 PD-L1; Lag-3 및 TIM-3; OX40 및 PD-1; TIM-3 및 PD-1; TIM-3 및 PDL-1; EGFR 및 DLL-4; VEGF 및 EGFR; HGF 및 VEGF; VEGF 및 VEGF(동일하거나 상이한 에피토프); VEGF 및 Ang2; EGFR 및 cMet; PDGF 및 VEGF; VEGF 및 DLL-4; OX40 및 PD-L1; ICOS 및 PD-1; ICOS 및 PD-L1; Lag-3 및 PD-1; Lag-3 및 PD-L1; Lag-3 및 CTLA-4; ICOS 및 CTLA-4; CD138 및 CD20; CD138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD3 및 CD33; CD3 및 CD133; CD38 및 CD138; CD38 및 CD20; CD20 및 CD22; CD38 및 CD40; CD40 및 CD20; CD47 및 CD20; CD-8 및 IL-6; CSPGs 및 RGM A; CTLA-4 및 BTNO2; CTLA-4 및 PD-1; IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; IGF-1R 및 EGFR; EGFR 및 CD13; IGF-1R 및 ErbB3; EGFR-2 및 IGFR; Her2 및 Her2(동일하거나 상이한 에피토프); 인자 IXa 및 인자 X; VEGFR-2 및 Met; VEGF-A 및 안지오포이에틴-2(Ang-2); IL-12 및 TWEAK; IL-13 및 IL-1베타; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; PDL-1 및 CTLA-4; PD-1 및 CTLA-4; PD-1 및 TIM-3; RGM A 및 RGM B; Te38 및 TNFα; TNFα 및 Blys; TNFα 및 CD-22; TNFα 및 CTLA-4 도메인; TNFα 및 GP130; TNFα 및 IL-12p40; TNFα 및 RANK 리간드; EGFR 및 PD-L1; EGFR 및 cMet; Her3 및 IGF-IR; DLL-4 및 VEGF; PD-1 및 PD-L1; Her3 및 PD-1; Her3 및 EGFR; cMet 및 PD-L1; 및 BTLA 및 PD-1로 구성된 군으로부터 선택된 표적 쌍에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 오파투무맙, 리툭시맙, 요오드 i 131 토시투모맙(tositumomab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 및 미국 특허 제9228008호, 제8206711호, 제7682612호, 제8562992호, 제7799900호, 제7422739호, 제7850962호, 제8097713호, 제8057793호, 제8592156호, 제6652852호, 제6893625호, 제6120767호, 제8084582호, 제8778339호, 제9184781호, 제7381560호, 제8101179호, 제9382327호, 제7151164호, 제7435803호, 제8529902호, 제9416187호, 제7812116호, 제8329181호, 제8034902호, 제9289479호, 제9234045호, 제4987084호, 제9173961호, 제9175086호 및 제6410319호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 CD20 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 CD20 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 뮤로모납(muromonab)-CD3, 오텔릭시주맙(otelixizumab), 테플리주맙(teplizumab) 및 비질리주맙(visilizumab), 및 미국 특허 제8569450호, 제7635472호, 제5585097호, 제6706265호, 제5834597호, 제9056906호, 제9486475호, 제7728114호, 제8551478호, 제9226962호, 제9192665호, 제9505849호, 제8394926호, 제6306575호, 제5795727호, 제8840888호, 제5627040호, 제9249217호, 제8663634호, 제6491917호 및 제5877299호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 CD3 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 CD3 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 이필리무맙, 및 미국 특허 제5434131호, 제5968510호, 제5844095호, 제7572772호, 제6090914호, 제7311910호, 제5885796호, 제5885579호, 제5770197호, 제5851795호, 제5977318호, 제7161058호, 제6875904호, 제7504554호, 제7034121호, 제6719972호 및 제7592007호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 CTLA-4 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 CTLA-4 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙, 아테졸리주맙(atezolizumab), 및 미국 특허 제8741295호, 제7029674호, 제7722868호, 제9243052호, 제8927697호, 제9181342호, 제8552154호, 제9102727호, 제9220776호, 제9084776호, 제8008449호, 제9387247호, 제9492540호, 제8779105호, 제9358289호, 제9492539호, 제9205148호, 제8900587호, 제8952136호, 제8460886호, 제7414171호, 제8287856호, 제8580247호, 제7488802호, 제7521051호, 제8088905호, 제7709214호, 제8617546호, 제9381244호, 제8993731호, 제8574872호, 제7432059호, 제8216996호, 제9499603호, 제9102728호 및 제9212224호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 PD-1 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 PD-1 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 듀르발루맙(durvalumab), 아벨루맙(avelumab), 및 미국 특허 제8741295호, 제9102725호, 제8168179호, 제8952136호, 제8552154호, 제8617546호, 제9212224호, 제8217149호 및 제8383796호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 PD-L1 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 PD-L1 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 라파티닙(lapatinib), 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙, 반데타닙(vandetanib), 네시투무맙(necitumumab), 오시메르티닙(osimertinib), 및 미국 특허 제7723484호, 제9044460호, 제9226964호, 제8658175호, 제7618631호, 제8748175호, 제9499622호, 제9527913호, 제9493568호, 제8580263호, 제7514240호, 제9314536호, 제9051370호, 제9233171호, 제9029513호, 제8592152호, 제8597652호, 제9327035호, 제8628773호, 제9023356호, 제9132192호, 제8637026호, 제9283276호, 제9540440호, 제9545442호, 제8758756호, 제9120853호, 제7981605호, 제8546107호, 제7598350호, 제5212290호, 제8017321호, 제7589180호, 제9260524호, 제8790649호, 제9125896호, 제9238690호 및 제8071093호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 EGFR 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 EGFR 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 4C4G3, 7D3, B8.2C12, F38-2E2, 및 미국 특허 제8841418호, 제8552156호 및 제9556270호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 TIM3(CD366) 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 TIM3(CD366) 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 h1332, 71-8000, ab74217, 및 미국 특허 제8673302호, 제9120852호, 제7476724호, 제7892550호, 제9249221호, 제9535055호, 제9487589호, 제8329173호, 제9101610호, 제8101727호, 제9068011호, 제9260531호, 제9296817호, 제8481689호, 제8546544호, 제8563696호, 제8871909호, 제8889832호, 제8871910호, 제9107907호, 제8747850호, 제9469691호, 제8765128호, 제8729249호, 제8741290호, 제8637027호, 제8900582호, 제9192666호, 제9201074호, 제9505843호, 제8821869호, 제8163280호, 제7498420호, 제8562985호, 제8545839호, 제9213031호, 제9213032호, 제8217148호, 제8398974호, 제9394367호, 제9364556호, 제8623359호, 제9011865호, 제9375425호, 제9233155호, 제9169329호 및 제9150655호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 cMet 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 cMet 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 ab97619, ab128048, ab128038, 및 미국 특허 제7279161호, 제7033590호, 제4786726호, 제6624295호, 제7049411호 및 제7297336호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 인자 IXa 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 인자 IXa 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 PA5-22059, ab97632 및 B122M을 포함하나 이들로 한정되지 않는 인자 X 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 둘리고투맙(duligotumab), 엘겜투맙(elgemtumab), 룸레투주맙(lumretuzumab), 파트리투맙, 세리반투맙(seribantumab), 및 미국 특허 제9346883호, 제9321839호, 제8859737호, 제8362215호, 제8828388호, 제9220775호, 제9217039호, 제9527913호, 제9085622호, 제9192663호, 제8735551호, 제9011851호, 제7846440호, 제9284380호, 제8791244호, 제8691225호, 제9487588호, 제8961966호, 제9034328호, 제5968511호, 제9346889호, 제9217039호 및 제9346890호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 Her3(ErbB3) 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 Her3(ErbB3) 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 식수투무맙(cixutumumab), 달로투주맙(dalotuzumab), 피기투무맙, 가니투맙(ganitumab), 로바투무맙(robatumumab), 테프로투무맙(teprotumumab), 및 미국 특허 제7572897호, 제7579157호, 제7968093호, 제7638605호, 제7329745호, 제7037498호, 제7982024호, 제8642037호, 제7700742호, 제9234041호, 제7815907호, 제8945871호, 제8361461호, 제9056907호, 제8168410호, 제7241444호, 제7914784호, 제9150644호, 제7985842호, 제7538195호, 제8268617호, 제8034904호, 제8344112호, 제7553485호, 제8101180호, 제8105598호, 제7824681호, 제8124079호, 제8420085호 및 제7854930호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 IGF-1R(CD221) 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 IGF-1R(CD221) 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 뎀시주맙, 에노티쿠맙(enoticumab), 나비식시주맙(navicixizumab), 및 미국 특허 제9469689호, 제9115195호, 제8623358호, 제9132190호, 제9469688호, 제9403904호, 제8663636호, 제8192738호 및 제750124호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 DLL4 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 DLL4 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 베바시주맙(Bevacizumab), 브롤루시주맙(Brolucizumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 및 미국 특허 제8921537호, 제7910098호, 제7365166호, 제7060269호, 제7169901호, 제6884879호, 제7297334호, 제7375193호, 제9388239호, 제8834883호, 제8287873호, 제7998931호, 제8007799호, 제7785803호, 제9102720호, 제8486397호, 제6730489호, 제6383484호, 제9441034호, 제7097986호, 제9079953호, 제8945552호, 제8236312호, 제7740844호, 제6403088호, 제9018357호, 제8975381호, 제7691977호, 제7758859호, 제8512699호, 제8492527호, 제9353177호, 제8092797호, 제7811785호, 제8101177호, 제8592563호, 제9090684호 및 제8349322호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 VEGF 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 VEGF 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 벡투모맙(bectumomab), 에프라투주맙, 이노투주맙(inotuzumab), 목세투모맙(moxetumomab), 피나투주맙(pinatuzumab), 및 미국 특허 제9181343호, 제5484892호, 제9279019호, 제8591889호, 제9499632호, 제8481683호, 제7355012호, 제7777019호, 제8809502호, 제8389688호 및 제7829086호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 CD22 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 CD22 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 MIH26, AAP44003, MA5-16843, 6A5, 및 미국 특허 제8563694호, 제9346882호, 제8580259호 및 제8247537호(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨)에 기재된 BTLA(CD272) 항체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 BTLA(CD272) 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 CDR을 함유한다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 전체로서 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공보 제WO2015103072호에 기재된 항체들을 함유한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 인간 IL-17 및 인간 IL-20에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 인간 IL-17 및 인간 IL-20에 결합할 수 있고, 서열번호 15, 25 및 27로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 21과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 23과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 인간 IL-17 및 인간 IL-20에 결합할 수 있고, 서열번호 15, 25 및 27로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1; 및 서열번호 29, 30 및 31로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #4를 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 인간 CD3 및 인간 CD20에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 서열번호 41, 48 및 316으로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 44 또는 서열번호 325와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 46 또는 서열번호 330과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 인간 IL-17 및 인간 TNF에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 인간 IL-17 및 인간 TNF에 결합할 수 있고, 서열번호 87과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 89와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 91과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 인간 CTLA-4 및 인간 PD-1에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 인간 CTLA-4 및 인간 PD-1에 결합할 수 있고, 서열번호 92, 서열번호 126, 서열번호 145, 서열번호 164 또는 서열번호 183과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 95, 서열번호 135, 서열번호 154, 서열번호 173 또는 서열번호 192와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 97, 서열번호 140, 서열번호 159, 서열번호 178 또는 서열번호 197과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 EGFR 및 PD-L1에 결합할 수 있고, 서열번호 99, 서열번호 202 또는 서열번호 221과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 100, 서열번호 211 또는 서열번호 230과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 101, 서열번호 216 또는 서열번호 235와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합할 수 있고, 서열번호 102 또는 서열번호 240과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 103 또는 서열번호 249와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 104 또는 서열번호 254와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 인자 IXa 및 인자 X에 결합할 수 있고, 서열번호 105 또는 서열번호 259와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 106 또는 서열번호 268과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 107 또는 서열번호 273과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 Her3 및 IGF-1R에 결합할 수 있고, 서열번호 108 또는 서열번호 278과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 109 또는 서열번호 287과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 110 또는 서열번호 292와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 DLL-4 및 VEGF에 결합할 수 있고, 서열번호 111 또는 서열번호 297과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 112 또는 서열번호 306과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 113 또는 서열번호 311과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 CD20 및 CD3에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 CD20 및 CD3에 결합할 수 있고, 서열번호 114 또는 서열번호 316과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 115 또는 서열번호 325와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 116 또는 서열번호 330과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 Her3 및 EGFR에 결합할 수 있고, 서열번호 117, 서열번호 335 또는 서열번호 354와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 118, 서열번호 344 또는 서열번호 363과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 119, 서열번호 349 또는 서열번호 368과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 PD-1 및 PD-L1에 결합할 수 있고, 서열번호 120 또는 서열번호 373과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 121 또는 서열번호 382와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 122 또는 서열번호 387과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 Her3 및 PD-1에 결합할 수 있고, 서열번호 123 또는 서열번호 411과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 124 또는 서열번호 420과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 125 또는 서열번호 425와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 cMet 및 PD-L1에 결합할 수 있고, 서열번호 430과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 439와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 444와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 BTLA 및 PD-1에 결합할 수 있고, 서열번호 449 또는 서열번호 468과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 458 또는 서열번호 477과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 463 또는 서열번호 482와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질은 CD20 및 CD22에 결합할 수 있고, 서열번호 392와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 FIT-Ig 폴리펩타이드 쇄 #1 서열; 서열번호 401과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #2 서열; 및 서열번호 406과 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 쇄 #3 서열을 포함한다.
본원에 기재된 예시적인 결합 단백질의 생물학적 활성 변이체 또는 기능적 변이체도 본 발명의 일부이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단백질과 관련하여 어구 "생물학적 활성 변이체" 또는 "기능적 변이체"는 기준 서열의 실질적인 생물학적 활성을 여전히 유지하면서 기준 서열에 비해 하나 이상의 아미노산에 의해 변경되어 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 변이체는 "보존적" 변화를 가질 수 있고, 이때 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 성질을 가진다(예를 들면, 이소류신에 의한 류신의 대체). 하기 표는 예시적인 보존적 아미노산 치환을 보여준다. 일부 실시양태에서, 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖고, 이때 하나 이상의 또는 모든 치환은 산성 아미노산, 예컨대, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산 또는 글루타민이다.
Figure 112018086445842-pct00001
대안적으로, 변이체는 "비보존적" 변화를 가질 수 있다(예를 들면, 트립토판에 의한 글리신의 대체). 유사한 소수의 변이는 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 이들 둘 다도 포함할 수 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 제거하지 않으면서 어느 아미노산 잔기를 치환시킬 수 있거나, 삽입할 수 있거나 결실시킬 수 있는 지를 결정하는 데 사용되는 지침은 당분야에서 잘 공지되어 있는 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, DNASTAR 소프트웨어를 이용함으로써 확인될 수 있다.
본원에 기재된 예시적인 이중특이적 결합 단백질의 에피토프와 동일한 소정의 표적 군의 에피토프에 결합할 수 있는 결합 단백질들도 본 발명의 일부이다. 상기 에피토프는 선형 에피토프, 입체형태 에피토프 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 동일한 에피토프는 X-선 공-결정학, 어레이-기반 올리고펩타이드 스캐닝, 부위-지정된 돌연변이유발, 고처리율 돌연변이유발 맵핑, 박테리오파지 표면 디스플레이 및 수소-이중수소 교환을 포함하나 이들로 한정되지 않는 적합한 에피토프 맵핑 기법에 의해 확인될 수 있다. 추가 방법은 미국 특허 제5955264호, 제65796676호, 제6984488호 및 제8802375호(이들 각각은 모든 목적을 위해 전체로서 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BMP1, BMP2, BMP3B(GDF10), BMP4, BMP6, BMP8, CSF1(M-CSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(G-CSF), EPO, FGF1(aFGF), FGF2(bFGF), FGF3(int-2), FGF4(HST), FGF5, FGF6(HST-2), FGF7(KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFNG, IFNW1, FIL1, FIL1(EPSILON), FIL1(ZETA), IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, FGER1, FGFR2, FGFR3, EGFR, ROR1, 2B4, KIR, CD137, CD27, OX40, CD40L, A2aR, CD48, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CD70, CD40, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA(TNF-b), LTB, TNF(TNF-a), TNFSF4(OX40 리간드), TNFSF5(CD40 리간드), TNFSF6(FasL), TNFSF7(CD27 리간드), TNFSF8(CD30 리간드), TNFSF9(4-1BB 리간드), TNFSF10(TRAIL), TNFSF11(TRANCE), TNFSF12(APO3L), TNFSF13(April), TNFSF13B, TNFSF14(HVEM-L), TNFSF15(VEGI), TNFSF18, FIGF(VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP(렙틴(Leptin)), PTN 및 THPO로 구성된 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 사이토카인, 사이토카인 관련 단백질 및 사이토카인 수용체에 결합할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질은 CCL1(I-309), CCL2(MCP-1/MCAF), CCL3(MIP-1a), CCL4(MIP-1b), CCL5(RANTES), CCL7(MCP-3), CCL8(mcp-2), CCL11(에오탁신(eotaxin)), CCL13(MCP-4), CCL15(MIP-1d), CCL16(HCC-4), CCL17(TARC), CCL18(PARC), CCL19(MIP-3b), CCL20(MIP-3a), CCL21(SLC/엑소더스(exodus)-2), CCL22(MDC/STC-1), CCL23(MPIF-1), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2), CCL25(TECK), CCL26(에오탁신-3), CCL27(CTACK/ILC), CCL28, CXCL1(GRO1), CXCL2(GRO2), CXCL3(GRO3), CXCL5(ENA-78), CXCL6(GCP-2), CXCL9(MIG), CXCL10(IP 10), CXCL11(I-TAC), CXCL12(SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4(CXCL4), PPBP(CXCL7), CX3CL1(SCYD1), SCYE1, XCL1(림포탁틴(lymphotactin)), XCL2(SCM-1b), BLR1(MDR15), CCBP2(D6/JAB61), CCR1(CKR1/HM145), CCR2(mcp-1RB/RA), CCR3(CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7(CKR7/EBI1), CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1), CCR9(GPR-9-6), CCRL1(VSHK1), CCRL2(L-CCR), XCR1(GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1(RDC1), CX3CR1(V28), CXCR4, GPR2(CCR10), GPR31, GPR81(FKSG80), CXCR3(GPR9/CKR-L2), CXCR6(TYMSTR/STRL33/본조(Bonzo)), HM74, IL8RA(IL8Ra), IL8RB(IL8Rb), LTB4R(GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCC10(C10), EPO, FY(DARC), GDF5, HIF1A, IL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2 및 VHL로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인, 케모카인 수용체 및 케모카인 관련 단백질에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 세포 표면 단백질, 예를 들면, 인테그린(integrin)에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 키나제(kinase) 및 프로테아제(protease)로 구성된 군으로부터 선택된 효소에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 림포카인 수용체, 모노카인 수용체 및 폴리펩타이드 호르몬 수용체로 구성된 군으로부터 선택된 수용체에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 결합 단백질은 다가이다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 다중특이적이다. 상기 다가 및/또는 다중특이적 결합 단백질은 특히 치료적 관점에서 볼 때 바람직한 성질을 가진다. 예를 들면, 다가 및/또는 다중특이적 결합 단백질은 (1) 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 더 빠르게 내재화(및/또는 이화)될 수 있고/있거나; (2) 아고니스트 항체일 수 있고/있거나; (3) 다가 항체가 결합할 수 있는 항원을 발현하는 세포의 세포 사멸 및/또는 아폽토시스를 유도할 수 있다. 다가 및/또는 다중특이적 결합 단백질의 적어도 하나의 항원 결합 특이성을 제공하는 "모 항체"는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 내재화(및/또는 이화)되는 항체일 수 있고/있거나; 아고니스트, 세포 사멸 유도 및/또는 아폽토시스 유도 항체일 수 있고, 본원에 기재된 다가 및/또는 다중특이적 결합 단백질은 이 성질들 중 하나 이상의 성질의 개선(들)을 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, 모 항체는 이 성질들 중 어느 하나 이상의 성질을 결여할 수 있으나, 본원에 기재된 다가 결합 단백질로서 구축될 때 이러한 성질을 부여받을 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 때 하나 이상의 표적에 대해 적어도 약 102 M-1s-1; 적어도 약 103 M-1s-1; 적어도 약 104 M-1s-1; 적어도 약 105 M-1s-1; 및 적어도 약 106 M-1s-1(이들 사이의 모든 값들을 포함함)로 구성된 군으로부터 선택된 결합 속도 상수(Kon)를 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 때 하나 이상의 표적에 대해 102 M-1s-1 내지 103 M-1s-1; 103 M-1s-1 내지 104 M-1s-1; 104 M-1s-1 내지 105 M-1s-1; 또는 105 M-1s-1 내지 106 M-1s-1(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 결합 속도 상수(Kon)를 가진다.
또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 때 하나 이상의 표적에 대해 최대 약 103 s-1; 최대 약 104 s-1; 최대 약 105 s-1; 및 최대 약 106 s-1(이들 사이의 모든 값들을 포함함)로 구성된 군으로부터 선택된 해리 속도 상수(Koff)를 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 때 하나 이상의 표적에 대해 103 s-1 내지 104 s-1; 104 s-1 내지 105 s-1; 또는 105 s-1 내지 106 s-1(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 해리 속도 상수(Koff)를 가진다.
또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 하나 이상의 표적에 대해 최대 약 10-7 M; 최대 약 10-8 M; 최대 약 10-9 M; 최대 약 10-10 M; 최대 약 10-11 M; 최대 약 10-12 M; 및 최대 10-13 M(이들 사이의 모든 값들을 포함함)로 구성된 군으로부터 선택된 해리 상수(KD)를 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 단백질은 IL-12 또는 IL-23에 대해 10-7 M 내지 10-8 M; 10-8 M 내지 10-9 M; 10-9 M 내지 10-10 M; 10-10 내지 10-11 M; 10-11 M 내지 10-12 M; 또는 10-12 M 내지 10-13 M(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 해리 상수(KD)를 가진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 크기-배제 크로마토그래피(SEC)-HPLC를 이용한 1-단계 단백질 A 정제에서 적어도 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 80%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 약 99.2%, 약 99.3%, 약 99.4%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8%, 약 99.9% 이상, 또는 100%(이들 사이의 모든 값들을 포함함)의 단량체 %를 가진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 최적화된 조건 하에서 적어도 약 0.01 mg/ℓ, 0.05 mg/ℓ, 0.1 mg/ℓ, 약 0.2 mg/ℓ, 약 0.3 mg/ℓ, 약 0.4 mg/ℓ, 약 0.5 mg/ℓ, 약 0.6 mg/ℓ, 약 0.7 mg/ℓ, 약 0.8 mg/ℓ, 약 0.9 mg/ℓ, 약 1.0 mg/ℓ, 약 2 mg/ℓ, 약 3 mg/ℓ, 약 4 mg/ℓ, 약 5 mg/ℓ, 약 6 mg/ℓ, 약 7 mg/ℓ, 약 8 mg/ℓ, 약 9 mg/ℓ, 약 10 mg/ℓ, 약 11 mg/ℓ, 약 12 mg/ℓ, 약 13 mg/ℓ, 약 14 mg/ℓ, 약 15 mg/ℓ, 약 16 mg/ℓ, 약 17 mg/ℓ, 약 18 mg/ℓ, 약 19 mg/ℓ, 약 20 mg/ℓ, 약 21 mg/ℓ, 약 22 mg/ℓ, 약 23 mg/ℓ, 약 24 mg/ℓ, 약 25 mg/ℓ, 약 26 mg/ℓ, 약 27 mg/ℓ, 약 28 mg/ℓ, 약 29 mg/ℓ, 약 30 mg/ℓ, 약 40 mg/ℓ, 약 50 mg/ℓ, 약 60 mg/ℓ, 약 70 mg/ℓ, 약 80 mg/ℓ, 약 90 mg/ℓ, 약 100 mg/ℓ, 약 200 mg/ℓ, 약 300 mg/ℓ, 약 400 mg/ℓ, 약 500 mg/ℓ, 약 600 mg/ℓ, 약 700 mg/ℓ, 약 800 mg/ℓ, 약 900 mg/ℓ 또는 약 1000 mg/ℓ(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 발현 수준을 가진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 293E 세포, 또는 목적에 적합한 임의의 다른 세포에서 발현된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 시차 주사 열량측정법(DSC)에 의해 측정될 때 적어도 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃, 약 80℃, 약 81℃, 약 82℃, 약 83℃, 약 84℃, 약 85℃, 약 86℃, 약 87℃, 약 88℃, 약 89℃, 약 90℃, 약 95℃ 또는 약 99℃(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 Tm1 전이 온도를 가진다.
본 발명의 결합 단백질은 냉동-해동 시험에서 큰 안정성을 가진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질 샘플이 1일, 3일 또는 7일 동안 4℃, 25℃ 및 40℃에서 해동되고 항온처리될 때, 응집체로 인한 온전한 결합 단백질의 감소는 SEC-HPLC에 의해 측정될 때 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.1%, 약 0.05% 또는 약 0.01%(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 미만이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 정맥내로 투여될 때 하기 PK 파라미터들 중 하나 이상의 PK 파라미터를 가진다: (1) 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 혈장으로부터의 약물의 겉보기 전신 제거(CL, ㎖/일/kg); (2) 정상 상태에서 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 겉보기 분포 부피(Vss, ㎖/kg); (3) 2-구획 모델에서 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 중심 또는 혈장 구획의 겉보기 부피; (4) 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 초기 또는 처분 반감기(알파 t1/2, 일); (5) 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 말기 제거 반감기(베타 t1/2, 일); (6) 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 또는 3000(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 혈장 농도-시간 곡선 하 면적(AUC, 일 x ㎍/㎖); 및 (7) 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 평균 체류 시간(MRT, 일). 일부 실시양태에서, 상기 파라미터들은 약 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg 또는 200 mg/kg(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 용량과 관련되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 피하 투여될 때 하기 PK 파라미터들 중 하나 이상의 PK 파라미터를 가진다: (1) 약물 투여 후 최대(피크) 혈장 농도에 도달하기 위해 소요되는 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 시간(Tmax, 일); (2) 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 최대(피크) 혈장 약물 농도(Cmax, ㎍/㎖); (3) 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 제거 반감기(최종 t1/2, 일); (4) 0시간부터 마지막 측정가능한 농도의 시간까지 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 또는 3000(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 혈장 농도-시간 곡선 하 면적(AUClast, 일 x ㎍/㎖); (5) 0시간부터 무한대까지 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 또는 3000(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 혈장 농도-시간 곡선 하 면적(AUCinf, 일 x ㎍/㎖); (6) 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 대사물질로의 약물의 형성 제거(CL/F, ㎖/일/kg); (7) 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 생체이용률(F, %). 일부 실시양태에서, 상기 파라미터들은 약 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg 또는 200 mg/kg(이들 사이의 모든 값들을 포함함) 이상의 용량과 관련되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 면역부착 분자, 영상화제, 치료제 및 세포독성제로 구성된 군으로부터 선택된 물질을 추가로 포함하는 접합체이다. 한 실시양태에서, 영상화제는 방사성표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생체발광 표지, 자기 표지 및 바이오틴으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 영상화제는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 및 153Sm으로 구성된 군으로부터 선택된 방사성표지이다. 한 실시양태에서, 치료제 또는 세포독성제는 면역억제제, 면역자극제, 항-대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토카인, 항-혈관신생성 물질, 항-유사분열 물질, 안쓰라사이클린, 독소 및 아폽토시스성 물질로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 결합 단백질은 상기 물질에 직접적으로 접합된다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 링커를 통해 상기 물질에 접합된다. 적합한 링커는 본원에 개시된 아미노산 및 폴리펩타이드 링커를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 링커는 절단될 수 있거나 절단될 수 없다.
또 다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 결정화된 결합 단백질이고 결정으로서 존재한다. 바람직하게는, 결정은 담체 무함유 약학 조절 방출 결정이다. 보다 바람직하게는, 결정화된 결합 단백질은 상기 결합 단백질의 가용성 대응물보다 더 큰 생체내 반감기를 가진다. 가장 바람직하게는, 결정화된 결합 단백질은 생물학적 활성을 보유한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 글리코실화된다. 바람직하게는, 글리코실화는 인간 글리코실화 패턴이다.
본 발명의 한 양태는 상기 개시된 결합 단백질들 중 어느 한 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 추가 실시양태는 상기 개시된 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공하고, 이때 상기 벡터는 pcDNA; pTT(Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No. 2); pTT3(추가 다중 클로닝 부위를 가진 pTT); pEFBOS(Mizushima, S. and Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research Vol 18, No. 17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO; pEF6 TOPO; 및 pBJ로 구성된 군으로부터 선택된다. 다중특이적 결합 단백질 및 이를 제조하는 방법이 제공된다. 다양한 기법들을 이용하여 상기 결합 단백질을 생성할 수 있다. 상기 결합 단백질을 생성하는 발현 벡터, 숙주 세포 및 방법이 이 개시에서 제공된다.
이 개시의 결합 단백질의 항원 결합 가변 도메인은 관심 있는 항원에 결합할 수 있는 다중클론 Ab, 단일클론 Ab 및/또는 수용체를 포함하는 모 결합 단백질로부터 수득될 수 있다. 이 모 결합 단백질은 천연 생성될 수 있거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 하이브리도마 기법의 이용, 선택된 림프구 항체 방법(SLAM), 파지, 효모 또는 RNA-단백질 융합 디스플레이 또는 다른 라이브러리의 이용, 인간 면역글로불린 좌위들 중 적어도 일부를 포함하는 비-인간 동물의 면역화, 및 키메라 항체, CDR-이식된 항체 및 인간화된 항체의 제조를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 항체 및/또는 단리된 수용체를 제조하는 많은 방법들을 잘 알고 있다. 예를 들면, 미국 특허 공보 제20090311253호(A1)를 참조한다. 친화성 성숙 기법을 이용하여 가변 도메인을 제조할 수도 있다. 결합 단백질의 결합 가변 도메인은 당분야에서 공지되어 있는 추출 절차(예를 들면, 용매, 세제 및/또는 친화성 정제의 이용)에 의해 수득되었거나 당분야에서 공지되어 있는 생체물리학적 방법(예를 들면, X-선 결정학, NMR, 간섭측정법 및/또는 컴퓨터 모델링)에 의해 확인된 단리된 수용체 분자로부터 수득될 수도 있다.
결합 단백질 분자에서 요구되는 적어도 하나 이상의 성질을 가진 모 결합 단백질을 선택하는 단계를 포함하는 실시양태가 제공된다. 한 실시양태에서, 요구된 성질은 항체 파라미터를 특징규명하는 데 사용되는 성질들, 예를 들면, 항원 특이성, 항원에 대한 친화성, 효능, 생물학적 기능, 에피토프 인식, 안정성, 가용성, 생성 효율, 면역원성, 약물동력학, 생체이용률, 조직 교차반응성 또는 이종상동성 항원 결합 중 하나 이상의 성질이다. 예를 들면, 미국 특허 공보 제20090311253호를 참조한다.
다중특이적 항체는 항원 결합 도메인들 중 하나 이상의 항원 결합 도메인을 비-기능적 도메인으로 만들도록 디자인될 수도 있다. 본원에 기재된 방법들 중 어느 한 방법에 의해 생성된 모 결합 단백질로부터 재조합 DNA 기법을 이용하여 가변 도메인을 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 가변 도메인은 뮤린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다. 또 다른 실시양태에서, 가변 도메인은 CDR 이식된 또는 인간화된 가변 중쇄 또는 경쇄 도메인이다. 한 실시양태에서, 가변 도메인은 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다.
한 실시양태에서, 재조합 DNA 기법을 이용하여 하나 이상의 불변 도메인을 가변 도메인에 연결한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 서열은 중쇄 불변 도메인에 연결되고, 하나 이상의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 서열은 경쇄 불변 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 불변 도메인은 각각 인간 중쇄 불변 도메인 및 인간 경쇄 불변 도메인이다. 한 실시양태에서, 중쇄는 Fc 영역에 추가로 연결된다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE 또는 IgD로부터의 Fc 영역을 포함한다.
추가로, 본원에서 제공된 결합 단백질은 세포내 전달(내재화 수용체 및 세포내 분자를 표적화함), 및 뇌 내부로의 전달(혈액-뇌 장벽을 횡단하기 위해 트랜스페린 수용체 및 CNS 질환 매개자를 표적화함)을 포함하는 조직 특이적 전달을 위해 사용될 수 있다(향상된 국소 PK를 위해 조직 마커 및 질환 매개자를 표적화함으로써, 효능을 더 높이고/이거나 독성을 더 낮춘다). 결합 단백질은 항원의 비-중화 에피토프에 결합함으로써 그 항원을 특정 위치로 전달하고 항원의 반감기도 증가시키기 위한 담체 단백질로서 작용할 수도 있다. 뿐만 아니라, 결합 단백질은 환자 내로 이식되는 의료 디바이스에 물리적으로 연결되거나 이 의료 디바이스를 표적화하도록 디자인될 수 있다(문헌(Burke et al. (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446); 문헌(Hildebrand et al. (2006) Surface and Coatings Technol. 200(22-23): 6318-6324); 문헌(Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467); 및 문헌(Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices, Marques (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397) 참조). 적절한 유형의 세포를 의료 이식물의 부위로 향하게 하는 것은 치유를 촉진할 수 있고 정상 조직 기능을 회복시킬 수 있다. 대안적으로, 디바이스에 커플링되었거나 표적화된 수용체 항체 융합 단백질에 의해 디바이스 이식 시 방출된 매개자(사이토카인을 포함하나 이것으로 한정되지 않음)의 억제도 제공된다.
한 양태에서, 숙주 세포는 상기 개시된 벡터로 형질전환된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 추가 실시양태에서, 숙주 세포는 대장균(Escherecia coli)이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는는 진핵 세포이다. 추가 실시양태에서, 진핵 세포는 원생동물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 293, COS, NS0 및 CHO를 포함하나 이들로 한정되지 않는 포유동물 세포; 및/또는 진균 세포, 예컨대, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae); 또는 곤충 세포, 예컨대, Sf9이다.
본 발명의 또 다른 양태는 결합 단백질을 생성하기에 충분한 조건 하에서 배양 배지에서 상기 개시된 숙주 세포들 중 어느 한 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 개시된 결합 단백질을 생성하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이 방법에 의해 생성된 결합 단백질들 중 50% 내지 75%의 결합 단백질은 이중특이적 4가 결합 단백질이다. 보다 바람직하게는, 이 방법에 의해 생성된 결합 단백질들 중 75% 내지 90%의 결합 단백질은 이중특이적 4가 결합 단백질이다. 가장 바람직하게는, 생성된 결합 단백질들 중 90% 내지 95%의 결합 단백질은 이중특이적 4가 결합 단백질이다.
또 다른 실시양태는 상기 개시된 방법에 따라 생성된 결합 단백질을 제공한다.
한 실시양태는 결합 단백질을 방출시키는 조성물로서, 상기 개시된 결정화된 결합 단백질 및 성분; 및 적어도 하나의 중합체성 담체를 포함하는 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 중합체성 담체는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(젖산), 폴리(젖산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필)메타크릴아미드, 폴리[(오르가노)포스파젠], 폴리(오르토에스테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 설페이트화된 폴리사카라이드, 이들의 블렌드 및 공중합체로 구성된 군 중 하나 이상의 군으로부터 선택된 중합체이다. 바람직하게는, 성분은 알부민, 수크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태는 유효량의 상기 개시된 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 개시된 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물도 제공한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 포스페이트 완충제 또는 식염수를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 통상의 모 비히클은 인산나트륨 용액, 링커 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 첨가된 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양분 보충제, 전해질 보충제, 예컨대, 링거 덱스트로스 기제의 보충제 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들면, 항균제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 기체 등도 존재할 수 있다. 보다 구체적으로, 주사 용도에 적합한 약학 조성물은 멸균 수성 용액(수용성을 나타내는 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우, 등장성 물질, 예를 들면, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
추가 실시양태에서, 약학 조성물은 장애를 치료하기 위한 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다. 한 실시양태에서, 추가 물질은 치료제, 영상화제, 세포독성제, 혈관신생 억제제(항-VEGF 항체 또는 VEGF-트랩(trap)을 포함하나 이들로 한정되지 않음), 키나제 억제제(KDR 및 TIE-2 억제제를 포함하나 이들로 한정되지 않음); 보조자극 분자 차단제(항-B7.1, 항-B7.2, CTLA4-Ig, 항-PD-1, 항-CD20을 포함하나 이들로 한정되지 않음); 부착 분자 차단제(항-LFA-1 항체, 항-E/L 셀렉틴(selectin) 항체, 소분자 억제제를 포함하나 이들로 한정되지 않음); 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능적 단편(항-IL-18, 항-TNF, 항-IL-6/사이토카인 수용체 항체를 포함하나 이들로 한정되지 않음); 메토트렉세이트(methotrexate); 사이클로스포린(cyclosporin); 라파마이신(rapamycin); FK506; 검출가능한 표지 또는 레포터; TNF 길항제; 항류마티스성 물질; 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드 소염성 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화 스테로이드, 에리쓰로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성약제, 항우울제, 항정신병제, 자극제, 천식 약물, 베타 아고니스트, 흡입되는 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토카인 및 사이토카인 길항제로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 개시된 결합 단백질에 의해 결합될 수 있는 표적 또는 표적들이 유해한 효과를 나타내는 장애를 앓고 있는 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체에서 상기 표적 또는 표적들의 활성이 억제되고 상기 장애의 치료 또는 예방이 달성되도록 상기 개시된 결합 단백질을 상기 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 질환 또는 장애는 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암이다. 한 실시양태에서, 질환 또는 장애는 관절염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 패혈증성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절병증, 전신 홍반 루푸스, 크론병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존적 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 피부염 피부경화증, 이식물 대 숙주 질환, 장기 이식 거부, 장기 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 사르코이드증, 죽상동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브스병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇤라인(Henoch-Schoenlein) 자반증, 신장의 미시적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈증성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 졸중, 원발성 담즙성 경변증, 용혈성 빈혈, 악성종양, 심부전, 심근경색, 애디슨병, 산발적 다선성 결핍 I형 및 다선성 결핍 II형, 슈미트(Schmidt) 증후군, 성인 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모, 원형탈모, 혈청음성 관절병증, 관절병증, 라이터병, 건선성 관절병증, 궤양성 결장염성 관절병증, 장병증성 활막염, 클라미디아(chlamydia), 예르시니아(yersinia) 및 살모넬라(salmonella)와 관련된 관절병증, 척추관절병증, 아테롬성 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유사천포창, 선형 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스(Coombs) 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 소아 악성 빈혈, 근육통성 뇌염/로얄 프리(Royal Free) 질환, 만성 점막피부 칸디다증, 거대 세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 원인불명의 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질환, 간염 B, 간염 C, 공통 가변 면역결핍(공통 가변 저감마글로불린혈증), 확장된 심근병증, 여성 불임, 난소 부전, 미성숙 난소 부전, 섬유성 폐 질환, 원인불명의 섬유화 폐포염, 염증 후 간질 폐 질환, 간질 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질 폐 질환, 혼합된 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신 경화증 관련 간질 폐 질환, 류마티스성 관절염 관련 간질 폐 질환, 전신 홍반 루푸스 관련 폐 질환, 피부근염/다발근염 관련 폐 질환, 쇼그렌병 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염성 미만성 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물에 의해 유도되는 간질 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 폐쇄성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤성 폐 질환, 감염 후 간질 폐 질환, 통풍 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(고전적인 자가면역 또는 루푸스모양 간염), 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개 저혈당증, 흑색가시세포증을 가진 B형 인슐린 내성, 부갑상선기능저하증, 장기 이식과 관련된 급성 면역 질환, 장기 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절염, 원발성 경화성 담관염, 건선 1형, 건선 2형, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 미시적 혈관염, 라임병, 원판상 홍반 루푸스, 남성 불임 특발성 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 서브타입), 교감성 안염, 결합 조직 질환에 뒤따르는 폐 고혈압, 굿파스처 증후군, 결절성 다발동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 열, 류마티스성 척추염, 스틸병, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 타카야수병/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선기능항진증, 갑상선종성 자가면역 갑상선기능저하증(하시모토병), 위축성 자가면역 갑상선기능저하증, 원발성 점액부종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알코올성 경변증, 알코올에 의해 유도되는 간 손상, 담즙울혈, 특이체질 간 질환, 약물에 의해 유도되는 간염, 비-알코올성 지방간염, 알레르기 및 천식, 군 B 스트렙토코커스(GBS) 감염, 정신 장애(예를 들면, 우울증 및 조현병), Th2형 및 Th1형 매개 질환, 급성 및 만성 통증(상이한 형태의 통증), 및 암, 예컨대, 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 직장암, 및 조혈성 악성종양(백혈병 및 림프종), 무베타지질단백혈증, 말단청색증, 급성 및 만성 기생충 또는 감염성 과정, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전, 선암종, 대기 이소성 박동, AIDS 치매 복합, 알코올에 의해 유도되는 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식 거부, 알파-1-항트립신 결핍, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 협심증, 전각 세포 변성, 항-cd3 요법, 항인지질 증후군, 항-수용체 과민성 반응, 대동맥 및 말초 동맥류, 대동맥 박리, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥루, 운동실조, (지속된 또는 발작성) 심방 세동, 심방 조동, 방실 차단, B 세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식(BMT) 거부, 각차단, 버킷 림프종, 화상, 심장 부정맥, 심장 마비 증후군, 심장 종양, 심근병증, 심폐 우회 염증 반응, 연골 이식 거부, 소뇌 피질 변성, 소뇌 장애, 혼돈 또는 다소성 심방 빈맥, 화학요법 관련 장애, 만성 골수세포성 백혈병(CML), 만성 알코올중독, 만성 염증성 병상, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 만성 살리실레이트 중독, 대장암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉 피부염, 폐심증, 관상 동맥 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 배양 음성 패혈증, 낭성 섬유증, 사이토카인 요법 관련 장애, 권투선수 치매, 탈수초 질환, 뎅기출혈열, 피부염, 피부과학적 질환, 당뇨병, 진성 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화성 질환, 미만성 루이 소체 질환, 확장된 울혈성 심근병증, 기저 신경절의 장애, 중년의 다운 증후군, CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도되는 약물-유도된 운동 장애, 약물 민감성, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병증, 후두개염, 엡스테인-바 바이러스 감염, 홍색사지통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 혈구포식세포성 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부, 프리드라이히 운동실조, 기능성 말초 동맥 장애, 진균 패혈증, 가스 괴저병, 위 궤양, 사구체 신염, 임의의 장기 또는 조직의 이식 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 유기체로 인한 육아종, 모발 세포 백혈병, 할러로르덴-스파츠(Hallerrorden-Spatz) 질환, 하시모토 갑상선염, 고초열, 심장 이식 거부, 혈색소침착증, 혈액투석, 용혈성 요독성 증후군/혈전용해성 혈소판감소성 자반증, 출혈, 간염(A), 히스속(His bundle) 부정맥, HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨병, 운동과다증성 운동 장애, 과민성 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동부족성 운동 장애, 시상하부-뇌하수체-부신 축 평가, 특발성 애디슨병, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 유아 척수 근육 위축증, 대동맥의 염증, 인플루엔자 a, 이온화 방사선 노출, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 허혈 재관류 손상, 허혈성 졸중, 소아 류마티스성 관절염, 소아 척수 근육 위축증, 카포시 육종, 신장 이식 거부, 레기오넬라(legionella), 리슈만편모충증(leishmaniasis), 한센병, 피질척수 시스템의 병변, 지방부종, 간 이식 거부, 림프부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌수막염, 수막구균혈증, 대사/특발성, 편두통, 미토콘드리아 다중시스템 장애, 혼합된 결합 조직 질환, 단일클론 감마글로불린병증, 다발성 골수종, 다중 시스템 변성(멘셀 데제린(Mencel Dejerine)-토마스 샤이-드라거(Thomas Shi-Drager) 및 마카도-조셉(Machado-Joseph)), 중증 근무력증, 세포내 마이코박테리움 아비움(mycobacterium avium), 마이코박테리움 투버큘로시스(mycobacterium tuberculosis), 골수형성이상 증후군, 심근경색, 심근 허혈성 장애, 비인두암종, 신생아 만성 폐 질환, 신염, 신장증, 신경퇴행성 질환, 신경성 I 근육 위축증, 호중구감소 열, 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 분지의 폐쇄, 폐쇄성 동맥 장애, okt3 요법, 고환염/부고환염, 고환염/정관절제술 복원 시술, 장기비대, 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장암종, 신생물딸림 증후군/악성종양의 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증성 질환, 연중 비염, 심장막 질환, 말초 죽상동맥경화성 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성 빈혈, 주폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군(다발신경병증, 장기비대, 내분비병증, 단일클론 감마글로불린병증 및 피부 변화 증후군), 재관류 후 증후군, 펌프 후 증후군, MI 후 심장절개 증후군, 전자간증, 진행성 핵상 마비, 원발성 폐 고혈압, 방사선 요법, 레이노 현상 및 질환, 레이노병, 레프섬병, 규칙적인 좁은 QRS 빈맥, 신장혈관 고혈압, 재관류 손상, 제한적 심근병증, 육종, 피부경화증, 노년 무도병, 루이 소체 유형의 노년 치매, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 겸상 세포 빈혈, 피부 동종이식 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특정 부정맥, 척수 운동실조, 척수소뇌 변성, 스트렙토코커스 근염, 소뇌의 구조적 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계의 매독, 전신 아나필락시스, 전신 염증성 반응 증후군, 전신 발병 소아 류마티스성 관절염, T 세포 또는 FAB ALL, 모세혈관확장증, 폐색성 혈전정맥염, 혈소판감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민성 반응, IV형 과민성, 불안정한 협심증, 요독증, 요로패혈증, 두드러기, 판막 심장 질환, 하지 정맥류, 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균 감염, 활력 뇌염/패혈증성 뇌수막염, 활력 관련 혈구포식성 증후군, 베르니케-코르사코프(Wernicke-Korsakoff) 증후군, 윌슨병, 임의의 장기 또는 조직의 이종이식 거부를 포함하는 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 논의된 바와 같이 제2 물질의 투여 전에, 동시에 또는 후에 상기 개시된 결합 단백질들 중 어느 한 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 제2 물질은 부데노사이드(budenoside), 표피 성장 인자, 코르티코스테로이드(corticosteroid), 사이클로스포린(cyclosporin), 설파살라진(sulfasalazine), 아미노살리실레이트(aminosalicylates), 6-머캡토푸린(mercaptopurine), 아자티오프린(azathioprine), 메트로니다졸(metronidazole), 리폭시게나제(lipoxygenase) 억제제, 메살라민(mesalamine), 올살라진(olsalazine), 발살라자이드(balsalazide), 항산화제, 트롬복산(thromboxane) 억제제, IL-1 수용체 길항제, 항-IL-1β 단일클론 항체, 항-IL-6 단일클론 항체, 성장 인자, 엘라스타제(elastase) 억제제, 피리디닐-이미다졸 화합물, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-23, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF의 항체 또는 아고니스트, CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는 이들의 리간드의 항체, 메토트렉세이트(methotrexate), 사이클로스포린, FK506, 라파마이신(rapamycin), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 레플루노마이드(leflunomide), NSAID, 이부프로펜(ibuprofen), 코르티코스테로이드, 프레드니솔론(prednisolone), 포스포디에스터라제(phosphodiesterase) 억제제, 아덴소신(adensosine) 아고니스트, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린성 물질, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP 키나제 억제제, IL-1β 전환 효소 억제제, TNFα 전환 효소 억제제, T 세포 신호전달 억제제, 메탈로프로테이나제(metalloproteinase) 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캡토푸린, 안지오테신(angiotensin) 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체, 가용성 p55 TNF 수용체, 가용성 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 소염성 사이토카인, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 상기 개시된 약학 조성물은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉수내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 코내 및 경피로부터 선택된 적어도 하나의 모드에 의해 대상체에게 투여된다.
본 발명의 한 양태는 본 발명의 적어도 하나의 결합 단백질에 대한 적어도 하나의 항-이디오타입(idiotype) 항체를 제공한다. 항-이디오타입 항체는 본 발명의 결합 단백질 내로 도입될 수 있는 면역글로불린 분자의 적어도 부분, 예컨대, 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 골격 영역, 또는 이들의 임의의 부분을 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; 아그레칸(Aggrecan); AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPT1; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; AZGP1(아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLR1(MDR15); BlyS; BMP1; BMP2; BMP3B(GDF10); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B; BMPR2; BPAG1(플렉틴(plectin)); BRCA1; C19orf10(IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2(D6/JAB61); CCL1(I-309); CCL11(에오탁신); CCL13(MCP-4); CCL15(MIP-1d); CCL16(HCC-4); CCL17(TARC); CCL18(PARC); CCL19(MIP-3b); CCL2(MCP-1); MCAF; CCL20(MIP-3a); CCL21(MIP-2); SLC; 엑소더스-2; CCL22(MDC/STC-1); CCL23(MPIF-1); CCL24(MPIF-2/에오탁신-2); CCL25(TECK); CCL26(에오탁신-3); CCL27(CTACK/ILC); CCL28; CCL3(MIP-1a); CCL4(MIP-1b); CCL5(RANTES); CCL7(MCP-3); CCL8(mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1(CKR1/HM145); CCR2(mcp-1RB/RA); CCR3(CKR3/CMKBR3); CCR4; CCR5(CMKBR5/ChemR13); CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6); CCR7(CKR7/EBI1); CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1); CCR9(GPR-9-6); CCRL1(VSHK1); CCRL2(L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD-22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD47, CD48, CD52; CD69; CD70, CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CD137, CD138, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CDH1(E-캐드헤린(cadherin)); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A(p21Wap1/Cip1); CDKN1B(p27Kip1); CDKN1C; CDKN2A(p16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; 키티나제(Chitinase); CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7(클라우딘(claudin)-7); CLN3; CLU(클루스터린(clusterin)); cMet; CMKLR1; CMKOR1(RDC1); CNR1; COL18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSF1(M-CSF); CSF2(GM-CSF); CSF3(GCSF); CTLA-4; CTNNB1(b-카테닌(catenin)); CTSB(카텝신(cathepsin) B); CX3CL1(SCYD1); CX3CR1(V28); CXCL1(GRO1); CXCL10(IP-10); CXCL11(I-TAC/IP-9); CXCL12(SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2(GRO2); CXCL3(GRO3); CXCL5(ENA-78/LIX); CXCL6(GCP-2); CXCL9(MIG); CXCR3(GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DLL-4; DNCL1; DPP4; E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2(Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; F3(TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FGF; FGF1(aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2(bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3(int-2); FGF4(HST); FGF5; FGF6(HST-2); FGF7(KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF(VEGFD); FIL1(EPSILON); FIL1(ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRT1(피브로넥틴(fibronectin)); FLT1; FOS; FOSL1(FRA-1); FY(DARC); GABRP(GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNAS1; GNRH1; GPR2(CCR10); GPR31; GPR44; GPR81(FKSG80); GRCC10(C10); GRP; GSN(겔솔린(Gelsolin)); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HIP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; Her3; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOX1; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; IFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; IL1F10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2 IL1RN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST(당단백질 130); IL7; IL7R; IL8; IL8RA; IL8RB; IL8RB; IL9; IL9R; ILK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAK1; IRAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6(a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4(b 4 인테그린); JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KITLG; KLF5(GC Box BP); KLF6; KLK10; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19(케라틴(Keratin) 19); KRT2A; KRTHB6(모발 특이적 II형 케라틴); LAMA5; LEP(렙틴); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA(TNF-b); LTB; LTB4R(GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG 또는 Omgp; MAP2K7(c-Jun); MDK; MIB1; 미드카인(midkine); MIF; MIP-2; MKI67(Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3(메탈로티오넥틴(메탈로티오넥틴)-III); MTSS1; MUC1(뮤신(mucin)); MYC; MYD88; NCK2; 뉴로칸(neurocan); NFKB1; NFKB2; NGFB(NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66(Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1(NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZ1; OPRD1; PCSK9; P2RX7; PAP; PART1; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PD-1; PD-L1; 알파4베타7, OX40, GITR, TIM-3, Lag-3, B7-H3, B7-H4, GDF8, CGRP, Lingo-1, 인자 IXa, 인자 X, ICOS, GARP, BTLA, CD160, ROR1, 2B4, KIR, CD27, OX40, CD40L, A2aR, PDGFA; PDGFB; PECAM1; PF4(CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸(phosphacan); PIAS2; PIK3CG; PLAU(uPA); PLG; PLXDC1; PPBP(CXCL7); PPID; PR1; PRKCQ; PRKD1; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2(COX-2); PTN; RAC2(p21Rac2); RARB; RGS1; RGS13; RGS3; RNF110(ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2(리포필린(lipophilin) B); SCGB2A1(맘마글로빈(mammaglobin) 2); SCGB2A2(맘마글로빈 1); SCYE1(내피 단핵구 활성화 사이토카인); SDF2; SERPINA1; SERPINA3; SERPINB5(마스핀(maspin)); SERPINE1(PAI-1); SERPINF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPP1; SPRR1B(Spr1); ST6GAL1; STAB1; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCP10; TDGF1; TEK; TGFA; TGFB1; TGFB1I1; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBR1; TGFBR2; TGFBR3; TH1L; THBS1(쓰롬보스폰딘(thrombospondin)-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE(Tie-1); TIMP3; 조직 인자; TLR10; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAIP2(B94); TNFAIP3; TNFRSF11A; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6(Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10(TRAIL); TNFSF11(TRANCE); TNFSF12(APO3L); TNFSF13(April); TNFSF13B; TNFSF14(HVEM-L); TNFSF15(VEGI); TNFSF18; TNFSF4(OX40 리간드); TNFSF5(CD40 리간드); TNFSF6(FasL); TNFSF7(CD27 리간드); TNFSF8(CD30 리간드); TNFSF9(4-1BB 리간드); TOLLIP; 톨(Toll) 유사 수용체; TOP2A(토포이소머라제(topoisomerase) Iia); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; 버시칸(versican); VHL C5; VLA-4; XCL1(림포탁틴); XCL2(SCM-1b); XCR1(GPR5/CCXCR1); YY1; 및 ZFPM2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질은 2개 이상의 항원들에 결합하는 그의 능력을 고려할 때 보편적인 면역어세이, 예컨대, 효소 연결된 면역흡착 어세이(ELISA), 방사면역어세이(RIA) 또는 조직 면역조직화학을 이용하여 (예를 들면, 생물학적 샘플, 예컨대, 혈청 또는 혈장에서) 항원을 검출하는 데 사용될 수 있다. FIT-Ig는 결합되거나 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하기 위해 검출가능한 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지된다. 적합한 검출가능한 물질은 다양한 효소들, 보철 기들, 형광 물질들, 발광 물질들 및 방사성 물질들을 포함한다. 적합한 효소의 예로는 호스라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제(phosphatase), 베타-갈락토시다제(galactosidase) 또는 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase)가 있고; 적합한 보철 기 복합체의 예로는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 있고; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민(dichlorotriazinylamine) 플루오레세인, 단실(dansyl) 클로라이드 또는 파이코에리쓰린(phycoerythrin)이 있고; 발광 물질의 예로는 루미놀(luminol)이 있고; 적합한 방사성 물질의 예로는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 또는 153Sm이 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 항원의 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 이러한 FIT-Ig는 예를 들면, 본 발명의 결합 단백질과 교차반응하는 항원을 함유하는 세포 배양물, 또는 이러한 항원을 가진 인간 대상체 또는 다른 포유동물 대상체에서 항원 활성을 억제하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 항원 활성이 유해한 효과를 나타내는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 항원 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 결합 단백질은 치료 목적을 위해 인간 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 활성이 유해한 효과를 나타내는 장애"는 상기 장애를 앓고 있는 대상체 내의 항원의 존재가 상기 장애의 병태생리학의 원인, 또는 상기 장애의 악화에 기여하는 요인인 것으로 밝혀졌거나 의심되는 질환 및 다른 장애를 포함하기 위한 것이다. 따라서, 항원 활성이 유해한 효과를 나타내는 장애는 항원 활성의 감소가 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시킬 것으로 예상되는 장애이다. 이러한 장애는 예를 들면, 상기 장애를 앓고 있는 대상체의 생물학적 체액에서의 항원 농도의 증가(예를 들면, 대상체의 혈청, 혈장, 활액 등에서의 항원 농도의 증가)에 의해 입증될 수 있다. 본 발명의 결합 단백질로 치료될 수 있는 장애의 비-한정적 예로는 이하 단락 및 본 발명의 항체의 약학 조성물에 관한 단락에서 논의된 장애들이 있다.
본 발명의 FIT-Ig는 1개의 항원 또는 다수의 항원들에 결합할 수 있다. 이러한 항원은 본원에 참고로 도입되는 하기 데이터베이스에 나열된 표적들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이 표적 데이터베이스들은 하기 목록들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다:
Figure 112018086445842-pct00002
치료 표적(http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp);
Figure 112018086445842-pct00003
사이토카인 및 사이토카인 수용체(http://www.cytokinewebfacts.com/, http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi, and http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html);
Figure 112018086445842-pct00004
케모카인(http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html);
Figure 112018086445842-pct00005
케모카인 수용체 및 GPCR(http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/);
Figure 112018086445842-pct00006
후각 수용체(http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp);
Figure 112018086445842-pct00007
수용체(http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm);
Figure 112018086445842-pct00008
암 표적(http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi);
Figure 112018086445842-pct00009
잠재적 항체 표적으로서의 분비된 단백질(http://spd.cbi.pku.edu.cn/);
Figure 112018086445842-pct00010
단백질 키나제(http://spd.cbi.pku.edu.cn/); 및
Figure 112018086445842-pct00011
인간 CD 마커(http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf) 및 (Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106:3123-6).
FIT-Ig는 2개의 상이한 표적들을 동시적으로 차단하여 효능/안전성을 향상시키고/시키거나 환자 적용범위를 증가시키기 위한 치료제로서 유용하다. 이러한 표적은 가용성 표적(예를 들면, IL-13 및 TNF) 및 세포 표면 수용체 표적(예를 들면, VEGFR 및 EGFR)을 포함할 수 있다. 상기 표적은 암 치료를 위해 종양 세포와 T 세포 사이에(Her2 및 CD3), 또는 자가면역/이식을 위해 자가반응성 세포와 이펙터 세포 사이에, 또는 임의의 소정의 질환에서 질환 야기 세포를 제거하기 위해 임의의 표적 세포와 이펙터 세포 사이에 방향전환된 세포독성을 유도하는 데 사용될 수도 있다.
추가로, FIT-Ig는 동일한 수용체의 2개의 상이한 에피토프들을 표적화하도록 디자인될 때 수용체 밀집 및 활성화를 유발하는 데 사용될 수 있다. 이것은 아고니스트성 및 길항제성 항-GPCR 치료제를 제조하는 데 있어서 유리할 수 있다. 이 경우, FIT-Ig는 밀집/신호전달(2개의 세포 표면 분자들) 또는 신호전달(1개의 분자)을 위해 1개의 세포의 2개의 상이한 에피토프들을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 유사하게, FIT-Ig 분자는 CTLA-4 세포외 도메인의 2개의 상이한 에피토프들(또는 동일한 에피토프의 2개의 카피들)을 표적화함으로써 CTLA-4 결찰 및 음성 신호를 유발하여, 면역 반응의 하향조절을 이끌어내도록 디자인될 수 있다. CTLA-4는 다수의 면역학적 장애들의 치유적 치료를 위한 임상적으로 검증된 표적이다. CTLA-4/B7 상호작용은 활성화 후 세포 주기 진행, IL-2 생성 및 T 세포의 증식을 약화시킴으로써 T 세포 활성화를 음성적으로 조절하고, CTLA-4(CD152) 개입은 T 세포 활성화를 하향조절할 수 있고 면역 내성의 유도를 촉진할 수 있다. 그러나, CTLA-4의 아고니스트성 항체 개입으로 T 세포 활성화를 약화시키는 전략은 CTLA-4 활성화가 결찰을 요구하기 때문에 성공적이지 못하였다. CTLA-4/B7의 분자 상호작용은 결정 구조 분석에 의해 입증된 바와 같이 "편향된 지퍼(skewed zipper)" 어레이로 존재한다(Stamper 2001 Nature 410:608). 그러나, 항-CTLA-4 단일클론 항체를 포함하는, 현재 입수가능한 CTLA-4 결합 시약들 중 어느 것도 결찰 성질을 갖지 않는다. 이 문제를 해결하기 위한 여러 시도들이 있었다. 한 사례에서, 세포 구성원에 결합된 단일 쇄 항체가 생성되었고 마우스에서 동종이계 거부를 유의미하게 억제하였다(Hwang 2002 JI 169:633). 별개의 사례에서, CTLA-4에 대한 인공 APC 표면-연결된 단일 쇄 항체가 생성되었고 T 세포 반응을 약화시키는 것으로 입증되었다(Griffin 2000 JI 164:4433). 상기 사례들 둘 다에서, CTLA-4 결찰은 인공 시스템에서 가깝게 위치된 구성원-결합된 항체에 의해 달성되었다. 이 실험들은 CTLA-4 음성 신호전달을 유발함으로써 면역 하향조절에 대한 개념 증명을 제공하지만, 이 보고들에서 사용된 시약들은 치료 용도에 적합하지 않다. 결국, CTLA-4 결찰은 CTLA-4 세포외 도메인의 2개의 상이한 에피토프들(또는 동일한 에피토프의 2개의 카피들)을 표적화하는 FIT-Ig 분자를 사용함으로써 달성될 수 있다. 근거는 IgG의 2개의 결합 부위들에 걸쳐 있는 거리인 대략 150 내지 170 Å이 CTLA-4의 활성 결찰에 너무 크다는 것이다(2개의 CTLA-4 동종이량체 사이의 30 내지 50 Å). 그러나, FIT-Ig(1개의 아암(arm))의 2개의 결합 부위들 사이의 거리는 훨씬 더 짧고 30 내지 50 Å의 범위 내에 있어, CTLA-4의 적절한 결찰을 가능하게 한다.
유사하게, FIT-Ig는 세포 표면 수용체 복합체의 2개의 상이한 구성원들(예를 들면, IL-12R 알파 및 베타)을 표적화할 수 있다. 뿐만 아니라, FIT-Ig는 CR1 및 가용성 단백질/병원체를 표적화하여, 표적 가용성 단백질/병원체의 신속한 제거를 유도할 수 있다.
추가로, 본 발명의 FIT-Ig는 세포내 전달(내재화 수용체 및 세포내 분자를 표적화함) 및 뇌 내부로의 전달(혈액-뇌 장벽을 횡단하기 위해 트랜스페린 수용체 및 CNS 질환 매개자를 표적화함)을 포함하는 조직 특이적 전달을 위해 사용될 수 있다(향상된 국소 PK를 위해 조직 마커 및 질환 매개자를 표적화함으로써, 효능을 더 높이고/이거나 독성을 더 낮춘다). FIT-Ig는 항원의 비-중화 에피토프에 결합함으로써 그 항원을 특정 위치로 전달하고 항원의 반감기도 증가시키기 위한 담체 단백질로서 작용할 수도 있다. 뿐만 아니라, FIT-Ig는 환자 내로 이식되는 의료 디바이스에 물리적으로 연결되거나 이 의료 디바이스를 표적화하도록 디자인될 수 있다(Burke, Sandra E.; Kuntz, Richard E.; Schwartz, Lewis B. Zotarolimus (ABT-578) eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006), 58(3), 437-446; Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices. Hildebrand, H. F.; Blanchemain, N.; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F. Surface and Coatings Technology (2006), 200(22-23), 6318-6324; Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis. Wu, Peng; Grainger, David W. Biomaterials (2006), 27(11), 2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices. Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L. Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397; Page: 52. Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices. Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L. Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397). 요약하건대, 적절한 유형의 세포를 의료 이식물의 부위로 향하게 하는 것은 치유를 촉진할 수 있고 정상 조직 기능을 회복시킬 수 있다. 대안적으로, 디바이스에 커플링되었거나 표적화된 FIT-Ig에 의해 디바이스 이식 시 방출된 매개자(사이토카인을 포함하나 이것으로 한정되지 않음)의 억제도 제공된다. 예를 들면, 스텐트(Stent)는 차단된 동맥을 깨끗하게 하고 심장 근육으로의 혈액의 유동을 개선하기 위해 심장중재시술에서 수년 동안 사용되고 있다. 그러나, 전통적인 나금속 스텐트는 일부 환자들에서 재협착증(치료된 영역 내의 동맥의 재협소화)을 야기하는 것으로 공지되어 있고 혈전을 유발할 수 있다. 최근에, 혈액 전체를 통해 순환하는 내피 전구체 세포(EPC)를 포획함으로써 재협착증을 감소시키고 혈전이 생성되는 것을 방지하는, 항-CD34 항체로 코팅된 스텐트가 기재되어 있다. 내피 세포는 혈관 내층을 형성하여 혈액이 매끄럽게 유동하게 하는 세포이다. EPC는 스텐트의 단단한 표면에 부착하여, 치유를 촉진할 뿐만 아니라 스텐트의 사용과 관련된 것으로 이미 확인된 합병증인 재협착증 및 혈전도 예방하는 매끄러운 층을 형성한다(Aoji et al. 2005 J Am Coll Cardiol. 45(10):1574-9). 스텐트를 요구하는 환자에 대한 결과를 개선하는 것 이외에, 심혈관 우회 수술을 요구하는 환자와도 연관되어 있다. 예를 들면, 항-EPC 항체로 코팅된 보철 혈관 도관(인공 동맥)은 우회 수술 이식물용으로 환자 다리 또는 팔로부터의 동맥을 사용할 필요성을 없앨 것이다. 이것은 수술 및 마취 시간을 감소시킴으로써, 관상 수술 사망을 감소시킬 것이다. FIT-Ig는 세포 집결을 용이하게 하기 위해 이식된 디바이스 상에 코팅되어 있는 세포 표면 마커(예컨대, CD34) 및 단백질(또는 지질 및 폴리사카라이드를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 종류의 에피토프)에 결합하는 방식으로 디자인된다. 이러한 방법은 일반적으로 다른 의료 이식물에도 적용될 수 있다. 대안적으로, FIT-Ig는 의료 디바이스 위에 코팅될 수 있고, 이식하고 디바이스로부터 모든 FIT들을 방출시킬 때(또는 이미 적재된 FIT-Ig의 시효 및 변성을 포함하는, 추가 새로운 FIT-Ig를 요구할 수 있는 임의의 다른 필요성이 있을 때) 상기 디바이스는 환자에게의 새로운 FIT-Ig의 전신 투여에 의해 재적재될 수 있고, 이때 FIT-Ig는 한 세트의 결합 부위를 가진 관심 있는 표적(사이토카인, 세포 표면 마커(예컨대, CD34) 등), 및 다른 것과 함께 디바이스 위에 코팅된 표적(단백질, 및 지질, 폴리사카라이드 및 중합체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 종류의 에피토프를 포함함)에 결합하도록 디자인된다. 이 기술은 코팅된 이식물의 유용성을 확장한다는 장점을 가진다.
본 발명의 FIT-Ig 분자는 다양한 질환들을 치료하기 위해 치료 분자로서도 유용하다. 이러한 FIT-Ig 분자는 특정 질환에 관여하는 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다. 다양한 질환들에서 이러한 표적의 예는 이하에 기재되어 있다.
C5, CCL1(I-309), CCL11(에오탁신), CCL13(mcp-4), CCL15(MIP-1d), CCL16(HCC-4), CCL17(TARC), CCL18(PARC), CCL19, CCL2(mcp-1), CCL20(MIP-3a), CCL21(MIP-2), CCL23(MPIF-1), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2), CCL25(TECK), CCL26, CCL3(MIP-1a), CCL4(MIP-1b), CCL5(RANTES), CCL7(mcp-3), CCL8(mcp-2), CXCL1, CXCL10(IP-10), CXCL11(I-TAC/IP-9), CXCL12(SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5(ENA-78/LIX), CXCL6(GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13(mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1(CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1(내피 단핵구 활성화 사이토카인), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA-4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10(IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2 및 RNF110(ZNF144)을 포함하는 많은 단백질들은 일반적인 자가면역 및 염증성 반응과 관련되어 있다. 상기 나열된 표적들 중 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 FIT-Ig도 고려된다.
알레르기성 천식은 호산구증가증, 배상 세포 화생, 상피 세포 변경, 기도 과다반응성(AHR), 및 Th2 및 Th1 사이토카인 발현의 존재뿐만 아니라, 상승된 혈청 IgE 수준도 특징으로 한다. 기도 염증이 염증성 세포, 예컨대, T 세포, B 세포, 호산구, 비만 세포 및 대식세포, 및 사이토카인 및 케모카인을 포함하는 이들의 분비된 매개자의 복합 상호작용을 수반하는, 천식의 발병의 기저를 이루는 핵심 요인이라는 것은 현재 널리 인식되어 있다. 코르티코스테로이드는 오늘날 천식에 대한 가장 중요한 소염 치료제이나, 그의 작용 기작은 비특이적이고, 특히 소아 환자 집단에서 안전성 우려가 존재한다. 따라서, 보다 특이적이고 표적화된 요법의 개발이 필요하다. 마우스에서 IL-13이 호산구성 염증과 무관하게 AHR, 점막 과다분비 및 기도 섬유증을 포함하는, 천식의 특징들 중 많은 특징들을 모방한다는 것을 보여주는 증거가 증가하고 있다(Finotto et al., International Immunology (2005), 17(8), 993-1007; Padilla et al., Journal of Immunology (2005), 174(12), 8097-8105).
IL-13은 천식과 관련된 병리학적 반응을 야기하는 데 있어서 중추적인 역할을 하는 것으로서 암시되어 있다. 폐에서 IL-13의 효과를 감소시키는 항-IL-13 단일클론 항체 요법의 개발은 천식에 대한 신규 치료로서 상당한 기대를 제공하는 흥미로운 신규 방법이다. 그러나, 상이한 면역학적 경로의 다른 매개자들도 천식 발병에 관여할 수 있고, IL-13 이외에 이 매개자들의 차단은 추가 치료 이익을 제공할 수 있다. 이러한 표적 쌍은 IL-13 및 전구염증성 사이토카인, 예컨대, 종양 괴사 인자-α(TNF-α)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. TNF-α는 천식에서 염증성 반응을 증폭시킬 수 있고 질환 중증도와 연관될 수 있다(McDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31(New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250). 이것은 IL-13 및 TNF-α 둘 다의 차단이 특히 중증 기도 질환에서 유리한 효과를 가질 수 있다는 것을 암시한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 FIT-Ig는 표적 IL-13 및 TNFα에 결합하고 천식을 치료하는 데 사용된다.
염증 및 AHR 둘 다가 평가될 수 있는 동물 모델, 예컨대, OVA에 의해 유도된 천식 마우스 모델은 당분야에서 공지되어 있고 천식을 치료하는 다양한 FIT-Ig 분자들의 능력을 측정하는 데 사용될 수 있다. 천식을 연구하기 위한 동물 모델은 문헌(Coffman, et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1875-1879); 문헌(Lloyd, et al., Advances in Immunology (2001), 77, 263-295); 문헌(Boyce et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1869-1873); 및 문헌(Snibson, et al., Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology (2005), 35(2), 146-52)에 개시되어 있다. 이 표적 쌍들의 상용적인 안전성 평가 이외에 면역억제의 정도에 대한 특정 시험이 필요할 수 있고 가장 우수한 표적 쌍을 선택하는 데 도움을 줄 수 있다(문헌(Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43); 문헌(Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102); 및 문헌(Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257) 참조).
상기 개시된 근거에 기반을 두고 효능 및 안전성에 대한 동일한 평가 모델을 이용하여, FIT-Ig 분자에 결합될 수 있고 천식을 치료하는 데 유용할 수 있는 다른 표적 쌍을 확인할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 표적은 IL-13 및 IL-1베타(IL-1베타도 천식에서 염증성 반응에 관여함); IL-13, 및 염증에 관여하는 사이토카인 및 케모카인, 예컨대, IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-13 및 IL-25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MIF; IL-13 및 TGF-β; IL-13 및 LHR 아고니스트; IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; 및 IL-13 및 ADAM8을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명은 CSF1(MCSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, 히스타민 및 히스타민 수용체, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24, CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, 및 키티나제로 구성된 군으로부터 선택된, 천식에 관여하는 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 FIT-Ig도 고려한다.
전신 질환인 류마티스성 관절염(RA)은 관절의 활막 내에서의 만성 염증성 반응을 특징으로 하고 연골의 변성 및 관절곁 뼈의 부식과 관련되어 있다. TNF, 케모카인 및 성장 인자를 포함하는 많은 전구염증성 사이토카인들이 병든 관절에서 발현된다. RA 마우스 모델에게의 항-TNF 항체 또는 sTNFR 융합 단백질의 전신 투여는 소염성 및 관절 보호성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. RA 환자에서의 TNF의 활성이 정맥내로 투여된 인플릭시맙(infliximab)(키메라 항-TNF 단일클론 항체(mAB))에 의해 차단된 임상 연구(Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Summary of clinical trials in rheumatoid arthritis using infliximab, an anti-TNFalpha treatment. Ann Rheum Dis 58 Suppl 1:I61-4)는 TNF가 IL-6, IL-8, MCP-1 및 VEGF 생성, 관절 내로의 면역 및 염증성 세포의 집결, 혈관신생, 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-3의 혈액 수준의 감소를 조절한다는 것을 보여주는 증거를 제공하였다. 류마티스성 관절염에서의 염증성 경로의 보다 더 우수한 이해는 류마티스성 관절염에 관여하는 다른 치료 표적의 확인으로 이어졌다. 기대되는 치료제, 예컨대, 인터류킨-6 길항제(MRA)인 CTLA4Ig(아바타셉트(abatacept), Genovese Mc et al 2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition. N Engl J Med. 353:1114-23) 및 항-B 세포 요법(리툭시맙, Okamoto H, Kamatani N. 2004 Rituximab for rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 351:1909)은 지난 해에 걸쳐 무작위 대조 시험에서 이미 시험되었다. 인터류킨-15, 인터류킨-17 및 인터류킨-18을 포함하는 다른 사이토카인도 확인되었고 동물 모델에서 유익한 것으로 밝혀졌고, 이 물질들의 임상 시험은 현재 진행되고 있다. 항-TNF와 또 다른 매개자를 조합하는 이중특이적 항체 요법은 임상 효능 및/또는 환자 적용범위를 향상시키는 데 있어서 큰 잠재력을 가진다. 예를 들면, TNF 및 VEGF 둘 다의 차단은 RA의 병태생리학에 관여하는 염증 및 혈관신생을 잠재적으로 박멸시킬 수 있다. 특정 FIT-Ig Ig를 사용하여 TNF 및 IL-18; TNF 및 IL-12; TNF 및 IL-23; TNF 및 IL-1베타; TNF 및 MIF; TNF 및 IL-17; 및 TNF 및 IL-15를 포함하나 이들로 한정되지 않는, RA에 관여하는 다른 표적 쌍들을 차단하는 것도 고려된다. 이 표적 쌍들의 상용적인 안전성 평가 이외에, 면역억제의 정도에 대한 특정 시험이 필요할 수 있고 가장 우수한 표적 쌍을 선택하는 데 도움을 줄 수 있다(문헌(Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43); 문헌(Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102); 및 문헌(Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257) 참조). 임상전 동물 RA 모델, 예컨대, 콜라겐에 의해 유도된 관절염 마우스 모델을 이용하여 FIT-Ig Ig 분자가 류마티스성 관절염의 치료에 유용할 지를 평가할 수 있다. 다른 유용한 모델도 당분야에서 잘 공지되어 있다(문헌(Brand DD., Comp Med. (2005) 55(2):114-22) 참조).
전신 홍반 루푸스(SLE)의 면역병원적 특징은 과다글로불린혈증, 자가항체 생성 및 면역 복합체 형성을 유발하는 다중클론 B 세포 활성화이다. 근본적인 비정상은 일반화된 T 세포 조절이상으로 인해 T 세포가 금지된 B 세포 클론을 억제하지 못한다는 것인 듯하다. 추가로, B 세포 및 T 세포 상호작용은 여러 사이토카인들, 예컨대, IL-10에 의해 용이해질 뿐만 아니라, 제2 신호를 시작하는 보조자극 분자, 예컨대, CD40 및 CD40L, B7 및 CD28 및 CTLA-4에 의해서도 용이해진다. 면역 복합체 및 아폽토시스성 물질의 손상된 식세포 제거와 함께 이 상호작용은 면역 반응 및 그에 따른 조직 손상을 영속시킨다. 하기 표적들이 SLE에 관여할 수 있고 치료적 중재를 위한 FIT-Ig 방법을 위해 잠재적으로 사용될 수 있다: B 세포 표적화된 요법: CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGS1, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA 및 NT5E; 보조자극 신호: CTLA-4 또는 B7.1/B7.2; B 세포 생존의 억제: BlyS, BAFF; 보체 불활성화: C5; 사이토카인 조절: 핵심 원리는 임의의 조직에서 최종 생물학적 반응이 전구염증성 또는 소염성 사이토카인들의 국소 수준 사이의 균형의 결과라는 것이다(문헌(Sfikakis PP et al 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7) 참조). SLE는 혈청 IL-4, IL-6 또는 IL-10이 상승되는 것으로 입증된, Th-2에 의해 유도된 질환인 것으로 간주된다. IL-4, IL-6, IL-10, IFN-a 및 TNF-a로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 FIT-Ig Ig도 고려된다. 상기 논의된 표적들의 조합물은 다수의 루푸스 임상전 모델들에서 시험될 수 있는 SLE에 대한 치료 효능을 향상시킬 것이다(문헌(Peng SL (2004) Methods Mol Med.; 102:227-72) 참조).
다발성 경화증(MS)은 대부분 공지되어 있지 않은 병인을 가진 복잡한 인간 자가면역 유형 질환이다. 신경계 전체에 걸쳐 수초 염기성 단백질(MBP)의 면역학적 파괴는 다발성 경화증의 주요 병상이다. MS는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 침윤 및 중추신경계 내에서의 반응을 수반하는, 복잡한 병상의 질환이다. CNS에서의 사이토카인, 반응성 질소 종 및 보조자극제 분자의 발현은 모두 MS와 관련하여 기재되어 있다. 자가면역의 발생에 기여하는 면역학적 기작이 주요 고려사항이다. 특히, 항원 발현, 사이토카인 및 백혈구 상호작용, 및 다른 T 세포, 예컨대, Th1 및 Th2 세포의 균형/조절에 도움을 주는 조절 T 세포는 치료 표적 확인을 위해 중요한 연구분야이다.
IL-12는 APC에 의해 생성되고 Th1 이펙터 세포의 분화를 촉진하는 전구염증성 사이토카인이다. IL-12는 MS를 가진 환자의 발생 병변뿐만 아니라 EAE에 의해 영향을 받은 동물에서도 생성된다. IL-12 경로의 방해가 설치류에서 EAE를 효과적으로 방해하고 항-IL-12 mAb를 사용한 IL-12p40의 생체내 중화가 비단 마모셋에서 수초에 의해 유도된 EAE 모델에서 유리한 효과를 가진다는 것은 이미 확인되었다.
세포 유형에 따라 전구염증성, 증식성 또는 아폽토시스성 효과를 가진 TWEAK는 중추신경계(CNS)에서 항시적으로 발현되는, TNF 과의 구성원이다. 그의 수용체인 Fn14는 내피 세포, 반응성 성상교세포 및 신경에 의해 CNS에서 발현된다. TWEAK 및 Fn14 mRNA 발현은 실험 자가면역 뇌척수염(EAE) 동안 척수에서 증가되었다. C57BL/6 마우스에서 수초 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)에 의해 유도된 EAE의 항-TWEAK 항체 치료는 마우스가 프라이밍 단계 후 치료되었을 때 질환 중증도 및 백혈구 침윤을 감소시켰다.
본 발명의 한 양태는 IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFN감마, GM-CSF, FGF, C5, CD52 및 CCR2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상, 바람직하게는 2개의 표적들에 결합할 수 있는 FIT-Ig Ig 분자에 관한 것이다. 바람직한 실시양태는 MS의 치료에 유리한 치료제로서 이중특이적 항-IL-12/TWEAK FIT-Ig Ig를 포함한다. MS를 치료하기 위한 FIT-Ig 분자의 유용성을 평가하기 위한 여러 동물 모델들이 당분야에서 공지되어 있다(문헌(Steinman L, et al., (2005) Trends Immunol. 26(11):565-71); 문헌(Lublin FD., et al., (1985) Springer Semin Immunopathol. 8(3):197-208); 문헌(Genain CP, et al., (1997) J Mol Med. 75(3):187-97); 문헌(Tuohy VK, et al., (1999) J Exp Med. 189(7):1033-42); 문헌(Owens T, et al., (1995) Neurol Clin. 13(1):51-73); 및 문헌('t Hart BA, et al., (2005) J Immunol 175(7):4761-8) 참조). 이 표적 쌍들의 상용적인 안전성 평가 이외에, 면역억제의 정도에 대한 특정 시험이 필요할 수 있고 가장 우수한 표적 쌍을 선택하는 데 도움을 줄 수 있다(문헌(Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43); 문헌(Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102); 및 문헌(Jones R. 2000 Rovelizumab (ICOS Corp). IDrugs.3(4):442-6) 참조).
패혈증의 병태생리학은 그람 음성 유기체(리포폴리사카라이드[LPS], 지질 A, 내독소) 및 그람 양성 유기체(리포테이코산, 펩티도글리칸) 둘 다의 외부 막 성분들에 의해 시작된다. 이 외부 막 성분들은 단핵구의 표면의 CD14 수용체에 결합할 수 있다. 그 다음, 신호는 최근에 기재된 톨 유사 수용체에 의해 세포로 전달되어, 전구염증성 사이토카인 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파) 및 인터류킨-1(IL-I)의 궁극적인 생성을 유발한다. 압도적인 염증 및 면역 반응은 패혈증성 쇼크의 본질적인 특징이고 조직 손상, 다발성 장기 부전, 및 패혈증에 의해 유도된 사망의 발생에 있어서 중추적인 역할을 한다. 사이토카인, 특히 종양 괴사 인자(TNF) 및 인터류킨(IL)-1은 패혈증성 쇼크의 핵심적인 매개자인 것으로 확인되었다. 이 사이토카인들은 조직에 대한 직접적인 독성 효과를 갖고; 이들은 포스포리파제(phospholipase) A2도 활성화시킨다. 이 효과 및 다른 효과는 혈소판 활성화 인자의 농도 증가, 산화질소 합성효소(synthase) 활성의 촉진, 호중구에 의한 조직 침윤의 촉진 및 호중구 활성의 촉진을 유발한다.
패혈증 및 패혈증성 쇼크의 치료는 어려운 임상 문제로 남아있고, 염증성 반응을 목표로 한 생물학적 반응 변형제(즉, 항-TNF, 항-MIF)를 사용한 최근의 기대되는 시험은 그다지 대단하지 않은 임상 이익만을 보여주었다. 최근에, 동반되는 면역 억제의 시간을 되돌리는 것을 목표로 한 요법 쪽으로 관심이 옮겨지고 있다. 실험 동물 및 위독한 환자들의 연구는 림프 장기 및 일부 실질 조직들의 증가된 아폽토시스가 이 면역 억제, 아네르기(anergy) 및 장기 시스템 기능장애에 기여한다는 것을 입증하였다. 패혈증 증후군 동안, 림프구 아폽토시스는 IL-2의 부재, 또는 글루코코르티코이드, 그랜자임 또는 소위 '사멸' 사이토카인인 종양 괴사 인자 알파 또는 Fas 리간드의 방출에 의해 유발될 수 있다. 아폽토시스는 Bcl-2 과의 전구아폽토시스성 구성원 및 항-아폽토시스성 구성원에 의해 영향을 받을 수 있는, 세포질 및/또는 미토콘드리아 캐스파제의 자가-활성화를 통해 진행한다. 실험 동물에서, 아폽토시스의 억제제를 사용한 치료는 림프 세포 아폽토시스를 방해할 수 있을 뿐만 아니라; 결과를 개선할 수도 있다. 항-아폽토시스성 물질들을 사용한 임상 시험이 주로 그들의 투여 및 조직 표적화와 관련된 기술적 어려움으로 인해 요원한 상태로 남아있지만, 림프구 아폽토시스의 억제는 패혈증 환자를 위한 매력적인 치료 표적을 대표한다. 마찬가지로, 염증 매개자 및 아폽토시스 매개자 둘 다를 표적화하는 이중특이적 물질은 추가된 이익을 가질 수 있다. 본 발명의 한 양태는 TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, 톨 유사 수용체, TLR-4, 조직 인자, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL10, IL1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1A, CSF3, IL10, IL1B, IL6, ADORA2A, CCR3, IL10, IL1B, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, 미드카인, IRAK1, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1 및 TREM1로 구성된 군으로부터 선택된, 패혈증에 관여하는 하나 이상의 표적, 바람직하게는 2개의 표적들에 결합할 수 있는 FIT-Ig Ig에 관한 것이다. 패혈증에 대한 이러한 FIT-Ig Ig의 효능은 당분야에서 공지되어 있는 임상전 동물 모델에서 평가될 수 있다(문헌(Buras JA, et al.,(2005) Nat Rev Drug Discov. 4(10):854-65) 및 문헌(Calandra T, et al., (2000) Nat Med. 6(2):164-70) 참조).
만성 신경퇴행성 질환은 통상적으로 신경 기능의 점진적인 상실(신경 세포 사멸, 탈수초), 운동성의 상실 및 기억의 상실을 특징으로 하는 연령 의존적 질환이다. 만성 신경퇴행성 질환(예를 들면, 알츠하이머병)의 기저를 이루는 기작의 최근 지식은 복잡한 병인을 보여주고, 다양한 요인들, 예를 들면, 연령, 혈당증 상태, 아밀로이드 생성 및 다량체화, 그 자신의 수용체 RAGE(AGE에 대한 수용체)에 결합하는 진행된 당화반응 최종 생성물(AGE)의 축적, 증가된 뇌 산화 스트레스, 감소된 뇌 혈류, 염증성 사이토카인 및 케모카인의 방출을 포함하는 신경염증, 신경 기능장애 및 미세교세포 활성화가 상기 질환의 발생 및 진행에 기여하는 것으로 인식되어 있다. 따라서, 이 만성 신경퇴행성 질환은 다수의 세포 유형들과 매개자들 사이의 복잡한 상호작용을 나타낸다. 이러한 질환에 대한 치료 전략은 한정되고 주로 비특이적 소염제(예를 들면, 코르티코스테로이드, COX 억제제)를 사용한 염증 과정의 차단, 또는 신경 상실 및/또는 시냅스 기능을 방해하는 물질로 구성된다. 이 치료는 질환 진행을 중단시키지 못한다. 최근의 연구는 보다 더 표적화된 요법, 예컨대, 가용성 A-β 펩타이드(A-b 올리고머 형태를 포함함)에 대한 항체가 질환 진행을 중단시키는 것을 도울 수 있을 뿐만 아니라 기억을 유지하는 것도 도울 수 있다는 것을 암시한다. 이 예비적 관찰결과는 하나 초과의 질환 매개자(예를 들면, A-β 및 전구염증성 사이토카인, 예컨대, TNF)를 표적화하는 특정 요법이 단일 질환 기작(예를 들면, 가용성 A-β 단독)을 표적화하였을 때 관찰된 치료 효능보다 훨씬 더 우수한 만성 신경퇴행성 질환에 대한 치료 효능을 제공할 수 있다는 것을 암시한다(예를 들면, 문헌(C.E. Shepherd, et al, Neurobiol Aging. 2005 Oct 24); 문헌(Nelson RB., Curr Pharm Des. 2005; 11:3335); 문헌(William L. Klein.; Neurochem Int. 2002; 41:345); 문헌(Michelle C Janelsins, et al., J Neuroinflammation. 2005; 2:23); 문헌(Soloman B., Curr Alzheimer Res. 2004; 1:149); 문헌(Igor Klyubin, et al., Nat Med. 2005; 11:556-61); 문헌(Arancio O, et al., EMBO Journal (2004) 1-10); 문헌(Bornemann KD, et al., Am J Pathol. 2001; 158:63); 문헌(Deane R, et al., Nat Med. 2003; 9:907-13); 및 문헌(Eliezer Masliah, et al., Neuron. 2005;46:857) 참조).
본 발명의 FIT-Ig 분자는 만성 신경퇴행성 질환, 예컨대, 알츠하이머병에 관여하는 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다. 이러한 표적은 AD 발병에 관여하는 임의의 가용성 또는 세포 표면 매개자, 예를 들면, AGE(S100 A, 암포테린(amphoterin)), 전구염증성 사이토카인(예를 들면, IL-1), 케모카인(예를 들면, MCP 1), 신경 재생을 억제하는 분자(예를 들면, Nogo, RGM A), 및 신경돌기 성장을 향상시키는 분자(뉴로트로핀(neurotrophin))를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. FIT-Ig 분자의 효능은 임상전 동물 모델, 예컨대, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 RAGE를 과다발현하고 알츠하이머병 유사 증상을 발생시키는 형질전환 마우스에서 검증될 수 있다. 추가로, FIT-Ig 분자는 구축될 수 있고 동물 모델에서 효능에 대해 시험될 수 있고, 가장 우수한 치료 FIT-Ig는 인간 환자에서의 시험을 위해 선택될 수 있다. FIT-Ig 분자는 다른 신경퇴행성 질환, 예컨대, 파킨슨병의 치료를 위해 사용될 수도 있다. 알파-시누클레인(Synuclein)은 파킨슨 병리에 관여한다. 알파-시누클레인 및 염증성 매개자, 예컨대, TNF, IL-1, MCP-1을 표적화할 수 있는 FIT-Ig는 파킨슨병을 위한 효과적인 요법으로서 입증될 수 있고 본 발명에서 고려된다.
병리학적 기작의 지식이 증가함에도 불구하고, 척수 손상(SCI)은 여전히 치명적인 질환이고 높은 의료 수요를 특징으로 하는 의료 적응증을 대표한다. 대부분의 척수 손상은 좌상 또는 압박 손상이고 통상적으로 일차 손상이 일어난 후, 초기 손상을 악화시키고 병변 영역을 종종 10배 이상까지 유의미하게 확장시키는 이차 손상 기작(염증 매개자, 예를 들면, 사이토카인 및 케모카인)이 일어난다. SCI에서 이들 일차 기작 및 이차 기작은 다른 수단에 의해 야기된 뇌 손상, 예를 들면, 졸중의 일차 기작 및 이차 기작과 매우 유사한다. 만족스러운 치료는 존재하지 않고, 메틸프레드니솔론(MP)의 고용량 볼루스 주사가 손상 후 8시간의 좁은 시간대 내에서 유일하게 사용되는 요법이다. 그러나, 이 치료는 임의의 유의미한 기능적 회복을 야기하지 않으면서 이차 손상을 예방하기 위한 것일 뿐이다. 이 치료는 명확한 효능의 결여 및 심각한 부작용, 예컨대, 면역억제에 이은 감염 및 심각한 조직병리학적 근육 변경으로 인해 많은 비난을 받고 있다. 내생성 재생력을 자극하는 다른 약물, 생물제제 또는 소분자는 승인되어 있지 않으나, 기대되는 치료 원리 및 약물 후보는 최근에 SCI의 동물 모델에서 효능을 보였다. 대체로, 인간 SCI에서의 기능적 회복의 결여는 병변 부위, 흉터 조직, 수초 및 손상과 관련된 세포에서 신경돌기 성장을 억제하는 인자에 의해 야기된다. 이러한 인자는 수초 관련 단백질 NogoA, OMgp 및 MAG, RGM A, 흉터 관련 CSPG(콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸) 및 반응성 성상세포의 억제 인자(일부 세마포린 및 에프린)이다. 그러나, 병변 부위에서 성장 억제 분자가 발견되지 않을 뿐만 아니라 신경돌기 성장 자극 인자, 예컨대, 뉴로트로핀, 라미닌, L1 등도 발견되지 않는다. 신경돌기 성장 억제 및 성장 촉진 분자들의 이 앙상블은 억제 영향의 감소가 균형을 성장 억제로부터 성장 촉진으로 이동시킬 수 있기 때문에 단일 인자, 예컨대, NogoA 또는 RGM A의 차단이 설치류 SCI 모델에서 유의미한 기능적 회복을 야기하였다는 것을 설명할 수 있다. 그러나, 단일 신경돌기 성장 억제 분자를 차단하였을 때 관찰된 회복은 완전하지 않았다. 더 빠르고 더 현저한 회복을 달성하기 위해, 2개의 신경돌기 성장 억제 분자들, 예를 들면, Nogo 및 RGM A의 차단, 또는 신경돌기 성장 억제 분자, 예를 들면, Nogo의의 차단 및 신경돌기 성장 향상 분자, 예를 들면, 뉴로트로핀의 기능 향상, 또는 신경돌기 성장 억제 분자, 예를 들면, Nogo 및 전구염증성 분자, 예를 들면, TNF의 차단이 바람직할 수 있다(문헌(McGee AW, et al., Trends Neurosci. 2003; 26:193); 문헌(Marco Domeniconi, et al., J Neurol Sci. 2005; 233:43); 문헌(Milan Makwana1, et al., FEBS J. 2005; 272:2628); 문헌(Barry J. Dickson, Science. 2002; 298:1959); 문헌(Felicia Yu Hsuan Teng, et al., J Neurosci Res. 2005; 79:273); 문헌(Tara Karnezis, et al., Nature Neuroscience 2004; 7, 736); 및 문헌(Gang Xu, et al., J. Neurochem. 2004; 91; 1018) 참조).
고려되는 다른 FIT-Ig는 표적 쌍, 예컨대, NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; MAG 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; RGM A 및 RGM B; CSPGs 및 RGM A; 아그레칸, 미드카인, 뉴로칸, 버시칸, 포스파칸, Te38 및 TNF-a; 및 수상돌기 및 축삭돌기 발아를 촉진하는 항체와 조합된 Aβ 글로불로머(globulomer) 특이적 항체에 결합할 수 있는 FIT-Ig이다. 수상돌기 병리는 AD의 매우 초기 징후이고, NOGO A가 수상돌기 성장을 제한한다는 것은 공지되어 있다. 이러한 유형의 ab를 임의의 SCI 후보물질(수초-단백질) Ab와 조합할 수 있다. 다른 FIT-Ig 표적은 NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66(Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG 또는 Omgp의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 추가로, 표적은 신경돌기의 억제와 관련된 임의의 가용성 또는 세포 표면 매개자, 예를 들면, Nogo, Ompg, MAG, RGM A, 세마포린, 에프린, 가용성 A-b, 전구염증성 사이토카인(예를 들면, IL-1), 케모카인(예를 들면, MIP 1a), 신경 재생을 억제하는 분자도 포함할 수 있다. 항-nogo/항-RGM A 또는 유사한 FIT-Ig 분자의 효능은 척수 손상의 임상전 동물 모델에서 검증될 수 있다. 추가로, 이 FIT-Ig 분자는 구축될 수 있고 동물 모델에서 효능에 대해 시험될 수 있고, 가장 우수한 치료 FIT-Ig는 인간 환자에서의 시험을 위해 선택될 수 있다. 추가로, 단일 수용체, 예를 들면, 3개의 리간드 Nogo, Ompg 및 MAG에 결합하는 Nogo 수용체, 및 A-b 및 S100 A에 결합하는 MAG 및 RAGE의 2개 상이한 리간드 결합 부위들을 표적화하는 FIT-Ig 분자가 구축될 수 있다. 더욱이, 신경돌기 성장 억제제, 예를 들면, nogo 및 nogo 수용체는 면역학적 질환, 예컨대, 다발성 경화증에서 신경 재생을 방해하는 데 있어서도 역할을 한다. nogo-nogo 수용체 상호작용의 억제는 다발성 경화증의 동물 모델에서 회복을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 1개의 면역 매개자, 예를 들면, 사이토카인, 예컨대, IL-12 및 신경돌기 성장 억제제 분자, 예를 들면, nogo 또는 RGM의 기능을 차단할 수 있는 FIT-Ig 분자는 면역 또는 신경돌기 성장 억제제 분자 단독을 차단하는 것보다 더 빠르고 더 큰 효능을 제공할 수 있다.
단일클론 항체 요법은 암에 대한 중요한 치료법으로서 등장하였다(von Mehren M, et al 2003 Monoclonal antibody therapy for cancer. Annu Rev Med.; 54:343-69). 항체는 아폽토시스를 유도하거나, 세포독성의 방향을 바꾸거나, 리간드-수용체 상호작용을 방해하거나 신생물성 표현형에 매우 중요한 단백질의 발현을 방해함으로써 항종양 효과를 발휘할 수 있다. 추가로, 항체는 종양 미세환경의 성분을 표적화하여, 필수적인 구조, 예컨대, 종양 관련 혈관구조의 형성을 교란시킬 수 있다. 항체는 그의 리간드가 성장 인자인 수용체, 예컨대, 표피 성장 인자 수용체를 표적화할 수도 있다. 따라서, 항체는 세포 성장을 자극하는 천연 리간드가 표적화된 종양 세포에 결합하는 것을 방해한다. 대안적으로, 항체는 항-이디오타입 네트워크, 보체 매개 세포독성 또는 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있다. 2개의 별도 종양 매개자들을 표적화하는 이중특이적 항체의 사용은 단일특이적 요법에 비해 추가 이익을 제공할 가능성이 있을 것이다. 종양학적 질환을 치료하기 위해 하기 표적 쌍들에 결합할 수 있는 FIT-Ig Ig도 고려된다: IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; VEGFR 및 EGFR; CD20 및 CD3; CD138 및 CD20; CD38 및 CD20; CD38 및 CD138; CD40 및 CD20; CD138 및 CD40; 및 CD38 및 CD40. 다른 표적 조합물은 EGF/erb-2/erb-3 과의 하나 이상의 구성원을 포함한다. FIT-Ig Ig에 결합될 수 있는, 종양학적 질환에 관여하는 (하나 이상의) 다른 표적은 CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSF10, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, EGF, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1, IGF1R, IL2, VEGF, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, IL1A, IL1B, ODZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, ENO1, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NR0B1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1, CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1, CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROBO2, CD44, ILK, ITGA1, APC, CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT1, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB2IP, DES, DNCL1, ELAC2, ENO2, ENO3, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1, GGT1, GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PART1, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAI1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PROK2, SERPINF1, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1(E-캐드헤린), CDKN1B(p27Kip1), CDKN2A(p16INK4a), COL6A1, CTNNB1(b-카테닌), CTSB(카텝신 B), ERBB2(Her-2), ESR1, ESR2, F3(TF), FOSL1(FRA-1), GATA3, GSN(겔솔린), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST(당단백질 130), ITGA6(a6 인테그린), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7(c-Jun), MKI67(Ki-67), NGFB(NGF), NGFR, NME1(NM23A), PGR, PLAU(uPA), PTEN, CTLA-4, OX40, GITR, TIM-3, Lag-3, B7-H3, B7-H4, GDF8, CGRP, Lingo-1, ICOS, GARP, BTLA, CD160, ROR1, SERPINB5(마스핀), SERPINE1(PAI-1), TGFA, THBS1(트롬보스폰딘-1), TIE(Tie-1), TNFRSF6(Fas), TNFSF6(FasL), TOP2A(토포이소머라제 Iia), TP53, AZGP1(아연-a-당단백질), BPAG1(플렉틴), CDKN1A(p21Wap1/Cip1), CLDN7(클라우딘-7), CLU(클루스터린), ERBB2(Her-2), FGF1, FLRT1(피브로넥틴), GABRP(GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6(a6 인테그린), ITGB4(b 4 인테그린), KLF5(GC Box BP), KRT19(케라틴 19), KRTHB6(모발 특이적 II형 케라틴), MACMARCKS, MT3(메탈로티오넥틴-III), MUC1(뮤신), PTGS2(COX-2), RAC2(p21Rac2), S100A2, SCGB1D2(리포필린 B), SCGB2A1(맘마글로빈 2), SCGB2A2(맘마글로빈 1), SPRR1B(Spr1), THBS1, THBS2, THBS4 및 TNFAIP2(B94)로 구성된 군으로부터 선택된 표적들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공된 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있거나 진단될 수 있는 질환은 유방, 결장, 직장, 폐, 구강인두, 하인두, 식도, 위, 췌장, 간, 담낭 및 담관, 소장, 요로(신장, 방광 및 요로상피를 포함함), 여성 생식관(자궁경부, 자궁 및 난소뿐만 아니라, 융모막암종 및 임신 영양막 질환도 포함함), 남성 생식관(전립선, 정낭, 정소 및 생식 세포 종양을 포함함), 내분비선(갑상선, 부신 및 뇌하수체를 포함함) 및 피부의 암종뿐만 아니라, 혈관종, 흑색종, 육종(뼈 및 연조직으로부터 발생하는 육종뿐만 아니라 카포시 육종도 포함함), 뇌, 신경, 눈 및 뇌척수막의 종양(성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경모세포종, 신경초종 및 뇌수막종을 포함함), 조혈 악성종양, 예컨대, 백혈병으로부터 발생하는 고형 종양, 및 림프종(호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종 둘 다)을 포함하는 원발성 암 및 전이성 암을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 단독으로 사용되거나 방사선요법 및/또는 다른 화학요법제와 함께 사용될 때 암을 치료하거나 본원에 기재된 종양으로부터의 전이를 예방하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 인간 면역 이펙터 세포는 인간 림프 세포 계통의 구성원이다. 이 실시양태에서, 이펙터 세포는 유리하게는 인간 T 세포, 인간 B 세포 또는 인간 천연 킬러(NK) 세포일 수 있다. 유리하게는, 이러한 세포는 표적 세포에 대한 세포독성 또는 아폽토시스 효과를 가질 것이다. 특히 유리하게는, 인간 림프 세포는 활성화되었을 때 표적 세포에 대한 세포독성 효과를 발휘하는 세포독성 T 세포이다. 그 다음, 이 실시양태에 따르면, 인간 이펙터 세포의 집결된 활성은 이 세포의 세포독성 활성이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 세포독성 T 세포의 활성화는 본 발명의 이 실시양태의 이중특이적 항체에 의한 세포독성 T 세포의 표면의 이펙터 항원으로서 CD3 항원의 결합을 통해 일어날 수 있다. 인간 CD3 항원은 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포 둘 다에 존재한다. 인간 CD3은 다중분자 T 세포 복합체의 부분으로서 T 세포에서 발현되고 3개의 상이한 쇄들, 즉 CD3-엡실론, CD3-델타 및 CD3-감마를 포함하는 항원을 의미한다.
T 세포의 세포독성 잠재력의 활성화는 다수의 단백질들의 상호작용을 요구하는 복잡한 현상이다. T 세포 수용체("TCR") 단백질은 2개의 상이한 당단백질 서브유닛들로 구성된 막 결합된 디설파이드-연결된 이종이량체이다. TCR은 그 자체가 주조직적합성 복합체("MHC") 단백질의 고도로 다양한 클래스의 구성원에 의해 결합되고 항원 제시 세포("APC")의 표면 위에서 MHC에 결합된 상태로 제시되는 외래 펩타이드성 항원을 인식하고 이 항원에 결합한다.
가변 TCR이 상기 요약된 바와 같이 외래 항원에 결합할지라도, 이 결합이 일어난 T 세포로의 신호전달은 상기 TCR과 회합된 다른 불변 신호전달 단백질의 존재에 의존한다. 회합된 형태에서 이 신호전달 단백질은 CD3 복합체로서 총칭되고, 여기서 CD3 항원으로서 총칭된다.
그 다음, T 세포 세포독성의 활성화는 우선 통상적으로 별도의 세포에 위치하는, 그 자체가 외래 항원에 결합된 MHC 단백질과 TCR의 결합에 의존한다. 이 초기 TCR-MHC 결합이 일어난 유일한 때는 T 세포 클론 증폭을 담당하는 CD3 의존적 신호전달 캐스케이드일 수 있고, 궁극적으로 T 세포 세포독성이 뒤따른다.
그러나, 본 발명의 이중특이적 항체의 제1 또는 제2 부분에 의한 인간 CD3 항원의 결합은 독립적인 TCR-MHC 결합의 부재 하에서 T 세포를 활성화시켜 다른 세포에 대한 세포독성 효과를 발휘한다. 이것은 T 세포가 클론 독립적 방식으로, 즉 T 세포에 의해 운반되는 특정 TCR 클론과 무관한 방식으로 세포독성학적으로 활성화될 수 있다는 것을 의미한다. 이것은 특정 클론 정체성의 특정 T 세포만의 활성화보다는 오히려 전체 T 세포 구획의 활성화를 가능하게 한다.
상기 논의에 비추어 볼 때, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 이펙터 항원이 인간 CD3 항원인 이중특이적 항체를 제공한다. 본 발명의 이 실시양태에 따른 이중특이적 항체는 총 2개 또는 3개의 항체 가변 도메인들을 가질 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 본 발명의 이중특이적 항체에 의해 결합되는 다른 림프 세포 관련 이펙터 항원은 인간 CD16 항원, 인간 NKG2D 항원, 인간 NKp46 항원, 인간 CD2 항원, 인간 CD28 항원 또는 인간 CD25 항원일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 인간 이펙터 세포는 인간 골수 계통의 구성원이다. 유리하게는, 이펙터 세포는 인간 단핵구, 인간 호중구성 과립구 또는 인간 수지상 세포일 수 있다. 유리하게는, 이러한 세포는 표적 세포에 대한 세포독성 또는 아폽토시스성 효과를 가질 것이다. 본 발명의 이중특이적 항체에 의해 결합될 수 있는, 이 실시양태 내의 유리한 항원은 인간 CD64 항원 또는 인간 CD89 항원일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 표적 항원은 질환 상태에서는 표적 세포 또는 이펙터 세포에서 독특하게 발현되나, 건강한 상태에서 발현되지 않거나 낮은 수준으로 발현되거나 접근불가능한 상태로 남아 있는 항원이다. 본 발명의 이중특이적 항체에 의해 특이적으로 결합될 이러한 표적 항원의 예는 유리하게는 EpCAM, CCR5, CD19, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1(뮤신), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, βhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, 강글리오사이드(ganglioside) GD3, 9-O-아세틸-GD3, GM2, Globo H, 푸코실(fucosyl) GM1, 폴리 SA, GD2, 카보안하이드라제(Carboanhydrase) IX(MN/CA IX), CD44v6, 소닉 헤지호그(Sonic Hedgehog)(Shh), Wue-1, 형질 세포 항원, (막에 결합된) IgE, 흑색종 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), CCR8, TNF-알파 전구체, STEAP, 메소텔린(mesothelin), A33 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), Ly-6; 데스모글레인(desmoglein) 4, E-캐드헤린 신생에피토프, 태아 아세틸콜린 수용체, CD25, CA19-9 마커, CA-125 마커 및 뮬러리안(Muellerian) 억제 물질(MIS) 수용체 II형, sTn(시알릴화된 Tn 항원; TAG-72), FAP(섬유모세포 활성화 항원), 엔도시알린(endosialin), EGFRvIII, LG, SAS 및 CD63으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 이중특이적 항체에 의해 특이적으로 결합되는 표적 항원은 암 관련 항원, 예를 들면, 악성 상태와 관련된 항원일 수 있다. 이러한 항원은 악성 세포에서 발현되거나 접근가능한 반면, 상기 항원은 비-악성 세포에 존재하지 않거나, 유의미하게 존재하지 않거나 접근가능하지 않다. 따라서, 본 발명의 이 실시양태에 따른 이중특이적 항체는 표적 항원을 보유하거나 표적 항원을 접근가능하게 만드는 악성 표적 세포에 대한 인간 면역 이펙터 세포의 활성을 집결시키는 이중특이적 항체이다.
유전자 요법: 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 결합 단백질 또는 본원에서 제공된 또 다른 예방제 또는 치료제를 코딩하는 핵산 서열은 유전자 요법에 의해 투여되어, 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 관리하거나 완화시킨다. 유전자 요법은 발현되거나 발현될 수 있는 핵산을 대상체에게 투여함으로써 수행되는 요법을 지칭한다. 이 실시양태에서, 핵산은 예방 또는 치료 효과를 매개하는, 본원에서 제공된 그의 코딩된 항체, 예방제 또는 치료제를 생성한다.
당분야에서 이용될 수 있는 유전자 요법을 위한 방법들 중 임의의 방법이 본원에서 제공된 방법에서 이용될 수 있다. 유전자 요법의 방법에 대한 일반적인 검토를 위해서는 문헌(Goldspiel et al. (1993) Clin. Pharmacy 12:488-505); 문헌(Wu and Wu (1991) Biotherapy 3:87-95); 문헌(Tolstoshev (1993) Ann Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596); 문헌(Mulligan (1993) Science 260:926-932); 문헌(Morgan and Anderson (1993) Ann Rev. Biochem. 62:191-217); 및 문헌(May (1993) TIBTECH 11(5):155-215)을 참조한다. 이용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에서 통상적으로 공지되어 있는 방법은 문헌(Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993)); 및 문헌(Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990))에 기재되어 있다. 유전자 요법의 다양한 방법들의 상세한 설명은 미국 특허 공보 제20050042664호에 개시되어 있다.
진단: 본원의 개시는 진단 어세이 방법, 하나 이상의 결합 단백질을 함유하는 진단 키트, 및 자동화된 시스템 및/또는 반자동화된 시스템에서 사용하기 위한 상기 방법 및 키트의 개조를 포함하나 이들로 한정되지 않는 진단 적용도 제공한다. 제공된 방법, 키트 및 개조는 개체에서 질환 또는 장애의 검출, 모니터링 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 이것은 이하에 더 설명되어 있다.
A. 어세이의 방법: 본 개시는 본원에 기재된 적어도 하나의 결합 단백질을 사용하여 시험 샘플에서 분석물 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 확인하는 방법도 제공한다. 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 어세이가 이 방법에서 이용될 수 있다. 예로는 면역어세이 및/또는 질량 분광측정을 이용하는 방법이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 본 개시에 의해 제공된 면역어세이는 특히 샌드위치 면역어세이, 방사면역어세이(RIA), 효소 면역어세이(EIA), 효소-연결된 면역흡착 어세이(ELISA), 경쟁-억제 면역어세이, 형광 편광 면역어세이(FPIA), 효소 증대된 면역어세이 기법(EMIT), 생체발광 공명 에너지 전달(BRET) 및 균일 화학발광 어세이를 포함할 수 있다. 화학발광 미세입자 면역어세이, 특히 ARCHITECT® 자동화된 분석기(애보트 래보러토리스(Abbott Laboratories), 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하는 화학발광 미세입자 면역어세이는 면역어세이의 일례이다. 질량 분광측정을 이용하는 방법은 본 개시에 의해 제공되고, MALDI(매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화) 또는 SELDI(표면-향상된 레이저 탈착/이온화)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
면역어세이 및 질량 분광측정을 이용하여 생물학적 시험 샘플을 수집하고 취급하고 프로세싱하고 분석하는 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있을 것이고 본 개시의 실시를 위해 제공된다(미국 특허 공보 제2009-0311253호(A1)).
B. 키트: 시험 샘플 중의 분석물 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도에 대해 시험 샘플을 분석하기 위한 키트도 제공된다. 이 키트는 분석물 또는 이의 단편에 대해 시험 샘플을 분석하기 위한 적어도 하나의 구성요소, 및 분석물 또는 이의 단편에 대해 시험 샘플을 분석하기 위한 설명서를 포함한다. 분석물 또는 이의 단편에 대해 시험 샘플을 분석하기 위한 적어도 하나의 구성요소는 임의적으로 고체 상에 고정되어 있는, 본원에 개시된 결합 단백질 및/또는 항-분석물 결합 단백질(또는 이의 단편, 변이체, 또는 변이체의 단편)을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 임의적으로, 상기 키트는 단리된 또는 정제된 분석물을 포함할 수 있는 캘리브레이터(calibrator) 또는 대조군을 포함할 수 있다. 상기 키트는 면역어세이 및/또는 질량 분광측정으로 분석물에 대해 시험 샘플을 분석하기 위한 적어도 하나의 구성요소를 포함할 수 있다. 분석물, 결합 단백질 및/또는 항-분석물 결합 단백질, 또는 이들의 단편을 포함하는 키트 구성요소는 당분야에서 공지되어 있는 임의의 검출가능한 표지를 사용함으로써 임의적으로 표지될 수 있다. 본 개시의 실시를 위해 제공된 생물 물질 및 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있을 것이다(미국 특허 공보 제2009-0311253호(A1)).
C. 키트 및 방법의 개조: 어세이, 예컨대, 본원에 기재된 면역어세이로 시험 샘플에서 분석물의 존재, 양 또는 농도를 확인하는 키트(또는 이의 구성요소) 및 방법은 예를 들면, 미국 특허 제5,089,424호 및 제5,006,309호에 기재되어 있고, 예를 들면, 애보트 래보러토리스(일리노이주 애보트 파크 소재)에 의해 ARCHITECT®로서 시판되는 다양한 자동화된 시스템들 및 반자동화된 시스템들(미세입자를 포함하는 고체 상을 가진 시스템을 포함함)에서 사용되도록 개조될 수 있다. 애보트 래보러토리스로부터 입수될 수 있는 다른 플랫폼은 AxSYM®, IMx®(예를 들면, 미국 특허 제5,294,404호 참조), PRISM®, EIA(bead) 및 Quantum™ II뿐만 아니라 다른 플랫폼도 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 어세이, 키트 및 키트 구성요소는 예를 들면, 전기화학적 또는 다른 소형 또는 현장현시(point-of-care) 어세이 시스템에서 다른 포맷으로 이용될 수 있다. 본 개시는 예를 들면, 샌드위치 면역어세이를 수행하는 상업용 애보트 현장현시(i-STAT®, 애보트 래보러토리스) 전기화학적 면역어세이 시스템에 적용될 수 있다. 1회용 시험 디바이스에서 면역센서 및 이의 제조 및 작동 방법은 예를 들면, 미국 특허 제5,063,081호, 제7,419,821호 및 제7,682,833호; 및 미국 특허 공보 제20040018577호, 제20060160164호 및 제20090311253호에 기재되어 있다. 본원에 기재된 방법의 다른 적합한 변형 및 개조가 자명하고 본원에 개시된 실시양태의 범위를 벗어나지 않으면서 적합한 등가물을 사용함으로써 만들어질 수 있다는 것은 당분야에서 숙련된 자에게 용이하게 분명할 것이다. 일부 실시양태들이 상세히 기재되어 있지만, 이들은 예증 목적만을 위해 포함되고 한정하기 위한 것이 아닌 하기 실시예들을 참고함으로써 더 명확히 이해될 것이다.
상기 발명은 명료한 이해를 목적으로 예증 및 예에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명을 일부 변화시킬 수 있거나 변형시킬 수 있다는 것은 본 발명의 교시에 비추어 볼 때 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 용이하게 명확할 것이다. 하기 실시예는 예증으로만 제공되고 한정으로 제공되지 않는다. 당분야에서 숙련된 자는 본질적으로 유사한 결과를 생성하기 위해 변화될 수 있거나 변형될 수 있는 다양한 비-임계적 파라미터들을 용이하게 인식할 것이다.
실시예
실시예 1. 항-IL17/IL-20 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 구축, 발현, 정제 및 분석
FIT-Ig 기술을 입증하기 위해, 본 발명자들은 일군의 항-IL-17/IL-20 FIT-Ig 분자들을 생성하였다: FIT1-Ig, FIT2-Ig 및 FIT3-Ig, 이들 모두는 도 1에 나타낸 바와 같이 3개의 상이한 폴리펩타이드들을 함유하고, 이때 항원 A는 IL-17이고 항원 B는 IL-20이다. IL-17 및 IL-20에 결합할 수 있는 FIT-Ig를 생성하는 데 사용된 DNA 구축물은 도 1b에 예시되어 있다. 요약하건대, 모 mAb는 2개의 높은 친화성 항체들, 즉 항-IL-17(클론 LY)(미국 특허 제7,838,638호) 및 항-hIL-20(클론 15D2)(미국 특허출원 공보 제2014/0194599호)을 포함하였다. FIT-Ig 구축물 #1을 생성하기 위해, LY의 VL-CL을 15D2 중쇄의 N-말단에 직접적으로(FIT1-Ig), 또는 3개 아미노산(FIT2-Ig) 또는 7개 아미노산(FIT3-Ig) 링커를 통해 융합시켰다(표 1에 나타냄). 구축물 #2는 LY의 VH-CH1이고, 제3 구축물은 15D2의 VL-CL이다. 각각의 FIT-Ig에 대한 3개의 구축물들을 293 세포에 공-형질감염시켜, FIT-Ig 단백질을 발현시키고 분비시켰다.
본 발명자들은 일군의 항-IL-17/IL-20 FIT-Ig 분자들도 생성하였다: FIT4-Ig, FIT5-Ig 및 FIT6-Ig, 이들 각각은 도 2에 나타낸 바와 같이 2개의 상이한 폴리펩타이드들을 함유한다. IL-17 및 IL-20에 결합할 수 있는 FIT-Ig를 생성하는 데 사용된 DNA 구축물은 도 2b에 예시되어 있고, 이때 항원 A는 IL-17이고, 항원 B는 IL-20이다. 요약하건대, 모 mAb는 2개의 높은 친화성 항체들, 즉 항-IL-17(클론 LY) 및 항-hIL-20(클론 15D2)을 포함하였다. FIT-Ig 구축물 #1을 생성하기 위해, LY의 VL-CL을 15D2 중쇄의 N-말단에 직접적으로(FIT4-Ig), 또는 3개 아미노산(FIT5-Ig) 또는 7개 아미노산(FIT6-Ig) 링커를 통해 융합시켰다(표 1에 나타냄). FIT-Ig 구축물 #4를 생성하기 위해, LY의 VH-CH1을 15D2 경쇄의 N-말단에 직접적으로(FIT4-Ig), 또는 3개 아미노산(FIT5-Ig) 또는 7개 아미노산(FIT6-Ig) 링커를 통해 융합시켰다. 각각의 FIT-Ig에 대한 2개의 DNA 구축물들(구축물 #1 및 #4)을 293 세포에 공-형질감염시켜, FIT-Ig 단백질을 발현시키고 분비시켰다. PCR 클로닝의 상세한 절차는 이하에 기재되어 있다.
실시예 1.1: 항-IL-17/IL-20 FIT-Ig 분자의 분자 클로닝:
구축물 #1 클로닝을 위해, 경쇄 신호 서열에서의 정방향 프라이머 어닐링 및 경쇄의 C-말단에서의 역방향 프라이머 어닐링을 이용하여 PCR로 LY 경쇄를 증폭하였다. 15D2 VH의 N-말단에서의 정방향 프라이머 어닐링 및 CH의 C-말단에서의 역방향 프라이머 어닐링을 이용하여 PCR로 15D2 중쇄를 증폭하였다. 이들 2개의 PCR 단편들을 겔 정제하였고 신호 펩타이드 및 CH 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR로 조합하였다. 조합된 PCR 생성물을, 인간 Fc 서열을 이미 함유하는 293 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
Figure 112018086445842-pct00012
구축물 #2 클로닝을 위해, 중쇄 신호 펩타이드에서의 정방향 프라이머 어닐링 및 CH1의 C-말단에서의 역방향 프라이머 어닐링을 이용하여 PCR로 LY VH-CH1을 증폭하였다. 293 발현 벡터 내로 클로닝하기 전에 PCR 생성물을 겔 정제하였다.
구축물 #3의 경우, 경쇄 신호 펩타이드의 N-말단에서의 정방향 프라이머 어닐링 및 CL의 말단에서의 역방향 프라이머 어닐링을 이용하여 PCR로 15D2 경쇄를 증폭하였다. 293 발현 벡터 내로 클로닝하기 전에 PCR 생성물을 겔 정제하였다.
구축물 #4 클로닝을 위해, 중쇄 신호 펩타이드의 N-말단에서의 정방향 프라이머 어닐링 및 CH1의 말단에서의 역방향 프라이머 어닐링을 이용하여 PCR로 LY VH-CH1을 증폭하였다. 15D2 VL의 말단에서의 프라이머 어닐링을 이용하여 15D2 VL을 증폭하였다. PCR 생성물들 둘 다를 겔 정제하고 중첩 PCR로 조합하였다. 조합된 PCR 생성물을 겔 정제하고 293 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 표 2는 상기 분자 클로닝을 위해 사용된 PCR 프라이머들의 서열을 보여준다.
Figure 112018086445842-pct00013
hIL-17/hIL-20 FIT1-Ig, FIT2-Ig, FIT3-Ig, FIT4-Ig, FIT5-Ig 및 FIT6-Ig의 최종 서열은 표 3에 나열되어 있다.
Figure 112018086445842-pct00014
Figure 112018086445842-pct00015
Figure 112018086445842-pct00016
Figure 112018086445842-pct00017
Figure 112018086445842-pct00018
Figure 112018086445842-pct00019
Figure 112018086445842-pct00020
실시예 1.2: 항-IL-17/IL-20 FIT-Ig 단백질의 발현, 정제 및 분석:
각각의 FIT-Ig의 모든 DNA 구축물들을 pBOS 기반 벡터 내로 서브클로닝하고 시퀀싱하여 정확성을 보장하였다. 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 각각의 FIT-Ig(1, 2 및 3)의 구축물 #1, #2 및 #3, 또는 각각의 FIT-Ig(4, 5 및 6)의 구축물 #1 및 #4를 293E 세포에서 일시적으로 공-발현시켰다. 요약하건대, FreeStyle™ 293 발현 배지에서 1:2의 DNA 대 PEI 최종 농도 비로 DNA를 PEI와 혼합하였고 실온에서 15분(20분 이하) 동안 항온처리한 후, 60 ㎍ DNA/120 ㎖ 배양물의 농도로 293E 세포(1.0X106/㎖ 내지 1.2X106/㎖, 세포 생존율 > 95%)에 첨가하였다. 진탕기에서 6시간 내지 24시간 동안 배양한 후, 125 rpm/분, 37℃ 및 8% CO2에서 진탕하면서 펩톤을 5%의 최종 농도로 형질감염된 세포에 첨가하였다. 6일째 날 또는 7일째 날, 상청액을 원심분리 및 여과로 수거하였고, 제조자의 설명서에 따라 단백질 A 크로마토그래피(피어스(Pierce), 일리노이주 록포드 소재)를 이용하여 FIT-Ig 단백질을 정제하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였고 그의 농도를 A280 및 BCA(피어스, 일리노이주 록포드 소재)로 측정하였다.
FIT1-Ig, FIT2-Ig 및 FIT3-Ig의 발현을 위해, 구축물 #1:#2:#3 = 1:1:1, 구축물 #1:#2:#3 = 1:1.5:1.5, 및 구축물 #1:#2:#3 = 1:3:3(표 4)을 포함하는 상이한 DNA 몰 비의 3개의 구축물들을 사용하였다. FIT-Ig 단백질을 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 정제 수율(7 내지 16 mg/ℓ)은 각각의 단백질에 대한 발현 배지의 hIgG 정량과 일치하였다. 정제된 FIT-Ig의 조성 및 순도를 환원 조건 및 비-환원 조건 둘 다에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 비-환원 조건에서, FIT-Ig는 대략 250 KDa의 단일 밴드로서 이동하였다. 환원 조건에서, 각각의 FIT-Ig 단백질은 2개의 밴드를 생성하였는데, 1개의 보다 더 높은 MW 밴드는 대략 75 KDa의 구축물 #1이고, 1개의 보다 더 낮은 MW 밴드는 대략 25 KDa에서 중첩된 구축물 #2 및 #3 둘 다에 상응한다. SDS-PAGE는 각각의 FIT-Ig가 단일 종으로서 발현되고 3개의 폴리펩타이드 쇄들이 효율적으로 쌍을 이루어 IgG 유사 분자를 형성한다는 것을 보여주었다. 쇄의 크기뿐만 아니라 FIT-Ig 분자의 전체 길이 단백질의 크기도 아미노산 서열에 근거한 그들의 계산된 분자 질량과 일치한다.
Figure 112018086445842-pct00021
용액에서의 FIT-Ig의 물리적 성질을 더 연구하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 각각의 단백질을 분석하였다. FIT-Ig의 SEC 분석을 위해, PBS 중의 정제된 FIT-Ig를 TSKgel SuperSW3000, 300x4.6 mm 컬럼(TOSOH)에 적용하였다. SEC를 위해 HPLC 기계인 모델 U3000(DIONEX)을 이용하였다. 280 nm 및 214 nm에서의 UV 검출을 이용하여 모든 단백질들을 확인하였다. 용출은 0.25 ㎖/분의 유속에서 등용매 용출이었다. 모든 3개의 FIT-Ig 단백질들은 단일 주 피크를 나타내었는데, 이것은 단량체 단백질로서의 물리적 균질성을 입증한다(표 4). 구축물 #1:#2:#3의 비 = 1:3:3은 모든 3개의 FIT-Ig 단백질들에 대해 SEC에 의한 보다 더 우수한 단량체 프로파일을 보였다(표 4).
표 4는 모든 FIT-Ig 단백질들의 발현 수준이 통상의 mAb의 발현 수준에 필적할만하다는 것도 보여주는데, 이것은 FIT-Ig가 포유동물 세포에서 효율적으로 발현될 수 있다는 것을 시사한다. FIT4-Ig, FIT5-Ig 및 FIT6-Ig의 발현의 경우, 구축물 #1:#4의 DNA 비는 1:1이었고, 발현 수준은 1 내지 10 mg/ℓ의 범위 내에 있었고, SEC에 의해 측정된 % 피크 단량체 비율은 58% 내지 76%의 범위 내에 있었다. 이 특정 mAb 조합물(LY 및 15D2)에 근거할 때, 3-폴리펩타이드 FIT-Ig 구축물들(FIT1-Ig, FIT2-Ig 및 FIT3-Ig)은 2-폴리펩타이드 FIT-Ig 구축물들(FIT4-Ig, FIT5-Ig 및 FIT6-Ig)의 발현 프로파일보다 더 우수한 발현 프로파일을 보였으므로, FIT1-Ig, FIT2-Ig 및 FIT3-Ig를 기능적 성질에 대해 더 분석하였다.
실시예 1.3: 항-IL-17/IL-20 FIT-Ig의 항원 결합 친화성의 측정
rhIL-17 및 rhIL-20에 결합하는 FIT-Ig의 동력학을 25℃에서 HBS-EP(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.005% 계면활성제 P20)를 사용하여 비아코어 X100 기계(비아코어 아베(Biacore AB), 스웨덴 업살라 소재)를 이용한 표면 플라스몬 공명(표 5)으로 측정하였다. 요약하건대, 제조자의 설명서에 따라 표준 아민 커플링 키트를 사용하여 염소 항-인간 IgG Fcγ 단편 특이적 다중클론 항체(피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology Inc), 일리노이주 록포드 소재)를 CM5 연구 등급 바이오센서 칩 전체에 직접적으로 고정시켰다. 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 반응 표면 전체에서 포획하기 위해 정제된 FIT-Ig 샘플을 HEPES-완충된 식염수로 희석하고 5 ㎕/분의 유속으로 반응 매트릭스 위에 주사하였다. 결합 속도 상수 및 해리 속도 상수인 kon(M-1s-1) 및 koff(s-1)를 30 ㎕/분의 연속적인 유속 하에서 측정하였다. 1.25 내지 1000 nM의 10개 상이한 항원 농도에서 동력학적 결합 측정을 수행함으로써 속도 상수를 유도하였다. 그 다음, FIT-Ig와 표적 단백질 사이의 반응의 평형 해리 상수(M)를 하기 식으로 동력학적 속도 상수로부터 계산하였다: KD = koff/kon. 임의의 비특이적 결합 배경을 기록하고 공제하여 대부분의 굴절 지수 변화 및 주사 노이즈(noise)를 제거하기 위해 항원 샘플의 분취액도 블랭크 기준물 및 반응 CM 표면 위에 동시적으로 주사하였다. 10 ㎕/분의 유속으로 25 ㎖의 10 mM 글리신(pH 1.5)을 2회 후속 주사하여 표면을 재생시켰다. 항-Fc 항체가 고정된 표면은 완전히 재생되었고 12 주기에 걸쳐 그의 전체 포획 성능을 보유하였다.
Figure 112018086445842-pct00022
비아코어 분석은 hIL-17 및 hIL-20에 대한 3개의 FIT-Ig들의 전체 결합 파라미터가 유사하고, 이때 FIT-Ig의 친화성이 모 mAb LY 및 15D2의 친화성과 매우 유사하고, 항원 결합 도메인들 중 어느 한 항원 결합 도메인에 대한 결합 친화성의 상실이 없다는 것을 시사하였다(표 5).
추가로, FIT-Ig의 4가 이중특이적 항원 결합도 비아코어로 분석하였다. 먼저 비아코어 센서 칩의 염소 항-인간 Fc 항체를 통해 FIT1-Ig를 포획하였고, 제1 항원을 주사하였고 결합 신호를 관찰하였다. FIT1-Ig가 제1 항원에 의해 포화되었기 때문에, 제2 항원을 그 다음 주사하였고 제2 신호를 관찰하였다. 이것은 FIT2-Ig의 경우 IL-17을 먼저 주사한 후 IL-20을 주사하였거나, IL-20을 먼저 주사한 후 IL-17을 주사함으로써 수행되었다(도 3). 어느 순서로도 이중 결합 활성이 검출되었고, 항원 결합 둘 다가 25 내지 30 RU에서 포화되었다. FIT2-Ig 및 FIT3-Ig에 대한 유사한 결과를 수득하였다. 따라서, 각각의 FIT-Ig는 이중특이적 4가 분자로서 동시적으로 상기 항원들 둘 다에 결합할 수 있었다.
FIT-Ig의 발현 프로파일 및 이중 결합 성질은 FIT-Ig 분자 내에서 VL-CL 둘 다가 그들의 상응하는 VH-CH1과 정확히 쌍을 이루어 2개의 기능적 결합 도메인들을 형성하였고, 단일 단량체 4가 이중특이적 전체 길이 FIT-Ig 단백질로서 발현되었다는 것을 명확히 입증하였다. 이것은 1개의 표적 항원에 대한 4가 단일특이적 결합 활성을 나타낸 다가 항체 유형의 분자와 대조된다(Miller and Presta, 미국 특허 제8722859호).
실시예 1.4: 항-IL-17/IL-20 FIT-Ig의 생물학적 활성의 측정
GROα 바이오어세이를 이용하여 IL-17 기능을 중화시키는 FIT-Ig의 생물학적 활성을 측정하였다. 요약하건대, Hs27 세포를 96-웰 플레이트 내에 10000개 세포/50 ㎕/웰로 시딩하였다. 2.5 nM의 농도에서 출발한 후 5 pM까지 1:2 연속 희석하면서 FIT-Ig 또는 항-IL-17 대조군 항체(25 ㎕)를 이중 웰에 첨가하였다. 그 다음, IL-17A(25 ㎕)를 각각의 웰에 첨가하였다. IL-17A의 최종 농도는 0.3 nM이었다. 세포 배양 상청액을 수거하기 전에 세포를 17시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 세포 배양 상청액 중의 GRO-α의 농도를 제조자의 프로토콜(R&D 시스템스(Systems))에 따라 인간 CACL1/GRO 알파 콴티카인(Quantikine) 키트로 측정하였다.
IL-20R+ BAF3 세포 증식 어세이를 이용하여 IL-20 기능을 중화시키는 FIT-Ig의 생물학적 활성을 측정하였다. 요약하건대, 0.8 nM에서 25 ㎕의 재조합 인간 IL-20을 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다(IL-20의 최종 농도는 0.2 nM이다). 항-IL20 항체 또는 FIT-Ig 또는 다른 대조군 항체를 400 nM(작업 농도는 100 nM이었음)까지 희석한 후 5배 연속 희석하였고 96-웰 어세이 플레이트에 첨가하였다(웰당 25 ㎕). 그 다음, IL-20 수용체로 안정하게 형질감염된 BaF3 세포를, 10% FBS, 800 ㎍/㎖ 농도의 하이그로마이신 B 및 800 ㎍/㎖ 농도의 G418을 함유하는 50 ㎕ 부피의 RPMI 1640에서 10000개 세포/웰의 농도로 각각의 웰에 첨가하였다. 48시간 항온처리 후, 100 ㎕ 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 발광 완충제를 각각의 웰에 첨가하였다. 내용물을 궤도 진탕기에서 2분 동안 혼합하여 세포 용해를 유도하였고, 플레이트를 10분 동안 실온에서 항온처리하여 발광 신호를 안정화시켰다. 발광을 스펙트라맥스(SpectraMax) M5로 기록하였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 모든 FIT-Ig들은 모 항체의 친화성과 유사한 친화성으로 hIL-20 및 hIL-17 둘 다를 중화시킬 수 있었다. 비아코어 및 세포-기반 중화 어세이 둘 다를 이용한 기능적 분석에 근거할 때, 모든 3개의 FIT-Ig들은 모 mAb의 활성을 완전히 보유하는 듯하다. 3개의 FIT-Ig들 사이에 유의미한 기능적 차이는 없었는데, 이것은 링커가 임의적이었고 FIT-Ig 구축물이 2개의 Fab 결합 영역들 사이의 펩타이드 스페이서의 부재 하에서 이중 결합을 허용할 정도로 충분한 유연성 및 특수한 치수를 제공하였다는 것을 시사하였다. 이것은 2개의 폴리펩타이드 쇄들 각각의 2개의 가변 도메인들 사이의 링커가 하부 (제2) 가변 도메인의 활성을 보유하기 위해 요구되는 DVD-Ig 유형의 분자와 대조된다.
실시예 1.5: 항-IL-17/IL-20 FIT-Ig의 안정성 연구
시트레이트 완충제(pH=6.0) 중의 FIT1-Ig 단백질 샘플을 1일, 3일 또는 7일 동안 일정한 4℃, 25℃ 및 40℃에서 개별적으로 항온처리하였다. 유사하게, FIT1-Ig 단백질 샘플을 1회, 2회 또는 3회 냉동-해동시켰다. 10 ㎍의 각각의 단백질 샘플을 15분 동안 0.3 ㎖/분의 유속으로 Superdex200 5/150 GL을 갖춘 울티메이트(Utimate) 3000 HPLC 내로 주사함으로써 SEC-HPLC로 모든 샘플들의 온전한 전체 단량체 단백질의 비율을 검출하였고, 제조자에 의해 공급된 크로멜레온(Chromeleon) 소프트웨어를 이용하여 데이터를 기록하고 분석하였다. 표 6은 FIT1-Ig 및 FIT3-Ig가 이들 열-챌린징된(thermo-challenged) 조건 하에서 전체 온전한 단량체 분자로 남아 있었다는 것을 보여준다.
Figure 112018086445842-pct00023
실시예 1.6: 항-IL-17/IL-20 FIT-Ig의 가용성 연구
증가하는 농도의 PEG6000(PEG6000은 상하이 링펑 케미칼 리전트 컴파니 리미티드(Shanghai lingfeng chemical reagent co. Ltd)로부터 구입되었음)의 존재 하에서 침전 신호를 측정함으로써 FIT1-Ig의 가용성을 분석하였다. 요약하건대, PEG6000의 존재 하에서 단백질의 가용성은 PEG6000 농도(0, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 및 30%)의 함수로서 수득되었다. 가용성 연구를 6.0의 용액 pH에서 25℃의 온도에서 수행하였다. 요약하건대, 단백질, PEG 및 완충제의 완충된 저장 용액을 적당량 혼합하여 원하는 성분 농도를 수득함으로써 단백질을 침전시켰다. 최종 부피를 200 ㎕로 만들었고, 단백질의 농도를 1.0 mg/㎖로 설정하였다. 최종 용액을 잘 혼합하였고 16시간 동안 평형화시켰다. 평형화 후, 상기 용액을 10분 동안 13000 rpm에서 원심분리하여 단백질 침전물을 분리하였다. 스펙트라맥스 Plus384(몰레큘라 디바이스(Molecular Device))를 이용하여 280 nm에서 단백질 가용성을 측정하였고 상청액의 흡광도로부터 수득하였고, 단백질 농도의 표준 곡선에 근거하여 농도를 계산하였다(도 4a). 본 발명자들은 3개의 상이한 pH 조건들 하에서 동일한 실험 방법을 이용하여 상업용 항체 리툭산도 분석하였다(도 4b). 단백질 가용성은 pH 조건에 의존하고 FIT-Ig의 예측된 가용성은 단일클론 항체의 범위 내에 있는 듯하다.
실시예 1.7: 항-IL-17/IL-20 FIT-Ig의 약물동력학적 연구
FIT1-Ig의 약물동력학적 성질을 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley)(SD) 래트에서 평가하였다. 경정맥 캐뉼라를 통해 또는 등 피부 아래에서 피하로 FIT-Ig 단백질을 5 mg/kg의 단회 정맥내 용량으로 수컷 SD 래트에게 투여하였다. 꼬리 정맥을 통한 연속 채혈로 0분, 5분, 15분 및 30분; 1시간, 2시간, 4시간, 8시간 및 24시간; 및 2일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일 및 28일에서 샘플링하면서 28일의 기간에 걸쳐 상이한 시점에서 혈청 샘플을 채취하였고 인간 IL-17 포획 및/또는 인간 IL-20 포획 ELISA로 분석하였다. 요약하건대, ELISA 플레이트를 염소 항-바이오틴 항체(5 ㎍/㎖, 4℃, 밤새)로 코팅하였고 수퍼블록(Superblock)(피어스)으로 차단하였고 2시간 동안 실온에서 10% 수퍼블록 TTBS에서 50 ng/㎖의 바이오티닐화된 인간 IL-17(IL-17 포획 ELISA) 또는 IL-20(IL-20 포획 ELISA)과 함께 항온처리하였다. 혈청 샘플을 연속적으로 희석하였고(0.5% 혈청, TTBS에서 10% 수퍼블록) 실온에서 30분 동안 플레이트 위에서 항온처리하였다. HRP-표지된 염소 항-인간 항체로 검출을 수행하였고, 4 파라미터 로지스틱 피트를 이용하여 표준 곡선의 도움으로 농도를 측정하였다. 특히 피하 군에서 여러 동물들은 아마도 항-인간 반응의 발생으로 인해 10일째 날 후 FIT-Ig 농도의 갑작스런 하강을 보였다. 이 동물들은 최종 계산으로부터 배제되었다. 윈놀린(WinNonlin) 소프트웨어(파사이트 코포레이션(Pharsight Corporation), 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)를 이용하여 비-구획 모델로 약물동력학적 파라미터에 대한 값을 측정하였다.
래트 PK 연구, FIT1-Ig 혈청 농도는 2종의 상이한 ELISA 방법에 의해 측정되었을 때 매우 유사하였는데, 이것은 상기 분자가 온전하였고 생체내에서 항원들 둘 다에 결합할 수 있었다는 것을 시사한다. IV 투약 시, FIT1-Ig는 보편적인 IgG 분자의 PK 프로파일과 유사한, 분포 상에 이은 제거 상으로 구성된 이상(bi-phasic) 약물동력학적 프로파일을 나타내었다. 2종의 상이한 분석 방법들에 근거하여 계산된 약물동력학적 파라미터는 매우 유사하였고 표 7에 표시되어 있다. FIT-Ig의 제거는 낮았는데(~12 ㎖/일/kg), 이때 낮은 분포 부피(Vss~130 ㎖/kg)는 긴 반감기(T1/2>10일)를 초래하였다. 피하 투여 후, FIT-Ig는 서서히 흡수되었는데, 이때 대략 26.9 ㎍/㎖의 최대 혈청 농도가 투약 후 4일째 날에 도달되었다. 최종 반감기는 약 11일이었고, 피하 생체이용률은 100%에 가까웠다. 이 결과에 의해 입증된 바와 같이, FIT1-Ig의 성질은 생체내에서 보편적인 IgG 분자와 매우 유사한데, 이것은 필적할만한 투약법을 이용한 치료 적용에 대한 잠재력을 시사한다.
FIT-Ig의 약물동력학 연구는 다중특이적 Ig 유사 생물제제 개발의 분야에서 놀라운 돌파구를 입증하였다. 래트 약물동력학적 시스템은 치료 mAb의 임상전 평가를 위해 제약 산업에서 통상적으로 이용되고, 인간에서의 mAb의 약물동력학적 프로파일을 잘 예측한다. FIT-Ig의 긴 반감기 및 낮은 제거는 치료 mAb와 유사하게 보다 덜 빈번한 투약으로 만성 적응증에 대한 그의 치료 유용성을 가능하게 할 것이다. 추가로, IgG보다 100 kDa 더 큰 FIT-Ig는 PK 연구로부터의 그의 IgG 유사 분포 부피 파라미터에 근거할 때 조직 내로 효율적으로 침투하는 것으로 보였다.
Figure 112018086445842-pct00024
실시예 1.8: FIT-Ig의 안정한 CHO 세포주 개발 연구
FIT-Ig는 일시적으로 형질감염된 293E 세포에서 효율적으로 발현되는 것으로 관찰되었다. FIT-Ig의 제조 용이성을 추가로 확인하기 위해, CHO-DG44 세포주 및 CHO-S 세포주 둘 다에서 안정한 형질감염을 수행하였고, 후속 클론 선택뿐만 아니라 생산성 분석도 수행하였다. 요약하건대, 프리덤(Freedom) pCHO 벡터(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))에 서브클로닝된 20 ㎍ DNA(CHO DG44 세포의 경우) 또는 25 ㎍ DNA(CHO-S 세포의 경우)를 가진 400 ㎕ 형질감염 용액에서 8X106개의 세포로 전기천공하여 CHO 세포를 형질감염시켰다. 상용적인 절차를 이용하여 안정한 세포주 선택을 수행하였다. 요약하건대, CHO-DG44 선택을 위해, 형질감염 시, 안정한 풀을 선택하였고(-HT/2P/400G, 이때 P는 ㎍/㎖ 푸로마이신이고, G는 ㎍/㎖ G418임), 단백질 생성을 IgG ELISA로 분석하였다. 상부 풀을 선택하였고 증가하는 농도의 MTX(50, 100, 200 및 500 nM)를 사용하여 여러 라운드 동안 증폭을 진행시킨 후, IgG ELISA로 단백질 생성을 분석하였다. 그 다음, 서브클로닝을 위해 상부 풀을 선택하였다. CHO-S 세포 선택을 위해, 10P/400G/100M(M은 nM MTX임)을 함유하는 배지에서 제1 단계 선택을 수행한 후, 단백질 생성을 분석하였다. 그 다음, 상부 풀을 선택하였고 30P/400G/500M 또는 50P/400G/1000M에서 제2 단계 선택을 진행한 후, ELISA로 단백질 생성을 측정하였다. 그 다음, 서브클로닝을 위해 상부 풀을 선택하였다. 단백질 생산성 분석을 위해, 125 ㎖ 진탕 플라스크에서 30 ㎖의 새로운 배지(6 mM L-글루타민으로 보충된 CD FortiCHO™ 배지)를 사용하여 완전히 회수된 세포 풀(생존율 >90%)을 5X105개 생존 세포/㎖(CHO DG44) 또는 3X105개 생존 세포/㎖(CHO-S)로 시딩하였다. 세포를 37℃, 80% 상대습도, 8% CO2 및 130 rpm에서 진탕 플랫폼 위에서 항온처리하였다. 배양 생존율이 50% 미만으로 떨어지거나 배양의 14일째 날에 도달될 때까지 세포 밀도, 생존율 및 생산성을 측정하기 위해 매일 또는 규칙적인 간격(예를 들면, 0일째 날, 3일째 날, 5일째 날, 7일째 날, 10일째 날, 12일째 날 및 14일째 날)으로 배양물을 샘플링하였다. 샘플링 후, 필요에 따라 글루코스를 배양물에 공급하였다.
FIT1-Ig CHO 안정한 세포주 발생의 전체 과정은 CHO 세포에서의 단일클론 항체 발생의 과정과 유사한 특징을 보였다. 예를 들면, 2P/400G 하에서 DG44 풀 분석 동안 VCD는 10일째 날 내지 12일째 날까지 약 1.3E7까지 계속 증가한 반면, 세포 생존율은 13일째 날 또는 14일째 날까지 80% 초과의 수준으로 유지되었고, 생산성은 14일째 날에 거의 40 mg/㎖에 도달하였다. 5P/400G/50M에서 증폭하였을 때, 생산성은 14일째 날에 50 mg/㎖ 초과의 수준에 도달하였다. CHO-S 세포 선택의 경우, 역가는 1 단계 선택 동안 200 mg/㎖ 초과의 수준에 도달하였고 2 단계 선택에서 370 mg/㎖ 초과의 수준에 도달하였다. 이 생산성 수준은 본 발명자들의 연구실에서 통상의 인간 mAb 개발의 경우 이미 관찰된 생산성 수준과 유사한데, 이것은 FIT-Ig가 상업적 적용을 위한 mAb 유사 제조 용이성을 나타낸다는 것을 암시한다.
실시예 2: 항-CD3/CD20 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 구축, 발현 및 정제
FIT-Ig가 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 지를 입증하기 위해, 본 발명자들은 도 1에 나타낸 바와 같이 3-폴리펩타이드 구축물인 항-CD3/CD20 FIT-Ig 분자 FIT7-Ig 및 FIT8-Ig를 생성하였다. 세포 표면 CD3 및 CD20에 결합할 수 있는 FIT-Ig를 생성하는 데 사용된 구축물은 도 1b에 예시되어 있다. 요약하건대, 모 mAb는 2개의 높은 친화성 항체들, 즉 항-CD3(OKT3) 및 항-CD20(오파투무맙)을 포함한다. FIT7-Ig 구축물 #1을 생성하기 위해, 직접적으로(FIT7-Ig) 또는 7 아미노산 링커(FIT8-Ig)를 통해 OKT3의 VL-CL을 오파투무맙 중쇄의 N-말단에 융합시켰다(표 8에 나타냄). 구축물 #2는 OKT3의 VH-CH1이고, 제3 구축물은 오파투무맙의 VL-CL이다. FIT-Ig에 대한 3개의 구축물들을 293 세포에 공-형질감염시켜, FIT-Ig 단백질을 발현시키고 분비시켰다. PCR 클로닝의 상세한 절차는 이하에 기재되어 있다:
실시예 2.1: 항-CD3/CD20 FIT-Ig의 분자 클로닝:
분자 클로닝 방법은 항-hIL-17/hIL-20 FIT-Ig에 대한 방법과 유사하다.
Figure 112018086445842-pct00025
표 9는 상기 분자 구축을 위해 사용된 PCR 프라이머들의 서열을 보여준다.
Figure 112018086445842-pct00026
항-CD3/CD20 FIT-Ig의 최종 서열은 표 10에 기재되어 있다.
Figure 112018086445842-pct00027
Figure 112018086445842-pct00028
Figure 112018086445842-pct00029
실시예 2.2: 항-CD3/CD20 FIT-Ig의 발현 및 정제:
각각의 FIT-Ig의 모든 DNA 구축물들을 pBOS 기반 벡터 내로 서브클로닝하고 시퀀싱하여 정확성을 보장하였다. 293E 세포에서 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 각각의 FIT-Ig의 구축물 #1, #2 및 #3을 일시적으로 공-발현시켰다. 요약하건대, FreeStyle™ 293 발현 배지에서 1:2의 DNA 대 PEI 최종 농도 비로 DNA를 PEI와 혼합하고 실온에서 15분(20분 이하) 동안 항온처리한 후 60 ㎍ DNA/120 ㎖ 배양물의 농도로 293E 세포에 첨가하였다(1.0X106/㎖ 내지 1.2X106/㎖, 세포 생존율 >95%). 진탕기에서 6시간 내지 24시간 동안 배양한 후, 125 rpm/분, 37℃ 및 8% CO2에서 진탕하면서 펩톤을 5%의 최종 농도로 형질감염된 세포에 첨가하였다. 6일째 날 또는 7일째 날, 상청액을 원심분리 및 여과로 수거하였고, 제조자의 설명서에 따라 단백질 A 크로마토그래피(피어스, 일리노이주 록포드 소재)를 이용하여 FIT-Ig 단백질을 정제하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였고 그의 농도를 A280 및 BCA(피어스, 일리노이주 록포드 소재)로 측정하였다(표 11).
Figure 112018086445842-pct00030
실시예 2.3: 항-CD3/CD20 FIT-Ig 분자의 결합 활성:
세포 표면에서 CD3을 발현하는 Jurkat 세포뿐만 아니라 세포 표면에서 CD20을 발현하는 Raji 세포도 사용하여 항-CD3/CD20 FIT-Ig와 표적들 둘 다의 결합을 FACS로 분석하였다. 요약하건대, 5X105개의 세포를 빙냉 PBS로 세척하고 1시간 동안 얼음 위에서 2% FBS로 차단하였다. 세포를 1시간 동안 얼음 위에서 항체, FIT-Ig(100 nM) 또는 이소타입 대조군과 함께 항온처리하고 PBS로 3회 세척하였다. 이차 항체(알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488(인비트로겐(Invitrogen))로 표지된 염소 항-인간 IgG)를 첨가하고 어두운 곳에서 1시간 동안 얼음 위에서 세포와 함께 항온처리한 후, PBS로 3회 세척하였다. 샘플을 FACs calibur에서 분석하였다. 세포 표면 결합은 FIT7-Ig 및 FIT8-Ig 둘 다가 농도 의존적 방식으로 세포 표면 항원 CD3 및 CD20 둘 다에 결합할 수 있었다는 것을 보여준다. 모 mAb의 결합 활성에 비해, FIT-Ig는 Jurkat 세포에서 CD3에 대한 감소된 결합 강도를 보였으나, Raji 세포에서 CD20에 대한 향상된 결합 강도를 보였다. 모든 결합 연구에서, FIT7-Ig 및 FIT8-Ig는 상기 항원들 둘 다에 대한 유사한 결합 활성을 보였는데, 이것은 링커가 FIT8-Ig에 대한 그의 결합 능력에 유의미한 영향을 미치지 않았다는 것을 시사한다(표 12).
Figure 112018086445842-pct00031
실시예 3: 항-TNF/IL-17 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 구축, 발현 및 정제
도 1에 나타낸 바와 같이, 항-IL-17 mAb 클론 LY 및 항-TNF mAb 골리무맙(Golimumab)을 사용하여 인간 IL-17 및 인간 TNFα에 결합할 수 있는 또 다른 FIT-Ig(FIT9-Ig)도 3-폴리펩타이드 구축물로 생성하였다. FIT9-Ig 구축물 #1을 생성하기 위해, 골리무맙의 VL-CL을 LY 중쇄의 N-말단에 직접적으로 융합시켰다(표 13에 나타냄). 구축물 #2는 골리무맙의 VH-CH1이고, 제3 구축물은 LY의 VL-CL이다. FIT9-Ig에 대한 3개의 구축물들을 293 세포에 공-형질감염시켜, FIT9-Ig 단백질을 발현시키고 분비시켰다. 항-TNF/IL-17 FIT-Ig의 최종 서열은 표 14에 기재되어 있다.
실시예 3.1: 항-TNF/IL-17 FIT-Ig의 분자 클로닝:
분자 클로닝 방법은 항-hIL-17/hIL-20 FIT-Ig에 대한 방법과 유사하다.
Figure 112018086445842-pct00032
Figure 112018086445842-pct00033
Figure 112018086445842-pct00034
실시예 3.2: 항-TNF/IL-17 FIT-Ig 단백질의 발현, 정제 및 분석:
각각의 FIT-Ig의 모든 DNA 구축물들을 pBOS 기반 벡터 내로 서브클로닝하고 시퀀싱하여 정확성을 보장하였다. 앞서 기재된 바와 같이, 293E 세포에서 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 FIT9-Ig의 구축물 #1, #2 및 #3을 일시적으로 공-발현시켰고, FIT9-Ig 단백질을 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 발현 수준은 10 내지 23 mg/ℓ이었다. 세포-기반 어세이를 이용하여 정제된 단백질을 IL-17(Hs27 세포에 의한 GROα의 생성) 및 TNF(L929 세포에 의한 IL-8의 생성)에 대해 기능적으로 분석하였다. 인간 TNF에 대한 FIT9-Ig의 중화 효능은 (동일한 실험에서 골리무맙에 의한 15.9 pM에 비해) 11.6 pM이었고, 인간 IL-17에 대한 FIT9-Ig의 중화 효능은 (동일한 실험에서 LY에 의한 51.5 pM에 비해) 122 pM이었다. 전체 FIT9-Ig는 모 mAb의 생물학적 활성을 유지하였다.
실시예 4: 항-CTLA-4/PD-1 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 구축, 발현 및 정제
도 1에 나타낸 바와 같이, 항-CTLA-4 mAb 이필리무맙 및 항-PD-1 mAb 니볼루맙을 사용하여 인간 CTLA-4 및 인간 PD-1에 결합할 수 있는 또 다른 FIT-Ig(FIT10-Ig)를 3-폴리펩타이드 구축물로 생성하였다. FIT10-Ig 구축물 #1을 생성하기 위해, 이필리무맙의 VL-CL을 니볼루맙 중쇄의 N-말단에 직접적으로 융합시켰다(표 15에 나타냄). 구축물 #2는 이필리무맙의 VH-CH1이고 제3 구축물은 니볼루맙의 VL-CL이다. FIT10-Ig에 대한 3개의 구축물들을 293 세포에 공-형질감염시켜, FIT10-Ig 단백질을 발현시키고 분비시켰다.
실시예 4.1: 항-CTLA-4/PD-1 FIT-Ig의 분자 클로닝:
분자 클로닝 방법은 항-hIL-17/hIL-20 FIT-Ig에 대한 방법과 유사하다. 항-CTLA-4/PD-1 FIT-Ig의 최종 서열은 표 16에 기재되어 있다.
Figure 112018086445842-pct00035
Figure 112018086445842-pct00036
Figure 112018086445842-pct00037
실시예 4.2: 항-CTLA-4/PD-1 FIT-Ig 단백질의 발현, 정제 및 기능 분석:
각각의 FIT-Ig의 모든 DNA 구축물들을 pBOS 기반 벡터 내로 서브클로닝하고 시퀀싱하여 정확성을 보장하였다. 앞서 기재된 바와 같이, 293E 세포에서 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 FIT10-Ig의 구축물 #1, #2 및 #3을 일시적으로 공-발현시켰고, FIT9-Ig 단백질을 단백질 A 크로마토그래피로 98% 단량체 전체 단백질까지 정제하였다. 발현 수준은 최대 43 mg/ℓ이었다. ELISA를 이용하여 정제된 단백질을 재조합 CTLA-4Ig 및 PD-1에 대해 결합 분석하였다. 요약하건대, CTLA-4에의 결합을 위해, 인간 CTLA-4Ig(R&D 시스템스)를 96-웰 플레이트에 고정시킨 후, 상용적인 세척 및 차단 절차를 수행하였다. 그 다음, 다양한 농도의 FIT10-Ig 또는 이필리무맙을 상기 플레이트에 첨가한 후, 항온처리 및 다중 세척 단계를 수행하였고, 항-인간 Fab-HRP로 검출하였다. PD-1에의 결합을 위해, (his 태그를 가진) 인간 PD-1(R&D 시스템스)을 96-웰 플레이트에 고정시킨 후, 상용적인 세척 및 차단 절차를 수행하였다. 그 다음, 다양한 농도의 FIT10-Ig 또는 니볼루맙을 상기 플레이트에 첨가한 후, 항온처리 및 다중 세척 단계를 수행하였고, 항-인간 Fc-HRP로 검출하였다(도 5). FIT10-Ig는 각각 모 mAb 이필리무맙 및 니볼루맙과 유사한 활성으로 CTLA-4(도 5a) 및 PD-1(도 5b) 둘 다에 결합할 수 있었을 것으로 보인다.
추가로, FIT10-Ig가 재조합 CTLA-4 및 PD-1에 동시적으로 결합할 수 있는 지를 확인하기 위해 옥테트레드(OctetRed)를 사용하여 다중 항원 결합 연구를 수행하였다. 요약하건대, FIT10-Ig를 10 ㎍/㎖의 농도로 AR2G 센서에 고정시킨 후, 80 nM의 농도로 어세이 완충제(PBS pH 7.4, 0.1% BSA, 0.02% Tween)에서 CTLA-4Ig 및 그 다음 PD-1(또는 PD-1 먼저, 그 다음 CTLA-4Ig)을 결합시켰다. 실험의 말기에, 표면을 pH 1.5의 10 mM 글리신으로 5회 재생시켰다(도 6). 이 실험은 FIT10-Ig가 CTLA-4에 이미 결합되었을 때 PD-1에 결합할 수 있었고, 그 반대의 경우도 가능하다는 것을 보여주는데, 이것은 FIT10-Ig가 CTLA-4Ig 및 PD-1 둘 다에 동시적으로 결합할 수 있었다는 것을 시사한다.
실시예 5: 추가 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 구축, 발현 및 정제
EGFR 및 PD-L1; cMet 및 EGFR; 인자 IXa 및 인자 X; Her3 및 IGF-1R; DLL-4 및 VEGF; CD20 및 CD3; Her3 및 EGFR; PD-1 및 PD-L1; 및 Her3 및 PD-1에 대한 특이성을 가진 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이들 예시적인 FIT-Ig 및 이들의 상응하는 서열들은 하기 표 17에서 제공된다. 표 18은 FIT-Ig 각각에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00038
Figure 112018086445842-pct00039
Figure 112018086445842-pct00040
Figure 112018086445842-pct00041
Figure 112018086445842-pct00042
Figure 112018086445842-pct00043
표 17 및 18의 FIT-Ig 각각에 대한 SEC 프로파일은 도 7a 내지 7i에서도 제공된다.
FIT13a-Ig에 대한 기능적 결합 데이터는 하기 표 19에서 제공된다. 추가로, FIT13a-Ig가 cMet 및 EGFR에 결합할 수 있는 지를 확인하기 위해 다중 항원 결합 연구를 수행하였다. 이 연구의 결과는 도 8에 제시되어 있고, FIT13a-Ig가 cMet 및 EGFR 둘 다에 동시적으로 결합할 수 있었다는 것을 보여준다.
Figure 112018086445842-pct00044
FIT14-Ig의 인자 IXa 결합 활성에 대한 기능적 결합 데이터는 하기 표 20에서 제공된다.
Figure 112018086445842-pct00045
연구의 결과는 추가 FIT-Ig가 구축될 수 있고 발현될 수 있고 정제될 수 있고, 표적 단백질에 대한 기능적 결합을 나타낼 것이라는 것을 보여준다.
실시예 6: 신규 항-CTLA-4/PD-1 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 구축, 발현 및 정제
CTLA4 및 PD1에 대한 특이성을 가진 신규 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이들 예시적인 FIT-Ig 및 이들의 상응하는 서열은 하기 표 21에서 제공된다. 표 21은 FIT-Ig 각각에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00046
Figure 112018086445842-pct00047
Figure 112018086445842-pct00048
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Figure 112018086445842-pct00050
장쇄 및 단쇄는 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(서열번호 487) 또는 MEFGLSWLFLVAILKGVQC(서열번호 488)일 수 있는 리더 서열을 포함한다.
Figure 112018086445842-pct00051
NBS3을 제외하고 임의의 최적화 없이 발현 수준을 소규모 생성에서 평가하였다. 모든 SEC 샘플들은 1-단계 단백질 A 정제 하에 있다. IgG1 및 IgG4 포맷 둘 다에서 FIT-Ig는 293 세포로부터 균질한 단백질로서 생성될 수 있다.
기능적 연구
이들 항체들에 대한 기능적 결합 데이터는 하기 표 23에서 제공된다. 이 데이터는 친화성이 IgG 불변 서열의 변화에 의해 영향을 받지 않았으나 상부 도메인 내로의 특정 Fab의 배치에 의해 개선될 수 있다는 것을 암시한다.
Figure 112018086445842-pct00052
ELISA 결합 연구: NBS3R의 ELISA 결합을 시험하였다. 요약하건대, CTLA-4에의 결합을 위해, 인간 CTLA-4Ig(R&D 시스템스)를 96-웰 플레이트에 고정시킨 후, 상용적인 세척 및 차단 절차를 수행하였다. 그 다음, 다양한 농도의 FIT-Ig 또는 관련 단일클론 항체를 상기 플레이트에 첨가한 후, 항온처리 및 다중 세척 단계를 수행하였고, 항-인간 Fab-HRP로 검출하였다. PD-1에의 결합을 위해, (his 태그를 가진) 인간 PD-1(R&D 시스템스)을 96-웰 플레이트에 고정시킨 후, 상용적인 세척 및 차단 절차를 수행하였다. 그 다음, 다양한 농도의 NBS3R 또는 니볼루맙을 상기 플레이트에 첨가한 후, 항온처리 및 다중 세척 단계를 수행하였고 항-인간 Fc-HRP로 검출하였다. NBS3R은 각각 CTLA-4(도 9a) 및 PD-1(도 9b) 둘 다에 결합할 수 있었던 것으로 보인다. 결과는 도 9a 및 9b에 제시되어 있다.
다중 결합 연구: NBS3의 다중 결합 연구도 수행하였다. 결과는 도 10에 제시되어 있다.
열안정성 연구: 이들 항체들에 대한 열안정성 시험도 수행하였고, 이의 결과는 표 24에 제시되어 있다. 용융 온도를 DSC로 측정하였다.
Figure 112018086445842-pct00053
저장 안정성 연구: NBS3의 저장 안정성을 SEC-HPLC 방법으로 평가하였고, 결과는 표 25에 제시되어 있다. 샘플을 1회, 2회 또는 3회 냉동/해동 주기로 처리하였고, 응집 또는 분해는 SEC-HPLC 프로파일에 의해 관찰되지 않았다. 샘플을 1일, 3일 또는 7일 동안 4℃, 25℃ 또는 40℃에서 처리하였고, 응집 또는 분해는 SEC-HPLC 프로파일에 의해 관찰되지 않았다.
Figure 112018086445842-pct00054
NBS3을 래트 PK 연구에서 추가로 시험하였고, 결과는 도 11a 및 도 11b에 제시되어 있다. 이 연구의 목적은 SD 래트에서 단회 정맥내(IV) 또는 피하(SC) 투여 후 NBS3의 약물동력학을 평가하는 것이었다. 족배 정맥 주사를 통해 IV 용량을 투여하였고 피하 주사를 통해 SC 용량을 투여하였다. 지정된 시점에서, 동물을 수동으로 저지하였고, 꼬리 정맥 천자 또는 심장 천자를 통해 대략 240 ㎕ 혈액/시점을 튜브 내로 채취하였다. 혈액 샘플을 0.5시간 동안 실온에서 놓아두었다. 그 다음, 혈액 샘플을 원심분리하여(10000 g, 4℃ 하에서 5분) 혈청 샘플을 수득하였다. 혈청 샘플을 분석할 때까지 -80℃에서 즉시 저장하였다. ELISA를 통해 샘플을 투약 용액과 함께 분석하였다. PK 파라미터 계산을 위해 측정된 투약 농도를 사용하였다.
NBS3, NBS3-C 및 NBS3R-C를 세포-기반 수용체 차단 어세이에서 시험하였다. 요약하건대, PD1-Fc를 96-웰 플레이트에 고정시킨 후, 상용적인 세척 및 차단 절차를 수행하였다. 그 다음, 희석된 FIT-Ig 및 바이오티닐화된 PD-L1-Fc를 각각의 웰에 첨가한 후, 항온처리 및 다중 세척 단계를 수행하였고, 스트렙타비딘-HRP로 검출하였다. 결과는 도 12에 제시되어 있다.
NBS3, NBS3-C 및 NBS3R-C를 이들의 기능적 활성에 대한 MLR(혼합된 림프구 반응) 어세이 및 PBMC SEB-자극 어세이에서 추가로 시험하였다.
MLR 어세이에서, 한 기증자로부터의 단핵구 유래의 수지상 세포 및 또 다른 기증자로부터의 동종이계 CD4 T 세포를 사용하여 혼합된 림프구 반응을 수행하였다. 건강한 기증자로부터 전혈 샘플을 채취하였고 피콜-파그(Ficoll-Pague) 구배 원심분리를 이용하여 전혈로부터 PBMC를 단리하였다. 1일째 날, 한 기증자로부터 PBMC를 단리하였고 무혈청 RPMI 1640으로 1X106/㎖까지 희석하였다. 희석된 PBMC를 웰당 3 ㎖씩 6-웰 조직 배양 플레이트 내에 시딩하고 3시간 동안 항온처리하였다. 상청액을 제거하였고 부착되지 않은 세포를 씻어내었다. 10% FBS를 가진 RPMI 1640에서 250 U/㎖ IL-4 및 500 U/㎖ GM-CSF를 사용하여 부착된 단핵구를 수지상 세포로 분극화하였다. 4일째 날, 배지를 새로운 IL-4 및 GM-CSF로 대체하였다. 7일째 날, 미성숙 DC를 수거하고 성숙을 위해 추가 24시간 동안 10% FBS를 가진 RPMI 1640에서 1 ㎍/㎖ LPS로 처리하였다. 8일째 날, 음성 선택으로 또 다른 기증자 PBMC로부터 CD4 T 세포를 단리하고 2X106개 세포/㎖의 최종 농도로 조절하였다. 성숙 DC를 1.5시간 동안 37℃에서 미토마이신 C로 처리하였다. 그 다음, DC를 PBS로 세척하고 1X106개 세포/㎖의 최종 농도로 조절하였다. CD4 T 세포(반응자 세포)를 웰당 100 ㎕씩 96-웰 플레이트 내에 첨가하고 30분 동안 희석된 농도의 시험 항체로 전처리하였다. 그 다음, 성숙 DC(자극자 세포)를 웰당 100 ㎕씩 상기 웰 내에 첨가하였다. 각각의 웰의 최종 부피는 200 ㎕이다. ELISA를 이용하여 IL-2 시험을 위해 72시간 동안 및 IFN-감마 시험을 위해 120시간 동안 37℃에서 MLR을 항온처리하였다. 결과는 도 13a 및 도 13b에 제시되어 있다.
PBMC SEB-자극 어세이에서, 피콜-파그 구배 원심분리로 건강한 기증자 혈액으로부터 PBMC를 단리하였다. 단리된 PBMC를 1X105개 세포/웰로 96-웰 조직 배양 플레이트 내에 시딩하였다. 그 다음, PBMC를 30분 동안 희석된 시험 항체로 전처리하였다. 스타필로코커스 장독소 B(SEB)를 100 ng/㎖의 최종 농도로 세포 배양 배지 내에 첨가하였다. 최종 어세이 부피는 200 ㎕/웰이었다. 세포를 96시간 동안 배양하였고, 배양 상청액을 수거하였다. 상기 상청액에서 IL-12 사이토카인 생성을 ELISA로 검출하였다. 결과는 도 14에 제시되어 있다.
실시예 7: 추가 항-EGFR/PD-L1 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 구축, 발현 및 정제
EGFR 및 PD-L1에 대한 특이성을 가진 신규 FIT-Ig들을 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이들 예시적인 FIT-Ig들 및 이들의 상응하는 서열은 하기 표 26에서 제공된다. 표 27은 FIT-Ig 각각에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00055
Figure 112018086445842-pct00056
Figure 112018086445842-pct00057
Figure 112018086445842-pct00058
SEC 프로파일 및 발현 데이터는 FIT012d가 PD-L1 항체 서열의 변화에 의해 FIT012b보다 더 우수한 순도를 나타내었다는 것을 암시한다.
이들 2개의 항체들에 대한 기능적 결합 데이터는 하기 표 28 및 표 29에서 제공된다. 이 데이터는 친화성이 IgG 불변 서열의 변화에 의해 영향을 받지 않았으나, 상부 도메인 내로의 일부 Fab의 배치에 의해 개선될 수 있다는 것을 암시한다.
Figure 112018086445842-pct00059
Figure 112018086445842-pct00060
FIT012b 및 FIT012d의 다중 결합 연구도 수행하였다. 결과는 도 15 (FIT012b), 및 도 16a 및 도 16b(FIT012d)에 제시되어 있다.
실시예 8: 항-cMet/EGFR Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 구축, 발현 및 정제
cMet 및 EGFR에 대한 특이성을 가진 신규 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이 예시적인 FIT-Ig 및 이의 상응하는 서열은 하기 표 30에서 제공된다. 표 31은 FIT-Ig 각각에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00061
Figure 112018086445842-pct00062
Figure 112018086445842-pct00063
안정성 데이터
FIT013a의 저장 안정성을 SEC-HPLC 방법으로 평가하였고, 결과는 표 32에 제시되어 있다. 샘플을 1회, 2회 또는 3회 냉동/해동 주기로 처리하였고, 응집 또는 분해는 SEC-HPLC 프로파일에 의해 관찰되지 않았다. 샘플을 1일, 3일 또는 7일 동안 4℃, 25℃ 또는 40℃에서 처리하였고, 응집 또는 분해는 SEC-HPLC 프로파일에 의해 관찰되지 않았다.
Figure 112018086445842-pct00064
기능적 연구: FIT013a에 대한 단백질 기반 결합 데이터는 하기 표 33 및 표 34에서 제공된다.
Figure 112018086445842-pct00065
Figure 112018086445842-pct00066
FIT013a의 다중 결합 연구도 수행하였다. 결과는 도 17에 제시되어 있다.
추가로, BD FACSVerse를 이용하여 유세포분석으로 암 세포주에서의 FIT013a의 결합 활성을 측정하였다. 배양물에서 성장된 세포를 트립신 무함유 배지로 플라스크로부터 탈착시키고 수거하였다. 수거된 세포를, 2% FBS를 함유하는 PBS 완충제로 세척하였다. 그 다음, 세포를 분취하고 1시간 동안 얼음 위에서 1:5 연속 희석된 FIT013a와 함께 항온처리하였다. FIT013a의 출발 작업 농도는 20 ㎍/㎖이었다. 세포를 세척하고 재현탁하고 1시간 동안 광으로부터 보호된 얼음 위에서 1:100 희석된 알렉사 플루오르® 488-표지된 마우스 항-인간 IgG1(인비트로겐, 카탈로그 번호 A-10631)과 함께 항온처리하였다. 세포를 세척하였고, 신호를 제조자의 프로토콜에 따라 BD FACSVerse 유세포분석기로 검출하였다.
이들 실험은 FIT013a가 많은 암세포주들, 예컨대, NCI-H1993, HCC827, MKN-45, SGC-7901, EBC-1, A549, KP4, NCI-H292, NCI-H1975 등에 결합할 수 있다는 것을 입증한다. 각각의 세포주에 대한 기하 평균 형광 강도(MFI) 및 EC50은 표 35에 나열되어 있다.
Figure 112018086445842-pct00067
추가로, FACS 어세이를 수행하여 FIT013a와 막 c-Met 및 EGFR의 이중 결합을 측정함으로써, 그의 다중 결합 활성을 보여주었다.
여러 세포주들을 이 어세이에서 사용하였다. MKN-45(인간 위 선암종 세포)는 높은 수준의 c-Met 및 낮은 수준의 EGFR을 발현하였다. SGC-7901(인간 위암)은 높은 수준의 EGFR 및 낮은 수준의 c-Met를 발현하였다. NCI-H1975(인간 비-소세포 폐암)는 동등한 수준의 c-Met 및 EGFR을 발현하였다.
배양물에서 성장된 세포를 트립신 무함유 배지로 플라스크로부터 탈착시키고 수거하였다. 수거된 세포를, 2% FBS를 함유하는 PBS 완충제로 세척하였다. 세포를 분취하고 1시간 동안 얼음 위에서 연속 희석된 FIT013a 또는 FIT013a-Fab와 함께 항온처리하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 1시간 동안 얼음 위에서 1 ㎍/㎖ 바이오티닐화된 인간 c-MET 또는 바이오티닐화된 EGFR과 함께 항온처리하였다. 세포를 재현탁하고 1시간 동안 광으로부터 보호된 얼음 위에서 4 ㎍/㎖ 알렉사 플루오르® 488-표지된 스트렙타비딘(인비트로겐, 카탈로그 번호 S32354)과 함께 항온처리하였다. 세포를 세척하였고, 신호를 제조자의 프로토콜에 따라 BD FACSVerse 유세포분석기로 검출하였다.
(예를 들면, MKN-45 세포에서) 세포 막 발현 수준 c-Met가 EGFR보다 훨씬 더 높을 때, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 c-Met 결합 부위는 막 c-Met에 의해 점유될 수 있고, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 유리 EGFR 결합 부위는 바이오티닐화된 EGFR에 의해 검출될 수 있다. (예를 들면, SGC-7901에서) 세포 막 발현 수준 EGFR이 c-Met보다 훨씬 더 높을 때, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 EGFR 결합 부위는 막 EGFR에 의해 점유될 수 있고, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 유리 c-Met 결합 부위는 바이오티닐화된 c-Met에 의해 검출될 수 있다. (예를 들면, NCI-H1975 세포에서) 세포 막 발현 수준 c-Met가 EGFR과 동등할 때, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 c-Met 및 EGFR 결합 부위는 동시적으로 점유되고, FIT013a 및 FIT013a-Fab의 유리 EGFR 또는 c-Met 결합 부위는 검출될 수 없다. 도 18a 내지 도 18c에서 입증된 바와 같이, FIT013a 및 FIT013a-Fab는 세포 표면의 2개 수용체 c-Met 및 EGFR에 동시적으로 결합할 수 있다.
신호전달 어세이: 다음으로, FIT013a를 사용하여 세포에서 HGF에 의해 유도된 AKT 인산화를 억제하였다. NCI-H292 세포를 96-웰 플레이트 내에 웰당 2X105개씩 플레이팅하였고 하룻밤 동안 혈청을 공급하지 않았다. 연속 희석된 FIT013a 또는 다른 관련 항체들을 상기 플레이트에 첨가하고 30분 동안 항온처리한 후, 40 ng/㎖ HGF를 5분 동안 어세이 플레이트에 첨가하였다. 세포를 용해시켰고, AKT 인산화를 ERK 인-T202/Y204 키트(시스바이오(Cisbio), 카탈로그 번호: 64AKSPEG)로 검출하였다. 실험은 FIT013a가 NCI-H292 세포에서 HGF에 의해 유도된 AKT 인산화를 중화시키는 데 있어서 mAb 조합물보다 더 우수한 활성을 보인다는 것을 입증한다. FIT013a는 80%의 AKT 인산화를 억제한 반면, EGFR 및 c-Met 항체 조합물은 60%의 AKT 인산화를 억제하였다(도 19 참조).
아고니스트 어세이: FIT013a에서 c-Met 및 EGFR 항체의 아고니스트 효과를 AKT 인산화로 시험하였다. NCI-H441 세포를 96-웰 플레이트 내에 웰당 2X105개씩 플레이팅하였고 하룻밤 동안 혈청을 공급하지 않았다. 연속 희석된 FIT013a 또는 다른 관련 항체들을 상기 플레이트에 첨가하고 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 용해시켰고 AKT 인산화를 ERK 인-T202/Y204 키트(시스바이오, 카탈로그 번호: 64AKSPEG)로 검출하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 실험은 FIT013a가 HGF의 부재 하에서 약한 아고니스트 효과를 보였다는 것을 입증한다.
수용체 고갈 연구: FIT013a가 세포 막에서 c-Met 및 EGFR 둘 다를 고갈시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 FIT013a를 시험하였다. c-Met 항체, EGFR 항체 및 FIT013a를 37℃에서 16시간 초과의 시간 동안 H441 세포와 함께 항온처리한 후, 세포 표면에 남아있는 EGFR 및 c-Met를 FACS로 검출하였다. 결과는 FIT013a가 c-Met 항체 또는 EGFR 항체보다 더 높은 거의 70%의 세포 막 c-Met 및 EGFR을 고갈시킬 수 있다는 것을 시사한다(표 36 참조).
Figure 112018086445842-pct00068
래트 PK 연구: 이 연구의 목적은 SD 래트에서 단회 정맥내(IV) 또는 피하(SC) 투여 후 FIT013a(c-met/EGFR)의 약물동력학을 평가하는 것이었다. IV 및 SC 투약을 위해, 시험 제품 FIT013a(c-met/EGFR)을 2.3 mg/㎖로 용해시켰다(10 mM 시트르산나트륨, 50 mM NaCl, pH 6.0)(로트: 160408001). 총 8마리의 수컷 SD 래트들(대략 195 내지 208 g의 체중, SLAC 래보러토리 애니멀 컴파니 리미티드(SLAC Laboratory Animal Co. LTD.)로부터 구입됨, 인증 번호: SCXK (SH) 2008001659659)을 이 연구에서 사용하였다. 투약 및 샘플링은 표 37로서 디자인된다.
Figure 112018086445842-pct00069
족배 정맥 주사를 통해 IV 용량을 투여하였고 피하 주사를 통해 SC 용량을 투여하였다. 지정된 시점에서, 동물을 수동으로 저지하였고, 꼬리 정맥 천자 또는 심장 천자를 통해 대략 240 ㎕ 혈액/시점을 튜브 내로 채취하였다. 혈액 샘플을 0.5시간 동안 실온에서 놓아두었다. 그 다음, 혈액 샘플을 원심분리하여(10000 g, 4℃ 하에서 5분) 혈청 샘플을 수득하였다. 혈청 샘플을 분석할 때까지 -80℃에서 즉시 저장하였다. 각각 c-Met 및 EGFR 단백질을 사용하여 ELISA로 샘플을 검출하였다. IV 및 SC 연구를 위한 래트 혈청 중의 FIT013a(c-met/EGFR)의 농도-시간 데이터는 표 38 내지 41에 나열되어 있고, 도 21a 내지 21d에 예시되어 있다.
Figure 112018086445842-pct00070
Figure 112018086445842-pct00071
Figure 112018086445842-pct00072
Figure 112018086445842-pct00073
NCI-H1975-HGF 이종이식 모델 종양 분포 연구
이 연구에서, NCI-H1975-HGF 종양 보유 누드 BALB/c 마우스에서 단회 IP 용량을 투여한 지 24시간 후에 FIT013a의 혈청 및 종양 농도를 측정하였다.
NCI-H1975-HGF 세포를 누드 BALB/c 마우스에 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 200 내지 250 mm3에 도달하였을 때, 마우스들을 4개의 군, 즉 FIT013a, H1332, 파니투무맙 및 비히클 군으로 무작위로 배정하였다. FIT013a 군은 단회 IP 용량 16 mg/kg 군이었고; H1332 또는 파니투무맙 군은 단회 IP 용량 10 mg/kg 군이었다. 비히클 군은 제제화 완충제(10 mM 시트르산나트륨, 50 mM NaCl, pH 6.0)를 투약받았다. 투약한 지 24시간 후, 종양 및 혈청을 채취하였다. 종양을 균질화하였고, 후속 ELISA 연구를 위해 상청액을 수거하였다. 혈청 및 종양 둘 다에 대해 일반적인 hIgG ELISA 방법을 이용하여 FIT013a, 파니투무맙 및 H1332를 정량하였다.
실험은 FIT013a가 혈청 및 종양에서 단일클론 항체와 필적할만한 분포 활성을 보였다는 것을 입증한다(도 22 참조).
NCI-H1975-HGF 이종이식 모델 효능 연구
이 연구에서, FIT013a의 효능을 NCI-H1975-HGF 이종이식 모델에서 측정하였다.
NCI-H1975-HGF 세포를 누드 BALB/c 마우스에게 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 100 내지 130 mm3에 도달하였을 때, 가장 큰 종양 부피는 140 mm3 미만이었다. 상기 마우스들을 4개의 군, 즉 FIT013a, H1332, 파니투무맙 및 비히클 군으로 무작위로 배정하였다. 항체를 3주 동안 주당 2회 복강내로 투약하였다. FIT013a에 대한 투약은 16 mg/kg이었고, H1332 또는 파니투무맙에 대한 투약은 10 mg/kg이었다. 비히클 군은 제제화 완충제(10 mM 시트르산나트륨, 50 mM NaCl, pH 6.0)를 투약받았다. 종양 부피 및 마우스 체중을 주당 2회 측정하였다. 퍼센트 종양 성장 억제(% TGI)를 대조군 처리군 평균 종양 부피(MTV)와 시험 항체 처리군 MTV 사이의 차이로서 정의하였다.
실험은 FIT013a가 EGFR 또는 c-Met 단일클론 항체보다 더 우수한 효능을 보였다는 것을 입증한다(도 23 참조).
실시예 9: 항-인자 IXa/인자 X Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 연구
인자 IXa 및 인자 X에 대한 특이성을 가진 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이 예시적인 FIT-Ig 및 이의 상응하는 서열은 하기 표 42에서 제공된다. 표 43은 FIT-Ig 각각에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00074
Figure 112018086445842-pct00075
Figure 112018086445842-pct00076
기능적 연구
표면 플라스몬 공명에 의한 친화성 측정: 25℃에서 HBS-EP(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20)를 사용하여 비아코어 X100 기계(비아코어 아베, 스웨덴 업살라 소재)를 이용한 표면 플라스몬 공명으로 h인자 IX 및 h인자 X(엔자임 리서치 래보러토리(Enzyme Research Laboratory))에 결합하는 FIT-Ig의 동력학을 측정하였다. 요약하건대, 제조자의 설명서에 따라 표준 아민 커플링 키트를 사용하여 염소 항-인간 IgG Fc 단편 특이적 다중클론 항체(피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드, 일리노이주 록포드 소재)를 CM5 연구 등급 바이오센서 칩 전체에 직접적으로 고정시켰다. 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 반응 표면 전체에 걸친 포획을 위해 정제된 FIT-Ig 샘플을 HEPES-완충된 식염수에 희석하고 5 ㎕/분의 유속으로 반응 매트릭스 전체에 주사하였다. 결합 속도 상수 및 해리 속도 상수인 kon(M-1s-1) 및 koff(s-1)를 30 ㎕/분의 연속 유속 하에서 측정하였다. 500 nM 항원 농도에서 동력학적 결합 측정을 수행함으로써 속도 상수를 유도하였다. 그 다음, FIT-Ig와 표적 단백질 사이의 반응의 평형 해리 상수(M)를 하기 식으로 동력학적 속도 상수로부터 계산하였다: KD = koff/kon. 항원 샘플의 분취액을 블랭크 기준물 및 반응 CM 표면 위에도 동시적으로 주사하여, 임의의 비특이적 결합 배경을 기록하고 공제함으로써 대부분의 굴절 지수 변화 및 주사 노이즈를 제거하였다. 10 ㎕/분의 유속으로 25 ㎖의 10 mM 글리신(pH 1.5)을 2회 후속 주사하여 표면을 재생시켰다. 항-Fc 항체가 고정된 표면은 완전히 재생되었고 12 주기에 걸쳐 그의 전체 포획 성능을 보유하였다. FIT014a에 대한 단백질 기반 결합 데이터는 하기 표 44에서 제공된다.
Figure 112018086445842-pct00077
인자 VIIIa 유사 활성 어세이: FIT-Ig의 FVIIIa 유사 활성을 BIOPHEN FVIII:C 키트(하이펜-바이오메드, 221402-RUO)의 제조자의 설명서에 따라 효소 어세이로 평가하였다. 결과는 FIT014a가 에미시주맙 및 정제된 FVIIIa와 필적할만한 FVIIIa 유사 활성을 갖는 반면, 인자 IX 및 인자 X의 단일클론 항체들뿐만 아니라 이들의 조합물도 활성을 갖지 않는다는 것을 시사한다(도 24 참조).
다중 항원 결합 연구: FIT014a가 h인자 IX 및 h인자 X에 동시적으로 결합할 수 있는 지를 확인하기 위해 옥테트레드를 이용하여 이 연구를 수행하였다. 요약하건대, FIT014a를 10 ㎍/㎖의 농도로 AR2G 센서에 고정시킨 후, 500 nM의 농도로 어세이 완충제(PBS pH 7.4, 0.1% BSA, 0.02% Tween)에서 h인자 IX 및 그 다음 h인자 X(엔자임 리서치 래보러토리)를 결합시켰다. 실험의 말기에, 표면을 pH 1.5에서 10 mM 글리신으로 5회 재생시켰다. 이 실험은 FIT014a가 h인자 IX에 이미 결합되어 있을 때 h인자 X에 결합할 수 있다는 것을 보여주는데, 이것은 FIT014a가 h인자 IX 및 h인자 X 둘 다에 동시적으로 결합할 수 있다는 것을 시사한다(도 25 참조).
안정성 연구: 시트레이트 완충제(pH=6.0) 중의 FIT014a 단백질 샘플을 1일, 3일 또는 7일 동안 일정한 4℃, 25℃ 및 40℃에서 개별적으로 항온처리하였다. 유사하게, FIT014a 단백질 샘플을 1회, 2회 또는 3회 냉동-해동시켰다. 10 ㎍의 각각의 단백질 샘플을 15분 동안 0.3 ㎖/분의 유속으로 Superdex200 5/150 GL을 갖춘 울티메이트 3000 HPLC 내로 주사함으로써, 모든 샘플들의 온전한 전체 단량체 단백질의 비율을 SEC-HPLC로 검출하였고, 제조자에 의해 공급된 크로멜레온 소프트웨어를 이용하여 데이터를 기록하고 분석하였다. 표 45는 FIT014a가 이 열-챌린징된 조건 하에서 전체 온전한 단량체 분자로 남아 있었다는 것을 보여준다.
Figure 112018086445842-pct00078
래트 PK 연구: 래트에서 FIT014a에 대한 PK 연구를 수행하였고, 결과는 도 26 및 표 46에 제시되어 있다. 62.5 ng/㎖의 LLOQ를 이용하여 래트 혈청 샘플 중의 항체 농도를 ELISA로 검출하였다. hIgG 플레이트에서, 코팅 단백질은 항-hIgG Fc이고, 검출 항체는 항-hIgG Fab이다. 인자 X 플레이트에서, 코팅 단백질은 h인자 X인 반면, 검출 항체는 항-인간-IgG Fc이다.
Figure 112018086445842-pct00079
실시예 10: 항-HER3/IGF-1R Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 연구
Her3 및 IGF-1R에 대한 특이성을 가진 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이 예시적인 FIT-Ig 및 이의 상응하는 서열은 하기 표 47에서 제공된다. 표 48은 FIT-Ig에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00080
Figure 112018086445842-pct00081
Figure 112018086445842-pct00082
기능적 연구
기능적 결합 연구: FIT016a에 대한 기능적 결합 데이터는 하기 표 49에서 제공된다.
Figure 112018086445842-pct00083
다중 항원 결합 연구: FIT016a가 Her3 및 IGF1R에 동시적으로 결합할 수 있는 지를 확인하기 위해 옥테트레드를 이용하여 이 연구를 수행하였다. 이 실험은 FIT016a가 이미 IGF1R에 결합되어 있을 때 Her3에 결합할 수 있다는 것을 보여주는데, 이것은 FIT016a가 Her3 및 IGF-1R 둘 다에 동시적으로 결합할 수 있다는 것을 시사한다(도 27 참조).
실시예 11: 항-DLL4/VEGF Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 연구
DLL4 및 IGF1R에 대한 특이성을 가진 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이 예시적인 FIT-Ig 및 이의 상응하는 서열은 하기 표 50에서 제공된다. 표 51은 FIT-Ig에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00084
Figure 112018086445842-pct00085
Figure 112018086445842-pct00086
기능적 연구
기능적 결합 연구: FIT017a에 대한 기능적 결합 데이터는 하기 표 52에서 제공된다.
Figure 112018086445842-pct00087
다중 항원 결합 연구: FIT017a가 DLL4 및 VEGF에 동시적으로 결합할 수 있는 지를 확인하기 위해 옥테트레드를 이용하여 이 연구를 수행하였다. 이 실험은 FIT017a가 이미 VEGF에 결합되어 있을 때 DLL4에 결합할 수 있다는 것을 보여주는데, 이것은 FIT017a가 DLL4 및 VEGF 둘 다에 동시적으로 결합할 수 있다는 것을 시사한다(도 28 참조).
실시예 12: 항-CD20/CD3 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 연구
CD20 및 CD3에 대한 특이성을 가진 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이 예시적인 FIT-Ig 및 이의 상응하는 서열은 하기 표 53에서 제공된다. 표 54는 FIT-Ig에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00088
Figure 112018086445842-pct00089
Figure 112018086445842-pct00090
기능적 연구
기능적 결합 연구: FIT018a에 대한 기능적 결합 데이터는 하기 표 55에서 제공된다.
Figure 112018086445842-pct00091
세포 기반 결합 연구: BD FACSVerse를 이용하여 유세포분석으로 인간 또는 사이노몰구스 B 세포 및 T 세포에 대한 FIT018a의 결합 활성을 측정하였다. 인간 B 세포 결합을 검출하기 위해 Raji 세포를 사용하였다. 인간 T 세포 결합을 검출하기 위해 Jurakt 세포를 사용하였다. 사이노몰구스 T 세포 결합을 검출하기 위해 일차 사이노몰구스 T 세포를 사용하였다. 사이노몰구스 B 세포 결합을 검출하기 위해 cynoCD20으로 형질감염된 HEK 293 세포 트랜짓(transit)을 사용하였다. 2% FBS를 함유하는 PBS 완충제로 세포를 세척하였다. 그 다음, 세포를 분취하고 1시간 동안 얼음 위에서 1:5 연속 희석된 FIT018a와 함께 항온처리하였다. FIT018a의 출발 작업 농도는 20 ㎍/㎖이었다. 세포를 세척하고 재현탁하고 1시간 동안 광으로부터 보호된 얼음 위에서 1:100 희석된 알렉사 플루오르® 488-표지된 마우스 항-인간 IgG1(인비트로겐, 카탈로그 번호 A-10631)와 함께 항온처리하였다. 세포를 세척하였고, 신호를 제조자의 프로토콜에 따라 BD FACSVerse 유세포분석기로 검출하였다. 이들 실험은 FIT018a가 인간 B 세포 및 T 세포에 결합할 수 있다는 것을 입증한다(Raji는 인간 B 세포주이고, Jurkat는 인간 T 세포주임)(도 29a 및 29b 참조). FIT018a는 사이노몰구스 CD20 및 CD3에도 결합할 수 있다(도 30a 및 30b 참조).
B 세포 고갈 어세이: FIT018a의 시험관내 활성을 B 세포 고갈 어세이로 측정하였다. 인간 PBMC를 제조자의 설명서에 따라 피콜 파크 플러스(Ficoll Paque Plus)(지이 헬스케어(GE HEALTHCARE), 카탈로그 번호: GE17144002)로 단리하였다. 표적 세포 Raji를 수거하고 웰당 5X104개씩 어세이 플레이트에 시딩하였다. 항체를 연속적으로 희석하고 어세이 플레이트에 첨가하였다. 웰당 2.5X105개의 PBMC를 어세이 플레이트에 첨가하고 2일 또는 3일 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, FACS 기계를 이용하여 항-CD19 항체로 B 세포를 검출하였다. 실험은 FIT018a가 B 세포 아폽토시스를 유도할 수 있다는 것을 입증한다(도 31a 및 31b 참조).
실시예 13: 항-HER3/EGFR Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 연구
HER3 및 EGFR에 대한 특이성을 가진 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이 예시적인 FIT-Ig 및 상응하는 서열은 하기 표 56에서 제공된다. 표 57은 FIT-Ig에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00092
Figure 112018086445842-pct00093
Figure 112018086445842-pct00094
Figure 112018086445842-pct00095
기능적 연구
기능적 결합 연구: FIT019a 및 FIT019b에 대한 기능적 결합 데이터는 각각 하기 표 58 및 표 59에서 제공된다.
Figure 112018086445842-pct00096
Figure 112018086445842-pct00097
다중 결합 연구: FIT019a 및 FIT019b의 다중 결합 연구를 수행하였다. 결과는 각각 도 32(FIT019a), 및 도 33a 및 도 33b(FIT019b)에 제시되어 있다. 결과는 FIT019a 및 FIT019b 둘 다가 HER3 및 EGFR에 동시적으로 결합할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 14: 항-PD-L1/PD-1 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 연구
PD-L1 및 PD-1에 대한 특이성을 가진 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이 예시적인 FIT-Ig 및 이의 상응하는 서열은 하기 표 60에서 제공된다. 표 61은 FIT-Ig에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00098
Figure 112018086445842-pct00099
Figure 112018086445842-pct00100
기능적 연구
표면 플라스몬 공명에 의한 친화성 측정: 25℃에서 HBS-EP(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20)를 사용하여 비아코어 X100 기계(비아코어 아베, 스웨덴 업살라 소재)를 이용한 표면 플라스몬 공명으로 rhPD-L1 및 rhPD-1에 결합하는 FIT-Ig의 동력학을 측정하였다. 요약하건대, 제조자의 설명서에 따라 표준 아민 커플링 키트를 사용하여 rhPD-L1 및 rhPD-1을 CM5 연구 등급 바이오센서 칩 전체에 40 RU로 직접적으로 고정시켰다. 1 내지 40 nM의 7개 상이한 항원 농도에서 동력학적 결합 측정을 수행함으로써 속도 상수를 유도하였다. 그 다음, FIT-Ig와 표적 단백질 사이의 반응의 평형 해리 상수(M)를 하기 식으로 동력학적 속도 상수로부터 계산하였다: KD = koff/kon. FIT-Ig/항체 샘플의 분취액을 블랭크 기준물 및 반응 CM 표면 위에도 동시적으로 주사하여, 임의의 비특이적 결합 배경을 기록하고 공제함으로써 대부분의 굴절 지수 변화 및 주사 노이즈를 제거하였다. 10 ㎕/분의 유속으로 25 ㎖의 10 mM 글리신(pH 1.5)을 2회 후속 주사하여 표면을 재생시켰다. FIT020b에 대한 기능적 결합 데이터는 하기 표 62에서 제공된다.
Figure 112018086445842-pct00101
MLR 어세이에 의한 기능적 활성 시험: 한 기증자로부터의 단핵구 유래의 수지상 세포 및 또 다른 기증자로부터의 동종이계 CD4 T 세포를 사용하여 혼합된 림프구 반응을 수행하였다. 건강한 기증자로부터 전혈 샘플을 채취하였고 피콜-파그 구배 원심분리를 이용하여 전혈로부터 PBMC를 단리하였다. 1일째 날, 한 기증자로부터 PBMC를 단리하였고 무혈청 RPMI 1640으로 1X106/㎖까지 희석하였다. 희석된 PBMC를 웰당 3 ㎖씩 6-웰 조직 배양 플레이트 내에 시딩하고 3시간 동안 항온처리하였다. 상청액을 제거하였고 부착되지 않은 세포를 씻어내었다. 10% FBS를 가진 RPMI 1640에서 250 U/㎖ IL-4 및 500 U/㎖ GM-CSF를 사용하여 부착된 단핵구를 수지상 세포로 분극화하였다. 4일째 날, 배지를 새로운 IL-4 및 GM-CSF로 대체하였다. 7일째 날, 미성숙 DC를 수거하고 성숙을 위해 추가 24시간 동안 10% FBS를 가진 RPMI 1640에서 1 ㎍/㎖ LPS로 처리하였다. 8일째 날, 음성 선택으로 또 다른 기증자 PBMC로부터 CD4 T 세포를 단리하고 2X106개 세포/㎖의 최종 농도로 조절하였다. 성숙 DC를 1.5시간 동안 37℃에서 미토마이신 C로 처리하였다. 그 다음, DC를 PBS로 세척하고 1X106개 세포/㎖의 최종 농도로 조절하였다. CD4 T 세포(반응자 세포)를 웰당 100 ㎕씩 96-웰 플레이트 내에 첨가하고 30분 동안 희석된 농도의 시험 항체로 전처리하였다. 그 다음, 성숙 DC(자극자 세포)를 웰당 100 ㎕씩 상기 웰 내에 첨가하였다. 각각의 웰의 최종 부피는 200 ㎕이다. IL-2 시험을 위해 72시간 동안 37℃에서 MLR을 항온처리하였다. 결과는 도 34a 및 도 34b에 제시되어 있다.
다중 결합 연구: FIT020b의 다중 결합 연구를 수행하였다. 결과는 도 35에 제시되어 있다. 결과는 FIT020b가 PD-L1 및 PD-1에 동시적으로 결합할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 15: 항-CD20/CD-22 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 연구
CD20 및 CD22에 대한 특이성을 가진 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이 예시적인 FIT-Ig 및 이의 상응하는 서열은 하기 표 63에서 제공된다. 표 64는 FIT-Ig에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00102
Figure 112018086445842-pct00103
Figure 112018086445842-pct00104
기능적 연구
세포 기반 결합 연구: BD FACSVerse를 이용하여 유세포분석으로 B 림프종 세포주 Raji 또는 Daudi에 대한 FIT021b의 결합 활성을 측정하였다. 2% FBS를 함유하는 PBS 완충제로 세포를 세척하였다. 그 다음, 세포를 분취하고 1시간 동안 얼음 위에서 1:5 연속 희석된 FIT021b와 함께 항온처리하였다. FIT021b의 출발 작업 농도는 20 ㎍/㎖이었다. 세포를 세척하고 재현탁하고 1시간 동안 광으로부터 보호된 얼음 위에서 1:100 희석된 알렉사 플루오르® 488-표지된 마우스 항-인간 IgG1(인비트로겐, 카탈로그 번호 A-10631)과 함께 항온처리하였다. 세포를 세척하였고, 신호를 제조자의 프로토콜에 따라 BD FACSVerse 유세포분석기로 검출하였다. 이들 실험은 FIT021b가 B 림프종 세포주 Raji 또는 Daudi에 결합할 수 있다는 것을 입증한다(도 36a 및 36b 참조).
실시예 16: 항-HER3/PD-1 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 연구
HER3 및 PD1에 대한 특이성을 가진 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이 예시적인 FIT-Ig 및 이의 상응하는 서열은 하기 표 65에서 제공된다. 표 66은 FIT-Ig에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00105
Figure 112018086445842-pct00106
Figure 112018086445842-pct00107
기능적 연구
표면 플라스몬 공명에 의한 친화성 측정: Her3-his 및 hPD-1-Fc에 결합하는 FIT022a-Ig의 동력학을 표면 플라스몬 공명으로 측정하였다. 결과는 표 67에 제시되어 있다.
Figure 112018086445842-pct00108
다중 결합 연구: FIT022a의 다중 결합 연구를 수행하였다. 결과는 도 37에 제시되어 있다. 결과는 FIT022a가 PD-L1 및 PD-1에 동시적으로 결합할 수 있다는 것을 시사한다.
MLR 기능적 어세이: 한 기증자로부터의 단핵구 유래의 수지상 세포 및 또 다른 기증자로부터의 동종이계 CD4 T 세포를 사용하여 혼합된 림프구 반응을 수행하였다. 건강한 기증자로부터 전혈 샘플을 채취하였고 피콜-파그 구배 원심분리를 이용하여 전혈로부터 PBMC를 단리하였다. 1일째 날, 한 기증자로부터 PBMC를 단리하였고 무혈청 RPMI 1640으로 1X106/㎖까지 희석하였다. 희석된 PBMC를 웰당 3 ㎖씩 6-웰 조직 배양 플레이트 내에 시딩하고 3시간 동안 항온처리하였다. 상청액을 제거하였고 부착되지 않은 세포를 씻어내었다. 10% FBS를 가진 RPMI 1640에서 250 U/㎖ IL-4 및 500 U/㎖ GM-CSF를 사용하여 부착된 단핵구를 수지상 세포로 분극화하였다. 4일째 날, 배지를 새로운 IL-4 및 GM-CSF로 대체하였다. 7일째 날, 미성숙 DC를 수거하고 성숙을 위해 추가 24시간 동안 10% FBS를 가진 RPMI 1640에서 1 ㎍/㎖ LPS로 처리하였다. 8일째 날, 음성 선택으로 또 다른 기증자 PBMC로부터 CD4 T 세포를 단리하고 2X10e6개 세포/㎖의 최종 농도로 조절하였다. 성숙 DC를 1.5시간 동안 37℃에서 미토마이신 C로 처리하였다. 그 다음, DC를 PBS로 세척하고 1X106개 세포/㎖의 최종 농도로 조절하였다. CD4 T 세포(반응자 세포)를 웰당 100 ㎕씩 96-웰 플레이트 내에 첨가하고 30분 동안 희석된 농도의 시험 항체로 전처리하였다. 그 다음, 성숙 DC(자극자 세포)를 웰당 100 ㎕씩 상기 웰 내에 첨가하였다. 각각의 웰의 최종 부피는 200 ㎕이다. ELISA를 이용하여 IL-2 시험을 위해 72시간 동안 및 IFN-감마 시험을 위해 120시간 동안 37℃에서 MLR을 항온처리하였다. 결과는 도 38a 및 도 38b에 제시되어 있다.
실시예 17: 항-cMet/PD-L1 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 연구
cMet 및 PD-L1에 대한 특이성을 가진 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이 예시적인 FIT-Ig 및 이의 상응하는 서열은 하기 표 68에서 제공된다. 표 69는 FIT-Ig에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다.
Figure 112018086445842-pct00109
Figure 112018086445842-pct00110
Figure 112018086445842-pct00111
기능적 연구
표면 플라스몬 공명에 의한 친화성 측정: cMet 및 PD-L1에 결합하는 FIT023a-Ig의 동력학을 표면 플라스몬 공명으로 측정하였다. 결과는 표 70에 제시되어 있다.
Figure 112018086445842-pct00112
다중 결합 연구: FIT023a의 다중 결합 연구를 수행하였다. 결과는 도 39a 및 도 39b에 제시되어 있다. 결과는 FIT023a가 cMet 및 PD-L1에 동시적으로 결합할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 18: 항-BTLA/PD-1 Fabs-인-탠덤 면역글로불린(FIT-Ig)의 연구
BTLA 및 PD-L1에 대한 특이성을 가진 FIT-Ig를 상기 실시예와 같이 구축하였다. 이 예시적인 FIT-Ig 및 이의 상응하는 서열은 하기 표 71에서 제공된다. 표 72는 FIT-Ig에 대한 293E 세포에서의 발현 수준 및 SEC 프로파일을 제공한다. FIT024a 및 FIT024b 둘 다가 1-단계 단백질 A 정제 후 우수한 순도를 가진다.
Figure 112018086445842-pct00113
Figure 112018086445842-pct00114
Figure 112018086445842-pct00115
Figure 112018086445842-pct00116
기능적 연구
표면 플라스몬 공명에 의한 친화성 측정: BTLA4 및 PD-1에 결합하는 FIT024a-Ig 및 FIT024b-Ig의 동력학을 표면 플라스몬 공명으로 측정하였다. 결과는 표 73에 제시되어 있다.
Figure 112018086445842-pct00117
다중 결합 연구: FIT024a 및 FIT024b의 다중 결합 연구를 수행하였다. 결과는 도 40a 및 도 40b, 및 도 41a 및 41b에 제시되어 있다. 결과는 FIT024a 및 FIT024b가 BTLA4 및 PD-1에 동시적으로 결합할 수 있다는 것을 시사한다.
MLR 기능적 어세이: 한 기증자로부터의 단핵구 유래의 수지상 세포 및 또 다른 기증자로부터의 동종이계 CD4 T 세포를 사용하여 혼합된 림프구 반응을 수행하였다. 건강한 기증자로부터 전혈 샘플을 채취하였고 피콜-파그 구배 원심분리를 이용하여 전혈로부터 PBMC를 단리하였다. 1일째 날, 한 기증자로부터 PBMC를 단리하였고 무혈청 RPMI 1640으로 1X106/㎖까지 희석하였다. 희석된 PBMC를 웰당 3 ㎖씩 6-웰 조직 배양 플레이트 내에 시딩하고 3시간 동안 항온처리하였다. 상청액을 제거하였고 부착되지 않은 세포를 씻어내었다. 10% FBS를 가진 RPMI 1640에서 250 U/㎖ IL-4 및 500 U/㎖ GM-CSF를 사용하여 부착된 단핵구를 수지상 세포로 분극화하였다. 4일째 날, 배지를 새로운 IL-4 및 GM-CSF로 대체하였다. 7일째 날, 미성숙 DC를 수거하고 성숙을 위해 추가 24시간 동안 10% FBS를 가진 RPMI 1640에서 1 ㎍/㎖ LPS로 처리하였다. 8일째 날, 음성 선택으로 또 다른 기증자 PBMC로부터 CD4 T 세포를 단리하고 2X10e6개 세포/㎖의 최종 농도로 조절하였다. 성숙 DC를 1.5시간 동안 37℃에서 미토마이신 C로 처리하였다. 그 다음, DC를 PBS로 세척하고 1X106개 세포/㎖의 최종 농도로 조절하였다. CD4 T 세포(반응자 세포)를 웰당 100 ㎕씩 96-웰 플레이트 내에 첨가하고 30분 동안 희석된 농도의 시험 항체로 전처리하였다. 그 다음, 성숙 DC(자극자 세포)를 웰당 100 ㎕씩 상기 웰 내에 첨가하였다. 각각의 웰의 최종 부피는 200 ㎕이다. IL-2 시험을 위해 72시간 동안 37℃에서 MLR을 항온처리하였다. 결과는 도 42a 및 도 42b에 제시되어 있다. FIT024a 및 FIT024b 둘 다가 MLR 연구에서 니볼루맙에 비해 T 세포 활성화를 향상시키는 보다 더 높은 활성을 가진다.
본 명세서에서 인용된 모든 공개문헌들, 특허출원들 및 발행된 특허들은 각각의 개별 공개문헌, 특허출원 또는 발행된 특허가 전체로서 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것처럼 본원에 참로로 도입된다.
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있다.
본원에서 논의된 공개문헌은 본원의 출원일 전 그의 개시에 대해서만 제공된다. 본원에서 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 공개문헌보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 취지로서 해석되어서는 안 된다.
본 발명은 그의 특정 실시양태와 관련하여 기재되어 있지만, 더 변형시킬 수 있고, 본원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고 본 개시로부터의 이러한 이탈을 포함하는 본 발명의 임의의 변경, 용도 또는 개조가 본 발명이 속하는 분야 내의 공지된 또는 통상의 관행 내에 있고 본 명세서 및 하기 청구범위에 기재된 필수 특징에 적용될 수 있기 때문에 이러한 변경, 용도 또는 개조를 포함하기 위한 것임을 이해할 것이다.
<110> Epimab BioTherapeutics <120> FABS-IN-TANDEM IMMUNOGLOBULIN AND USES THEREOF <130> 2018-FPA-8894 <150> PCT/CN2016/073722 <151> 2016-02-06 <160> 519 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 1 caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgaa g 31 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 2 gctggacctg agagcctgaa ccgccaccac cacactctcc cctgttgaag c 51 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 3 ggtggtggcg gttcaggctc tcaggtccag cttgtgcaat ctggcgccga gg 52 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 4 gtctgcggcc gctcatttac ccggagacag ggagag 36 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 5 taagcgtacg gtggctgcac catctgtctt c 31 <210> 6 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 6 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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln Ile Thr Leu 225 230 235 240 Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu 245 250 255 Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Val Gly Val 260 265 270 Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Leu 275 280 285 Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg 290 295 300 Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met 305 310 315 320 Ala Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His Ile 325 330 335 Arg Ile Thr Glu Val Arg Gly Val Ile Ile Ser Tyr Tyr Gly Met Asp 340 345 350 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 355 360 365 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 370 375 380 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 385 390 395 400 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 405 410 415 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 420 425 430 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 435 440 445 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 450 455 460 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 465 470 475 480 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 485 490 495 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 500 505 510 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 515 520 525 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 530 535 540 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 545 550 555 560 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 565 570 575 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 580 585 590 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 595 600 605 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 610 615 620 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 625 630 635 640 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 645 650 655 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 660 665 670 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 675 680 685 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 690 <210> 469 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolu VL <400> 469 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 470 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolu VL - CDR1 <400> 470 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 471 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolu VL - CDR2 <400> 471 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 472 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolu VL - CDR3 <400> 472 Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr 1 5 <210> 473 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A5 VH <400> 473 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Ala Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Ile Arg Ile Thr Glu Val Arg Gly Val Ile Ile Ser Tyr 100 105 110 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 474 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A5 VH - CDR1 <400> 474 Thr Ser Gly Val Gly Val Gly 1 5 <210> 475 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A5 VH - CDR2 <400> 475 Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 476 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A5 VH - CDR3 <400> 476 Ile Arg Ile Thr Glu Val Arg Gly Val Ile Ile Ser Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 477 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Short Chain 1 (Nivolu VH-CH1) <400> 477 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 <210> 478 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolu VH <400> 478 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 479 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolu VH - CDR1 <400> 479 Asn Ser Gly Met His 1 5 <210> 480 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolu VH - CDR2 <400> 480 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 481 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolu VH - CDR3 <400> 481 Asn Asp Asp Tyr 1 <210> 482 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Short Chain 2 (6A5 VL-hCK) <400> 482 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr 20 25 30 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly 65 70 75 80 Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 483 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A5 VL <400> 483 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 484 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A5 VL - CDR1 <400> 484 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 485 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A5 VL - CDR2 <400> 485 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 486 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A5 VL - CDR3 <400> 486 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 487 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> leader sequence <400> 487 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Arg Cys 20 <210> 488 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> leader sequence <400> 488 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 489 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 489 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 490 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 490 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 491 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 491 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 492 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 492 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 493 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 493 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 494 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 494 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 495 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 495 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 496 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 496 Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 1 5 10 15 <210> 497 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 497 Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 1 5 10 15 Val <210> 498 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 498 Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly 1 5 <210> 499 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 499 Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly 1 5 10 <210> 500 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 500 Ser Ala Lys Thr Thr Pro 1 5 <210> 501 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 501 Arg Ala Asp Ala Ala Pro 1 5 <210> 502 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 502 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 1 5 <210> 503 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 503 Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 504 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 504 Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 505 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 505 Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala 1 5 10 15 Arg Val <210> 506 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 506 Ala Asp Ala Ala Pro 1 5 <210> 507 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 507 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 508 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 508 Thr Val Ala Ala Pro 1 5 <210> 509 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 509 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 510 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 510 Gln Pro Lys Ala Ala Pro 1 5 <210> 511 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 511 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 512 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 512 Ala Lys Thr Thr Pro Pro 1 5 <210> 513 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 513 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 514 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 514 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 515 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 515 Ala Ser Thr Lys Gly Pro 1 5 <210> 516 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 516 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 517 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 517 Gly Glu Asn Lys Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Met Ala Leu Ser 1 5 10 15 <210> 518 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 518 Gly Pro Ala Lys Glu Leu Thr Pro Leu Lys Glu Ala Lys Val Ser 1 5 10 15 <210> 519 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 519 Gly His Glu Ala Ala Ala Val Met Gln Val Gln Tyr Pro Ala Ser 1 5 10 15

Claims (99)

  1. 항원 A 및 항원 B에 결합하고 3개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 이중특이적 결합 단백질로서,
    제1 폴리펩타이드 쇄는 아미노 말단부터 카복시 말단까지 (1) VLA-CL-VHB-CH1-Fc 또는 (2) VHB-CH1-VLA-CL-Fc를 포함하고, 이때 VLA는 항원 A에 결합하는 제1 모 항체의 항체 경쇄 가변 도메인이고, CL은 항체 경쇄 불변 도메인이고, VHB는 항원 B에 결합하는 제2 모 항체로부터의 항체 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 항체 중쇄의 제1 불변 도메인이고, 가변 도메인 및 불변 도메인 사이에 링커가 삽입되어 있지 않으며;
    제2 폴리펩타이드 쇄는 아미노 말단부터 카복시 말단까지 VHA-CH1을 포함하고, 이때 VHA는 항원 A에 결합하는 상기 제1 모 항체의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 항체 중쇄의 제1 불변 도메인이고, VHA 및 CH1 사이에 링커가 삽입되어 있지 않으며; 및
    제3 폴리펩타이드 쇄는 아미노 말단부터 카복시 말단까지 VLB-CL을 포함하고, 이때 VLB는 항원 B에 결합하는 상기 제2 모 항체의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 항체 경쇄 불변 도메인이고, VLB 및 CL 사이에 링커가 삽입되어 있지 않으며;
    2개의 상기 제1 폴리펩타이드 쇄, 2개의 상기 제2 폴리펩타이드 쇄, 및 2개의 상기 제3 폴리펩타이드 쇄는 결합하여 4개의 기능적 Fab 결합 유닛을 갖는 6개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 이중특이적인 4가의 결합 단백질을 제공할 수 있고;
    상기 이중특이적 결합 단백질은 항원 A 및 B에 결합하고, 이때 상기 A는 cMet이고 상기 B는 EGFR이며;
    상기 VLA는 3개의 CDR 서열(CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3)을 포함하고, 이때 CDR-1에 대한 서열은 서열번호 242이고, CDR-2에 대한 서열은 서열번호 243이고, 및 CDR-3에 대한 서열은 서열번호 244이고;
    상기 VHA는 3개의 CDR 서열(CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3)을 포함하고, 이때 CDR-1에 대한 서열은 서열번호 251이고, CDR-2에 대한 서열은 서열번호 252이고, 및 CDR-3에 대한 서열은 서열번호 253이고;
    상기 VLB는 3개의 CDR 서열(CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3)을 포함하고, 이때 CDR-1에 대한 서열은 서열번호 256이고, CDR-2에 대한 서열은 서열번호 257이고, 및 CDR-3에 대한 서열은 서열번호 258이고; 및
    상기 VHB는 3개의 CDR 서열(CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3)을 포함하고, 이때 CDR-1에 대한 서열은 서열번호 246이고, CDR-2에 대한 서열은 서열번호 247이고, 및 CDR-3에 대한 서열은 서열번호 248인 이중특이적 결합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 이중특이적 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합하고, VLA, VHA, VLB 및 VHB를 포함하며, 이때 VLA에 대한 서열은 서열번호 241이고,VHA에 대한 서열은 서열번호 250이고, VLB에 대한 서열은 서열번호 255이고, 및 VHB에 대한 서열은 서열번호 245인 이중특이적 결합 단백질.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 이중특이적 결합 단백질은 cMet 및 EGFR에 결합하고, 제1 폴리펩타이드 쇄, 제2 폴리펩타이드 쇄 및 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, 이때 상기 제1 폴리펩타이드 쇄에 대한 서열은 서열번호 240의 잔기 23-685이고, 상기 제2 폴리펩타이드 쇄에 대한 서열은 서열번호 249의 잔기 20-239이고, 및 상기 제3 폴리펩타이드 쇄에 대한 서열은 서열번호 254의 잔기 23-236인 이중특이적 결합 단백질.
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  96. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암의 치료용 약학 조성물.
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