CN110272495A

CN110272495A - 一种能结合两种抗原的双特异性结合的免疫球蛋白及其用途

Info

Publication number: CN110272495A
Application number: CN201910524522.4A
Authority: CN
Inventors: 姜东成
Original assignee: Nanjing Huayan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Huayan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2019-09-24

Abstract

本发明公开了一种能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白及其应用，该重组免疫球蛋白从氨基端到羧基端包含多肽链VHb‑CH1‑(X)n‑VLa‑CL，其中，VHb为重链的第二个可变结构域，CH1为重链恒定区的第一恒定结构域，X为连接子，n≥0，VLa为轻链第一个可变结构域，CL为轻链恒定结构域，a为双特异性结合的第一抗原，b为双特异性结合的第二抗原。该双特异性重组免疫球蛋白，是由结合第二抗原的轻链或重链直接或间接融合至第一抗原的轻链N端，不会对第一抗原的重链可变区造成位阻效应以及对Fc区介导的免疫反应造成影响；具有两条完全一样的重链，不存在重链错配问题。在制备用于疾病治疗的药物中将具有广泛的用途。

Description

一种能结合两种抗原的双特异性结合的免疫球蛋白及其用途

技术领域

本发明属于免疫球蛋白技术领域，具体涉及一种能结合两种抗原的双特异性结合的重组免疫球蛋白及其用途。

背景技术

双特异抗体(Bispecific antibody)是含有两个不同抗原结合位点的免疫球蛋白分子。由于其特异性和双功能性，增加对目标的结合亲和力，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤免疫治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景。由于自然状态下不存在双特异性抗体，只能通过基因工程改造等特殊方法进行制备。由于抗体轻链与其相应重链的配对是基于两条多肽链中的半胱氨酸形成的链间二硫键，配对过程并非特异性，不同肽链之间的随机组合导致了来自两种不同抗原的轻链与重链的配对，在理论上有10种组合形式，其中绝大多数配对为轻链重链错误配对的副产物，所以目前双特异性抗体技术的核心都围绕着解决两种不同抗原的轻链与重链的错配问题。

在过去的几年里，研究者开发了各种结构的双特异性抗体。一种双特异性结合抗原的技术形式是将不同的抗体的抗原结合区(Fv)或Fab片段通过连接子连接，这种分子架构不含抗体FC区。代表性的有德国Micromet公司开发的双特异T细胞衔接器-BiTE技术平台，BiTE技术是将抗CD3单链抗体(scFv)与不同抗肿瘤细胞表面抗原结合区通过肽链连接子进行连接而获得，可同时结合CD3阳性T细胞及肿瘤细胞。这种技术方案由于不含有抗体Fc段，不能与新生儿FC受体(FcRn)结合，进入体内后会迅速的从循环中被清除，所以半衰期极短，因此患者需要采用持续输注的给药方式，有的给药方案需要超过2个月的总持续时间，给临床治疗带来极大的不便。采用BiTE技术的已上市药物BLINCYTO的给药方式一次给药需要用特殊输注装置连续给药24-48小时。同时，由于没有抗体的Fc结构，这种双抗结构不能介导抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，补体依赖的细胞毒性作用(CDC)，ADCP等免疫功能。从分子结构上讲，这种抗体结构不能算是真正意义上的抗体。

不含Fc的二价双特异抗体被进一步改进，一种技术方案采用三个连接子不同抗原结合区串联，形成四价(具有四个特异性抗原结合位点)串联的分子结构，被命名为“串联多抗”(TandAbs)。与BiTE技术相比，其分子量要大很多，所以其半衰期比BiTE要长。TandAbs技术架构与BiTE技术类似，都不含抗体Fc区，从分子结构，不能算是真正意义上的抗体，不能介导抗体的ADCC，CDC，ADCP等免疫功能，半衰期也不能与天然抗体媲美。

MacroGenics公司和Servier公司通过二硫键稳定分子变体，联合开发了一种双特异性抗体构建技术(DART技术)采用将一个抗体可变区的VH和VL序列分别与另一个抗体可变区的VL和VH序列连接形成，在两条多肽链的C末端引入了半胱氨酸，通过半胱氨酸形成链间二硫键以此来提高产品的稳定性。这种技术架构不含抗体Fc区，不能介导抗体ADCC，CDC，ADCP等免疫功能。

抗体在体内的作用机制有：(1)通过中和抗原起阻断效用；(2)诱导机体产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；(3)通过补体依赖的细胞毒作用(CDC)等免疫效应调节作用发挥疗效；(4)抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)。而抗体的这些作用机制都依赖于抗体Fc区与Fc受体的结合。抗体与肿瘤细胞靶抗原特异性结合后，其Fc段可以与NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等效应免疫细胞表面的Fc受体(FcR)结合，激活细胞内信号，发挥效应功能。NK细胞通过释放细胞毒性颗粒(穿孔素和颗粒酶)导致靶细胞的凋亡；释放细胞因子和趋化因子抑制细胞增殖及血管生成。巨噬细胞可以吞噬肿瘤细胞，释放蛋白酶、活性氧和细胞因子等杀死肿瘤细胞。最近的文献研究了Fc区与抗体的ADCC，CDC，ADCP等免疫功能活性的密切关系，同时研究了Fc突变(P329G)导致了抗体活性失活(Cancer Research，2014，74(19Supplement)：3631-3631)，可见抗体Fc区对抗体免疫功能活性的重要作用。另一方面抗体重链可变区与轻链可变区共同组成了抗体与抗原的特异性结合区。本领域技术人员悉知，由抗体重链可变区与轻链可变区组成的抗体与抗原特异性结合的可变区中，起主要特异性结合作用的为重链的可变区。SANDRA.J等的研究指出在抗体与抗原的特异性结合过程中起决定作用的是抗体重链可变区(VH区)(J Immunol，vol.139：4135-4144.No.12.December 15.1987)。而在骆驼和鲨鱼类动物体内的抗体没有轻链，只有重链。再例如在专利(专利申请号201510008045.8，US7183076)申请中报道了一种双特异性抗体，这种双特异性抗体的轻链是一样的，而与两个不同抗原起双特异性识别结合靠的是重链的可变区，可见抗体中与抗原结合起主要作用的是重链的可变区。

目前含有Fc的双特异性抗体技术中，第二抗原都是直接或间接的融合至抗体重链的C端或N端(Fc端或VH端)，融合至重链C端会影响抗体Fc区介导的免疫杀伤功能，融合至重链N端会对重链可变区(VH区)与抗原的结合造成空间位阻效应，影响抗体与抗原的特异性结合。

在含有Fc结构域的双特异性抗体中，围着解决抗体重链与轻链的错配问题，人们设计了各种方案。Genentech公司对抗体重链Fc结构域进行突变，将其中一条重链CH3区域的氨基酸突变为含有较大侧链的氨基酸，形成突出的“Knobs”型结构，另一条重链CH3区域的氨基酸突变为含有较小侧链的氨基酸，形成凹陷的“holes”型结构。利用“Knobs-into-holes”结构的空间位阻效应实现两种不同抗体重链间的正确装配。为了解决轻链的错配，研究人员在“knobs-holes”结构基础上通过链交换技术将双特异性抗体的第一抗原抗体Fab结构域中的CL与CH1互换，而双特异性抗体的第一抗原抗体的Fab结构则保持不变。经过改造的第一抗原抗体轻链不易与第二抗原抗体的重链发生错配，同时“knobs-holes”结构可促进两条重链异源二聚化。在WO2009/080253的申请中详细披露了该技术方案。

在WO2006/106905的专利申请中，研究者采用了上述“knobs-holes”技术类似的技术方案，将抗体两条重链的CH3结构域的一个或多个位置的氨基酸突变为带异种电荷的氨基酸，通过静电相互作用力使带有同种电荷的重链相互排斥不进行配对，异种电荷的重链相互配对，形成异源二聚体双特异性抗体。

在专利WO2009/080254的技术方案中，研究者将双特异性抗体中第一条重链CH3结构域替换为CH1，另一条重链CH3结构域替换为CL，通过CH1与CL的特异性配对结合形成异源双特异性抗体。

上述技术方案中，为了解决重链间与轻链间的错配问题，分别对重链与轻链特点位点进行了突变，在很大程度了解决了错配问题，但不足之处也显而易见。本领域人员皆知，抗体Fc区介导ADCC，CDC，ADCP等免疫功能，这些免疫功能是抗体分子实现其药学功能的重要方式。人体免疫应答反应是非常复杂的系统，对Fc结构域进行突变会造成未知的免疫副反应，带来巨大的不确定性。上述技术方案都未披露免疫反应的相关研究及安全性数据。

理想的双特异性抗体分子是含有天然抗体Fc的区，这种构架方案要求抗体的两条重链一样，形成对称结构，重链间不存在错配问题。研究者设计了各种分子架构实现这一目的。一种技术方案在天然抗体重链的N端(VH区)或C端(CH3区)融合第二抗原的重链或轻链的恒定区(CL区)或可变区(VL)，其中重链与轻链的恒定区及可变区可以彼此交换，这种技术架构共有24种可正确配对的双特异性四价结合的抗体分子(详见，专利WO2010/145792A1说明书附图第6，7页)。

这种架构一种实现形式是基于抗体重链与轻链的恒定区及可变区彼此交换，形成杂交的分子结构。SherisL.Morrison等研究了抗体重链与轻链可变区交换对抗体功能的影响，指出抗体重链与轻链可变区交换会降低抗体与抗原的结合动力(The Journal ofImmunology 1998，160：2802-2808)。

这种架构的另一种实现形式在中国专利(申请号201480076500.1)申请中进一步明确，具体为在重链N端(VH区)融合第二抗原的Fab段(恒定区CL与可变区VL)，形成两条对称的“融合重链”来避免错配。一方面本领域技术人员悉知，由抗体重链可变区与轻链可变区组成的抗体与抗原特异性结合的可变区中，起主要特异性结合作用的为重链的可变区，SANDRA.J等的研究也指出在抗体与抗原的特异性结合过程中起决定作用的是抗体重链可变区(VH区)(J Immunol，vol.139：4135-4144.No.12.December 15.1987)。甚至在骆驼和鲨鱼类动物体内的抗体只有重链，轻链天然缺失，也叫单域抗体。在专利(专利申请号201510008045.8，US7183076)申请中也报道了一种具有共同轻链的双特异性抗体，此类双特异性抗体具有共同的轻链，与两个不同抗原的特异性结合靠的是重链的可变区，可见抗体中与抗原结合起主要作用的是重链的可变区。另一方面，上述技术方案是在重链的可变区(VH区)融合第二抗原的Fab片段，势必会对重链可变区与第一抗原的结合造成很大的影响，妨碍抗体功能的实现。而在原申请中也并未给出与两个特异性抗原亲和力的研究数据。

而在WO2014/144357的技术申请中进一步明确了上述技术方案(WO2010/145792A1)中的在重链C端(CH3结构域)直接或间接连接第二抗原的Fab段融合成的含有两个抗原的抗体重链，两条重链配对形成同源二聚体双特异性四价抗体，避免错配的存在。本领域的技术人员悉知，抗体对靶细胞的杀伤作用靠的是抗体Fc区所介导的ADCC与CDC及ADCP免疫作用，在抗体重链C端连接第二抗原的Fab段会对抗体对靶细胞的杀伤作用造成不可预知的影响，在原专利申请中也并未给出相关研究数据。

综上所述，最理想的技术方案是具有天然抗体Fc区，两条重链对称避免重链错配，同时第二抗原Fab段连接在第一抗原轻链可变区(VL区)，尽可能避免第二抗原Fab段对重链可变区与第一抗原的特异性结合造成空间位阻效应。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种可同时结合两种抗原的四价特异性抗体。本发明的另一目的是提供一种上述能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，包含三条多肽链，其中一条多肽链从氨基端到羧基端包含VHb-CH1-(X)n-VLa-CL，其中，VHb为重链的第二个可变结构域，CH1为重链恒定区的第一恒定结构域，X为连接子，n≥0，VLa为轻链第一个可变结构域，CL为轻链恒定结构域，a为双特异性结合的第一抗原，b为双特异性结合的第二抗原。

所述的双特异性结合的免疫球蛋白的第二条多肽链，从氨基端到羧基端包含VHa-CH1-Fc，其中，VHa为重链的第一个可变结构域，CH1为重链恒定区的第一恒定结构域。

所述的双特异性结合的免疫球蛋白的第三条多肽链，从氨基端到羧基端包含VLb-CL，其中，VLb为轻链第二个可变结构域，CL为轻链恒定结构域。

所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，在Fc结构域，包含人IgG重链恒定区的CH2、CH3结构域。

所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，CH1结构域与CL结构域均为野生型或突变型结构域。

所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，在CH1结构域与CL结构域进行界面氨基酸突变，使CH1结构域与CL结构域突变的氨基酸带相反电荷或形成极性-非极性相互作用力。

所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，在CH1结构域与CL结构域进行界面氨基酸突变，使CH1结构域或/和CL结构域中的一个或多个氨基酸突变为具有较大侧链体积的氨基酸或/和具有较小侧链体积的氨基酸。

所述的具有较大侧链体积的氨基酸选自精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸。

所述的连接子X是由多个相同或不同氨基酸组成的多肽链。

所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白在制备用于治疗人类疾病的药物中的应用。

一种能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，包含三条多肽链，其中一条多肽链从氨基端到羧基端包含VLb-CL-(X)n-VLa-CL，其中，VLb为轻链的第二个可变结构域，CL为轻链恒定区结构域，X为连接子，n≥0，VLa为轻链第一个可变结构域，a为双特异性结合的第一抗原，b为双特异性结合的第二抗原。

所述的双特异性结合的免疫球蛋白包含三条多肽链的第三条多肽链从氨基端到羧基端包含VHb-CH1，其中，VHb为重链第二个可变结构域，CH1为重链第一恒定结构域。

所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，所述的CH1结构域与CL结构域为野生型或突变型结构域。

所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，在所述的CH1结构域与CL结构域进行界面氨基酸突变，使CH1结构域与CL结构域突变的氨基酸带相反电荷或形成极性-非极性相互作用力。

所述的具有较大侧链体积的氨基酸选自精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；所述具有较小侧链体积的氨基酸选自由丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸。

所述的带相反电荷的氨基酸指在生物pH环境下带有正电或负电。所述的带正电的氨基酸选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)，带负电的氨基酸选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。

所述的极性氨基酸选自半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、天门冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)；所述的非极性氨基酸选自苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)、亮酰胺(L)、甲硫氨酸(M)、异亮氨酸(I)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点包括：

1)提供了两种全新的双特异性抗体分子架构方式，第一种全新的双特异性抗体分子架构方式由三条多肽链配对组合而成，第一条多肽链从氨基端到羧基端为VHb-CH1-(X)n-VLa-CL，第二条多肽链从氨基端到羧基端为VHa-CH1-Fc，第三条多肽链从氨基端到羧基端为VLb-CL。第二种由三条多肽链配对组合而成，第一条多肽链从氨基端到羧基端为VLb-CL-(X)n-VLa-CL，第二条多肽链从氨基端到羧基端为VHa-CH1-Fc，第三条多肽链从氨基端到羧基端为VHb-CH1。

2)该全新的结合两种抗原的四价特异性抗体，结合两种抗原的四价特异性抗体是由结合第二抗原的轻链或重链直接或间接融合至第一抗原的轻链N端(VL区)，因此不会对第一抗原的重链可变区造成位阻效应以及对Fc区介导的免疫反应造成影响。该结合两种抗原的四价特异性抗体具有两条完全一样的重链，因此不存在重链错配问题。此外，本发明可以通过恒定区氨基酸突变来加强抗体分子正确配对。

附图说明

图1是能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白的第一种结构示意图；

图2是能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白的第二种结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

本申请提供的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，基本框架结构共有两种，第一种框架结构如图1所示，由三条多肽链配对组合而成，其中，第一条多肽链从氨基端到羧基端为VHb-CH1-(X)n-VLa-CL，第二条多肽链从氨基端到羧基端为VHa-CH1-Fc，第三条多肽链从氨基端到羧基端为VLb-CL。其中，VHb为重链的第二个可变结构域，CH1为重链恒定区的第一恒定结构域，X为连接子，n≥0，VLa为轻链第一个可变结构域，CL为轻链恒定结构域，a为双特异性结合的第一抗原，b为双特异性结合的第二抗原，VHa为重链的第一个可变结构域，CH1为重链恒定区的第一恒定结构域，VLb为轻链第二个可变结构域，CL为轻链恒定结构域。

第二种框架结构如图2所示，也由三条多肽链配对组合而成，第一条多肽链从氨基端到羧基端为VLb-CL-(X)n-VLa-CL，第二条多肽链从氨基端到羧基端为VHa-CH1-Fc，第三条多肽链从氨基端到羧基端为VHb-CH1。其中，VLb为轻链的第二个可变结构域，CL为轻链恒定区结构域，X为连接单元，n≥0，VLa为轻链第一个可变结构域，a为双特异性结合的第一抗原，b为双特异性结合的第二抗原，VHa为重链的第一个可变结构域，CH1为重链恒定区的第一恒定结构域，其中，VHb为重链第二个可变结构域，CH1为重链第一恒定结构域。

在这两种结构中，轻链恒定结构域CL与重链第一恒定结构域CH1，均可以为野生型或突变型。

在多肽链VHb-CH1-(X)n-VLa-CL和多肽链VLb-CL-(X)n-VLa-CL中，可以不需要连接子X；也可以通过连接子进行连接。连接子X是多个相同或不同氨基酸组成的多肽链。连接子优选为GGGGSGGGGSGGGGS或人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4铰链区的全部或部分氨基酸序列；该连接子可对人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4铰链区个别氨基酸进行突变。连接子具体可由以下氨基酸组合组成：GSGS、GGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、STPPTPSPSGG、ERKCCVECPPCP、ASTKGPSVFPLA、EPKSCDKTHTCPPCP、ESKYGPPCPSCP、EPKSCDKTHTSPPSP、ESKYGPPSPSSP、TVAAPSVFIFPPS、AKTTPKLEEGEFSEAR、EPKSCDTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG。

实施例2

本发明用途为制备用于治疗人类疾病的药物。人类疾病包括各种实体肿瘤与血液肿瘤、自身免疫性疾病、糖尿病等内分泌系统疾病、各种炎症及过敏性疾病、神经系统疾病、移植物抗宿主疾病等各种人类疾病。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体被设计用于靶向同一个靶细胞上的两个抗原来调节与人类疾病发生及治疗相关的细胞信号传导，靶细胞可以是肿瘤细胞，也可以是免疫细胞例如T细胞或B细胞或其他与人类疾病发生及治疗相关的目标细胞。

在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体被设计用于靶细胞与细胞外游离的抗原来调节与人类疾病发生及治疗相关的细胞信号传导，该靶细胞可以是肿瘤细胞也可以是免疫细胞例如T细胞或B细胞或其他与人类疾病发生及治疗相关的目标细胞。

又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体被设计用于两个细胞外游离的抗原来调节与人类疾病发生及治疗相关的细胞信号传导。

又另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体被设计用于靶向两个不同的靶细胞抗原来调节与人类疾病发生及治疗相关的细胞信号传导，靶细胞可以是肿瘤细胞也可以是免疫细胞或其与人类疾病发生及治疗相关的目标细胞。

在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不局限于293、COS、NSO及CHO。

在一个优选实施方式中，CH1结构域衍生自IgG免疫球蛋白，优选IgG1亚型。CL结构域优选为κ型。更优选地，用于对人的治疗时，用于衍生形成突变型CH1和CL结构域的免疫球蛋白，是人免疫球蛋白。VH和VL结构域可衍生自任何识别靶向表位的抗体，包括天然的或经基因工程(改造)的抗体。

使用本发明的双特异性抗体分子可以预防和/或治疗的优选的癌症包括一般对免疫治疗有应答的癌症。可治疗的优选癌症的非限制性的例子包括肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤(例如转移的恶性黑色素瘤)、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病，包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。

上述人类疾病包括给该对象使用本发明的双特异性抗体分子可以预防和/或治疗的优选的自身免疫性疾病的非限制性的例子包括慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎等器官特异性自身免疫病；以及系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、系统性血管炎、硬皮病、天胞疮、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、混合型结缔组织病、溃疡性结肠炎、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、以及许多种皮肤病、慢性肝病、多发性神经炎等系统性自身免疫疾病。

上述人类疾病包括给该对象使用本发明的双特异性抗体分子可以预防和/或治疗的优选的感染性病毒及细菌、炎症、内分泌系统、心脑血管及其他与免疫相关的疾病的非限制性的例子包括肝炎病毒(甲，乙，丙)、流感病毒、疱疹病毒、贾第虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌，疱疹病毒、腺病毒、流感病毒、虫媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、虫媒病毒脑炎病毒、衣原体、立克次氏体菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏杆菌、变形菌、雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱菌、破伤风菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌、钩端螺旋体、和莱姆病细菌。关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆氏关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、克罗恩氏病、炎性肠病、高血脂、高血压、糖尿病、原发性胆汁性硬化、溶血性贫血、恶性疾病、心脏衰竭、心肌梗塞、多腺体缺陷、成人呼吸窘迫综合症、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠源性滑膜炎、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、骨质疏松、脊柱关节病、动脉粥样化病/动脉硬化、自体免疫性大疱病、寻常性天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自体免疫性溶血性贫血、青少年恶性贫血、慢性皮肤黏膜念珠菌病、巨细胞动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐源性自体免疫性肝炎、获得性免疫缺陷疾病综合症、获得性免疫缺陷相关疾病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见变异性免疫缺陷、移植物抗宿主等疾病。

实施例3

一种含有本发明的双特异性蛋白的制剂药物组合物，该药物组合物媒介或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或5％葡萄糖溶液。药物组合物可以包含用于改变、保持或保存例如组合物的pH、渗透压、粘性、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附性或渗透性的制剂材料。合适的制剂材料包括但不限于氨基酸：例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、或赖氨酸)；抗氧化剂：例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠；缓冲体系：例如醋酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、组氨酸、甘氨酸或其他有机酸；填充剂：例如甘露醇或甘氨酸；螯合剂：例如乙二胺四乙酸；多元醇：山梨醇、甘露糖醇，蔗糖；蛋白：例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；乳化剂；表面活性剂：例如普兰尼克、PEG、山梨醇酯、聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇；稳定增强剂(蔗糖或山梨醇)。

该药物组合制剂包括但不局限于冻干粉针剂、水针剂、预充针剂。其中，水针剂为1-500mL，优选1-250mL，更优选1-100mL，最优选5-50mL。

实施例4

人抗体蛋白恒定区氨基酸序列参考NCBI中所收录，氨基酸采用IMGT编码方式。将目标氨基酸序列对应的DNA序列委托序列合成公司进行合成，应用瞬时表达系统(HEK293F细胞)。

1识别PD-1和VEGF的四价双特异性抗体的构建、表达及表征

1.1抗体分子的构建

使用抗PD-1单抗与抗VEGF单抗构建的可结合人T细胞表面抗原PD-1及血管内皮生长因子(VEGF)的四价双特异性抗体。第一条多肽链为VH_PD-1-CH1-(G₄S)₃-VL_VEGF-CL(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，第二条多肽链为VH_VEGF-CH1-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，第三条多肽链为VL_PD-1-CL(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)。

1.2抗体分子的表达及表征

(1)将HEK-293细胞置于5％的CO₂恒温摇床中，恒温震荡培养，确定其细胞密度及存活率。使用生长处于指数期，存活率大于97％的细胞做转染；细胞无需离心，直接兑入KOP293培养液，将细胞密度稀释成3×10⁶个/毫升；摇瓶置于5％的CO2恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养。

(2)瞬时转染

转染100mL细胞悬液，准备两支15mL的无菌离心管。在其中一支离心管中加入5mLKPM和50μg无菌质粒DNA，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入5mL KPM和500μl TA-293转染试剂，轻轻吹打混匀；将两只离心管中的液体混合，轻轻吹打混匀，室温下静置10分钟制备出质粒-载体复合物；从恒温摇床中取出细胞，将质粒-载体复合物均匀加入细胞悬液中并用手摇匀，放回CO₂恒温摇床中培养。

(3)产物表达与检测

转染24小时后可加入500μL 293细胞蛋白表达增强剂(KE-293)，以增加产物表达量；继续培养6天后测定抗体的表达量；随后，通过Protein A亲和层析将上清液将其纯化，通过质谱术、SDS-PAGE等技术测定单体含量和稳定性。结果显示双特异性四价抗体可以稳定表达。通过ELISA和Biacore测定法来研究对PD-1和VEGF的结合活性，显示生成的双特异性四价抗体能够同时结合PD-1和VEGF，并同时阻断二者的信号通路发挥抗肿瘤活性。

实施例5

识别PDL-1和VEGFR的四价双特异性抗体的构建、表达及表征，具体过程如下：

1抗体分子的构建

(1)使用抗PDL-1单抗与抗VEGFR单抗构建的可结合人肿瘤细胞表面抗原PDL-1及血管内皮生长因子受体(VEGFR)的四价双特异性抗体。第一条多肽链为VH_PDL-1-CH1-(G₄S)₃-VL_VEGFR-CL(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，第二条多肽链为VH_VEGFR-CH1-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，第三条多肽链为VL_PDL-1-CL(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)。

(2)抗PD-L1与抗VEGFR四价双特异性抗体分子的另一种构建方式为：第一条多肽链为VLb-CL-(G₄S)₃-VLa-CL，第二条多肽链为VHa-CH1-Fc，第三条多肽链为VHb-CH1，a为VEGFR抗原，b为PD-L1抗原。

2抗体分子的表达及表征

抗体分子表达采用HEK-293细胞，采用实施例3中的操作方法进行瞬时表达，采用Protein A亲和层析将目标产物进行纯化，采用质谱术、SDS-PAGE、HPLC等技术方法将纯化得到的目标蛋白进行表征。结果显示，双特异性四价抗体可以稳定表达。通过ELISA和Biacore测定法来研究对PDL-1和VEGFR的结合活性，显示生成的双特异性四价抗体能够同时结合PDL-1和VEGFR，并同时阻断它们的活性。

实施例6

血管内皮生长因子(VEGF)是选择性血管内皮细胞有丝分裂，通过刺激血管新生促进肿瘤细胞的生长和转移。血管生成素-2(ANG-2)破坏内皮细胞和外周基质间的相互作用，使不稳定状态的血管内皮、基质对生长因子的敏感性增加，诱导血管再建，参与肿瘤血管新生的起始及延续过程，影响肿瘤生长和转移。

ANG-2在肿瘤血管新生中的作用显著，在多种癌组织中均有ANG-2及其受体的表达增加，特别是肿瘤边缘的新生血管区。ANG-2表达是肿瘤血管新生起始及加强的因素，与肿瘤血管形成数目，临床分期，预后关系密切(Etoh T，etc.Cancer Res，2001；61：2145-2153.)。众多的研究已经表明，ANG-2与VEGF具有协同作用促进新血管的生长(Holash，J.，etc，Science，284(1999)1994-98；Maisonpierre，P.C.，etc，Science，277(1997)55-60；Asahara，T.，etc，Circ Res，83(1998)233-40)。

识别VEGF和ANG-2的四价双特异性抗体的构建、表达及表征，具体过程如下：

1抗体分子的构建

1.1使用贝伐单抗与抗促血管生成素-2(ANG-2)单抗构建的可结合人血管内皮生长因子(VEGF)及促血管生成素-2(ANG-2)的四价双特异性抗体。第一条多肽链为VL_ANG-2-CL--VL_VEGF-CL(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)，第二条多肽链为VH_VEGF-CH1-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)，第三条多肽链为VL_ANG-2-CL(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)。

2.抗体分子的表达及表征

抗体分子表达采用HEK-293细胞，采用实施例3中的操作方法进行瞬时表达，采用Protein A亲和层析将目标产物进行纯化，采用质谱术、SDS-PAGE、HPLC等技术方法将纯化得到的目标蛋白进行表征。结果显示，双特异性四价抗体可以稳定表达。通过ELISA和Biacore测定法来研究对ANG-2和VEGF的结合活性，显示生成的双特异性四价抗体能够同时结合ANG-2和VEGF，并同时阻断它们的活性。

实施例7

白细胞介素17(IL-17)是主要由TH17细胞分泌产生的一种炎症前因子，其在自身免疫性疾病、移植排斥反应及炎症发展中起着重要作用。IL-17通过与受体特异性结合，可以促进T细胞的激活和刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子如IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和化学增活素及细胞黏附分子1(cellularadhesion molecule 1，CAM-1)，从而放大炎症的产生。IL-17失调与急性炎症反应相关，造成银屑病、类风湿性关节炎和多发性硬化症等疾病。

白介素-23(IL-23)是由树突细胞等产生的细胞因子。其通过与IL-23受体(IL-23R)结合触发细胞信号通路。已知IL-23与银屑病、克罗恩病或溃疡性结肠炎等炎症性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、白塞氏病和葡萄膜炎等疾病密切相关。银屑病为慢性皮肤角化疾病，患者皮肤中观察到IL-23表达的亢进。炎症性肠病是以克罗恩病、溃疡性结肠炎为代表的慢性复发性疾病，会导致消化道的功能和结构的变性。已知克罗恩病患者的肠道炎症部位粘膜固有层巨噬细胞旺盛地产生IL-23，认为会诱导来自免疫细胞等的IL-21、IL-22、IL-17等细胞因子从而促进炎症性肠病的炎症的发病。系统性红斑狼疮是由于免疫系统的亢进在全身的各个部位引起多样的症状。据报道，系统性红斑狼疮病状与IL-23R阳性T淋巴细胞数存在正相关。另外，已知系统性红斑狼疮患者血中的IL-23与正常人相比显著地亢进系统性红斑狼疮，暗示IL-23与系统性红斑狼疮相关。强直性脊柱炎是主要在脊柱和骶髂关节产生病变的慢性炎症性疾病。已知强直性脊柱炎患者血液中的IL-23与正常人相比显著升高，这启示了强直性脊柱炎的病因与IL-23有关。白塞氏病是多发于各种大小的血管的炎症、即以血管炎为特征的慢性炎症性疾病，认为免疫系的异常、嗜中性粒细胞活化与其发病相关。这种白塞氏病患者体内IL-23与疾病活动性具有显著的相关，另外，在作为相关病状的葡萄膜炎患者的血清中确认到IL-23表达的亢进，这也启示了IL-23助发这种病状。类风湿性关节炎(RA)是慢性自身免疫性疾病，导致关节的变形、强烈的疼痛。类风湿性关节炎患者的滑液和血清中IL-23增加，给药类风湿性关节炎治疗剂TNF阻断剂的患者体内血清中IL-23量与病状程度相关，类风湿性关节炎患者的滑膜中抗IL-23R抗体会抑制TNF-α和IL-6的产生，由此也启示了与该病状的关联。

研究证实IL-23刺激TH17的扩增和维持(Annunziato F.etc.Phenotypic andfunctional features of human Th17 cells.J Exp Med，2007，204(8)：1849-1861.)。故IL-23R对TH17细胞亚群来说是一个关键的作用因子。IL-23-IL23R-TH17-IL-17轴在自身免疫性疾病中的致病性也已被证实。

抗IL-17和IL-23R的四价双特异性抗体能同时结合IL-17R与IL-23抗原，同时阻断IL-23/IL-23R及IL-17/IL-17R信号通路，用于炎症性疾病及自身免疫性疾病。

识别IL-17和IL-23R的四价双特异性抗体的构建、表达及表征，具体过程如下：

1抗体分子的构建

使用抗IL-17单抗与抗IL-23R单抗构建的可结合人IL-23R及IL-17的四价双特异性抗体。第一条多肽链为VL_IL-23R-CL-VL_IL-17-CL(氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示)，第二条多肽链为VH_IL-17-CH1-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示)，第三条多肽链为VH_IL-23R-CH1。(氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)。

2抗体分子的表达及表征

抗体分子表达采用HEK-293细胞，采用实施例3中的操作方法进行瞬时表达，采用Protein A亲和层析将目标产物进行纯化，采用质谱术、SDS-PAGE、HPLC等技术方法将纯化得到的目标蛋白进行表征。结果显示，双特异性四价抗体可以稳定表达。通过ELISA和Biacore测定法来研究对IL-17和IL-23R的结合活性，显示生成的双特异性四价抗体能够同时结合IL-17和IL-23R，并同时阻断它们的活性。

实施例8

人间质表皮转化因子(c-Met)是酪氨酸激酶受体，也是肝细胞生长因子(HGF)已知唯一的受体。HGF与其受体c-Met结合并激活后，可促进肿瘤细胞的增殖、迁徙和血管生成，最终导致恶性肿瘤的侵袭和转移。大量的临床和实验研究表明HGF及其受体c-Met在肿瘤的发生发展中具有重要作用，c-Met的过量表达可见于人的肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌和脑胶质瘤等(Amemiya H等，Oncology，2002，63(3)：286-296；Ho-Yen等，Cancer 2014，120(2)：163-171；Sun B等，PLos One，2012，7(1)：e30143)。

表皮生长因子受体(EGFR)通过介导这些通路调节正常细胞的生长和分化，增加肿瘤细胞的侵袭力、促进血管生成、抑制肿瘤细胞的凋亡，EGFR在肿瘤中的高度表达及其在肿瘤细胞生长、分化中起着重要作用的这些特点，使EGFR成为具有良好前景的肿瘤诊断和治疗的靶点。

1.识别cMET和EGFR的四价双特异性抗体的构建、表达及表征，具体过程如下：

使用抗cMet单抗与抗EGFR单抗构建的可结合人cMet及EGFR的四价双特异性抗体。抗EGFR单抗氨基酸序列采用Cetuximab单抗序列(来源于DRUGBANK)，抗cMet抗体可变区序列来源于专利CN 105688209中的氨基酸序列。第一条多肽链为VH_cMet-CH1-(G₄S)₃-VL_EGFR-CL(氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示)，第二条多肽链为VH_VEGF-CH1-Fc(氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示)，第三条多肽链为VL_cMet-CL(氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示)。

2.抗体分子的表达及表征

抗体分子表达采用HEK-293细胞，采用实施例3中的操作方法进行瞬时表达，采用Protein A亲和层析将目标产物进行纯化，采用质谱术、SDS-PAGE、HPLC等技术方法将纯化得到的目标蛋白进行表征。结果显示，双特异性四价抗体可以稳定表达。通过ELISA和Biacore测定法来研究对cMet和EGFR的结合活性，显示生成的双特异性四价抗体能够同时结合cMet和EGFR，并同时阻断它们的活性。

序列表

<110> 南京华岩生物技术有限公司

<120> 一种能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白及其应用

<130> 100

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 466

<212> PRT

<213> 第一条多肽链氨基酸序列(Artificial)

<400> 1

Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

245 250 255

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

260 265 270

Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr

275 280 285

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser

290 295 300

Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

305 310 315 320

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

325 330 335

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln

340 345 350

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

355 360 365

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

370 375 380

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

385 390 395 400

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

405 410 415

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

420 425 430

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

435 440 445

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

450 455 460

Glu Cys

465

<210> 2

<211> 453

<212> PRT

<213> 第二条多肽链的氨基酸序列(Artificial)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 3

<211> 344

<212> PRT

<213> 第三条多肽链的氨基酸序列(Artificial)

<400> 3

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Arg Thr Val

225 230 235 240

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

245 250 255

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

260 265 270

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

275 280 285

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

290 295 300

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

305 310 315 320

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

325 330 335

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

340

<210> 4

<211> 445

<212> PRT

<213> VHPDL-1-CH1-(G4S)3-VLVEGFR-CL的氨基酸序列(Artificial)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

225 230 235 240

Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

245 250 255

Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

260 265 270

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly

275 280 285

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu

290 295 300

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln

305 310 315 320

Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp

325 330 335

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

340 345 350

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys

355 360 365

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

370 375 380

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

385 390 395 400

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

405 410 415

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

420 425 430

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

435 440 445

<210> 5

<211> 446

<212> PRT

<213> VHVEGFR-CH1-Fc的氨基酸序列(Artificial)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> VL PDL-1-CL的氨基酸序列(Artificial)

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 7

<211> 428

<212> PRT

<213> VL ANG-2-CL-VLVEGF-CL的氨基酸序列(Artificial)

<400> 7

Gln Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Asp His Tyr

85 90 95

Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

210 215 220

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser

225 230 235 240

Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

245 250 255

Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val

260 265 270

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

275 280 285

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

290 295 300

Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

305 310 315 320

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

325 330 335

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Thr Cys Leu Leu Asn Asn

340 345 350

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

355 360 365

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

370 375 380

Ser Thr Tyr Ser Leu Val Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

385 390 395 400

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

405 410 415

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

420 425

<210> 8

<211> 453

<212> PRT

<213> VHVEGF-CH1-Fc的氨基酸序列(Artificial)

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Gln Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Val Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 9

<211> 225

<212> PRT

<213> VHANG-2-CH1的氨基酸序列(Artificial)

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ala Gln Lys Phe Gln Gly

50 55 60

Arg Val Thr Met Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro

100 105 110

Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

130 135 140

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

210 215 220

Val

225

<210> 10

<211> 440

<212> PRT

<213> VLIL-23R-CL-VLIL-17-CL的氨基酸序列(Artificial)

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Ile Leu Tyr Pro

20 25 30

Ser Asn Asn Met Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Arg Ala Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Ser Leu Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

115 120 125

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

130 135 140

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

145 150 155 160

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

165 170 175

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

180 185 190

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

195 200 205

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Ile Val

210 215 220

Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala

225 230 235 240

Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser Arg Gly Asn

245 250 255

Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu

260 265 270

Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe

275 280 285

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val

290 295 300

Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Leu

305 310 315 320

Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val

325 330 335

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

340 345 350

Ser Gly Thr Ala Ser Val Trp Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

355 360 365

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

370 375 380

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

385 390 395 400

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

405 410 415

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

420 425 430

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

435 440

<210> 11

<211> 449

<212> PRT

<213> VH IL-17-CH1-Fc的氨基酸序列(Artificial)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Leu

115 120 125

Pro Ala Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Glu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 12

<211> 223

<212> PRT

<213> VHIL-23R-CH1的氨基酸序列(Artificial)

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Gln Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Asp His Tyr Trp Thr Thr Trp Ile Leu Thr Arg Gln His Pro

35 40 45

Gly Glu Val Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Ser Ser Gly His Thr

50 55 60

Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Leu Asp Thr

65 70 75 80

Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Ala Thr Ala Ala

85 90 95

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Gly Asp Tyr Glu Trp Phe

100 105 110

Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

195 200 205

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215 220

<210> 13

<211> 445

<212> PRT

<213> VHcMet-CH1- (G4S)3-VLEGFR-CL的氨基酸序列(Artificial)

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val

225 230 235 240

Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala

245 250 255

Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn

260 265 270

Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly

275 280 285

Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

290 295 300

Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

305 310 315 320

Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

325 330 335

Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

340 345 350

Asp Lys Arg Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

355 360 365

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

370 375 380

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

385 390 395 400

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

405 410 415

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

420 425 430

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

435 440 445

<210> 14

<211> 449

<212> PRT

<213> VHEGFR-CH1-Fc的氨基酸序列(Artificial)

<400> 14

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Asp Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Glu Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 15

<211> 217

<212> PRT

<213> VLcMet-CL的氨基酸序列(Artificial)

<400> 15

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Cys Gln Ser Lys Glu Asp

85 90 95

Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims

1.一种能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，所述的重组免疫球蛋白包含三条多肽链，其中一条多肽链从氨基端到羧基端包含VHb-CH1-(X)n-VLa-CL，其中，VHb为重链的第二个可变结构域，CH1为重链恒定区的第一恒定结构域，X为连接子，n≥0，VLa为轻链第一个可变结构域，CL为轻链恒定结构域，a为双特异性结合的第一抗原，b为双特异性结合的第二抗原。

2.根据权利要求1所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，所述的双特异性结合的免疫球蛋白的第二条多肽链，从氨基端到羧基端包含VHa-CH1-Fc，其中，VHa为重链的第一个可变结构域，CH1为重链恒定区的第一恒定结构域。

3.根据权利要求1或2所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，所述的双特异性结合的免疫球蛋白的第三条多肽链，从氨基端到羧基端包含VLb-CL，其中，VLb为轻链第二个可变结构域，CL为轻链恒定结构域。

4.根据权利要求2所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，在Fc结构域，包含人IgG重链恒定区的CH2、CH3结构域。

5.根据权利要求1-3任一项所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，CH1结构域与CL结构域均为野生型或突变型结构域。

6.根据权利要求5所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，在CH1结构域与CL结构域进行界面氨基酸突变，使CH1结构域与CL结构域突变的氨基酸带相反电荷或形成极性-非极性相互作用力。

7.根据权利要求5所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，在CH1结构域与CL结构域进行界面氨基酸突变，使CH1结构域或/和CL结构域中的一个或多个氨基酸突变为具有较大侧链体积的氨基酸或/和具有较小侧链体积的氨基酸。

8.根据权利要求7所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，所述的具有较大侧链体积的氨基酸选自精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸。

9.根据权利要求1所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，所述的连接子X是由多个相同或不同氨基酸组成的多肽链。

10.权利要求1-3任一项所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白在制备用于治疗人类疾病的药物中的应用。

11.一种能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，所述的重组免疫球蛋白从氨基端到羧基端包含三条多肽链，其中一条多肽链从氨基端到羧基端包含VLb-CL-(X)n-VLa-CL，其中，VLb为轻链的第二个可变结构域，CL为轻链恒定区结构域，X为连接子，n≥0，VLa为轻链第一个可变结构域，a为双特异性结合的第一抗原，b为双特异性结合的第二抗原。

12.根据权利要求11所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，所述的双特异性结合的免疫球蛋白的第二条多肽链，从氨基端到羧基端包含VHa-CH1-Fc，其中，VHa为重链的第一个可变结构域，CH1为重链恒定区的第一恒定结构域。

13.根据权利要求11或12所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，所述的双特异性结合的免疫球蛋白包含三条多肽链的第三条多肽链从氨基端到羧基端包含VHb-CH1，其中，VHb为重链第二个可变结构域，CH1为重链第一恒定结构域。

14.根据权利要求11-13所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，所述的CH1结构域与CL结构域为野生型或突变型结构域。

15.根据权利要求11-13所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，在所述的CH1结构域与CL结构域进行界面氨基酸突变，使CH1结构域与CL结构域突变的氨基酸带相反电荷或形成极性-非极性相互作用力。

16.根据权利要求11所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，在CH1结构域与CL结构域进行界面氨基酸突变，使CH1结构域或/和CL结构域中的一个或多个氨基酸突变为具有较大侧链体积的氨基酸或/和具有较小侧链体积的氨基酸。

17.根据权利要求16所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白，其特征在于，所述的具有较大侧链体积的氨基酸选自精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；所述具有较小侧链体积的氨基酸选自由丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸。

18.权利要求11-13任一项所述的能结合两种抗原的双特异性重组免疫球蛋白在制备用于治疗人类疾病的药物中的应用。