CN100475849C

CN100475849C - p53四聚化结构域介导的四价单链抗体

Info

Publication number: CN100475849C
Application number: CNB2005101093199A
Authority: CN
Inventors: 黄华樑; 刘梦元; 王祥斌; 尹长城; 林晴
Original assignee: BEIJING ANBOTE GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: Hongye Innovative Antibody Technologies Co ltd
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2005-10-14
Publication date: 2009-04-08
Anticipated expiration: 2025-10-14
Also published as: CN1948343A

Abstract

本发明涉及一种基因工程四价抗体，其特征在于由抗TNF-α抗体、HSA连接肽和人类抑癌蛋白p53四聚化结构域依次连接而成。更具体地说，本发明涉及抗TNF-α的基因工程四价单链抗体：TNF-TeAb，该抗体是将一种抗人TNF-α单链抗体片段和介导人类抑癌蛋白p53的四聚体形成的结构域片段通过HSA连接肽串联在一起构建而成的，并可在其C-末端添加C-myc标签和组氨酸标签((His)₆-tag)。本发明还涉及一种构建、表达、纯化和复性该抗体的方法；该抗体的编码DNA序列、表达载体和含有该载体的宿主细胞。

Description

p53四聚化结构域介导的四价单链抗体

技术领域

本发明涉及基因工程抗体领域，更具体地，涉及一种p53四聚化结构域介导的四价单链抗体，特别是基因工程抗人TNF-α四价单链抗体；这种抗体的构建、表达、纯化和复性方法；含有该抗体编码序列的载体和含有该载体的宿主细胞。

背景技术

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)是上世纪70年代中叶发现的一个细胞因子，最初发现它能引起某些肿瘤组织的出血性坏死，现在研究表明其除了具有抗肿瘤作用外，还在机体的免疫，炎症和病理反应中起着非常重要的作用(参考文献1-2)。TNF-α的拮抗剂包括中和性抗体被认为是多种急慢性炎症疾病，如类风湿性关节炎、牛皮癣、局限性回肠炎和急性内毒素休克等(参考文献3-5)的有效治疗剂。早在1988年，人们在对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)滑膜组织细胞的体外培养物的研究中发现，在无外界刺激剂存在时，前炎性细胞因子的产生仍然可持续几天，提示在该培养体系中有内源性刺激信号调节细胞因子的产生(参考文献6)，随后在该培养体系中加入TNF-α的抗体，其它几种前炎性细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8和GM-CSF的产生都受到明显的抑制(参考文献6-11)。上述事实表明TNF-α是在类风湿炎症反应中具有支配作用的前炎性细胞因子。因此，推测TNF-α抗体在类风湿性关节炎的治疗中具有潜在的临床应用前景。随后进行的用抗TNF-α的单克隆抗体治疗胶原诱导的小鼠关节炎模型验证了上述假说，即抗TNF-α的单克隆抗体可明显的改善小鼠关节炎的临床症状并缓解关节的破坏(参考文献12-14)。TNF-α被证实为RA的有效治疗靶点后，大量靶向TNF-α的生物治疗剂相继被开发出来或正处于不同的研发阶段，其中有三种得到美国FDA的批准，etanercept，一种可溶性的TNF-α受体(参考文献16)；infliximab，一种人-鼠嵌合抗TNF-α单克隆抗体(参考文献15)以及adalimumab，一种抗TNF-α人源单克隆抗体(参考文献17)，这三种上市的生物治疗剂在临床上对类风湿性关节炎都取到了极其有效的治疗作用，并对其它由免疫反应造成的急慢性炎症性疾病如牛皮癣、局限性回肠炎、僵直性脊椎炎、急性眼葡萄膜炎、急性脓毒血症和脑脊髓膜炎等也显示出了良好的治疗前景(参考文献18-21)。另外还有一些小分子的TNF-α的拮抗剂如PEG-sTNFR1、sLTr、CDP-571、CDP-870、MAK-195F和rTBP-1正处在开发阶段和不同期的临床试验阶段。

20世纪80年代后，随着分子生物学的发展和抗体基因结构的阐明，出现了第三代抗体-基因工程抗体，如ScFv及单域抗体等，这些抗体由于分子量小、穿透性强、易于构建并可在大肠杆菌等原核系统中表达而降低生产成本，还可以进一步进行基因工程改造形成多价抗体以提高亲和力和体内的半寿期，而显示出了很好的应用前景(参考文献22，23)。

人类p53基因产物是一个磷酸化蛋白，其主要功能是对细胞周期起负调控作用，抑制细胞的恶性转化。野生型的p53蛋白是以四聚体的形式发挥生理功能的，每个单体由393个氨基酸残基组成，具有四个重要的结构域，其中第20-40位的氨基酸残基具有类似于转录因子的酸性活化区即反式激活域；第90-286位的氨基酸残基为特异的DNA结合域；第319-360位的氨基酸残基为四聚化结构域，C-末端的第363-386位的氨基酸残基构成了p53蛋白的碱性区，对p53与特异的DNA结合起负调控作用。研究表明第319-360位的四聚化结构域氨基酸残基的可形成一段α-螺旋和一段β-折叠，两个单体上的同一结构分别以反向平行的方式结合在一起，形成二聚体，然后，两个二聚体再以反向平行的方式形成四聚体(参考文献24-26)。P53蛋白的这一特殊的结构域为构建基因工程四价抗体提供了可能。

发明内容

本发明将P53蛋白的四聚化结构域引入基因工程抗体的构建，通过它来介导单链抗体自我装配成四聚体以增加单链抗体对抗原的亲和力并延长体内的半寿期，构建成抗TNF-α的四价单链抗体的原核表达质粒，通过大肠杆菌的高效表达、目的蛋白的分离和纯化及体外活性分析，表明构建的四价抗体比单链抗体具有更高的亲和力和中和TNF-α的能力，体内活性表明，四价单链抗体能明显的改善胶原诱导的大鼠关节炎临床症状，抑制关节炎大鼠的自身免疫反应，降低前炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的表达量，显示出了良好的临床应用前景。

因此在本发明的一个方面，提供了一种用于治疗多种急慢性炎症性疾病如类风湿性关节炎、牛皮癣、局限性回肠炎，急性内毒素休克和急性脓毒血症的基因工程四价单链抗体药物。

本发明在另一个方面，提供了构建该基因工程四价抗体的方法。

本发明所述的四价单链抗体TNF-TeAb包含的抗TNF-α鼠源单链抗体TNF-scFv的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)如下：

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKEHFAF SLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGDAMDYWGQGTSVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRSIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKMLMYSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTIS SVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGTKLEIK

本发明所述的HSA连接肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)如下：

ALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIEL

本发明所述的四价单链抗体TNF-TeAb包含的P53四聚化结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)如下：

KKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPG

本发明所述的四价单链抗体TNF-TeAb的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)如下：

1 CAGATCCAGCTGGTTCAGTCCGGTCCGGAACTGAAAAAACCGGGTGAAAC

51 CGTTAAAATCTCCTGCAAAGCTTCCGGTTACACCTTCACCCACTACGGTA

101 TGAACTGGGTTAAACAGGCTCCGGGTAAAGGTCTGAAATGGATGGGTTGG

151 ATCAACACCTACACCGGTGAACCGACCTACGCTGACGACTTCAAAGAACA

201 CTTCGCTTTCTCCCTGGAAACCTCCGCTTCCACCGTTTTCCTGCAGATCA

251 ACAACCTGAAAAACGAAGACACCGCTACCTACTTCTGCGCTCGTGAACGT

301 GGTGACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACCTCCGTTACCGTTTCCTC

351 CACTAGTGGAGGCGGTGGGAGCGGCGGTGGTGGTTCTGGGGGTGGCGGAA

401 GCTCTAGATCCATCGTTATGACCCAGACCCCGAAATTCCTGCTGGTTTCC

451 GCTGGTGACCGTGTTACCATCACCTGCACCGCTTCCCAGTCCGTTTCCAA

501 CGACGTTGTTTGGTACCAGCAGAAACCGGGTCAGTCCCCGAAAATGCTGA

551 TGTACTCCGCTTTCAACCGTTACACCGGTGTTCCGGACCGTTTCACCGGT

601 CGTGGTTACGGTACCGACTTCACCTTCACCATCTCCTCCGTTCAGGCTGA

651 AGACCTGGCTGTTTACTTCTGCCAGCAGGACTACAACTCCCCGCGTACCT

701 TCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAAGAATTCGCGCTGGAAGTGGAT

751 GAAACCTATGTGCCGAAAGAATTTAACGCGGAAACCTTTACCTTTCATGC

801 GGATATTGAGCTCAAAAAAAAACCGCTGGATGGCGAATATTTTACCCTGC

851 AGATTCGCGGCCGCGAACGCTTTGAAATGTTTCGCGAACTGAACGAAGCG

901 CTGGAACTGAAAGATGCGCAGGCGGGCAAAGAACCGGGCGAACAGAAACT

951 GATTAGCGAAGAAGATCTGAACGGATCCGTCGAGCACCACCACCACCACC

1001 ACTGA

本发明所述的四价单链抗体TNF-TeAb氨基酸序列(SEQ ID NO：5)如下：

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKEHFAFSLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGDAMDYWGQGTSVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRSIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKMLMYSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTIS SVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGTKLEIKEFALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIELKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGEQKLISEEDLNGSAEHHHHHH

在本发明的另一个方面，提供了一种用于表达该抗体的载体。

在本发明的另一个方面，提供了一种含有上述表达载体的大肠杆菌宿主细胞。

在本发明的另一个方面，提供了一种采用固定化金属(Ni)离子亲和层析纯化该抗体的方法。

在本发明的另一个方面，提供了一种通过缓慢透析逐渐除去变性剂复性该抗体的方法。

更具体地，本发明涉及一种四价的单链抗体，其特征在于由单链抗体与介导人类抑癌蛋白p53四聚体形成的结构域(四聚化结构域)构成的融合蛋白在表达后自然聚合而成。

在本发明的一个实施方案中，所述的四价单链抗体，其特征在于由单链抗体、HSA连接肽和p53四聚化结构域依次连接而成。

在本发明另一个实施方案中，所述的四价单链抗体中所述的单链抗体是抗TNF-α抗体。

在本发明另一个实施方案中，所述的四价单链抗体中所述抗TNF-α抗体可以是单链抗体片段，抗体Fab片段或单域抗体片段。

在本发明另一个实施方案中，所述的四价单链抗体中所述的四价单链抗体的C-末端可带有C-myc标签和组氨酸标签。

在本发明另一个实施方案中，所述的四价单链抗体是由抗人TNF-α单链抗体，HSA连接肽和人类抑癌蛋白p53四聚化结构域依次连接而成，所述的人TNF-α单链抗体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

在本发明另一个实施方案中，所述的四价单链抗体是由抗人TNF-α单链抗体，HSA连接肽和人类抑癌蛋白p53四聚化结构域依次连接而成，所述的HSA连接肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明另一个实施方案中，所述的四价单链抗体是由抗人TNF-α单链抗体，HSA连接肽和人类抑癌蛋白p53四聚化结构域依次连接而成，所述介导人类抑癌蛋白p53四聚体形成的结构域具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

在本发明另一个实施方案中，所述的四价单链抗体是由抗人TNF-α单链抗体，HSA连接肽和人类抑癌蛋白p53四聚化结构域依次连接而成的TNF-TeAb，具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

本发明还涉及DNA序列，其特征在于其编码上述任何一种四价单链抗体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述DNA序列具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

本发明还涉及一种表达载体，其特征在于含有上述DNA序列。

在本发明的一个优选实施方案中，表达载体是TNF-TeAb/pTTA。

本发明还涉及一种宿主细胞，其特征在于含有上述表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。在本发明的一个特别优选实施方案中，所述大肠杆菌是含有上述表达载体的BL21(DE3)star大肠杆菌。

本发明还涉及一种构建基因工程四价单链抗体的方法，其特征在于把单链抗体编码序列和人p53蛋白四聚化结构域的编码序列进行串联表达。

本发明另外涉及一种复性上述任何一种的四价单链抗体的方法，其特征在于用硼酸盐缓冲液为复性液，通过缓慢透析的方法逐渐去除变性剂尿素，使变性的的四价单链抗体重新折叠成有具有生物学活性的蛋白。

另外，本发明涉及一种用于治疗或预防急慢性炎症性疾病如类风湿性关节炎、牛皮癣、局限性回肠炎、僵直性脊椎炎、急性眼葡萄膜炎、急性脓毒血症和脑脊髓膜炎的药物组合物，其特征在于包含上述任何一种四价单链抗体和药用载体。

本发明进一步涉及上述任何一种四价单链抗体在制备用于治疗或预防急慢性炎症性疾病如类风湿性关节炎、牛皮癣、局限性回肠炎、僵直性脊椎炎、急性眼葡萄膜炎、急性脓毒血症和脑脊髓膜炎的药物中的应用。

发明详述

在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。

本发明所构建的基因工程四价单链抗体是采用基因工程重组的方法构建的，是抗同一分子TNF-α的四个抗体分子形成的四聚体。具体地，本文所述的抗TNF-α四价单链抗体是指首先将抗TNF-α的抗体片段和p53蛋白四聚化结构域通过HSA连接肽(HSA连接肽，来源于人血清白蛋白的一段小肽，序列如SEQ ID NO：2所示)串联在一起构建成的抗TNF-α单体分子，然后通过四聚化结构域介导单体分子的同源四聚化而形成的四价抗TNF-α的抗体。对于每个单体分子，可以在该单体的C端添加c-myc标签(氨基酸序列为：EQKLISEEDLN)和组氨酸标签((His)₆-tag)(参考文献27，28)，用于活性检测和纯化，也可以不加。抗TNF-α抗体片段可以是单链抗体片段(scFv：single chain fragment of variable region)，抗体Fab片段或单域抗体片段(VH或VL)。更具体地，是将抗TNF-α的单链抗体片段和p53蛋白四聚化结构域通过HSA连接肽串联在一起构建成的抗TNF-α单链抗体分子，然后通过四聚化结构域介导单链抗体分子的同源四聚化而形成的抗TNF-α四价单链抗体。它具有以下优点：

1.具有基因工程抗体本身所固有的优点如分子量小、穿透性强、易于构建和表达、便于大量发酵生产。

2.不与Fc受体结合，可减少因广泛存在的Fc受体而带来的不利影响。

3.通过单链抗体的寡聚化克服了单链抗体亲和力低和半寿期短而带来的不利影响，具有很好的临床应用前景。

在本发明的工作中，为了证实四价单链抗体的优越性，我们同时也构建了抗TNF-α单链抗体，其构建方式只是在单链抗体的C-末端不再连接P53蛋白的四聚体结构域，构建时所用的基因序列、酶切位点、质粒载体以及后面的表达、纯化和复性都与四价单链抗体一样。为了更加详细的介绍本发明的四价单链抗体，在下面的技术方案和实施例当中，我们将不再具体地介绍抗TNF-α单链抗体

本发明的一个优选技术方案如下：

首先通过文献报道的具有中和作用的抗TNF-α单克隆抗体Di62(参考文献29)的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列设计成完整的单链抗体编码DNA序列，同时根据文献报道的人类野生型p53蛋白的四聚化结构域氨基酸序列设计成编码这段结构域的DNA序列。然后采用全合成的方式合成了两段基因片段，第一段为单链抗体的编码序列，第二段为编码HSA肽和四聚化结构域的序列。把两段合成的基因片段通过酶切、连接和转化反应分别克隆进表达载体pTMF中，构建成四价单链抗体的表达载体TNF-TeAb/pTTA。

用此表达载体TNF-TeAb/pTTA转化宿主细胞BL21(DE3)菌株，利用IPTG在37℃条件下诱导抗体的高效表达，然后通过表达产物的分离和包涵体蛋白的制备，并在变性的条件下利用Ni离子亲和层析柱纯化TNF-TeAb，通过一步亲和层析，TNF-TeAb可得到初步的纯化。采用缓慢透析的方法逐渐的除去变性剂尿素，对四价单链抗体进行复性，复性后的样品用高效液相色谱检测，确定复性产物中多价抗体的存在和各自所占的相对百分比。采用酶联免疫吸附(ELISA)实验检测TNF-TeAb的抗原结合活性及特异性.。采用ELISA方法检测TNF-TeAb抑制TNF-α与其受体的结合，并确定其50％抑制时的浓度(IC₅₀)。采用MTT法检测TNF-TeAb体外抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用并与单链抗体进行比较，测定它们的抑制50％细胞杀伤时的浓度(IC₅₀)。建立胶原诱导的大鼠关节炎模型，利用通过分离、纯化和复性的四价单链抗体TNF-TeAb对诱发关节炎的大鼠进行治疗，并通过大鼠关节炎临床症状的变化，抗II型胶原抗体的变化，以及前炎性细胞因子的变化来评价四价抗体TNF-TeAb对大鼠关节炎模型是否具有治疗作用。

应当指出，在本说明书的上下文中，尤其是在实施例公开内容的基础上，本发明的其它方面和优点对于本领域的技术人员来说是很容易理解的。

附图说明

图1.构建TNF-TeAb的操作过程简图。

图2.用于构建TNF-TeAb的各中间载体和构建成功的含有TNF-TeAb的载体简图。

图3.采用重叠PCR拼接用于构建TNF-TeAb的载体的抗TNF-α单链抗体DNA的过程简图，其中数字1-20分别代表用于构建的合成寡聚核苷酸片段，S1和S2分别表示最后一轮扩增时两端的引物。字母A、B、C、D、E、F、G、H、I、J分别表示第一轮配对延伸的产物；罗马数字I、II、III、IV和V表示第二轮配对延伸的产物；符号UP、DOWN分别代表构建过程中的第三轮配对延伸产物，符号WHOLE代表终产物。

图4.构建TNF-TeAb过程中采用重叠PCR拼接抗TNF-α单链抗体各中间产物和终产物的琼脂糖电泳鉴定。其中泳道1为UP，泳道2为DOWN，泳道3为WHOLE，泳道4为标准分子量。

图5.构建TNF-TeAb过程中采用重叠PCR拼接P53四聚化结构域DNA(上游带有HSA连接肽，下游带有C-myc标签)的过程简图，其中数字1-9分别代表用于构建的合成寡核苷酸片段，罗马数字I、II、III、IV代表第一轮配对延伸产物，UP、DOWN分别代表第二轮配对延伸产物，WHOLE为终产物。

图6.重叠PCR拼接构建P53四聚化结构域DNA终产物的琼脂糖电泳鉴定，泳道1分子量标准(TaKaRa大连宝生物)：DL2000；泳道2为包含有HSA连接肽、四聚化结构域和C-myc标签的全长片段WHOLE，大小为255bp。

图7.载体TNF-TeAb/pTTA的酶切鉴定图，泳道1为分子量标准(大连宝生物公司)：DL2000；泳道2为用XhoI和BamHI的酶切结果，切下的大约为1000bp条带，为四聚体编码DNA片段，泳道3为XhoI和EcoRI双酶切结果，切下的750bp条带，为单链抗体编码DNA片段。

图8.37℃诱导TNF-TeAb胞内高效表达的SDS-PAGE鉴定结果，泳道1：标准分子量蛋白(上海生物化学研究所)；泳道2：载体pTMF的全菌蛋白；泳道3：载体pTTA的全菌蛋白；泳道4：载体pTMF的超声上清；泳道5：载体pTTA的超声上清；泳道6：载体pTMF的超声沉淀；泳道7：载体pTTA的超声沉淀。

图9.37℃诱导TNF-TeAb表达产物的Western blot鉴定，泳道1：TNF-TeAb/pTTA表达产物超声沉淀的Western-blotting鉴定。泳道2：预染蛋白分子量标准(NEB公司)

图10.固定化金属(Ni)离子亲和层析纯化TNF-TeAb的SDS-PAGE鉴定，泳道1：TNF-TeAb包涵体蛋白的变性上清；泳道2：上样后的流穿组分；泳道3：Ni-NTA洗涤缓冲液的洗涤组分；泳道4：目的蛋白利用包涵体洗脱液的洗脱组分；泳道5：低分子量蛋白标准(购自上海生物化学研究所)。

图11.高效液相色谱(HPLC)检测TNF-TeAb复性样品中的多价抗体的形成情况，其中A为样品TNF-TeAb的色谱分析图；B为标准分子量蛋白BSA(牛血清白蛋白)的色谱分析图；C为标准分子量蛋白IgG(免疫球蛋白)的色谱分析图。

图12.TNF-TeAb的ELISA检测结果。第一条曲线：1μg/ml重组人TNF-α；第二条曲线：1μg/ml BSA。

图13.ELISA检测TNF-TeAb及TNF-scFv体外抑制TNF-α与其受体结合。

图14.MTT法检测TNF-TeAb及TNF-scFv体外抑制TNF-α对小鼠成纤维细胞L929的细胞毒效应。

图15.治疗过程中各组大鼠的临床评分的变化情况和统计。

图16.治疗过程中，各组大鼠的左后腿(致炎侧)踝关节的周长的变化情况和统计。

图17.治疗过程中，各组大鼠右后腿(非致炎侧)踝关节周长的变化情况统计。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，本说明书中的实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：重叠PCR构建抗TNF-α单链抗体：

将抗TNF-α单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列，一段多肽序列(GGGGSGGGGSGGGGS)连接起来，设计成抗TNF-α单链抗体(SEQID No 1)。然后按照大肠杆菌偏爱的密码子将其反向翻译成一段DNA序列(见SEQ ID No 4)，并把这段DNA序列按照互补的原则进一步拆分成22个寡聚核苷酸片段(下述序列1-20，S1和S2)，以便于使用重叠PCR技术拼接成全长的抗TNF-α单链抗体DNA片段。以下为用于拼接抗TNF-α单链抗体全基因片段的寡聚核苷酸片段(5’→3’)。

1.TTC CTC GAG CAG ATC CAG CTG GTT CAG TCC GGT CCGGAA CTG AAA AAA CCG GGT(SEQ ID NO：6)

2.GTA ACC GGA AGC TTT GCA GGA GAT TTT AAC GGT TTCACC CGG TTT TTT CAG TTC(SEQ ID NO：7)

3.TGC AAA GCT TCC GGT TAC ACC TTC ACC CAC TAC GGTAAC TGG GTT AAA CAG(SEQ ID NO：8)

4.GAT CCA ACC CAT CCA TTT CAG ACC TTT ACC CGG AGCCTG TTT AAC CCA GTT CAT(SEQ ID NO：9)

5.AAA TGG ATG GGT TGG ATC AAC ACC TAC ACC GGT GAACCG ACC TAC GCT GAC GAC(SEQ ID NO：10)

6.GGA GGT TTC CAG GGA GAA AGC GAA GTG TTCTTT GAAGTC GTC AGC GTA GGT CGG(SEQ ID NO：11)

7.TTC TCC CTG GAA ACC TCC GCT TCC ACC GTT TTC CTGCAG ATC AAC AAC CTG AAA(SEQ ID NO：12)

8.TTC ACG AGC GCA GAA GTA GGT AGC GGT GTC TTC GTTTTT CAG GTT GTT GAT GTC(SEQ ID NO：13)

9.TAC TTC TGC GCT CGT GAA CGT GGT GAC GCT ATG GACTAC TGG GGT CAG GGT ACC(SEQ ID NO：14)

10.CCC ACC GCC TCC ACT AGT GGA GGA AAC GGT AAC GGAGGT ACC CTG ACC CCA GTA(SEQ ID NO：15)

11.ACT AGT GGA GGC GGT GGG AGC GGC GGT GGT GGT TCTGGG GGT GGC GGA AGC TCT(SEQ ID NO：16)

12.CAG GAA TTT CGG GGT CTG GGT CAT AAC GAT GGA TCTAGA GCT TCC GCC ACC CCC(SEQ ID NO：17)

13.CAG ACC CCG AAA TTC CTG CTG GTT TCC GCT GGT GACCGT GTT ACC ATC ACC TGC(SEQ ID NO：18)

14.CCA AAC AAC GTC GTT GGA AAC GGA CTG GGA AGC GGTGCA GGT GAT GGT AAC ACG(SEQ ID NO：19)

15.TCC AAC GAC GTT GTT TGG TAC CAG CAG AAA CCG GGTCAG TCC CCG AAA ATG CTG(SEQ ID NO：20)

16.CGG AAC ACC GGT GTA ACG GTT GAA AGC GGA GTA CATCAG CAT TTT CGG GGA CTG(SEQ ID NO：21)

17.CGT TAC ACC GGT GTT CCG GAC CGT TTC ACC GGT CGTGGT TAC GGT ACC GAC TTC(SEQ ID NO：22)

18.CAG GTC TTC AGC CTG AAC GGA GGA GAT GGT GAA GGTGAA GTC GGT ACC GTA ACC(SEQ ID NO：23)

19.GTT CAG GCT GAA GAC CTG GCT GTT TAC TTC TGC CAGCAG GAC TAC AAC TCC CTG(SEQ ID NO：24)

20.TTT GAT TTC CAG TTT GGT ACC ACC ACC GAA GGT ACGCGG GGA GTT GTA GTC CTG(SEQ ID NO：25)

S1.TTC CTC GAG CAG ATC CAG CT(SEQ ID NO：26)

S2.GGC GAA TTC TTT GAT TTC CAG TTT GGT(SEQ ID NO：27)

步骤1：将片段1-20各自配对重叠延伸，不加引物，反应产物不需要回收，直接进行下一步反应。用于反应的每个片段各1μl(10pmol)；2μl10×PCR缓冲液(500mM KCl，50mM Tris pH 8.5，25mM MgCl₂下同)；2μldNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，每种2mM)(购自大连宝生物技术公司，下同)；0.3μl pfu(1U)(购自大连宝生物技术公司，下同)；水14μl。反应条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec；50℃退火30sec；72℃延伸30sec；15个循环。得到反应产物A(片段1和2配对)、B(片段3和4配对)、C(片段5和6配对)、D(片段7和8配对)、E(片段9和10配对)，F(片段11和12配对)、G(片段13和14配对)、H(片段15和16配对)、I(片段17和18配对)、J(片段19和20配对)。

步骤2：将反应产物A和B，C和D，E和F，G和H，I和J各自配对重叠延伸，不加引物。用于反应的每种物质各10μl(10pmol)。反应条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec；50℃退火30sec；72℃延伸30sec；10个循环。经1％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒进行回收反应产物：I(A和B配对)、II(C和D配对)、III(E和F配对)、IV(G和H配对)、V(I和J配对)。每个拼接片段的大小大约为170bp。

步骤3：将I、II和III配对，IV和V配对，形成2个反应体系，每个反应体系都添加各自的引物(片段1和片段12对应I、II与III配对，片段13和片段20对应、IV与V配对)，进行PCR扩增。用于反应的每种物质各1μl(约100ng)；2μl 10×PCR缓冲液；2μldNTPs(每种2mM)；引物各1μl(10pmol)；0.3μlpfu(1U)；补加水至终体积为20μl。反应条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec；50℃退火30sec；72℃延伸30sec；25个循环。经1％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒进行回收，反应产物为UP(I和II配对)的大小约为430bp，DOWN(III、IV和V配对)的大小约为340bp。

步骤4：将反应产物UP和DOWN配对，添加引物(片段S1和片段S2)进行PCR扩增。反应产物UP和DOWN各1μl(约100ng)；2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTP(每种2mM)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl Taq(1U)；水12μl。反应条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec；50℃退火30sec；72℃延伸1min；25个循环。得到的反应产物WHOLE(约750bp)经1％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒进行回收。

上述操作步骤流程参见图3，中间步骤的反应产物的PCR鉴定见图4。

将上述750bp的DNA片段和载体pTMF同时进行XhoI和EcoRI(Promega)双酶切反应，具体酶切反应条件参照酶供应商的说明书。载体pTMF来源于载体pET28a(+)(Novagen公司)，由本公司将合成的一段多克隆位点取代载体pET28a(+)的多克隆位点构建而成(见参考文献30)。采用胶回收试剂盒回收PCR产物的酶切产物(750bp左右)和pTMF酶切大片段产物(5300bp左右)，进行连接和转化TOP10菌株，进行阳性重组克隆的鉴定和序列测定。选择序列正确的克隆命名为TNF-scFv/pTMF。其中所进行的酶切反应、连接反应、细菌感受态制备和转化反应的具体操作如下：

酶切反应：使用20μl体系，对约1μg pTMF空载体或多克隆位点DNA片段分别进行ZhoI和EcoRI(Promega公司)双酶切反应。酶的用量、缓冲溶液以及反应条件参见所用限制性内切酶的说明书。酶切产物经过1％琼脂糖电泳后，采用胶回收试剂盒(上海华舜公司)回收特异大小的片段，pTMF空载体酶切产物大小约5300bp。

连接反应：酶切后的pTMF载体片段：50-100ng；酶切后的单链抗体DNA片段：载体的3-10倍(摩尔比)；10×T4DNA连接酶缓冲溶液：2μl；T4DNA连接酶(大连宝生物公司)1U；补加ddH₂O至总体积为20μl。16℃过夜连接。

制备大肠杆菌感受态细胞：将TOP 10菌株(Invitrogen公司)转接在2mlLB培养基((10g/l tryptone(GIBCO公司)，5g/l yeast extract(GIBCO公司)，5g/l NaCl，pH7.5))中37℃振荡培养过夜。按1∶100的比例转接至20-40ml无抗生素LB培养基中，快速振荡培养至A₆₀₀为0.3-0.4时(约2.5小时)停止，冰浴15分钟，4℃4,000rpm离心10分钟收集菌体，弃上清，加入10ml预冷的0.1mol/ml CaCl₂(Sigma公司)，重悬混匀，冰浴20分钟，4℃4,000rpm离心10分钟，弃上清后加入预冷的含12％甘油的0.1mol/ml CaCl₂1-2ml，轻轻悬起菌体，每管200μl，-80℃冻存备用。

连接产物的转化：在200μl感受态细胞中加入1μl上述连接混合物，混匀后冰浴30分钟，42℃热激100秒，然后迅速冰浴2分钟。向冰浴后的混合物中加入0.8ml LB培养基，37℃轻摇(＜150rpm)或静置45分钟复苏；10,000rpm离心1分钟，弃上清，加50～100μl LB培养基重悬沉淀，涂布于LB-K平板(10g/l tryptone，5g/l yeast extract，5g/l NaCl，15g/l琼脂(SIGMA公司)，50μg/ml卡那霉素(SIGMA公司)，pH7.5)，37℃培养过夜。

阳性重组克隆的筛选与鉴定：挑取卡那霉素筛选阳性的连接产物单克隆，接入2ml LB-K培养基(10g/l tryptone，5g/l yeast extract，5g/l NaCl，50μg/ml卡那霉素(SIGMA公司)，pH7.5)，37℃振荡过夜培养，然后按照质粒提取试剂盒(上海华舜公司)的说明书提取质粒DNA。按照下述方法进行PCR鉴定。

PCR鉴定：在20μl的扩增体系中加入0.1-1μl质粒DNA(约20-200ng)，上游引物(S1-TTC CTC GAG CAG ATC CAG CT)(SEQ ID NO：25)和下游引物(S2-GGC GAA TTC TTT GAT TTC CAG TTT GGT)(SEQ IDNO：26)各10pmol，2μl10×Taq酶缓冲液和2μl 2mmol/ml的dNTPs，Taq酶1U，补水至总体积20μl。具体反应程序：94℃预变性5分钟后，94℃变性40秒，54℃退火40秒，72℃延伸40秒，扩增25个循环，取5μlPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小约为750bp。

实施例2：重叠PCR方法构建四聚化结构域和HSA的融合基因

将人类野生型p53四聚化结构域的氨基酸序列(SEQ ID No 3)和人血清白蛋白连接肽(HSA，SEQ ID No.2)的氨基酸序列融合并在C-末端加上C-myc标签，形成一段氨基酸序列，并按照大肠杆菌偏爱的密码子反向翻译成编码的DNA序列(SEQ ID No 4)，把这段DNA序列按照互补的原则进一步的拆分成9个聚核苷酸片段(1-9)，以便于利用重叠PCR拼接成完整的四聚化结构域片段。以下为用于拼接四聚体结构域全基因片段的寡聚核苷酸片段(5’→3’)。

1.TTC GAA TTC GCG CTG GAA GTG GAT GAA ACC TAT GTGCCG AAA GAA TTT AAC GCG(SEQ ID NO：28)

2.TTT GAG CTC AAT ATC CGC ATG AAA GGT AAA GGT TTCCGC GTT AAA TTC TTT CGG(SEQ ID NO：29)

3.GCG GAT ATT GAG CTC AAA AAA AAA CCG CTG GAT GGCGAA TAT TTT ACC CTG CAG(SEQ ID NO：30)

4.TTC GCG AAA CAT TTC AAA GCG TTC GCG GCC GCG AATCTG CAG GGT AAA ATA TTC(SEQ ID NO：31)

5.TTT GAA ATG TTT CGC GAA CTG AAC GAA GCG CTG GAACTG AAA GAT GCG CAG GCG(SEQ ID NO：32)

6.TTC GCT AAT CAG TTT CTG TTC GCC CGG TTC TTT GCC CGCCTG CGC ATC TTT CAG(SEQ ID NO：33)

7.CAG AAA CTG ATT AGC GAA GAA GAT CTG AAC GGA TCCGCC(SEQ ID NO：34)

8.GGC GGA TCC GTT CAG ATC TT(SEQ ID NO：35)

9.TTC GAA TTC GCG CTG GAA GT(SEQ ID NO：36)

步骤1：将片段1和2、3和4、5和6、7和8各自配对延伸，不加引物，反应产物不需回收，直接用于下一步的反应。用于反应的每个片段各1μl(10pmol)；2μl10×PCR缓冲液(500mM KCl，50mM Tris pH 8.5，25mMMg(Cl)₂下同)；2μl dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，每种2mM)(购自大连宝生物技术公司，下同)；0.3μl pfu(1U)(购自大连宝生物技术公司，下同)；水14μl。反应条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec；54℃退火30sec；72℃延伸30sec；15个循环。得到反应产物A(片段1和2配对)、B(片段3和4配对)、C(片段5和6配对)、D(片段7和8配对)。

步骤2：将反应产物A和B、C和D进行配对重叠延伸，不加引物。用于反应的每种物质各10μl(10pmol)。反应条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec；54℃退火30sec；72℃延伸30sec；10个循环。经1％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒进行回收反应产物：UP(A和B配对)和(C和D配对)，其中片段UP的大小约为170bp，片段DOWN的大小约为120bp。

步骤3：将反应产物UP和DOWN配对，添加引物(片段8和片段9)进行PCR扩增。反应产物UP和DOWN各1μl(约100ng)；2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTP(每种2mM)；引物各1μl(10pmol)；0.3μlTaq(1U)；水12μl。反应条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec；54℃退火30sec；72℃延伸1min；25个循环。得到的反应产物WHOLE(255bp)经1％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒进行回收。

上述操作步骤流程参见图5，反应终产物WHOLE的琼脂糖凝胶电泳见图6。

步骤4：将上述255bp的DNA片段和载体TNF-scFv/pTMF同时进行EcoRI和BamHI(Promega)双酶切反应，具体酶切反应条件参照酶供应商的说明书。采用胶回收试剂盒回收PCR产物的酶切产物(250bp左右)和TNF-scFv/pTMF酶切大片段产物(6000bp左右)，进行连接和转化TOP10菌株，进行阳性重组克隆的鉴定和序列测定。选择序列正确的克隆命名为TNF-TeAb/pTTA。其中所进行的酶切反应、连接反应、细菌感受态制备和转化反应的具体操作参照实施例1的方法进行。

阳性重组克隆的鉴定同样参照实施例1的方法进行，所用的PCR扩增引物为：

上游引物(P1：5’-TTC GAA TTC GCG CTG GAA GT-3’)，(SEQ IDNO：36)下游引物(P2：5’-GGC GGA TCC GTT CAG ATC TT-3’)(SEQ IDNO：35)，PCR扩增产物为255bp。

步骤5：质粒TNF-TeAb/p TTA的酶切鉴定

挑选步骤4鉴定出的阳性克隆接种3ml LB-K(卡那霉素)液体培养基，37℃振荡培养过夜，然后按照质粒提取试剂盒(上海华舜公司)的说明书提取质粒DNA并按实施例1所述的方法进行酶切鉴定，反应分为2个体系，第1个体系为XhoI和BamHI酶切，第2个体系为EcoRI和XhoI酶切，酶切结果见图7。

实施例3：TNF-TeAb的诱导表达

(1)将TNF-TeAb/pTTA转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)

按照实施例1中所述制备感受态细胞的方法，制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。按照质粒提取试剂盒(上海华舜公司)的说明书提取质粒TNF-TeAb/pTTA，按照实施例1所述的转化方法进行转化实验，并如实施例1所述进行鉴定。

(2)诱导表达

将分别转化了载体TNF-TeAb/pTTA和载体pTMF的BL21(DE3)涂LB-K平板，37℃过夜培养，然后挑取单克隆，接种于5ml LB-K液体培养基中，在大试管内，37℃摇床培养过夜(200转/分钟)。次日取过夜培养物按1/100的比例转接到250ml LB-K液体培养基中，继续37℃摇床培养(200转/分钟)至A₆₀₀＝0.6，补加IPTG(大连宝生物公司)至终浓度为0.4mmol/ml，继续在37培养4小时，进行诱导表达。室温8000rpm离心10分钟，收集菌体，悬于1/5培养体积的PBS缓冲液中，进行菌体超声破碎。经过室温12,000m离心10分钟后，收集离心上清和沉淀，将离心沉淀悬浮在1/5培养体积的PBS中。按照《分子克隆实验指南》(金冬雁，黎孟枫译，1996，科学出版社)，采用还原SDS-PAGE电泳和Western blot检测上述超声上清和超声沉淀中的TNF-TeAb表达情况，并使用数字图象分析仪(美国Alpha Innotech公司，AlphaImage 2200 Documentation &analysis system)确定胞内可溶表达和包涵体表达的相对比例。SDS-PAGE电泳(图8)和Western blot(图9)的结果表明，采用上述诱导表达的方法，TNF-TeAb主要以包涵体的形式表达，其通过SDS-PAGE电泳的单体形式大约为40kD，与理论计算值相符，包涵体表达量大约占菌体蛋白的30％，占包涵体蛋白的50％。

实施例4：变性条件下采用固定化金属(Ni²⁺)亲和层析纯化TNF-TeAb

将上述250ml的37℃诱导表达产物室温12,000rpm离心10分钟，并重悬在1/5体积(50ml)的超声缓冲液(50mM Tris-HCl pHS.0，100mM NaCl，2mM EDTA，100μg/ml溶菌酶)中，搅拌2小时，4℃放置过夜。用连续超声仪超声30分钟，功率为800W。于4℃，8000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用超声缓冲液洗一次，然后用包涵体洗涤缓冲液洗一次，每次洗涤均在室温下摇床振摇2小时，然后，于4℃，8000rpm离心20分钟，收集沉淀。在沉淀中加入少许(1ml)的包涵体变性液(8mol/L Urea，20mmol/LTris-Cl(pH8.0)，0.15mol/L NaCl，10mmol/L imidazole)，用玻棒碾磨沉淀使其分散，然后补加包涵体变性液至50ml。室温下摇床振摇过夜，使包涵体蛋白充分变性溶解，然后于4℃，8000rpm离心20分钟，收集离心上清。将镍离子亲和层析柱料(Ni²⁺-NTA)进行装柱，然后用10体积的包涵体变性缓冲液进行平衡，将上述的包涵体变性上清上柱，待上清流穿柱体后，用Ni-NTA洗涤缓冲液(8mol/L Urea，20mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，0.15mol/LNaCl，20mmol/L imidazole)洗涤20柱体积至基线，充分的去除非特异结合的蛋白。用含有250mM咪唑的包涵体洗脱缓冲液(8mol/L Urea，20mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，0.15mol/L NaCl，250mmol/L imidazole)洗脱结合在柱上的目的蛋白，收集洗脱峰。用0.5M的NaOH洗柱，去除除残留在柱上的少量蛋白和非蛋白的杂质，然后再用20％的乙醇过柱，将柱保存在4备用。

上面的流穿组分、洗涤组分和洗脱组分直接进行还原SDS-PAGE检测，鉴定纯化效果(图10)。SDS-PAGE的结果显示：目的蛋白在变性的条件下挂柱良好，流穿组分中几乎不含目的蛋白，小量非特异结合的杂蛋白可用20mM的咪唑进行充分的洗涤而除去。用数字图象分析仪(美国Alpha Innotech公司，AlphaImage 2200Documentation & analysis system)确定TNF-TeAb经上述方法纯化后，纯度可达到95％以上。

实施例5：利用缓慢透析除去变性剂的方法复性TNF-TeAb

将剪成适当长度的透析袋在较大体积的2％NaHCO₃，1mmol/L EDTApH8.0中煮10分钟后用ddH₂O冲洗，再在1mmol/L EDTA pH8.0中煮10分钟，存于4℃，用前以ddH₂O冲洗。将实施例4纯化的包涵体蛋白用包涵体体变性液调整浓度到250μg/ml，装入上述经处理过的20ml的透析袋中，首先对1L含有4M尿素的复性缓冲液(0.9％硼酸，0.3％NaOH，pH9.5)透析，透析时间为4小时，温度控制在4-10℃，并置于电磁搅拌器搅拌。然后依次对含有2M、1M尿素的复性缓冲液透析，每次透析4小时，条件同上。最后将上述复性的样品对20mM的Tris-HCl(pH8.0)透析，时间为4小时，条件同上。取出透析袋里复性好的样品，采用Bradford法对透析后的样品进行蛋白定量，具体操作按照《精编分子生物学实验指南》(颜子颖，王海林译，金冬雁校，1999，科学出版社，)进行。定量后的样品补加NaN₃(Sigma公司)至终浓度0.05％(W/V)，作为防腐剂；补加海藻糖(购自中国科学院微生物研究所)至终浓度0.15mol/L，作为稳定剂。然后分装为1ml/份冻存于-80℃，待用。

实施例6：利用高效液相色谱检测四价抗体的形成

将用实施例5的方法复性的样品(纯度95％以上)对高效液相色谱的流动相进行透析，调整蛋白浓度为500μg/ml，上样20μl，记录蛋白峰的数量和各自的保留时间，并用标准分子量蛋白IgG(150kD)、牛血清白蛋白(BSA)(66kD)作为对照，上样并记录各自的保留时间，用TNF-TeAb的各蛋白峰的保留时间与标准蛋白进行比较，即可推测出TNF-TeAb各峰蛋白分子量的大小和形成聚体的情况。所用高效液相为Waters Delta 600(MILLENNIUM色谱工作站)，分子筛柱料为G-3000SWXL，分离范围为5kD-500kD。样品和标准分子量的色谱分析见图11。

上述结果表明，样品TNF-TeAb样品主要有三个蛋白峰，其中第一峰的保留时间为7.819分，第二峰的保留时间为9.596分，第三峰的保留时间为15.299分。标准蛋白IgG的保留时间为7.906分，BSA的保留时间为10.791分，于是推定第一峰为四聚体即四价抗体，分子量大约为160kD，与理论计算值156kD基本相符；第二峰为二聚体，分子量大约为80kD，与理论计算值78kD基本相符：第三峰为极少量的单体，分子量大约为40kD。通过色谱仪的计算，四价抗体所占比率58.9％，双价抗体为36.59％，单体所占比率为4.51％.由此可见TNF-TeAb主要以多价抗体而存在。

实施例7：ELISA方法检测TNF-TeAb的抗原结合活性

重组人TNF-α购自英国Peprotech公司，对L929细胞的杀伤的ED₅₀≤0.1ng/ml，相对应的生物学活性为≥2×10⁷U/mg。抗cmyc-tag单抗9E10，购自SANTA CRUTZ公司，HRP标记的羊抗鼠IgG华美公司。ELISA操作步骤如下：

(1)包被：用抗原包被缓冲液稀释重组人TNF-α为1μg/ml并加入到96孔ELISA板中，每孔100μl，于37℃包被2小时或4℃包被过夜。为了证明抗体结合的特异性，同时包被牛血清白蛋白(BSA)作为抗体结合的特异性检测。包被缓冲液配方：1.36g Na₂CO₃，7.35g NaHCO₃，950ml水，使用1mol/L HCl或1mol/L的NaOH调pH9.2，补水至1L。

(2)封闭：PBST洗板1-2次后，加入封闭液(PBS-4％脱脂奶粉(W/V))，200μl/孔，37℃封闭1-2小时。

(3)加样：PBS洗板三次后，加入纯化样品，100μl/孔，37℃孵育1-2小时。样品使用方法：以40μg/ml的纯化样品(TNF-TeAb)作为起始浓度，进行倍比稀释10个梯度，每个梯度两复孔。

(4)加入第一抗体：PBST(PBS-0.05％Twen-20(V/V))洗板三次后，以封闭液1/1000稀释抗cmyc-tag单抗(9E10，购自SANTA CRUTZ公司)，100μl/孔，37℃孵育1-2小时。

(5)加入第二抗体：PBST洗板三次后，以封闭液1/10000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG(购自华美公司)，100μl/孔，37℃孵育1-2小时。

(6)显色：PBST洗板5次后，添加显色液(48.6ml 0.1M柠檬酸，51.4ml0.2M Na₂HPO₄加水至1L，pH5.0，配成底物缓冲液；10ml底物缓冲液中加入4mg OPD即邻苯二胺(Sigma公司)，15μl30％H₂O₂配成显色液)，100μl/孔，室温避光显色15-30分钟。

(7)终止反应：添加终止液(2mol/L H₂SO₄)，100μl/孔。

(8)测定结果：在490nm读取吸光值。

上述结果表明，TNF-TeAb能与重组人TNF-α以高亲和力结合，OD₄₉₀与TNF-TeAb的浓度是呈现正相关的，TNF-TeAb与牛血清白蛋白(BSA)没有结合活性，说明TNF-TeAb是特异性结合的。ELISA结果见图12。

实施例8：ELISA方法检测TNF-TeAb抑制TNF-α与其受体蛋白的结合

TNF-α是通过结合其受体引起细胞特定的信号转导而发挥生理功能，L929细胞表面高效表达p55和p75两种TNF受体，重组人TNF-α只与L929细胞受体p55特异结合，中和性的抗体可抑制TNF-α与其受体的结合，从而影响其生理功能的发挥。采用ELISA方法可在体外检测到TNF-TeAb抑制重组人TNF-α与其受体结合。具体操作如下：

(1)培养、收集L929细胞(购自美国ATCC)：细胞培养条件为：RPMI-1640液体培养基(GIBCO公司)，10％胎牛血清(黑龙江江海生物工程技术公司)，5％CO₂，37℃孵箱培养；在细胞生长至对数期后，收集细胞2×10⁶个。

(2)TNF受体蛋白的制备：将上述收集的细胞用PBS缓冲液洗两次，细胞重悬于0.8ml的PBS(含0.05％NaN₃，1mmol/L EDTA)中，冻融2次，14,000rpm离心60分钟，弃上清。沉淀重悬于0.8ml的PBS(含0.05％NaN₃，1mmol/L EDTA)中，超声破碎细胞(输出功率≤50％，脉冲20-30％，40秒，间隔超声)至溶液清亮。12,000rpm离心30分钟，取上清，测定蛋白浓度，储存待用。

(3)ELISA操作：将上述提取的L929细胞TNF受体蛋白包被96孔ELISA板，100μg/ml/孔4℃过夜，用4％的脱脂奶粉封闭各包被孔2小时，同时在另一块ELISA板中每一行孔中加入50μlPBS，并从第3孔对单链抗体TNF-scFv和四价抗体TNF-TeAb进行倍比稀释到第12孔，留下第1和第2孔；于第2到第12孔中加入50μlTNF-α并使其终浓度为1μg/ml，留下第一孔，并用PBS补足到100μl，37℃保温2小时。PBST洗涤包被板三次，每次1分钟，将第二块板对应的各孔中的抗原抗体混合液转入包被板的对应的各孔中，37℃保温1小时；于每孔中加入100μl抗TNF-α的单克隆抗体(5μg/ml)，37℃保温1小时；PBST洗板3次，每次1分钟，于每孔中加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5000稀释)，37℃保温1小时；PBST洗板5次，每次1分钟，于每孔中加入100显色液，室温避光显色到满意为止；于每孔中加入50μl2M的H₂SO₄终止反应；利用酶标仪读取每孔在490nm的吸收值OD₄₉₀，根据以下的公式计算抗体在不同浓度下的抑制率和IC₅₀。上述实验每个浓度做双复孔。抑制率的计算公式为：

[(OD_Ag-OD_Ag/Ab)/(OD_Ag-OD_PBS)]×100％

其中OD_Ag为只有TNF-α的孔的吸收值；OD_Ag/Ab为同时加有TNF-α和单链抗体或四价抗体的吸收值；OD_PBS为不加TNF-α和单链抗体或四价抗体的吸收值。

上述实验结果(见图13)显示，TNF-scFv和TNF-TeAb能够抑制TNF-α与其受体的结合，抑制效应对两种抗体都显示出剂量依赖性，抑制1μg/ml的TNF-α与其受体结合，TNF-TeAb 50％抑制的抗体浓度为大约为0.4μM，TNF-scFv 50％抑制的抗体浓度大约为3.2μM。

实施例9：MTT法检测TNF-TeAb抑制TNF-α对L929细胞的杀伤

TNF-α受体是一种细胞死亡受体，可介导细胞的凋亡，中和性抗体可抑制TNF-α结合细胞表面受体，从而抑制TNF-α对敏感细胞的细胞毒效应。MTT法可检测TNF-TeAb抑制TNF-α对L929的细胞毒效应。具体操作如下：

1.培养、收集L929细胞(美国ATCC)：细胞培养条件为：RPMI-1640液体培养基(GIBCO公司)，10％胎牛血清(黑龙江江海生物工程技术公司)，5％CO₂，37℃孵箱培养；在细胞生长至对数期后，收集细胞2×10⁶个。

2.用含10％胎牛血清的RPMI-1640液体培养基调整收集的细胞至2×10⁵个/ml，加入96孔细胞培养板，每孔100μl，于5％CO₂，37℃孵箱培养过夜。

3.取另一块细胞培养板，每孔中加入100μl含有2％胎牛血清的RPMI-1640液体培养基，于每排的第3孔中加入100μl经培养基稀释至浓度为10μg/ml TNF-TeAb进行倍比稀释至第12孔，留下第1和第2孔。一共做2排，即每个样品梯度做2复孔。

4.用含2％胎牛血清的RPMI-1640液体培养基稀释重组人TNF-α至4ng/ml，并加入50μl于每排的第2孔到第12孔中，留下第1孔并用培养基补足到150μl。

5.用含2％胎牛血清的RPMI-1640液体培养基稀释放线菌素D至浓度4μg/ml，并加入50μl于上述的每孔中，使其终浓度为1μg/ml。

6.将细胞培养板置37℃温箱中孵育2小时，让TNF-TeAb与TNF-α进行充分的反应。

7.弃去第一块37℃孵箱培养过夜的细胞培养板中的培养液，于上述的第二块细胞培养板每孔中取100μl抗体/抗原反应液加入到第一块板相对应的孔中。并将细胞板置5％CO₂，37℃温箱中继续培养24小时。

8.于细胞培养板的每孔中加入10μl浓度为500mg/ml的MTT溶液，置37℃温箱中染色4小时。

9.弃去每孔中的液体，用PBS洗板一次，于每孔中加入100μl MTT溶剂二甲亚砜(DMSO)，置板于37℃温箱中使MTT充分溶解。

10.用酶标仪在570nm读取上述每孔的吸收值(OD₅₇₀)，计算上述每孔中对应的细胞杀伤保护率。保护率(Inhibition rate)计算的公式为：

保护率(Inhibition rate)＝[(OD_Ab/Ag-OD_Ag)/(OD_N-OD_Ag)]×100％

其中，OD_Ab/Ag为同时含有TNF-TeAb和TNF-α的孔的吸收值；OD_Ag为仅含有TNF-α的孔的吸收值；OD_N为既不含有TNF-TeAb也不含有TNF-α的孔的吸收值。计算每孔的保护率后，以抗体的浓度为横轴，保护率为纵轴作一曲线，确定50％抑制时的TNF-TeAb浓度(IC₅₀)。

上述实验结果表明：单链抗体TNF-scFv和四价抗体TNF-TeAb都能够抑制TNF-α对L929细胞的细胞毒作用，抑制1ng(20U)/ml TNF-α的细胞毒作用，单链TNF-scFv 50％抑制的浓度(IC₅₀)为40nM，四价抗体的50％的抑制浓度(IC₅₀)2.5nM。说明四价抗体比单链抗体具有更高的中和活性。中和保护曲线见图14。

实施例10：四价抗体对胶原诱导的大鼠关节炎模型的治疗作用

(1)大鼠关节炎模型的建立

27只SD雄性大鼠(购自中国医学科学院实验动物研究所)年龄在6-7周，体重在150±10g，在SPF级的动物房每天用标准的啮齿动物饲料进行饲养，并供给必要的水份。随机分成4组，即对照组(未致病组)5只、模型组(未用药组或阴性对照组)10只、地塞米松治疗组(阳性药物组)6只、四价抗体治疗组(处理组)6只。除对照组外，其它组的每只大鼠在左后足跖皮内注射0.1ml牛II型胶原CII乳剂(配方：CII(购于Sigma公司)溶解于0.1mol/L的醋酸中，浓度为4mg/mL，4度过夜。将CII溶液滴加入等量冰冷的不完全弗氏佐剂中，充分乳化混合，制成CII乳剂，其最终浓度为2mg/mL)进行免疫，对照组注射不含CII的不完全弗氏佐剂制成的乳剂，初次免疫7天后，于尾巴根部皮内注射0.1ml上述CII乳剂进行强化，大鼠关节炎的形成一般在初次免疫的第20天发病。

(2)治疗

在大鼠开始出现临床症状第一天开始给药，四价抗体采用腹腔注射的方式，剂量为15mg/kg，注射浓度为1mg/ml，每周注射二次；以地塞米松这一特效抗炎药物为对照药物，并采用灌胃的方式给药，剂量为0.1mg/kg，每天给药一次，模型组的大鼠每天腹腔注射等体积的生理盐水，治疗时间为3周。

(3)治疗效果的评价

1.临床评分

采用足肿胀度，关节评分和嘶叫次数相结合的方法对多发性关节炎进行评价。足肿胀度采用特制小尺测量大鼠踝关节的周长的方法，关节评分根据下面的标准进行，0分：正常；1：红，2：红+轻肿；3：严重肿；4：关节变形，强直。每肢最高关节指数(arthritic index，AI)为4分，四肢AI之和代表每只动物的AI，最高AI为16分。嘶叫次数的计数方法是以手握住大鼠后腿踝关节把大鼠足向内侧折，每腿折5次，计数大鼠总的嘶叫次数，嘶叫次数最高为10次。

通过3周的治疗，四价抗体治疗组和地塞米松治疗组的大鼠关节炎临床症状有了明显的改善。图15是治疗过程中各组大鼠的临床评分变化，可以看出，四价抗体TNF-TeAb治疗组的临床评分明显低于模型组，略高于地塞米松治疗组；图16和图17分别为治疗过程中各组大鼠左后腿踝关节(致炎侧)与右后腿踝关节(非致炎侧)的周长变化，可以看出，与模型组相比，四价抗体TNF-TeAb治疗组和地塞米松治疗组的大鼠的左右后腿踝关节的周长都小于模型组，其中四价抗体TNF-TeAb治疗组踝关节周长略高于地塞米松组。表1和表2是治疗3周后各实验组组的临床评分和左右踝关节周长的差异性统计，其中p＜0.05表示治疗组与模型组具有明显的差异，表3是治疗3周后各实验组大鼠的嘶叫次数的差异性统计，结果表明四价抗体能明显的降低关节炎大鼠的嘶叫次数(p＜0.05)，以上结果充分说明四价抗体能明显的改善关节炎大鼠的临床症状。

表1治疗3周后各组大鼠关节炎症状的临床评分统计

表2治疗3周后，各组大鼠后腿左右踝关节周长的统计

表3治疗3周后各组大鼠嘶叫次数的差异性统计

2.抗II型胶原抗体的变化

抗II型胶原抗体的产生，预示大鼠产生了自身免疫反应，大鼠血清中抗II型胶原抗体滴度的高低，直接反映了大鼠自身免疫反应的强弱，同时与大鼠关节的炎症反应也是正相关的。通过测定治疗组和对照组大鼠血清中抗II型胶原抗体滴度，可以评价药物治疗的效果。在治疗21天后，处死大鼠并采血，制备血清。利用大鼠抗II型胶原抗体检测试剂盒(Chondrex公司)检测大鼠血清中抗II型胶原抗体的浓度，具体的操作见试剂盒说明。通过统计学分析，分析治疗组和模型组抗II型胶原抗体的差异，来评价药物治疗的效果。表4是治疗3周后，对照组、模型组、地塞米松治疗组和四价抗体治疗组的大鼠血清中抗II型胶原抗体的滴度及差异性统计。结果表明，通过3周的治疗，四价抗体治疗组和地塞米松治疗组与模型组相比，抗II型胶原抗体都有明显的下降p＜0.05。说明四价抗体TNF-TeAb能够明显的降低关节炎大鼠的自身免疫反应。

表4治疗3周后，各组大鼠血清抗II型胶原抗体滴度的统计

3.细胞因子的变化

肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)是类风湿性关节炎病理中最为重要的两个细胞因子，处于细胞因子调节的最上游，在人类类风湿性关节炎中(RA)，TNF-α除可上调IL-1β、IL-6、IL-8等前炎性细胞因子和趋化因子的表达外，同时还能上调血管内皮细胞黏附分子和细胞表面黏附分子的表达，这些前炎性细胞因子和黏附分子表达的上调是RA发病的最为直接的原因。另外TNF-α和IL-1β还是促进关节骨组织和软骨组织发生损伤的最主要的细胞因子，它们可作用于关节滑膜的纤维原细胞和软骨细胞，促进其分泌基质金属蛋白酶(MMPs)，后者则介导骨和软骨组织的损伤。在大鼠的关节炎模型中，TNF-α和IL-1β具有同样的作用。故治疗后TNF-α和IL-1β两中前炎性细胞因子的变化将直接反映药物的疗效。本实施例对对照组、模型组和治疗组的大鼠血清中TNF-α和IL-1β的进行了定量检测，具体操作按照TNF-α和IL-1β定量检测试剂盒(购自Biosource)。表5是治疗3周后各组大鼠血清中TNF-α和IL-1β浓度的统计，结果表明通过治疗后，地塞米松组治疗组和四价抗体TNF-TeAb治疗组两种细胞因子的血清浓度都有所下降，其中TNF-α明显的降低(p＜0.05)，IL-1β下降也比较明显(p＜0.05)，说明四价抗体TNF-TeAb具有明显的抗炎作用。

表5治疗3周后，各组大鼠血清前炎性细胞因子含量统计

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序列表

<110>北京安波特基因工程技术有限公司

<120>p53四聚化结构域介导的四价单链抗体

<130>IB055022

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>243

<212>PRT

<213>人类

<400>1

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Glu His Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro

130 135 140

Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr

145 150 155 160

Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ser Pro Lys Met Leu Met Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr

180 185 190

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Phe Thr Ile SerSer Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys

210 215 220

Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Ile Lys

<210>2

<211>26

<212>PRT

<213>人类

<400>2

Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu

1 5 10 15

Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Glu Leu

20 25

<210>3

<211>42

<212>PRT

<213>人类

<400>3

Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly

1 5 10 15

Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu

20 25 30

Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly

35 40

<210>4

<211>1005

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cagatccagc tggttcagtc cggtccggaa ctgaaaaaac cgggtgaaac cgttaaaatc 60

tcctgcaaag cttccggtta caccttcacc cactacggta tgaactgggt taaacaggct 120

ccgggtaaag gtctgaaatg gatgggttgg atcaacacct acaccggtga accgacctac 180

gctgacgact tcaaagaaca cttcgctttc tccctggaaa cctccgcttc caccgttttc 240

ctgcagatca acaacctgaa aaacgaagac accgctacct acttctgcgc tcgtgaacgt 300

ggtgacgcta tggactactg gggtcagggt acctccgtta ccgtttcctc cactagtgga 360

ggcggtggga gcggcggtgg tggttctggg ggtggcggaa gctctagatc catcgttatg 420

acccagaccc cgaaattcct gctggtttcc gctggtgacc gtgttaccat cacctgcacc 480

gcttcccagt ccgtttccaa cgacgttgtt tggtaccagc agaaaccggg tcagtccccg 540

aaaatgctga tgtactccgc tttcaaccgt tacaccggtg ttccggaccg tttcaccggt 600

cgtggttacg gtaccgactt caccttcacc atctcctccg ttcaggctga agacctggct 660

gtttacttct gccagcagga ctacaactcc ccgcgtacct tcggtggtgg taccaaactg 720

gaaatcaaag aattcgcgct ggaagtggat gaaacctatg tgccgaaaga atttaacgcg 780

gaaaccttta cctttcatgc ggatattgag ctcaaaaaaa aaccgctgga tggcgaatat 840

tttaccctgc agattcgcgg ccgcgaacgc tttgaaatgt ttcgcgaact gaacgaagcg 900

ctggaactga aagatgcgca ggcgggcaaa gaaccgggcg aacagaaact gattagcgaa 960

gaagatctga acggatccgt cgagcaccac caccaccacc actga 1005

<210>5

<211>334

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Glu His Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro

130 135 140

Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr

145 150 155 160

Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ser Pro Lys Met Leu Met Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr

180 185 190

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys

210 215 220

Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Ile Lys Glu Phe Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys

245 250 255

Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Glu Leu Lys

260 265 270

Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg

275 280 285

Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys

290 295 300

Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu

305 310 315 320

Glu Asp Leu Asn Gly Ser Ala Glu His His His His His His

325 330

Claims

1.一种四价单链抗体，其特征在于由单链抗体、HSA连接肽和p53四聚化结构域依次连接而成，其中所述的单链抗体是抗TNF-α抗体，所述的HSA连接肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的四价单链抗体，其中所述抗TNF-α抗体是单链抗体片段，抗体Fab片段或单域抗体片段。

3.权利要求1所述的四价单链抗体，其特征在于所述的四价单链抗体的C-末端带有C-myc标签和组氨酸标签。

4.权利要求1所述的四价单链抗体，该抗体是由抗人TNF-α单链抗体，HSA连接肽和人类抑癌蛋白p53四聚化结构域依次连接而成，所述的人TNF-α单链抗体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

5.权利要求1所述的四价单链抗体，该抗体是由抗人TNF-α单链抗体，HSA连接肽和人类抑癌蛋白p53四聚化结构域依次连接而成，所述介导人类抑癌蛋白p53四聚体形成的结构域具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

6.权利要求1所述的四价单链抗体，其特征在于该抗体是由抗人TNF-α单链抗体，HSA连接肽和人类抑癌蛋白p53四聚化结构域依次连接而成的TNF-TeAb，具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

7.DNA序列，其特征在于编码权利要求1-6中任一项的四价单链抗体。

8.权利要求7所述的DNA序列，其具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

9.一种表达载体，其特征在于含有权利要求7或8所述的DNA序列。

10.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求9的表达载体。

11.权利要求10的宿主细胞，其是大肠杆菌。

12.权利要求11的宿主细胞，其中所述大肠杆菌是含有权利要求9的表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)。

13.一种构建基因工程四价单链抗体的方法，其特征在于把单链抗体编码序列和人p53蛋白四聚化结构域的编码序列进行串联表达。

14.一种用于治疗或预防急慢性炎症性疾病的药物组合物，其特征在于包含权利要求1-6中任何一项的四价单链抗体和药用载体。

15.权利要求14的药物组合物，其中所述急慢性炎症性疾病是类风湿性关节炎、牛皮癣、局限性回肠炎、僵直性脊椎炎、急性眼葡萄膜炎、急性脓毒血症或脑脊髓膜炎。

16.权利要求1-6中任何一项的四价单链抗体在制备用于治疗或预防急慢性炎症性疾病的药物中的应用。

17.权利要求16的应用，其中所述急慢性炎症性疾病是类风湿性关节炎、牛皮癣、局限性回肠炎、僵直性脊椎炎、急性眼葡萄膜炎、急性脓毒血症或脑脊髓膜炎。