CN113061191B - 一种IgG样三功能抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程抗体领域，公开了一种IgG样三功能抗体，所述IgG样三功能抗体为ILTsAb，所述ILTsAb由抗TNF‑α抗体、抗ED‑B抗体、人IgG CH3区及20T小肽依次串联连接成为单体后再同源二聚化而成；本发明还公开了编码基因、表达载体和宿主细胞；本发明还公开了复性方法和应用。本发明克服了抗TNF‑α单链抗体的单价结合抗原及缺乏炎症组织特异性的不足，可有效提高疗效，降低副作用，发挥抗炎作用，并大大提高了该抗体的血浆半衰期。

Description

一种IgG样三功能抗体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程抗体领域，具体涉及一种IgG样三功能抗体(ILTsAb)及其应用。
背景技术
肿瘤坏死因子(TNF-α)及其受体介导的信号通路在多种自身免疫性疾病如类风湿关节炎(RA)、Crohn’s病、牛皮癣型关节炎(PsA)、强直性脊柱炎(AS)等疾病中发挥着重要作用，抗TNF-α生物制剂是治疗上述疾病最为有效的药物之一。自上世纪末，美国FDA相继批准了4个抗TNF-α抗体工程药物，分别为Infliximab、Adalimumab、Certolizumab pegol和Golimumab，这四种抗体见证了过去10多年来从鼠源抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、噬菌体展示技术筛选人源抗体到转基因小鼠生产全人抗体的发展过程，逐渐解决了治疗性抗体的免疫原性问题。但上述抗体具备一个共性的问题，即缺乏针对炎症组织的特异性。炎症组织是机体自身免疫发生和病理损伤的场所，药物有效分布和保留于炎症组织是治疗的关键。目前的研究表明，治疗性单抗在RA的炎症滑膜中分布量极小，需要大剂量才能达到一定疗效，而大量的抗体分布于正常组织会抑制TNF-α的免疫防御作用，进而增加RA患者发生严重感染(结核)和恶性肿瘤的风险，这也是近十几年来全世界风湿学家在抗TNF-α治疗上最为关注的安全问题。因此，下一代治疗自身免疫病的生物治疗剂应该更加注重其组织特异性，增进疗效的同时减少副作用。
人纤维连接蛋白(FN)是机体最为丰富的胞外基质(ECM)之一，FN的前体RNA(pre-mRNA)对外显子进行选择性的拼接，可产生不同亚型的FN，保留III型重复单位额外域B(extro-domain B，ED-B)的FN称为B-FN。研究表明，B-FN是成熟个体在病理条件下发生胞外基质重构的产物，其表达具有高度的组织特异性，B-FN在正常成年的个体组织中不表达，在炎症组织中却丰富表达。在RA中，B-FN表达于血管翳(pannus)，pannus具有肿瘤样生长的特征，是一个高度血管化的肉芽组织，从关节滑膜延伸并浸入到关节腔，含有大量的成纤维细胞及其合成的ECM，是造成关节纤维炎性增生，骨和软骨破坏的病理组织，同时也是TNF-α合成最丰富的组织，这说明B-FN是靶向自身免疫炎症的良好抗原。新生儿Fc受体(FcRn)最早发现于哺乳动物的一个与IgG Fc相互作用的受体蛋白。FcRn在成熟的个体中广泛的表达，其与抗体工程药物相关的第一个功能特点就是特异性结合并双向转运IgG，可避免IgG在溶酶体中降解，可维持血浆中IgG的相对稳定，使IgG血浆半衰期达到19天。FcRn与生物制药相关的另一个重要生理功能是它表达于近端肾小管上皮细胞，可通过相关转运作用促进IgG的重吸收，避免IgG通过肾小球的滤过作用而丢失。由此可见，FcRn在延长生物技术药物血浆半衰期上具有重要作用。
因此，发明人在上述技术背景下研发了一种IgG样三功能抗体及其应用。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种IgG样三功能抗体及其应用，本发明克服了抗TNF-α单链抗体的单价结合抗原及缺乏炎症组织特异性的不足，可有效提高疗效，降低副作用，发挥抗炎作用，并大大提高了该抗体的血浆半衰期。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种IgG样三功能抗体，所述IgG样三功能抗体为ILTsAb，所述ILTsAb由抗TNF-α抗体、抗ED-B抗体、人IgG CH3区及20T小肽依次串联连接成为单体后，再通过IgG CH3区介导两个单体分子的同源二聚化并形成二硫键连接而成；所述20T小肽是一个能与人新生儿受体(FcRn)结合的20个氨基酸小肽。
进一步的，所述抗TNF-α抗体可变区为VH1和VL1，所述抗ED-B抗体可变区为VH2和VL2；所述ILTsAb的串联连接顺序为VH1-VL2-VH2-VL1-CH3-20T，其中VH1与VL2之间、VH2与VL1之间均用(GGGGS)2作为连接肽，VL2与VH2之间用(GGGGS)4作为连接肽，VL1与CH3之间引入IgG的铰链区序列以使两个抗原结合臂能够自由的伸展，所述IgG的铰链区序列为：EPKSCDKTHTCPPC，CH3与20T之间用GGGGS作为连接肽。
进一步的，所述抗TNF-α抗体为抗TNF-α的单链抗体片段、Fab片段和单域抗体片段中的任意一种；所述抗ED-B抗体为抗ED-B的单链抗体片段、Fab片段和单域抗体片段中的任意一种。
进一步的，所述ILTsAb的氨基酸序列见SEQ ID NO:1。
为解决以上技术问题，本发明还提供了编码所述ILTsAb的基因。
进一步的，所述基因的DNA序列见SEQ ID NO:2。
为解决以上技术问题，本发明还提供了一种体外复性ILTsAb的方法，具体方法如下：选用硼酸盐缓冲液为复性液，通过缓慢复性的方法逐渐去除变性剂尿素，使变性的IgG样三功能抗体单体重新折叠成具有空间结构的单体，然后通过CH3同源二聚化形成具有生物学活性的ILTsAb。
为解决以上技术问题，本发明还提供了ILTsAb在制备治疗或预防自身免疫性疾病的产品中的应用。
进一步的，所述疾病包含类风湿关节炎、牛皮癣、Crohn’s病、强直性脊柱炎、炎症性肠炎；所述产品为药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明具有天然IgG结合同一种抗原的双价性，即可以同时结合2分子TNF-α和2分子ED-B，克服了单链抗体的单价结合抗原的不足；本发明利用炎症组织丰富表达ED-B的特点，特异性结合ED-B抗原而靶向积累于炎症组织，大大提高了炎症组织对抗体药物的摄取率，克服了目前的TNF-α抗体工程药物缺乏炎症组织特异性的缺点，可有效提高疗效，降低副作用；另外，进入炎症组织的IgG样三功能抗体，不易从炎症组织释出，可有效中和TNF-α的生理作用而发挥抗炎功能，引入的与FcRn相互作用的20T小肽具有与IgG Fc区相似的功能，能与FcRn以pH依赖的方式相互作用，使得本抗体具有较长的血浆半衰期，能有效避免ILTsAb被细胞溶酶体降解及通过肾小球的滤过作用而丢失，在自身免疫性疾病的治疗上具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的实施例的ILTsAb/pTET质粒图谱；
图2为本发明的实施例的ILTsAb的表达、鉴定结果图；
图3为本发明的实施例的ILTsAb的抗原结合活性和细胞毒性抑制作用结果图；
图4为本发明的实施例利用PI/Annexin V双染细胞进行流式细胞术分析TsAb对TNF-α细胞毒的抑制作用结果图；
图5为本发明的实施例的ILTsAb的药动学(靶向性、血浆半衰期)分析结果图；
图6为本发明的实施例的ILTsAb对小鼠关节的治疗结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例：
本实施例提供一种IgG样三功能抗体，所述IgG样三功能抗体为ILTsAb，所述ILTsAb由抗TNF-α抗体、抗ED-B抗体、人IgG CH3区及20T小肽依次串联连接成为单体后，再通过IgG CH3区介导两个单体分子的同源二聚化并形成二硫键连接而成；所述20T小肽是一个能与人新生儿受体(FcRn)结合的20个氨基酸小肽(20T)。本实施例所用的抗TNF-α抗体和抗ED-B抗体并不限于本实施例所述的这两种，也可以是其他单链抗体。
本实施例用不同长度的柔性连接肽的编码基因将抗TNF-α抗体可变区(VH1、VL1)、抗ED-B抗体可变区(VH2、VL2)、IgG CH3区及20T小肽进行依次串联，所述ILTsAb的串联连接顺序为VH1-VL2-VH2-VL1-CH3-20T，其中VH1与VL2之间、VH2与VL1之间均用(GGGGS)2作为连接肽，VL2与VH2之间用(GGGGS)4作为连接肽，VL1与CH3之间引入IgG的铰链区序列以使两个抗原结合臂能够自由的伸展，所述IgG的铰链区序列为：EPKSCDKTHTCPPC，CH3与20T之间用GGGGS作为连接肽。
本实施例所述的抗TNF-α抗体为抗TNF-α的单链抗体片段、Fab片段和单域抗体片段中的任意一种，所述的抗ED-B抗体为抗ED-B的单链抗体片段、Fab片段和单域抗体片段中的任意一种。
本实施例抗TNF-α抗体的氨基酸序列为：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKEHFAFSLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSSIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKMLMYSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGTKLEIK。
本实施例抗ED-B抗体的氨基酸序列为：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKGDGSSGGSGGASTGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS。
本实施例20T小肽的氨基酸序列为HGNYFLSGHFGGLYPVQGSV。
本实施例利用上述氨基酸序列连接而成的ILTsAb的氨基酸序列为：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKEHFAFSLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSSIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKMLMYSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSHGNYFLSGHFGGLYPVQGSVHHHHHH，具体见SEQ ID NO:1。
本实施例设计了编码上述ILTsAb的基因，并采用全基因合成的方式合成了此编码基因，所述基因的DNA序列见SEQ ID NO:2，可用于编码上述ILTsAb的基因并不限于本实施例公开的基因。本实施例将上述编码基因克隆进表达载体pTMF，构建成为ILTsAb的表达载体ILTsAb/pTET，ILTsAb/pTET质粒图谱见附图1，两个杂合单链抗体VH1-VL2、VH2-VL1之间由于10肽不能满足同一单元中的VH和VL的缔合所需要的长度，其有效的折叠只能发上在两个杂合单链抗体之间，即VH1与VL1缔合，VH2与VL2缔合，形成了分别结合TNF-α和ED-B两个功能区，两个单体表达之后，依靠CH3的同源二聚化聚合成为二聚体，借助IgG铰链区Cys形成二硫键，最后折叠成如图1所示的IgG样三功能抗体。
接着，发明人用表达载体ILTsAb/pTET转化宿主细胞BL21(DE3)star大肠杆菌菌株，将含有表达载体的BL21 star(DE3)菌株接种25ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇动培养过夜，以1：40转接于1L含50μg/ml卡那霉素的LB培养基，置于5L的摇瓶中于37℃摇动培养至A600为0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的IPTG，继续培养4-5小时，诱导ILTsAb的表达。8000g离心收集表达菌体，重悬于250ml含50mM Tris/HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mMEDTA、100μg/ml lysozyme、10μg/mlDNase和10μg/ml RNase的缓冲液中，超声破碎菌体，于4℃，12000g离心20分钟，分别收集上清和沉淀，进行还原SDS/PAGE检测，观察ILTsAb的表达情况。将凝胶上的蛋白条带电转至0.45μm硝酸纤维膜(美国Pall Gelman)，取出膜，于含5％的脱脂牛奶的1×PBS(pH7.4)缓冲液中4℃封闭过夜，1×PBS洗膜三次，每次3min；将膜分别浸泡于含HRP标记抗His tag单抗(1：1000稀释)的1×PBS(pH7.4)缓冲液中，37℃孵育2h，1×PBS洗膜三次，每次3min；加入DAB显色剂，待显色到理想的程度，用自来水冲洗，终止反应。
见附图2，ILTsAb在大肠杆菌中获得了高效表达，分子量大约为69kDa，与理论大小一致，表达产物以包涵体的形式存在，占菌体超声破碎离心后沉淀的30％左右(图2A)；目的蛋白经转膜，进一步用HRP标记抗His tag单抗进行Western-blot鉴定，结果表明69kDa蛋白条带为目的蛋白ILTsAb(图2B)。
发明人还在变性条件下利用Ni2+亲和层析分离重组蛋白，选用硼酸盐缓冲液为复性液，通过缓慢复性的方法逐渐去除变性剂尿素，使变性的IgG样三功能抗体单体重新折叠成具有空间结构的单体，然后通过CH3同源二聚化形成具有生物学活性的IgG样三功能抗体，之后对复性后的ILTsAb进行高效液相(HPLC)检测，确定是否二聚化形成ILTsAb，具体见下文。
发明人将上述1L表达培养物的超声沉淀用含20mM Tris/HCl、pH 8.0、3％TritonX-100和1M尿素的缓冲液清洗两次，重悬于200ml的变性缓冲液(20mM Tris/HCl，pH8.0，8M尿素，150mM NaCl，10mM咪唑)中，置于25℃缓慢摇动过夜，确保包涵体蛋白完全溶解。4℃12000g离心30分钟，取包涵体蛋白离心上清，经固定化的Ni2+亲和层析(IMAC)纯化。将包涵体蛋白上样于10倍柱体积的上述变性缓冲液平衡的10ml Ni-NTA柱，流速0.5ml/min。流穿后，用含20mM Tris/HCl，pH 8.0，8M尿素，500mM NaCl，20mM咪唑的缓冲液洗涤至基线，流速为1ml/min，充分去除非特异结合的蛋白质；最后用含20mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl，8M尿素，500mM咪唑的缓冲液进行洗脱，流速为1ml/min，收集蛋白质峰，进行SDS/PAGE检测。用上述变性缓冲液将洗脱的包涵体蛋白稀释到250μg/ml，装入适当大小的透析袋。进行逐步移除变性剂尿素的透析复性。对100倍体积分别含4M、2M、1M、0M的硼酸缓冲液【0.9％(w/v)硼酸，0.3％(w/v)NaOH，pH 9.6】从高到低分步透析，每个尿素浓度透析4h，同时在2M、1M、0M的透析过程中于硼酸缓冲液中加入0.5M的L-精氨酸和GSH/GSSG(1mM/1mM)作为添加剂。最后，蛋白置于100倍体积20mM Tris-HCl(pH8.0)中透析两次，每次4h，彻底除去其中残留的尿素和其它杂质，并通过0.22μm的滤膜过滤除菌，超滤浓缩，冻干备用。复性后的蛋白对高效液相流动相进行透析，调整蛋白浓度为500μg/ml，上样20μl，记录蛋白峰的保留时间，并用标准蛋白IgG(150kDa)和BSA(66kDa)作为对照，上样并记录保留时间，比较3个蛋白质的保留时间可以确定ILTsAb相对分子量，确定是否在复性后形成二聚体形式的IgG样三功能抗体。所用的高效液相为Waters Delta 600(MILLENNIUM色谱工作站)，分子筛柱料位G-3000SWXL，分离范围为50-500kDa。
见附图2，ILTsAb经固定化的Ni2+亲和层析(IMAC)纯化，可以达到95％以上的纯度(图2C)；复性后的蛋白经HPLC检测，发现目的蛋白的保留时间与IgG接近，明显小于BSA的保留时间，表明目的蛋白分子量与IgG(150kDa)接近，ILTsAb形成二聚体后分子量大约在140kDa，结果与理论一致，同时发明人检测不到单体的存在，说明ILTsAb在复性后形成了均一的二聚体，即IgG样的三功能抗体(图2D)。
发明人检测了ILTsAb的抗原结合活性，具体操作步骤见下文。
100ng/孔TNF-α及100ng/孔ED-B分别包被于96孔ELISA板，每孔于100μL0.1M的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中，4℃过夜；PBST洗板2次，用100μl含5％(w/v)的脱脂牛奶的1×PBS(pH7.4)缓冲液于37℃封闭2h。PBST洗板3次，于每孔中加入100μl不同浓度的ILTsAb及对照抗体，每个抗体浓度做3复孔，置ELISA板于37℃温箱中孵育1.5h。PBST洗板3次，于每孔中加入100μl HRP标记的抗His-tag单抗(1：1000稀释)，置ELISA板于37℃温箱中孵育1h。PBST洗板3次，于每孔中加入100μl显色液(1mM OPD，0.016％v/v H2O2)，37℃避光孵育10min，酶标仪读取每孔490nm处的吸收值。抗TNF-α单链抗体TNF-scFv、抗ED-B单链抗体ED-B scFv作为阳性对照，抗CD3单链抗体CD3-scFv作阴性对照。
见附图3，与其亲本抗体TNF-scFv和ED-B scFv一样，ILTsAb可特异性的结合TNF-α及ED-B，而对照抗体CD3-scFv没有结合作用(图3A、B)。
发明人还进行了ILTsAb中和TNF-α的生理作用的测试，具体见下文。
EDTA消化收集培养的L929细胞，用RPMI-1640(10％FBS)培养基调整浓度为2.5×105个/ml，100μl/孔加入96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养过夜。另取一块96孔培养板，于第3孔到第12孔加入100μl RPMI-1640(2％FBS)培养基倍比稀释的ILTsAb。同样的方法处理TNF-scFv及CD3-scFv，每种抗体浓度梯度做3复孔，剩余的孔1和孔2加入100μl的培养基；于第2孔到12孔加入100μl RPMI-1640(2％FBS)培养基稀释的TNF-α，至终浓度为1ng/ml，剩余的孔1加入100μl的培养基，置37℃温箱中孵育2h。弃掉第一块培养板中的培养液，将第二块培养板的孵育物转移100μl至第一块培养板的相应孔中，与每孔中补加放线菌素D至终浓度为1μg/ml，37℃、5％CO2培养24小时。于每孔中加入10μl浓度为5mg/ml的MTT溶液，37℃、5％CO2培养3小时，弃掉培养基，PBS洗板3次，每次2分钟，于每孔中加入50μlDMSO，摇动培养板，使细胞内结晶全部溶解，酶标仪阅读每孔的570nm的吸收值(A570)，如下公式计算每种抗体对TNF-α细胞毒的抑制率(％)：抑制率(％)＝[[A570,M-A570,T]/[A570,N-A570,T]]×100％，其中A570,M为加入TNF-α和抗体的3复孔平均吸收值；A570,T为只加TNF-α的3复孔平均吸收值；A570,N为既不加TNF-α又不加抗体的3复孔的平均吸收值。重复上述试验，不加MTT，胰酶消化收集细胞，用PI和Annexin-v双染细胞，流式细胞术(FACS)分析细胞的凋亡，进一步观察ILTsAb对TNF-α细胞毒的抑制作用。为了证实ILTsAb在结合ED-B的情况下，仍然能够中和TNF-α生理效应，对上述实验进行了调整。即在96孔细胞培养板中首先包被1μg/孔的ED-B,1×PBS洗板后于每孔中加入不同浓度的ILTsAb,25℃孵育2h，用1×PBS洗板三次，充分去除未结合的ILTsAb，然后于每孔中加入100μl细胞悬液，并加入终浓度为1ng/ml的TNF-α和终浓度为1μg/ml的放线菌素D，37℃、5％CO2培养24小时。后续抑制作用的分析与上述一致。TNF-scFv为阳性对照，CD3-scFv为阴性对照。
TNF-α对小鼠成纤维细胞L929具有细胞毒作用，于是分析了ILTsAb对TNF-α细胞毒的抑制作用。见附图3，ILTsAb与TNF-scFv一样，能够有效抑制TNF-α诱导L929细胞的凋亡，抑制率与ILTsAb及TNF-scFv的剂量正相关，抑制1ng/ml TNF-α的细胞毒作用，ILTsAb 50％抑制的浓度(IC50)为20nM，100％抑制的浓度为160nM；ILTsAb对TNF-α细胞毒的抑制作用与TNF-scFv相比，没有显著性差异(图3C)。在生理条件，ILTsAb必须特异性结合炎症组织中的ED-B，同时还必须中和TNF-α的生理作用，才能发挥靶向治疗的作用。
为了模拟体内的这种情形，发明人先在96孔培养板上包被ED-B，然后与ILTsAb作用，洗去未结合的ILTsAb。在这种情况下，只有特异性结合ED-B的ILTsAb才能保留在培养板上并抑制TNF-α的细胞毒。结果表明，即使ILTsAb与ED-B结合，仍能中和TNF-α的细胞毒作用。相反，如果用大量的游离的ED-B与ILTsAb一起孵育以抑制ILTsAb与板上包被的ED-B结合，则不能观察到对TNF-α的细胞毒的抑制作用(图3D)，说明ILTsAb可同时结合两种抗原并能中和TNF-α的生理活性。
见附图4，结果表明PI和Annexin-V可进一步证实ILTsAb能够有效的抑制TNF-α诱导L929细胞的凋亡。
本实施例将35只T197小鼠随机分成7个实验组，于每只小鼠尾静脉注射7.4MBq放射性131I标记的ILTsAb(溶于50μl 1×PBS)，分别于时间点10min、30min、1h、4h、12h、24h、48h处死5只小鼠。取每只小鼠的肝、脾、肾、肺、炎症爪子、正常爪子和血液，用γ计数器(德国Berthold公司)检测血液和各组织的放射剂量，各组织对ILTsAb的摄取以每克组织中放射剂量占注射总放射剂量的百分比(ID％/g)表示。为了比较ILTsAb与TNF-scFv的药动学，35只T197小鼠随机分成7个实验组，每只小鼠尾静脉注射7.4MBq放射性131I标记的TNF-scFv(溶于50μl 1×PBS)，分别与时间点10min、30min、1h、4h、12h、24h、48h处死5只小鼠。取每只小鼠的肝、脾、肾、肺、炎症爪子、正常爪子和血液，用γ计数器(德国Berthold公司)检测血液和各组织的放射剂量，计算各组织中TNF-scFv的ID％/g。取小鼠炎症爪子和正常爪子，4％的多聚甲醛固定，5％的硝酸脱钙，并进行石蜡包埋。随后进行切片，厚度为5μm。切片浸入10mM的枸橼酸缓冲液，于微波炉中最大火力加热至沸腾，冷却10min，反复两次，进行抗原修复。1×PBS洗片3次，每次5min。标准羊血清25℃封闭30min。1×PBS洗片3次，每次5min，加入10μg/ml的ILTsAb，37℃孵育1h。1×PBS洗片3次，每次5min，加入HRP标记的抗His tag的单克隆抗体(1：1000稀释)，37℃孵育1h。1×PBS洗片3次，每次5min，加入含0.016％(v/v)H2O2的1mM的DAB溶液，显色5-10min，自来水冲洗终止反应，苏木精复染2min，自来水冲洗，显微镜下观察并照相，Adobe Photoshop 7.0进行图像处理。对照抗体ED-B-scFv为阳性对照，CD3-scFv为阴性对照。
见附图5，发明人分析了ILTsAb和TNF-scFv在CIA小鼠血浆中不同时间的百分放射剂量(图5A)，通过GraphPad Prism 4.0的单相指数消除进行曲线拟合，计算出ILTsAb的血浆半衰期(t1/2β)为(9.8±1.7)h，TNF-scFv的血浆半衰期(t1/2β)为(0.34±0.05)h；ILTsAb在小鼠炎症爪子中的迅速积累，并在注射后12h到达最高，但未发现ILTsAb在正常爪子中积累。单个炎症爪子最高平均摄取(4.2±1.50)％ID/g的ILTsAb，是同时间点正常爪子摄取量的8倍多；48h仍然有(3.23±1.00)％ID/g的ILTsAb保留于炎症爪子中，是同时间点正常爪子中摄取量的近7倍；TNF-scFv在炎症爪子中没有积累作用，单个炎症爪子对TNF-scFv的最大摄取为(1.5±0.50)％ID/g，发生在注射后30min，并快速降低，48h后几乎完全从炎症爪子中清除；TNF-scFv在正常爪子中的摄取表现为相似的结果(图5C)。这些结果表明，ILTsAb可选择性的积累于T197小鼠的炎症关节，并能够在炎症关节中保留较长的时间。取用药后的炎症爪子进行放射自显影，可见ILTsAb积累于炎症关节，而正常关节没有积累(图5D)。见附图5B,对T197小鼠的炎症爪子进行组织切片，用ILTsAb进行免疫组化，发现ILTsAb与对照抗体ED-B-scFv一样，可特异性结合炎症爪子中的ED-B抗原，对正常爪子未发现结合,其中①正常关节切片，②正常关节免疫组化，③炎症关节切片，④炎症关节的免疫组化，⑤阳性对照ED-B scFv免疫组化，⑥阴性对照CD3-scFv免疫组化。上述实施例说明ILTsAb能够特异性与炎症爪子中的ED-B抗原结合，选择性的积累于炎症关节，同时借助20T与FcRn的相互作用，显著提高了血浆半衰期。
发明人接着将T197小鼠分为4组：(1)关节炎对照组(n＝5)；(2)CIA+生理盐水(n＝5)；(3)CIA plus TNF-scFv(n＝5)；(4)CIA plus ILTsAb(n＝5)。TNF-scFv和ILTsAb用生理盐水稀释为1mg/ml，隔天一次以10mg/kg的剂量腹腔注射T197小鼠，正产对照组小鼠注射相同体积的生理盐水，注射时间与两种抗体一致，持续治疗3周。治疗期间每3天对小鼠关节指数进行评分一次，标准如下：0＝正常；1＝红；2＝红+轻微肿；3＝明显水肿；4＝关节僵硬和变形。对小鼠四肢进行打分，最高分为16。治疗结束后，处死小鼠，收集各组小鼠后肢，用10％的甲醛固定，5％的硝酸脱钙，石蜡包埋，组织切片，苏木精和伊红染色，光学显微镜下观察。对下述4种病理改变滑膜炎、骨侵蚀、软骨降解及纤维炎性肿胀进行评分。评分标准：0＝正常，未发现明显变化；1＝轻微，分散性的微小病理改变；2＝中等,病理变化较明显但关节结构完整；3＝严重，严重的病理变化和关节结构的破坏。每项病理变化最终得分为其病理学得分乘以其权重，其中滑膜液、纤维炎性肿胀，×1；骨侵蚀、软骨降解，×3。总的组织学得分为4种病理改变的得分之和，最大值为18分。剪取各个实验组小鼠的踝关节和指关节包括滑膜、临近的组织和骨，立即放入液氮中，在研钵中快速研磨，使组织块变成粉末状，将组织转入15ml的试管，按1ml/200mg组织加入1×PBS重悬组织，再用电动匀浆器充分匀浆2-3min，1000g离心15min，将上清转入1.5ml离心管，15000g离心10min。上清中的细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6用商业化的定量ELISA试剂盒检测，检测方法参照试剂盒说明书。
见附图6，生理盐水治疗组关节指数和爪子肿胀度在整个治疗过程中缓慢上升，治疗结束时分别达到12.5和75％，ILTsAb治疗组的关节指数和爪子肿胀度相比生理盐水治疗组明显下降(p<0.01)，在整个治疗过程中始终保持在一个较低水平，而TNF-scFv治疗组关节指数和爪子肿胀度只在治疗末期才出现一定程度的下降(p<0.05)(图6A、图6B)；组织病理学分析显示，生理盐水治疗组的得分为12.5±2.1，TNF-scFv治疗组为9.5±1.6(p<0.05)，ILTsAb治疗组为3.1±0.6(p<0.01)，后者相比生理盐水治疗组都有显著性的差异。各实验组代表性踝关节切片如图6D所示；其中①正常组，②③模型组，④生理盐水治疗组，⑤TNF-scFv治疗组⑥ILTsAb治疗组，生理盐水治疗组关节表现为大量的炎性细胞浸润、滑膜肿胀、血管翳形成以及骨和软骨的侵蚀。与生理盐水治疗组相比，ILTsAb治疗组关节只表现为轻微的炎性细胞浸润，滑膜肿胀消失，未形成血管翳，骨与软骨结构完整。TNF-scFv治疗组可观察到明显的炎性细胞浸润和血管翳的形成，但骨与软骨的结构完整。以上结果说明ILTsAb能够有效的抑制小鼠关节炎发展，维持关节的正常结构和功能，其疗效明显优于TNF-scFv。各治疗组关节炎性细胞因子的表达如图6C所示，TNF-scFv和ILTsAb治疗能有效的降低小鼠关节的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，相比TNF-scFv，ILTsAb治疗在下调炎性细胞因子方面表现更为显著(p<0.01)。这些结果表明，ILTsAb由于能够靶向积累于炎症关节，其疗效明显优于抗TNF-α的单链抗体TNF-scFv。
本实施例所得的IgG样三功能抗体可应用于制备治疗或预防自身免疫性疾病的产品中，本实施例所述疾病包含类风湿关节炎、牛皮癣、Crohn’s病、强直性脊柱炎、炎症性肠炎，但不限于上述疾病；所述产品可以为药物或药物组合物。
本实施例所构建的IgG样三功能抗体(ILTsAb)是采用基因工程重组的方法构建的，本实施例通过上述构建ILTsAb的原核表达载体，通过大肠杆菌的高效表达、目的蛋白的分离纯化、复性和生物学活性分析，表明ILTsAb能够特异性的结合人TNF-α及ED-B，高效中和TNF-α生理活性；在转人TNF-α基因小鼠Tg197小鼠关节炎作为模型上进一步证实ILTsAb能有有效的结合炎症关节的ED-B，靶向积累于小鼠的炎症关节，能有效缓解小鼠关节炎的各项指标，并有着较长的血浆半衰期，显示出良好的应用前景。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
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Claims (9)

1.一种IgG样三功能抗体，其特征在于，所述IgG样三功能抗体为ILTsAb，所述ILTsAb由抗TNF-α抗体、抗ED-B抗体、人IgG CH3区及20T小肽依次串联连接成为单体后，再通过IgGCH3区介导两个单体分子的同源二聚化并形成二硫键连接而成；所述20T小肽是一个能与人新生儿受体结合的20个氨基酸小肽；所述抗TNF-α抗体的氨基酸序列为：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKEHFAFSLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSSIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKMLMYSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGTKLEIK；
所述抗ED-B抗体的氨基酸序列为：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKGDGSSGGSGGASTGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGT LVTVSS；
所述20T小肽的氨基酸序列为：HGNYFLSGHFGGLYPVQGSV。
2.根据权利要求1所述的一种IgG样三功能抗体，其特征在于，所述抗TNF-α抗体可变区为VH1和VL1，所述抗ED-B抗体可变区为VH2和VL2；所述ILTsAb的串联连接顺序为VH1-VL2-VH2-VL1-CH3-20T，其中VH1与VL2之间、VH2与VL1之间均用(GGGGS)2作为连接肽，VL2与VH2之间用(GGGGS)4作为连接肽，VL1与CH3之间引入IgG的铰链区序列以使两个抗原结合臂能够自由的伸展，所述IgG的铰链区序列为：EPKSCDKTHTCPPC，CH3与20T之间用GGGGS作为连接肽。
3.根据权利要求2所述的一种IgG样三功能抗体，其特征在于，所述抗TNF-α抗体为抗TNF-α的单链抗体片段、Fab片段和单域抗体片段中的任意一种；所述抗ED-B抗体为抗ED-B的单链抗体片段、Fab片段和单域抗体片段中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的一种IgG样三功能抗体，其特征在于，所述ILTsAb的氨基酸序列见SEQ ID NO:1。
5.编码权利要求1-4中任意一项所述ILTsAb的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的DNA序列见SEQ IDNO:2。
7.一种体外复性权利要求1-4中任意一项所述ILTsAb的方法，其特征在于，具体方法如下：选用硼酸盐缓冲液为复性液，通过缓慢复性的方法逐渐去除变性剂尿素，使变性的IgG样三功能抗体单体重新折叠成具有空间结构的单体，然后通过CH3同源二聚化形成具有生物学活性的ILTsAb。
8.权利要求1-4中任意一项所述的ILTsAb在制备治疗或预防自身免疫性疾病的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病包含类风湿关节炎、牛皮癣、Crohn’s病、强直性脊柱炎、炎症性肠炎；所述产品为药物。
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