KR101921767B1

KR101921767B1 - 단백질 정제

Info

Publication number: KR101921767B1
Application number: KR1020137004824A
Authority: KR
Inventors: 마리안겔라 스피탈리; 조나단 시몬스; 리챠드 위트콤; 마크 로버트 피어스-히긴즈
Original assignee: 유씨비 바이오파마 에스피알엘
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2011-07-26
Publication date: 2018-11-23
Also published as: CA2805132A1; CN107793477A; IL223931A; US20130184439A1; SG186957A1; US10189897B2; WO2012013682A3; US20220289832A1; US20160108119A1; JP5893622B2; EP3747893A1; HK1246330A1; US20190135909A1; SG10201802316VA; US11339214B2; JP2013532673A; BR112013000623A2; WO2012013682A2; AU2011284896B2; GB201012603D0

Abstract

본 발명은 제1 양이온 교환 크로마토그래피 단계 및 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는, 주변세포질 세포 추출물로부터 항체 단편의 정제 방법에 관한 것이다.

Description

단백질 정제 {PROTEIN PURIFICATION}

본 발명은 단백질 정제 분야에 속한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항체 단편의 정제 방법에 관한 것이다.

단백질의 대규모 경제적인 정제는 생물공학 산업의 경우 더욱더 중요한 난제이다. 일반적으로, 단백질은 관심 대상의 단백질에 대한 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드의 삽입에 의해 그러한 단백질을 생산하도록 조작된 포유동물 또는 박테리아 세포주를 사용하여 세포 배양물로부터 생산된다. 사용된 세포주는 살아있는 유기체이기 때문에, 이러한 세포주에는 당, 아미노산, 및 성장 인자를 함유한 복합 성장 배지가 공급되어야 한다. 관심 대상의 단백질은 세포에 공급된 화합물들의 혼합물과 세포 자체의 부산물(공급 스트림)로부터 인간 치료제로서 사용하기에 충분한 순도로 단리되어야 한다. 공급 스트림에서 유래한 불순물과 관련하여 인간 투약을 위해 의도된 단백질에 대해 보건당국이 설정한 기준은 매우 높다. 업계에 공지된 다수의 단백질 정제 방법은 예를 들어 정제될 단백질의 생물학적 활성을 비가역적으로 위태롭게할 수 있고 이에 따라 부적합한 낮거나 높은 pH, 고염 농도 또는 다른 극단적인 조건의 적용을 요구하는 단계들을 포함한다. 이에, 원하는 단백질을 충분한 순도로의 분리는 힘겨운 도전에 놓여 있다. 역사적으로, 단백질 정제 과정은 정제될 단백질과 원치않은 단백질 오염원 간의 크기, 전하 및 용해도의 분자적 성질에 있어 차이에 근거하고 있다. 이러한 파라미터에 기초한 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 차등(differential) 침전 등을 포함한다.

항체 및 항체 단편은 치료 영역의 범위에서 중요성이 증가하고 있다. 항체 또는 항체 단편의 제조를 위한 가장 중요한 방법 중 하나는 재조합 기법이다. 이러한 기법은 숙주 세포를 사용하여 원하는 항체 또는 항체 단편을 발현시키는 것이며, 이러한 항체 또는 항체 단편은 이후 생성 배지로부터 분리되어 정제된다.

항체는 글리코실화를 필요로 하고, 이에 따라 일반적으로 진핵세포, 특히 포유동물 세포 예컨대 CHO, PER.C6, NS0, BHK 또는 Sp2/0 세포를 채택하는 진핵세포 발현 시스템에서 발현된다. 진핵세포 발현 시스템에서 발현되는 관심 대상의 단백질 예컨대 항체는 일반적으로 세포 배양 배지 중으로 분비된다. 이후 배지는 단백질 분비 세포로부터, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 쉽게 분리될 수 있다.

최근의 거의 모든 산업용 항체 정제 플랫폼은 (예를 들어 WO　98/23645에 기재된) 단백질 A를 사용한다. 단백질 A는 포유동물의 면역글로불린의 Fc 부분에 결합하는 박테리아 스타필로코커스 아우레우스(staphylococcus aureus)의 세포벽에서 발견되는 세포 표면 단백질이다. 단백질 A는 인간 IgG₁ 및 IgG₂에 대해 높은 친화성과 인간 IgM, IgA 및 IgE 항체에 대해 중간 정도의(moderate)의 친화성을 가진다. 결과적으로, 단백질 A 정제는 Fc 부분이 결여된 항체 단편의 경우에는 적합치 않다.

글리코실화를 요구하지 않는 단백질은 바람직하게는 그람 음성 박테리아와 같은 원핵세포를 채택하는 원핵세포 발현 시스템에서 발현되어진다. 특히, 글리코실화를 요구하지 않는 항체, 예를 들어 Fab, Fab' 또는 scFv와 같은 항체 단편이 바람직하게는 이러한 시스템에서 발현되어진다. 원핵세포 발현 시스템 및 특히 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli , E. coli) 시스템 또는 다른 그람 음성 박테리아는 글리코실화를 요구하지 않는 단백질, 예컨대 항체 단편의 경제적으로 매력적인 방식으로의 제작을 가능하게 한다. 이. 콜라이에서 단백질의 제조는 특히 보다 낮은 제품 비용 및 보다 빠른 약물 개발 과정으로 인해 유리하다(Humphreys, 2003; Humphreys, 2003). 원핵세포 및 특히 이. 콜라이 단백질 발현 시스템은 업계에 익히 알려져 있다(Swartz, 2001; Jana and Deb, 2005; Terpe, 2006). 원핵세포는 이러한 세포에서 발현된 관심 대상의 이종 단백질을 능동적으로 분비하지 못한다. 그러나, 이. 콜라이와 같은 그람 음성 원핵세포는 세포에서 발현된 이종 단백질, 예컨대 항체 단편이 이황화 결합을 형성할 수 있는 주변세포질 공간(periplasmic space) 안으로 확산되도록 조작될 수 있다. 주변세포질 공간으로부터 이러한 이종 단백질의 단리는 원핵세포의 외부막의 파괴를 요구하며, 이는 숙주 세포 단백질(HCP)의 상당한 방출을 야기한다. 그람 음성 원핵세포의 외부막의 파괴와 이종 단백질을 함유한 세포 배양액의 후속적인 채취 방법은 업계에 익히 알려져 있다. 이. 콜라이에서 항체 단편의 제조는 또한 끝잘린(truncated) 경쇄, 경쇄의 글루타티온 부가물 및 경쇄 이량체와 같은 부산물을 생성한다(Battersby et al., 2001).

이. 콜라이 발현 시스템과 같은 원핵세포 발현 시스템으로부터 채취된 세포 배양액(공급 스트림), 특히 그람 음성 박테리아로부터 얻어진 주변세포질 세포 추출물은 진핵세포 발현 시스템으로부터 채취된 세포 배양액과는 상대적인 양과 (원핵세포 또는 진핵세포 발현 시스템에서 발현되는 관심 대상의 이종 단백질로부터 분리될 필요가 있는) HCP, 박테리아 DNA 및 엔도톡신의 조성에 있어 실질적으로 차이가 있다. HCP의 복잡성 및 이종성 뿐만 아니라 HCP의 농도는 발현 시스템 또는 세포주 및 세포 배양 조건에 의존한다(Arunakumari, 2009). 따라서, 원핵세포 발현 시스템, 특히 그람 음성 원핵세포 발현 시스템에서 발현된 항체 단편의 정제는 상이한 도전 군에 직면하고 있으며 상이한 접근법을 필요로 한다(Humphreys and Glover, 2001). 단일클론 항체 단편에 대한 기본적인 정제 원리는 업계에 공지되어 있다(Spitali, 2009). 현재 미 식품 의약국(FDA) 및 유럽 의약품국(EMA)에서 승인된, 미생물 세포에서 생산되는 항체 단편을 활성 성분으로서 포함하는 두 종류의 의약품이 존재한다: 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol)(Cimzia^®)은 TNFα에 특이적으로 결합하는 Fab를 포함하고 라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis^®)은 혈관내피성장인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 Fab 단편이다. 미생물 공급 스트림으로부터 라니비주맙의 정제는 4 단계의 크로마토그래피를 이용하는 공정에 의해 수행된다(Walsh, 2007). 의약품 압식시맙(abciximab, ReoPro^®)은 인간 혈소판의 글리코프로테인(GP) IIb/IIIa 수용체에 결합하고 혈소판 응집을 방해하는 키메라 인간-쥐 단일클론 항체 7E3의 Fab 단편을 포함한다. 키메라 7E3 항체는 포유동물 세포 배양액에서 연속적인 관류에 의해 생산된다. 48 Kd Fab 단편은 파파인을 이용한 소화(digestion) 및 컬럼 크로마토그래피 후에 정제된 전장 항체로부터 얻어진다.

친화성 크로마토그래피는 관심 대상의 단백질(또는 단백질 군)과 크로마토그래피 매트릭스에 결합된 특정 리간드 간의 가역성 상호작용에 기초하여 단백질을 분리한다. 관심 대상의 단백질과 크로마토그래피 매트릭스에 결합된 리간드 간의 상호작용은 정전기적 또는 소수성 상호작용, 반 데르 발스 힘 및/또는 수소 결합의 결과일 수 있다. 친환성 매질로부터 표적 분자를 용출시키기 위해 이러한 상호작용은 역전될 수 있는데, 특이적으로 경쟁적 리간드를 사용하거나 또는 비특이적으로 pH, 이온 강도 또는 극성을 변화시킴으로써 역전될 수 있다. 친화성 정제는 크로마토그래피 매트릭스에 공유적으로 부착될 수 있는 생물특이적 리간드를 필요로 한다. 결합된 리간드는 표적 분자에 대해 특이적인 결합 친화성을 보유해야 하며, 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거한 후에, 표적 분자가 활성 형태로 제거될 수 있도록 리간드와 표적 분자 간의 결합이 가역성이어야 한다. 이러한 통상적인 사용에도 불구하고, 친화성 크로마토그래피는 특히 치료용 단백질을 정제하는데 필요한 산업적 규모에서 비용이 많이 든다.

이온 교환 크로마토그래피는 이온성 분자를 정제하는데 사용될 수 있다. 이온화된 분자는 이들의 하전된 기(group)와 고상 지지 매트릭스에 부착된 반대로 하전된 분자 간의 비특이적 정전기적 상호작용에 의해 고상과 더욱 강하게 상호작용하는 이온화된 분자의 진행을 늦추도록 하는 것에 기초하여 분리된다. 이온화된 분자의 각 타입의 총 전하 및 매트릭스에 대한 이의 친화성은 하전된 기의 수, 각 기의 전하, 및 하전된 고상 매트릭스와 상호작용을 위해 경쟁하는 분자의 성질에 따라 달라진다. 이러한 차이로 인해 이온 교환 크로마토그래피에 의한 다양한 분자 타입들의 분해가 이루어진다. 고상에 결합된 분자의 용출은 일반적으로 이온 교환 매트릭스의 하전된 부위에 대해 용질과 경쟁하기 위해 버퍼(buffer)의 이온 강도(즉, 전도도)를 증가시킴으로써 달성된다. 용질의 용출을 달성하기 위한 또 다른 방법은 pH를 변화시켜 용질의 전하를 변경하는 것이다. 전도도 또는 pH에 있어 변화는 점진적이거나(구배 용출) 또는 단계적(단계 용출)일 수 있다. 2 종류의 일반적인 상호작용이 알려져 있다: 양으로 하전된 표면과 상호작용하는 음으로 하전된 아미노산 측쇄(예, 아스파르트산 및 글루탐산)에 의해 매개되는 음이온 교환 크로마토그래피 및 음으로 하전된 표면과 상호작용하는 양으로 하전된 아미노산 잔기(예, 라이신 및 아르기닌)에 의해 매개되는 양이온 교환 크로마토그래피. 음이온 교환기는 약(weak)음이온 교환기 또는 강(strong)음이온 교환기로서 분류될 수 있다. 약음이온 교환기 상의 하전 기는 약염기이며, 이는 탈프로톤화되어지고, 이에 따라 높은 pH에서 자신의 전하를 상실한다. 디에틸아미노에틸(DEAE)-셀룰로스는 약음이온 교환기의 일례이며, 여기서 아미노 기는 pH~9 아래에서 양으로 하전될 수 있고 이보다 높은 pH 값에서 자신의 전하를 점진적으로 상실한다. DEAE 또는 디에틸-(2-히드록시프로필)아미노에틸(QAE)은 예를 들어 카운터 이온으로서 클로라이드를 가진다.

용출 버퍼의 이온 강도를 증가시킴에 의한 용출(용출 크로마토그래피)에 대한 대안은 결합된 단백질 보다 정지상에 대해 보다 높은 동적 친화성을 가진 분자를 사용하는 용출이다. 이온 교환 크로마토그래피의 이러한 실시 방식은 치환(displacement) 크로마토그래피로 불린다. 치환 크로마토그래피는 용질이 이동상 변경자(modifier)에서 탈착되지 않고 이동 속도에 있어 차이에 의해 분리된다는 점에서 임의의 다른 방식의 크로마토그래피와 근본적으로 상이하다(Tugcu, 2008). 치환에서, 분자는 공급 스트림에서 유래한 임의 성분보다 정지상에 대해 보다 높은 친화성을 가진 디스플레이서 분자(displacer molecule)의 진행성 쇼크파(advancing shock wave)에 의해 크로마토그래피 컬럼에서 강제적으로 하강 이동한다. 이러한 강제식 이동은 고 체류(high retention)의 다른 작동 방식에 비해 보다 높은 생성물 농도 및 순도를 가능하게 하며, 강제식 이동 후 컬럼 중으로 디스플레이서 용액의 일정한 주입이 이루어진다.

동적 결합능(Dynamic binding capacity)은 정해진 흐름 조건하에 컬럼에서 크로마토그래피 수지에 결합하는 관심 대상 단백질의 양을 설명해 준다. 크로마토그래피 수지에 대한 동적 결합능은 실행 조건(예를 들어, 유속, pH 및 전도도), 샘플의 기원, 샘플 제조 및 존재하는 다른 결합 불순물에 따라 달라진다. 동적 결합능은 공지 농도의 관심 대상의 단백질을 함유한 샘플을 로딩하고 컬럼 통과액에서 이러한 농도를 모니터링함으로써 결정된다(Do et al., 2008). 이온 교환 수지의 동적 결합능은 로딩 도중 관심 대상의 단백질이 통과액에서 회수되기 시작하는 시점으로써 정의된다. 전형적으로 로드(load)에 비해 통과액에서 관심 대상 단백질의 비율에 대한 10% 값을 사용하여 이러한 시점을 정의한다(McCue et al., 2003). 불순물 제거를 위해, 통과액에서 불순물에 대한 역치(threshold)가 이러한 적용에 특이적인 기준에 따라 설정된다.

WO　99/57134, WO　2004/024866 및 WO　2007/117490는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 단백질 또는 항체 정제 방법에 관한 것이다. 이러한 방법들은 포유동물 세포에서 생산된 항체를 사용하여 예시화된다. WO　2009/058812는 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 항체 정제 방법에 관한 것이다. 이 방법은 포유동물 세포에서 생산된 항체를 사용하여 예시화된다. WO　2007/108955는 양이온 교환 크로마토그래피에 이어 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는, 단백질 정제용 2-단계 비친화성 이온 교환 크로마토그래피 방법에 관한 것이다. WO　2007/108955의 실시예는 포유동물 세포에서 생산된 완전한 인간 항체의 정제를 기재하고 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 동안 복수의 세척 단계가 수행되었고 음이온 교환 크로마토그래피 이전에 용출물이 희석되었다. Humphreys 등은 양이온 교환 크로마토그래피와 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 Fab'의 실험실 규모의 정제를 기재하고 있다(Humphreys et al., 2004). WO　2004/035792는 박테리아 세포 배양물로부터 정제된 항체 단편 조제물에서 PhoS 단백질 불순물을 감소시키기 위해 돌연변이 PhoS 단백질을 발현하는 이. 콜라이 균주의 생성에 관한 것이다.

CDP870은 WO　01/94585(본원에서 그 전체로 참고적으로 인용됨)에 기재된 바와 같이 PEG 모이어티에 화학적으로 결합된, 유전적으로 조작된 항체 단편(Fab')이다. CDP870은 강력한 인간 TNFα 중화 성질을 가진다.

당업계에서는 원핵세포, 특히 이. 콜라이 발현 시스템과 같은 그람 음성 박테리아로부터 채취된 세포 배양액으로부터 항체 단편을 정제하는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 당업계에서는 특히, 항체 단편 또는 HCP 또는 항체 단편과 HCP 모두를 매우 높은 역가로 함유하는 세포 추출물을 사용하기에 적합한 원핵세포, 특히 이. 콜라이 발현 시스템과 같은 그람 음성 박테리아로부터 채취된 주변세포질 세포 추출물로부터 항체 단편을 정제하는 방법에 대한 필요성이 존재하다. 항체 단편의 고역가 발현은 경제적인 방식으로, 즉 컬럼 크기, 버퍼 사용 및 가공 시간을 감소시키는 방식으로 다량의 항체 단편을 정제하기에 적합한 방법을 필요로 한다(GE Healthcare data file 11-0025-76 AE, 2007).

박테리아 세포 배양물로부터 정제되는 단백질의 경우 진핵세포 배양물로부터 정제되어야 하는 단백질과 정제 요건 및 도전과제에 있어 실질적으로 상이하다. 그람 음성 박테리아의 주변세포질 세포 추출물로부터 단백질을 정제할 필요가 있는 경우 예를 들어 박테리아 숙주 세포 단백질의 함량으로 인해 특별한 어려움에 직면한다. 이종 단백질을 매우 고농도로 발현시키는 그람 음성 박테리아 배양물로부터 단백질을 정제할 필요가 있는 경우 추가적인 어려움을 극복할 필요가 있다.

본 발명자들은 놀랍게도, 항체 단편을 고농도로 포함하는 주변세포질 세포 추출물의 경우에 매우 효율적이고 적합한, 주변세포질 세포 추출물로부터 항체 단편을 정제하는 새로운 방법을 밝혀내었다.

일 측면에서 본 발명은 항체 단편을 포획하기 위한 제1 크로마토그래피 단계로서, 항체 단편을 함유하는 혼합물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 그 후에 용출시켜 항체 단편을 함유하는 제1 용출물을 생성하는 것인 단계; 제1 용출물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물을 포획하고 항체 단편을 함유하는 통과액을 생성하는 제2 크로마토그래피 단계; 및 상기 항체 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 주변세포질 세포 추출물로부터 항체 단편의 정제 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 항체 단편을 포획하기 위한 제1 크로마토그래피 단계로서, 항체 단편을 함유하는 혼합물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 그 후에 용출시켜 항체 단편을 함유하는 제1 용출물을 생성하는 것인 단계; 제1 용출물에 적용되는 제1 한외여과; 정제된 제1 용출물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물을 포획하고 항체 단편을 함유하는 통과액을 생성하는 제2 크로마토그래피 단계; 통과액에 적용되는 제2 한외여과; 및 상기 항체 단편을 회수하는 단계로 실질적으로 구성된, 주변세포질 세포 추출물로부터 항체 단편의 정제 방법을 제공한다.

도면의 간단한 설명
도 1은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(Capto S^TM) 상에서 제1 포획 단계로부터 전도도(점선)를 따라 UV광 흡광도[밀리-흡광도 단위(mAU)로 측정](실선)에 의해 모니터링된 단백질(Fab' 포함)에 대한 크로마토그램을 도시하고 있다. 이러한 크로마토그램은, 큰 부피를 컬럼 상에 로딩할 수 있고(이러한 로딩 동안 일부 단백질은 결합하지 않음) 이후에 전도도 증가에 따라 적은 부피의 Fab'를 포함한 결합된 단백질의 회수를 보여준다.
도 2는 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(Capto Q^TM) 상에서 상기의 크로마토그래피 단계로부터 얻어진 크로마토그램을 도시하고 있다. 이러한 크로마토그램은 Fab'의 비결합 및 로딩 후 세척시에 이의 출현을 보여주고 결합된 불순물은 재생 피크에서 회수되었다.
도 3은 캡처 로드(capture load), 캡처 용출물 및 음이온 교환 플로우스루에 대한 SDS-PAGE 분석을 도시한다.
도 4는 음이온 교환 크로마토그래피 이전(레인 2)과 이후(레인 3)의 샘플에 존재하는 숙주 세포 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블랏을 도시한다.
도 5는 CDP870의 아미노산 서열을 도시한다.
서열에 대한 간단한 설명
서열 번호 1은 CDP870의 CDRH1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 2는 CDP870의 CDRH2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 3은 CDP870의 CDRH3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 4는 CDP870의 CDRL1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 5는 CDP870의 CDRL2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 6은 CDP870의 CDRL3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 7은 CDP870 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 예상 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 8은 CDP870 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 예상 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 9는 그라프트된 항-TNFα Fab CDP870 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 10은 그라프트된 항-TNFα Fab CDP870 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.

제1 측면에서 본 발명은 항체 단편을 포획하기 위한 제1 크로마토그래피 단계로서, 항체 단편을 함유하는 혼합물, 예컨대 주변세포질 세포 추출물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 그 후에 용출시켜 항체 단편을 함유하는 제1 용출물을 생성하는 것인 단계; 제1 용출물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물을 포획하고 항체 단편을 함유하는 통과액을 생성하는 제2 크로마토그래피 단계; 및 상기 항체 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 주변세포질 세포 추출물로부터 항체 단편의 정제 방법에 관한 것이다.

제2 측면에서 본 발명은 항체 단편을 포획하기 위한 제1 크로마토그래피 단계로서, 항체 단편을 함유하는 혼합물, 예컨대 주변세포질 세포 추출물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 그 후에 용출시켜 항체 단편을 함유하는 제1 용출물을 생성하는 것인 단계; 제1 용출물에 적용되는 제1 한외여과; 정제된 제1 용출물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물을 포획하고 항체 단편을 함유하는 통과액을 생성하는 제2 크로마토그래피 단계; 통과액에 적용되는 제2 한외여과; 및 상기 항체 단편을 회수하는 단계로 실질적으로 구성된, 주변세포질 세포 추출물로부터 항체 단편의 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제1 측면의 제1 실시양태에서 본 발명의 제1 측면에 따른 방법은 오직 2 단계 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명의 제2 측면의 제1 실시양태에서는 양이온 교환 크로마토그래피 후 한외여과 및 음이온 교환 크로마토그래피 후 한외여과가 접선 흐름 여과(tangential flow filtration, TFF)에 의해 수행된다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제2 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1 실시양태에 따른 방법에서 모든 크로마토그래피 단계가 크로마토그래피 컬럼 상에서 수행된다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제3 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1 또는 제2 실시양태에 따른 방법에서 제1 크로마토그래피 단계의 양이온 교환 크로마토그래피가 용출 방식으로 수행된다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제4 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제2 또는 제3 실시양태에 따른 방법에서 제1 크로마토그래피 단계의 양이온 교환 크로마토그래피가 하기 단계들을 순차적으로 포함한다:

a) 항체 단편을 함유하는 혼합물, 예컨대 주변세포질 세포 추출물을 양이온 교환 컬럼 상으로 로딩하는 단계,

b) 양이온 교환 컬럼을 세척 버퍼로 세척하는 단계로서, 세척 동안 세척 버퍼의 전도도, pH 및 염 농도가 변함이 없는 것인 단계, 및

c) 항체 단편을 용출 버퍼로 용출시키는 단계.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제5 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제4 실시양태에 따른 방법에서 세척 버퍼의 pH가 제1 크로마토그래피 단계 이전에 항체 단편을 함유하는 혼합물, 예컨대 주변세포질 세포 추출물의 pH와 동일하다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제6 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 실시양태에 따른 방법에서 항체 단편을 함유하는 혼합물, 예컨대 주변세포질 세포 추출물이 제1 크로마토그래피 단계 이전에 4.0 내지 5.0의 pH, 바람직하게는 4.3 내지 4.7의 pH, 더욱 바람직하게는 4.3 내지 4.5의 pH, 가장 바람직하게는 pH 4.5를 가진다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제7 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 실시양태에 따른 방법에서 항체 단편을 함유하고 일차 포획 단계로서 양이온 교환 크로마토그래피가 수행되는 혼합물이 총 단백질을 1.5　g/L 이상, 또는 3　g/L 이상, 또는 4　g/L 이상, 또는 5　g/L 이상, 또는 7.5　g/L 이상, 또는 10　g/L 이상 또는 20　g/L 이상, 또는 40　g/L 이상의 농도로, 또는 3 내지 40　g/L의 농도로, 또는 4 내지 20　g/L의 농도로, 또는 5 내지 15　g/L의 농도로 함유한다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제8 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 또는 제7 실시양태에 따른 방법에서 항체 단편을 함유하고 일차 포획 단계로서 양이온 교환 크로마토그래피가 수행되는 혼합물이 항체 단편을 3　g/L 이상, 또는 4　g/L 이상, 또는 5　g/L 이상, 또는 7.5　g/L 이상, 또는 10　g/L 이상 또는 20　g/L 이상의 농도로, 또는 3 내지 20　g/L의 농도로, 또는 4 내지 50　g/L의 농도로, 또는 5 내지 10　g/L의 농도로 함유한다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제9 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 또는 제8 실시양태에 따른 방법에서 일차 포획 단계의 양이온 교환 크로마토그래피가 300　cm/h 이상의 유속, 바람직하게는 300 내지 2000　cm/h, 더욱 바람직하게는, 350 내지 1500　cm/h, 더욱더 바람직하게는 350 내지 1000　cm/h, 가장 바람직하게는 400 내지 700　cm/h의 유속으로 수행된다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제10 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 또는 제9 실시양태에 따른 방법에서 일차 포획 단계의 양이온 교환 크로마토그래피가 6　mS/cm 이하의 전도도, 바람직하게는 6 내지 2　mS/cm, 더욱 바람직하게는 5 내지 3　mS/cm, 더욱더 바람직하게는 4.5 내지 3.5　mS/cm의 전도도에서 수행된다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제11 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 실시양태에 따른 방법에서 일차 포획 단계의 양이온 교환 크로마토그래피가 아가로스의 가교된 비드화 형태(예, 세파로스(Sepharose)^TM 또는 수페로스(Superose)^TM), 개질된 메타크릴레이트 중합체(예를 들면, 텐타클(tentacle), 히드록실화); 실리카; 세라믹 및 스티렌 디비닐벤젠(이에 한정되지 않음)을 포함한 업계에 공지된 적합한 재료의 수지에 결합된 술포닐, 술포프로필 또는 카르복시메틸을 포함하는 수지 상에서 수행된다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제12 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제11 실시양태에 따른 방법에서 일차 포획의 양이온 교환 크로마토그래피의 수지가 항체 단편에 대한 동적 결합능이 50　g/L 수지 이상, 또는 60　g/L 수지 이상, 또는 75　g/L 수지 이상, 또는 150　g/L 수지 이상, 또는 50 내지 150　g/L 수지, 또는 60 내지 100　g/L 수지, 또는 50 내지 75　g/L 수지이다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제13 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제11 또는 제12 실시양태에 따른 방법에서 일차 포획의 양이온 교환 크로마토그래피의 수지가 50　㎛ 이상의 평균 입자 크기, 바람직하게는 60 내지 300 ㎛, 더욱 바람직하게는 70 내지 200　㎛, 더욱더 바람직하게는 80 내지 100 ㎛의 평균 입자 크기를 가진다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제14 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 또는 제13 실시양태에 따른 방법에서 일차 포획 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피가 수행되는 항체 단편을 함유하는 혼합물이 박테리아 숙주 세포 단백질을 약 200　㎍/ml 내지 10,000　㎍/ml, 약 500　㎍/ml 내지 5000　㎍/ml, 약 1000　㎍/ml 내지 4000　㎍/ml 또는 약 2000　㎍/ml 내지 4000　㎍/ml의 양으로 함유한다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제15 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13 또는 제14 실시양태에 따른 방법에서, 일차 포획 단계의 양이온 교환 크로마토그래피에서 수지 1 리터 당 5 내지 100　g의 항체 단편, 수지 1 리터 당 10 내지 90　g의 항체 단편 또는 수지 1 리터 당 20 내지 75　g의 항체 단편이 로딩된다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제16 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14 또는 제15 실시양태에 따른 방법에서, 제2 크로마토그래피 단계에서 음이온 교환 크로마토그래피가 아가로스의 가교된 비드화 형태(예, 세파로스^TM 또는 수페로스^TM), 개질된 메타크릴레이트 중합체(예를 들면, 텐타클, 히드록실화); 실리카; 세라믹 및 스티렌 디비닐벤젠(이에 한정되지 않음)을 포함한 업계에 공지된 적합한 재료의 수지에 결합된 4급 암모늄(Q), 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 트리메틸아미노에틸(TMAE)을 포함하는 수지 상에서 수행된다. 제2 크로마토그래피 단계는 또한 셀룰로스 및 폴리에틸렌(이에 한정되지 않음)을 포함한 업계에 공지된 적합한 재료의 막(membrane)에 결합된 4급 암모늄 또는 폴리(알릴아민)을 포함하는 막 상에서 수행될 수 있다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제17 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15 또는 제16 실시양태에 따른 방법에서, 제2 크로마토그래피 단계에서 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 50　㎛ 이상의 평균 입자 크기, 바람직하게는 60 내지 300　㎛, 더욱 바람직하게는 70 내지 200　㎛, 더욱더 바람직하게는 80 내지 100　㎛의 평균 입자 크기를 가진다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제18 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16 또는 제17 실시양태에 따른 방법에서, 제2 크로마토그래피 단계에서 음이온 교환 크로마토그래피가 pH 6 내지 10, 바람직하게는 pH 7 내지 9, 더욱 바람직하게는 pH 8 내지 9, 더욱더 바람직하게는 pH 8.5에서 수행된다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제19 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17 또는 제18 실시양태에 따른 방법에서, 제2 크로마토그래피 단계에서 음이온 교환 크로마토그래피가 공정 관련 불순물에 대한 결합능이 20　g/L 수지를 초과하거나, 바람직하게는 30　g/L 수지를 초과하거나, 더욱더 바람직하게는 40　g/L 수지를 초과하거나, 또는 20 내지 80　g/L 수지이거나 또는 20 내지 40　g/L 수지이다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제20 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18 또는 제19 실시양태에 따른 방법이 고성능 접선 흐름 여과(HPTFF) 단계를 포함하지 않는다.

본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제21 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19 또는 제20 실시양태에 따른 방법에서, 회수된 항체 단편이 숙주 세포 단백질(HCP)을 150 백만분율(ppm) 이하, 또는 120 ppm 이하, 또는 100 ppm 이하의 양으로 함유한다.

추가 실시양태에서는 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 방법에서 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv 또는 카멜리드(camelid) 항체이다.

본원에서 사용된 용어 "친화성 크로마토그래피"는, 관심 대상의 단백질 또는 관심 대상의 항체가 가역적으로 그리고 특이적으로 생물특이적 리간드에 결합되는 단백질 분리 기법을 지칭한다. 바람직하게는, 생물특이적 리간드는 크로마토그래피용 고상 재료에 공유적으로 부착되고 용액이 크로마토그래피용 고상 재료와 접촉할 때 용액 중의 관심 대상 단백질에 접근가능하다. 관심 대상 단백질(예를 들어, 항체)은 크로마토그래피 단계 동안 생물특이적 리간드(예를 들어, 항원, 기질, 보조인자, 또는 호르몬)에 대한 특이적인 결합 친화성을 보유하지만, 혼합물 내의 다른 용질 및/또는 단백질은 리간드에 인지가능할 정도로 또는 특이적으로 결합하지 않는다. 고정화된 리간드에 관심 대상 단백질의 결합은 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 크로마토그래피용 매질을 통과하도록 하지만 관심 대상 단백질은 고상 재료 상에 고정화된 리간드에 특이적으로 결합되어 남는다. 특이적으로 결합된 관심 대상 단백질은 이후에 낮은 pH, 높은 pH, 고염, 경쟁 리간드 등을 사용하여 고정화된 리간드로부터 활성 형태로 제거되고, 좀더 일찍 컬럼을 통과한 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 없는 용출 버퍼와 함께 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 특이적인 결합 단백질, 예를 들어 항체를 정제하기 위한 리간드로서 임의의 물질이 사용될 수 있다.

용어 "아글리코실화된(aglycosylated)"과 "비글리코실화된(non-glycosylated)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 항체와 같은 단백질에 글리코실- 또는 탄수화물 모이어티의 특이적인 번역후 부가의 결여를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "항체" 또는 "항체들"은, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 단일클론 또는 다클론의 4중체(tetrameric) 전장 항체를 지칭한다. 용어 면역글로불린 또는 면역글로불린들은 각각 "항체" 또는 "항체들"과 동의어로 사용된다. 본원에서 사용된 용어 "항체" 또는 "항체들"은 업계에 공지된 재조합 기술에 의해 생성된 재조합 항체를 포함하며 이에 한정되지 않는다. "항체" 또는 "항체들"은 인간, 비인간 영장류(예를 들어, 침팬지, 비비 원숭이, 붉은털원숭이 또는 사이노몰거스 원숭이), 설치류(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니아 피그), 염소, 소 또는 말 종과 같은 포유동물 종을 포함한 임의 기원일 수 있다. 본원에서 항체는 관심 대상의 "항원"에 대한 것이다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고 질환 또는 장애를 앓고 있는 포유동물에의 항체 투여는 상기 포유동물에서 치료적 이익을 제공할 수 있다. 그러나, 비-폴리펩티드 항원에 대한 항체도 또한 고려된다. 항원이 폴리펩티드이면, 이러한 항원은 성장 인자 또는 사이토카인과 같은 막관통 분자(예를 들면, 수용체) 또는 리간드일 수 있다. 본 발명에서 고려되는 항체에 대한 바람직한 분자 타겟은 CD 폴리펩티드 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD38, CD40 및 CD40-L; FcRN; OX40; HER 수용체 군의 멤버, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 α 또는 β 서브유닛을 포함한 av/b3 인테그린(예를 들면, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 케모카인 및 사이토카인 또는 이들의 수용체 예컨대 IL-1 α 및 β, IL-2, IL-6, IL-6 수용체, IL-12, IL-13, IL-17 형태, IL-18, IL-21, IL-23, TNFα 및 TNFβ; 성장 인자 예컨대 VEGF; IgE; 혈액 그룹 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 폴리펩티드 C; 등을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "항체 단편" 또는 "항체 단편들"은, 비글리코실화된 항체 또는 항체의 비글리코실화된 부분, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fc 부분이 결여되거나 없는 임의의 항체를 포함한다. 항체 단편의 예로는 또한 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 및 scFv 단편; 디아바디(diabodies); 트리아바디(triabodies); 테트라바디(tetrabodies); 미니바디(minibodies); 실질적으로 1, 2 또는 3 개의 면역글로불린 도메인(들)으로 구성된 항체, 예컨대 도메인 안티바디즈(Domain Antibodies)^TM; 단일쇄 항체; 상기 중 임의의 것의 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 또는 다중특이적 변이체를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "항체 단편" 또는 "항체 단편들"은 또한 카멜리드 항체(예, 낙타 또는 야마(llama)에서 유래한 항체, 예컨대 나노바디즈(Nanobodies)^TM) 및 이의 유도체를 지칭한다. 항체 단편은 업계에 익히 알려져 있다(Holliger and Hudson, 2005). 항체 단편의 제조를 위한 다양한 기법이 개발되어져 왔으며 이들은 업계에 공지되어 있다(Glover and Humphreys, 2004). 본원에서 사용된 용어 "항체 단편" 또는 "항체 단편들"은 인간 항체 단편, 인간화 항체 단편, 영장류화 항체 단편 및 키메라 항체 단편을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "버퍼(buffer)"는, 용액 중에 이의 존재에 의해 pH에 있어 단위 변화를 야기하기 위해 첨가되어야 하는 산 또는 알칼리의 양을 증가시키는 물질을 지칭한다. 완충용액(buffered solution)은 산-염기 컨쥬게이트 성분들의 작용에 의해 pH 변화를 견딘다. 생물학적 시약과 함께 사용하기 위한 완충 용액은 일반적으로 용액의 pH가 생리학적 범위 내이도록 수소 이온 농도를 일정하게 유지할 수 있다. 전통적인 버퍼 성분은 유기 및 무기 염, 산 및 염기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "크로마토그래피"는, 혼합물의 개개 용질들이 이동상의 영향하에 정지 매질을 통해 이동하는 속도에 있어 차이, 또는 결합 및 용출 공정에 있어 차이로 인해 혼합물 중의 관심 대상 물질을 혼합물 중의 다른 물질들로부터 분리하는 공정을 지칭한다.

본원에서 크로마토그래피와 연계하여 사용된 용어 "크로마토그래피 컬럼" 또는 "컬럼"은, 크로마토그래피용 매트릭스 또는 수지로 충전된, 흔히 원통형 또는 중공형 필러(pillar) 형태의 용기를 지칭한다. 크로마토그래피용 매트릭스 또는 수지는 정제를 위해 채택되는 물리적 및/또는 화학적 성질을 제공하는 재료이다.

본원에서 사용된 용어 "전도도(conductivity)"는, 두 전극 간에 전류를 전도시키는 수용액의 능력을 지칭한다. 용액에서, 전류는 이온 수송에 의해 흐른다. 따라서, 수용액에 존재하는 이온의 양이 증가할수록, 용액은 보다 높은 전도도를 가질 것이다. 전도도를 위한 측정 단위는 센티미터 당 밀리시멘스 (milliSiemens)(mS/cm)이며, 전도도 측정기를 사용하여 측정될 수 있다. 용액의 전도도는 그 속의 이온 농도를 변화시킴으로써 달라질 수 있다. 예를 들어, 용액에서 완충제의 농도 및/또는 염(예, NaCl 또는 KCl)의 농도는 원하는 전도도를 달성하기 위해 달라질 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "용출물(eluate)"은, 크로마토그래피 재료에 물질(예, 항체 단편 또는 오염 물질)의 결합 및 크로마토그래피 재료로부터 이러한 물질을 해리시키기 위해 용출 버퍼의 첨가에 이어 얻어진, 그러한 물질을 포함하는 액체 조성물을 지칭한다. 용출물은 정제 공정에서 단계의 관점에서 언급될 수 있다. 예를 들어, 용어 "제1 용출물"은 제1 크로마토그래피 단계로부터 얻어진 용출물을 지칭하고; 용어 "제2 용출물"은 제2 크로마토그래피 단계 등으로부터 얻어진 용출물을 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "통과액(플로우스루)(flow-through)"은, 분자가 결합 없이 크로마토그래피 재료 위를 통과하도록 물질(예, 항체 단편 또는 오염 물질)을 포함한 혼합물을 크로마토그래피 재료 위에 통과시켜 얻어진, 그러한 물질을 포함하는 액체 조성물을 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "혼합물"은, 존재할 수 있는 다른 물질들로부터 정제하고자 하는 1종 이상의 관심 대상 항체 단편을 포함하는 적어도 부분적으로 액체 조성물을 지칭한다. 예를 들면, 혼합물은 현탁액, 수용액, 유기 용매 시스템, 또는 수성/유기 용매 혼합물 또는 용액일 수 있다. 혼합물은 종종 다수의 생물 분자(예컨대, 단백질, 항체, 호르몬, 및 바이러스), 소분자(예컨대, 염, 당, 지질, 등) 및 심지어 미립자를 포함한 복합 혼합물 또는 용액이다. 생물학적 기원의 전형적인 혼합물이 수용액 또는 현탁액으로 개시될 수 있지만, 이러한 혼합물은 또한 이전의 분리 단계, 예컨대 용매 침전, 추출, 등에서 사용된 유기 용매를 함유할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "주변세포질 세포 추출물(periplasmic cell extract)"은, 외부막의 파괴 및 주변세포질 공간으로부터 물질의 방출에 이어서 그람 음성 원핵세포의 세포 배양물로부터 얻어진 조성물을 지칭한다. 주변세포질 세포 추출물은 흔히 액체이고 미립자 또는 가스를 함유할 수도 있다. 용어 "주변세포질 세포 추출물"은 또한 주변세포질 공간으로부터 수집 후, 예를 들어 불용성 물질을 제거하기 위해 추가 처리될 수 있는 액체 조성물을 포함한다.

용어 "정제" 또는 "정제하는" 또는 "정제된"은 관심 대상 단백질, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 함유하는 혼합물로부터, HCP, DNA 또는 염과 같은 원치않은 물질을 제거하거나 감소시키는 공정을 지칭한다. "정제 단계"는 "균일(homogeneous)" 조성물을 얻는 전체 정제 공정의 일부일 수 있으며, 본원에서 균일 조성물은 관심 대상 단백질을 포함하는 조성물 중에 150 ppm 미만의 HCP, 이와 달리 120　ppm 미만, 100　ppm 미만, 90　ppm 미만, 80　ppm 미만, 70　ppm 미만, 60　ppm 미만, 50　ppm 미만, 40　ppm 미만, 30　ppm 미만, 20　ppm 미만, 10　ppm 미만, 5　ppm 미만, 또는 3　ppm 미만의 HCP를 포함하는 조성물을 지칭하는데 사용된다.

본원에서 사용된 용어 "한외여과"는 예를 들어 관심 대상 단백질을 함유하는 혼합물, 예컨대 용액을 농축 또는 정제 목적으로 막에 통과시키는 압력 구동 공정을 지칭한다. 한외여과막의 평균 공극 크기는 전형적으로 역삼투막의 평균 공극 크기와 마이크로여과막의 평균 공극 크기 사이인 1 내지 50 nm 이다. 이러한 공극 크기는 일반적으로 특정 분자량의 단백질을 보유하는 능력으로 정량화되며 보통은 공칭 분자량 컷오프(NMWCO)의 관점에서 kDa으로 인용된다. 한외여과는 정해진 압력 구동력에 반응하여 막을 가로지르는 다양한 물질들의 여과 속도에 있어 차이에 기초하여 용질을 분리하며, 여과 속도는 용질의 크기에 좌우된다. 따라서, 혼합물 또는 용액 중의 용질은 크기 차이에 기초하여 분리된다. 한외여과는 흔히 단백질 농축, 버퍼 교환 및 탈염, 단백질 정제, 바이러스 제거, 및 정화를 위한 하류(downstream) 공정에 사용된다. 용어 "한외여과"는 혼합물, 예컨대 용액이 한외여과막을 수평으로 통과하는 접선 흐름 여과(TFF)를 포함한다. 용어 "한외여과"는 단지 크기에 기초하지 않고 크기와 전하에 기초하여 용질을 분리하는 고성능 접선 흐름 여과(HPTFF)를 포함하지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "총 단백질"은, 임의 크기의 단백질 단편을 포함한, 샘플 중의 실질적으로 모든 단백질을 지칭한다. 종종, 주변세포질 세포 추출물 또는 다른 세포 배양물 채취와 연계하여, "총 단백질"은 샘플에 함유된 세포 배양물에서 발현되는 HCP와 이종 단백질 모두를 지칭한다. 총 단백질은 업계에 익히 알려진 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 항체 단편은 재조합 항체 단편을 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 원핵세포, 바람직하게는 그람 음성 박테리아이다. 더욱 바람직하게는, 숙주 세포는 이. 콜라이 세포이다. 단백질 발현을 위한 원핵 숙주 세포는 업계에 익히 알려져 있다(Terpe, 2006). 숙주 세포는 관심 대상 단백질, 예컨대 항체 단편을 생산하도록 유전적으로 조작된 재조합 세포이다. 재조합 이. 콜라이 숙주 세포는 MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XL1Blue 및 JM109를 포함한 임의의 적합한 이. 콜라이 균주로부터 유래할 수 있다. 일례는 재조합 단백질 발효를 위해 통상적으로 사용되는 숙주 균주인 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC 27,325)이다. 항체 단편은 또한 이. 콜라이 변종, 예를 들어 대사 돌연변이 또는 프로테아제 결핍 이. 콜라이 균주를 배양함으로써 생산될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 항체 단편은 전형적으로, 단백질의 성질, 생산 규모 및 사용된 이. 콜라이에 따라 이. 콜라이 숙주 세포의 주변세포질에서 발견되거나 또는 숙주 세포 배양 상등액에서 발견된다. 단백질을 이들 구획으로 표적화하는 방법은 업계에 익히 알려져 있다(Makrides, 1996). 단백질을 이. 콜라이의 주변세포질로 인도하기에 적합한 신호 서열의 예는 이. 콜라이 PhoA, OmpA, OmpT, LamB 및 OmpF 신호 서열을 포함한다. 단백질은 단백질 분비를 위해 자연 분비 경로에 의존하거나 또는 외부막의 제한된 누설의 유도에 의해 상등액으로 표적화될 수 있으며 이의 예는 pelB 리더, 단백질 A 리더의 사용, 배양 배지에 글리신의 첨가와 함께 박테리오신 방출 단백질, 마이오신-유도된 박테리오신 방출 단백질의 공동발현 및 막투과를 위한 kil 유전자의 공동발현이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 방법에서, 재조합 단백질은 숙주 이. 콜라이의 주변세포질에서 발현된다.

이. 콜라이 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현은 또한 유도성 시스템의 통제하에 놓일 수 있으며, 이로인해 이. 콜라이에서 재조합 항체의 발현은 유도성 프로모터의 통제하에 놓인다. 이. 콜라이에서 사용하기 적합한 다수의 유도성 프로모터가 업계에 익히 알려져 있으며, 재조합 단백질의 발현은 프로모터에 따라 예컨대 온도 또는 성장 배지 중의 특정 물질의 농도와 같은 인자를 달리함으로써 유도될 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 이. 콜라이 lac, tac, 및 trc 프로모터를 포함하며, 이들 프로모터는 락토스 또는 비가수분해성 락토스 유사체, 이소프로필-b-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG), 및 각각 포스페이트, 트립토판 및 L-아라비노스에 의해 유도되는 phoA, trp 및 araBAD 프로모터로 유도가능하다. 발현은 예를 들어 유도제(inducer)의 첨가에 의해 또는 유도가 온도 의존적인 경우 온도 변화에 의해 유도될 수 있다. 유도제를 배양액에 첨가함으로써 재조합 단백질의 발현을 유도하는 경우, 유도제는 발효 시스템 및 유도제에 의존하는 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 단일 또는 복수 샷(shot) 첨가에 의해, 또는 공급물을 통한 유도제의 점진적인 첨가에 의해 첨가될 수 있다. 예를 들어 유도제가 락토스인 경우 유도제의 첨가와 실제 단백질 발현 유도 간에 지연(delay)이 있을 수 있고, 임의의 기존 탄소원이 락토스 이전에 사용되는 경우 단백질 발현 유도가 일어나기 이전에 지연이 있을 수 있다.

이. 콜라이 숙주 세포 배양물(발효물)은 이. 콜라이의 성장과 재조합 단백질의 발현을 지지하는 임의의 배지에서 배양될 수 있다. 배지는 예컨대 문헌(Durany O, 2004)에 기재된 임의의 화학적 규명 배지(chemically defined medium)일 수 있다.

이. 콜라이 숙주 세포의 배양은 원하는 생산 규모에 따라 임의의 적합한 용기, 예컨대 진탕 플라스크 또는 발효기에서 이루어질 수 있다. 1,000　리터 초과 내지 약 100,000　리터의 용량을 갖는 다양한 대형 발효기가 활용가능하다. 바람직하게는, 1,000 내지 50,000　리터, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 10,000 또는 12,000　리터 용량의 발효기가 사용된다. 0.5 내지 1,000　리터 용량의 보다 작은 규모의 발효기도 사용될 수 있다.

이. 콜라이의 발효는 필요한 단백질 및 수율에 따라 임의의 적합한 시스템에서 예를 들어 연속식, 배치식 또는 유가식(fed-batch) 방식으로 수행될 수 있다. 배치식 방식은 필요한 영양분 또는 유도제의 샷 첨가와 함께 사용될 수 있다. 대안으로, 유가식 배양이 사용될 수 있으며 발효기에 초기에 존재하는 영양분을 사용하여 지속될 수 있는 최고 특정 성장 속도에서 배치 방식의 사전 유도로 배양물을 성장시키고 하나 이상의 영양분 공급 방식을 사용하여 발효가 완료될 때까지 상기 성장 속도를 제어한다. 유가식 방식은 또한 이. 콜라이 숙주 세포의 대사를 제어하고 보다 높은 세포 밀도에 이르도록 하는 사전 유도로서 사용될 수 있다.

원한다면, 숙주 세포는 발효 배지로부터 수집될 수 있으며, 예를 들면 숙주 세포가 원심분리, 여과 또는 농축에 의해 샘플로부터 수집될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 치료적 성질을 갖는 항체의 산업적 대량 제조에 적합하다.

일 실시양태에서 본 발명에 따른 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 포획 단계 이전에 세포 배양 채취물을 원심분리한 다음 추출 버퍼를 첨가하여 숙주 세포를 현탁시키는 단계를 포함한다.

관심 대상 단백질, 예컨대 항체 단편이 숙주 세포의 주변세포질 공간에서 발견되는 이. 콜라이 발효 공정의 경우 숙주 세포로부터 단백질을 방출시킬 것이 요구된다. 이러한 방출은 임의의 적합한 방법, 예컨대 기계적 또는 압력 처리, 동결-해동 처리, 삼투압 쇼크, 추출제 또는 열처리에 의한 세포 용해에 의해 이루어질 수 있다. 단백질 방출을 위한 이러한 추출법은 업계에 익히 알려져 있다.

바람직한 일 실시양태에서 추출 버퍼를 샘플에 첨가한 다음 샘플에 대해 열처리 단계를 수행한다. 열처리 단계는 바람직하게는 US　5,655,866에 상세히 기재되고 있다. 열처리 단계는 다른 항체 관련 물질의 제거를 촉진함으로써 가용성의, 정확하게 폴딩되고 어셈블리된 항체 단편의 샘플을 수득가능하도록 해준다.

열처리 단계는 샘플에 원하는 고온을 처리함으로써 이루어진다. 가장 바람직하게는, 열처리 단계는 30℃ 내지 70℃ 범위 내에서 수행된다. 온도는 원하는 바에 따라 선택될 수 있고 정제용 항체의 안정성에 좌우될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 40℃ 내지 65℃ 범위 내이거나, 바람직하게는 40℃ 내지 60℃ 범위 내, 더욱 바람직하게는 45℃ 내지 60℃ 범위 내, 더욱더 바람직하게는 50℃ 내지 60℃ 범위 내, 가장 바람직하게는 55℃ 내지 60℃, 58℃ 내지 60℃ 또는 59℃이다. 따라서, 최저 온도는 30℃, 35℃ 또는 40℃ 이고 최고 온도는 60℃, 65℃ 또는 70℃이다.

열처리 단계는 바람직하게는 연장된 시간 동안 수행된다. 열처리 시간은 바람직하게는 1 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 4 내지 18 시간, 더욱더 바람직하게는 6 내지 16 시간이고, 가장 바람직하게는 10 내지 14 시간 또는 10 내지 12 시간이고, 예를 들면 12 시간이다. 따라서, 열처리용 최단 시간은 1, 2 또는 3 시간이고 최장 시간은 20, 22 또는 24 시간이다.

특정 실시양태에서, 열처리는 50℃ 내지 60℃에서 10 내지 16 시간 동안, 더욱 바람직하게는 59℃에서 10 내지 12 시간 동안 수행된다. 당업자라면 온도 및 시간이 해당 샘플 및 생산될 항체의 특성에 맞게 선택될 수 있음을 숙지하고 있을 것이다.

추출 단계 이후, 항체 단편과 같은 관심 대상 단백질을 함유하는 혼합물에 대해 pH 조절 단계 이전에 원심분리 및/또는 여과 단계를 실시할 수 있다.

추가 실시양태에서 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 방법은 VEGF-A, 글리코프로테인 IIb/IIIa 수용체, C5, HER2/neu, TNFα, IL1β, CD40-L, OX40 또는 ICOS에 특이적으로 결합하는 항체 단편, 예를 들면 Fab 또는 Fab'를 사용하여 수행된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 방법은 WO　01/094585(이의 내용은 본원에서 참고적으로 인용됨)에 기재된 바와 같이 인간 TNFα에 대해 특이성을 가진 항체 단편, 더욱 바람직하게는 CDP870인 항체 단편을 포함하는 주변세포질 세포 추출물을 사용하여 수행된다.

일 실시양태에서 인간 TNFα에 대해 특이성을 가진 항체 단편은 중쇄를 포함하고 여기서 가변 도메인은 서열 번호 1에 나타낸 CDRH1에 대한 서열, 서열 번호 2에 나타낸 CDRH2에 대한 서열 또는 서열 번호 3에 나타낸 CDRH3에 대한 서열을 가진 CDR을 포함한다.

일 실시양태에서 항체 단편은 서열 번호 4에 나타낸 CDRL1에 대한 서열, 서열 번호 5에 나타낸 CDRL2에 대한 서열 또는 서열 번호 6에 나타낸 CDRL3에 대한 서열을 가진 CDR을 포함한다.

일 실시양태에서 항체 단편은 서열 번호 1에 나타낸 CDRH1에 대한 서열, 서열 번호 2에 나타낸 CDRH2에 대한 서열 또는 서열 번호 3에 나타낸 CDRH3에 대한 서열을 가진 CDR 및 서열 번호 4에 나타낸 CDRL1에 대한 서열, 서열 번호 5에 나타낸 CDRL2에 대한 서열 또는 서열 번호 6에 나타낸 CDRL3에 대한 서열을 가진 CDR을 포함한다.

일 실시양태에서 항체 단편은 CDRH1에 대한 서열 번호 1, CDRH2에 대한 서열 번호 2, CDRH3에 대한 서열 번호 3, CDRL1에 대한 서열 번호 4, CDRL2에 대한 서열 번호 5 및 CDRL3에 대한 서열 번호 6을 포함한다.

항체 단편은 바람직하게는 CDR-그라프트된 항체 단편 분자이고 전형적으로 가변 도메인은 인간 억셉터 프레임워크 영역 및 비인간 도너 CDR을 포함한다.

바람직하게는, 항체 단편은 CDP870 경쇄 가변 도메인(서열 번호 7) 및 CDP870 중쇄 가변 도메인(서열 번호 8)을 포함한다.

항체 단편은 변형된 Fab 단편이 바람직하며 여기서 변형은 중쇄의 C-말단에 효과기(effector) 또는 리포터(reporter) 분자의 부착을 가능하게 하는 하나 이상의 아미노산의 첨가이다. 바람직하게는, 이러한 부가적인 아미노산은 효과기 또는 리포터 분자가 부착될 수 있는 1개 또는 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 이러한 변형된 Fab 단편은 바람직하게는 서열 번호 10으로서 주어진 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄와 서열 번호 9로서 주어진 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄를 가진다.

추가 실시양태에서 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 방법은 압식시맙, 라니비주맙, 펙셀리주맙, CDP484, 또는 CDP7657를 사용하여 수행된다.

평형( Equilibration )

본 발명의 추가 실시양태에서 일차 포획 단계용 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 원하는 pH 및 전도도로 완화하기 위해 적합한 조성의 음이온 버퍼(예를 들면 pH　5의 50　mM 아세트산나트륨 또는 pH　4.0의 50　mM 락트산나트륨)를 사용하여 평형화된다. 평형은 평형 버퍼의 2 이상의 컬럼 부피(column volumes)를 사용하여 달성될 수 있지만, 또한 (컬럼이 해당 카운터 양이온으로 적절하게 하전되도록 하기 위해) 1　M NaCl 함유 버퍼의 2 컬럼 부피에 이은 평형 버퍼의 2 이상의 컬럼 부피를 이용한 2 단계 평형 공정을 포함할 수 있다.

본 발명의 추가 실시양태에서 제2 크로마토그래피 단계의 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 평형 버퍼가 이상적으로 양이온 버퍼, 예컨대 pH　8.0의 20　mM Tris HCl 또는 pH　7.0의 20　mM 비스-트리스 HCl인 것을 제외하고는 동일한 방식으로 평형화된다. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 평형은 또한 (컬럼이 해당 카운터 음이온으로 적절하게 하전되도록 하기 위해) 1　M NaCl 함유 버퍼에 이어 상기 평형 버퍼를 사용한 2 단계 평형 공정에 의하거나; 또는 상기 평형 버퍼를 곧바로 사용하는 단일 단계에 의해 이루어질 수 있다.

세척

본 발명의 추가 실시양태에서 일차 단계를 위한 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 로딩한 후, 이를 평형 버퍼의 2 이상의 컬럼 부피로 세척한다. 부가적인 불순물은 보다 높은 전도도, 예를 들어 0.5　mScm 또는 이보다 높은 전도도를 가진 세척 버퍼를 사용하여 제거될 수 있다.

본 발명의 추가 실시양태에서 제2 크로마토그래피 단계용 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 로딩한 후, 컬럼을 평형 버퍼의 최대 2 컬럼 부피로 세척한다. 유사한 pH 및 전도도를 가진 다른 버퍼도 사용될 수 있다. 공정 관련 불순물의 최대한 제거가 바람직한 경우라면 이보다 높은 전도도를 가진 버퍼는 권장되지 않는다.

용출

본 발명의 추가 실시양태에서 항체 단편은 일차 포획 단계에서 보다 높은 pH, 보다 높은 전도도, 또는 이 둘의 조합인 버퍼를 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출된다. 전도도 증가는 농도가 50　mM를 초과하는, 바람직하게는 100　mM를 초과하는, 더욱더 바람직하게는 200　mM를 초과하는 평형 버퍼에 NaCl (또는 다른 염)을 첨가하여 달성될 수 있다.

본 발명의 추가 실시양태에서 제2 크로마토그래피 단계에서 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 항체 단편의 용출은 로딩 단계와 세척 단계 동안 일어난다. 결합된 공정 관련 불순물은 보다 낮은 pH, 보다 높은 전도도 또는 이 둘다의 조합인 버퍼를 사용함으로써 용출될 수 있다. 이상적으로, 보다 높은 전도도는 70　mS/cm 이상이다.

본 발명이 충분히 기재되어 있으므로, 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어남이 없이 그리고 과도한 실험없이도 대등한 파라미터, 농도 및 조건의 광범위한 범위내에서 동일한 결과를 달성할 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명이 구체적인 실시양태들과 연계하여 기술되고 있으나, 추가 변경이 이루어질 수 있는 것으로 이해해야 할 것이다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르면서, 본 발명이 속하는 업계에 공지되거나 일반적인 프랙티스 내에 속하고 첨부된 청구범위 내에서 전술한 기본적인 특성에 적용될 수 있는 본 기재로부터의 변형을 포함하는 본 발명의 임의의 변경, 사용 또는 개조를 포괄하는 것으로 해석된다.

본원에서 사용된 "하나의(a 또는 an)"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에서 용어 "또는"은, 비록 기재가 단지 택일 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지하지만, 오직 택일만을 지칭하는 것으로 명확히 언급되지 않거나 택일이 상호 배타적이지 않다면 "및/또는"을 의미하는 것으로 한다. 본원에서 사용된 "또 다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.

본원에서 사용된 "X 내지 Y"는 X와 Y를 포함하는 범위를 의미할 수 있다.

본원에서 인용된 모든 참고문헌(저널 기사 또는 요약, 공개되거나 비공개된 미국 또는 외국 특허 출원, 발행된 미국 또는 외국 특허 또는 임의의 다른 참고문헌 포함)은 인용된 문헌에서 제공된 모든 데이터, 표, 도면 및 텍스트를 포함하여 그 전체로 본원에서 참고적으로 인용된다. 부가적으로, 본원에서 인용된 참고문헌 내에서 인용된 참고문헌의 전체 내용도 또한 그 전체로 참고적으로 인용된다.

공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 언급은 본 발명의 임의의 측면, 기재 또는 실시양태가 당업계에 개시되거나, 교시되거나 시사된 것임을 인정하는 것이 결코 아니다.

실시예

실시예 1

CDP870 Fab'를 이. 콜라이 W3110 숙주 세포에서 이종 단백질로서 1.9　g/L 농도로 발현시켰다. Tris-EDTA를 첨가하고 50℃에서 열처리하여 숙주 세포의 주변세포질 공간으로부터 이종 단백질을 방출시켰다. 원심분리를 통해 세포 물질을 제거하고 아세트산의 첨가를 통해 이종 단백질을 함유하는 세포 추출물을 pH　4.5로 조정하였다. 이후, pH 조정된 세포 추출물을 원심분리와 0.2 ㎛ 필터를 갖는 다층 여과(depth filtration)를 조합하여 정화시켰다.

정화된 추출물(공급 스트림)을 물을 사용하여 희석 배율 4로 희석하여 3.5　mS/cm의 전도도를 달성하였다.

이후, CDP870 Fab'를 함유한 공급 스트림을 지이 헬스케어(GE　Healthcare)의 Capto　S^TM 양이온 교환 컬럼 상으로 400　cm/h의 유속으로 약 75　g/L 수지로 로딩하였다[덱스트란 링커(이온 용량 0.11 - 0.14 mmol　Na⁺/ml)를 통해 부착된 술포네이트 양이온 교환 리간드를 가진 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)]. Capto　S^TM 양이온 교환 컬럼은 7.7 mm의 직경 및 20 cm 높이의 컬럼층을 가졌다. 컬럼은 공급 스트림 로딩 이전에 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50　mM 아세트산나트륨 버퍼의 6 컬럼 부피로 평형화되어 있었다.

로딩 후 결합되지 않은 모든 물질이 씻겨 제거될 때까지 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50　mM 아세트산나트륨 버퍼의 5 컬럼 부피로 컬럼을 세척하였다. CDP870 Fab' 분획을, 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50　mM 아세트산나트륨 및 250 mM NaCl의 농도에 이르는 20 컬럼 부피 구배를 사용하여 용출시켰다. 280　nm에서 UV 흡광도가 0.26　AU/cm를 초과했을 때 0.54　AU/cm 아래로 떨어질 때까지 용출된 CDP870 Fab'를 수집했다.

CDP870 Fab' 풀(pool)에 대해 10　kDa의 공칭 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르 술폰계 한외여과막을 사용하는 원심식 농축기에서 한외여과 처리하여 CDP870 Fab' 풀의 농도가 6　mg/mL에 이르도록 했다. 이후, 20　mM Tris에서 CDP870 Fab' 풀이 pH　8.0 및 전도도 1.1　mS/cm에 도달할 때까지 정용여과(diafiltration)를 수행하였다. 정용여과를 위해 버퍼의 6 부피가 필요하였다.

CDP870 Fab' 풀을 지이 헬스케어의 Capto　Q^TM 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상으로 500　cm/h의 유속으로 수지 1리터당 약 5　g의 CDP870 Fab'를 적용하며 로딩하였다[덱스트란 링커(이온 용량 0.16 - 0.22　mmol Cl^-/ml)를 통해 부착된 4급 아민 음이온 교환 리간드를 가진 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)]. Capto　Q^TM 음이온 교환 컬럼은 10 cm 높이와 7.7 mm 직경을 가진 컬럼층을 가졌다. 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 단계 이전에 염산을 사용하여 pH　8.0으로 조정된 20　mM Tris / 1M NaCl 버퍼의 3 컬럼 부피와 염산을 사용하여 pH　8.0으로 조정된 20　mM Tris 버퍼의 5 컬럼 부피로 평형화되어져 있었다.

이후 컬럼을 평형 버퍼의 5 컬럼 부피로 세척하여 CDP870 Fab'를 회수했다.

로딩 개시 직후 280　nm에서 UV 흡광도가 0.5　AU/cm를 초과했을 때 CDP870 Fab' 분획의 수집을 개시하였다. UV 흡광도가 0.5　AU/cm 아래로 떨어졌을 때 세척 동안 분획 수집을 종결하였다. 이 단계에서 항체 단편에 대한 수율은 90.5%였다.

실시예 2

CDP870 Fab'를 이. 콜라이 숙주 세포에서 이종 단백질로서 1.9　g/L 농도로 발현시켰다. Tris-EDTA를 첨가하고 50℃에서 열처리하여 숙주 세포의 주변세포질 공간으로부터 이종 단백질을 방출시켰다. 원심분리를 통해 세포 물질을 제거하고 아세트산의 첨가를 통해 이종 단백질을 함유하는 세포 추출물을 pH　4.5로 조정하였다. 이후, pH 조정된 세포 추출물을 원심분리와 0.2 ㎛ 필터를 갖는 다층 여과를 조합하여 정화시켰다.

이후, CDP870 Fab'를 함유한 공급 스트림을 지이 헬스케어의 Capto　S 양이온 교환 컬럼 상으로 300　cm/h의 유속으로 약 51　g/L 수지로 로딩하였다[덱스트란 링커(이온 용량 0.11 - 0.14 mmol　Na⁺/ml)를 통해 부착된 술포네이트 양이온 교환 리간드를 가진 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)]. Capto　S 양이온 교환 컬럼은 16 mm 직경 및 20 cm 높이의 컬럼층을 가졌다. 컬럼은 공급 스트림 로딩 이전에 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50　mM 아세트산나트륨 / 1　M NaCl 버퍼의 3 컬럼 부피 및 이후에 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50　mM 아세트산나트륨 버퍼의 4 컬럼 부피로 평형화되어 있었다.

로딩 후 결합되지 않은 모든 물질이 씻겨 제거될 때까지 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50　mM 아세트산나트륨 버퍼의 6 컬럼 부피로 컬럼을 세척하였다. CDP870 Fab' 분획을, 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50　mM 아세트산나트륨 및 200　mM NaCl를 갖는 버퍼의 최대 8 컬럼 부피로 용출시켰다. 280　nm에서 UV 흡광도가 0.5　AU/cm를 초과했을 때 0.5　AU/cm 아래로 떨어질 때까지 용출된 CDP870 Fab'를 수집했다.

CDP870 Fab' 풀에 대해 10　kDa의 공칭 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르 술폰계 한외여과막을 사용하는 원심식 농축기(Amicon)에서 한외여과 처리하여 CDP870 Fab' 풀의 농도가 18　mg/mL에 이르도록 했다. 이후 20　mM Tris에서 CDP870 Fab' 풀이 pH　8.3 및 전도도 1.0　mS/cm에 도달할 때까지 정용여과를 수행하였다. 정용여과를 위해 버퍼의 6 부피가 필요하였다.

CDP870 Fab' 풀을 지이 헬스케어의 Capto　Q 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상으로 250　cm/h의 유속으로 수지 1리터당 약 30　g의 CDP870 Fab'를 적용하며 로딩하였다[덱스트란 링커(이온 용량 0.16 - 0.22　mmol Cl^-/ml)를 통해 부착된 4급 아민 음이온 교환 리간드를 가진 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)]. Capto　Q^TM 음이온 교환 컬럼은 10 cm 높이와 7.7 mm 직경을 가진 컬럼층을 가졌다. 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 단계 이전에 염산을 사용하여 pH　8.3으로 조정된 20　mM Tris / 1M NaCl 버퍼의 3 컬럼 부피와 염산을 사용하여 pH　8.3으로 조정된 20　mM Tris 버퍼의 5 컬럼 부피로 평형화되어져 있었다.

로딩 개시 직후 280　nm에서 UV 흡광도가 0.5　AU/cm를 초과했을 때 CDP870 Fab' 분획의 수집을 개시하였다. UV 흡광도가 2.0　AU/cm 아래로 떨어졌을 때 세척 동안 분획 수집을 종결하였다.

실시예 3

CDP870 Fab'를 이. 콜라이 숙주 세포에서 이종 단백질로서 2.5　g/L 농도로 발현시켰다. Tris-EDTA를 첨가하고 50℃에서 열처리하여 숙주 세포의 주변세포질 공간으로부터 이종 단백질을 방출시켰다. 원심분리를 통해 세포 물질을 제거하고 아세트산의 첨가를 통해 이종 단백질을 함유하는 세포 추출물을 pH　4.5로 조정하였다. 이후, pH 조정된 세포 추출물을 원심분리와 0.2 ㎛ 필터를 갖는 다층 여과를 조합하여 정화시켰다.

정화된 추출물(공급 스트림)을 물을 사용하여 희석 배율 4로 희석하여 4.0　mS/cm의 전도도를 달성하였다.

이후, CDP870 Fab'를 함유한 공급 스트림을 지이 헬스케어의 Capto　S 양이온 교환 컬럼 상으로 400　cm/h의 유속으로 약 60　g/L 수지로 로딩하였다[덱스트란 링커(이온 용량 0.11 - 0.14 mmol　Na⁺/ml)를 통해 부착된 술포네이트 양이온 교환 리간드를 가진 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)]. Capto　S 양이온 교환 컬럼은 20 cm 직경 및 24 cm 높이의 컬럼층을 가졌다. 컬럼은 공급 스트림 로딩 이전에 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50　mM 아세트산나트륨 / 1　M NaCl 버퍼의 3 컬럼 부피 및 이후에 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50　mM 아세트산나트륨 버퍼의 4 컬럼 부피로 평형화되어 있었다.

로딩 후 결합되지 않은 모든 물질이 씻겨 제거될 때까지 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50　mM 아세트산나트륨 버퍼의 6 컬럼 부피로 컬럼을 세척하였다. CDP870 Fab' 분획을, 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50　mM 아세트산나트륨 및 250　mM NaCl을 갖는 버퍼의 최대 5 컬럼 부피로 용출시켰다. 280　nm에서 UV 흡광도가 1.75　AU/cm를 초과했을 때 0.55　AU/cm 아래로 떨어질 때까지 용출된 CDP870 Fab'를 수집했다.

CDP870 Fab'에 대해 10　kDa의 공칭 분자량 컷오프를 갖는 0.4　㎡ 폴리에테르술폰막(폴(Pall) 10k 오메가 센트라메이트 T-시리즈)을 사용하여 접선 흐름 방식으로 한외여과 처리하였다. Fab' 용액이 pH　8.5 및 전도도 0.8　mS/cm일 때까지 20　mM Tris pH　8.5의 5.8 부피를 이용한 정용여과 이전에 CDP870 Fab'를 51　mg/mL로 농축하였다. Fab'를 한외여과 장비로부터 회수하고 이러한 시스템으로부터 임의의 남은 Fab'를 세척하는데 사용된 20　mM Tris pH　8.5 버퍼 600　mL로 풀링하였다.

CDP870 Fab' 풀을 지이 헬스케어의 Capto　Q 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상으로 200　cm/h의 유속으로 수지 1리터당 약 37　g의 CDP870 Fab'를 적용하며 로딩하였다[덱스트란 링커(이온 용량 0.16 - 0.22　mmol Cl^-/ml)를 통해 부착된 4급 아민 음이온 교환 리간드를 가진 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)]. Capto　Q^TM 음이온 교환 컬럼은 24 cm 높이와 20 cm 직경의 컬럼층을 가졌다. 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 단계 이전에 염산을 사용하여 pH　8.5로 조정된 20　mM Tris / 1M NaCl 버퍼의 3 컬럼 부피와 염산을 사용하여 pH　8.5로 조정된 20　mM Tris 버퍼의 5 컬럼 부피로 평형화되어져 있었다.

실시예 4

참고문헌 목록

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Claims

주변세포질 세포 추출물로부터 항체 단편의 정제 방법으로서, 상기 방법은 2 이하의 크로마토그래피 단계를 포함하며,
a) 항체 단편을 포획하기 위한 제1 크로마토그래피 단계로서, 항체 단편을 1.5　g/L 이상의 농도로 함유하는 혼합물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 그 후에 용출시켜 항체 단편을 함유하는 제1 용출물을 생성하는 것인 단계; 및
b) 제1 용출물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물을 포획하고 항체 단편을 함유하는 통과액(flow through)을 생성하는 제2 크로마토그래피 단계
를 포함하는 정제 방법.
삭제
주변세포질 세포 추출물로부터 항체 단편의 정제 방법으로서, 상기 방법은 2 이하의 크로마토그래피 단계를 포함하며,
a) 항체 단편을 포획하기 위한 제1 크로마토그래피 단계로서, 항체 단편을 1.5　g/L 이상의 농도로 함유하는 혼합물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 그 후에 용출시켜 항체 단편을 함유하는 제1 용출물을 생성하는 것인 단계;
b) 제1 용출물에 적용되는 제1 한외여과;
c) 정제된 제1 용출물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물을 포획하고 항체 단편을 함유하는 통과액을 생성하는 제2 크로마토그래피 단계; 및
d) 통과액에 적용되는 제2 한외여과
를 포함하는 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 모든 크로마토그래피 단계를 크로마토그래피 컬럼 상에서 수행하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피를 용출 방식으로 수행하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 제1 크로마토그래피 단계는 하기 단계들을 순차적으로 포함하는 것인 정제 방법:
a) 항체 단편을 함유하는 혼합물을 양이온 교환 컬럼 상으로 로딩하는 단계,
b) 양이온 교환 컬럼을 세척 버퍼로 세척하는 단계로서, 세척 동안 버퍼의 전도도, pH 및 염 농도가 변함이 없는 것인 단계, 및
c) 항체 단편을 용출 버퍼로 용출시키는 단계.
제6항에 있어서, 세척 버퍼의 pH가 제1 크로마토그래피 단계 이전에 항체 단편을 함유하는 혼합물의 pH와 동일한 것인 정제 방법.
제6항에 있어서, 항체 단편을 함유하는 혼합물은 제1 크로마토그래피 단계 이전에 pH 4.0 내지 5.0을 가지는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 제1 크로마토그래피 단계에서 항체 단편을 함유하는 혼합물은 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 이전에 박테리아 숙주 세포 단백질을 200　㎍/ml 내지 10,000　㎍/ml의 양으로 함유하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 제1 크로마토그래피 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피를 300 cm/h 이상의 유속으로 수행하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 제1 크로마토그래피 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피를 6 mS/cm 이하의 전도도에서 수행하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 제1 크로마토그래피 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수지에 결합된 술포닐, 술포프로필 또는 카르복시메틸을 포함하는 크로마토그래피 컬럼에서 수행하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 제1 크로마토그래피 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 항체 단편에 대한 동적 결합능(dynamic binding capacity)이 50 내지 75　g/L 수지인 정제 방법.
제12항에 있어서, 제1 크로마토그래피 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 수지는 50　㎛ 이상의 평균 입자 크기를 가지는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 일차 포획 단계의 양이온 교환 크로마토그래피에서 수지 1 리터 당 5 내지 100　g의 항체 단편이 로딩되는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 제2 크로마토그래피 단계에서 음이온 교환 크로마토그래피를 4급 암모늄(Q), 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 트리메틸아미노에틸(TMAE)을 포함하는 수지 상에서 수행하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 항체 단편은 Fab, Fab' 또는 scFv인 정제 방법.
제17항에 있어서, Fab 또는 Fab'는 VEGF-A, FcRn, OX40, 글리코프로테인 IIb/IIIa 수용체, C5, HER2/neu, TNFα, IL1β 또는 CD40-L에 특이적으로 결합하는 것인 정제 방법.
제18항에 있어서, Fab 또는 Fab'은 압식시맙, 라니비주맙, 펙셀리주맙, CDP870, CDP484 또는 CDP7657인 정제 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 공정으로부터 회수되는 항체 단편은 숙주 세포 단백질을 150 ppm 이하의 양으로 함유하는 것인 정제 방법.