KR20110093799A - Ｉｌ-12에 결합하는 항체 및 이의 정제 방법 - Google Patents

Ｉｌ-12에 결합하는 항체 및 이의 정제 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20110093799A
KR20110093799A KR1020117011046A KR20117011046A KR20110093799A KR 20110093799 A KR20110093799 A KR 20110093799A KR 1020117011046 A KR1020117011046 A KR 1020117011046A KR 20117011046 A KR20117011046 A KR 20117011046A KR 20110093799 A KR20110093799 A KR 20110093799A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
disease
sample
hcp
antibodies
Prior art date
Application number
KR1020117011046A
Other languages
English (en)
Inventor
로버트 케이. 히크먼
칭 황
바바라 페릴리-팔머
Original Assignee
아보트 러보러터리즈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아보트 러보러터리즈 filed Critical 아보트 러보러터리즈
Publication of KR20110093799A publication Critical patent/KR20110093799A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

항-IL-12 항체가 이의 항원결합부와 함께 개시된다. 항-IL-12 항체를 샘플 매트릭스로부터 분리 및 정제하는 하나 이상의 방법이 제공된다. 이와 같이 분리된 항-IL-12 항체는 임상 환경뿐만 아니라 연구 및 개발에도 사용될 수 있다. 또한, 분리된 항-IL-12 항체를 포함하는 약제학적 조성물도 개시된다.

Description

ＩＬ-12에 결합하는 항체 및 이의 정제 방법{Antibodies that bind to IL-12 and methods of purifying the same}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 본원에 전문이 참고인용된 2008년 10월 20일에 출원된 미국 임시 출원번호 61/196,752를 우선권으로 주장한다.
발명의 배경
사람 인터루킨 12(IL-12)는 구조가 득특하고 다면발현성 효과가 있는 사이토킨으로 확인되어 있다. IL-12는 면역 및 염증 반응에 연관된 여러 질환과 관련이 있는 병리에 중요한 역할을 한다. IL-12, 이의 생물학적 활성 및 질환에서의 역할에 관한 검토는 문헌[Gately et al.(1998) Ann. Rev. Immunol. 16: 495-521]에서 찾아볼 수 있다.
구조적으로, IL-12는 이황화 가교에 의해 함께 결합된 35kDa 서브유닛(p35) 및 40 kDa 서브유닛(p40)을 포함하는 이종이량체성 단백질이다("p70 서브유닛"이라 불림). 이러한 이종이량체성 단백질은 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포에 의해 주로 생산된다. 이 세포 종류들은 또한 p70 서브유닛에 비해 p40 서브유닛을 과량으로 분비한다. p40 및 p35 서브유닛은 유전자적으로 관련이 없고 p40 동종이량체가 IL-12 길항물질로 기능하기도 하지만 생물학적 활성을 보유하는 것으로 보고된 적이 없다.
기능적으로, IL-12는 항원 특이적 T 헬퍼 타입(Th1) 및 타입 2(Th2) 림프구 간에 평형을 조절하는데 중심 역할을 한다. Th1 및 Th2 세포는 자가면역 장애의 개시 및 진행을 좌우하고 IL-12는 Th1-림프구 분화 및 성숙을 조절하는데 중요하다. Th1 세포에 의해 방출된 사이토킨은 염증성이고, 인터페론-γ(IFNγ), IL-2 및 림포톡신(LT)을 포함한다. Th2 세포는 체액면역, 알러지 반응 및 면역억제를 촉진하기 위해 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13을 분비한다.
자가면역 질환의 Th1 반응의 우세 및 IFNγ의 염증촉진성 활성과 일관성있게, IL-12는 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS) 및 크론병과 같은 많은 자가면역 질환 및 염증 질환과 관련된 병리에 주요 역할을 할 수 있다.
사람 MS 환자는 급성 MS 플라크 내의 p40 mRNA 수준에 의해 증명되는 것처럼 IL-12 발현의 증가를 입증했다. 또한, MS 환자 유래의 CD40L-발현 T 세포에 의한 항원-제시 세포의 생체외 자극은 CD40/CD40L 상호작용이 IL-12의 강력한 유도인자라는 관찰과 일관성 있게, 대조용 T 세포에 비해 IL-12 생산을 증가시켰다.
IL-12 p70의 상승 수준은 건강한 대조군에 비해 RA 환자의 활액에서 검출되었다. RA 활액에서 사이토킨 전령 리보핵산(mRNA) 발현 프로필은 주로 Th1 사이토킨으로 인식되었다. 또한, IL-12는 크론병(CD)과 관련된 병리에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 이 질환이 있는 환자의 장 점막에서는 IFNγ 및 IL-12의 발현 증가가 관찰되었다. CD 환자의 점막고유층 유래의 T 세포의 사이토킨 분비 프로필은 주로 Th1 반응, 예를 들어 매우 상승된 IFNγ 수준을 특징적으로 나타낸다. 더욱이, CD 환자 유래의 결장 조직 절편은 다량의 IL-12 발현성 대식세포 및 IFNγ 발현성 T 세포를 보여준다.
다양한 사람 장애에서 사람 IL-12의 역할로 인해, IL-12 활성을 억제하거나 반작용하는 치료 전략이 설계되었다. 특히, IL-12에 결합하고 중화하는 항체는 IL-12 활성을 억제하는 수단으로서 조사되고 있다. IL-12에 대한 항체를 포함하는 치료 수단은 고순도이어야 하는 것이 중요하다. 본 발명은 이러한 요구를 단백질 A 컬럼 또는 등가의 단백질 A계 정제 단계를 사용함이 없이 해결한다.
특정 양태에서, 본 발명은 IL-12에 결합하는 정제, 분리된 항체 및 항체 단편뿐만 아니라 이러한 항체 및 단편을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명은 사람 IL-12에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원-결합부에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 항-IL-12 항체는 임상 환경뿐만 아니라 연구 및 개발에도 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시된 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 항-IL-12 항체에 관한 것이다.
본 발명의 특정 양태는 숙주 세포 단백질("HCP")이 실질적으로 없도록 샘플 매트릭스로부터 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부를 정제하는 방법에 관한 것이다. 특정 관점에서, 샘플 매트릭스(또는 간단하게 "샘플")는 본 발명의 항-IL-12 항체를 생산하는데 이용된 세포주를 포함한다. 특정 관점에서, 샘플은 사람 항-IL-12 항체를 생산하는데 사용된 세포주를 포함한다.
본 발명의 특정 관점에서, 추정상의 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부를 포함하는 샘플 매트릭스는 pH 조정된다. 특정 관점에서, pH는 약 3.5로 조정된다. 무엇보다 낮은 pH는 샘플을 오염시킬 수 있는 pH-민감성 바이러스의 감소 및/또는 불활성화를 촉진한다. 적당한 시간 후, pH는 약 5.0으로 조정하고, 샘플은 이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 용출액을 수득한다. 특정 관점에서, 이온 교환 용출액은 수집한 후, 소수성 상호작용 크로마토그래피로 처리하고 용출액을 수득한다. 그 다음, 소수성 상호작용 크로마토그래피 용출액은 추가 가공처리 또는 사용을 위해 수집할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 무엇보다 세포 및 세포 파편을 제거하기 위해 1차 회수 단계를 포함하는 IL-12 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 전술한 방법의 특정 양태에서, 1차 회수 단계는 1회 이상의 원심분리 및 심층 여과 단계를 포함한다. 예를 들어, 원심분리 단계는 약 7000 x g 내지 약 11,000 x g에서 수행될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 전술한 방법의 특정 양태는 심층 여과 단계, 예를 들어 탈지질 심층 여과 단계를 포함할 것이다.
전술한 방법의 특정 양태에서, 이온 교환 단계는 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 이의 조합일 수 있다. 이 단계는 양이온 교환 단계 이후 음이온 교환 단계, 또는 그 반대와 같이 복수의 이온 교환 단계를 포함할 수 있다. 특정 관점에서, 이온 교환 단계는 2 단계 이온 교환 공정을 수반한다. 이러한 2 단계 공정은 예를 들어 1차 양이온 교환 단계, 및 그 다음 2차 음이온 교환 단계에 의해 달성될 수 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 양이온 교환 컬럼의 예로는 정지 상이 CM Hyper DF™ 컬럼과 같이 음이온 그룹을 포함하는 컬럼이다. 이러한 이온 교환 포획 크로마토그래피 단계는 1차 회수 혼합물로부터 항-IL-12 항체의 분리를 용이하게 한다. 적당한 음이온 교환 컬럼은 정지 상이 양이온 그룹인 컬럼이다. 이러한 컬럼의 한 예는 Q Sepharose™ 컬럼이다. 하나 이상의 이온 교환 단계는 추가로 숙주 세포 단백질 및 DNA, 이용가능한 경우 친화성 매트릭스 단백질로서 불순물을 감소시켜 항-IL-12 항체를 분리한다. 이러한 음이온 교환 절차는 항-IL-12 항체가 음이온 교환 수지(또는 고체 상)에 결합하거나 상호작용하지 않는 관류 방식의 크로마토그래피이다. 하지만, 많은 불순물이 상호작용하여 음이온 교환 수지에 결합한다.
특정 양태에서, 1차 및 2차 이온 교환 단계는 1차 회수 후에 수행한다. 이러한 양태의 특정예에서, 이온 교환 샘플은 1차 이온 단계 전, 두 이온 교환 단계 사이 또는 이 둘 모두에 중간 여과 단계로 처리된다. 특정 관점에서, 이 여과 단계는 포획 한외여과/정용여과("UF/DF")를 포함한다. 이러한 여과는 무엇보다 항-IL-12 항체 및 이의 항원결합부의 농축 및 완충액 교환을 용이하게 한다.
본 발명의 특정 양태는 하나 이상의 소수성 상호작용 크로마토그래피("HIC") 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 적당한 HIC 컬럼은 정지 상이 소수성 그룹을 포함하는 것이다. 이러한 컬럼의 비제한적 예는 페닐 HP Sepharose™ 컬럼이다. 특정 경우에, 항-IL-12 항체는 분리/정제 과정 동안 응집물을 형성할 것이다. 하나 이상의 HIC 단계의 포함은 이러한 응집물의 감소 또는 제거를 용이하게 한다. 또한, HIC는 불순물의 제거를 보조한다. 특정 양태에서, HIC 단계는 소수성 컬럼과 항-IL-12 항체(또는 이의 응집물)의 상호작용을 촉진하기 위해 고염 완충액을 이용한다. 그 다음, 항-IL-12 항체는 저 농도의 염을 이용하여 용출시킬 수 있다.
특정 양태에서, HIC 용출액은 바이러스 제거 필터를 이용해 여과하며, 그 예로는 Ultipor DV50™ 필터(Pall Corporation, East Hills, N.Y.)를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 대안적 필터, 예를 들어 Viresolve™ 필터(Millipore, Billerica, Mass.); Zeta Plus VR™ 필터(CUNO; Meriden, Conn.); 및 Planova™ 필터(Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, Ill.)도 이 양태에 사용할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 분리된 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부 및 허용되는 담체를 포함하는 하나 이상의 약제학적 조성물에 관한 것이다. 한 관점에서, 조성물은 추가로 항-IL-12 항체 외에 하나 이상의 항체 또는 이의 항원결합부를 포함한다. 다른 관점에서, 조성물은 추가로 하나 이상의 약제학적 제제를 포함한다.
도 1은 항-IL-12 항체의 비제한적 예(ABT-847)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 개시한다.
본 발명은 IL-12에 결합하는 항체에 관한 것이다. 한 관점에서, 본 발명은 사람 IL-12에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원결합부에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 항-IL-12 항체는 임상 환경뿐만 아니라 연구 및 개발에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 항-IL-2 항체 또는 이의 항원결합부를 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 상황에서 정제될 수 있는 적당한 항-IL-12 항체는 미국 특허 6,914,128(전문이 본원에 참고인용됨)에 개시되어 있으며, 그 예로는 이 특허에서 J695로 표시되고 이후에 ABT-874로 표시된 항-IL-12 항체를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. ABT-874의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열은 도 1과 서열번호 1 및 2에 제시하고 있다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제한하기 위한 것이 아니라 명확히 하기 위해, [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]은 다음과 같은 하위 부분으로 분류한다:
1. 정의;
2. 항체 제조;
3. 항체 생산;
4. 항체 정제;
5. 샘플 순도 분석 방법;
6. 추가 변형;
7. 약제학적 조성물; 및
8. 항체 용도.
1. 정의
본 발명은 더 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해 먼저 특정 용어들을 정의한다.
"항체"란 용어는 2개의 중쇄(H)와 경쇄(L)가 이황화 결합에 의해 상호연결된 4개의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 면역글로불린 분자를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH라 약칭) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL이라 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 다시 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 초가변성 영역, 및 산재해 있는 프레임워크 영역(FR)이라 불리는 더욱 보존적인 영역으로 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단부터 카르복시 말단까지 다음과 같은 순서, 즉 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되어 있다.
항체의 "항원결합부"(또는 "항체부")란 용어는 항원(예: hIL-12)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편을 포함한다. 항체의 항원 결합 기능은 완전한 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 포함하는 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 2개의 Fab 단편이 힌지(hinge) 영역에서 이황화 가교에 의해 결합되어 있는 이가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인을 포함하는 Fd 단편; (iv) 항체 한쪽 암(arm)의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 Fv 단편; (v) VH 도메인을 포함하는 dAb 단편(본원에 전체 교시가 참조로서 인용되는, Ward et al.,(1989) Nature 341: 544-546 참조); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH는 다른 유전자에 의해 암호화되지만, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로 알려진 것; 예를 들어 Bird et al.(1998) Science 242: 423-426; 및 Huston et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:5879-5883, 전체 교시는 본원에 참고 인용됨)를 형성하고 있는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커를 이용하여 재조합법으로 결합시킬 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 항체의 "항원결합부"라는 용어에도 포함되는 것으로 간주한다. 단일쇄 항체의 다른 형태, 예를 들어 디아바디(diabody)도 포함된다. 디아바디는 단일 폴리펩타이드 쇄에서 VH 및 VL 도메인이 발현되지만, 동일 쇄 상의 두 도메인 사이에 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 상기 도메인들이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가의 이특이적 항체이다(예를 들어, Holliger, P., et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al.(1994) Structure 2: 1121-1123, 전체 교시가 본원에 참고인용됨). 또한, 항체 또는 이의 항원결합부는 이 항체 또는 항체부와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와의 공유 또는 비공유 연합에 의해 형성된 더 큰 면역부착 분자의 부분일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예로는 사량체성 scFv 분자를 제조하는 스트렙타비딘 코어 영역의 용도(Kipriyanov, S.M., et al.(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101, 이의 전체 교시는 본원에 참고 인용됨) 및 2가 비오티닐화된 scFv 분자를 제조하는 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 용도(Kipriyanov, S.M. et al.(1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058, 이의 전체 교시는 본원에 참고인용됨)를 포함한다. 항체부, 예를 들어 Fab 및 F(ab')2 단편은 각각 완전 항체의 파파인 또는 펩신 분해와 같은, 통상의 기술을 이용하여 완전 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체부 및 면역부착 분자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 한 관점에서, 항원결합부는 전체 도메인 또는 전체 도메인의 쌍이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "사람 인터류킨 12"(hIL-12 또는 IL-12로 약칭됨)는 대식세포 및 수지상 세포에 의해 주로 분비되는 사람 사이토킨이다. 상기 용어는 이황화 가교에 의해 함께 결합되는 35kD 서브유닛(p35) 및 40kD 서브유닛(p40)을 포함하는 이종이량체성 단백질을 포함한다. 이러한 이종이량체성 단백질은 "p70 서브유닛"이라 한다. 사람 IL-12의 구조는 추가로 예를 들면, 문헌[Kobayashi, et al. (1989) J. Exp. Med. 170:827-845; Seder, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp. Med. 154:116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237. 이들의 전체 교시는 본원에 참고인용됨]에 기술되어 있다. IL-12를 암호화하는 핵산은 진뱅크(GenBank) 등록번호 NM_000882로 입수가능하고, 폴리펩타이드 서열은 진뱅크 등록번호 NP_000873.2로 입수가능하다. 용어 사람 IL-12는 표준 재조합 발현 방법으로 제조할 수 있는 재조합 사람 IL-12(rh IL-12)를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "캐뱃(Kabat) 번호", "캐뱃 정의" 및 "캐뱃 표지"는 상호교환적으로 본원에서 사용된다. 당해 분야에 인식된 이 용어들은 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기보다 더 가변성(즉, 초가변성)인 아미노산 잔기의 번호를 매기는 시스템을 의미한다[Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 및 Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 이의 전체 교시들은 본원에 참고인용됨]. 중쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 위치 31 내지 35, CDR2에 있어서 아미노산 위치 50 내지 65, 및 CDR3에 있어서 아미노산 위치 95 내지 102의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 위치 24 내지 34, CDR2에 있어서 아미노산 위치 50 내지 56, 및 CDR3에 있어서 아미노산 위치 89 내지 97의 범위이다.
용어 "사람 항체"는 문헌[참조: Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Services, NIH Publication No. 91-3242, 이의 전체 교시들은 본원에 참고인용됨]에 기술된 바와 같이 사람 생식계열 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 사람 항체는 예를 들면, CDR 및 특히 CDR3에서, 사람 생식계열 면역글로불린 서열에 의해서 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해서 또는 생체내 체세포성 돌연변이에 의해서 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 돌연변이는 "선택적 돌연변이유발 방법"을 사용하여 도입시킬 수 있다. 사람 항체는 아미노산 잔기, 예를 들어 사람 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 활성 증진 아미노산 잔기로 교체된 하나 이상의 위치를 보유할 수 있다. 사람 항체는 최고 20개 위치까지 사람 생식계열 면역글로불린 서열의 일부가 아닌 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 다른 양태에서, 10개 이하, 5개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하의 위치가 교체된다. 한 양태에서, 이러한 교체는 CDR 영역 내에서 이루어진다. 하지만, 본 명세서에 사용되는 "사람 항체"란 용어는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열 유래의 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하는 것을 의미하지는 않는다.
"선택적 돌연변이유발 방법"이란 어구는 적어도 하나의 적당한 선택적 돌연변이유발 위치, 과돌연변이 및/또는 접촉 위치에서 CDR 아미노산을 선택하고 각각 돌연변이시킴으로써 항체의 활성을 개선시키는 방법을 포함한다. "선택적으로 돌연변이된" 사람 항체는 선택적 돌연변이유발 방법을 사용하여 선택한 위치에 돌연변이를 포함하는 항체이다. 또 다른 관점에서, 선택적 돌연변이유발 방법은 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3(이후, 각각 H1, H2, 및 H3) 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3(이후, 각각 L1, L2 및 L3)에서 선택된 각각의 아미노산 잔기를 바람직하게 돌연변이시키는 방법을 제공함을 의미한다. 아미노산 잔기는 선택적 돌연변이유발 위치, 접촉 위치 또는 과돌연변이 유발 위치 중에서 선택할 수 있다. 각각의 아미노산은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에서의 각자 위치에 기초하여 선택한다. 이는 과돌연변이 위치가 또한 접촉 위치일 수도 있는 것으로 이해되어야 한다. 한 가지 관점에서, 선택적 돌연변이유발 방법은 "표적화된 방법"이다. 용어 "표적화된 방법"은 표적화된 방식, 예를 들면, "그룹형 표적화된 방법" 또는 "CDR형 표적화된 방법"으로 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에서 선택된 각각의 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 방법을 포함한다. "그룹형 표적화된 방법"에서, 특정 그룹 내의 각 아미노산 잔기는 예를 들어 표적화 선호도 순으로 기재 시, 그룹 I(L3 및 H3 포함), II(H2 및 L1 포함), 및 III(L2 및 H1 포함) 등이 선택적 돌연변이를 위해 표적화된다. "CDR형 표적화 방법"에서, 특정 CDR 중의 각 아미노산 잔기는 H3, L3, H2, L1, H1 및 L2의 표적화에 바람직한 순서로 선택적 돌연변이에 대해서 표적화된다. 선택된 아미노산 잔기는 예를 들면, 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이되며 항체 활성에서의 돌연변이 효과를 측정한다. 활성은 항체의 결합 특이성/친화도 및/또는 항체의 중화 효능에서의 변화로서 측정한다. 선택적 돌연변이유발 방법은 파지 디스플레이, 사람 IgG 생식계열 유전자를 보유한 도입유전자 동물, 사람 B 세포로부터 분리된 사람 항체를 비롯한 임의의 공급원에서 유래되는 모든 항체의 최적화에 사용될 수 있다. 선택적 돌연변이유발 방법은 파지 디스플레이 기술을 사용하여 더 이상 최적화시킬 수 없는 항체에 사용될 수 있다. 파지 디스플레이, 사람 IgG 생식계열 유전자를 보유한 도입유전자 동물, 사람 B 세포로부터 분리된 사람 항체를 비롯한 모든 공급원으로부터의 항체가 선택적 돌연변이유발 방법 전 또는 후에 역돌연변이될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
"재조합형 사람 항체"란 용어는 재조합형 방식에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 사람 항체, 예를 들어 숙주 세포에 형질감염된 재조합형 발현 벡터에 의해 발현된 항체, 재조합형 조합 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 사람 면역글로불린 유전자에 대해 돌연변이성인 동물(예: 마우스)로부터 분리된 항체(예를 들어, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295, 이의 전체 교시는 본원에 참고인용됨) 또는 다른 DNA 서열과 사람 면역글로불린 유전자 서열의 이식을 포함하는 임의의 다른 방식에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합형 사람 항체는 사람 생식계열 면역글로불린 서열 유래의 가변영역 및 불변 영역을 보유한다(Kabat, E.A. et al.(1991) Sequences of Proteins of immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 하지만, 특정 양태에서 이러한 재조합형 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 사람 Ig 서열에 대해 도입유전자성인 동물이 사용될 때에는 생체내 체세포 돌연변이유발)로 처리되어, 재조합형 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열이 사람 생식계열 VH 및 VL 서열에서 유래하고 관련이 있지만, 생체내 사람 항체 생식계열 목록에는 본래 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 하지만, 특정 양태에서 이러한 재조합형 항체는 선택적 돌연변이유발 방법 또는 역돌연변이, 또는 이 둘 모두의 결과이다.
"분리된 항체"는 항원 특이성이 상이한 다른 항체(예를 들어, hIL-12 외에 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없는 hIL-12에 특이적으로 결합하는 분리된 항체)를 포함한다. hIL-12에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종 유래의 IL-12 분자에 결합할 수 있다. 더욱이, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없는 것일 수 있다.
"중화 항체"(또는 "hIL-12 활성을 중화시키는 항체")는 hIL-12에 결합하여 hIL-12의 생물학적 활성을 억제하는 항체를 포함한다. 이러한 hIL-12의 생물학적 활성 억제는 hIL-12 생물학적 활성의 하나 이상의 지표인자, 예를 들어 피토헤마글루티닌 아세포 증식 분석(PHA)에서 사람 피토헤마글루티닌 아세포 증식 억제, 또는 사람 IL-12 수용체 결합 분석에서 수용체 결합의 억제를 측정하여 평가할 수 있다. 이러한 hIL-12 생물학적 활성의 지표인자는 당업계에 공지된 여러 표준 시험관내 또는 생체내 분석법 중 하나 이상에 의해 평가될 수 있다.
"활성"이란 용어는 항원에 대한 항체, 예를 들어 IL-12 항원에 결합하는 항-hIL-12 항체의 결합 특이성/친화성 및/또는 hIL-12에 대한 결합이 hIL-12의 생물학적 활성을 억제하는 항-hIL-12 항체와 같은 항체의 중화 효능과 같은 활성, 예를 들어 PHA 아세포 증식 억제 또는 사람 IL-12 수용체 결합 분석에서 수용체 결합 억제를 포함한다.
"표면 플라스몬 공명"이란 용어는 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ) 등을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경을 검출하여 생체특이적 상호작용의 실시간 분석을 가능케 하는 광학 현상을 포함한다. 이에 대한 상세한 설명은 문헌[Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al.(1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; 및 Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277, 이의 전체 교시들은 본원에 인용됨]에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용되는 "Koff"란 용어는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리를 나타내는 해리율 상수(off rate constant)를 의미하는 것으로 간주한다.
본 명세서에 사용되는 "Kd"란 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미하는 것으로 간주한다.
"핵산 분자"란 어구는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있지만, 한 관점에서는 이본쇄 DNA이다.
hIL-12에 결합하는 항체 또는 항체부(예: VH, VL, CDR3)를 암호화하는 핵산과 관련하여 본 명세서에 사용되는 "분리된 핵산 분자"란 어구는 항체 또는 항체부를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hIL-12 외에 다른 항원에 결합하는 항체 또는 항체부를 암호화하는 다른 뉴클레오타이드 서열이 없는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 다른 서열은 본래 사람 게놈 DNA 중의 핵산에 인접해 있을 수 있는 것이다. 따라서, 예를 들어 항-IL-12 항체의 VH 영역을 암호화하는 본 발명의 분리된 핵산은 IL-12 외에 다른 항원에 결합하는 다른 VH 영역을 암호화하는 다른 서열을 전혀 함유하지 않는다. 또한, "분리된 핵산 분자"란 어구는 2가 이중특이성 항체, 예를 들어 VH 및 VL 영역이 디아바디의 서열 외에 어떤 다른 서열을 전혀 함유하지 않는 디아바디를 암호화하는 서열을 포함하는 것을 의미한다.
재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 어구는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 포함한다. 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 포함한다. 이 용어는 특정 피검 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 언급하려는 것으로 이해되어야 한다. 하지만, 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 후속 세대에서는 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않지만, 본 명세서에 사용되는 "숙주 세포"란 용어의 범위에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 "변형"이란 용어는 항체 또는 이의 항원결합부에 존재하는 하나 이상의 아미노산을 변화시키는 것을 언급하고자 한다. 이 변화는 하나 이상의 위치에서 아미노산을 부가, 치환 또는 결실시켜 생산할 수 있다. 이 변화는 공지된 기술, 예를 들어 PCR 돌연변이유발을 이용하여 생산할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "약"이란 용어는 언급한 값보다 약 10 내지 20% 크거나 작은 범위를 의미하려는 것이다. 특정 상황에서, 당업자는 언급한 값의 성질에 따라서, "약"이란 용어가 그 값의 10 내지 20% 편차보다 많거나 적은 것을 의미할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
본 명세서에 사용되는 "바이러스 감소/불활성화"란 어구는 특정 샘플에 존재하는 바이러스 입자 수의 저하("감소")뿐만 아니라 활성의 저하, 예를 들어 특정 샘플에 존재하는 바이러스 입자의 감염도 또는 복제능(이에 국한되지 않는다)의 저하("불활성화")를 의미하려는 것이다. 이러한 바이러스 입자 수 및/또는 활성의 저하는 약 1% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 99%, 더욱 바람직하게는 약 30% 내지 약 99%, 더욱 바람직하게는 약 40% 내지 약 99%, 더 더욱 바람직하게는 약 50% 내지 약 99%, 더 더욱 바람직하게는 약 60% 내지 약 99%, 더 더욱 바람직하게는 약 70% 내지 약 99%, 더 더욱 바람직하게는 약 80% 내지 99%, 더 더욱 바람직하게는 약 90% 내지 약 99% 정도일 수 있다. 비제한적인 특정 양태에서, 정제된 항체 산물의 바이러스 양(존재한다면)은 이 바이러스의 ID50(표적 집단의 50%를 감염시키는 바이러스 양) 미만, 바람직하게는 상기 바이러스의 ID50보다 적어도 10배 미만, 더욱 바람직하게는 상기 바이러스의 ID50보다 적어도 100배 미만, 더 더욱 바람직하게는 상기 바이러스의 ID50보다 적어도 1000배 미만인 양이다.
"접촉 위치"란 어구는 26가지 공지된 항체-항원 구조 중 하나에서 항원에 접촉한 아미노산이 차지하는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에 존재하는 아미노산 위치를 포함한다. 26가지 공지된 항체-항원 복합체 구조 중 임의의 구조에서 CDR 아미노산이 항원과 접촉한다면, 그 아미노산이 접촉 위치를 차지하는 것으로 간주될 수 있다. 접촉 위치는 비-접촉 위치에서보다 항원과 접촉하는 아미노산이 차지할 가능성이 더 높다. 한 관점에서, 접촉 위치는 26가지 구조 중 3가지 구조 이상(>1.5%)에서 항원과 접촉하는 아미노산을 함유하는 CDR 위치이다. 다른 관점에서, 접촉 위치는 25가지 구조 중 8가지 이상(>32%)에서 항원과 접촉하는 아미노산을 함유하는 CDR 위치이다.
2. 항체 제조
본 섹션에 사용된 "항체"란 용어는 온전한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 의미한다.
본 명세서의 항체는 다양한 기술, 예를 들어 당해 항원으로 동물을 면역화한 후, 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein(1975) Nature 256: 495]의 표준 체세포 하이브리드화 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 대체로 체세포 하이브리드화 절차가 바람직하지만, 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양유전자성 형질전환을 이용할 수도 있다.
하이브리도마를 제조하는 한가지 바람직한 동물 시스템은 쥐 시스템이다. 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립되어 있는 절차이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 분리 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너(예: 쥐 골수종 세포) 및 융합 절차도 역시 공지되어 있다.
항체는 바람직하게는 사람 항체, 키메라 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다. 본 명세서의 키메라 항체 또는 사람화된 항체는 전술한 바와 같이 제조한 비-사람 모노클로날 항체의 서열을 기초로 하여 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA는 당해의 비-사람 하이브리도마로부터 수득하여 표준 분자생물학 기술을 이용해 비-쥐(예: 사람) 면역글로불린 서열을 함유하도록 유전자조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 쥐 가변 영역을 당업계에 공지된 방법으로 사람 불변 영역에 결합시킬 수 있다(예를 들어, 미국 특허 4,816,567, Cabilly et al. 참조). 사람화된 항체의 생성을 위해, 쥐 CDR 영역은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 사람 프레임워크에 삽입시킬 수 있다(예를 들어, 미국 특허 5,225,539(Winter) 및 미국 특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370(Queen et al.) 참조).
한가지 비제한적 양태에서, 본 명세서의 항체는 사람 모노클로날 항체이다. IL-12에 대해 지향성인 이러한 사람 모노클로날 항체는 마우스계보다는 사람 면역계의 일부를 운반하는 도입유전자성 또는 도입염색체성 마우스를 이용해서 제조할 수 있다. 이러한 도입유전자성 및 도입염색체성 마우스로는 HuMAb Mouse®(Medarex, Inc.), KM Mouse®(Medarex, Inc.) 및 XenoMouse®(Amgen)로 본 명세서에 언급되는 마우스를 포함한다.
더욱이, 사람 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적 도입염색체성 동물 시스템은 당업계에서 입수가능하고 본 발명의 항-IL-12 항체를 발생시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 사람 중쇄 도입염색체(transchromosome) 및 사람 경쇄 도입유전자를 모두 운반하는 마우스("TC 마우스"라고도 지칭됨)가 사용될 수 있고; 이러한 마우스는 문헌[Tomizuka et al.(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727]에 기술되어 있다. 또한, 사람 중쇄 및 경쇄 도입염색체를 운반하는 암소도 당업계에 개시되어 있고[예, Kuroiwa et al.(2002) Nature Biotechnology 20: 889-894 및 PCT 출원번호 WO 2002/092812], 본 발명의 항-IL-12 항체를 발생시키는데 사용될 수 있다.
항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부, 또는 본 명세서에 개시된 항-IL-12 관련 항체를 비롯한 본 발명의 재조합형 사람 항체는 사람 림프구 유래의 mRNA로부터 제조된 사람 VL 및 VH cDNA를 이용해 만든 재조합형 조합 항체 라이브러리, 예를 들어 scFv 파지 디스플레이 라이브러리를 선별하여 분리할 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조하고 선별하는 방법론은 당업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하기 위한 시판 키트(예: Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP™ 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612, 이의 전체 교시는 본원에 인용됨) 외에 항체 디스플레이 라이브러리를 제조 및 선별하는데 사용하기 위해 특별하게 수정할 수 있는 방법 및 시약의 예는 예를 들어, Ladner et al . 미국 특허 5,223,409; Kang et al . PCT 공개번호 WO 92/18619; Dower et al . PCT 공개번호 WO 91/17271; Winter et al . PCT 공개번호 WO 92/20791; Markland et al . PCT 공개번호 WO 92/15679; Breitling et al . PCT 공개번호 WO 93/01288; McCafferty et al . PCT 공개번호 WO 92/01047; Garrard et al . PCT 공개번호 WO 92/09690; Fuchs et al . (1991) Bio / Technology 9:1370-1372; Hay et al . (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al . (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al ., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al . (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al . (1991) Nature 352:624-628; Gram et al . (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al . (1991) Bio / Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al . (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; 및 Barbas et al . (1991) PNAS 88:7978-7982(이의 전체 교시들은 본원에 인용됨)에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 사람 모노클로날 항체는 또한 면역화 후 사람 항체 반응이 생성될 수 있도록 사람 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 이용해서 제조할 수도 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 5,476,996 및 5,698,767(Wilson et al.)에 기술되어 있다.
한 양태에서, 본 발명의 방법들은 항-IL-12 항체 및 항체부, 항-IL-12-관련 항체 및 항체부, 및 항-IL-12 항체와 등가의 성질, 예를 들어 해리 동역학이 낮은 hIL-12에 대한 높은 친화성 결합 및 높은 중화능을 나타내는 사람 항체 및 항체부를 포함한다. 한 관점에서, 본 발명은 표면 플라스몬 공명으로 측정한 바에 의하면, 약 1 x 10-8 M 이하의 Kd 및 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 hIL-12로부터 해리되는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원결합부로의 치료를 제공한다. 비제한적인 구체적 양태에서, 본 발명에 따라 정제된 항-IL12 항체는 생리적 조건 하에서 IL12에 대한 ABT-874의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 항-IL-12 항체 또는 이의 단편은 항체의 불변 영역을 변형시켜 적어도 하나의 불변 영역-매개 생물학적 이펙터 기능이 미변형 항체에 비해 감소하도록 개조될 수 있다. Fc 수용체에 대한 감소된 결합을 나타내도록 본 발명의 항체를 변형시키기 위해, 항체의 면역글로불린 불변 영역 분절은 Fc 수용체(FcR) 상호작용에 필요한 특정 영역에서 돌연변이될 수 있다(예를 들어, Canfield and Morrison(1991) J. Exp . Med . 173:1483-1491; 및 Lund et al . (1991) J. of Immunol . 147:2657-2662; 이의 전체 교시는 본원에 인용됨). 항체의 FcR 결합능의 감소는 또한 FcR 상호작용에 의존적인 다른 이펙터 기능, 예를 들어 옵소닌화 및 식세포작용 및 항원-의존적 세포의 세포독성 등을 감소시킬 수도 있다.
3. 항체 생산
본 발명의 항체를 발현하기 위해, 부분 또는 전체 길이의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 하나 이상의 발현 벡터에 유전자가 전사 및 해독 조절 서열에 작동가능하게 결합되도록 삽입한다(예를 들어, 전체 교시가 참고인용된 미국 특허 6,914,128 참조). 이 상황에서, "작동가능하게 결합된"이란 용어는 벡터 내의 전사 및 해독 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 해독을 조절하는 의도된 기능을 제공하도록 항체 유전자가 벡터에 연결되어 있다는 것을 의미하려는 것이다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 융화성인 것으로 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 다른 벡터에 삽입될 수 있거나, 또는 더욱 일반적으로 두 유전자가 동일한 발현 벡터에 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편과 벡터 상의 상보성 제한효소 부위의 연결, 또는 제한효소 부위가 존재하지 않는다면, 평활 말단 연결)으로 발현 벡터에 삽입한다. 항체 또는 항체-관련 경쇄 또는 중쇄 서열을 삽입하기 전에, 발현 벡터는 이미 항체 불변 영역 서열을 운반할 수도 있다. 예를 들어, 항-IL-12 항체 또는 항-IL-12 항체-관련 VH 및 VL 서열을 전체 길이의 항체 유전자로 변환시키기 위한 한가지 방법은 상기 서열들을 각각 이미 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 암호화하는 발현 벡터에, VH 분절이 벡터 내의 CH 분절(들)에 작동가능하게 결합하고 VL 분절이 벡터 내의 CL 분절에 작동가능하게 결합하도록 삽입하는 것이다. 또한, 또는 대안적으로, 재조합형 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 시그널 펩타이드를 암호화할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 시그널 펩타이드가 항체 쇄 유전자의 아미노산 말단에 프레임내(in-frame) 결합되도록 벡터에 클로닝할 수 있다. 시그널 펩타이드는 면역글로불린 시그널 펩타이드 또는 이종 시그널 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질 유래의 시그널 펩타이드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 외에, 본 발명의 재조합형 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열을 운반할 수 있다. "조절 서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 항체 쇄 유전자의 전사 또는 해독을 조절하는 다른 발현 조절 인자(예: 폴리아데닐화 시그널)를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 조절 서열은 문헌[Goeddel; Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), 이의 전체 교시는 본원에 참고인용됨]에 기술되어 있다. 당업자라면 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 설계가 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 적당한 조절 서열은 포유동물 세포에서 단백질 발현의 높은 수준을 유도하는 바이러스 인자, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV) 유래의 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40(SV40)(예를 들어, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들어 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마를 포함한다. 바이러스 조절 인자 및 이의 서열에 대한 더 상세한 설명은 문헌[예를 들어, 미국 특허 5,168,062, Stinski, 미국 특허 4,510,245, Bell et al. 및 미국 특허 4,968,615, Schaffner et al., 전체 교시는 본원에 참고인용됨]을 참조한다.
항체 쇄 유전자 및 조절 서열 외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 추가 서열, 예를 들어 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예: 복제 오리진) 및/또는 선택성 마커 유전자를 운반할 수 있다. 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입되는 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예를 들어, 미국 특허 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017, 모두 Axel et al. 참조, 전체 교시는 본원에 참고인용됨). 예를 들어, 일반적으로 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 적당한 선택성 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에 사용 시) 및 neo 유전자(G418 선택 시)를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체부는 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합형 발현에 의해 제조할 수 있다. 항체의 재조합 발현을 위해, 숙주 세포는 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포에서 발현되어 숙주 세포가 배양되는 배지로 분비되고 이 배지로부터 항체를 회수할 수 있도록 상기 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 운반하는 하나 이상의 재조합형 발현 벡터로 형질감염시킨다. 표준 재조합형 DNA 방법론은 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고 이 유전자들을 재조합형 발현 벡터에 혼입시키고 이 벡터를 숙주 세포에 도입시키는데 사용되며, 이 방법론은 예를 들어 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning ; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel et al . (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 및 미국 특허 4,816,397 및 6,914,128, 이의 전체 교시들은 본원에 인용됨]에 기술되어 있다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)를 표준 기술로 숙주 세포에 형질감염시킨다. "형질감염"이란 용어의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 도입시키는데 상용되는 매우 다양한 기술을 포함하는 것으로, 예를 들어 전기침투, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등이 있다. 이론적으로 본 발명의 항체는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 가능하지만, 진핵생물 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포에서 항체의 발현은 이러한 진핵생물 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵생물 세포보다 적당히 폴딩되고 면역학적 활성인 항체를 조립하여 분비할 가능성이 크기 때문에 적합하다. 항체 유전자의 원핵생물 발현은 활성 항체를 고 수율로 생산하는데 비효과적인 것으로 보고되어 있다(Boss and Wood (1985) Immunology Today 6:12-13, 전체 교시는 본원에 참고인용됨).
본 발명의 벡터에 있는 DNA를 클로닝하거나 발현하기에 적합한 숙주 세포는 전술한 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이 목적에 적당한 원핵생물은 진정세균, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아시에(Enterobacteriaceae), 예를 들어 에세리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실러스(Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리체니포미스(B. licheniformis)(예를 들어, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리체니포미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 한가지 적당한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294(ATCC 31,446)이지만, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110(ATCC 27,325)과 같은 다른 균주도 적당하다. 이러한 예들은 제한하는 것이 아니라 예시한 것이다.
원핵생물 외에, 진핵성 미생물, 예를 들어 사상 진균 및 효모는 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터에 적당한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 빵효모는 하등 진핵성 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 하지만, 다수의 다른 속, 종 및 균주도 일반적으로 이용가능하고, 본 발명에도 유용하며, 그 예로는 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라질리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 월티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라럼(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 써모톨러란스(K. thermotolerans), 및 케이. 막시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 나이거(A. niger)가 있다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체에서 유래되는 것이다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수많은 배큘로바이러스 균주 및 변형체와 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(털애벌레), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽터스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(과일파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주 유래의 대응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변형체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주는 공개적으로 이용가능하고, 이러한 바이러스들은 본 발명에 따른 본 발명의 바이러스로서, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염에 사용할 수 있다. 또한, 면, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물도 숙주로 이용할 수 있다.
본 발명의 재조합형 항체를 발현하기에 적합한 포유동물 숙주 세포로는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어, 전체 교시가 본 발명에 참고인용된 Kaufman and Sharp(1982) Mol. Biol. 159: 601-621에 기술된 바와 같은 DHFR 선택성 마커와 함께 사용되는, Urlaub and Chasin, (1980) PNAS USA 77: 4216-4220에 기술된, dhfr- CHO 세포), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합형 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 때, 항체는 숙주 세포가 항체를 발현하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양하거나 또는 숙주 세포가 증식된 배양 배지로 항체를 분비하기에 충분한 시간 동안 배양하여 수득한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양물에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59(1977)); 어린 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216(1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251(1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방암(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68(1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간암 세포주(Hep G2)이며, 이의 전체 교시들은 본원에 참고인용된다.
숙주 세포는 항체 생산을 위해 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자의 증폭에 적당하게 변성된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
항체 생산에 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 시판 배지, 예를 들어 Ham's F10™(Sigma), 최소 필수 배지™((MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지™((DMEM), Sigma)는 숙주 세포를 배양하는데 적당하다. 또한, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58:44(1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255(1980), 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기술된 모든 배지도 숙주 세포의 배양 배지로 사용할 수 있으며, 상기 문헌의 전체 교시는 본원에 참고인용된다. 이러한 배지는 모두 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피성장인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(예: HEPES), 뉴클레오타이드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들어, 젠타마이신 약물), 미량 원소(보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 또한, 다른 임의의 필수 보충물도 당업자에게 공지된 적당한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택한 숙주 세포와 함께 종래 사용된 것으로, 당업자라면 잘 알고 있을 것이다.
또한, 숙주 세포는 온전한 항체의 일부, 예를 들어 Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하는데 사용될 수도 있다. 상기 절차 상의 변경은 본 발명의 범위 내이어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄(하지만, 둘 모두는 아니다)를 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합형 DNA 기술은 IL-12, 특히 hIL-12에 결합하는데 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하는 데에도 사용될 수 있다. 이러한 절두형 DNA 분자로부터 발현된 분자도 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 본 발명의 항체를 표준 화학적 가교 방법에 의해 제2 항체에 가교시킴으로써 하나의 중쇄와 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄가 IL-12 외에 다른 항원에 특이적인 이작용기성 항체도 생산할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부의 재조합형 발현에 적당한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 암호화하는 재조합형 발현 벡터는 인산칼슘-매개의 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포에 도입시킨다. 재조합형 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄와 경쇄 유전자는 각각 유전자의 전사를 높은 수준으로 유도하는 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자에 작동가능하게 결합된다. 또한, 재조합형 발현 벡터는 메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 하는 DHFR 유전자도 운반한다. 선택된 형질전환체 숙주 세포는 항체 중쇄와 경쇄가 발현되도록 배양하고, 배양 배지로부터 온전한 항체를 회수한다. 표준 분자 생물학 기술은 재조합형 발현 벡터를 제조하고 숙주 세포를 형질감염시키며 형질전환체를 선택하고 숙주 세포를 배양하고 배양 배지로부터 항체를 회수하는데 사용된다.
재조합체 기술을 이용할 때, 항체는 세포내 생산되거나, 원형질 공간 내에 생산되거나 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 한 관점에서, 항체가 세포내 생산된다면, 제1 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 세포(예를 들어, 균질화 결과)인 미립형 파편을, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과를 통해 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우에는 상기 발현 시스템으로부터의 상청액을 먼저 시판 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 이용해 농축시킬 수 있다.
본 발명의 과정 전에, 먼저 세포 파편으로부터 항체를 정제하기 위한 절차는 항체의 발현 부위에 따라 달라진다. 일부 항체는 세포로부터 주위 성장배지로 직접 분비될 수 있고; 다른 항체는 세포내 제조된다. 후자의 항체인 경우, 정제 과정의 제1 단계는 일반적으로 다양한 방법, 예를 들어 기계적 전단, 삼투압 충격 또는 효소 처리로 수행될 수 있는 세포의 용해를 수반한다. 이러한 붕괴는 세포의 전 내용물을 균질액 중으로 방출시키고, 또한 크기가 작아서 제거하기 어려운 아세포 단편을 생산한다. 이것은 일반적으로 차등 원심분리 또는 여과에 의해 제거한다. 항체가 분비되는 경우에는 이 발현 시스템의 상청액을 일반적으로 먼저 시판 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 이용해 농축한다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 재조합 숙주 세포는 세포 배양 배지로부터 접선류 여과 등에 의해 분리될 수 있다. 이후, 이 배양 배지로부터 본 발명의 항체 정제 방법을 이용해 항체를 회수할 수 있다.
4. 항체 정제
4.1 항체 정제 일반
항체와 적어도 하나의 HCP를 포함하는 혼합물로부터 정제된(또는 "HCP-감소된") 항체 제제를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 정제 방법은 항체가 전술한 방법 및 당업계에 통상적인 방법으로 생산되었을 때 분리 단계에서 시작한다. 일반적으로, 당업계에서 항체-HCP 혼합물은, 항체가 단백질 A에 결합하고 HCP는 관통하므로, 1차 정제 단계로서 단백질 A 포획(예: 단백질 A 컬럼)으로 처리한다. 본 발명의 정제 방법은 초기 단계로서, 또는 정제 방법의 임의의 단계로서 항체와 적어도 하나의 HCP를 함유하는 혼합물을 단백질 A 포획(예: 단백질 A 컬럼)으로 처리하는 것이 필수적인 것은 아니라는 장점이 있다. 표 1은 정제 계획안의 한 양태를 정리한 것이다. 이러한 계획안의 변경도 예상되고 본 발명의 범위에 포함된다.
정제 단계와 이의 관련 목적
정제 단계 목적
1차 회수 샘플 매트릭스의 정화
양이온 교환 크로마토그래피 항체 포획, 숙주 세포 단백질 및 관련 불순물 감소
한외여과/정용여과 농축 및 완충액 교환
음이온 교환 크로마토그래피 숙주 세포 단백질 및 DNA의 감소
페닐 세파로스 HP 크로마토그래피 항체 응집물과 숙주 세포 단백질의 감소
바이러스 여과 존재한다면, 큰 바이러스의 제거
최종 한외여과/정용여과 항체 농축 및 제형화
항체를 포함하는 정화 용액 또는 혼합물이 수득되면, 세포가 생산한 다른 단백질, 예를 들어 HCP로부터 항체의 분리를 여러 정제 기술의 조합, 예를 들어 이온 교환 분리 단계(들)와 소수성 상호작용 분리 단계(들)를 이용하여 수행한다. 이 분리 단계는 단백질의 하전, 소수성 정도 또는 크기에 기초하여 단백질의 혼합물을 분리한다. 본 발명의 한 관점에서, 분리는 크로마토그래피, 예를 들어 양이온, 음이온 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 등에 의해 수행된다. 이 기술 각각에는 여러 다른 크로마토그래피 수지가 이용가능하여, 수반된 특정 단백질에 정확한 정제 계획안을 맞출 수 있다. 각 분리 방법의 본질은 단백질이 컬럼 아래로 다른 속도로 이동하게 하여 컬럼 아래로 이동할수록 증가하는 물리적 분리를 달성할 수 있거나, 또는 분리 매질에 선택적으로 부착하여 다른 용매에 의해 다르게 용출될 수 있는 것이다. 몇몇 경우에, 항체는 불순물이 컬럼에 특이적으로 부착하고 항체가 부착하지 않을 때, 즉 항체를 관류물에 존재할 때 불순물로부터 분리된다.
위에서 언급한 바와 같이, 정제 계획안의 정확한 맞춤은 정제될 단백질의 고찰에 의존적이다. 특정 양태에서, 본 발명의 분리 단계는 하나 이상의 HCP로부터 항체를 분리하는데 이용된다. 본원에 기술된 방법을 사용하여 성공적으로 정제할 수 있는 항체는 사람 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM 항체를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 특정 양태에서, 본 발명의 정제 전략은 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 사용을 배제한다. 이러한 양태는 특히 단백질 A에 비효율적으로 결합하는 것으로 알려진 IgG3 항체의 정제에 유용하다. 정제 계획안의 특이적 맞춤을 가능하게 하는 다른 요인으로는, Fc 영역의 존재 또는 부재(즉, Fab 단편과 비교했을 때 전체 길이 항체의 상황에서); 당해 항체를 발생시키는데 이용되는 특정 생식계열 서열; 및 항체의 아미노산 조성(예: 항체의 1차 서열뿐만 아니라 분자의 전제 하전/소수성)을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 하나 이상의 특징을 공유하는 항체는 그 특징을 이용하도록 맞춰진 정제 전략을 이용해 정제할 수 있다.
4.2 1차 회수
본 발명의 정제 방법의 1차 단계는 샘플 매트릭스로부터 항-IL-12 항체를 정화 및 1차 회수하는 제1 단계를 수반한다. 또한, 1차 회수 방법은 샘플 매트릭스에 존재할 수 있는 바이러스를 불활성화시키는 시점일 수도 있다. 예를 들어, 정제의 1차 회수 단계 동안 바이러스 불활성화의 다양한 방법 중 어느 하나 이상의 방법을 이용할 수 있으며, 그 예로는 열 불활성화(저온살균), pH 불활성화, 용매/세정제 처리, UV 및 γ선 조사 및 특정 화학적 불활성화제, 예를 들어 β-프로피오락톤 또는 예를 들어 미국 특허 4,534,972(그 전체 교시는 본원에 참고인용됨)에서와 같은 구리 페난트롤린의 첨가를 포함한다. 본 발명의 특정 양태에서, 샘플 매트릭스는 1차 회수 단계 동안 pH 바이러스 불활성화에 노출된다.
pH 바이러스 불활성화 방법으로는, 혼합물을 낮은 pH에서 일정 시간 동안 항온처리하고, 이어서 pH를 중화한 뒤, 미립자를 여과 제거하는 것을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 특정 양태에서, 혼합물은 pH 2 내지 5, 바람직하게는 pH 3 내지 4, 더욱 바람직하게는 pH 3.5에서 항온처리될 것이다. 샘플 혼합물의 pH는 임의의 적합한 산, 예를 들어 시트르산, 아세트산, 카프릴산 또는 다른 적당한 산(이에 국한되지 않는다)에 의해 저하될 수 있다. pH 수준의 선택은 주로 항체 산물의 안정성 프로필과 완충액 성분에 좌우된다. 낮은 pH 바이러스 불활성화 동안 표적 항체의 품질은 pH 및 낮은 pH 항온처리 기간에 의해 영향을 받는다. 특정 양태에서, 낮은 pH 항온처리 기간은 0.5시간 내지 2시간, 바람직하게는 0.5시간 내지 1.5시간, 더욱 바람직하게는 1시간일 것이다. 바이러스 불활성화는 상기와 같은 파라미터들 외에 단백질 농도에 의존적이며, 고농도는 불활성화를 감소시킬 수 있다. 따라서, 단백질 농도, pH 및 불활성화 시간의 적당한 파라미터는 원하는 바이러스 불활성화 수준을 달성하도록 선택할 수 있다.
특정 양태에서, 바이러스 불활성화는 적당한 필터의 사용을 통해 달성할 수 있다. 적당한 필터의 비제한적 예는 Ultipor DV50™ 필터(Pall Corporation)이다. 본 발명의 특정 양태는 1차 회수 단계에서 상기 여과를 이용하지만, 다른 양태는 정제 단계의 다른 단계에서, 예를 들어 최종 정제 단계에서 두번째 또는 최종 정제 단계에서 이용할 수 있다. 특정 양태에서는 다른 필터가 바이러스 불활성화에 이용되며, 그 예로는 Viresolve™ 필터(Millipore, Billerica, Mass.); Zeta Plus VR™ 필터(CUNO; Meriden, Conn.); 및 Planova™ 필터(Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, III.)가 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
바이러스 불활성화가 이용되는 양태에서, 샘플 혼합물은 추가 정제 단계를 위해 필요한 경우 조정될 수 있다. 예를 들어, 낮은 pH 바이러스 불활성화 후, 샘플 혼합물의 pH는 일반적으로 더욱 중성인 pH, 예를 들어 약 5.0 내지 약 8.5로 조정한 뒤, 정제 과정을 계속한다. 또한, 혼합물은 원하는 전도율을 얻기 위해 주사용 물(WFI)로 플러싱할 수 있다.
특정 양태에서, 1차 회수는 샘플 매트릭스를 더욱 정화하여 항-IL-12 항체의 정제를 돕기 위한 하나 이상의 원심분리 단계를 포함한다. 샘플의 원심분리는, 예를 들어 7,000 x g 내지 약 12,750 x g로 작업할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 대규모 정제 상황에서, 이러한 원심분리는 최종 상청액이 예를 들어 혼탁도가 150 NTU(이에 국한되지 않는다)가 되도록 설정된 유속으로 가동 중에 이루어질 수 있다. 그 다음, 이러한 상청액은 추가 정제를 위해 수집할 수 있다.
특정 양태에서, 1차 회수는 샘플 매트릭스를 다시 정화하여 항-IL-12 항체의 정제를 돕기 위한 하나 이상의 심층 여과 단계의 사용을 포함할 것이다. 심층 필터는 등급화된 밀도를 지닌 여과 매체를 함유한다. 이러한 등급화된 밀도는 필터의 표면 부근에서 큰 입자가 포획되게 하고, 작은 입자는 필터 표면의 큰 체눈 부위에서는 투과하여 필터 중심에 가까울수록 작은 체눈에서만 포획되도록 한다. 특정 양태에서, 심층 여과 단계는 탈지질 심층 여과 단계일 수 있다. 특정 양태는 1차 회수 단계 동안에만 심층 여과 단계를 이용하지만, 다른 양태들은 하나 이상의 추가 여과 단계 동안 심층 필터, 예를 들어 탈지질 심층 필터를 이용한다. 본 발명의 상황에서 사용될 수 있는 심층 필터의 비제한적 예로는 Cuno™ 모델 30/60ZA 심층 필터(3M Corp.) 및 0.45/0.2㎛ Sartopore™ 이중층 필터 카트리지를 포함한다.
4.3 이온 교환 크로마토그래피
특정 양태에서, 본 발명은 항체와 적어도 하나의 HCP를 포함하는 혼합물을 적어도 하나의 이온 교환 분리 단계로 처리하여 항체 함유 용출액이 수득되도록 하는 상기 혼합물로부터 HCP-감소된 항체 제제를 생산하는 방법을 제공한다. 이온 교환 분리는 2가지 물질을 이들 각각의 이온 하전의 차이를 기초로 하여 분리하는 임의의 방법을 포함하며, 양이온 교환 물질 또는 음이온 교환 물질을 이용할 수 있다.
양이온 교환 물질 대 음이온 교환 물질의 이용은 단백질의 총 전하를 기초로 한다. 따라서, 양이온 교환 단계 전에 음이온 교환 단계를 이용하거나, 또는 음이온 교환 단계 전에 양이온 교환 단계를 이용하는 것은 본 발명의 범위 내에 속한다. 또한, 양이온 교환 단계만을 이용하거나, 음이온 교환 단계만을 이용하거나, 또는 이 둘의 임의의 연속 조합을 이용하는 것도 본 발명의 범위에 속한다.
분리를 수행하는데 있어서, 1차 항체 혼합물은 임의의 다양한 기술, 예를 들어 회분식 정제 기술 또는 크로마토그래피 기술을 이용하여 이온 교환 물질과 접촉할 수 있다.
예를 들어, 회분식 정제 상황에서, 이온 교환 물질은 바람직한 출발 완충액에 제조하거나, 또는 이 완충액으로 평형화시킨다. 제조 또는 평형화 후, 이온 교환 물질의 슬러리가 수득된다. 항체 용액은 분리될 항체를 이온 교환 물질에 흡착시키기 위해 슬러리와 접촉시킨다. 이온 교환 물질에 결합하지 않는 HCP(들)를 함유하는 용액은 예를 들어 슬러리를 침전시킨 후 상청액을 제거하는 등에 의해 슬러리로부터 분리한다. 슬러리는 1회 이상의 세척 단계로 처리할 수 있다. 필요하다면, 슬러리는 이온 교환 물질에 결합된 HCP를 탈착시키기 위해 고 전도성 용액과 접촉시킬 수 있다. 결합된 폴리펩타이드를 용출시키기 위해 완충액의 염 농도는 증가시킬 수 있다.
또한, 이온 교환 분리 기술로서 이온 교환 크로마토그래피를 이용할 수도 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 분자 전체 하전 사이의 차이를 기초로 하여 분자를 분리한다. 항체 정제를 위해 항체는 결합하기 위해, 수지와 같은 이온 교환 물질에 부착된 작용기의 하전과 반대의 하전을 보유해야 한다. 예를 들어, pI 이하의 완충액 pH에서 일반적으로 총 하전이 양성인 항체는 음하전성 작용기를 함유한 양이온 교환 물질에 잘 결합할 것이다.
이온 교환 크로마토그래피에서, 용질 표면에 있는 하전성 패치는 주위 완충액의 이온 강도가 낮다면, 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 반대 하전에 의해 이끌린다. 용출은 일반적으로 이온 교환 매트릭스의 하전 부위에 대해 용질과 경쟁하는 완충액의 이온 강도(즉, 전도성)를 증가시킴으로써 달성한다. pH 변화 및 용질의 하전 변경은 용질의 용출을 달성하는 다른 방식이다. 전도성 또는 pH의 변화는 점진적(구배 용출) 또는 단계식(단계 용출)일 수 있다.
음이온 또는 양이온 치환체는 매트릭스에 부착하여 크로마토그래피용 음이온 또는 양이온 지지체를 형성할 수 있다. 음이온 교환 치환체의 비제한적 예로는 디에틸아미노에틸(DEAE), 4급 아미노에틸(QAE) 및 4급 아민(Q) 그룹을 포함한다. 양이온 치환체로는 카르복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)를 포함한다. 셀룰로스 이온 교환 수지, 예를 들어 DE23™, DE32™, DE52™, CM-23™, CM-32™, 및 CM-52™는 와트만 리미티드(Whatman Ltd.)(영국 켄트 메이드스톤)에서 입수할 수 있다. SEPHADEX®-계 및 -lo가교된 이온 교환제도 공지되어 있다. 예를 들어, DEAE-, QAE-, CM- 및 SP-SEPHADEX® 및 DEAE-, Q-, CM 및 S-SEPHAROSE® 및 SEPHAROSE® Fast Flow는 모두 파미시아 에이비(Pharmacia AB)에서 입수가능하다. 또한, DEAE 및 CM 유도체화된 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체, 예를 들어 TOYOPEARL™ DEAE-650S 또는 M 및 TOYOPEARL™ CM-650S 또는 M은 토소 하아스 컴패니.(Toso Haas Co.)(미국 펜실베니아 필라델피아)에서 입수가능하다.
항체와 불순물, 예를 들어 HCP(들)를 포함하는 혼합물은 양이온 교환 컬럼과 같은 이온 교환 컬럼 위에 로딩한다. 예를 들어, 혼합물은 사용된 컬럼에 따라 약 80g 단백질/L 수지의 로딩량으로 로딩할 수 있다. 적당한 양이온 교환 컬럼의 한 예는 베드 용적이 약 116L인 80 cm 직경 x 23 cm 길이의 컬럼이다. 이 양이온 컬럼에 로딩된 혼합물은 이어서 세척 완충액(평형화 완충액)으로 세척될 수 있다. 그 다음, 항체는 컬럼으로부터 용출되고, 1차 용출액이 수득된다.
이 이온 교환 단계는 HCP와 같은 불순물을 감소시키면서 당해의 항체의 포획을 용이하게 한다. 특정 관점에서, 이온 교환 컬럼은 양이온 교환 컬럼이다. 예를 들어, 이러한 양이온 교환 컬럼에 적합한 수지는 CM HyperDF 수지이나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이 수지들은 폴 코포레이션(Pall Corporation)과 같은 시판원에서 입수가능하다. 이러한 양이온 교환 절차는 실온에서 또는 대략 실온에서 수행할 수 있다.
4.4 한외여과 / 정용여과
본 발명의 특정 양태는 항-IL-12 항체 샘플을 더욱 정제 및 농축하기 위해 한외여과 및/또는 정용여과 단계를 이용한다. 한외여과는 문헌[Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L.Zeman and A. Zydney(Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996)] 및 [Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan(Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9)]에 상세하게 설명되어 있다. 바람직한 여과 방법은 "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp. 177-202(Bedford, Mass., 1995/96)에 기술된 바와 같은 접선류 여과이다. 한외여과는 일반적으로 기공 크기가 0.1 ㎛보다 작은 필터를 이용한 여과라 불린다. 이러한 작은 기공 크기의 필터를 이용하여, 샘플의 용적은 필터를 통한 샘플 완충액의 투과를 통해 감소될 수 있고, 한편 항-IL-12 항체는 보유된다.
정용여과는 염, 당, 비수성 용매를 제거 및 교환하거나, 결합된 종으로부터 자유 종의 분리, 저분자량 물질의 제거 또는 이온 환경 및/또는 pH 환경의 급변을 유발하기 위해 한외여과기를 이용하는 방법이다. 이러한 미세용질은 한외여과되는 용액에 한외여과 속도와 동일한 속도로 용매를 첨가함으로써 가장 효율적으로 제거된다. 이것은 일정 용적에서 용액으로부터 미세종을 세척하여, 보유된 항체를 효과적으로 정제한다. 본 발명의 특정 양태에서, 정용여과 단계는 경우에 따라 추가 크로마토그래피 또는 다른 정제 단계 전에 본 발명과 관련하여 사용된 다양한 완충액을 교환하고, 뿐만 아니라 항체 제제로부터 불순물을 제거하는데 사용된다.
4.5 소수성 상호작용 크로마토그래피
또한, 본 발명은 소수성 상호작용 분리 단계를 추가로 포함하여, 항체와 적어도 하나의 HCP를 포함하는 혼합물로부터 HCP-감소된 항체 제제를 생산하는 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 이온 교환 컬럼으로부터 수득되는 제1 용출액은 소수성 상호작용 물질로 처리되어 HCP 농도가 감소된 제2 용출액이 수득될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계, 예를 들어 본 명세서에 개시된 것은 일반적으로 단백질 응집물, 예를 들어 항체 응집물과 공정 관련 불순물을 제거하기 위해 수행된다.
분리를 수행하는데 있어서, 샘플 혼합물은 예를 들어 회분식 정제 기술 또는 컬럼을 이용하여 HIC 물질과 접촉한다. HIC 정제 전에, 임의의 카오트로픽(chaotropic) 제제 또는 매우 소수성인 물질을, 예를 들어 예비컬럼을 통해 혼합물을 통과시키는 등에 의해 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, 회분식 정제 상황에서, HIC 물질은 바람직한 평형화 완충액에 제조하거나 그 완충액으로 평형화한다. HIC 물질의 슬러리가 수득된다. 이 슬러리와 항체 용액을 접촉시켜 분리될 항체를 HIC 물질에 흡착시킨다. HIC 물질에 결합하지 않은 HCP를 포함하는 용액을 슬러리로부터 분리하는데, 예를 들어 슬러리를 침전시키고 상청액을 제거하여 분리한다. 슬러리는 1회 이상의 세척 단계로 처리할 수 있다. 원한다면, 슬러리는 HIC 물질에 결합한 항체를 탈착시키기 위해 전도성이 낮은 용액과 접촉시킬 수 있다. 결합된 항체를 용출시키기 위해 염 농도를 줄일 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피는 분리할 항체의 하전에 의존적인 반면, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 항체의 소수성 성질을 이용한다. 항체의 소수성 그룹은 컬럼 상의 소수성 그룹과 상호작용한다. 소수성이 클수록 단백질은 컬럼과 더욱 강하게 상호작용할 것이다. 따라서, HIC 단계는 숙주 세포 유래의 불순물(예를 들어, DNA 및 다른 고 분자량 및 저 분자량 산물-관련 종)을 제거한다.
소수성 상호작용은 높은 이온 강도에서 가장 강하므로, 이러한 분리 형태는 염 침전 또는 이온 교환 절차 후에 수행하는 것이 편리하다. HIC 컬럼에 대한 항체의 흡착은 고염 농도에 의해 유리해지지만, 실제 농도는 항체와 선택된 특정 HIC 리간드의 성질에 따라 광범위하게 다양해질 수 있다. 다양한 이온은 이들이 소수성 상호작용을 촉진하는지(염석 효과), 또는 물 구조를 파괴하고(카오트로픽 효과) 소수성 상호작용의 약화를 초래하는지에 따라 소위 솔루포빅(soluphobic) 시리즈로 배열될 수 있다. 양이온은 Ba++; Ca++; Mg++; Li+; Cs+; Na+; K+; Rb+; NH4 +와 같이 염석 증가 효과로 순위를 매길 수 있고; 음이온은 PO---; SO4 --; CH3CO3 -; Cl-; Br-; NO3 -; ClO4 -; I-; SCN-과 같은 카오트로픽 증가 효과로 등급이 매겨질 수 있다.
일반적으로, Na, K 또는 NH4 설페이트들은 HIC에서 리간드-단백질 상호작용을 효과적으로 촉진한다. 다음과 같은 관계식으로 주어진 바와 같이 상호작용 강도에 영향을 미치는 염이 제형화될 수 있다: (NH4)2SO4 > Na2SO4 > NaCl > NH4Cl > NaBr > NaSCN. 일반적으로, 약 0.75 내지 약 2M 황산암모늄 또는 약 1 내지 4M NaCl 사이의 염 농도가 유용하다.
HIC 컬럼은 일반적으로 소수성 리간드(예: 알킬 또는 아릴 그룹)가 커플링된 기본 매트릭스(예: 가교된 아가로스 또는 합성 공중합체 물질)를 포함한다. 적당한 HIC 컬럼은 페닐 그룹(예: Phenyl Sepharose™ 컬럼)으로 치환된 아가로스 수지를 포함한다. 많은 HIC 컬럼은 시중에서 입수가능하다. 그 예로는 치환도가 낮거나 높은 Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow 컬럼(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Phenyl Sepharose™ High Performance 컬럼(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Octyl Sepharose™ High Performance 컬럼(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Fractogel™ EMD Propyl 또는 Fractogel™ EMD Phenyl 컬럼(E. Merck, Germany); Macro-Prep™ Methyl 또는 Macro-Prep™ t-Butyl Support(Bio-Rad, California); WP HI-Propyl(C3)™ 컬럼(J.T. Baker, New Jersey); 및 Toyopearl™ Ether, Phenyl 또는 Butyl 컬럼(TosoHaas, PA)을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
4.6 예시적 정제 전략
특정 양태에서, 1차 회수는 생산 생물반응기 수거물로부터 세포 및 세포 파편(HCP 포함)을 제거하기 위해 pH 감소, 원심분리 및 여과 단계를 연속해서 이용하여 진행할 수 있다. 예를 들어, 항체, 배지 및 세포를 포함하는 배양물은 약 3.5의 pH를 이용한 pH 불활성화로 약 1시간 동안 처리할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. pH 감소는 공지된 산 제제, 예를 들어 시트르산, 예를 들어 3M 시트르산을 이용해 촉진할 수 있다. 이러한 pH 감소는 pH 민감성 바이러스 오염물을 감소 및/또는 불활성화시키고, 완전하지 않은 경우 제거하며, 일부 배지/세포 오염물을 침전시킨다. 이러한 감소 후, pH는 수산화나트륨, 예를 들어 3M 수산화나트륨과 같은 염기를 이용하여 약 20분 내지 약 40분 동안 약 4.9 또는 5.0으로 조정한다. 이러한 조정은 약 20℃에서 일어날 수 있다. 특정 양태에서, pH 조정된 배양물은 그 다음 약 7000 x g 내지 약 11,000 x g에서 원심분리된다. 특정 양태에서, 최종 샘플 상청액은 복수의 심층 필터를 포함하는 필터 트레인을 통해 통과된다. 특정 양태에서, 필터 트레인은 약 12개의 16-인치 Cuno™ 모델 30/60ZA 심층 필터(3M Corp.) 및 3개의 30 인치 0.45/0.2㎛ Sartopore™ 2 필터 카트리지(Sartorius)가 장착된 약 3개의 둥근 필터 하우징을 포함한다. 정화된 상청액은 예비살균된 수거 용기와 같은 용기에 수집하여 약 8℃에서 유지시킨다. 그 다음, 이 온도는 아래에 개략된 포획 크로마토그래피 단계 또는 단계들 전에 약 20℃로 조정된다. 당업자는 위에서 언급한 조건을 변경시킬 수 있고, 이 역시 본 발명의 범위에 속한다는 것을 유념해야 한다.
그 다음, 정화된 상청액은 양이온 교환 컬럼을 이용해 정제할 수 있다. 특정 양태에서, 양이온 교환 컬럼에 사용된 평형화 완충액은 pH가 약 5.0인 완충액이다. 적당한 완충액의 한 예는 약 210mM 아세트산나트륨, pH 5.0이다. 평형화 후, 컬럼에는 상기 1차 회수 단계에서 제조된 샘플이 로딩된다. 이 컬럼에는 양이온 교환 수지, 예를 들어 CM Sepharose™ Fast Flow(GE Healthcare)가 충진된다. 그 다음, 이 컬럼은 평형화 완충액을 이용하여 세척한다. 그 다음, 컬럼은 평형화 또는 세척 완충액과 비교했을 때 이온 강도가 더 큰 완충액을 이용하여 용출 단계로 처리한다. 예를 들어, 적당한 용출 완충액은 약 790 mM 아세트산나트륨, pH 5.0일 수 있다. 항-IL-12 항체는 용출되고 OD280nm로 설정된 UV 분광광도계를 이용해 모니터할 수 있다. 특정 예에서, 용출 수집은 3 OD280nm 상측부터 8 OD280nm 하측까지 이루어질 수 있다. 당업자는 조건을 변경할 수 있고 이 역시 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해해야 한다.
특정 양태에서, 1차 회수 시 수득한 정화된 상청액은 음이온 교환 컬럼을 이용하여 대신 추가 정제할 수 있다. 이 단계에 적당한 컬럼의 비제한적 예는 베드 용적이 약 85L인 60 cm 직경 x 30 cm 길이의 컬럼이다. 이 컬럼은 음이온 교환 수지, 예를 들어 Q Sepharose™ Fast Flow(GE Healthcare)로 충전된다. 이 컬럼은 적당한 완충액, 예를 들어 트리스/염화나트륨의 약 7배 컬럼 용적을 이용하여 평형화할 수 있다. 적당한 조건의 한 예는 25 mM Tris, 50 mM 염화나트륨 pH 8.0이다. 다시, 당업자는 조건을 변경할 수 있으나, 이 역시 본 발명의 범위에 속한다. 이 컬럼에는 앞에서 개략한 바와 같은 1차 회수 단계로부터 수집한 샘플을 로딩한다. 다른 관점에서, 컬럼은 양이온 교환 동안 수집한 용출액이 로딩된다. 컬럼을 로딩한 후, 컬럼은 평형화 완충액(예: 트리스/염화나트륨 완충액)으로 세척한다. 항-IL-12 항체를 함유하는 관류물은 OD280nm 에서 UV 분광광도계를 이용하여 모니터할 수 있다. 이 음이온 교환 단계는 DNA와 같은 핵산 및 숙주 세포 단백질과 같은 공정 관련 불순물을 감소시킨다. 분리는 당해 항체가 컬럼의 고체 상, 예를 들어 Q Sepharose™에 결합하거나 상호작용하지 않고 많은 불순물이 컬럼의 고체상에 상호작용하여 결합한다는 사실로 인해 일어난다. 음이온 교환은 약 12℃에서 수행될 수 있다.
특정 양태에서, 양이온 교환 또는 음이온 교환 용출액은 어떤 이온 교환 단계가 먼저 이용되는지에 따라, 그 다음 예를 들어 16 인치 Cuno™ 탈지질 필터를 이용하여 여과한다. 그 다음, 이러한 탈지질 필터를 이용한 여과는 예를 들어 30 인치 0.45/0.2㎛ Sartopore™ 이중층 필터 카트리지가 이용될 수 있다. 이온 교환 용출 완충액은 필터에 남아있는 잔여 용적을 플러싱하는데 사용하고 한외여과/정용여과를 위해 준비할 수 있다.
한외여과/정용여과 단계를 수행하기 위해, 여과 매질은 적당한 완충액, 예를 들어 20mM 인산나트륨, pH 7.0에 제조한다. 염화나트륨과 같은 염, 예를 들어 100 mM 염화나트륨은 이온 강도를 증가시키기 위해 첨가할 수 있다. 이 한외여과/정용여과 단계는 항-IL-12 항체를 농축하고 아세트산나트륨을 제거하며 pH를 조정하는 작용을 한다. 시판 필터는 이 단계를 구동시키는데 이용가능하다. 예를 들어, 밀리포어는 30kD 분자량 컷오프(MWCO) 셀룰로스 한외여과기 막 카세트를 제조한다. 이 여과 절차는 실온 또는 대략 실온에서 수행할 수 있다.
특정 양태에서, 상기 포획 여과 단계 유래의 샘플은 2차 이온 교환 분리로 처리한다. 이러한 2차 이온 교환 분리는 1차 이온 교환 분리의 반대 하전에 기초한 분리를 수반하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 음이온 교환 단계가 1차 회수 후 이용되면, 2차 이온 교환 크로마토그래피 단계는 양이온 교환 단계이어야 한다. 이와 반대로, 1차 회수 단계 다음 양이온 교환 단계가 수행된다면, 이 단계 다음에는 음이온 교환 단계가 후속될 수 있다. 특정 양태에서, 1차 이온 교환 용출액은 1차 이온 교환 용출액이 적당한 완충액 조건으로 조정되는 2차 이온 교환 크로마토그래피 단계로 직접 처리될 수 있다. 적당한 음이온 및 양이온 분리 물질과 조건은 전술한 바와 같다.
본 발명의 특정 양태에서, 항-IL-12 항체를 함유하는 샘플은 소수성 상호작용 분리 단계를 이용하여 추가 처리될 것이다. 이 단계에 적합한 컬럼의 비제한적 예는 베드 용적이 약 75L이고 HIC에 사용된 적당한 수지, 예를 들어 비제한적으로 페닐 HP Sepharose™(Amersham Biosciences, Upsala, Sweden)가 충전된 80cm 직경 x 15cm 길이의 컬럼이다. 이전 음이온 교환 크로마토그래피 단계로부터 수득되는 당해 항체를 함유한 관류 제제는 동량의 약 1.7M 황산암모늄, 50mM 인산나트륨, pH 7.0으로 희석될 수 있다. 그 다음, 0.45/0.2㎛ Sartopore™ 2 이중층 필터 또는 이의 등가물을 이용하여 여과 처리할 수 있다. 특정 양태에서, 소수성 크로마토그래피 절차는 2회 이상의 사이클을 수반한다.
특정 양태에서, HIC 컬럼은 먼저 적당한 완충액에 의해 평형화된다. 적당한 완충액의 비제한적 예는 0.85M 황산암모늄, 50mM 인산나트륨, pH 7.0이다. 당업자는 평형화 완충액을 변경할 수 있고, 완충제 농도 변경 및/또는 평형 완충액 치환은 본 발명의 범위에 속할 수 있다. 특정 양태에서, 그 다음, 컬럼은 음이온 교환 관류 샘플로 로딩되고, 황산암모늄/인산나트륨과 같은 적당한 완충액 시스템으로 수회, 예를 들어 3회 세척된다. 적당한 완충액 시스템의 예로는 1.1M 황산암모늄, 50mM 인산나트륨 완충액, pH 약 7.0을 포함한다. 경우에 따라, 컬럼은 추가 세척 사이클로 처리될 수 있다. 예를 들어, 2차 세척 사이클은 적당한 완충액 시스템을 이용한, 1 내지 7회와 같은 수회 컬럼 세척물을 포함할 수 있다. 적당한 완충액 시스템의 비제한적 예로는 0.85M 황산암모늄, 50mM 인산나트륨, pH 7.0을 포함한다. 한 관점에서, 로딩된 컬럼은 적당한 완충액 시스템을 이용한 3차 세척으로 처리된다. 이 컬럼은 1.1M 황산암모늄, 50mM 인산나트륨 pH 약 7.0과 같은 완충액 시스템을 이용하여 수회 세척, 예를 들어 1 내지 3회 세척될 수 있다. 또한, 당업자는 완충 조건을 변경할 수 있고, 이 역시 본 발명의 범위에 속한다.
컬럼은 적당한 용출 완충액을 이용하여 용출시킨다. 이러한 용출 완충액의 적당한 예는 0.5M 황산암모늄, 15mM 인산나트륨, pH 약 7.0이다. 당해의 항체는 통상적인 분광광도계를 이용하여 3 OD280nm 상측에서부터 3 OD280nm 피크 하측까지 검출하여 수집할 수 있다.
본 발명의 특정 관점에서, 소수성 크로마토그래피 단계의 용출액은 존재한다면 온전한 바이러스를 비롯한 바이러스 입자의 제거를 위한 여과 처리한다. 적당한 필터의 비제한적 예는 Ultipor DV50™ 필터(Pall Corporation)이다. 본 여과 단계에는 다른 바이러스 필터가 사용될 수 있고, 이는 당업자에게 공지되어 있다. HIC 용출액은 약 34 psig에서 약 0.1 ㎛의 예비함침된 필터와 2 x 30-인치 Ultipor DV50™ 필터 트레인을 통해 통과된다. 특정 양태에서, 여과 과정 후, 필터는 필터 하우징에 남은 임의의 항체 제거를 위해 HIC 용출 완충액 등을 이용해 세척한다. 용출액은 약 12℃에서 예비살균된 용기에 보관할 수 있다.
특정 양태에서, 상기의 여과액은 다시 한외여과/정용여과 처리된다. 이 단계는 실행자의 최종 목적이 상기 항체를 약제 등에 사용하기 위한 것이라면 중요하다. 이 과정은 이용된다면 항체의 농축, 앞서 사용된 완충 염의 제거를 촉진하고 특정 제형화용 완충액과 치환할 수 있다. 특정 양태에서, 여러 용적, 예를 들어 2 용적의 제형화 완충액을 이용한 연속 정용여과가 수행된다. 적당한 제형화 완충액의 비제한적 예는 5mM 메티오닌, 2% 만니톨, 0.5% 수크로오스, pH 5.9 완충액(Tween 없이)이다. 이 2용적 교환을 완료한 후 항체를 농축한다. 소정 농도의 항체가 달성되면, 실행자는 최종 Tween 농도가 약 0.005%(v/v)에 이르도록 첨가해야 하는 10% Tween의 양을 계산할 수 있다.
본 발명의 특정 양태는 추가 정제 단계를 포함할 것이다. 이온 교환 크로마토그래피 방법 전, 방법 동안 또는 방법 후에 수행될 수 있는 추가 정제 절차의 예로는 에탄올 침전, 등전 초점, 역상 HPLC, 실리카 크로마토그래피, 헤파린 Sepharose™ 크로마토그래피, 추가 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 추가 양이온 교환 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피(예: 단백질 A, 단백질 G, 항체, 특이적 기질, 리간드 또는 항원을 포획 시약으로 이용함)를 포함한다.
본 발명의 특정 양태에서, 항-IL-12 항체는 도 1에 개략된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM 이소타입 항체이다. 바람직한 양태에서, 항-IL-12 항체는 도 1에 개략된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입 항체이고, 더욱 바람직하게는 항-IL-12 항체는 도 1에 개략된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 IgG1 항체이다.
5. 샘플 순도를 분석하는 방법
또한, 본 발명은 분리/정제된 항체 조성물에 잔류하는 숙주 세포 단백질(HCP) 농도의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이, HCP는 최종 표적 물질 산물, 즉 항-IL-12 항체로부터 배제되는 것이 바람직하다. HCP의 예로는 항체 생산의 근원에서 기원하는 단백질을 포함한다. 표적 항체로부터 HCP를 동정하고 충분히 제거하지 못하면 효능 감소 및/또는 피검체의 부작용을 초래할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "HCP ELISA"란 용어는 본 분석에 사용된 제2 항체가 항체, 항-IL-12 항체를 생산하는데 사용된 세포, 예를 들어 CHO 세포에서 생산되는 HCP에 특이적인 ELISA를 의미한다. 제2 항체는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 따라 생산될 수 있다. 예를 들어, 제2 항체는 거짓 생산 및 정제 실험에 의해 수득된 HCP를 사용하여 생산할 수 있고, 즉 당해 항체를 생산하는데 사용된 동일한 세포주가 사용되지만, 이 세포주는 항체 DNA에 의해 형질감염되지 않는다. 예시적 양태에서, 제2 항체는 최상의 세포 발현계, 즉 표적 항체를 생산하는데 사용한 세포 발현계에서 발현된 것과 유사한 HPC를 이용하여 생산한다.
일반적으로, HCP ELISA는 HCP를 포함하는 액체 샘플을 두 층의 항체, 즉 제1 항체와 제2 항체 사이에 중첩시키는 것을 포함한다. 샘플은 항온처리하고, 그 동안 샘플 중의 HCP는 제1 항체, 예를 들어 친화성 정제된 염소 항-CHO(이에 국한되지 않는다)(Cygnus)에 의해 포획된다. 항체, 예를 들어 항-CHO HCP 비오티닐화된 항체를 생산하는데 사용된 세포로부터 수득한 HCP에 특이적인 표지화된 제2 항체 또는 항체 블렌드를 첨가하여 샘플 내의 HCP에 결합시킨다. 특정 양태에서, 제1 항체와 제2 항체는 폴리클로날 항체이다. 특정 관점에서, 제1 및 제2 항체는 HCP에 대해 유발된 폴리클로날 항체, 예를 들어 비오티닐화된 염소 항 숙주 세포 단백질 혼합물 599/626/748(이에 국한되지 않는다)의 블렌드이다. 샘플에 함유된 HCP의 양은 제2 항체의 표지에 기초하여 적당한 검사법으로 측정한다.
HCP ELISA는 항체 조성물, 예를 들어 상기 섹션 III에 기술된 방법을 사용하여 수득한 용출액 또는 관류물에서 HCP의 수준을 측정하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 HCP 효소 면역분석법("ELISA")으로 측정 시 HCP의 검출가능한 수준이 없는, 항체 함유 조성물을 제공한다.
6. 추가 변형
본 발명의 항-IL-12 항체는 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 항-IL-12 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 바람직한 효과를 제공하기 위해 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 본 발명의 항체와 항체 단편의 페길화는 당업계에 공지된 임의의 페길화 반응, 예를 들어 다음 문헌[Focus on Growth Factors 3:4-10(1992); EP 0 154 316; 및 EP 0 401 384, 각 문헌의 전문은 본원에 참고인용되었다]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 한 관점에서, 페길화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 유사 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본 발명의 항체와 항체 단편의 페길화에 적합한 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 본 명세서에 사용되는 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하는데 사용된 임의의 형태의 PEG, 예를 들어 모노(Cl-ClO)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것이다.
본 발명의 페길화된 항체 및 항체 단편을 제조하는 방법은 일반적으로 (a) 항체 또는 항체 단편을 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데하이드 유도체와 적당한 조건 하에 반응시켜 항체 또는 항체 단편을 하나 이상의 PEG 그룹에 부착되게 하는 단계, 및 (b) 반응 산물을 수득하는 단계를 포함할 것이다. 당업자에게는 공지된 파라미터와 원하는 결과에 기초하여 아실화 반응 또는 최적의 반응 조건을 선택하는 것이 쉽게 알 수 있을 것이다.
페길화된 항체 및 항체 단편은 일반적으로 본 명세서에 기술된 항-IL-12 항체 및 항체 단편을 투여하여 본 발명의 IL-12-관련 장애를 치료하는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 페길화된 항체 및 항체 단편은 페길화되지 않은 항체 및 항체 단편에 비해 반감기 증가를 나타낸다. 페길화된 항체 및 항체 단편은 단독으로 사용되거나, 함께 사용되거나 또는 다른 약제학적 조성물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체부는 유도체화되거나 다른 작용성 분자(예: 다른 펩타이드 또는 단백질)에 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체부는 본 명세서에 기술된 사람 항-hIL-12 항체의 유도체화된 형태 및 다른 변형 형태, 예를 들어 면역부착 분자를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체부는 하나 이상의 다른 분자 실체, 예를 들어 다른 항체(예: 이특이적 항체 또는 디아바디), 검출성 제제, 세포독성제, 약제 및/또는 상기 항체 또는 항체부와 다른 분자의 연합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드(예를 들어, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)에 작동가능하게 결합될 수 있다(화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 연합 또는 기타에 의해).
유도체화된 항체의 한가지 형태는 2 이상의 항체(동종 또는 이종의 항체로, 예를 들어 이특이적 항체를 생산한다)를 가교시켜 생산한다. 적당한 가교제로는 2가지 상이한 반응성 그룹이 적당한 스페이서(예: m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르)에 의해 분리되어 있는 이종이작용기성 또는 동종이작용기성(예: 디석신이미딜 수베레이트)인 것을 포함한다. 이러한 링커는 피어스 케미컬 컴패니(Pierce Chemical Company)(Rockford, IL)에서 입수할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체부가 유도체화될 수 있는 유용한 검출성 제제로는 형광 화합물이 포함된다. 형광 검출성 제제의 예로는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등을 포함한다. 또한, 항체는 검출성 효소, 예를 들어 알칼리 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 유도체화될 수도 있다. 항체가 검출성 효소에 의해 유도체화될 때, 효소가 검출성 반응 산물을 생산하는데 사용하는 추가 시약을 첨가함으로써 검출된다. 예를 들어, 검출성 제제인 양고추냉이 퍼옥시다제가 존재할 때, 과산화수소와 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한 유색 반응 산물을 산출한다. 또한, 항체는 비오틴에 의해 유도체화될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출할 수 있다.
7. 약제학적 조성물
본 발명의 항체 및 항체부는 피검체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체부와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리적 융화성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상뿐만 아니라 이의 배합물을 포함한다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 소량의 보조 물질, 예를 들어 항체 또는 항체부의 보관수명 또는 유효성을 증가시키는 함습제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체부는 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 항체 또는 항체부는 예를 들어 0.1 내지 250 mg/ml 항체를 함유하는 주사성 용액으로 제조될 수 있다. 주사성 용액은 플린트 또는 호박색 바이알, 앰플 또는 예비충전된 주사기에 액체 또는 동결건조 투여량 형태로 구성될 수 있다. 완충액은 L-히스티딘 약 1 내지 50 mM(최적은 5 내지 10 mM), pH5.0 내지 7.0(최적은 pH 6.0)일 수 있다. 다른 적당한 완충액으로는 석신산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 염화나트륨은 0 내지 300mM(액체 투약 형태에 최적은 150mM) 농도에서 용액의 독성을 조정하는데 사용될 수 있다. 동결방지제는 동결건조 투약 형태에 첨가될 수 있고, 주로 0 내지 10% 수크로오스(최적은 0.5 내지 1.0%)가 사용된다. 다른 적당한 동결방지제로는 트레할로스 및 락토스를 포함한다. 팽화제(bulking agent)는 동결건조 투약 형태에 첨가될 수 있고, 주로 1 내지 10% 만니톨(최적은 24%)이다. 안정화제는 액체 및 동결건조 투약 형태에 사용될 수 있고, 주로 1 내지 50mM L-메티오닌(최적은 5 내지 10mM)이다. 다른 적당한 팽화제로는 글리신, 아르기닌을 포함하고 0 내지 0.05% 폴리소르베이트-80(최적은 0.005 내지 0.01%)으로 포함될 수 있다. 다른 계면활성제는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
한 관점에서, 약제학적 조성물은 약 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg 투여량의 항체를 포함한다. 다른 관점에서, 항체의 투여량은 격주로 투여되는 약 1 mg/kg 또는 매주 투여되는 약 0.3 mg/kg을 포함한다. 당업자는 피검체에게 투여하기에 적당한 투여량 및 요법을 확인할 수 있다.
본 발명의 조성물은 형태가 다양할 수 있다. 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투약 형태, 예를 들어 액체 용액(예: 주사성 및 주입성 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌제를 포함한다. 이 형태는 의도한 투여 방식 및 치료 응용 등에 따라 달라진다. 일반적인 조성물은 주사성 용액 또는 주입성 용액, 예를 들어 다른 항체들에 의한 사람의 수동 면역화에 사용된 것과 유사한 조성물의 형태이다. 한가지 투여 방식은 비경구 투여(예: 정맥내, 피하, 복강내, 근육내 투여)이다. 한 관점에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 관점에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
치료 조성물은 일반적으로 멸균성이고 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 고농도 약물에 적합한 다른 정연한 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사성 용액은 필요한 경우 위에 열거한 한 성분 또는 성분의 배합물과 적당한 용매에 필요한 양의 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체부)을 첨가한 후, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질과 위에서 열거한 것 중에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 첨가하여 제조한다. 멸균 주사성 용액을 제조하기 위한 멸균, 동결건조 분말인 경우에, 제조 방법은 앞서 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 다른 필요 성분의 분말을 생산하는 진공 건조 및 분무 건조이다. 용액의 적당한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사성 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 첨가하여 초래될 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체부는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있고, 한가지 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자라면 알고 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 양태에서, 활성 화합물은 고속 방출에 대하여 화합물을 보호하는 담체를 이용하여, 예를 들어 조절 방출 제형, 예를 들어 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템으로 제조할 수 있다. 생체분해성, 생체화합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 많은 방법은 특허되거나 또는 일반적으로 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, 이의 전체 교시는 본원에 참고인용됨]을 참조한다.
특정 관점으로, 본 발명의 항체 또는 항체부는 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체를 이용해 경구 투여할 수 있다. 화합물(및 필요한 경우, 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐에 포위되거나, 정제로 압축되거나 또는 피검체의 식이에 직접 첨가될 수 있다. 경구 치료적 투여 시, 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취성 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여외에 다른 투여로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물을 불활성화 방지 물질로 코팅하거나, 불활성화 방지 물질과 함께 공동투여할 필요가 있을 수 있다.
보충성 활성 화합물도 역시 조성물에 첨가할 수 있다. 특정 관점에서, 본 발명의 항체 또는 항체부는 IL-12 활성이 유해한 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 공동제형화 및/또는 공동투여한다. 예를 들어, 본 발명의 항-hIL-12 항체 또는 항체부는 다른 표적에 결합하는 하나 이상의 추가 항체(예: 다른 사이토킨에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체)와 공동제형화 및/또는 공동투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 하나 이상의 항체는 전술한 치료제 중 2종 이상과 병용하여 사용할 수도 있다. 이러한 병용 요법은 투여된 치료제의 낮은 투여량을 이용할 수 있어, 다양한 단독요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피하게 하여 유리하다. 당업자라면, 본 발명의 항체가 병용 요법의 일부로 사용될 때, 항체가 단독으로 피검체에 투여될 때보다 낮은 항체 투여량이 적당할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다(예를 들어, 상승작용성 치료 효과는 병용 요법의 사용을 통해 달성할 수 있고, 결과적으로 바람직한 치료 효과를 달성하는데 항체의 낮은 용량을 사용할 수 있게 한다).
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 단독 사용하거나 추가 제제, 예를 들어 치료제와 함께 사용할 수 있는 것으로 이해되어야 하며, 상기 추가 제제는 당업자라면 의도 목적에 따라 선택할 수 있다. 예를 들어, 추가 제제는 본 발명의 항체에 의해 치료되는 질환 또는 상태를 치료하는데 유용한 것으로 당업계에 인식된 치료제일 수 있다. 또한, 추가 제제는 치료 조성물에 유익한 특성을 부여하는 제제, 예를 들어 조성물의 점도에 영향을 미치는 제제일 수 있다.
또한, 본 발명에 포함되어야 하는 배합물은 의도 목적에 유용한 배합물인 것으로 이해되어야 한다. 이하에 제시되는 제제는 예시적이며, 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 일부인 배합물은 본 발명의 항체와 이하 목록 중에서 선택되는 적어도 하나의 추가 제제일 수 있다. 또한, 배합물은 형성된 조성물이 의도한 기능을 수행할 수 있는 배합이라면 하나보다 많은 추가 제제, 예를 들어 2개 또는 3개의 추가 제제를 포함할 수 있다.
이러한 배합물은 이부프로펜과 같은 약물을 포함하는 NSAID라 불리는 비스테로이드성 항염증 약물(들)이다. 다른 배합물은 프레드니솔론을 포함하는 코르티코스테로이드이다; 스테로이드 사용의 공지된 부작용은 본 발명의 항-IL-12 항체와 함께 환자를 치료할 때 필요한 스테로이드 용량을 점감시킴에 의해 저하되거나 또는 심지어 제거될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체부가 배합될 수 있는 류마티스성 관절염 치료제의 비제한적 예로는 사이토킨 억제성 항염증 약물(들)(CSAID); 다른 사람 사이토킨 또는 성장인자, 예를 들어 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF에 대한 항체 또는 길항제를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90과 같은 세포 표면 분자 또는 이들의 리간드, 예를 들어 CD154(gp39 또는 CD40L)에 대한 항체와 배합될 수 있다.
치료제의 일부 배합물은 자가면역 및 후속 염증 캐스캐이드의 여러 지점에서 방해할 수 있다; 그 예에는 TNF 길항제, 예를 들어, 키메라, 사람화된 또는 사람 TNF 항체, D2E7(미국 특허출원 일련번호 08/599,226, 1996년 2월 9일 출원, 전체 교시는 본원에 참고인용됨), cA2(Remicade™), CDP571, 항-TNF 항체 단편(예: CDP870) 및 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이의 유도체, (p75TNFR1gG (Enbrel™) 또는 p55TNFR1gG (Lenercept), 가용성 IL-13 수용체(sIL-13), 및 또한 TNFα 전환효소(TACE) 억제제가 있고; 유사하게 IL-1 억제제(인터류킨-1-전환효소 억제제, 예를 들어 Vx740, 또는 IL-1RA 등)는 동일 이유로 인해 유효할 수 있다. 다른 배합물에는 인터류킨 11, 항-P7 및 p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL)이 포함된다. 또 다른 배합물은 IL-12 기능과 병행하거나, IL-12 기능에 의존적이거나 IL-12 기능과 협동적인 작용을 할 수 있는 자가면역 반응의 다른 주요 작용인자를 수반하는 것이고, 특히 IL-18 길항제, 예를 들어 IL-18 항체 또는 가용성 IL-18 수용체, 또는 IL-18 결합 단백질이 포함된다. 확인된 바에 따르면, IL-12와 IL-18이 중복되지만 독특한 기능을 보유하여, 이 둘에 대한 길항제의 배합물이 가장 효과적이었다. 또 다른 바람직한 배합물은 비고갈성 항-CD4 억제제를 포함한다. 또 다른 바람직한 배합물은 공동자극 경로의 길항제 CD80(B7.1) 또는 CD86(B7.2), 예를 들어 항체, 가용성 수용체 또는 길항제성 리간드 등을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 또한 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린 설파살라진, 메살라진, 올살라진 클로로퀴닌/하이드록시클로로퀸, 펜실라민, 오로티오말레이트(근육내 및 경구), 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국소 주사), β-2 아드레날린수용체 작용제(살부타몰, 터부탈린, 살메테랄), 크산틴(테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID, 예를 들어 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 작용제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, 염증촉진성 사이토킨, 예를 들어 TNF-α 또는 IL-1에 의한 시그널 전달을 방해하는 제제(예: IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환효소 억제제(예: Vx740), 항-P7, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TNFα 전환효소(TACE) 억제제, T-세포 시그널링 억제제, 예를 들어 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예: 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체 및 유도체 p75TNFRIgG(Enbrel™) 및 p55TNFRIgG(Lenercept), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)) 및 항염증 사이토킨(예: IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ)과 같은 제제와 배합될 수도 있다. 일부 배합물은 메토트렉세이트 또는 레플루노미드를 포함하고, 중등증 또는 중증 류마티스 관절염의 경우에는 사이클로스포린을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체부가 배합될 수 있는 염증장병을 위한 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 부데노사이드; 상피 성장 인자; 코르티코스테로이드; 사이클로스포린, 설파살라진; 아미노살리실레이트; 6-머캅토퓨린; 아자티오프린; 메트로니다졸; 리폭시게나제 억제제; 메살라민; 올살라진; 발살라지드; 항산화제; 트롬복산 억제제; IL-1 수용체 길항제; 항-IL-1α 모노클로날 항체; 항-IL-6 모노클로날 항체; 성장 인자; 엘라스타제 억제제; 피리디닐-이미다졸 화합물; 다른 사람 사이토킨 또는 성장 인자, 예를 들어 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF 등에 대한 항체 또는 길항제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 세포 표면 분자, 예를 들어 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는 이들의 리간드에 대한 항체와 배합될 수도 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 제제, 예를 들어 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들어 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 작용제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, TNFα 또는 IL-1과 같은 염증촉진성 사이토킨에 의한 시그널 전달을 방해하는 제제(예: IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환효소 억제제(예: Vx740), 항-P7, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TNFα 전환효소 억제제, T-세포 시그널 전달 억제제, 예를 들어 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예: 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)) 및 항염증 사이토킨(예: IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ)과 배합될 수 있다.
항체 또는 항원결합부가 배합될 수 있는 크론병 치료제의 예에는 다음과 같은 것이 있다: TNF 길항제, 예를 들어 항-TNF 항체, D2E7(미국 특허출원 일련번호 08/599,226, 1996년 2월 9일 출원, 본원에 참고인용됨), cA2(REMICADE™), CDP 571, 항-TNF 항체 단편(예: CDP870), TNFR-Ig 작제물(p75TNFR1gG (Enbrel™) 및 p55TNFR1gG(Lenercept)), 항-P7, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), 가용성 IL-13 수용체(sIL-13) 및 PDE4 억제제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 코르티코스테로이드, 예를 들어 부데노사이드 및 덱사메타손과 배합될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 설파살라진, 5-아미노살리실산 및 올살라진과 같은 제제, 및 염증촉진성 사이토킨, 예를 들어 IL-1의 합성 또는 작용을 방해하는 제제, 예를 들어 IL-1 전환효소 억제제(예: Vx740) 및 IL-1ra와 배합될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 T 세포 시그널 전달 억제제, 예를 들어 타이로신 키나제 억제제 6-머캅토퓨린과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 IL-11과 배합될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항체부가 배합될 수 있는 다발성 경화증 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 코르티코스테로이드; 프레드니솔론; 메틸프레드니솔론; 아자티오프린; 사이클로포스파미드; 사이클로스포린; 메토트렉세이트; 4-아미노피리딘; 티자니딘; IFNβ1a(AVONEX; Biogen); INFβ1b(BETASERON; Chiron/Berlex); 공중합체 1(Cop-1; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압 산소; 정맥내 면역글로불린; 클라브리빈; 기타 사람 사이토킨 또는 성장 인자, 예를 들어 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF에 대한 항체 또는 길항제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90과 같은 세포 표면 분자 또는 이의 리간드에 대한 항체와 배합될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 또한 제제, 예를 들어 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들어 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 작용제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, TNFα 또는 IL-1과 같은 염증촉진성 사이토킨에 의한 시그널 전달을 방해하는 제제(예: IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환효소 억제제(예: Vx740), 항-P7, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TACE 억제제, T-세포 시그널 전달 억제제, 예를 들어 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예: 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)) 및 항염증 사이토킨(예: IL-4, IL-10, IL-13 및 TGFβ)과 배합될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부가 배합될 수 있는 다발성 경화증 치료제의 예에는 IFNβ, 예를 들어 IFNβ1a 및 IFNβ1b; 코팍손, 코르티코스테로이드, IL-1 억제제, TNF 억제제 및 CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체가 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체부의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"이란 용어는 원하는 치료 결과를 수득하는데 필요한 투여량 및 필요한 시간 기간 동안의 유효한 양을 의미한다. 상기 항체 또는 항체부의 치료학적 유효량은 질환 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중과 개체 내에서 원하는 반응을 유도하는 항체 또는 항체부의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 치료학적 유익 효과가 항체 또는 항체부의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방학적 결과를 수득하기 위한 투여량 및 필요 기간 동안의 유효한 양을 의미한다. 일반적으로, 예방학적 용량은 질환의 초기 단계전이나 초기 단계에 피검체에 사용되기 때문에 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적은 양일 것이다.
투여 계획은 원하는 최적 반응(예를 들어, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 1회의 일시주사를 투여할 수도 있고, 여러 분할 용량을 경시적으로 투여할 수도 있으며 또는 치료 상황의 위급성에 따라 비례하여 감소 또는 증가된 용량을 투여할 수도 있다. 특정 양태에서, 투여 용이성과 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용되는 투여 단위 형태는 치료하는 포유동물 피검체에 대하여 단위 투여량으로서 적당한 물리적으로 분리된 단위를 의미하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정의 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 수득하고자 하는 특정 치료 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체의 감응도 치료에 있어서 상기 활성 화합물을 배합하는 기술 고유의 제한에 따라 결정되고 직접 좌우된다.
본 발명의 항체 또는 항체부의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 비제한적 범위의 예는 0.01 내지 20mg/kg, 또는 1 내지 10mg/kg 또는 0.3-1mg/kg이다. 투여량 값은 경감되어야 하는 상태의 종류 및 중증도에 따라 달라질 수 있다는 것도 유의해야 한다. 임의의 특정 피검체에서는 개체의 필요 및 조성물 투여를 관리하거나 감독하는 자의 전문가적 판단에 따라 특정 투여 계획이 경시적으로 조정되어야 하며, 본 명세서에 제시된 투여량 범위는 예시적일 뿐이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하려는 것이 아님을 명심해야 한다.
8. 본 발명의 항체의 용도
8.1 일반 용도
IL-12에 결합하는 능력이 있다면, 본 발명의 항-IL-12 항체 또는 이의 일부는 IL-12, 한 관점에 따르면 hIL-12(예를 들어, 샘플 매트릭스에서, 한 관점에 따르면 생물학적 샘플, 예를 들어 혈청 또는 혈장에서)를 통상적인 면역분석법, 예를 들어 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA) 또는 조직 면역조직화학 등으로 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 생물학적 샘플을 본 발명의 항체 또는 항체부와 접촉시키는 단계 및 IL-12에 결합된 항체(또는 항체부) 또는 미결합된 항체(또는 항체부)를 검출하여 샘플 중의 IL-12를 검출하는 단계를 포함하여, 생물학적 샘플 내의 IL-12를 검출하는 방법을 제공한다. 항체는 결합된 항체 또는 미결합된 항체의 검출을 촉진하기 위해 검출성 물질로 직접 또는 간접적으로 표지화한다. 적당한 검출성 물질로는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질이 있다. 적당한 효소의 예에는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있고; 적당한 보결분자단 복합체의 예에는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있으며; 적당한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 있으며; 적당한 방사성 물질의 예에는 125I, 131I, 35S, 또는 3H이 있다. 샘플 중의 IL-12의 검출은 진단 상황, 예를 들어 IL-12 증가와 관련이 있는 상태의 진단에 유용할 수 있고/있거나 항-IL-12 항체로 치료 시 혜택을 입을 수 있는 피검체를 동정하는데 유용할 수 있다.
항체 표지화의 대안으로, IL-12는 예를 들어 검출성 물질로 표지화된 rhIL-12 표준물 및 미표지화된 항-IL-12 항체, 예를 들어 항-hIL-12 항체를 이용하는 경쟁 면역분석에 의해 샘플에서 분석될 수 있다. 이 분석에서, 샘플, 표지화된 rhIL-12 표준물, 및 항-hIL-12 항체가 배합되고 미표지화된 항체에 결합된, 표지화된 rhIL-12 표준물의 양이 결정된다. 샘플 중의 hIL-12의 양은 항-hIL-12 항체에 결합된 표지화된 rhIL-12 표준물의 양에 반비례한다.
본 발명의 항체 및 항체부는 시험관내 및 생체내에서 IL-12의 활성, 한 관점에서 hIL-12 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체부는 IL-12를 함유하는 세포 배양물에서, 본 발명의 항체가 교차 반응하는 IL-12를 보유하는 사람 피검체 또는 기타 포유동물 피검체(예: 영장류, 예를 들어 비비, 사이노몰거스 및 리서스)에서 IL-12 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 관점에서, 본 발명은 사람 IL-12 및 비비 IL-12, 마모셋 IL-12, 침팬지 IL-12, 사이노몰거스 IL-12 및 리서스 IL-12로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 추가 영장류 IL-12의 활성을 중화시키지만, 마우스 IL-12의 활성을 중화시키지 않는 분리된 사람 항체 또는 이의 항원결합부를 제공한다. 한 관점에서, IL-12는 사람 IL-12이다. 예를 들어, hIL-12를 함유하거나 함유할 것으로 의심되는 세포 배양물에서, 본 발명의 항체 또는 항체부는 배양물 중의 hIL-12 활성을 억제하도록 배양 배지에 첨가될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 IL-12 활성이 해로운 장애를 앓고 있는 피검체에서 IL-12 활성을 억제하는 방법을 제공한다. IL-12는 다양한 장애의 병태생리에 연관되어 있다(Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996; Morita et al.(1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-314; Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367; Fais et al.(1994) J.Interferon Res. 14: 235-238; Pyrronchi et al.,(1997) Am. J. Path. 150: 823-832; Monteleone et al., (1997) Gastoenterology. 112: 1169-1178, 및 Berrebi et al.,(1998) Am. J. Path 152: 667-672; Pyrronchi et al.(1997) Am. J.Path. 150: 823-832, 이의 전체 교시들은 본원에 참고인용됨). 본 발명은 상기 장애를 앓고 있는 피검체에서 IL-12 활성을 억제하는 방법으로, 피검체의 IL-12 활성이 억제되도록 본 발명의 항체 또는 항체부를 피검체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 한 관점에서, IL-12는 사람 IL-12이고 피검체는 사람 피검체이다. 대안적으로, 피검체는 본 발명의 항체가 교차반응하는 IL-12를 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한, 피검체는 hIL-12가 도입된(예를 들어, hIL-12의 투여 또는 hIL-12 도입유전자의 발현에 의해) 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료 목적으로 사람 피검체에 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항체가 교차반응하는 IL-12를 발현하는 비-사람 포유동물에게 수의학적 목적으로 또는 사람 질환의 동물 모델로서 투여할 수 있다. 후자의 경우에, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가(예를 들어, 투여량 및 투여 시간 경과 검사)하는데 유용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "IL-12 활성이 해로운 장애"는 장애를 앓는 피검체에서 IL-12의 존재가 장애의 병태생리에 원인이 되거나 장애의 악화에 기여하는 인자인 것으로 의심되거나 밝혀진, 질환 및 다른 장애를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, IL-12 활성이 해로운 장애는 IL-12 활성의 억제가 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시킬 것으로 예상되는 장애이다. 당해 장애는 예를 들어, 장애를 앓고 있는 피검체의 생물학적 유체 중에 IL-12 농도를 증가시켜(예를 들어, 피검체의 혈청, 혈장, 윤활액 중의 IL-12 농도의 증가) 입증할 수 있고, 이의 검출은 예를 들어 전술한 항-IL-12 항체를 사용하여 수행할 수 있다. IL-12 활성이 해로운 장애의 예는 다수가 있다. 한 관점에서, 항체 또는 이의 항원결합부는 본 명세서에 기술된 장애 또는 질환을 치료하는 치료법에 사용될 수 있다. 다른 관점에서, 항체 또는 이의 항원결합부는 본 명세서에 기술된 장애 또는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 몇몇 비제한적 특정 장애를 치료하는데 사용되는 본 발명의 항체 및 이의 항체부의 용도는 이하에 더 상세히 논의된다.
인터류킨 12는 면역 및 염증 인자를 수반한 다양한 질환과 관련된 병리에 중요한 역할을 한다. 이러한 질환으로는, 류마티스성 관절염, 골관절염, 연소성 만성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 크론 질환, 궤양 대장염, 장 염증 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 피부경화증, 아토피성 피부염, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브스병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇤라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전증, 심근경색, 애디슨병, 산발성 다분비선 제I형 결핍증 및 다분비선 제II형 결핍증, 슈미트 증후군, 성인성(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청반응 음성 관절증, 관절증, 라이터병, 건선성 관절증, 궤양성 대장염성 관절증, 장병증성 관절병증, 클라미디아증, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절증, 척추관절증, 죽종 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 연소성 악성 빈혈, 근통성 뇌염/로얄 프리(Royal Free) 질환, 만성 점막 피부 칸디다증, 거세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질환, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 감마글로불린저혈증), 확장형 심근증, 여성 불임증, 난소 부전증, 조숙 난소부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유조직 폐포염, 후-염증성 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 복합 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련 폐 질환, 쇼그렌 질환 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염 미만성 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 방사선 섬유증, 폐색성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(전형적 자가면역 또는 루포이드 간염), 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 극세포증에 따른 B형 인슐린 내성, 부갑상선 기능저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원판양 홍반성 낭창, 남성 불임증 특발증 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 인슐린 의존성 진성당뇨병, 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압증, 굿패스처 증후군, 결절성 다발성 동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 열, 류마티스성 척추염, 스틸씨 병, 전신성 경화증, 다카야스 병/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능항진증, 갑상선종성 자가면역 갑상선 기능저하증(하시모토 병), 위축성 자가면역 갑상선 기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염 및 백반증을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 사람 항체 및 항체부는 자가면역 질환, 특히 염증 관련 질환, 예를 들어 류마티스성 척추염, 알레르기, 자가면역 당뇨병 및 자가면역 포도막염을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정 관점에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 류마티스성 관절염, 크론 질환, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 진성 당뇨병 및 건선을 치료하는데 사용된다.
8.2 류마티스성 관절염에서의 용도
인터류킨-12는 류마티스성 관절염과 같은 염증 질환에서 역할을 하는 것으로 연관되어 있다. 유도성 IL-12p40 메시지는 류마티스성 관절염 환자의 활액에서 검출되었고, IL-12는 류마티스성 관절염 환자 유래의 활액에 존재하는 것으로 밝혀진 바 있다[예를 들어, Morita et al ., (1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306-314, 이의 전체 교시는 본원에 참고 인용됨]. IL-12 양성 세포는 류마티스성 관절염 활액의 내면밑 층에 존재하는 것으로 발견되었다. 본 발명의 사람 항체 및 항체부는 예를 들어 류마티스성 관절염, 연소성 류마티스성 관절염, 라임 관절염, 류마티스성 척추염, 골관절염 및 통풍 관절염 등을 치료하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 항체부는 전신 투여하지만, 특정 장애에서는 항체 또는 항체부의 국소 투여가 유익할 수도 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 항체부는 자가면역 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여될 수 있다.
류마티스성 관절염에 대해 콜라겐 유도 관절염(CIA) 쥐 모델에서, 관절염 전에 항-IL-12 mAb(래트 항-마우스 IL-12 모노클로날 항체, C17.15)에 의한 마우스 치료는 질환의 개시를 상당히 억제했고, 질환의 빈도 및 중증도를 감소시켰다. 관절염 개시 후 곧 항-IL-12 mAb로 치료 시에는 중증도를 감소시키지만, 질환이 개시된 후 나중에 항-IL-12 mAb로 마우스 치료 시 질환 중증도에 미치는 효과가 적었다.
8.3 크론병에서의 용도
인터류킨-12는 또한 장 염증 질환, 크론 질환에 역할을 한다. 크론병에 걸린 환자는 장 점막에서 IFN-γ 및 IL-12의 발현 증가가 나타난다(예를 들어, Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Pyrronchi et al., (1997) Amer. J. Pathol. 150: 823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178; Berrebi et al., (1998) Amer. J. Pathol. 152: 667-672, 이의 전체 교시들은 본원에 참고인용됨). 항-IL-12 항체는 대장염 마우스 모델, 예를 들어 TNBS 유도된 대장염 IL-2 녹아웃 마우스에서, 최근에서는 IL-10 녹아웃 마우스에서 질환을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체부는 장 염증 질환의 치료에 사용될 수 있다.
8.4 다발성 경화증에서의 용도
인터류킨-12는 다발성 경화증의 주요 매개인자로서 연관되어 있다. 유도성 IL-12 p40 메시지 또는 IL-12 자체의 발현은 다발성 경화증 환자의 병변에서 입증될 수 있다(Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med 182: 1985-1996, Drulovic et al., (1997) J. Neurol. Sci. 147:145-150, 이의 전체 교시들은 본원에 참고인용됨). 다발성 경화증이 있는 만성 진행성 환자는 IL-12의 혈행 수준을 상승시켰다. 다발성 경화증 환자의 T 세포 및 항원제시세포(APC)에 대한 연구는 Th1형 면역 반응을 야기하는 진행성 다발성 경화증의 기본으로서 일련의 자기-영속성 면역 상호작용을 밝혀냈다. T 세포로부터 IFN-γ의 분비 증가는 APC에 의한 IL-12 생산을 증가시켰고, 이는 그 사이클을 영속시켜 Th1형 면역 활성화와 질환의 만성 상태를 야기했다(Balashov et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 599-603, 이의 전체 교시는 본원에 참고 인용됨). 다발성 경화증에서 IL-12의 역할은 다발성 경화증이 있는 마우스 및 래트의 실험용 알레르기 뇌척수염(EAE) 모델에서 연구되었다. 다발성 경화증이 있는 마우스의 재발-완화 EAE 모델에서, 항-IL-12 mAb에 의한 전처리는 마비를 지연시키고 임상 스코어를 감소시켰다. 마비의 최고점에서 또는 후속 완화 기간 동안 항-IL-12 mAb로의 치료는 임상 점수를 감소시켰다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 사람의 다발성 경화증과 관련된 증상을 경감시키는 작용을 할 수 있다.
8.5 인슐린-의존적 진성 당뇨병에서의 용도
인터류킨-12는 인슐린-의존적 진성 당뇨병(IDDM)의 중요한 매개인자로 연관되어 있다. IDDM은 NOD 마우스에서 IL-12의 투여에 의해 유도되었고, IDDM의 입양 전달 모델에서 항-IL-12 항체는 예방적이었다. 조기 개시성 IDDM 환자는 종종 약간의 잔류 섬세포 기능이 유지되는, 소위 "허니문 기간"을 경험한다. 이러한 잔류 섬세포는 인슐린을 생산하고 투여된 인슐린보다 우수하게 혈당 수준을 조절한다. 이러한 조기 개시 환자의 항-IL-12 항체에 의한 치료는 섬세포의 추가 파괴를 방지하여 인슐린의 내인성 급원을 유지시킬 수 있다.
8.6 건선에서의 용도
인터류킨-12는 건선에서 주요 매개인자로서 연관되어 있다. 건선은 TH1형 사이토킨 발현 프로필과 관련된 급성 및 만성 피부 병변을 수반한다(Hamid et al. (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1:225-231; Turka et al. (1995) Mol. Med. 1:690-699, 이의 전체 교시는 본원에 참고인용됨). IL-12 p35 및 p40 mRNA는 질환이 있는 사람 피부 샘플에서 검출되었다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 건선과 같은 만성 피부 장애를 경감시키는 작용을 할 수 있다.
실시예
1. 항- IL -12 항체의 분리/정제
본 실시예는 숙주 세포 단백질(HCP) 및 다른 불순물로부터 항-IL-12 항체를 정제하는 한가지 방법을 제공한다.
1차 회수
pH 감소, 원심분리 및 여과에 의해 1차 회수는 생산 생물반응기 수거물로부터 세포 및 세포 파편을 제거하는데 사용했다. 당해 항체, 배지 및 세포를 포함하는 배양물은 가능한 pH 민감성 바이러스 오염물을 사멸시키고 3000L 생산 생물반응기에서 배지/세포 오염물을 침전시키기 위해 1시간 동안 3.5로 pH 불활성화시켰다. 그 다음, 이 배양물을 pH 4.9로 조정했다. pH 감소는 3M 시트르산으로 20분 내지 40분 동안 수행했다. pH 증가는 3M 수산화나트륨으로 20 내지 40분 동안 수행했다. 이러한 작업은 20℃의 온도에서 실시했다. pH 불활성화 후 배양물은 보유 탱크로 사용되는 다른 생물반응기 내로 원심분리했다. 원심분리기는 28L/min의 공급 속도 하에 11,000 x g로 작동시켰다. 방출 간격 용적은 150의 낮은 혼탁도 수준을 달성하도록 300초로 고정시켰다. 원심분리 여과액은 12개의 16인치 Cuno™ 모델 30/60 ZA 심층 필터와 3개의 30인치 0.45/0.2㎛ Sartopore™ 필터 카트리지가 장착된 3개의 둥근 필터 하우징을 포함하는 필터 트레인을 통해 통과시켰다. 정화된 상청액은 예비살균된 3000L 고정 수거물 탱크에 수집하고 8℃로 유지시켰다. 이 온도는 이온 교환 크로마토그래피 전에 20℃까지 조정했다.
각 샘플마다 28085BI, 28204BI, 28206BI, 28207BI 및 34142BI로 표시한 수거물에 있는 ABT-874의 역가는 3.76 내지 4.05 mg/ml 범위이고 평균 3.91 mg/ml였다. 세포 배양액의 pH 감소 유지 및 후속 pH 증가와 수거물의 원심분리 결과, 질량 회수 수율은 77% 내지 84% 범위, 평균 82%였고, 표준편차는 2.77이었다(표 2 및 3 참조). 항체 정량은 이 단계 전반에서 Poros A™ 정량 분석(당업자에게 공지되어 있음)을 통해 측정했다.
Figure pct00001
Figure pct00002
양이온 교환
양이온 교환 포획 크로마토그래피 단계의 목적은 심층 여과액으로부터 항체의 포획과 공정-관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질, 관련 항체 저분자량 종 및 배지 성분)의 감소이다. 본 공정 단계에 CM HyperDF™ 수지(Pall Corporation)를 이용했다. CM HyperDF™ 포획 단계는 상온에서 수행했다.
본 작업에는 80 cm 직경 x 23 cm 길이의 컬럼(베드 용적 116L)을 사용했다. 16.0L/min의 속도(선속도 = 191 cm/hr)로 예비평형화, 평형화, 로딩, 세척 및 재생 컬럼 단계를 수행했다. 용출, 스트립, 세척, 중화, 소독 및 보관 컬럼 단계는 9.2L/min의 속도(선속도 = 110cm/hr)로 수행했다. 컬럼은 210mM 아세트산나트륨 pH 5.0으로 평형화시켰다. 평형화 후, 컬럼에 USP 정제수로 직렬 희석된 정화된 수거물을 로딩했다. 컬럼에는 수지 1리터당 최대 80g의 단백질을 로딩했다(≤9248g/사이클). 그 다음, 컬럼은 평형화 완충액으로 기준선까지 세척했다. 산물은 790mM 아세트산나트륨 pH 5.0으로 용출시켰다. 용출 수집은 항체 용출 피크의 3 OD280nm 상측부터 8 OD280nm 하측까지 수행했다.
컬럼은 1M 염화나트륨으로 재생하고, 액체 세척물 1M 아세트산/20% 이소프로필 알콜로 세척하고, 790nM 아세트산나트륨, pH 5.0으로 세척한 뒤, 0.5M 수산화나트륨으로 소독한 후, 790mM 아세트산나트륨 pH 5.0으로 세척하고 25mM 인산나트륨, 20% 이소프로필 알콜(IPA)에 보관했다.
CM HyperDF™ 크로마토그래피 단계의 1 사이클은 조사한 각 샘플 로트마다 수행했다. 샘플 로트마다 평균 로딩량은 CM HyperDF™ 수지 1L당 67.38g 항체였고 표준편차는 1.37이며; 65.27 내지 68.62 g/L 범위였다(표 4 및 5 참조). 산물 회수 수율은 로트 29001BF, 29008BF, 30005BF, 30006BF 및 35036BF에서 83% 내지 96% 범위이고, 평균 88%이며 표준편차는 5.17이었다. 정화된 수거물에 대한 항체 정량은 Poros A™ 정량 분석을 이용해 측정하고 CM HyperDF™ 용출액에 대해서는 A280nm 정량을 사용했다. CM HyperDF™ 용출 산물 피크의 하위에 대한 커팅 기준은 산물 순도를 달성하기 위해 이중 경쇄 산물과 관련된 항체 종을 잘라내도록 높였다. 이것은 전체 CM HyperDF™ 크로마토그래피 단계 수율을 약 95%에서 80% 중반에 이르게 했다.
5회의 사이클 동안 크기 배제(SE)-HPLC에 의한 순도의 큰 차이는 확인되지 않았다. 표 16은 단량체 IgG이 평균 94.76%이고 표준편차 0.67임을 보여준다.
Figure pct00003
Figure pct00004
포획 한외여과 /정용여과( UF / DF )
CM HyperDF™ 용출액은 탈지질 심층 필터(1 X 16인치, Cuno™ Corporation)와 이어서 0.45/0.2㎛ Sartopore™ 이중층 필터 카트리지(1 X 30 인치)를 통해 여과했다. 필터에 남은 잔류 용적을 플러싱하기 위해, CM HyperDF™ 용출액 완충액 790 mM 아세트산나트륨, pH 5.0을 이용했다. 탈지질 CM HyperDF™ 용출액의 한외여과/정용여과(UF/DF)는 당해 항체를 농축하고 아세트산나트륨을 제거하고 산물의 완충액을 100 mM 염화나트륨, 20mM 인산나트륨 pH 7.0으로 교환하기 위해 수행했다. 분자량 컷오프(MWCO)가 30kD인 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation) 재생 셀룰로스 한외여과기형 막 카세트를 이 단계에 상온에서 사용했다.
30kD 재생 셀룰로스 막은 산물을 첨가하기 전에 790ml 아세트산나트륨 pH 5.0으로 플러싱했다. 탈지질-CM HyperDF™ 용출액은 입구 압력 20-30 psig 및 출구 압력 10-15 psig와 잔류물 유속 52L/min에서 104L/min 하에 40g/L 단백질로 농축했다. 이어서 최소 6 용적량의 100mM 염화나트륨, 20mM 인산나트륨 pH 7.0을 이용한 연속 정용여과를 수행했다. 그 다음, UF 시스템에서 목표 농도 42.5 g/L 단백질의 산물이 배출되었다. 이 시스템은 시스템 내에 보유되는 산물을 회수하기 위해 정용여과 완충액으로 세정했다. 농축물과 세척물을 합하여, 정용여과된 ABT-874를 수득했다. 이 단계는 상온에서 수행했다. 샘플 매트릭스는 OpticapXLT30™ 캡슐 2.0/1.2㎛ 필터와 이어서 0.45/0.2㎛ Sartopore™ 이중층 필터 카트리지(1 X 30 인치)로 여과했다.
CM HyperDF™ 용출액 단계의 탈지질 여과 및 UF/DF는 다양한 샘플 로트(즉, 29001BF, 29008BF, 30005BF, 30006BF 및 35036BF)에서 5.92Kg의 평균 산물 회수 수율을 얻었고, 범위는 80% 내지 94%였다(표 6과 7 참조).
SE-HPLC에 의한 순도는 5회 사이클에서 용인되는 정도였다. 표 16은 IgG가 평균 95.79%, 표준편차 0.57인 것을 보여준다.
Figure pct00005
Figure pct00006
음이온 교환 크로마토그래피
음이온 교환 크로마토그래피는 DNA 및 숙주 세포 단백질과 같은 공정-관련 불순물을 감소시킨다. 이 공정 단계는 주요 항체 산물이 Q Sepharose™에 결합하지 않지만, 불순물이 결합하는 관류식 크로마토그래피이다. 이 단계와 후속 단계는 포획 UF/DF 중간 산물을 이동식 밀폐 탱크 내에서 미세 정제 스위트로 옮긴 후 12 ± 2℃ 하에 Class 10,000 정제 스위트에서 수행했다.
직경 60 cm x 길이 30 cm의 컬럼(베드 용적 85L)을 사용했다. 컬럼에는 Q Sepharose™ Fast Flow 음이온 교환 크로마토그래피 수지(Amersham Biosciencies, Uppsala, Sweden)를 채웠다. 모든 컬럼 단계는 3.5 L/min로 진행되는 컬럼 보관 시를 제외하고는 7.0 L/min(선속도 = 150 cm/hr)로 수행했다.
컬럼은 7 컬럼 용적(CV)의 50mM 염화나트륨, 25mM Tris, pH 8.0으로 평형화시켰다. 이 단계의 최대 단백질 로딩량은 수지 L당 단백질 50g(≤4250g/사이클)이었다. 이 컬럼은 사이클마다 1M 염화나트륨 재생만으로 2회 순환시켰다. 포획 UF/DF 물질은 25mM Tris, pH 8.0으로 약 2배 희석했다. 이것은 약 7.0 mS/cm, pH 7.5 내지 8.1에서의 Q 로딩물이 되었다. 희석된 포획 UF/DF 물질의 로딩 후, 컬럼은 평형화 완충액으로 세척했다. 당해의 항체를 포함하는 관류물은 로딩 후 세척물을 포함하여 3 OD280nm 상측부터 3 OD280nm 피크 하측까지 수집했다. 이것은 Q 관류물 + 세척물(Q FTW)이었다.
제2 사이클 후, 컬럼은 1M 염화나트륨으로 재생하고, 주사용 물(WFI)로 세척하고, 1M 수산화나트륨으로 1시간 동안 소독한 뒤, 1M 염화나트륨, 25mM 인산나트륨 pH 7.0으로 세척하여 pH를 낮춘 다음, 25mM 인산나트륨, 20% IPA에 저장했다.
수득한 각 샘플 로트마다 Q Sepharose™ 컬럼의 2회 사이클을 수행했다. 사이클당 평균 로딩량은 34.8 g/L 및 31 g/L 수지(각각 사이클 A 및 사이클 B)였고, 29.01 내지 37.13 g/L 범위였다(표 8 및 9 참조). 양 사이클을 비롯한 전체 단계의 수율은 92%이고 표준편차는 17.8이었다. 이 단계는 일반적으로 99 내지 101%를 생산한다(샘플 로트 29001BF, 29008BF, 30005BF 및 30006BF). Q Sepharose™ FTW 전체 수율은 5개 배치에서 25.81kg이었다. Q 로딩물의 pH는 pH 7.5이고 전도성은 로트 30006BF에서 약 6.0 내지 6.7 mS/cm였다.
5회 사이클 동안 SE-HPLC에 의한 순도는 IgG의 경우 평균 96.75%이고 표준편차는 0.53이었다(표 16).
Figure pct00007
Figure pct00008
HIC 크로마토그래피
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 최종 산물 사양으로 항체 응집물과 공정-관련 불순물을 제거하는데 사용된다. 이 단계는 결합 및 용출식 크로마토그래피이다. 음이온 교환 산물(샘플)은 고염 완충액(황산암모늄)에 투입되고 컬럼에 결합시킨 후, 3회 세척한 후 컬럼으로부터 용출시켰다.
이 절차에 직경 80 cm x 길이 15 cm 컬럼(베드 용적 75L)을 이용했다. 이 컬럼에 Phenyl HP Sepharose™ 소수성 상호작용 수지(Amersham Biosciences, Upsala, Sweden)를 충전했다. Q FTW(당해 항체를 포함하는 것으로 추정됨)는 동일한 용적의 1.7M 황산암모늄, 50mM 인산나트륨, pH 7.0으로 희석한 뒤, 0.45/0.2 ㎛ Sartopore™ 이중층 필터(1 X 30 인치)를 통해 여과했다. Phenyl Sepharose™ HP는 Phenyl Sepharose™ HP 수지(≤3000g/사이클) L당 ABT-874 40g의 최대 로딩량으로 2 사이클로 진행시켰다.
페닐 로딩물은 컬럼에 로딩하고 5 CV의 0.85M 황산암모늄, 50mM 인산나트륨, pH 7.0으로 평형화했다. 산물의 로딩 이후, 컬럼은 3 CV의 세척 1(1.1M 황산암모늄, 50mM 인산나트륨, pH 7.0), 1 내지 7 CV의 세척 2(85M 황산암모늄, 50mM 인산나트륨, pH 7.0), 그 다음 3 CV의 세척 3(1.1M 황산암모늄, 50mM 인산나트륨, pH 7.0)으로 세척했다.
컬럼은 용출 완충액, 0.5M 황산암모늄, 15mM 인산나트륨 pH 7.0으로 용출시켰다. 샘플 산물은 3 OD280nm 상측부터 3 OD280nm 피크 하측까지 수집했다.
평형화, 로딩, 세척 1 및 2, 및 세척 3은 6.2L/min(선속도 = 74cm/hr)으로 수행했다. 컬럼의 용출, 재생, WFI 세척, 소독 및 보관 단계는 3.1 L/min(선속도 = 37 cm/hr)로 수행했다.
컬럼은 사이클 사이에 4 CV의 주사용 물(WFI), 3 CV의 1M NaOH 및 4 CV의 WFI로 재생시켰다. 마지막 사이클 후, 컬럼은 5 CV의 보관 완충액, 25mM 인산나트륨, 20% IPA로 처리했다.
각 샘플 로트마다 HIC의 2 사이클을 수행했다. 사이클당 평균 로딩량은 32.54 및 34.00 g/L 수지(각각 사이클 A 및 사이클 B)였고; 범위는 21.77 내지 37.79 g/L였다(표 10 및 11 참조). 합한 사이클 A와 B의 전체 산물 회수 수율은 샘플 로트 29001BF, 29008BF, 30005BF, 30006BF 및 35036BF에서 81% 내지 86% 범위이고, 평균은 84%이며 표준편차는 1.87이었다. 통합된 전체 페닐 세파로스 HP 크로마토그래피 단계에 따라, 총 20.94kg의 ABT-874가 수득되었다.
페닐 배치들의 SEC-HPLC에 의한 순도는 IgG에 대해 평균 99.63%이고 표준편차는 0.11이었다(표 16). 순도 %는 당해 항체의 정제가 항체 관련 응집물 IgG 및 이중 경쇄(저분자량 종)를 감소시켜 소수성 크로마토그래피 절차 동안 증가했다. 이것은 세척 2 완충액(SR-342: 25mM 인산나트륨, 0.85M 황산암모늄, pH 7)에 의해 달성되었다. 이 완충액은 이중 경쇄 항체의 저분자량 종을 용출시키고, A280nm가 약간 증가하고 로딩물의 절반인 유속과 세척 1 유속(분당 6.2에서 3.1L로 유속 감소) 하에 약 1 컬럼 용적으로 안정화시킨 후 수행한다. 응집물은 컬럼의 페닐 수지에 결합하고 항체가 용출할 때 0.5M 황산암모늄 완충액 기준에서 용출하지 않음으로써 제거했다.
Figure pct00009
Figure pct00010
바이러스 여과
HIC 단계의 페닐 용출액은 Ultipor DV50™ 바이러스 제거 여과 단계를 이용해 여과했다. Ultipor DV50™ 단계는 Phenyl Sepharose™ HP 컬럼 용출액에 존재할 수 있는 직경 ≥50nm인 우발적 바이러스의 물리적 제거를 제공한다.
소수성 상호작용 컬럼 용출액은 예비-함습된 0.1 ㎛ 필터와 2 x 30인치 Ultipor DV50™ 필터 트레인(Pall Corporation)을 통해 ≤34 psig에서 통과시켰다. 여과 후, 필터는 HIC 용출 완충액으로 플러싱하여 필터 하우징에 남은 임의의 ABT-874를 제거했다. Ultipor DV50™ 여과액은 최종 UF/DF 제형화 단계 전에 12℃±2℃인 예비멸균 탱크에 보관했다.
DV50™ 여과 단계의 산물 회수 수율은 97%부터 102% 범위였고 다양한 샘플 실험의 평균 수율은 100%였다(표 12 및 13 참조). 5가지 샘플 로트에서 총 20.99kg의 항체 산물이 프로세싱되었다.
Figure pct00011
Figure pct00012
최종 한외여과 / 정용여과 ( UF / DF ):
최종 UF/DF 단계는 항체의 농축, 황산암모늄 제거 및 5mM 히스티딘, 5mM 메티오닌, 2% 만니톨, 0.5% 수크로오스, 0.005% Tween 80, pH 5.9 중의 항체 산물의 제형화이었다. 이 단계에 분자량 컷오프(MWCO)가 30kD인 밀리포어 코포레이션 재생 셀룰로스 한외여과형 막 카세트를 사용했다.
Ultipor DV50™ 여과액은 30g/L 단백질로 농축했다. 2 용적의 5mM 메티오닌, 2% 만니톨, 0.5% 수크로오스, pH 5.9 완충액(Tween 없이)을 이용한 연속 정용여과를 수행했다. 그 다음, 산물을 40g/L로 농축했고, 이 때 대부분의 황산암모늄이 제거되었다. 5mM 메티오닌, 2% 만니톨, 0.5% 수크로오스, pH 5.9 완충액(Tween 없이)의 6 용적을 이용한 연속 정용여과를 수행했다. 이러한 6 정용용적 교환이 끝난 후, 항체는 75g/L로 농축되었다. 그 다음, UF 시스템은 산물을 배출했고, 이 시스템에 남은 산물을 회수하기 위해 정용여과 완충액으로 세정했다. 농축액과 세척액을 합하여, 정용여과된 ABT-874를 수득했고, 이어서 추가 제형화 완충액으로 ≥65 g/L로 조정했다. 표적 농도가 확인되면, 약물 중의 최종 Tween 80 농도가 0.005%(v/v)가 되도록 농축된 UF 잔류물에 첨가해야 하는 10% Tween 80을 함유하는 제형화 완충액을 양을 측정하기 위해 계산했다. 제형화된 약물의 최종 농도는 ≥65g/L였다. 항체 샘플은 멸균 용기 내에서 OpticalXLT30™ 캡슐 2.0/1.2㎛ 필터와 그 다음 0.45/0.2㎛ Sartopore™ 이중층 필터를 통해 여과한 뒤, 마지막으로 병에 채우기 위한 준비로 Class 100 구역으로 옮겼다.
UF/DF 단계 후 산물 회수 수율은 5회 실험에서 94% 내지 100% 범위였고 평균 수율은 97.0%였으며 표준편차는 2.22였다(표 14 및 15 참조). 이러한 최종 UF/DF 마직막에 항체 산물은 총 20.51kg이었다. 전체적으로, UF/DF 여과 단계는 실험마다 매우 일정했다. 컷오프가 30kD인 막의 사용은 컷오프 10kD인 막보다 수율의 손해없이 프로세싱 시간을 단축시켰다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
2. 항- IL -12 항체 조성물 중의 숙주 세포 단백질 농도의 측정
본 절차는 항-IL-12 항체 샘플에 잔류하는 숙주 세포 단백질 농도를 측정하는 검사 방법론을 설명하는 것이다. 효소 면역분석법(ELISA)은 특정 항체의 2 층 사이에 숙주 세포 단백질(항원)을 중첩시키기 위해 이용했다. 그 다음, 카세인으로 비특이적 부위를 차단시켰다. 그 다음, 숙주 세포 단백질은 항온처리했고, 그 동안 항원 분자가 제1 항체(코팅 항체)에 의해 포획된다. 그 다음, 제2 항체(비오티닐화된 항-숙주 세포 단백질)를 첨가하여 항원(숙주 세포 단백질)에 고정시킨다. 그 다음, 비오티닐화된 항-숙주 세포 단백질에 결합하는 HRP-접합된 뉴트라비딘을 첨가한다. 그 다음, K 블루 기질을 첨가한다. 발색원성 기질은 결합된 효소 접합 항체에 의해 가수분해되어 청색을 나타낸다. 반응은 2M H3PO4으로 정지시켰고, 색이 황색으로 변했다. 색 강도는 웰에 결합된 항원의 양에 정비례한다.
50mM 중탄산나트륨(코팅 완충액), pH 9.4의 제조. 1L 비커에 900ml Milli-Q 물; 4.20g ± 0.01g 중탄산나트륨을 첨가했다. 완전히 용해될 때까지 교반한다. pH를 1N NaOH로 9.4로 조정한다. 1L 용적 플라스크로 옮기고 Milli-Q 물로 용적을 맞춘다. 균질해질 때까지 뒤집어가며 혼합한다. 0.22 ㎛ 멸균 필터 유닛을 통해 여과한다. 제조일까지 최장 7일 동안 공칭 4℃에서 보관한다.
0.104 M Na2HPO4*7H2O, 1.37M NaCl, 0.027M KCl, 0.0176M KH2PO4, pH = 6.8-6.9(10X PBS)의 제조. 약 400ml의 Milli-Q 물을 유리 비커에 첨가한다. Na2HPO4 x 7H2O 13.94g ± 0.01g을 첨가한다. 40.0g ± 0.1g의 NaCl을 첨가한다. KCl 1.00g±0.01g을 첨가한다. KH2PO4 1.20g±0.01g을 첨가한다. 균질해질 때까지 교반한다. 500ml 용적 플라스크로 옮긴다. Milli-Q 물로 500ml 용적으로 QS한다. 뒤집어 혼합한다. 0.2 ㎛ 멸균 필터 유닛을 통해 여과한다. 실온에서 최장 7일 동안 보관한다.
1X PBS + 0.1% Triton X-100, pH 7.40: (플레이트 세척 완충액)의 제조. 4L 눈금 실린더에서 10X PBS(단계 5.2) 400ml와 Milli-Q 물 3500ml를 혼합한다. pH를 검사하고, 필요하면 1N HCl 또는 1N NaOH로 7.40±0.05으로 조정한다. 용적을 Milli-Q 물로 맞춘다. 실린더를 파라필름으로 밀봉하고 균질해질 때까지 뒤집어 혼합한다. 4L 병으로 옮긴다. 1X PBS 4ml를 제거해서 버린다. 트리톤 X-100 4ml를 1X PBS 3996ml에 첨가한다. 교반 플레이트에 놓고 교반하여 완전 용해시킨다. 희석 완충액 제조에 필요한 플레이트 세척 완충액의 양을 0.22 ㎛ 멸균 필터 유닛을 통해 여과한다. 실온에서 최장 7일 동안 보관한다.
코팅 항체 혼합물: 염소 항 CHO 599/626/748(lot #G11201@1.534 mg/ml), (친화성 정제됨)의 제조: 주의: 스톡(stock)은 바이알에서 공칭 -80℃에서 보관한다. 분취량을 제조한다. 사용 시에 플레이트당 1 분취량씩 취한다. 사용 직전에, 항체 혼합물을 다음과 같이 저온의 50mM 중탄산나트륨에 최종 농도가 4 ㎍/ml가 되도록 희석한다. 예를 들어: 31 ㎕ 코팅 항체 혼합물을 11969 ㎕ 저온 코팅 완충액에 첨가한다. 뒤집어 서서히 혼합한다.
비오티닐화된 염소 항 숙주 세포 단백질 혼합물, 599/626/748(lot#G11202@0.822 mg/ml)의 제조: 주의: 스톡은 바이알에서 공칭 -80℃에서 보관한다. 분취량을 제조한다. 사용 시에 플레이트당 1 분취량씩 취한다. 사용 직전에, 비오티닐화된 항체 혼합물을 다음과 같이 37℃±2℃ 카세인에 최종 농도가 1 ㎍/ml가 되도록 희석한다. 예를 들어, 14.6 ㎕ 비오티닐화된 항체 혼합물을 11985 ㎕ 37℃±2℃ 카세인에 첨가한다. 뒤집어 서서히 혼합한다.
뉴트라비딘-HRP의 제조. 새로운 로트(2mg/바이알)를 다음과 같이 1mg/ml로 복원시킨다: 바이알에 400㎕ Milli-Q 물을 바이알에 첨가한 뒤, 1600㎕ 1X PBS를 총 2ml가 되게 첨가한다. 서서히 볼텍싱하여 혼합한다. 공칭 -20℃에서 보관한다. 플레이트당 1 분취량이 사용되도록 바람직한 용적의 분취량을 제조한다. 폴리프로필렌 관에 준비한다. 새 로트를 정량분석하여 작업 농도를 측정한다. 만료일이 제조일부터 6개월이도록 한다. 예를 들어, 작업 농도가 0.2㎍/ml인 것으로 측정되면 다음과 같이 제조한다. 사용 직전에, 뉴트라비딘-HRP 분취량을 실온에서 해동한다. 1mg/ml 뉴트라비딘 용액을 0.1mg/ml(100㎍/ml)이 되도록 37℃±2℃ 카세인으로 희석한다. 예를 들어, X10 희석 시, 뉴트라비딘 50㎕를 카세인 450㎕에 첨가한다. 서서히 볼텍싱하여 혼합한다. 다시, 100㎍/ml 용액을 37℃±2℃ 카세인으로 0.2 ㎍/ml로 희석한다. 예를 들어, X500 희석 시, 뉴트라비딘(100㎍/ml) 24㎕를 카세인 11976㎕에 첨가한다. 서서히 볼텍싱하여 혼합한다.
5.7 2M 인산(종결 용액)의 제조. 진한 인산으로부터 2M 인산 용액을 다음과 같이 제조한다. 라벨에 표시된 인산%, 밀도(1.685g/ml) 및 화학식량(98g/mol)으로부터, 2M 인산 500ml를 제조하는데 필요한 진한 인산의 용적을 계산한다. 상기 계산된 진한 인산의 용적을 플라스크에 첨가한다. Milli-Q 물로 용적을 채우고 뒤집어 균질하게 혼합한다. 제조일부터 최장 6개월 동안 상온에서 보관한다.
희석 완충액(1X PBS에 X100 희석된 카세인 + 0.1% Triton X100, pH 7.4)의 제조. 0.22 ㎛ 멸균 여과된 1X PBS + 0.1% Triton X100, pH 7.4(상기 참조)에 37℃±2℃ 카세인을 X100 희석한다. 예를 들어, 37℃±2℃ 카세인 1ml를 99ml 0.22 ㎛ 멸균 여과된 1X PBS + 0.1% Triton X100, pH 7.4에 첨가한다. 잘 혼합한다. 사용시마다 새로 제조한다.
표준물질의 제조. 숙주 세포 단백질 표준물질(항원 표준물질)(로트 # G11203@1.218 mg/ml): 주의: 스톡은 공칭 -80℃에서 70 ㎕ 분취량으로 보관한다. 분취량을 실온에서 해동한다. 폴리프로필렌 관에 희석 완충액을 이용해 연속 희석을 수행한다.
샘플의 제조. 폴리프로필렌 관에서 최종 벌크 샘플을 희석 완충액에 24mg/ml로 희석한다. 농도를 기록한다. 주의: 스파이크 첨가된 샘플을 제조하고 이하에 언급된 12 mg/ml 용액을 제조하기 위해 이하 용액을 사용한다. 폴리프로필렌 마이크로관에서, 24mg/ml 용액을 12mg/ml로 희석 완충액으로 추가 희석한다. 12mg/ml 용액을 각각 플레이트 상의 웰에 3반복으로 총 6개 웰에 로딩한다.
스파이크의 제조. 폴리프로필렌 마이크로관에서, 위에서 제조한 20ng/ml 표준물질을 희석 완충액으로 2X 희석하여 10ng/ml 숙주 세포 단백질 스파이크를 제조한다. 플레이트 상의 3 웰에 10ng/ml 스파이크 용액을 로딩한다. 스파이크 첨가된 샘플을 위해 단계 6.1의 20ng/ml 표준 용액을 사용한다.
스파이크 첨가된 샘플의 제조. 폴리프로필렌 마이크로관에서, 각 24mg/ml 최종 벌크 용액 300 ㎕에 20ng/ml 스파이크 용액(6.1) 300 ㎕를 첨가한다. 각각 스파이크 첨가된 샘플 용액마다 3반복으로 총 6개 웰에 로딩한다.
대조군의 제조. 대조군 범위는 통상적인 검사에 사용하기 전에 새로운 대조군 스톡 용액마다 설정해야 한다. 대조군 스톡: ABT-874 약물 농축액 배치 150㎕ 분취량을 제조하고 최장 3년 동안 공칭 -80℃에서 동결 보관한다.
작업 대조군의 제조. 실온에서 대조군 분취량을 해동한다. 폴리프로필렌 관에서, 대조군을 희석 완충액으로 24mg/ml로 희석한다. 폴리프로필렌 마이크로관에서, 24mg/ml 대조 용액을 다시 희석 완충액으로 12mg/ml로 희석한다. 단일 희석물을 제조하고 대조군을 플레이트의 3 웰에 로딩한다.
ELISA 절차. 플레이트 세척 병을 플레이트 세척 완충액(단계 5.3 참조, 1X PBS + 0.1% Triton X-100)으로 충전한다. 플레이트 세척기를 준비한다. 다음과 같은 파라미터를 점검한다: 파라미터는 플레이트 종류: 각 사이클당 1개씩(총 5 사이클): 용적: 400㎕; 침지 시간: 10초; Asp. 시간: 4초.
분석 절차. 플레이트를 저온 50mM 중탄산나트륨 중의 4㎍/ml 염소 코팅 항체 혼합물 100㎕/웰로 코팅한다. 코팅 용액이 웰 바닥을 균일하게 덮을 때까지 플레이트의 옆면을 톡톡 치고, 봉인 테이프로 덮고 플레이트 진탕기(또는 이의 등가물)에서 속도 3 하에 18시간 ± 1시간 동안 진탕시키면서 공칭 4℃에서 항온처리한다. 밤새 항온처리한 후, 플레이트를 냉장고에서 꺼내어 실온까지 평형화시킨다. 코팅액을 털어낸다. 플레이트를 종이 타월로 수분을 제거한다. 37℃±2℃ 카세인 300 ㎕/웰로 차단하고, 봉인 테이프로 덮은 다음, 랩-라인 엔비론(Lab-line Environ) 플레이트 진탕기(또는 등가물)에서 80 rpm ± 5 rpm으로 1시간 동안 진탕하면서 37℃±2℃에서 항온처리한다. 차단 항온처리 동안 표준물질, 샘플, 대조군, 스파이크 및 스파이크 첨가된 샘플을 제조한다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척한다. 플레이트를 종이 타월로 수분을 제거한다. 8 채널 피펫으로, 플레이트의 웰에 3반복으로 표준물질, 샘플, 스파이크, 스파이크 첨가된 샘플 및 대조군을 100 ㎕/웰씩 피펫팅한다. 희석 완충액 100 ㎕/웰을 평편의 빈 웰에 모두 피펫팅하여 블랭크로 한다. 봉인 테이프로 덮어 랩-라인 엔비론 플레이트 진탕기(또는 등가물)에서 80 rpm ± 5 rpm으로 1시간 동안 진탕하면서 37℃±2℃에서 항온처리한다. 플레이트 로딩 시까지 가이드로 사용할 주형을 채운다.
플레이트 판독기 셋업. 표준물질에 대한 농도를 입력하고 주형을 셋업한다. 샘플, 대조군, 스파이크 또는 스파이크 첨가된 샘플에 대한 희석율은 입력하지 않는다. 블랭크로서 희석제를 함유하는 웰을 모든 웰에서 비워둔다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척한다. 플레이트를 종이 타월로 수분을 제거한다. 100 ㎕/웰 비오티닐화된 염소 항체를 첨가한다. 봉인 테이프로 덮어 랩-라인 엔비론 플레이트 진탕기(또는 등가물)에서 80 rpm ± 5 rpm으로 1시간 동안 진탕하면서 37℃±2℃에서 항온처리한다. 플레이트를 체거 완충액으로 5회 세척한다. 종이 타월로 플레이트의 수분을 제거한다. 100 ㎕/웰 뉴트라비딘-HRP 접합체 용액을 첨가한다. 봉인 테이프로 덮어 랩-라인 엔비론 플레이트 진탕기(또는 등가물)에서 80 rpm ± 5 rpm으로 1시간 동안 진탕하면서 37℃±2℃에서 항온처리한다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척한다. 플레이트를 종이 타월로 수분을 제거한다. 저온 K-블루 기질 100 ㎕/웰를 첨가하고, 봉인 테이프로 덮고 랩-라인 역가 플레이트 진탕기(또는 등가물)에서 속도 3으로 진탕하면서 실온에서 10분 동안(기질이 첫줄에 첨가되자마자 타이머를 작동시킨다) 항온처리한다. 100 ㎕/웰 2M 인산(단계 5.7)을 첨가하여 반응을 정지시킨다. 플레이트를 플레이트 진탕기에서 속도 3으로 3 내지 5분 동안 진탕한다. 플레이트를 450nm에서 판독한다.
데이터 분석 및 계산. 주의: 광학 밀도가 표준 곡선의 실제 정량 한계(2.5 ng/ml 표준물질) 내에 속하고 이하에 기술된 CV% 또는 차별 기준%에 부합하는, 샘플, 스파이크, 스파이크 첨가된 샘플 및 대조군만 해당된다. 샘플의 OD가 2.5 ng/ml 표준물질 이하이면, 결과는 2.5ng/ml 미만으로 기록해야 한다. 그 다음, 이 값은 희석된 샘플 농도(12mg/ml)로 나누어 ng/ml 값으로 기록해야 한다. 샘플이 숙주 세포 농도가 높아, 스파이크 첨가되지 않은 샘플 및/또는 스파이크 첨가된 샘플을 표준 곡선 이상이 되게 하면 값을 >100ng/ml로 기록한다. 그 다음, 이 값은 희석된 샘플 농도(12mg/ml)로 나누어 ng/ml 값으로 기록해야 한다. 샘플이 2.5ng/ml 표준물질 미만이면 스파이크 회수율 계산 시 0 값으로 간주한다.
표준 곡선. 표준 농도는 프로토콜 주형에 입력해야 한다. 2차 방정식 곡선 적합을 사용한다. 결정 계수는 0.99이어야 하고 3반복 웰 간에 CV%는 20%이어야 한다. 이 기준이 충족되지 않으면, 하나의 표준물질(1 레벨, 3웰)은 탈락시킬 수 있다. 1.25ng/ml가 탈락되면, 광학 밀도가 2.5 ng/ml와 100 ng/ml(나머지 표준 곡선 점) 내에 속하는 샘플과 스파이크 첨가된 샘플만이 사용된다. 또한, 각 표준 레벨의 3반복 실험에서, 한 웰이 분명히 오염되거나 낮은 결합률을 보이면, 탈락시킬 수 있다. 표준 레벨에서 웰이 탈락되면, 나머지 반복물은 차등률%이 20%이어야 한다. OD 값이 플레이트의 배경(블랭크)에 가까운 가장 낮은 표준물질의 CV%는 30%이어야 한다. 한 웰이 탈락되면, 나머지 반복물의 차등률%이 35%이어야 한다. 가장 낮은 표준물질이 탈락되면, 나머지 표준 곡선 레벨 내에 속하는 광학밀도를 가진 샘플과 스파이크 첨가된 샘플이 사용된다.
샘플. CV%는 3반복 웰간에 20%이어야 한다. 3반복 웰 간에 CV%를 기록한다. 각 샘플 희석물로부터 한 웰을 탈락시킬 수도 있다. 나머지 반복물은 차등률이 20%이어야 한다. 주의: 스파이크 첨가되지 않은 샘플의 OD가 2.5 ng/ml 표준 OD 미만이면, 차등률% 기준은 스파이크 첨가되지 않은 결과에 적용하지 않는다. 상기 계산을 참고한다.
평균(ng/ml) 값으로부터 실제 숙주 세포 농도(ng/ml)를 다음과 같이 계산한다: CHO 숙주 세포 단백질(ng/ml) = 평균 "스파이크 첨가되지 않은 샘플 결과(ng/ml)" - 희석된 샘플 농도(12mg/ml).
스파이크. CV%는 3반복 웰 간에 20%이어야 한다. CV%를 기록한다. 스파이크로부터 한 웰을 탈락시킬 수도 있다. 나머지 점들은 차등률%이 20%이어야 한다. 상기 계산을 참고한다. 숙주 세포 농도(ng/ml)를 기록한다. 이 결과는 스파이크 회수율 계산에 사용될 것이다. 스파이크의 최종 농도(ng/ml)는 이론적 스파이크 농도의 ±20%이어야 한다. 결과를 기록하고 통과 또는 실패로 표시한다. 스파이크 결과가 이론값의 20% 이내가 아니면, 분석을 반복해야 한다. 평균 스파이크 농도(ng/ml) x 100 = 100%±20% 10ng/ml이어야 한다.
스파이크 첨가된 샘플. CV%는 3반복 웰 간에 20%이어야 한다. 3반복 웰 간에 CV%를 기록한다. 각 스파이크 첨가된 샘플 희석물의 한 웰을 탈락시킬 수 있다. 나머지 반복물의 차등률%은 20%이어야 한다. 상기 계산을 참고한다. 각 희석물의 "스파이크 첨가된 샘플 결과"(ng/ml)를 보고한다. 2반복 희석물 간에 차등률%을 기록한다. 희석물 간에 차등률%은 25%이어야 한다. 이 결과는 스파이크 회수율 계산에 사용될 것이다.
각 희석 세트마다 스파이크 회수율%을 다음 식에 따라 계산한다: 스파이크 회수율% = 스파이크 첨가된 샘플 값 - 스파이크 첨가되지 않은 샘플 값 X 100 스파이크 값. 주의: (1) 스파이크 첨가되지 않은 샘플 값의 OD가 2.5ng/ml 표준물질 미만이면, 스파이크 회수율% 계산에서 0으로 간주한다. 스파이크 회수율%은 각 샘플의 각 희석물마다 100%±50%(50%-150%)이어야 한다. 결과를 기록하고 통과/실패로 표시한다.
대조군. CV%는 3반복 웰 간에 20%이어야 한다. CV% 결과를 기록한다. 대조군의 한 웰을 탈락시킬 수 있다. 나머지 반복물은 차등률%이 20%이어야 한다. 상기 계산을 참고한다. 대조군의 숙주 세포 농도(ng/ml)를 기록한다. 숙주 세포 농도(ng/mg)는 다음과 같이 계산한다: 숙주 세포 단백질(ng/mg) = 대조군 숙주 세포 단백질 결과(ng/ml).
본 명세서에는 다양한 공개문헌들이 인용되며, 그 내용들은 전문이 참조로서 인용된다.

Claims (43)

  1. 항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 샘플 매트릭스의 pH를 3 내지 4로 감소시켜 1차 회수 샘플을 형성시키고;
    (b) 상기 1차 회수 샘플을 pH 약 4.5 내지 6으로 조정한 후, 상기 1차 회수 샘플을 이온 교환 수지에 공급하여 이온 교환 샘플을 수집하고;
    (c) 상기 이온 교환 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지에 공급하여 상기 HCP-감소된 항체 제제를 포함하는 HIC 샘플을 수집함을 포함하는,
    항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 pH 감소가 상기 샘플 혼합물과 적당한 산의 혼합에 의해 수행되고, 상기 적당한 산은 시트르산, 아세트산, 카프릴산 등으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 수지가 음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 이온 교환 수지가 양이온 교환 수지인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지가 카르복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지가 카르복시메틸인, 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 이온 교환 수지가 음이온 교환 수지인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지가 큐 세파로스(Q sepharose), 디에틸아미노에틸(DEAE), 4급 아미노에틸(QAE) 및 4급 아민(Q) 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지가 큐-세파로스인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 단계가 1차 이온 교환 단계와 2차 이온 교환 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 1차 이온 교환 단계는 양이온 교환 단계이고, 그 다음은 2차 음이온 교환 단계인, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 1차 이온 교환 단계와 상기 2차 이온 교환 단계 사이에 수행되는 여과 단계인 중간 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 여과 단계가 포획 한외여과/정용여과에 의해 수행되는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 HIC가 하나 이상의 소수성 그룹을 포함하는 컬럼을 사용하여 수행되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 소수성 그룹이 알킬-, 아릴-그룹 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 컬럼이 페닐 세파로스(예를 들어, Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow 컬럼, Phenyl Sepharose™ High Performance 컬럼), Octyl Sepharose™ High Performance 컬럼, Fractogel™ EMD Propyl, Fractogel™ EMD Phenyl 컬럼, Macro-Prep™ Methyl, Macro-Prep™ t-Butyl Support, WP HI-Propyl(C3)™ 컬럼, 및 Toyopearl™ Ether, Phenyl 또는 Butyl 컬럼으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 컬럼이 페닐 세파로스를 포함하는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 여과 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 HIC 샘플이 바이러스 입자 제거 및 완충액 교환 촉진을 위해 여과 처리되는, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 HCP-감소된 항체 제제가 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부가 사람화된 항체, 키메라 항체 또는 다가 항체인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부가 사람화된 항체인, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부가 표면 플라스몬 공명으로 측정한 바에 의하면 약 1 x 10-8 M 이하의 Kd 및 약 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 IL-12로부터 해리되는 분리된 사람 항체인, 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부가 생체내 및 시험관내에서 모두 IL-12를 중화시키는, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 제제가 실질적으로 HCP를 포함하지 않는, 방법.
  25. 항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 샘플 매트릭스의 pH를 약 3.5로 감소시켜 1차 회수 샘플을 형성시키고;
    (b) 상기 1차 회수 샘플을 pH 약 4.9로 조정한 후, 상기 1차 회수 샘플을 양이온 교환 수지에 공급하여 양이온 교환 샘플을 수집하고;
    (c) 상기 양이온 교환 샘플을 음이온 교환 수지에 공급하여 음이온 교환 샘플을 수집하고;
    (d) 상기 음이온 교환 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지에 공급하여 상기 HCP-감소된 항체 제제를 포함하는 HIC 샘플을 수집함을 포함하는,
    항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 생산하는 방법.
  26. 항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 샘플 매트릭스의 pH를 약 3.5로 감소시켜 1차 회수 샘플을 형성시키고;
    (b) 상기 1차 회수 샘플을 pH 약 4.9로 조정한 후, 상기 1차 회수 샘플을 양이온 교환 수지에 공급하여 양이온 교환 샘플을 수집하고;
    (c) 상기 양이온 교환 샘플을 여과 처리하여 여과액을 수집하고;
    (d) 상기 (c)의 여과액을 음이온 교환 수지에 공급하여 음이온 교환 샘플을 수집하고;
    (e) 상기 음이온 교환 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지에 공급하여 상기 HCP-감소된 항체 제제를 포함하는 HIC 샘플을 수집함을 포함하는,
    항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 생산하는 방법.
  27. 제1항에 따른 방법에 의해 생산된 HCP-감소된 항체 제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항체가 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부인, 약제학적 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 상기 조성물이 실질적으로 HCP를 포함하지 않는, 약제학적 조성물.
  30. 제27항에 있어서, IL-12에 의해 촉진된 장애를 중화시키는데 사용되는, 약제학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 장애가 류마티스성 관절염, 골관절염, 연소성 만성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 크론 질환, 궤양 대장염, 장 염증 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 피부경화증, 아토피성 피부염, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브스병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇤라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전증, 심근경색, 애디슨병, 산발성 다분비선 제I형 결핍증 및 다분비선 제II형 결핍증, 슈미트 증후군, 성인성(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청반응 음성 관절증, 관절증, 라이터병, 건선성 관절증, 궤양성 대장염성 관절증, 장병증성 관절병증, 클라미디아증, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절증, 척추관절증, 죽종 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 연소성 악성 빈혈, 근통성 뇌염/로얄 프리(Royal Free) 질환, 만성 점막 피부 칸디다증, 거세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질환, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 감마글로불린저혈증), 확장형 심근증, 여성 불임증, 난소 부전증, 조숙 난소부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유조직 폐포염, 후-염증성 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 복합 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련 폐 질환, 쇼그렌 질환 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염 미만성 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 방사선 섬유증, 폐색성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(전형적 자가면역 또는 루포이드 간염), 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 극세포증에 따른 B형 인슐린 내성, 부갑상선 기능저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원판양 홍반성 낭창, 남성 불임증 특발증 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 인슐린 의존성 진성당뇨병, 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압증, 굿패스처 증후군, 결절성 다발성 동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 열, 류마티스성 척추염, 스틸씨 병, 전신성 경화증, 다카야스 병/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능항진증, 갑상선종성 자가면역 갑상선 기능저하증(하시모토 병), 위축성 자가면역 갑상선 기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증 및 자가면역 질환, 특히 염증 관련 질환, 예를 들어 류마티스성 척추염, 알레르기, 자가면역 당뇨병 및 자가면역 포도막염으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  32. 제27항에 있어서, 비스테로이드성 또는 스테로이드성 항염증 약물을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 비스테로이드성 항염증 약물을 포함하는, 약제학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 비스테로이드성 항염증 약물이 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  35. 제32항에 있어서, 스테로이드성 항염증 약물을 포함하는, 약제학적 조성물.
  36. 제27항에 있어서, 하나 이상의 다른 항체 또는 이의 항원결합부를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  37. 제27항에 있어서, 약제(pharmaceutical agent)를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 약제가 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린 설파살라진, 메살라진, 올살라진 클로로퀴닌/하이드록시클로로퀸, 펜실라민, 오로티오말레이트, 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드, β-2 아드레날린수용체 작용제(살부타몰, 터부탈린, 살메테랄), 크산틴(테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 작용제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, 염증촉진성 사이토킨, 예를 들어 TNF-α 또는 IL-1에 의한 시그널 전달을 방해하는 제제(예: IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환효소 억제제(예: Vx740), 항-P7, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TNFα 전환효소(TACE) 억제제, T-세포 시그널링 억제제, 예를 들어 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예: 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체 및 유도체 p75TNFRIgG(Enbrel™) 및 p55TNFRIgG(Lenercept), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)) 및 항염증 사이토킨(예: IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  39. 제1항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCP-감소된 항체 제제가 하나 이상의 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부를 포함하고 표지화되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 표지가 방사성인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 방사성 표지가 125I, 131I, 35S 및 3H로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 표지가 비-방사성인, 방법.
  43. 제1항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCP-감소된 항체 제제가 하나 이상의 항-IL-12 항체 또는 이의 항원결합부를 포함하고 페길화되는, 방법.
KR1020117011046A 2008-10-20 2009-10-20 Ｉｌ-12에 결합하는 항체 및 이의 정제 방법 KR20110093799A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19675208P 2008-10-20 2008-10-20
US61/196,752 2008-10-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20110093799A true KR20110093799A (ko) 2011-08-18

Family

ID=41835705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117011046A KR20110093799A (ko) 2008-10-20 2009-10-20 Ｉｌ-12에 결합하는 항체 및 이의 정제 방법

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20100111853A1 (ko)
EP (1) EP2346898A2 (ko)
JP (1) JP2012506384A (ko)
KR (1) KR20110093799A (ko)
CN (1) CN102257004A (ko)
AU (1) AU2009307735B2 (ko)
BR (1) BRPI0919547A2 (ko)
CA (1) CA2739455A1 (ko)
IL (1) IL211866A0 (ko)
MX (1) MX2011004198A (ko)
NZ (2) NZ603619A (ko)
RU (1) RU2011120178A (ko)
SG (1) SG195573A1 (ko)
TW (1) TW201024319A (ko)
WO (1) WO2010048190A2 (ko)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010048192A2 (en) 2008-10-20 2010-04-29 Abbott Laboratories Viral inactivation during purification of antibodies
MX2011004200A (es) 2008-10-20 2011-05-24 Abbott Lab Aislamento y purificacion de anticuerpos usando la cromatografia de afinidad de proteina a.
WO2011028962A1 (en) * 2009-09-04 2011-03-10 Xoma Technology Ltd. Antibody coformulations
GB201012603D0 (en) * 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Protein purification
US20120264920A1 (en) * 2010-10-11 2012-10-18 Abbott Laboratories Processes for purification of proteins
JP6077461B2 (ja) * 2011-01-04 2017-02-08 ウニヴェルズィテート チューリッヒ アルツハイマー病の予防又は治療のためのｉｌ−１２及び／又はｉｌ−２３のモジュレーター
CA2873647A1 (en) * 2012-05-14 2013-11-21 Ole Elvang Jensen Stabilised protein solutions
CN102757496B (zh) * 2012-06-07 2014-06-18 山东泉港药业有限公司 一种抗vegf抗体片段的纯化制备方法
KR102571391B1 (ko) 2013-09-13 2023-08-29 제넨테크, 인크. 정제된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 방법 및 조성물
WO2015038884A2 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for detecting and quantifying host cell protein in cell lines and recombinant polypeptide products
WO2015057910A1 (en) 2013-10-16 2015-04-23 Oncobiologics, Inc. Buffer formulations for enhanced antibody stability
WO2015166072A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of proteins using caprylic acid
WO2016118707A1 (en) 2015-01-21 2016-07-28 Oncobiologics, Inc. Modulation of charge variants in a monoclonal antibody composition
US20170065731A1 (en) * 2015-09-06 2017-03-09 Medical Theranostics Inc. Method, Apparatus, and System for Radiation Therapy
US11285210B2 (en) 2016-02-03 2022-03-29 Outlook Therapeutics, Inc. Buffer formulations for enhanced antibody stability
RU189938U1 (ru) * 2018-12-29 2019-06-11 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Вятский государственный университет" (ВятГУ) Автоодеяло
AU2020334055A1 (en) * 2019-08-19 2022-03-10 Wayne State University In vivo immunoimaging of interleukin-12
CN115624553B (zh) * 2022-10-24 2024-08-23 华南理工大学 氨茶碱在制备激活原始卵泡的药物中的应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5429746A (en) * 1994-02-22 1995-07-04 Smith Kline Beecham Corporation Antibody purification
US5853714A (en) * 1995-03-27 1998-12-29 Genetics Institute, Inc. Method for purification of IL-12
PT936923E (pt) * 1996-11-15 2004-04-30 Kennedy Inst Of Rheumatology Supressao de tnfalfa e il-12 em terapia
US6955917B2 (en) * 1997-06-20 2005-10-18 Bayer Healthcare Llc Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies
US6914128B1 (en) * 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
EP1257585A2 (en) * 2000-02-10 2002-11-20 Basf Aktiengesellschaft Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using
US6902734B2 (en) * 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
BRPI0214168B8 (pt) * 2001-11-14 2021-05-25 Centocor Inc anticorpos anti-il-6, moléculas de ácido nucleico codificando os mesmos, vetores compreendendo as referidas moléculas, composições e formulações compreendendo os referidos anticorpos, bem como métodos de produção dos mesmos
US20040092719A1 (en) * 2002-09-17 2004-05-13 Eszter Birck-Wilson Isolation of immunoglobulin molecules that lack inter-heavy chain disulfide bonds
US8728828B2 (en) * 2004-12-22 2014-05-20 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Purification of immunoglobulins
KR20150006085A (ko) * 2006-04-05 2015-01-15 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 항체 정제
MX2009002014A (es) * 2006-08-28 2009-03-09 Ares Trading Sa Proceso para la purificacion de proteinas que contienen fc.
WO2008079280A1 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Millipore Corporation Purification of proteins

Also Published As

Publication number Publication date
EP2346898A2 (en) 2011-07-27
US20100111853A1 (en) 2010-05-06
CN102257004A (zh) 2011-11-23
BRPI0919547A2 (pt) 2015-12-08
NZ592096A (en) 2013-01-25
MX2011004198A (es) 2011-05-24
AU2009307735A1 (en) 2010-04-29
NZ603619A (en) 2014-05-30
AU2009307735B2 (en) 2014-12-04
IL211866A0 (en) 2011-06-30
WO2010048190A3 (en) 2010-06-17
TW201024319A (en) 2010-07-01
RU2011120178A (ru) 2012-11-27
CA2739455A1 (en) 2010-04-29
JP2012506384A (ja) 2012-03-15
WO2010048190A2 (en) 2010-04-29
SG195573A1 (en) 2013-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2514657C2 (ru) Способ получения препарата антитела против il-18 или его антигенсвязывающей части (варианты)
AU2009307735B2 (en) Antibodies that bind to IL-12 and methods of purifying the same
RU2551237C2 (ru) Инактивация вируса при очистке антител
TWI610936B (zh) 使用蛋白質ａ親和性層析進行抗體之分離及純化
AU2015201093A1 (en) Antibodies that bind to IL-12 and methods of purifying the same

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application