MX2011004200A

MX2011004200A - Aislamento y purificacion de anticuerpos usando la cromatografia de afinidad de proteina a.

Info

Publication number: MX2011004200A
Application number: MX2011004200A
Authority: MX
Inventors: Robert K Hickman; Qing Huang; Barbara Perilli-Palmer; Cheryl L Weed; Scott T Ennis; Min Wan
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 2008-10-20
Filing date: 2009-10-20
Publication date: 2011-05-24
Also published as: BRPI0920027A2; IL244157A0; AU2009347206B2; SG10201702922VA; KR20110091678A; TW201024318A; US20170158760A1; CA2738498A1; WO2010141039A1; US20100135987A1; US8895709B2; EP2350127B1; MX343087B; TWI610936B; JP5808249B2; US20160083452A1; ES2535734T3; AU2018203810A1; IL211918A; IL232601A0

Abstract

Se describen en la presente los métodos para el aislamiento y purificación de anticuerpos en donde el uso de una etapa cromatográfica de afinidad da lugar a una composición de anticuerpo suficientemente pura para usos farmacéuticos. Los métodos descritos en la presente comprenden la reducción/desactivación viral por pH, ultrafiltración/diafiltració n, cromatografía de afinidad, preferiblemente cromatografía de afinidad de proteína A, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía hidrofóbica. Además, la presente invención se dirige hacia las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos de la presente invención.

Description

AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE ANTICUERPOS USANDO LA CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD DE PROTEINA A Referencia Cruzada a la Solicitud Relacionada Esta Solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional Estadounidense Número de Serie 61/196,753, presentada el 20 de octubre de 2008, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

Antecedentes de la Invención Los procesos de purificación para anticuerpos monoclonales de grado farmacéutico producidos por cultivo de fermentación comúnmente implican cuatro etapas básicas. Estas etapas incluyen (1) cosecha/clarificación - separación de células hospedadoras del cultivo de fermentación; (2) captura -separación del anticuerpo de la mayoría de componentes en la cosecha clarificada; (3) purificación detallada - eliminación de los contaminantes y agregados residuales de la célula hospedadora; y (4) formulación - colocación del anticuerpo en un portador apropiado para obtener una estabilidad y vida útil máximas.

Sin embargo, estas etapas frecuentemente no dan lugar necesariamente a composiciones de anticuerpo de suficiente pureza para el uso en contextos farmacéuticos. Existe una presente necesidad de métodos para producir y purificar un anticuerpo de interés en forma suficientemente pura que será conveniente para el uso farmacéutico. La presente invención trata esta necesidad.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se dirige a los métodos para aislar y purificar anticuerpos de una matriz de muestra. En ciertos aspectos, la invención se dirige a los métodos de purificación de anticuerpo que utilizan la cromatografía de afinidad, preferiblemente la cromatografía de proteína A. En aspectos específicos, los métodos en la presente utilizan una etapa de desactivación de ácido, una etapa de cromatografía de afinidad, y una o más etapas adicionales de cromatografía y/o filtración. Las etapas de cromatografía pueden incluir uno o más etapas de cromatografía de intercambio iónico y/o cromatografía de interacción hidrofóbica. Además, la presente invención se dirige hacia las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos purificados por un método descrito en la presente.

Una modalidad o la presente invención se dirige hacia un método para purificar un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de una matriz de muestra tal que la composición de anticuerpo resultante esté sustancialmente libre de las proteínas de célula hospedadora ("HCP", por su abreviación en inglés). En un aspecto, la matriz de muestra (o simplemente "muestra") comprende una cosecha de línea celular en donde la línea celular se utiliza para producir los anticuerpos específicos de la presente invención. En un aspecto particular, la matriz de muestra se prepara de una línea celular usada para producir los anticuerpos anti-IL-12; en otro aspecto, la matriz de muestra se prepara de una línea celular usada para producir los anticuerpos anti-TNFa, y en otro aspecto la matriz de muestra se prepara de una línea celular usada para producir los anticuerpos anti-IL-18.

Un método de la presente invención implica someter una matriz de muestra que comprende el posible anticuerpo de interés o porción de unión a antígeno del mismo a un ajuste de pH. En un aspecto, el pH se ajusta a un pH ácido. Un ejemplo de un pH conveniente está entre aproximadamente un pH de 3 y 5, preferiblemente un pH de aproximadamente 3.5. Esta recuperación primaria se realiza, en parte, para reducir o desactivar los virus sensibles al pH. Además de reducir y/o desactivar los virus, las condiciones ácidas facilitan la eliminación de células y residuos celulares que forman así una muestra de recuperación primaria. Después de un periodo de tiempo conveniente, el pH se puede ajustar hacia un pH más neutral o básico y la muestra de recuperación primaria se somete a la cromatografía de afinidad, preferiblemente cromatografía de proteína A. En un aspecto, la muestra de cromatografía de afinidad se recolecta y adicionalmente se somete a las etapas cromatográficas subsecuentes tal como cromatografía interactiva de intercambio iónico e hidrofóbica.

En una modalidad, la etapa de cromatografía de afinidad comprende someter la muestra de recuperación primaria a una columna que comprende un soporte de cromatografía de afinidad conveniente. Los ejemplos no limitantes de tales soportes cromatográficos incluyen, pero no se limitan a resina de proteína A, resina de proteína G, soportes de afinidad que comprenden el antígeno contra el cual el anticuerpo de interés fue producido, y el soporte de afinidad comprende una proteína de unión de Fe. La resina de proteína A es útil para la purificación de afinidad y aislamiento de los anticuerpos (IgG). En un aspecto, una columna de proteína A se equilibra con una solución amortiguadora conveniente antes de cargar la muestra. Un ejemplo de una solución amortiguadora conveniente es una solución amortiguadora de Tris/NaCI, pH de aproximadamente 7.2. Después de este equilibrio, la muestra se puede cargar en la columna. Después de la carga de la columna, la columna se puede lavar una o múltiples veces usando, por ejemplo, la solución amortiguadora de equilibrio. Otros lavados que incluyen lavados que utilizan diversas soluciones amortiguadoras, se pueden utilizar antes de eluir la columna. La columna de proteína A se puede entonces eluir usando una solución amortiguadora de elución apropiada. Un ejemplo de una solución amortiguadora de elución conveniente es una solución amortiguadora de ácido acético/NaCI, pH de aproximadamente 3.5. El eluato se puede supervisar usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede continuar la absorbancia a OD2eo Las fracciones eluídas de interés entonces se pueden preparar para el procesamiento adicional.

En una modalidad, una etapa de intercambio iónico sigue a la cromatografía de afinidad de proteína A. Esta etapa de intercambio iónico puede ser de intercambio catiónico o aniónico o una combinación de ambos. Esta etapa puede ser un solo procedimiento de intercambio iónico o puede incluir múltiples etapas de intercambio iónico tal como una etapa de intercambio catiónico seguido por una etapa de intercambio aniónico o al contrario. En un aspecto, la etapa de intercambio iónico es un procedimiento de una etapa. En otro aspecto, la etapa de intercambio iónico implica un proceso de intercambio iónico de dos etapas. Una columna de intercambio catiónico conveniente es una columna cuya fase fija comprende grupos aniónicos. Un ejemplo de tal columna es una columna Fractogel™ S03. Esta etapa de cromatografía de captura de intercambio iónico facilita el aislamiento de los anticuerpos de una muestra. Una columna de intercambio aniónico conveniente es una columna cuya fase fija comprende grupos catiónicos. Un ejemplo de tal columna es una columna Q Sepharose™. Una o más etapas de intercambio iónico además aislan los anticuerpos reduciendo las impurezas tal como proteínas de célula hospedadora y ADN y, en caso pertinente, la proteína de matriz de afinidad. Este procedimiento de intercambio aniónico es un modo de flujo directo de cromatografía en donde los anticuerpos de interés no interactúan ni se unen a la resina de intercambio aniónico (o fase sólida). Sin embargo, muchas impurezas interactúan con y se unen a la resina de intercambio aniónico. En un aspecto particular, la etapa de intercambio iónico es la cromatografía de intercambio aniónico.

El eluato de cromatografía de afinidad es preparado para el intercambio iónico ajustando el pH y la resistencia iónica de la solución amortiguadora de muestra. Por ejemplo, el eluato de afinidad se puede ajustar a un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.5 en una solución amortiguadora de 1 M Tris. Antes de cargar la muestra (eluato de afinidad) en la columna de intercambio iónico, la columna se puede equilibrar usando una solución amortiguadora conveniente. Un ejemplo de una solución amortiguadora conveniente es una solución amortiguadora de Tris/NaCI con un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8. Después del equilibrio, la columna se puede cargar con el eluato de afinidad. Después de la carga, la columna se puede lavar una o más veces con una solución amortiguadora conveniente. Un ejemplo de una solución amortiguadora conveniente es la solución amortiguadora de equilibrio por sí mismo. La recolección de flujo directo puede comenzar, por ejemplo, mientras la absorbancia (OD2eo) se eleva por encima de aproximadamente 0.2 AU.

En ciertas modalidades, el presente método utiliza otra etapa. Esta etapa implica el uso de la cromatografía interactiva hidrofóbica ("HIC", por su abreviación en inglés). Una columna conveniente es una cuya fase fija comprende grupos hidrofóbicos.

Un ejemplo de tal columna es una columna Phenyl Sepharose™. Es posible que los anticuerpos de interés hayan formado agregados durante el proceso de aislamiento/purificación. Esta etapa de cromatografía hidrofóbica facilita la eliminación de estas agregaciones. También ayuda a la eliminación de impurezas. El procedimiento utiliza una solución amortiguadora con alto contenido de sal que promueve la interacción de los anticuerpos (o agregaciones de los mismos) con la columna hidrofóbica. La columna se eluye usando concentraciones más bajas de sal.

En otra modalidad, el eluato de HIC se filtra usando un filtro de eliminación viral tal como un filtro Ultipor DV20™. Este procedimiento separa las partículas virales del eluato de fenilo para reducir la cantidad de virus (si está presente) a los niveles seguros. Los filtros bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden utilizar en esta modalidad.

La pureza de los anticuerpos de interés en el producto de muestra resultante se puede analizar usando los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, cromatografía de exclusión de tamaño, análisis Poros™ A HPLC, ELISA HCP, ELISA de proteína A, y análisis Western Blot.

En aún otra modalidad, la invención se dirige a una o más composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo aislado o porción de unión a antígeno del mismo y un portador aceptable. En otro aspecto, las composiciones además comprenden uno o más agentes farmacéuticos.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 describe las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de un ejemplo no limitante de un anticuerpo anti-IL-12 (ABT-847).

La figura 2 describe las secuencias de cadena pesada y ligera de un ejemplo no limitante de un anticuerpo anti-IL-18 (ABT-325).

La figura 3 describe las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de un ejemplo no limitante de un anticuerpo anti-TNFa (Adalimumab).

La figura 4 representa un cromatógrama representativo de un biorreactor de 300 I que muestra la pureza de producto después de que la cromatografía de proteína A MabSelect™ fuera utilizada para capturar los anticuerpos anti-IL-12 y para reducir el producto y las impurezas relacionadas al proceso tal como fragmentos de cadena ligera simple y doble, proteínas de célula hospedadora CHO (HCP) y ADN, etc.

La figura 5 representa una evaluación de las condiciones de lavado MabSelect™.

La figura 6 es una fotografía de un gel de poliacrilamida de los precipitados obtenidos después de que un eluato de MabSelect™ fuera ajustado a pH 8 y a una conductividad de 7 mS/cm.

La figura 7 representa un perfil de lavado de flujo directo representativo de una columna de cromatografía Q Sepharose™ FF de escala de biorreactor de 300 I.

La figura 8 representa un perfil de elución representativo de una columna de cromatografía Phenyl Sepharose™ HP de escala de biorreactor de 300 I.

La figura 9 representa los resultados de un análisis dinámico de capacidad de unión donde ei punto de rendimiento de 10% para la resina MabSelect™ se identifica como 37.4 g de anticuerpo por litro de resina.

La figura 10 es una fotografía de un gel de poliacrilamida realizada para comparar las diferencias intermedias entre el proceso de proteína A y el proceso de AY-04. Se cargó 2 g de anticuerpo de cada muestra.

La figura 11 representa la producción de recuperación de MabSelect™ Adalimumab contra pH de Elutin. La figura demuestra que una producción de por lo menos 90% fue obtenida para un intervalo de pH de elución de 2.5 a 3.8 y una disminución significativa de la producción ocurre a pH 4.

La figura 12 representa los resultados de un análisis que compara la recuperación de monómero de Adalimumab contra el pH de elución y el tiempo de incubación.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se dirige a los métodos para aislar y purificar los anticuerpos de una matriz de muestra. Un aspecto de la invención se dirige a la reducción/desactivación viral de las muestras generadas en varias etapas de purificación de anticuerpo. En un aspecto particular, los métodos en la presente utilizan una etapa ácida de reducción/desactivación viral seguida por una o más etapas de cromatografía. Las etapas de cromatografía pueden incluir uno o más de los siguientes procedimientos cromatográficos: cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y cromatografía de interacción hidrofóbica. Además, la presente invención se dirige hacia las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos purificados por un método descrito en la presente.

Para mayor claridad y de modo no limitante, esta descripción detallada se divide en las siguientes porciones secundarias: 1. Definiciones; 2. Generación de anticuerpo; 3. Producción de anticuerpo; 4. Purificación de anticuerpo; 5. Métodos de análisis de pureza de muestra; 6. Modificaciones adicionales; 7. Composiciones farmacéuticas; y 8. Usos de anticuerpo. 1. Definiciones Para poder entender más fácilmente la presente invención, primero se definen ciertos términos.

El término "anticuerpo" incluye una molécula de inmunoglobulina compuesta por cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada (CH). La región constante de cadena pesada está comprendida por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida por un dominio, CL. Las regiones de VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones de determinación de complementariedad (CDR, por su abreviación en inglés), entremezcladas con las regiones que son más conservadas, llamadas regiones estructurales (FR, por su abreviación en inglés). Cada VH y VL se compone de tres CDRs y cuatro FRs, ubicadas de la terminal amino a la terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o "porción de anticuerpo") incluye los fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, hlL-12, hTNFa, o hlL-18). Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar por los fragmentos de un anticuerpo integral. Ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluye (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que comprende los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un enlace de disulfuro en la región conectora; (iii) un fragmento Fd que comprende los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que comprende los dominios VL y VH de una sola ramificación de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y colaboradores, (1989) Nature 341:544-546, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia), que comprende un dominio VH; y (vi) una región de determinación de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, sean codificados por los genes separados, se pueden unir, usando los métodos recombinantes, por un enlace sintético que les permite formarse como una sola cadena de proteína en la cual las regiones VL y VH se unen para formar las moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv); ver, por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242:423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Tales anticuerpos de cadena simple también se piensan para estar comprendidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. También son comprendidas otras formas de anticuerpos de cadena simple, tal como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena de polipéptido, pero usando un enlace que es demasiado corto para permitir la unión entre los dos dominios en la misma cadena, para de tal modo forzar a los dominios a unirse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno (ver, por ejemplo, Holliger, P., y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., y colaboradores (1994) Structure 2:1121-1123, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Además, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo puede ser parte de una molécula más grande de inmunoadhesión, formada por la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con uno o más de otras proteínas o péptidos. Los ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región central de estreptavidina para hacer una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S. . , y colaboradores (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina de terminal C para hacer las moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S. M., y colaboradores (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia). Las porciones de anticuerpo, tal como los fragmentos Fab y F(ab')2, se pueden preparar de los anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tal como digestión de papaína o pepsina, respectivamente, de los anticuerpos completos. Por otra parte, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión se pueden obtener usando las técnicas de ADN recombinante estándar, según lo descrito en la presente. En un aspecto, las porciones de unión a antígeno son dominios completos o pares de dominios completos.

La frase "interleucina humana 12" (abreviada en la presente como hll_-12, o IL-12), según lo utilizado en la presente, incluye una citocina humana que es secretada principalmente por los macrófagos y células dendríticas. El término incluye una proteíria heterodimérica que comprende una subunidad de 35 kD (p35) y una subunidad de 40 kD (p40) que se unen juntas con un enlace de disulfuro. La proteína heterodimérica es referida como una "subunidad p70". La estructura de IL-12 humana se describe adicionalmente en, por ejemplo, Kobayashi, y colaboradores (1989) J. Exp Med. 170.827-845; Seder, y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. 90:10188-10192; Ling, y colaboradores (1995) J. Exp Med. 154:116-127; Podlaski, y colaboradores (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia. El ácido nucleico que codifica IL-12 está disponible como acceso GenBank No. NM_000882 y la secuencia de polipéptido está disponible como acceso GenBank No. NP_000873.2. El término IL-12 humana se piensa para incluir IL-12 humana recombinante (rh IL-12), que se puede preparar por métodos de expresión recombinante estándar.

La frase "interleucina humana 18" (abreviada en la presente como hll_-18, o IL-18), según lo utilizado en la presente, incluye un citocina humana que se sintetiza inicialmente como una proteína precursora de aminoácido 193 biológicamente inactiva así como una proteína madura de aminoácido 156 producida, por ejemplo, pero sin limitación, mediante división de la proteína precursora, por ejemplo, por caspasa-1 o caspasa-4, que exhibe actividades biológicas que incluyen coestimulación de la proliferación de células T, aumento de la citotoxicidad de células NK, inducción de la producción de IFN-? por las células T y células NK, y la potenciación de la diferenciación del auxiliar T tipo 1 (Th1). El ácido nucleico que codifica IL-18 está disponible como acceso GenBank No. NM_001562 y la secuencia de polipéptido está disponible como acceso GenBank No. NP_001553. El término IL-18 humana se piensa para incluir IL-18 humana recombinante (rh IL-18), que se puede preparar por métodos de expresión recombinante estándar.

La frase "factor de necrosis tumoral alfa humano" (abreviado en la presente como hTNFa o TNFa) es una citocina proinflamatoria de múltiples funciones secretada predominantemente por los monocitos/macrófagos que tienen efectos sobre el metabolismo de lípidos, coagulación, resistencia a insulina, y función endotelíal. El TNFa es un homotrímero soluble de subunidades de proteína de 17 kD. También existe una forma de precursor de 26 kD de unión a membrana de TNFa. Se encuentra en células y macrofagos sinoviales en tejidos. Las células distintas a los monocitos o macrofagos también producen TNFa. Por ejemplo, las líneas celulares tumorales no monocíticas humanas producen el TNFa así como los linfocitos periféricos de sangre T CD4+ y CD8+ y algunas líneas de células T y B cultivadas producen TNFa. El ácido nucleico que codifica TNFa está disponible como acceso GenBank No. X02910 y la secuencia de polipéptido está disponible como acceso GenBank No CAA26669. El término TNFa humano se piensa para incluir TNFa humano recombinante (rh TNFa), que se puede preparar por métodos de expresión recombinante estándar.

Los términos "numeración de Kabat", "definiciones de Kabat" y "etiquetado de Kabat" se utilizan alternativamente en la presente. Estos términos, que se reconocen en la técnica, se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácido que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácido en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo (Kabat y colaboradores (1971) Ann. NY Acad, Scí. 190:382-391 y, Kabat, E. A., y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Qinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Para la región variable de cadena pesada, la región hipervariable oscila de las posiciones de aminoácido 31 a 35 para CDR1, posiciones de aminoácido 50 a 65 para CDR2, y posiciones de aminoácido 95 a 102 para CDR3. Para la región variable de cadena ligera, la región hipervariable oscila de las posiciones de aminoácido 24 a 34 para CDR1, posiciones de aminoácido 50 a 56 para CDR2, y posiciones de aminoácido 89 a 97 para CDR3.

El término "anticuerpo humano" incluye los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponden a las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana según lo descrito por Kabat y colaboradores (ver, Kabat, y colaboradores (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242). Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o de sitio específico in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en CDRs y particularmente CDR3. Las mutaciones se pueden introducir usando el "método de mutagénesis selectiva". El anticuerpo humano puede tener por lo menos una posición reemplazada por un residuo de aminoácido, por ejemplo, un residuo de aminoácido de aumento de actividad que no sea codificado por la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana. El anticuerpo humano puede tener hasta veinte posiciones sustituidas por los residuos de aminoácido que no son parte de la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana. En otras modalidades, se sustituyen hasta diez, hasta cinco, hasta tres o hasta dos posiciones. En una modalidad, estos reemplazos están dentro de las regiones CDR. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", según lo utilizado en la presente, no se piensa para incluir los anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas del línea germinal de otra especie mamífera, tal como ratón, se han injertado en las secuencias estructurales humanas.

La frase "método de mutagénesis selectiva" incluye un método para mejorar la actividad de un anticuerpo seleccionando y mutando individualmente los aminoácidos de CDR en por lo menos una posición de mutagénesis, posición de hipermutación, y/o contacto selectivo conveniente. Un anticuerpo humano "selectivamente mutado" es un anticuerpo que comprende una mutación en una posición seleccionada usando un método de mutagénesis selectiva. En otro aspecto, el método de mutagénesis selectiva se piensa para proporcionar un método para mutar preferiblemente los residuos de aminoácido individuales seleccionados en CDR1, CDR2 o CDR3 de la región variable de cadena pesada (más adelante referida como ? .?2, y H3, respectivamente), o CDR1, CDR2 o CDR3 de la región variable de cadena ligera (más adelante referida como L1, L2, y L3, respectivamente) de un anticuerpo. Los residuos de aminoácido se pueden seleccionar de posiciones de mutagénesis selectiva, posiciones de contacto, o posiciones de hipermutación . Los aminoácidos individuales se seleccionan con base en su posición en la región de variable de cadena ligera o pesada. Se debe entender que una posición de hipermutación también puede ser una posición de contacto. En un aspecto, el método de mutagénesis selectiva es un "método dirigido". El leguaje "método dirigido" se piensa para incluir un método para mutar residuos de aminoácido individuales seleccionados en CDR1, CDR2 o CDR3 de la región variable de cadena pesada o CDR1, CDR2 o CDR3 de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo de una manera dirigida, por ejemplo, un "método dirigido por grupos" o "método dirigido por CDRs". En el "método dirigido por grupos", los residuos de aminoácido en los grupos particulares se dirigen para las mutaciones selectivas que incluyen los grupos I (incluyendo L3 y H3), II (incluyendo H2 y L1) e. III (incluyendo L2 y H1), los grupos son enumerados en el orden de preferencia para el direccionamiento. En el "método dirigido por CDRs", los residuos de aminoácido individuales en las CDRs particulares, se dirigen para las mutaciones selectivas con el orden de preferencia para el direccionamiento como sigue: H3, L3, H2, L1, H1 y L2. El residuo de aminoácido seleccionado es mutado, por ejemplo, a por lo menos dos de otros residuos de aminoácido, y se determina el efecto de la mutación sobre la actividad del anticuerpo. La actividad se mide como un cambio de la especificidad/afinidad de unión del anticuerpo, y/o de la potencia de neutralización del anticuerpo. Se debe entender que el método de mutagénesis selectiva se puede utilizar para la optimización de cualquier anticuerpo derivado de cualquier fuente incluyendo la expresión en fago, animales transgénicos con genes de línea germinal IgG humanos, y anticuerpos humanos aislados de las células B humanas. El método de mutagénesis selectiva se puede utilizar en los anticuerpos que no se pueden optimizar adicionalmente usando la tecnología de expresión en fago. Se debe entender que los anticuerpos de cualquier fuente incluyendo la expresión en fago, animales transgénicos con genes de línea germinal IgG humanos, anticuerpos humanos aislados de células B humanas, pueden someterse a mutación inversa antes o después del método de mutagénesis selectiva.

La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tal como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humana recombinante combinatoria, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico para los genes de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, Taylor, L. D., y colaboradores (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de las secuencias del gene de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (ver, Kabat, E. A., y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NEH No. 91-3242). En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a la mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de Ig humanas en la mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras se deriven y relacionen con las secuencias VH y VL de línea germinal humana, no pueden existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vivo. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos recombinantes son el resultado del método de mutagénesis selectiva o mutación inversa o ambos.

Un "anticuerpo aislado" incluye un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diversas especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que une específicamente hll_-12 está sustancialmente libre de los anticuerpos que unen específicamente antígenos distintos a hlL-12). Un anticuerpo aislado que une específicamente hll_-12 puede unir las moléculas de IL-12 de otras especies. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material y/o químico celulares. Los anticuerpos anti-IL-12 convenientes que se pueden purificar en el contexto de la presente invención se describen en la Patente Estadounidense No. 6,914,128 (que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) que incluyen, pero no se limitan al anticuerpo anti-IL-12 identificado en esa patente como J695, y que se ha identificado posteriormente como ABT-874. Los anticuerpos anti-IL-18 convenientes que se pueden purificar y aislar en el contexto de la presente invención se describen en el documento USSN 09/780,035 y 10/988,360, que incluyen, el anticuerpo que se ha identificado posteriormente como ABT-325. Un anticuerpo anti-TNFa conveniente es Adalimumab (Abbott Laboratories).

Un "anticuerpo de neutralización" (o un "anticuerpo que neutralizó la actividad de hlL-12") incluye un anticuerpo cuya unión a hlL-12 da lugar a la inhibición de la actividad biológica de hlL-12. Esta inhibición de la actividad biológica de hlL-12 se puede determinar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de hlL-12, tal como inhibición de la proliferación de blastos humana de fitohemaglutinina en un análisis de proliferación de blastos de fitohemaglutinina (PHA, por su abreviatura en inglés), o la inhibición del receptor de unión en un análisis de unión del receptor IL-12 humano. Estos indicadores de la actividad biológica de hlL-12 se pueden determinar por uno o más de varios análisis in vitro o in vivo estándar conocidos en la técnica.

Un "anticuerpo de neutralización" (o un "anticuerpo que neutralizó la actividad de hll_-18") incluye un anticuerpo cuya unión a hll_-18 da lugar a la inhibición de la actividad biológica de hlL-18. Esta inhibición de la actividad biológica de hlL-18 se puede determinar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de hlL-18, tal como inducción de la producción de IFNy por las células T o células NK, o la inhibición de la unión del receptor IL-18 en un análisis de unión del receptor IL-18 humano. Estos indicadores de la actividad biológica de hll_-18 se pueden determinar por uno o más de varios análisis in vitro o in vivo estándar conocidos en la técnica.

El término "actividad" incluye actividades tal como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo para un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-hlL-12 que une a un antígeno de IL-12 y/o la potencia de neutralización de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-hlL-12 cuya unión a hlL-12 inhibe la actividad biológica de hlL-12, por ejemplo, inhibición de la proliferación de blastos de PHA o inhibición de la unión del receptor en un análisis de unión del receptor IL-12 humano. El término "actividad" también incluye actividades tal como especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo anti-IL-18 para su antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-hlL-18 que une a un antígeno de IL-18 y/o la potencia de neutralización de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-hlL-18 cuya unión a hll_-18 inhibe la actividad biológica de hlL-18. El término "actividad" también incluye actividades tal como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo anti-TNFa para su antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFa que une a un antígeno de TNFa y/o la potencia de neutralización de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFa cuya unión al hTNFa inhibe la actividad biológica de hTNFa.

La frase "resonancia de plasmón superficial" incluye un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones bioespecíficas en tiempo real por la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo, usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ.). Para otras descripciones, ver Jonsson, U., y colaboradores (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., y colaboradores (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., y colaboradores (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Johnsson, B., y colaboradores (1991) Anal. Biochem. 198:268-277, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente.

El término "Koff", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse a la constante de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno.

El término "Kd", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse a la constante de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular.

La frase "molécula de ácido nucleico" incluye las moléculas de ADN y las moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero en un aspecto es ADN bicatenario.

La frase "molécula de ácido nucleico aislada", según lo utilizado en la presente con referencia a los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o porciones de anticuerpo (por ejemplo, VH, VL, CDR3), por ejemplo los que unen hlL-12, hTNFa, o hlL-18, e incluyen una molécula de ácido nucleico en la cual las secuencias de nucleótido que codifican el anticuerpo o porción de anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleótido que codifican los anticuerpos o porciones de anticuerpo que unen los antígenos distintos de hlL-12, hTNFa, o hlL-18, cuyas otras secuencias pueden evadir naturalmente el ácido nucleico en el ADN genómico humano. Así, por ejemplo, un ácido nucleico aislado de la invención que codifica una región VH de un anticuerpo anti-IL-12h, anti-TNFa o anti-hlL-18 no contiene ninguna otra secuencia que codifica otras regiones VH que unen los antígenos distintos a, por ejemplo, IL-12, hTNFa, o hlL-18. La frase "molécula de ácido nucleico aislada" también se piensa para incluir las secuencias que codifican los anticuerpos bivalentes biespecíficos, tal como diacuerpos en los cuales las regiones VH y VL no contienen ninguna otra secuencia distinta a las secuencias del diacuerpo.

La frase "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora") incluye una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se debe entender que tales términos están pensados para referirse no sólo a la célula objeto particular sino a la progenie de tal célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en las generaciones sucesivas debido a la mutación o influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula madre, pero aún estar incluida dentro del alcance del término "célula hospedadora" según lo utilizado en la presente.

El término "modificación", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse al cambio de uno o más aminoácidos en los anticuerpos o porciones de unión de antígeno del mismo. El cambio puede ser producido agregando, sustituyendo o suprimiendo un aminoácido en uno o más posiciones. El cambio se puede producir usando técnicas conocidas, tal como mutagénesis de PCR.

El término "aproximadamente", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse a intervalos de aproximadamente 10-20% mayor que o menor que el valor referido. En ciertas circunstancias, un experto en la técnica reconocerá que, debido a la naturaleza del valor referido, el término "aproximadamente" puede significar más o menos que una desviación de 10-20% de ese valor.

La frase "reducción/desactivación viral", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse a una disminución del número de partículas virales en una muestra particular ("reducción"), así como una disminución de la actividad, por ejemplo, pero sin limitarse a, la infectividad o capacidad de replica, de partículas virales en una muestra particular ("desactivación"). Tales disminuciones del número y/o actividad de las partículas virales pueden estar en el orden de aproximadamente 1% a aproximadamente 99%, preferiblemente de aproximadamente 20% a ' aproximadamente 99%, más preferiblemente de aproximadamente 30% a aproximadamente 99%, muy preferiblemente de aproximadamente 40% a aproximadamente 99%, incluso más preferiblemente de aproximadamente 50% a aproximadamente 99%, aún más preferiblemente de aproximadamente 60% a aproximadamente 99%, incluso muy preferiblemente de aproximadamente 70% a aproximadamente 99%, aún muy preferiblemente de aproximadamente 80% a aproximadamente 99%, e incluso aún muy preferiblemente de aproximadamente 90% a aproximadamente 99%. En ciertas modalidades no limitantes, la cantidad de virus, si lo hay, en el producto de anticuerpo purificado es de menos de Dl50 (la cantidad de virus que infectará a 50 por ciento de una población objeto) para ese virus, preferiblemente por lo menos diez veces menor que Dl50 para ese virus, más preferiblemente por lo menos cien veces menor que DI5o para ese virus, y muy preferiblemente por lo menos 1000 veces menor que Dl50 para ese virus.

La frase "posición de contacto" incluye una posición de aminoácido en CDR1, CDR2 o CDR3 de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo que es ocupado por un aminoácido que entra en contacto con el antígeno en una de las veintiséis estructuras de anticuerpo-antígeno conocidas. Si un aminoácido de CDR en cualquiera de las veintiséis estructuras determinadas conocidas de los complejos de anticuerpo-antígeno entra en contacto con el antígeno, entonces ese aminoácido se puede considerar como que ocupa una posición de contacto. Las posiciones de contacto tienen una probabilidad más alta de ser ocupadas por un aminoácido que entra en contacto con los antígenos que en una posición de no contacto. En un aspecto, una posición de contacto es una posición de CDR que contiene un aminoácido que entra en contacto con el antígeno en más de 3 de las 26 estructuras (>1.5%). En otro aspecto, una posición de contacto es una posición de CDR que contiene un aminoácido que entra en contacto con el antígeno en más de 8 de las^ 25 estructuras (>32%). 2. Generación del anticuerpo El término "anticuerpo" según lo utilizado en esta sección se refiere a un anticuerpo intacto o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Los anticuerpos de la presente descripción se pueden generar por una variedad de técnicas, incluyendo inmunización de un animal con el antígeno de interés seguido por metodologías de anticuerpo monoclonal convencionales, por ejemplo, la técnica de hibridación de célula somática estándar Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque los procedimientos de hibridación de célula somática son preferidos, en principio, otras técnicas para producir el anticuerpo monoclonal se pueden utilizar, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de los linfocitos B.

Un sistema animal preferido para preparar los hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridoma es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en la técnica. Los asociados de fusión (por ejemplo, células de mieloma de murino) y procedimientos de fusión también son conocidos.

Un anticuerpo preferiblemente puede ser un anticuerpo humano, quimérico, o humanizado. Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente descripción se pueden preparar con base en la secuencia de un anticuerpo monoclonal no humano preparado según lo descrito anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera se puede obtener del hibridoma no humano de interés y diseñarse para contener secuencias de inmunoglobulina de murino (por ejemplo, humana) usando técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de murino se pueden unir a las regiones constantes humanas usando los métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4,816,567 de Cabilly y colaboradores). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones de CDR de murino se pueden insertar en una estructura humana usando los métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,225,539 de Winter, y las Patentes Estadounidenses Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen y colaboradores).

En una modalidad no limitante, los anticuerpos de esta descripción son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra IL-12, TNFa, o IL-18 se pueden generar usando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmunológico humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en la presente como HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.), KM Mouse® (Medarex, Inc.), y XenoMouse® (Amgen).

Por otra parte, los sistemas animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden utilizar para producir los anticuerpos de la descripción, tal como, anticuerpos anti-IL-12, anti-TNFa o anti-IL-18. Por ejemplo, se puede utilizar los ratones que llevan un transcromosoma humano de cadena pesada y un transcromosoma humano de cadena ligera, referidos como "ratones TC"; tales ratones se describen en Tomizuka y colaboradores (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:722-727. Además, las vacas que llevan los transcromosomas humanos de cadena pesada y ligera se han descrito en la técnica (por ejemplo, Kuroiwa y colaboradores (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 y la Solicitud PCT No. WO 2002/092812) y se pueden utilizar para producir los anticuerpos anti-IL-12, anti-TNFa, o anti-l L18 de esta descripción.

Los anticuerpos humanos recombinantes de la invención, que incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos anti-IL-12, anti-TNFa, o anti-l L18 o una porción de unión a antígeno de los mismos, o los anticuerpos relacionados a anti-IL-12, relacionados a anti-TNFa, o relacionados a anti-IL-18 descritos en la presente, se pueden aislar por el análisis de una biblioteca de anticuerpo combinatoria recombinante, por ejemplo, una biblioteca de expresión en fago scFv, preparada usando ADNcs de VL y VH humanos preparados del ARNm derivado de linfocitos humanos. Las metodologías para preparar y analizar tales bibliotecas se conocen en la técnica. Además de los kits comercialmente disponibles para generar las bibliotecas de expresión en fago (por ejemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, número de catálogo 27-9400-01; y el kit de expresión en fago Stratagene SurfZAPTM, número de catálogo 240612, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente), los ejemplos de los métodos y reactivos particularmente favorables para el uso en la generación y análisis de las bibliotecas de expresión en anticuerpo se pueden encontrar en , por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,223,409 de Ladner y colaboradores; Publicación PCT No. WO 92/18619 de Kang y colaboradores; Publicación PCT No. WO 91/17271 de Dower y colaboradores; Publicación PCT No. WO 92/20791 de Winter y colaboradores; Publicación PCT No. WO 92/15679 de Markland y colaboradores; Publicación PCT No. WO 93/01288 de Breitling y colaboradores; Publicación PCT No. WO 92/01047 de McCafferty y colaboradores; Publicación PCT No. WO 92/09690 de Garrard y colaboradores; Fuchs y colaboradores (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay y colaboradores (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse y colaboradores (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty y colaboradores, Nature (1990) 348:552-554; Griffiths y colaboradores (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins y colaboradores (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson y colaboradores (1991) Nature 352:624-628; Gram y colaboradores (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard y colaboradores (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom y colaboradores (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas y colaboradores (1991) PNAS 88:7978-7982; cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente.

Los anticuerpos monoclonales humanos de esta descripción también se pueden preparar usando los ratones SCID en los cuales las células inmunes humanas se han reconstituido tal que una respuesta del anticuerpo humano se puede generar durante la inmunización. Tales ratones se describen en, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,476,996 y 5,698,767 de Wilson y otros.

En ciertas modalidades, los métodos de la invención incluyen los anticuerpos anti-IL 12, anti-TNFa, o anti-IL-18 y porciones de anticuerpo, o anticuerpos relacionados a anti-IL-18 relacionados a anti-IL-12, relacionados a anti-TNFa y porciones del anticuerpo, y anticuerpos humanos y porciones del anticuerpo con las propiedades equivalentes a los anticuerpos anti-IL-12, anti-TNFa, o anti-IL-18, tal como unión de alta afinidad a hlL-12, hTNFa, o hlL-18 con baja cinética de disociación y alta capacidad de neutralización. En un aspecto, la invención proporciona el tratamiento de un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se disocia de hlL-12, hTNFa, o hlL-18 con una Kd de aproximadamente 1 x 10-8 M o menos y una constante de Koff de 1 x 10-3 s-1 o menos, ambas determinadas por resonancia de plasmón superficial. En las modalidades no limitantes específicas, un anticuerpo anti-IL-12 purificado de acuerdo con la invención inhibe competitivamente la unión de ABT-874 a IL-12 bajo condiciones fisiológicas. En las modalidades no limitantes específicas, un anticuerpo anti-IL-18 purificado de acuerdo con la invención inhibe competitivamente la unión de ABT-325 a IL-18 bajo condiciones fisiológicas. En las modalidades no limitantes específicas, un anticuerpo anti-TNFa purificado de acuerdo con la invención inhibe competitivamente la unión de Adalimumab a TNFa bajo condiciones fisiológicas.

En aún otra modalidad de la invención, los anticuerpos o fragmentos de los mismos, por ejemplo pero sin limitarse a, anticuerpos anti-IL-12, anti-TNFa o anti-IL-18 o fragmentos de los mismos, se pueden alterar en donde la región constante del anticuerpo se modifica para reducir por lo menos una función efectora biológica mediada por la región constante con relación a un anticuerpo sin modificar. Para modificar un anticuerpo de la invención tal que exhiba una unión reducida al receptor Fe, el segmento de región constante de inmunoglobulina del anticuerpo puede ser mutado en las regiones particulares necesarias para las interacciones del receptor Fe (FcR) (ver, por ejemplo, Canfield and Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491; y Lund y colaboradores (1991) J. of Immunol. 147:2657-2662, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente). La reducción de la capacidad de unión de FcR del anticuerpo puede también reducir otras funciones efectoras que dependen de las interacciones de FcR, tal como opsonización y fagocitosis y citotoxicidad celular dependiente de antigeno. 3. Producción de anticuerpo Para expresar un anticuerpo de la invención, los ADNs que codifican las cadenas integrales ligera y pesada se insertan en uno o más vectores de expresión tal que los genes sean unidos operativamente a las secuencias de control de transcripción y traducción. (Ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6,914,128, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia). En este contexto, el término "unido operativamente" se piensa para dar a entender que un gen de anticuerpo es unido a un vector tal que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector sirven para su función prevista de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo se pueden insertar en un vector separado o, más comúnmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo son insertados en un vector de expresión por los métodos estándar (por ejemplo, unión de los sitios de restricción complementarios en el fragmento y vector de gen de anticuerpo, o unión de extremo romo si no hay sitios de restricción presentes). Antes de la inserción del anticuerpo o secuencias de cadena pesada y ligera relacionadas al anticuerpo, el vector de expresión puede ya llevar las secuencias de región constante de anticuerpo. Por ejemplo, un método para convertir, anticuerpos anti-IL-12, anti-TNFa, o anti-l L18 o secuencias de VH y Vl_ relacionadas al anticuerpo anti-IL-12, anti-TNFa, o anti-l L- 18 a los genes de anticuerpo integrales es insertarlos en vectores de expresión que 1 ? ya pueden codificar las regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera, respectivamente, tal que el segmento de VH se une operativamente a los segmentos de CH dentro del vector y el segmento VL se une operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula hospedadora. El gen de cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector tal que el péptido señal es unido en la estructura a la terminal amino del gen de cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).

Además de los genes de cadena de anticuerpo, un vector de expresión recombinante de la invención puede llevar una o más secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula hospedadora. El término "secuencia reguladora" se piensa para incluir los promotores, reforzadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia. Será apreciado por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión, que incluye la selección de secuencias reguladoras puede depender de factores tal como la elección de la célula hospedadora que se transformará, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras convenientes para la expresión en células hospedadoras mamíferas incluyen los elementos virales que dirigen los niveles de expresión de proteína en células mamíferas, tal como promotores y/o reforzadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/reforzador de CMV), virus 40 de simio (SV40) (tal como el promotor/reforzador de SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor posterior principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para la descripción adicional de los elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos, ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,168,062 de Stinski, Patente Estadounidense No. 4,510,245 de Bell y colaboradores y la Patente Estadounidense No. 4,968,615 de Schaffher y colaboradores, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia.

Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, un vector de expresión recombinante de la invención puede llevar una o más secuencias adicionales, tal como una secuencia que regula la réplica del vector en las células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de la réplica) y/o un gen marcador seleccionable. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células hospedadoras en las cuales se ha introducido el vector (ver, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos.4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas de Axel y colaboradores, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Por ejemplo, comúnmente el gene marcador seleccionable confiere resistencia a los fármacos, tal como G418, higromicina o metotrexato, a una célula hospedadora en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables convenientes incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para el uso en células hospedadoras de dhfr con la selección/amplificación de metotrexato) y el nuevo gen (para la selección de G418).

Un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención se puede preparar por la expresión recombinante de los genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula hospedadora. Para expresar un anticuerpo de manera recombinante, una célula hospedadora es transfectada con uno o más vectores de expresión recombinante que lleva los fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo tal que las cadenas ligera y pesada son expresadas en la célula hospedadora y secretadas en el medio en el cual se cultivan las células hospedadoras, de cuyo medio los anticuerpos se pueden recuperar. Las metodologías de ADN recombinante estándar son utilizadas para obtener los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo, incorporan estos genes en vectores de expresión recombinante e introducen los vectores en las células hospedadoras, tal como las descritas en Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), Ausubel y colaboradores (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,816,397 y 6,914,128, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente.

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el vector de expresión que codifica las cadenas pesada y ligera es transfectado en una célula hospedadora por técnicas estándar. Varias formas del término "transfección" se piensan para comprender una gran variedad de técnicas usadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación de calcio-fosfato, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque sea teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en las células hospedadoras procarióticas o eucarióticas, la expresión de anticuerpos en células eucarióticas, tal como células hospedadoras mamíferas, es conveniente debido a que tales células eucarióticas, y particularmente las células mamíferas, son más probables que las células procarióticas se agrupen y secreten un anticuerpo plegado correctamente e inmunológicamente activo. La expresión en células procarióticas de los genes de anticuerpo se ha descrito como ineficaz para la producción de altas cantidades de anticuerpo activo (Boss and Wood (1985) Immunology Today 6:12-13, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia).

Las células hospedadoras convenientes para la clonación o expresión del ADN en los vectores en la presente son las células procariotas, levadura, o eucariotas superiores descritas anteriormente. Las células procariotas convenientes para el propósito incluyen eubacteria, tal como organismos gram-negativos o gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. Coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrita en DD 266,710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P aeruginosa, y Streptomyces. Un anfitrión de clonación de E. Coli conveniente es E. Coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas tal como E. Coli B, E. Coli X1776 (ATCC 31.537), y E. Coli W3110 (ATCC 27.325) son convenientes. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

Además de las células procariotas, los microbios eucarióticos tal como hongos filamentosos o levadura son anfitriones de clonación o expresión convenientes para los vectores de codificación de polipéptido. Saccharomyces Cerevisiae, o levadura de panadero común, es el más usado comúnmente entre los microorganismos hospedadores eucarióticos inferiores. Sin embargo, una cantidad de otros géneros, especies, y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en la presente, tal como Schizosaccharomyces pombe; anfitriones Kluyveromyces tal como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24, 178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis, y hongos filamentosos tal como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y anfitriones Aspergillus tal como A. nidulans y A. niger.

Las células hospedadoras convenientes para la expresión de anticuerpos glicosilados se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células invertebradas incluyen células de planta e insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes del baculovirus y las células hospedadoras de insecto permisivas correspondientes de los anfitriones tal como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Una variedad de cepas virales para la transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus se pueden utilizar como el virus en la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Los cultivos celulares vegetales de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate, y tabaco también se puede utilizar como anfitriones.

Las células hospedadoras mamíferas convenientes para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster Chino (células CHO) (incluyendo células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) PNAS USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, según lo descrito en Kaufman y Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican los genes de anticuerpo se introducen en las células hospedadoras mamíferas, los anticuerpos son producidos cultivando las células hospedadoras por un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual crecen las células hospedadoras. Otros ejemplos de las líneas de células hospedadoras mamíferas útiles son la línea CVI de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embrionaria humana (células subclonadas 293 ó 293 para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham y colaboradores, J.

Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, CHO, Urlaub y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de búfalo-rata (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y colaboradores, Annals NI. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (G2 Hep), cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia.

Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en los medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir a los promotores, seleccionar a los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células hospedadoras usadas para producir un anticuerpo se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tal como F10™ de Ham (Sigma), Minimal Essential Médium™ ((MEM), (Sigma), RPMI- 1640 (Sigma), y Dulbecco's Modified Eagle's Médium™ ((DMEM), Sigma) son convenientes para cultivar las células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y colaboradores, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y colaboradores, Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes Estadounidenses Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ó 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de Referencia Estadounidense No. 30,985, se pueden utilizar como medios de cultivo para las células hospedadoras, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia. Cualquiera de estos medios se pueden complementar según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tal como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), soluciones amortiguadoras (tal como HEPES), nucleótidos (tal como adenosina y timidina), antibióticos (tal como fármaco de gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes comúnmente a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario puede también ser incluido a las concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, por ejemplo temperatura, pH, y similares, son las usadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.

Las células hospedadoras también se pueden utilizar para producir las porciones de anticuerpos intactos, tal como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entiende que las variaciones en el procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, en ciertas modalidades puede ser deseable transfectar la célula hospedadora con el ADN que codifica la cadena ligera o cadena pesada (pero no ambas) anticuerpo de esta invención. La tecnología de ADN recombinante también se puede utilizar para retirar parte o todo el ADN que codifica cualquiera o ambas cadenas ligera y pesada que no es necesario para unir IL-12, específicamente hlL-12, en el contexto de los anticuerpos anti-IL-12 o el ADN no necesario para unir IL-18, específicamente hlL-18, en el contexto de los anticuerpos anti-IL-18, o el ADN no necesario para unir TNFa, específicamente hTNFa, en el contexto de anticuerpos anti-TNFa. Las moléculas expresadas de tales moléculas de ADN truncadas también son comprendidas por los anticuerpos de la invención. Además, los anticuerpos bifuncionales se pueden producir en cuya cadena ligera y cadena pesada está un anticuerpo de la invención y la otra cadena pesada y ligera es específica para un antígeno distinto de IL-12, TNFa, o IL-18, dependiendo de la especificidad del anticuerpo de la invención, reticulando un anticuerpo de la invención a un segundo anticuerpo por los métodos de reticulación químicos estándar.

En un sistema conveniente para la expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera de anticuerpo, es introducido en las células dhfr-CHO por la transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo están cada uno unido operativamente a los elementos reguladores del reforzador de CMV/promotor de AdMLP para estimular los altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen de DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando la selección/amplificación de metotrexato. Las células hospedadoras transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Las técnicas de biolog ía molecular estándar se utilizan para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo.

Al usar las técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir de manera intracelular, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. En un aspecto, si el anticuerpo se produce de manera intracelular, como una primera etapa, los residuos de partículas, células hospedadoras o células lisadas (por ejemplo, resultantes de la homogeneización), se pueden eliminar, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Donde el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión se pueden primero concentrar usa ndo un filtro de concentración de prote ína dispon ible comercialmente, por ejemplo, una unidad de u ltrafiltración Amicon™ o Mi ll ipore Pel licon™.

Antes del proceso de la invención, los procedimientos para la purificación de anticuerpos para eliminar los residuos celulares dependen in icialmente del sitio de la expresión del anticuerpo. Alg unos anticuerpos se pueden secretar directamente de la célula en los medios de crecimiento circundantes; otros se hacen de manera intracelular. Para los últimos anticuerpos, la primera etapa de un proceso de purificación implica comúnmente: lisis de la célula, que se puede hacer por una variedad de métodos, incluyendo corte mecánico, choq ue osmótico, o tratam ientos enzimáticos. Tal alteración libera el contenido completo de la célula en el homogenado, y además produce fragmentos subcelulares que son difíciles de elim inar debido a su tamaño pequeño. Éstos son eliminados generalmente por centrifugación diferenciada o por filtración . Donde se secreta el anticuerpo, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión son generalmente primero concentrados usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon™ o Millipore Pellicon™. Donde el anticuerpo se secreta en el medio, las células hospedadoras recombinantes también se pueden separar del medio de cultivo celular, por ejem plo, por filtración de flujo tangencial. Los anticuerpos se pueden recuperar adicionalmente del medio de cultivo usando los métodos de purificación de anticuerpo de la invención. 4. Purificación de anticuerpo 4.1 Purificación general del anticuerpo La invención proporciona un método para producir una preparación de anticuerpo purificada (o "reducida en HCP") de una mezcla que comprende un anticuerpo y por lo menos una HCP. El proceso de purificación de la invención comienza en la etapa de separación cuando el anticuerpo se ha producido usando los métodos descritos anteriormente y los métodos convencionales en la técnica. La tabla 1 presenta brevemente una modalidad de un esquema de purificación. Las variaciones de este esquema, que incluyen, pero no se limitan a, las variaciones donde la etapa de cromatografía de afinidad de proteína A se omite o el orden de las etapas de intercambio iónico se invierte, se consideran y están dentro del alcance de esta invención.

Tabla 1 - Etapas efe purificación con su propósito asociado Etapa de purificación Propósito Clarificación de matriz de Recuperación primaria muestra Captura de anticuerpo, Cromatografía de afinidad reducción de proteína de célula hospedadora e impureza asociada Captura de anticuerpo, Cromatografía de intercambio reducción de proteína de célula catiónico hospedadora e impureza asociada Etapa de purificación Propósito Concentración e intercambio de Ultrafiltración/diafiltración solución amortiguadora Cromatografía de intercambio Reducción de proteínas de amónico célula hospedadora y ADN Reducción de agregados de Cromatografía de Phenyl anticuerpo y proteínas de Sepharose™ HP célula hospedadora Eliminación de virus grandes, si Filtración viral están presentes Concentrar y formular el Ultrafiltración/diafiltración final anticuerpo Una vez que se haya obtenido una solución o mezcla clarificada que comprende el anticuerpo, la separación del anticuerpo de las otras proteínas producidas por la célula, tal como HCPs, se realiza usando una combinación de diferentes técnicas de purificación, que incluyen las etapas de separación de intercambio iónico y las etapas de separación de interacción hidrofóbica. Las etapas de separación separan las mezclas de proteínas de acuerdo con su carga, grado de hidrofobicidad, o tamaño. En un aspecto de la invención, la separación se realiza usando la cromatografía, que incluye la interacción catiónica, aniónica, e hidrofóbica. Varias y diferentes resinas de cromatografía están disponibles para cada una de estas técnicas, que permiten la adaptación exacta del esquema de purificación a la proteína particular implicada. La esencia de cada uno de los métodos de separación es que pueden hacer que las proteínas atraviesen a diferentes velocidades bajo una columna, alcancen una separación física que aumenta mientras pasan adicionalmente bajo la columna, o se adhirieran selectivamente al medio de separación, para entonces ser eluídas de manera diferenciada por diferentes solventes. En algunos casos, el anticuerpo se separa de las impurezas cuando las impurezas se adhieren específicamente a la columna y no lo hace el anticuerpo, es decir, el anticuerpo está presente en el flujo directo.

Según lo observado anteriormente, la adaptación exacta de un esquema de purificación se basa en la consideración de que la proteína sea purificará. En ciertas modalidades, las etapas de separación de la presente invención se utilizan para separar un anticuerpo de una o más HCPs. Los anticuerpos que se pueden purificar con éxito usando los métodos descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos humanos IgAi, lgA2, IgD, IgE, \gG,, lgG2, lgG3, lgG4, y IgM. En ciertas modalidades, las estrategias de purificación de la presente invención excluyen el uso de la cromatografía de afinidad de proteína A, por ejemplo en el contexto de la purificación de los anticuerpos lgG3, puesto que los anticuerpos lgG3 se unen a la proteína A de manera ineficaz. Otros factores que permiten la adaptación específica de un esquema de purificación incluyen, pero no se limitan a: la presencia o ausencia de una región Fe (por ejemplo, en el contexto del anticuerpo integral con respecto a un fragmento Fab del mismo) debido a que la proteína A se une a la región Fe; las secuencias de línea germinal particulares utilizadas en la generación del anticuerpo de interés; y la composición de aminoácido del anticuerpo (por ejemplo, la secuencia primaria del anticuerpo así como la carga total/hidrofobicidad de la molécula). Los anticuerpos que comparten una o más característica se pueden purificar usando las estrategias de purificación adaptadas para aprovechar esa característica. 4.2. Recuperación primaria Las etapas iniciales de los métodos de purificación de la presente invención implican la primera fase de clarificación y recuperación primaria del anticuerpo de una matriz de muestra. Además, el proceso de recuperación primaria también puede ser un punto en el cual se reducen o desactivan los virus que pueden estar presentes en la matriz de muestra. Por ejemplo, cualquiera de uno o más de una variedad de métodos de reducción/desactivación viral se pueden utilizar durante la fase de recuperación primaria de la purificación que incluye la desactivación por calor (pasteurización), desactivación por pH, tratamiento con solvente/detergente, irradiación con rayos UV y ? y la adición de cierto químico que desactiva los agentes tal como ß-propiolactona o por ejemplo, fenantrolina de cobre como en la Patente Estadounidense No. 4,534,972, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia. En ciertas modalidades de la presente invención, la matriz de muestra se expone a la reducción/desactivación viral por pH durante la fase de recuperación primaria.

Los métodos de reducción/desactivación viral por pH incluyen, pero no se limitan a, incubación de la mezcla durante un periodo de tiempo a pH bajo, y posteriormente neutralización del pH y eliminación de las macropartículas por filtración. En ciertas modalidades, la mezcla será incubada a un pH de entre aproximadamente 2 y 5, preferiblemente a un pH de entre aproximadamente 3 y 4, y más preferiblemente a un pH de aproximadamente 3.5. El pH de la mezcla de muestra se puede disminuir por cualquier ácido conveniente que incluye, pero no se limita a, ácido cítrico, ácido acético, ácido caprílico, u otros ácidos convenientes. La elección del nivel de pH depende en gran parte del perfil de estabilidad del producto de anticuerpo y componentes de la solución amortiguadora. Se conoce que la calidad del anticuerpo objeto durante la reducción/desactivación de virus a pH bajo, es afectada por el pH y la duración de la incubación a pH bajo. En ciertas modalidades la duración de la incubación a pH bajo será de 0.5 hr a 2 hr, preferiblemente 0.5 hr a 1.5 hr, y más preferiblemente la duración será de 1 hr. La reducción/desactivación de virus es dependiente en estos mismos parámetros además de la concentración de proteína, que puede limitar la reducción/desactivación a altas concentraciones. Así, los parámetros apropiados de la concentración de proteína, pH, y duración de la reducción/desactivación, se pueden seleccionar para alcanzar el nivel deseado de reducción/desactivación virales.

En ciertas modalidades, la reducción/desactivación viral se puede alcanzar vía el uso de filtros convenientes. Un ejemplo no limitante de un filtro conveniente es el filtro Ultipor DV50™ de Pall Corporation. Aunque ciertas modalidades de la presente invención utilicen tal filtración durante la fase de recuperación primaria, en otras modalidades se utiliza en otras fases del proceso de purificación, que incluyen la etapa penúltima o final de la purificación. En ciertas modalidades, los filtros alternativos se utilizan para la reducción/desactivación virales, tal como, pero sin limitarse a, filtros Viresolve™ (Millipore, Billerica, Mass.); filtros Zeta Plus VR™ (CUNO; Meriden, Conn.); y filtros Planova™ (Asahi Kasei Pharma, Planova División, Buffalo Grove, III ).

En esas modalidades donde se utiliza la reducción/desactivación viral, la mezcla de muestra se puede ajustar, según sea necesario, para las etapas de purificación adicionales. Por ejemplo, después de la reducción/desactivación viral a pH bajo el pH de la mezcla de muestra se ajusta comúnmente a un pH más neutral, por ejemplo, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 8.5, y preferiblemente aproximadamente 4.9, antes de continuar el proceso de purificación. Además, la mezcla se puede enjuagar con agua para que la inyección (WFI) obtenga una conductividad deseada.

En ciertas modalidades, la recuperación primaria incluirá una o más etapas de centrifugación para clarificar adicionalmente la matriz de muestra y de tal modo ayudar a la purificación de los anticuerpos anti-IL-12, anti-TNFa, o anti-IL-18. La centrifugación de la muestra se puede implementar a, por ejemplo, pero sin limitarse a, 7,000 x g a aproximadamente 12,750 x g. En el contexto de la purificación a gran escala, tal centrifugación puede ocurrir en línea con un caudal determinado para alcanzar, por ejemplo, pero sin limitarse a, un nivel de turbiedad de 150 NTU en el sobrenadante resultante. Tal sobrenadante se puede entonces recolectar para la purificación adicional.

En ciertas modalidades, la recuperación primaria incluirá el uso de una o más etapas de filtración profunda para clarificar adicionalmente la matriz de muestra y de tal modo ayudar a la purificación de los anticuerpos de la presente invención. Los filtros profundos contienen el medio de filtración que tiene una densidad graduada. Tal densidad graduada permite que las partículas más grandes sean atrapadas cerca de la superficie del filtro mientras que partículas más pequeñas penetran las áreas abiertas más grandes en la superficie del filtro, sólo para quedar atrapadas en las aberturas más pequeñas más cerca al centro del filtro. En ciertas modalidades la etapa de filtración profunda puede ser una etapa de filtración profunda deslipidizante. Aunque ciertas modalidades utilizan las etapas de filtración profunda solamente durante la fase de recuperación primaria, otras modalidades utilizan los filtros profundos, que incluyen los filtros profundos deslipidizantes, durante una o más fases de purificación adicionales. Los ejemplos no limitantes de los filtros profundos que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención incluyen los filtros profundos de Cuno™ modelo 30/60ZA (3 Corp.), y los cartuchos de filtro de doble capa Sartopore™ de 0.45/0.2 pm. 4.3. Cromatografía de afinidad En ciertas modalidades, la muestra de recuperación primaria se somete a la cromatografía de afinidad para purificar adicionalmente el anticuerpo de interés para eliminar las HCPs. En ciertas modalidades el material cromatográfico es capaz de unir selectiva o específicamente al anticuerpo de interés. Los ejemplos no limitante de tal material cromatográfico incluyen: proteína A, proteína G, material cromatográfico que comprende el antígeno unido por el anticuerpo de interés, y el material cromatográfico que comprende una proteína de unión a Fe. En las modalidades específicas, la etapa de cromatografía de afinidad implica someter la muestra de recuperación primaria a una columna que comprende una resina de proteína A conveniente. La resina de proteína A es útil para la purificación de afinidad y el aislamiento de una variedad de isotipos de anticuerpo, particularmente lgG , lgG2, e lgG . La proteína A es una proteína bacteriana de pared celular que une a los IgGs mamíferos principalmente a través de sus regiones Fe. En su estado nativo, la proteína A tiene cinco dominios de unión de IgG así como otros dominios de función desconocida.

Existen varias fuentes comerciales para la resina de proteína A. Una resina conveniente es MabSelect™ de GE Healthcare. Un ejemplo no limitante de una columna conveniente llenada con MabSelect™ es una columna de aproximadamente 1.0 cm de diámetro x aproximadamente 21.6 cm de largo (-17 mi de volumen de lecho). Este tamaño de columna se puede utilizar para las purificaciones a pequeña escala y se puede comparar con otras columnas usadas para escalas mayores. Por ejemplo, una columna de 20 cm x 21 cm cuyo volumen de lecho es de aproximadamente 6.6 I, se puede utilizar para purificaciones más grandes. Sin importar la columna, la columna se puede llenar con usando una resina conveniente tal como MabSelect™.

En ciertas modalidades será ventajoso identificar la capacidad de unión dinámica (DBC, por su abreviatura en inglés) de la resina de proteína A para adaptar la purificación al anticuerpo de interés particular. Por ejemplo, pero sin limitarse a, la DBC de una columna de MabSelect™ se puede determinar por una estrategia de carga de caudal simple o carga de caudal doble. La carga de caudal simple se puede evaluar a una velocidad de aproximadamente 300 cm/hr a través de todo el período de carga. La estrategia de carga de caudal doble se puede determinar cargando la columna hasta aproximadamente 35 mg de proteína/ml de resina a una velocidad lineal de aproximadamente 300 cm/hr, después se puede reducir la velocidad lineal a la mitad para permitir un periodo de residencia más largo para la última porción de la carga.

En ciertas modalidades, la columna de proteína A se puede equilibrar con una solución amortiguadora conveniente antes de la carga de muestra. Un ejemplo no limitante de una solución amortiguadora conveniente es una solución amortiguadora de Tris/NaCI, pH de aproximadamente 7.2. Un ejemplo no limitante de las condiciones de equilibrio convenientes es 25 mM de Tris, 100 mM de NaCI, pH de aproximadamente 7.2. Después de este equilibrio, la muestra se puede cargar a la columna. Después de la carga de la columna, la columna se puede lavar una o múltiples veces usando, por ejemplo, la solución amortiguadora de equilibrio. Otros lavados, incluyendo los lavados que utilizan diferentes soluciones amortiguadoras, se pueden utilizar antes de eluir la columna. Por ejemplo, la columna se puede lavar usando uno o más volúmenes de columna de 20 mM de ácido cítrico/citrato de sodio, 0.5 M de NaCI a pH de aproximadamente 6.0. Este lavado puede ser seguido opcionalmente por uno o más lavados usando la solución amortiguadora de equilibrio. La columna de proteína A se puede entonces eluir usando una solución amortiguadora de elución apropiada. Un ejemplo no limitante de una solución amortiguadora de elución conveniente es una solución amortiguadora de ácido acético/NaCI, pH de aproximadamente 3.5. Las condiciones convenientes son, por ejemplo, 0.1 M de ácido acético, pH de aproximadamente 3.5. El eluato se puede supervisar usando las técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la absorbancia a OD28o se puede continuar. El eluato de columna se puede recolectar iniciando con una desviación inicial de aproximadamente 0.5 AU a una lectura de aproximadamente 0.5 AU en el borde de salida del pico de elución. Las fracciones de elución de interés entonces se pueden preparar para el procesamiento posterior. Por ejemplo, la muestra recolectada se puede titular a un pH de aproximadamente 5.0 usando Tris (por ejemplo, 1.0 M) a un pH de aproximadamente 10. Opcionalmente, esta muestra titulada se puede filtrar y procesar adicionalmente. 4.4. Cromatografía de intercambio iónico En ciertas modalidades, la presente invención proporciona los métodos para producir una preparación de anticuerpo reducida en HCP de una mezcla que comprende un anticuerpo y por lo menos una HCP sometiendo la mezcla a por lo menos a una etapa de separación de intercambio iónico tal que sea obtenido un eluato que comprende el anticuerpo. La separación de intercambio iónico incluye cualquier método por el cual dos sustancias sean separadas con base en la diferencia de sus cargas iónicas respectivas, y puedan utilizar el material de intercambio catiónico o el material de intercambio aniónico.

El uso de un material de intercambio catiónico contra un material de intercambio aniónico se basa en la carga total de la proteína. Por lo tanto, está dentro del alcance de esta invención utilizar una etapa de intercambio aniónico antes del uso de una etapa de intercambio catiónico, o una etapa de intercambio catiónico antes del uso de una etapa de intercambio aniónico. Además, está dentro del alcance de esta invención utilizar solamente una etapa de intercambio catiónico, sólo una etapa de intercambio aniónico, o cualquier combinación serial de las dos.

Al realizar la separación, la mezcla de anticuerpo inicial se puede poner en contacto con el material de intercambio iónico usando cualquiera de una variedad de técnicas, por ejemplo, usando una técnica de purificación por lotes o una técnica cromatográfica.

Por ejemplo, en el contexto de la purificación por lotes, el material de intercambio iónico se prepara en, o se equilibra de acuerdo con la solución amortiguadora inicial deseada. Durante la preparación, o equilibrio, se obtiene una mezcla de material de intercambio iónico. La solución de anticuerpo se pone en contacto con la mezcla para absorber el anticuerpo que se separará en el material de intercambio iónico. La solución que comprende las HCPs que no unen al material de intercambio iónico es separada de la mezcla, por ejemplo, para permitir que la mezcla se asiente y se retire el sobrenadante. La mezcla se puede someter a una o más etapas de lavado. Si se desea, la mezcla se puede poner en contacto con una solución de una conductividad más alta para desorber las HCPs que se han unido al material de intercambio iónico. Para eluir los polipéptidos unidos, se puede aumentar la concentración de sal de la solución amortiguadora.

La cromatografía de intercambio iónico también se puede utilizar como una técnica de separación de intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico separa las moléculas con base en las diferencias entre la carga total de las moléculas. Para la purificación de un anticuerpo, el anticuerpo debe tener una carga opuesta a la del grupo funcional unido al material de intercambio iónico, por ejemplo, resina, para la unión. Por ejemplo, los anticuerpos, que tienen generalmente una carga positiva total en la solución amortiguadora con un pH debajo de sus pl, se unirán bien al material de intercambio catiónico, que contienen grupos funcionales cargados negativamente.

En la cromatografía de intercambio iónico, los parches cargados en la superficie del soluto son atraídos por las cargas opuestas unidas a una matriz de cromatografía, haciendo que la fuerza iónica de la solución amortiguadora circundante sea baja. La elución es lograda generalmente aumentando la fuerza iónica (es decir, conductividad) de la solución amortiguadora para competir con el soluto por los sitios cargados de la matriz de intercambio iónico. El cambio del pH y de tal modo la alteración de la carga del soluto es otra manera de lograr la elución del soluto. El cambio en conductividad o pH puede ser gradual (elución de gradiente) o por etapas (elución de etapa).

Los sustituyentes aniónicos o catiónicos se pueden unir a las matrices para formar los soportes aniónicos o catiónicos para la cromatografía. Los ejemplos no limitantes de los sustituyentes de intercambio aniónico incluyen grupos dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE) y amina cuaternaria amina (Q). Los sustituyentes catiónicos incluyen carboximetilo (CM), sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) y sulfonatos (S). Las resinas de intercambio iónico de celulosa tal como DE23™, DE32™, DE52™, CM-23™, CM-32™, y CM-52™ están disponibles de Whatman Ltd. Maidstone, Kent, Reino Unido. Los intercambiadores iónicos basados en SEPHADEX® y unidos a locross también son conocidos. Por ejemplo, DEAE-, QAE-, CM-, y SP- SEPHADEX® y DEAE-, Q-, CM- y S- SEPHAROSE® y SEPHAROSE® Fast Flow están disponibles de Pharmacia AB. Además, DEAE y CM derivados del copolímero etilenglicol-metacrilato tal como TOYOPEARL™ DEAE-650S o M y TOYOPEARL™ CM-650S o M están disponibles de Toso Haas Co., Philadelphia, Pa.

Una mezcla que comprende un anticuerpo e impurezas, por ejemplo, HCP, se carga en una columna de intercambio iónico, tal como una columna de intercambio catiónico. Por ejemplo, pero sin limitación, la mezcla se puede cargar a una carga de aproximadamente 80 g de proteína/l de resina dependiendo de la columna usada. Un ejemplo de una columna de intercambio catiónico conveniente es una columna de 80 cm de diámetro x 23 cm de largo cuyo volumen de lecho es de aproximadamente 116 I. La mezcla cargada en esta columna catiónica puede lavarse posteriormente con solución amortiguadora de lavado (solución amortiguadora de equilibrio). El anticuerpo entonces se eluye de la columna, y se obtiene un primer eluato.

Esta etapa de intercambio iónico facilita la captura del anticuerpo de interés mientras que reduce las impurezas tal como HCPs. En ciertos aspectos, la columna de intercambio iónico es una columna de intercambio catiónico. Por ejemplo, pero sin limitación, una resina conveniente para tal columna de intercambio catiónico es la resina CM HyperDF. Estas resinas están disponibles de fuentes comerciales tal como Pall Corporation. Este procedimiento de intercambio catiónico se puede realizar en o a aproximadamente temperatura ambiente. 4.5. Ultrafiltración/dia filtración Ciertas modalidades de la presente invención utilizan etapas de ultrafiltración y/o diafiltración para purificar y concentrar adicionalmente la muestra de anticuerpo. La ultrafiltración se describe detalladamente en: Microfiltration and Ultrafiltration : Principies and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., 1996); y en: Ultrafiltration Handbook, Muñir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9). Un proceso de filtración preferido es filtración de flujo tangencial según lo descrito en el catálogo de Millipore titulado el "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp. 177-202 (Bedford, Mass., 1995/96). La ultrafiltración generalmente se considera que significa la filtración usando los filtros con un tamaño de poro más pequeño de 0.1 pm. Utilizando los filtros que tienen tal pequeño tamaño de poro, el volumen de la muestra se puede reducir a través de la impregnación de la solución amortiguadora de muestra a través del filtro mientras que los anticuerpos se conservan detrás del filtro.

La diafiltración es un método que usa los ultrafiltros para eliminar e intercambiar las sales, azúcares, y solventes no acuosos, para separarse libremente de las especie unidas, para eliminar el material de bajo peso molecular, y/o para producir el cambio rápido de los ambientes iónicos y/o de pH. Los microsolutos son eliminados más eficientemente agregando el solvente a la solución que es ultrafiltrada a una velocidad aproximadamente igual a la velocidad de ultratfiltración. Esto lava las microespecies de la solución a un volumen constante, purificando con eficacia el anticuerpo conservado. En ciertas modalidades de la presente invención, una etapa de diafiltración se utiliza para intercambiar varias soluciones amortiguadoras usadas con respecto a la presente invención, opcionalmente antes de la cromatografía adicional u otras etapas de purificación, así como para eliminar las impurezas de las preparaciones del anticuerpo. 4.6. Cromatografía de interacción hidrofóbica La presente invención también ofrece los métodos para producir una preparación de anticuerpo reducida en HCP de una mezcla que comprende un anticuerpo y por lo menos una HCP que adicionalmente comprende una etapa de separación de interacción hidrofóbica. Por ejemplo, un primer eluato obtenido de una columna de intercambio iónico se puede someter a un material de interacción hidrofóbica tal que es obtenido un segundo eluato que tiene un nivel reducido de HCP. Las etapas de cromatografía de interacción hidrofóbica, por ejemplo las descritas en la presente, se realizan generalmente para eliminar los agregados de proteína, tal como agregados de anticuerpo, e impurezas relacionadas al proceso.

Al realizar la separación, la mezcla de muestra se pone en contacto con el material de HIC, por ejemplo, usando una técnica de purificación por lotes o usando una columna. Antes de purificación por HIC puede ser deseable eliminar cualquier agente caotrópico o sustancia muy hidrofóbica, por ejemplo, pasando la mezcla a través de una columna previa.

Por ejemplo, en el contexto de la purificación por lotes, el material de HIC se prepara en o equilibra de acuerdo con la solución amortiguadora de equilibrio deseada. Una suspensión del material de HIC se obtiene. La solución de anticuerpo se pone en contacto con la suspensión para absorber el anticuerpo que se separará en el material de HIC. La solución que comprende las HCPs que no se unen al material de HIC, es separada de la mezcla, por ejemplo, para permitir que la mezcla se asiente y se pueda retirar el sobrenadante. La suspensión se puede someter a uno o más etapas de lavado. Si se deseada, la mezcla se puede poner en contacto con una solución de conductividad más baja para desorber los anticuerpos que se han unido al material de HIC. Para eluir los anticuerpos unidos, la concentración de la sal se puede disminuir.

Aunque la cromatografía de intercambio iónico se basa en las cargas de los anticuerpos para aislarlos, la cromatografía de interacción hidrofóbica utiliza las propiedades hidrofóbicas de los anticuerpos. Los grupos hidrofóbicos en el anticuerpo interactúan con los grupos hidrofóbicos en la columna. Mientras más hidrofóbica sea una proteína más fuerte interactuará con la columna. Así la etapa de HIC elimina las impurezas derivadas de la célula hospedadora (por ejemplo, ADN y otras especies relacionadas al producto de alto y bajo peso molecular).

Las interacciones hidrofóbicas son las más fuertes a una alta resistencia iónica, por lo tanto, esta forma de separación se realiza convenientemente después de las precipitaciones de sal o procedimientos de intercambio iónico. La adsorción del anticuerpo en una columna de HIC es favorecida por las altas concentraciones de sal, pero las concentraciones reales pueden variar en un intervalo amplio dependiendo de la naturaleza del anticuerpo y ligando de HIC particular elegido. Varios iones se pueden ordenar en una serie llamada serie solufóbica dependiendo de si promueven las interacciones hidrofóbicas (efectos de eliminación de sal) o alteran la estructura del agua (efecto caotrópico) y conducen al debilitamiento de la interacción hidrofóbica. Los cationes se clasifican en términos de efecto creciente de eliminación de sal como: Ba + + ; Ca++¡ Mg + + ; Li + ; Cs+; Na + ; K+; Rb+; NH4 + , mientras que los aniones se pueden clasificar en términos de efecto creciente caotrópico como: PO-; S04-; CH3C03-; CI-; Br; N03-; CI04-; I; SCN-.

Generalmente los sulfatos Na, K o NH4 promueven eficazmente la interacción de ligando-proteína en HIC. Las sales pueden ser formuladas para que influencien la resistencia de la interacción según lo dado por la siguiente relación: (NH4)2S04 > Na2S04 > NaCI > NH4CI > NaBr > NaSCN. Generalmente son útiles las concentraciones de sal de entre aproximadamente 0.75 y sulfato de amonio de aproximadamente 2 M o entre NaCI de aproximadamente 1 y 4 M.

Las columnas de HIC comprenden normalmente una matriz base (por ejemplo, agarosa reticulada o material de copolímero sintético) a la cual se unen los ligandos hidrofóbicos (por ejemplo, grupos alquilo o arilo). Una columna de HIC conveniente comprende una resina de agarosa sustituida con grupos fenilo (por ejemplo, una columna Phenyl Sepharose™). Muchas columnas de HIC están disponibles comercialmente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, columna Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow con sustitución baja o alta (Pharmacia LBCB Biotechnology, AB, Suecia); columna Phenyl Sepharose™ High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suecia); columna Octyl Sepharose™ High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suecia); columnas Fractogel™ EMD Propyl o Fractogel™ EMD Phenyl (E. Merck, Alemania); soportes Macro-Prep™ Methyl o Macro-Prep™ t-Butyl (Bio-Rad, California); columna WP Hl-Propyl (C3)™ (J. T. Baker, New Jersey); y columnas de éter, fenilo o butilo Toyopearl™ (TosoHaas, PA). 4.7. Estrategias de purificación ejemplares En ciertas modalidades, la recuperación primaria puede proceder secuencialmente utilizando la reducción de pH, centrifugación, y etapas de filtración para eliminar las células y residuos celulares (incluyendo HCPs) de la cosecha del biorreactor de producción. Por ejemplo, pero sin limitación, un cultivo que comprende los anticuerpos, medios, y células se pueden someter a la reducción/desactivación viral mediada por pH usando un pH ácido de aproximadamente 3.5 durante aproximadamente 1 hora. La reducción de pH se puede facilitar usando preparaciones ácidas conocidas tal como ácido cítrico, por ejemplo, 3M de ácido cítrico. La exposición al pH ácido reduce, si no es que elimina completamente, los contaminantes y precipitados virales sensibles al pH virales y algunos medios/contaminantes celulares. Después de esta etapa de reducción/desactivación viral, el pH se ajusta a aproximadamente 4.9 ó 5.0 usando una base tal como hidróxido de sodio, por ejemplo, 3M de hidróxido de sodio, durante aproximadamente veinte a aproximadamente cuarenta minutos. Este ajuste puede ocurrir a aproximadamente 20°C. En ciertas modalidades, el cultivo de ajuste de pH después es centrifugado a aproximadamente 7000 x g a aproximadamente 11,000 x g. En ciertas modalidades, el sobrenadante de muestra resultante entonces se pasa a través de un tren de filtros que comprende múltiples filtros profundos. En ciertas modalidades, el tren de filtros comprende aproximadamente doce filtros profundos de 40.64 cm (16 pulgadas) Cuno™ modelo 30/60ZA (3M Corp.) y aproximadamente tres alojamientos de filtro redondos ajustados con tres cartuchos de 2 filtros de 76.2 cm (30 pulgadas), 0.45/0.2 pm Sartopore™ (Sartorius). El sobrenadante clarificado se recolecta en un recipiente tal como un recipiente de cosecha esterilizado previamente y se mantiene a aproximadamente 8°C. Esta temperatura entonces se ajusta a aproximadamente 20°C antes de la etapa o etapas de cromatografía de captura descritas posteriormente. Se debe observar que el experto en la técnica puede variar las condiciones citadas anteriormente y aún estar dentro del alcance de la presente invención.

En ciertas modalidades, la recuperación primaria será seguida por la cromatografía de afinidad usando la resina de proteína A. Existen varias fuentes comerciales para la resina de proteína A. Una resina conveniente es MabSelect™ de GE Healthcare. Un ejemplo de una columna conveniente llenada con MabSelect™ es una columna de aproximadamente 1.0 cm de diámetro x aproximadamente 21.6 cm de largo (-17 mi de volumen de lecho). Este tamaño de columna se puede utilizar para la escala de referencia. Esta se puede comparar con otras columnas usadas para los incrementos sucesivos. Por ejemplo, una columna de 20 cm x 21 cm cuyo volumen de lecho es de aproximadamente 6.6 I se puede utilizar para la producción comercial. Sin importar la columna, la columna se puede llenar usando una resina conveniente tal como MabSelect™.

En ciertos aspectos, la columna de proteína A se puede equilibrar con una solución amortiguadora conveniente antes de la carga de muestra. Un ejemplo de una solución amortiguadora conveniente es una solución amortiguadora de Tris/NaCI, pH de aproximadamente 6 a 8, preferiblemente de aproximadamente 7.2. Un ejemplo específico de condiciones convenientes es 25 mM de Tris, 100 mM de NaCI, pH 7.2. Después de este equilibrio, la muestra se puede cargar en la columna. Después de la carga de la columna, la columna se puede lavar una o múltiples veces usando, por ejemplo, la solución amortiguadora de equilibrio. Otros lavados incluyendo los lavados que utilizan diversas soluciones amortiguadoras se pueden utilizar antes de eluir la columna. Por ejemplo, la columna se puede lavar usando uno o más volúmenes de columna de 20 mm de ácido cítrico/citrato de sodio, 0.5 M de NaCI a pH de aproximadamente 6.0. Este lavado se puede seguir opcionalmente por uno o más lavados usando la solución amortiguadora de equilibrio. La columna de proteína A se puede entonces eluir usando una solución amortiguadora de elución apropiada. Un ejemplo de una solución amortiguadora de elución conveniente es una solución amortiguadora de ácido acético/NaCI, pH de aproximadamente 3.5. Las condiciones convenientes son, por ejemplo, 0.1 M de ácido acético, pH 3.5. El eluato se puede supervisar usando las técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la absorbancia a OD 280 puede ser mantenida. El eluato de columna se puede recolectar comenzando con una desviación inicial de aproximadamente 0.5 AU a una lectura de aproximadamente 0.5 AU en el borde de salida del pico de elución. Las fracciones de elución de interés se pueden entonces preparar para el procesamiento posterior. Por ejemplo, la muestra recolectada se puede titular a un pH de aproximadamente 5.0 usando Tris (por ejemplo, 1.0 M) a un pH de aproximadamente 10. Opcionalmente, esta muestra titulada se puede filtrar y procesar adicionalmente.

La capacidad de unión dinámica de la columna de MabSelect™ se puede determinar por una estrategia de carga de caudal simple o carga de caudal doble. La carga de caudal simple se puede evaluar a una velocidad de aproximadamente 300 cm/hr a través de todo el período de carga. La estrategia de carga de caudal doble se puede determinar cargando la columna hasta aproximadamente 35 mg de proteína/ml de resina a una velocidad lineal de aproximadamente 300 cm/hr, y después reduciendo la velocidad lineal a la mitad para permitir un tiempo de residencia más largo para la última porción de la carga.

El eluato de proteína A se puede entonces purificar adicionalmente usando una columna de intercambio catiónico. En ciertas modalidades, la solución amortiguadora de equilibrio usada en la columna de intercambio catiónico es una solución amortiguadora que tiene un pH de aproximadamente 5.0. Un ejemplo de una solución amortiguadora conveniente es aproximadamente 210 mM de acetato de sodio, pH 5.0. Después del equilibrio, la columna se carga con la muestra preparada de la etapa de recuperación primaria anterior. La columna se llena con una resina de intercambio catiónico, tal como CM Sepharose™ Fast Flow de GE Healthcare. La columna entonces se lava usando la solución amortiguadora de equilibrio. La columna después se somete a una etapa de elución usando una solución amortiguadora que tiene una mayor resistencia iónica con respecto a la solución amortiguadora de equilibrio o lavado. Por ejemplo, una solución amortiguadora de elución conveniente puede ser de aproximadamente 790 mM de acetato de sodio, pH 5.0. Los anticuerpos serán eluídos y se pueden supervisar usando un espectrofotómetro UV ajustado a OD28onm- En un ejemplo particular, la recolección de elución puede ser de la parte superior 3 OD28onm a la parte inferior 8 OD28onm- Se debe entender que el experto en la técnica puede variar las condiciones pero aún estar dentro del alcance de la invención.

En ciertas modalidades, el eluato de proteína A es, de hecho, purificado adicionalmente usando una columna de intercambio aniónico. Un ejemplo no limitante de una columna conveniente para esta etapa es una columna de 60 cm de diámetro x 30 cm de largo cuyo volumen de lecho es de aproximadamente 85 I. La columna se llena con una resina de intercambio aniónico, tal como Q Sepharose™ Fast Flow de GE Healthcare. La columna se puede equilibrar usando aproximadamente siete volúmenes de columna de una solución amortiguadora apropiada tal como Tris/cloruro sódico. Un ejemplo de condiciones convenientes es 25 mM Tris, 50 m de cloruro sódico a pH 8.0. Un experto en la técnica puede variar las condiciones pero aún estar dentro del alcance de la presente invención. La columna se carga con la muestra recolectada de la etapa de purificación de proteína A descrita anteriormente. En otro aspecto, la columna se carga del eluato recolectado durante el intercambio catiónico. Después de la carga de la columna, la columna se lava con la solución amortiguadora de equilibrio (por ejemplo, la solución amortiguadora de Tris/cloruro de sodio). El flujo directo que comprende los anticuerpos se puede supervisar usando un espectrofotómetro UV a OD28onm- Esta etapa de intercambio aniónico reduce las impurezas relacionadas al proceso tal como ácidos nucleicos similares al ADN, y proteínas de célula hospedadora. La separación ocurre debido al hecho que los anticuerpos de interés no interactúan sustancialmente ni se unen a la fase sólida de la columna, por ejemplo, Q Sepharose™, pero muchas impurezas interactúan con y unen a la fase sólida de la columna. El intercambio aniónico puede ser realizado a aproximadamente 12°C.

En ciertas modalidades, el eluato de intercambio catiónico o intercambio aniónico, dependiendo de cual etapa de intercambio iónico se utiliza primero, se filtra después usando, por ejemplo, un filtro deslipidizante Cuno™ de 40.64 cm (16 pulgadas). Esta filtración, usando el filtro deslipidizante, se puede continuar mediante, por ejemplo, un cartucho de filtro de doble capa de 76.2 cm (30 pulgadas) de 0.45/0.2 µ?t? Sartopore™. La solución amortiguadora de intercambio de elución iónico se puede utilizar para enjuagar el volumen residual en los filtros y prepararse para la ultrafiltración/diafiltración.

Para lograr la etapa de ultratf iltración/diaf iltración , los medios de filtración se preparan en una solución amortiguadora conveniente, por ejemplo, 20 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. Una sal tal como cloruro de sodio se puede agregar para aumentar la resistencia iónica, por ejemplo, 100 mM de cloruro de sodio. Esta etapa de ultrafiltración/diafiltración sirve para concentrar los anticuerpos anti-IL-12, anti-TNFa, o anti-IL-18, eliminar el acetato de sodio y ajusfar el pH. Los filtros comerciales están disponibles para efectuar esta etapa. Por ejemplo, Millipore fabrica un contenedor de membrana de ultrafiltro de celulosa de corte de peso molecular ( WCO, por su abreviatura en inglés) de 30 kD. Este procedimiento de filtración se puede conducir en o a aproximadamente temperatura ambiente.

En ciertas modalidades, la muestra de la etapa de filtración de captura anterior se somete a una segunda etapa de separación de intercambio iónico. Preferiblemente esta segunda separación de intercambio iónico implicará la separación basada en la carga opuesta de la primera separación de intercambio iónico. Por ejemplo, si una etapa de intercambio aniónico se utiliza después de la recuperación primaria, la segunda etapa cromatográfica de intercambio iónico puede ser una etapa de intercambio catiónico. Por el contrario, si la etapa de recuperación primaria fuera seguida por una etapa de intercambio catiónico, esa etapa sería seguida por una etapa de intercambio aniónico. En ciertas modalidades el primer eluato de intercambio iónico se puede someter directamente a la segunda etapa cromatográfica de intercambio iónico donde el primer eluato de intercambio iónico se ajusta a las condiciones apropiadas de la solución amortiguadora. Los materiales y condiciones de separación aniónica y catiónica convenientes se describieron anteriormente.

En ciertas modalidades de la presente invención la muestra que contiene los anticuerpos será procesada adicionalmente usando una etapa de separación de interacción hidrofóbica. Un ejemplo no limitante de una columna conveniente para tal etapa es una columna de 80 cm de diámetro x 15 cm de largo cuyo volumen de lecho es de aproximadamente 75 I, que se llena con una resina apropiada usada para HIC, tal como, pero sin limitarse a, Phenyl HP Sepharose™ de Amersham Biosciences, Upsala, Suecia. La preparación de flujo directo obtenida de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico anterior que comprende los anticuerpos de interés se puede diluir con un volumen igual de aproximadamente 1.7 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. Esta entonces se puede someter a la filtración usando un filtro de doble capa de 0.45/0.2 µ?t? Sartopore™, o su equivalente. En ciertas modalidades, el procedimiento de cromatografía hidrofóbico implica dos o más ciclos.

En ciertas modalidades, la columna de HIC primero se equilibra usando una solución amortiguadora conveniente. Un ejemplo no limitante de una solución amortiguadora conveniente es 0.85 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. El experto en la técnica puede variar la solución amortiguadora de equilibrio y aún estar dentro del alcance de la presente invención alterando las concentraciones de los neutralizantes y/o sustituyendo las soluciones amortiguadoras equivalentes. En ciertas modalidades la columna entonces se carga con una muestra de flujo directo de intercambio aniónico y se lava múltiples veces, por ejemplo, tres veces, con un sistema amortiguador apropiado tal como sulfato de amonio/fosfato de sodio. Un ejemplo de un sistema amortiguador conveniente incluye 1.1 M de sulfato de amonio, 50 mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio con un pH de aproximadamente 7.0. Opcionalmente, la columna puede experimentar ciclos de lavado adicionales. Por ejemplo, un segundo ciclo de lavado puede incluir múltiples lavados de columna, por ejemplo, una a siete veces, usando un sistema amortiguador apropiado. Un ejemplo no limitante de un sistema amortiguador conveniente incluye 0.85 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. En un aspecto, la columna cargada experimenta aún un tercer lavado usando un sistema amortiguador apropiado. La columna se puede lavar múltiples veces, por ejemplo, una a tres veces, usando un sistema amortiguador tal como 1.1 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio a un pH de aproximadamente 7.0. Nuevamente, el experto en la técnica puede variar las condiciones de amortiguamiento y aún estar dentro del alcance de la presente invención.

La columna se eluye usando una solución amortiguadora de elución apropiada. Un ejemplo conveniente de tal solución de elución amortiguadora es 0.5 M de sulfato de amonio, 15 mM de fosfato de sodio a un pH de aproximadamente 7.0. Los anticuerpos de interés se pueden detectar y recolectar usando un espectrofotómetro convencional de la parte superior a 3 OD280nm a la parte inferior a 3 OD28onm- En ciertos aspectos de la invención, el eluato de la etapa de cromatografía hidrofóbica se somete a la filtración para la eliminación de partículas virales, incluyendo virus intactos, si están presentes. Un ejemplo no limitante de un filtro conveniente es el filtro de Ultipor DV50™ de Pall Corporation. Otros filtros virales se pueden utilizar en esta etapa de filtración y son bien conocidos por los expertos en la técnica. El eluato de HIC se pasa a través de un filtro humedecido previamente de aproximadamente 0.1 µ?? y un tren de filtros de 5.08 x 76.2 cm (2 x 30 pulgadas) Ultipor DV50™ a aproximadamente 2.34 bar (34 psig). En ciertas modalidades, después del proceso de filtración, el filtro se lava usando, por ejemplo, la solución amortiguadora de elución de HIC para eliminar cualquier anticuerpo conservado en el alojamiento de filtro. El filtrado se puede almacenar en un envase esterilizado previamente a aproximadamente 12°C.

En ciertas modalidades, el filtrado anterior se somete nuevamente a la ultrafiltración/diafiltración. Esta etapa es importante si una conclusión de un experto es utilizar el anticuerpo en, por ejemplo, una formulación farmacéutica. Este proceso, si se utiliza, puede facilitar la concentración de anticuerpo, eliminación de sales de amortiguamiento utilizadas previamente y las sustituye por una solución amortiguadora de formulación particular. En ciertas modalidades, se realiza la diafiltración continua con múltiples volúmenes, por ejemplo, dos volúmenes, de una solución amortiguadora de formulación. Un ejemplo no limitante de una solución amortiguadora de formulación conveniente es 5 mM de metionina, 2% de manitol, 0.5% de sucrosa, solución amortiguadora a pH 5.9 (ningún Tween). Al completar este intercambio de doble volumen se concentran los anticuerpos. Una vez que se haya logrado una concentración predeterminada de anticuerpo, entonces un experto puede calcular la cantidad de 10% de Tween que se debe agregar para lograr una concentración final de Tween de aproximadamente 0.005% (v/v).

Ciertas modalidades de la presente invención incluirán etapas de purificación adicionales. Los ejemplos de los procedimientos de purificación adicional que se pueden realizar antes, durante, o después del método de cromatografía de intercambio iónico incluyen la precipitación de etanol, concentración isoeléctrica, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina Sepharose™, cromatografía de intercambio aniónico adicional y/o cromatografía de intercambio catiónico adicional, cromato-concentración, SDS-PAGE, precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando la proteína G, un anticuerpo, un sustrato específico, ligando o antígeno como reactivo de captura).

En ciertas modalidades de la presente invención, el anticuerpo anti-IL-12 es un anticuerpo del isotipo IgA lgA2, IgD, IgE, Igd, lgG2, lgG3, lgG4, o IgM que comprende las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera presentada en la figura 1. En las modalidades preferidas, el anticuerpo anti-IL-12 es un anticuerpo del isotipo lgG1( lgG2, lgG3 o lgG4 que comprende las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera presentadas en la figura 1, más preferiblemente el anticuerpo anti-IL-12 es un anticuerpo \gG, que comprende las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera presentadas en la figura 1. En ciertas modalidades de la presente invención, el anticuerpo anti-TNFa es un anticuerpo del isotipo IgA!, lgA2, IgD, IgE, IgG!, lgG2, lgG3, lgG4, o Ig que comprende las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera presentadas en la figura 3. En las modalidades preferidas, el anticuerpo anti-TNFa es un anticuerpo del isotipo Igd, lgG2, lgG3 o lgG4 que comprende las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera presentadas en la figura 3, preferiblemente el anticuerpo anti-TNFa es un anticuerpo \gG-¡ que comprende las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera presentadas en la figura 3. 5. Métodos para analizar la pureza de muestra 5.1. Análisis de proteína de célula hospedadora La presente invención también proporciona los métodos para determinar los niveles residuales de la concentración de proteína de célula hospedadora (HCP) en la composición de anticuerpo aislada/purificada. Según lo descrito anteriormente, las HCPs se excluyen deseablemente del producto de sustancia objeto final, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-12, anti-TNFa o anti-IL-18. Las HCPs ejemplares incluyen las proteínas que se originan de la fuente de la producción de anticuerpo. La incapacidad de identificar y eliminar de manera suficientemente las HCPs del anticuerpo objeto puede conducir a la eficacia reducida y/o reacciones objeto adversas.

Según lo utilizado en la presente, el término "ELISA HCP" se refiere a un ELISA donde el segundo anticuerpo usado en el análisis es específico para las HCPs producidas de las células, por ejemplo, células CHO, usadas para generar el anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-12, anti-TNFa, o anti-IL-18). El segundo anticuerpo se puede producir de acuerdo con los métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el segundo anticuerpo se puede producir usando las HCPs obtenidas por los mismos análisis de producción y purificación, es decir, la misma línea celular usada para producir el anticuerpo de interés se utiliza, pero la línea celular no es transfectada con el ADN de anticuerpo. En una modalidad ejemplar, el segundo anticuerpo se produce usando las HPCs similares a las expresadas en el sistema de expresión celular de elección, es decir, el sistema de expresión celular usado para producir el anticuerpo objeto.

Generalmente, ELISA HCP comprende la inserción de una muestra líquida que comprende HCPs entre dos capas de anticuerpos, es decir, un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo. La muestra se incuba mientras las HCPs en la muestra se capturan por el primer anticuerpo, por ejemplo, pero sin limitarse a anti-CHO de cabra, purificado por afinidad (Cygnus). Un segundo anticuerpo etiquetado, o mezcla de anticuerpos, específico para las HCPs producidas de las células usadas para generar el anticuerpo, por ejemplo, HCP anti-CHO biotinilada, se agrega, y une a las HCPs dentro de la muestra. En ciertas modalidades el primer y segundo anticuerpos son anticuerpos policlonales. En ciertos aspectos el primer y segundo anticuerpos son mezclas de anticuerpos policlonales producidos contra HCPs, por ejemplo, pero sin limitarse a la mezcla de anti-proteína de célula hospedadora de cabra biotinilada 599/626/748. La cantidad de HCP contenida en la muestra es determinada usando la prueba apropiada basada en la etiqueta del segundo anticuerpo.

HCP ELISA se puede utilizar para determinar el nivel de HCPs en una composición de anticuerpo, tal como un eluato o flujo directo obtenido usando el proceso descrito anteriormente. La presente invención también proporciona una composición que comprende un anticuerpo, en donde la composición no tiene ningún nivel detectable de HCPs según lo determinado por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ("ELISA", por su abreviatura en inglés) de HCP. 5.2. Análisis del material cromatográfico de afinidad En ciertas modalidades, la presente invención también proporciona los métodos para determinar los niveles residuales de material cromatográfico de afinidad en la composición de anticuerpo aislada/purificada. En ciertos contextos tal material se lixivia en la composición de anticuerpo durante el proceso de purificación. En ciertas modalidades, se utiliza un análisis para identificar la concentración de proteína A en la composición de anticuerpo aislada/purificada. Según lo utilizado en la presente, el término "ELISA de proteína A" se refiere a un ELISA donde el segundo anticuerpo usado en el análisis es específico para la proteína A utilizada para purificar el anticuerpo de interés, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-12, anti-TNFa o anti-IL-18. El segundo anticuerpo se puede producir de acuerdo con los métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el segundo anticuerpo se puede producir usando la proteína A natural o recombinante en el contexto de los métodos convencionales para la generación y producción del anticuerpo.

Generalmente, el ELISA de proteína A comprende insertar una muestra líquida que comprende la proteína A (o que posiblemente contiene la proteína A) entre dos capas de anticuerpos anti-proteína A, es decir, un primer anticuerpo anti-proteína A y un segundo anticuerpo anti-proteína A. La muestra es expuesta a una primera capa de anticuerpo anti-proteína A, por ejemplo, pero sin limitarse a los anticuerpos policlonales o mezclas de anticuerpos policlonales, e incubada por un periodo de tiempo suficiente para que la proteína A en la muestra sea capturada por el primer anticuerpo. Un segundo anticuerpo etiquetado, por ejemplo, pero sin limitarse a los anticuerpos policlonales o mezclas de anticuerpos policlonales, específico para la proteína A entonces se agrega, y une a la proteína A capturada dentro de la muestra. Los ejemplos no limitantes adicionales de los anticuerpos anti-proteí na A útiles en el contexto de la presente invención incluyen los anticuerpos anti-proteína A de pollo y anti-proteína A biotinilados. La cantidad de proteína A contenida en la muestra es determinada usando la prueba apropiada basada en la etiqueta del segundo anticuerpo. Los análisis similares se pueden utilizar para identificar la concentración de los materiales cromatográficos de afinidad alternativos.

El ELISA de proteína A se puede utilizar para determinar el nivel de proteína A en una composición de anticuerpo, tal como un eluato o flujo directo obtenido usando el proceso descrito anteriormente. La presente invención también proporciona una composición que comprende un anticuerpo, en donde la composición no tiene ningún nivel detectable de proteína A según lo determinado por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ("ELISA") de proteína A. 6. Otras modificaciones Los anticuerpos de la presente invención se pueden modificar. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se modifican químicamente para proporcionar un efecto deseado. Por ejemplo, la pegilación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención se puede realizar por cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica, según lo descrito, por ejemplo, en las siguientes referencias: Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992); EP 0 154 316; y EP 0 401 384, que se incorporan por referencia en la presente en su totalidad. En un aspecto, la pegilación se realiza vía una reacción de acilación o una reacción de alquilizacion con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Un polímero soluble en agua conveniente para la pegilación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención es polietilenglicol (PEG). Según lo utilizado en la presente, se entiende que el "polietilenglicol" comprende cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivar otras proteínas, tal como mono(CI-CIO)alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol.

Los métodos para preparar los anticuerpos y fragmentos anticuerpo pegilados de la invención comprenderán generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo con polietilenglicol, tal como un derivado de éster o aldehido reactivo de PEG, bajo las condiciones convenientes por las cuales el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a uno o más grupos PEG, y (b) obtener los productos de reacción. Será evidente para un experto en la técnica seleccionar las condiciones de reacción óptimas o las reacciones de acilación con base en los parámetros conocidos y resultado deseado.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pegilados específicos para IL-12, TNFa, o IL-18 se pueden utilizar generalmente para tratar los trastornos relacionados con IL-12, relacionados con TNFa, o relacionados con IL-18 de la invención por la administración de los anticuerpos anti-IL-12, anti-TNFa o anti-IL 18 y fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. Generalmente los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pegilados han aumentado la vida útil, con respecto a los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo no pegilados. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pegilados se pueden utilizar solos, juntos, o en combinación con otras composiciones farmacéuticas.

Un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede derivar o unir a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por consiguiente, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se piensan para incluir las formas derivadas y de otra manera modificadas de los anticuerpos humanos anti-hlL-12, anti-TNFa, o anti-hlL-18 descritos en la presente, incluyendo las moléculas de inmunoadhesión. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede unir funcionalmente (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otra manera) a una o más de otras entidades moleculares, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puedan mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).

Un tipo de anticuerpo derivado es producido reticulando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o diferentes tipos, por ejemplo, para crear los anticuerpos biespecíficos). Los reticuladores convenientes incluyen los que son heterobifuncionales, que tiene dos grupos distintamente reactivos separados por un separador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) o homobifuncional (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Tales enlaces están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

Los agentes detectables útiles con los cuales un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede derivar incluyen los compuestos fluorescentes. Los agentes detectables fluorescentes ejemplares incluyen la fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1 -naftalensulfonilo, ficoeritrina y similares. Un anticuerpo también se puede derivar con las enzimas detectables, tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, oxidasa de glucosa y similares. Cuando un anticuerpo se deriva con una enzima detectable, es detectado agregando los reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando la peroxidasa de rábano picante de agente detectable está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de coloración, que es detectable. Un anticuerpo también se puede derivar con biotina, y detectar a través de la medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. 7. Composiciones farmacéuticas Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se pueden incorporar a las composiciones farmacéuticas convenientes para la administración a un sujeto. Comúnmente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Según lo utilizado en la presente, el "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, es deseable incluir los agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente cantidades menores de las sustancias auxiliares tal como agentes de humectación o los emulsificación, conservadores o soluciones amortiguadoras, que aumentan la vida útil o eficacia del anticuerpo o porción de anticuerpo.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se pueden incorporar en una composición farmacéutica conveniente para la administración parenteral. El anticuerpo o porciones de anticuerpo se pueden preparar como una solución inyectable que contiene, por ejemplo, 0.1-250 mg/ml de anticuerpos. La solución inyectable se puede componer de una forma de dosificación líquida o liofilizada en un frasco de pedernal o ámbar, ampolla o jeringuilla llenada previamente. La solución amortiguadora puede ser L-histidina de aproximadamente 1-50 m , (óptimamente 5-10 mM), a pH 5.0 a 7.0 (óptimamente pH 6.0). Otras soluciones amortiguadoras convenientes incluyen pero no se limitan a succcinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. El cloruro de sodio se puede utilizar para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente 150 mM para una forma de dosificación líquida). Los crioprotectores se pueden incluir para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 0-10% de sucrosa (óptimamente 0.5-1.0%). Otros crioprotectores convenientes incluyen trehalosa y lactosa. Los agentes espesantes se pueden incluir para una forma de dosificación liofilizada, principalmente de 1-10% de manitol (óptimamente 24%). Los estabilizadores se pueden utilizar en las formas de dosificación líquidas y liofilizadas, principalmente 1-50 mM de L-metionina (óptimamente 5-10 mM). Otros agentes espesantes convenientes incluyen glicina, arginina, se pueden incluir como 0-0.05% de polisorbato-80 (óptimamente 0.005-0.01%). Los tensioactivos adicionales incluyen pero no se limitan a polisorbato 20 y tensioactivos de BRIJ.

En un aspecto, la composición farmacéutica incluye el anticuerpo a una dosificación de aproximadamente 0.01 mg/kg-10 mg/kg. En otro aspecto, las dosificaciones de anticuerpo incluyen aproximadamente 1 mg/kg administradas cada semana intermedia, o aproximadamente 0.3 mg/kg administradas cada semana. Un médico experto puede determinar la dosificación y régimen apropiados para administrar a un sujeto.

Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tal como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma depende de, por ejemplo, el modo de administración previsto y el uso terapéutico. Las composiciones comunes están en forma de soluciones inyectables o infusibles, tal como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. Un modo de administración es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En un aspecto, el anticuerpo es administrado por infusión o inyección intravenosa. En otro aspecto, el anticuerpo es administrado por inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas comúnmente deben ser estériles y estables bajo condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como la solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura particular conveniente a alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables se pueden preparar incorporando ef compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por la esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles liofilizados para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y secado por aspersión que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada de manera estéril del mismo. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser causada por incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la presente invención se pueden administrar por una variedad de métodos conocidos en la técnica, una ruta/modo de administración son inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como será apreciado por el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un portador que proteja el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluyen implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microcapsulados. Los polímeros biodegradables biocompatibles se pueden utilizar, por ejemplo etilen-vinil-acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones se patentan o se conocen generalmente por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia.

En ciertos aspectos, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o portador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también se pueden incluir en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimir en tabletas, o incorporar directamente en la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los compuestos se pueden incorporar con los excipientes y utilizar en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención de una manera distinta a la administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para prevenir su desactivación.

Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar a las composiciones. En ciertos aspectos, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se co-formula con y/o co-administra con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos en los cuales la actividad de IL-12, TNFa, o IL-18 es perjudicial. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo anti-hlL-12, anti-TNFa o anti-IL-18 de la invención se puede co-formular y/o co-administrar con uno o más anticuerpos adicionales que unen otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que unen otras citocinas o que unen las moléculas de superficie celular). Además, uno o más anticuerpos de la invención se pueden utilizar en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones inferiores de los agentes terapéuticos administrados, evitando así las toxicidades o complicaciones posibles asociadas a varias monoterapias. Será apreciado por el médico experto que cuando los anticuerpos de la invención se utilizan como parte de una terapia de combinación, una dosificación inferior del anticuerpo puede ser deseable que cuando el anticuerpo solo se administra a un sujeto (por ejemplo, un efecto terapéutico sinérgico se puede alcanzar a través del uso de la terapia de combinación que, a su vez, permite el uso de una dosis inferior del anticuerpo para alcanzar el efecto terapéutico deseado).

Se debe entender que los anticuerpos de la invención o porción de unión a antígeno de los mismos se pueden utilizar solos o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, agente terapéutico, el agente adicional es seleccionado por el experto en la técnica para su propósito previsto. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como útil para tratar la enfermedad o condición que es tratada por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que imparte una cualidad beneficiosa a la composición terapéutica, por ejemplo, un agente que afecte la viscosidad de la composición.

Se debe entender adicionalmente que las combinaciones que se incluirán dentro de esta invención son las combinaciones útiles para su propósito previsto. Los agentes mencionados posteriormente son ilustrativos y no propuestos como limitantes. Las combinaciones que son parte de esta invención pueden ser los anticuerpos de la presente invención y por lo menos un agente adicional seleccionado de las listas posteriores. La combinación también puede incluir más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición formada puede realizar su función prevista.

Algunas combinaciones son fármacos antiinflamatorios no esteroideos también referidos como NSAIDS que incluyen fármacos tal como ibuprofeno. Otras combinaciones son corticosteroides que incluyen prednisolona; los efectos secundarios bien conocidos del uso de esferoides pueden ser reducidos o incluso ser eliminados disminuyendo la dosis de esferoides requerida al tratar a pacientes en combinación con los anticuerpos de esta invención. Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la artritis reumatoide con los cuales un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención se puede combinar incluyen los siguientes: fármacos antiinflamatorios supresores de citocina (CSAID); anticuerpos o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento humano, por ejemplo, TNF, LT, IL-I, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con los anticuerpos en las moléculas de superficie celular tal como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, o sus ligandos que incluyen CD 154 (gp39 o CD40L).

Algunas combinaciones de agentes terapéuticos pueden interferir en diferentes puntos en la cascada inflamatoria autoinmune y subsecuente; los ejemplos incluyen antagonistas de TNF similares a los anticuerpos de TNF quiméricos, humanizados o humanos, D2E7, (Solicitud Estadounidense Número de Serie 08/599,226 presentada el 9 de febrero de 1996, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia), cA2 (Remicade™), CDP 571, fragmentos de anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, CDP870), y receptores de TNF p55 o p75 solubles, derivados de los mismos, (p75TNFRIgG (Enbrel™) o p55TNFRIgG (Lenercept), receptor de IL-13 soluble (sIL- 13), y también inhibidores de enzima de conversión de TNFa (TACE); similarmente los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, inhibidores de enzima de conversión de lnterleucina-1 , tal como Vx740, o IL-1RA, etc.) pueden ser eficaces por la misma razón. Otras combinaciones incluyen Interleucina 11, anti-P7s y ligando de glicoproteína de selectina P. Aún otras combinaciones implican otros protagonistas esenciales de la respuesta autoinmune que pueden actuar de manera paralela, dependiente o en combinación con la función de IL-12; son especialmente incluidos los antagonistas de IL-18 que incluyen los anticuerpos de IL-18 o receptores solubles de IL-18, o proteínas de unión de IL-18. Se ha demostrado que IL-12 e IL-18 están traslapados pero las funciones distintas y una combinación de antagonistas a ambos pueden ser las más eficaces. Aún otra combinación incluye los inhibidores anti-CD4 no agotables. Aún otras combinaciones incluyen antagonistas de la trayectoria co-estimulante CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) que incluyen los anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagónicos.

Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, también se pueden combinar con los agentes, tal como metotrexato, 6-MP, sulfasalazina de azatioprina, mesalazina, cloroquinina/hidroxicloroquinina de olsalazina, penicilamina, aurotiomalato (intramuscular y oral), azatioprina, coquicina, corticoesteroides (orales, inhalados e inyección local), agonistas de adrenorreceptores ß-2 (salbutamol, terbutalina, salmeterol), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromilo, ketotifeno, ipratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetilo de micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tal como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias tal como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de cinasa IRAK, NDC, IKK, p38 o MAP), inhibidores de enzima de conversión de I L- 1 ß (por ejemplo, Vx740), anti-P7s, ligando de glicoproteína de selectina P, inhibidores de enzima de conversión de TNFa (TACE), inhibidores de la señalización de células T tal como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o de p75 solubles y derivados p75TNFRIgG (Enbrel.TM.) y p55TNFRIgG (Lenercept), SIL-1RI, sIL- IRII, SIL-6R, receptor de IL-13 soluble (slL-13)) y citocinas antiinflamatorios (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF ). Algunas combinaciones incluyen metotrexato o leflunomida y en los casos moderados o severos de artritis reumatoide, ciclosporina.

Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la enfermedad intestinal inflamatoria con la cual un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención se puede combinar incluyen los siguiente: budesónida, factor de crecimiento epidérmico, corticosteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de lipooxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antagonistas de receptor IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-1a, anticuerpos monoclonales anti-IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de piridinil-imidazol, anticuerpos o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento humano, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con los anticuerpos en las moléculas de superficie celular tal como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes, tal como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetilo de micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tal como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias tal como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de cinasa IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP), inhibidores de enzima de conversión de 1ß (por ejemplo, Vx740), anti-P7s, ligando de glicoproteína de selectina P, inhibidores de enzima de conversión de TNFa, inhibidores de señalización de células T tal como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o p75 solubles, slL-1 Rl , slL-1RII, slL-6R, receptor de IL-13 (slL-13) soluble) y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF ).

Los ejemplos de los agentes terapéuticos para la enfermedad de Crohn en los cuales un anticuerpo o porción de unión a antígeno se puede ser combinar incluyen los siguientes: antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, D2E7 (Solicitud Estadounidense Número de Serie 08/599,226, presentada el 9 de febrero de 1996, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia), cA2 (Remicade™), CDP 571, fragmentos de anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, CDP870), constructos de TNFR-lg (p75TNFRIgG (Enbrel™) y p55TNFRIgG (Lenercept)), anti-P7s, ligando de glicoproteína de selectina P (PSGL), receptor soluble de IL- 3 (slL-13), e inhibidores de PDE4. Los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con los corticosteroides, por ejemplo, budesónida y dexametasona. Los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes tal como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y olsalazina, y los agentes que interfieren con la síntesis o acción de citocinas proinflamatorias tal como IL-1, por ejemplo, inhibidores de enzima de conversión de IL-1 (por ejemplo, Vx740) e I L- 1 ra . Los anticuerpos de la invención o porción de unión a antígeno de los mismos también se pueden utilizar con los inhibidores de la señalización de células T, por ejemplo, inhibidores de la tirosina cinasa tal como 6-mercaptopurinas. Los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con IL-11.

Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple con los cuales un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención se pueden combinar incluyen los siguientes: corticosteroides, prednisolona, metilprednisolona, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, 4-aminopiridina, tizanidina, IFNpia (Avonex; Biogen), IFN lb (Betaseron; Chiron/Berlex), copolímero 1 (Cop-1, Copaxone, Teva Pharmaceutical Industries, Inc.), oxígeno hiperbárico, inmunoglobulina intravenosa, cladribina, anticuerpos o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento humano, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con los anticuerpos en las moléculas de superficie celular tal como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, también se pueden combinar con los agentes, tal como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetilo de micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tal como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias tal como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de cinasa IRAK, NIK, IKK, p38 o MAPA), inhibidores de enzima de conversión de I L- 1 ß (por ejemplo, Vx740), anti-P7s, ligando de glicoproteína de selectina P, inhibidores de TACE, inhibidores de señalización de células T tal como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o p75 solubles, sIL-1RI, slL-1 Rll , slL-6R, receptor de IL-13 (slL-13) soluble) y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGFP).

Los ejemplos de los agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple en los cuales el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se puede combinar, incluyen IFN3, por ejemplo, IFN31a e IFN 1b, copaxona, corticosteroides, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF, y anticuerpos para el ligando CD40 y CD80.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tal como estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y de la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo.

Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo es compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Comúnmente, puesto que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, un solo bolo se puede administrar, varias dosis divididas se pueden administrar en un cierto periodo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. En ciertas modalidades es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación según lo utilizado en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para que los sujetos mamíferos sean tratados; cada unidad comprende una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la invención se dicta por y es directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y efecto terapéutico o profiláctico particular que se alcanzará, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Un intervalo ejemplar no limitante para la cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es 0.01-20 mg/kg, ó 1-10 mg/kg, ó 0.3-1 mg/kg. Se debe observar que los valores de la dosificación pueden variar con el tipo y severidad de la condición que se aliviará. Se debe entender adicionalmente que cualquier régimen de dosificación específico objeto particular se debe ajusfar en un cierto periodo de tiempo de acuerdo con la necesidad individual y juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación indicados en la presente son ejemplares solamente y no están pensados como limitantes del alcance o práctica de la composición reivindicada. 8. Usos de los anticuerpos de la invención 8.1. Usos generales del anticuerpo anti-IL-12 debido a su capacidad de unirse a IL-12, los anticuerpos anti-IL-12, o porciones de los mismos, de la invención se pueden utilizar para detectar IL-12, en un aspecto, hlL-12 (por ejemplo, en una matriz de muestra, en un aspecto, una muestra biológica, tal como suero o plasma), usando un inmunoensayo convencional, tal como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA) o inmunohistoquímica de tejido. La invención proporciona un método para detectar IL-12 en una muestra biológica que comprende el contacto de una muestra con un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención y la detección del anticuerpo (o porción de anticuerpo) unido a IL-12 o anticuerpo no unido (o porción de anticuerpo), para de tal modo detectar IL-12 en la muestra. El anticuerpo se etiqueta directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables convenientes incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas convenientes incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos convenientes incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes convenientes incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de materiales radioactivos convenientes incluyen 125 I, 131 I, 35 S, ó 3 H. La detección de IL-12 en una muestra puede ser útil en un contexto de diagnóstico, por ejemplo en la diagnosis de una condición asociada a IL-12 creciente, y/o puede ser útil en la identificación de un sujeto que pueda beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-IL-12.

Alternativamente para etiquetar el anticuerpo, IL-12 se puede probar en una muestra por un ¡nmunoensayo de competencia que utiliza, por ejemplo, los estándares de rhlL-12 etiquetados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IL-12 sin etiqueta, tal como un anticuerpo anti-hlL-12. En este análisis, se combina la muestra, los estándares rhlL-12 etiquetados, y el anticuerpo anti-hlL-12 y se determina la cantidad del estándar de rhlL-12 etiquetado unido al anticuerpo sin etiqueta. La cantidad de hlL-12 en la muestra es proporcionalmente inversa a la cantidad del estándar de rhlL-12 etiquetado unido al anticuerpo anti-hlL- 2.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención son capaces de neutralizar la actividad de IL-12 ¡n vitro e in vivo, en un aspecto, una actividad de hlL-12. Por consiguiente, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de ia invención se pueden utilizar para inhibir la actividad de IL-12, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene IL-12, en temas humanos o en otros temas mamíferos que tienen IL-12 con el cual un anticuerpo de la invención reacciona de manera cruzada (por ejemplo, primates tal como babuino, mono Cynomolgus y Rhesus). En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que neutraliza la actividad de IL-12 de humano, y por lo menos una IL-12 de primate adicional seleccionado del grupo que consiste de IL-12 de babuino, IL-12 de mono tití, IL-12 de chimpancé, IL-12 de cynomolgus y IL-12 de rhesus, pero que no neutraliza la actividad de IL-12 de ratón. En un aspecto, IL-12 es IL-12 de humano. Por ejemplo, en un cultivo celular que contiene, o se sospecha que contiene hlL-12, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede agregar al medio de cultivo para inhibir la actividad de hlL-12 en el cultivo.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la actividad de IL-12 en un sujeto que sufre de un trastorno en el cual la actividad de IL-12 es perjudicial. IL-12 se ha implicado en la patofisiología de una gran variedad de trastornos (Windhagen y colaboradores, (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996; Morita y colaboradores (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-314; Bucht y colaboradores, (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367; Fais y colaboradores (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Pyrronchi y colaboradores, (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Monteleone y colaboradores, (1997) Gastroenterology. 112:1169-1178, y Berrebi y colaboradores, (1998) Am. J. Path 152:667-672; Pyrronchi y colaboradores (1997) Am. J. Path. 150:823-832, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). La invención proporciona los métodos para inhibir la actividad de IL-12 en un sujeto que sufre de tal trastorno, en donde el método comprende la administración al sujeto de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención tal que la actividad de IL-12 en el sujeto sea inhibida. En un aspecto, IL-12 es IL-12 de humano y el sujeto es un sujeto humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que expresa IL-12 con el cual un anticuerpo de la invención reacciona de manera cruzada. Incluso el sujeto puede ser un mamífero en el cual se ha introducido hlL-12 (por ejemplo, por administración de hlL-12 o por expresión de un transgén de hlL-12). Un anticuerpo de la invención se puede administrar a un sujeto humano para propósitos terapéuticos. Por otra parte, un anticuerpo de la invención se puede administrar a un mamífero no humano que expresa un IL-12 con el cual el anticuerpo reacciona de manera cruzada para propósitos veterinarios o como modelo animal de la enfermedad humana. Con respecto a esté último, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, prueba de las dosificaciones y evolución de la administración).

Según lo utilizado en la presente, la frase "un trastorno en donde la actividad de IL-12 es perjudicial" se piensa para que incluya las enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de IL-12 en un sujeto que sufre del trastorno ha mostrado ser o se sospecha que sea responsable de la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye a un agravamiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual la actividad de IL-12 es perjudicial es un trastorno en el cual se espera que la inhibición de la actividad de IL-12 alivie los síntomas y/o progreso del trastorno. Tales trastornos se pueden evidenciar, por ejemplo, por un aumento de la concentración de IL-12 en un líquido biológico de un sujeto que sufre del trastorno (por ejemplo, un aumento de la concentración de IL-12 en suero, plasma, líquido sinovial, etc. del sujeto), que puede ser detectada, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-IL-12 según lo descrito anteriormente. Existen numerosos ejemplos de los trastornos en los cuales la actividad de IL-12 es perjudicial. En un aspecto, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden utilizar en la terapia para tratar las enfermedades o trastornos descritos en la presente. En otro aspecto, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden utilizar para la fabricación de una medicina para tratar las enfermedades o trastornos descritos en la presente. El uso de los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención en el tratamiento de algunos trastornos específicos no limitantes se discute más detalladamente a continuación.

La interleucina-12 desempeña una función esencial en la patología asociada a una variedad de enfermedades que implican elementos inmunes e inflamatorios. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis de Lyme, artritis psoriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus sistémico eritematoso, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, esclerodermia, dermatitis atópica, enfermedad de anfitrión contra injerto, rechazo a trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con el trasplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, purpurea de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parásitas, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, afecciones malignas, paro cardíaco, infarto del miocardio, enfermedad de Addison, caso esporádico, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) en adultos, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriásica, artropatía eolítica ulcerosa, sínovitis enteropática, clamidia, yersinia y artropatía relacionada con salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arteriosclerosis, alergia atópica, Enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad de Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerótica primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de enfermedad de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas a la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, falla ovárica, falla ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial postinflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la enfermedad de tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de tejido conectivo mezclada, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada al lupus sistémico eritematoso, enfermedad pulmonar asociada a la dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de Sjodgren, enfermedad pulmonar asociada la espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada a la hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis por radiación, bronquitis obliterante, pulmonía eosinófila crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial postinfección, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide), hepatitis autoinmune tipo 2 (hepatitis de anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia mediada autoinmune, resistencia a la insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada al trasplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada al trasplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerótica primaria, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS en enfermedad renal, glomerulonefritides, vasulitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad de esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), diabetes mellitus dependiente de insulina, oftalmía simpatética, hipertensión pulmonar después de enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad de tiroides autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune con bocio (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria y vitíligo. Los anticuerpos humanos, y porciones de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para tratar las enfermedades autoinmunes, particularmente las asociadas a la inflamación, que incluyen, espondilitis reumatoide, alergia, diabetes autoinmune, y uveítis autoinmune.

En ciertos aspectos, los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, se utilizan para tratar la artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de insulina y psoriasis. 8.2. Uso del anticuerpo anti-IL-12 en artritis reumatoide La interleucina-12 se ha implicado en el desempeño de una función en enfermedades inflamatorias tal como artritis reumatoide. El mensaje de IL-12p40 inducible se ha detectado en fluido sínovial de los pacientes con artritis reumatoide y IL-12 ha mostrado estar presente en los fluidos sinoviales de los pacientes con artritis reumatoide (ver, Morita y colaboradores, (1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306-314, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia). Las células positivas a IL-12 se han encontrado presentes en la capa subíntima del sinovio de artritis reumatoide. Los anticuerpos humanos, y porciones de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para tratar, por ejemplo, la artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis de Lyme, espondilitis reumatoide, osteoartritis y artritis gotosa. Comúnmente, el anticuerpo, o porción de anticuerpo, se administra sistémicamente, aunque para ciertos trastornos, la administración local del anticuerpo o porción de anticuerpo puede ser beneficiosa. Un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención también se puede administrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

En el modelo murino de artritis inducida por colágeno (CIA) para la artritis reumatoide, el tratamiento de ratones con un mAb anti-IL-12 (anticuerpo monoclonal IL-12 anti-ratón de rata, C17.15) antes de la artritis suprimió profundamente el inicio, y redujo la incidencia y gravedad de la enfermedad. El tratamiento con mAb anti-IL-12 temprano después del inicio de la artritis redujo la gravedad, pero el tratamiento tardío de los ratones con mAb anti-IL-12 después del inicio de la enfermedad tuvo un efecto mínimo sobre la gravedad de la enfermedad. 8.3. Uso del anticuerpo anti-IL-12 en la enfermedad de Crohn la interleucina-12 también desempeña una función en la enfermedad intestinal inflamatoria, y enfermedad de Crohn. La expresión creciente de IFN-? y IL-12 ocurre en la mucosa intestinal de los pacientes con enfermedad de Crohn (ver, por ejemplo, Fais y colaboradores, (1994) J. Inferieron Res. 14: 235-238; Pyrronchi y colaboradores, (1997) Amer. J. Pathol. 150: 823-832; Monteleone y colaboradores, (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178; Berrebi y colaboradores, (1998) Amer. J. Pathol. 152: 667-672, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Los anticuerpos anti-IL-12 han mostrado para suprimir la enfermedad en modelos ratón con colitis, por ejemplo, ratones transgénicos para IL-12 con colitis inducida con TNBS, y recientemente en ratones transgénicos para IL-10. Por consiguiente, los anticuerpos, y porciones de anticuerpo, de la invención, se pueden utilizar en el tratamiento de las enfermedades intestinales inflamatorias. 8.4. Uso del anticuerpo anti-IL-12 en la esclerosis múltiple La interleucina-12 se ha implicado como mediador esencial de la esclerosis múltiple. La expresión del mensaje inducible en p40 de IL-12 o IL-12 por si misma se puede mostrar en las lesiones de pacientes con esclerosis múltiple (Windhagen y colaboradores, (1995) J. Exp. Med 182: 1985-1996, Drulovic y colaboradores, (1997) J. Neurol. Sci. 147:145-150, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Los pacientes con esclerosis múltiple progresiva crónica tienen niveles elevados en circulación de IL-12. Las investigaciones con las células T y las células que presentan el antígeno (APCs) de los pacientes con esclerosis múltiple, revelaron una serie de interacciones inmunes autoperpetuables como la base de la esclerosis múltiple progresiva que conduce a una inmunorespuesta de tipo Th1. La secreción creciente de IFN-? de las células T condujo a la producción creciente de IL-12 por las APCs, que perpetuaron el ciclo que condujo a un estado crónico de una activación y enfermedad inmune de tipo Th1 (Balashov y colaboradores, (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. 94: 599- 603, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia). La función de IL-12 en la esclerosis múltiple se ha investigado usando modelos experimentales ratón y rata con encefalomielitis alérgica (EAE) de la esclerosis múltiple. En un modelo de EAE en reincidencia-remisión de la esclerosis múltiple en ratones, el tratamiento previo con mAb anti-IL-12 retrasó la parálisis y redujo los conteos clínicos. El tratamiento con mAb anti-IL-12 en el pico de la parálisis o durante el período de remisión subsecuente redujo los conteos clínicos. Por consiguiente, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden servir para aliviar los síntomas asociados a la esclerosis múltiple en seres humanos. 8.5. Uso del anticuerpo anti-IL-12 en la diabetes mellitus dependiente de insulina La interleucina-12 se ha implicado como mediador importante de la diabetes mellitus dependiente de la insulina (IDDM, por su abreviatura en inglés). La IDD fue inducida en ratones NOD por la administración de IL-12, y los anticuerpos anti-IL-12 fueron protectores en un modelo de transferencia adoptiva de IDDM. Los pacientes con inicio temprano de IDDM experimentan frecuentemente un llamado "período de luna de miel" durante el cuál se mantiene una cierta función residual de la célula del islote. Estas células residuales del islote producen la insulina y regulan los niveles de glucosa en sangre de una mejora manera que la insulina administrada. El tratamiento de estos pacientes de inicio temprano con un anticuerpo anti-IL-12 puede prevenir la destrucción adicional de las células del islote, para de tal modo mantener una fuente endógena de insulina. 8.6. Uso del anticuerpo anti-IL-12 en la psoriasis La interleucina-12 se ha implicado como mediador esencial en la psoriasis. El psoriasis implica las lesiones de piel agudas y crónicas que se asocian a un perfil de expresión de citocina tipo TH1. (Hamid y colaboradores (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1: 225-231; Turka y colaboradores (1995) Mol. Med. 1: 690-699, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Los ARNms p35 y p40 de IL-12 fueron detectados en muestras de piel humana enfermas. Por consiguiente, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden servir para aliviar los trastornos crónicos de la piel tal psoriasis. 8.7. Usos generales del anticuerpo anti-IL-18 Debido a su capacidad de unir a IL-18, los anticuerpos anti-IL-18, o porciones de los mismos, de la invención se pueden utilizar para detectar a IL-18, en un aspecto, hlL-18 (por ejemplo, en una matriz de muestra, en un aspecto, una muestra biológica, tal como suero o plasma), usando un inmunoensayo convencional, tal como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA) o inmunohistoquímica de tejido. La invención proporciona un método para detectar a IL-18 en una muestra biológica que comprende el contacto de una muestra con un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención y detectar el anticuerpo (o porción de anticuerpo) unido a IL-18 o el anticuerpo no unido (o porción de anticuerpo), para de tal modo detectar a IL-18 en la muestra. El anticuerpo se etiqueta directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables convenientes incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas convenientes incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos convenientes incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes convenientes incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de materiales radioactivos convenientes incluyen 125l, 131l, 35S, o 3H. La detección de IL-18 en una muestra puede ser útil en un contexto de diagnóstico, por ejemplo en la diagnosis de una condición asociada a IL-18 creciente, y/o puede ser útil en la identificación de un sujeto que pueda beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-IL- 8.

Alternativamente al etiquetado del anticuerpo, el IL-18 se puede probar en una muestra por un inmunoensayo de competencia que utiliza, por ejemplo, los estándares de rhlL-18 etiquetados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IL-18 sin etiquetar, tal como un anticuerpo anti-hlL-18. En este análisis, se combina la muestra, estándares rhlL-18 etiquetados y el anticuerpo anti-hlL-18, y se determina la cantidad de estándar rhlL-18 etiquetado unido al anticuerpo sin etiquetar. La cantidad de hlL-18 en la muestra es proporcionalmente inversa a la cantidad de estándar de rhlL-18 etiquetado unido al anticuerpo anti-hlL-18.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención son capaces de neutralizar la actividad de IL-18 in vitro e in vivo, en un aspecto, una actividad de hlL-18. Por consiguiente, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para inhibir la actividad de IL-18, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene IL-18, en sujetos humanos o en otros sujetos mamíferos que tienen IL-18 con el cual un anticuerpo de la invención reacciona de manera cruzada (por ejemplo, primates tal como babuino, Cynomolgus y Rhesus). En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que neutraliza la actividad de IL-18 humano, y por lo menos un IL-18 de primate adicional seleccionado del grupo que consiste de IL-18 de babuino, IL-18 de mono tití, IL-18 de chimpancé, IL-18 de cynomolgus y IL-18 de rhesus, pero que no neutraliza la actividad de IL-18 de ratón. En un aspecto, IL-18 es IL-18 humano. Por ejemplo, en un cultivo celular que contiene, o que se sospecha que contiene hlL-18, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede agregar al medio de cultivo para inhibir la actividad de hlL-18 en el cultivo.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la actividad de IL-18 en un sujeto que sufre de un trastorno en el cual la actividad de IL-18 sea perjudicial. La interleucina-18 desempeña una función esencial en la patología asociada a una variedad de enfermedades que implican elementos inmunes e inflamatorios.

Según lo utilizado en la presente, la frase "un trastorno en el cual la actividad de IL-18 es perjudicial" se piensa para incluir las enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de IL-18 en un sujeto que sufre del trastorno ha mostrado ser o se sospecha que sea responsable de la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye a un agravamiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual la actividad de IL-18 es perjudicial es un trastorno en el cual se espera que la inhibición de la actividad de IL-18 alivie los síntomas y/o progreso del trastorno. Tales trastornos se pueden evidenciar, por ejemplo, por un aumento de la concentración de IL-18 en un fluido biológico de un sujeto que sufre del trastorno (por ejemplo, un aumento de la concentración de IL-18 en suero, plasma, fluido sinovial, etc. del sujeto), que puede ser detectado, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-IL-18 según lo descrito anteriormente. Existen numerosos ejemplos de trastornos en los cuales la actividad de IL-18 es perjudicial. En un aspecto, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden utilizar en terapia para tratar las enfermedades o trastornos descritos en la presente. En otro aspecto, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden utilizar para la fabricación de una medicina para tratar las enfermedades o trastornos descritos en la presente. El uso de los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención en el tratamiento de algunos trastornos específicos no limitantes se discute más detalladamente a continuación.

La invención proporciona las composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades o condiciones que requieren la modulación de la actividad de IL-18. Estas enfermedades o condiciones incluyen las enfermedades autoinmunes, diabetes tipo I, artritis reumatoide, rechazo de injerto, enfermedad intestinal inflamatoria, sepsis, esclerosis múltiple, enfermedades cardíacas isquémicas (incluyendo ataques cardíaco), lesión isquémica de cerebro, hepatitis crónica, psoriasis, pancreatitis crónica, pancreatitis aguda y similares.

Por consiguiente, los anticuerpos anti-IL-18 o porciones de unión a antígeno de los mismos, o vectores que expresan el mismo ¡n vivo se indican para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, diabetes tipo I, artritis reumatoide, rechazo de injerto, enfermedad intestinal inflamatoria, sepsis, esclerosis múltiple, enfermedad cardíaca isquémica incluyendo ataques cardíacos agudos, lesión isquémica de cerebro, hepatitis crónica, psoriasis, pancreatitis crónica y pancreatitis aguda y enfermedades similares, en las cuales existe una expresión anormal de IL-18, que conduce a un exceso de IL-18 o en algunos casos a complicaciones debido a IL-18 administrado de manera exógena. 8.8. Uso del anticuerpo anti-IL-18 en la lesión hepática Un aspecto de la presente invención es proporcionar nuevos medios para tratar y/o evitar la lesión hepática. Se ha encontrado que un inhibidor de IL-18 es eficaz en la prevención y tratamiento de los daños hepáticos. La invención por lo tanto también se relaciona con el uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la lesión hepática. Más específicamente, la invención se relaciona con el tratamiento y/o prevención de las lesiones hepáticas causadas por hepatitis alcohólica, hepatitis viral, hepatitis inmune, hepatitis fulminante, cirrosis de hígado, y cirrosis biliar primaria. 8.9. Uso del anticuerpo anti-IL-18 en la artritis También se ha encontrado de acuerdo con la presente invención que un inhibidor de IL-18 es eficaz en la terapia de la artritis. El efecto terapéutico incluye la disminución de la gravedad de la enfermedad, así como la prevención de la propagación de la enfermedad. La invención por lo tanto se relaciona con el uso de un inhibidor de IL-18 para el tratamiento y/o prevención de la artritis. Esto se encuentra inesperado, puesto que el estado de la técnica descrito anteriormente, no habría podido concluir que un bloqueo de un factor específico implicado en la artritis, es decir interleucina IL-18, conduciría al alivio de la artritis o incluso a la curación de una articulación artrítica enferma.

El término "artritis" incluye todos los diferentes tipos de artritis y condiciones artríticas, artritis aguda y crónica, según lo definido por ejemplo en Homepage of the Department of Orthopaedics of the University of Washington on Arthritis. Los ejemplos para las condiciones artríticas son la espondilitis anquilosante, dolor de espalda, síndrome de deposición del túnel carpiano, síndrome de Ehlers-Danlos, gota, artritis juvenil, lupus eritematoso, miositis, osteogénesis imperfecta, osteoporosis, poliarteritis, polimiositis, artritis psoriásica, síndrome de Reiter, escleroderma, artritis con enfermedad intestinal, enfermedad de Behcets, artritis infantil, enfermedad de articulación degenerativa, fibromialgia, artritis infecciosa, enfermedad de Lyme, síndrome de Marfan, osteoartritis, osteonecrosis, enfermedad de Pagets, polimialgia reumática, pseudogota, distrofia simpatética de reflejos, artritis reumatoide, reumatismo, síndrome de Sjogren, poliposis adenomatosa familiar y similares.

La artritis reumatoide (RA) causa inflamación en el revestimiento de las articulaciones (membrana sinovial, un epitelio de una capa celular) y/o órganos internos. La enfermedad tiende a persistir durante muchos años, afecta comúnmente a muchos y diferentes articulaciones a través del cuerpo y finalmente puede causar daño al cartílago, hueso, tendones, y ligamentos. Las articulaciones que se pueden afectar por la RA, por ejemplo, son las articulaciones ubicadas en el cuello, hombros, codos, caderas, muñecas, manos, rodillas, tobillos y pies. En muchos casos, las articulaciones se inflaman en un patrón simétrico en la RA.

La RA es frecuente en aproximadamente 1% de la población en los Estados Unidos de Norteamérica, que está distribuida dentro de todos los grupos étnicos y edades. Ocurre en todo el mundo, y las mujeres exceden en número a los hombres en 3 a 1 entre los tienen la RA.

Se ha encontrado que la administración de un inhibidor de IL-18 disminuye significativamente la erosión de cartílago en un modelo murino de artritis. La presente invención también se relaciona así con el uso de un inhibidor de IL-18 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la destrucción de cartílago. 8.10. Uso general del anticuerpo anti-TNFa El factor alfa de necrosis tumoral es una citocina proinflamatoria de múltiples funciones secretada predominantemente por los monocitos/macrófagos que tiene efectos sobre el metabolismo de lípidos, coagulación, resistencia a insulina, y función endotelial. El TNFa es un homotrímero soluble de subunidades de proteína de 17 kD. También existe una forma de precursor de 26 kD unido a membrana de TNFa. Se encuentra en células sinoviales y macrofagos en tejidos. Las células distintas a los monocitos o macrofagos también producen el TNFa. Por ejemplo, las líneas celulares tumorales no monocíticas humanas producen TNFa así como linfocitos T periféricos de sa'ngre CD4+ y CD8+ y algunas líneas de células T y B cultivadas producen TNFa. Está implicado en, pero no se limita a, artritis reumatoide, y ocurre en muchas enfermedades inflamatorias. Los receptores para TNFa están en varias células mononucleares, en la membrana sinovial, así como en la sangre periférica y líquido sinovial. TNFa es un mediador inflamatorio crítico en la artritis reumatoide, y puede por lo tanto ser un objetivo útil para la inmunoterapia específica.

TNFa causa acciones proinflamatorias que dan lugar a lesión de tejido, tal como degradación de cartílago y hueso, inducción de moléculas de adherencia, inducción de actividad procoagulante en las células endoteliales vasculares, aumento de la adherencia de neutrófilos y linfocitos, y estímulo de la liberación del factor de activación de plaquetas de los macrofagos, neutrófilos y células endoteliales vasculares. La evidencia reciente asocia el TNFa a infecciones, trastornos inmunes, patologías neoplásicas, patologías autoinmunes y patologías de injerto-contra-anfitrión.

Se cree que TNFa desempeña una función fundamental en la sepsis gram-negativa y choque endotóxico, incluyendo fiebre, malestar, anorexia, y caquexia. La endotoxina activa fuertemente la producción de macrófagos/monocitos y la secreción de TNFa y otras citocinas. TNFa y otras citocinas derivados de monocitos median las respuestas metabólicas y neurohormonales a la endotoxina. La administración de endotoxina a los voluntarios humanos produce una enfermedad aguda con síntomas similares a la gripe incluyendo fiebre, taquicardia, velocidad metabólica creciente y liberación de la hormona de tensión. El TNFa circulante aumenta en los pacientes que sufren de sepsis gram-negativa.

Así, el TNFa se ha implicado en enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, infecciones virales, bacterianas y parasitarias, afecciones, y/o enfermedades neurodegenerativas y es un objetivo útil para la terapia biológica específica en enfermedades, tal como artritis reumatoide y enfermedad de Crohn. Los efectos beneficiosos en ensayos de etiqueta abierta con un anticuerpo monoclonal quimérico para TNFa se han descrito con la supresión de inflamación y con tratamiento repetido acertado después de la recaída en la artritis reumatoide y enfermedad de Crohn.

Los antisueros o mAb neutralizantes para TNFa que se han mostrado en mamíferos anulan los cambios fisiológicos adversos y previenen la muerte después de un desafío mortal en la endotoxemia y bacteremia experimentales. Adalimumab (también conocido por su marca registrada HUMIRA® disponible de Abbott Laboratories) es un anticuerpo monoclonal recombinante humano específico para TNFa. Este anticuerpo monoclonal une a TNFa y bloquea su interacción con los receptores de TNFa de superficie celular p55 y p75. Este anticuerpo monoclonal es absolutamente específico para TNFa puesto que aparece no inhibir la actividad de TNF . En presencia del complemento, adalimumab somete a lisis la superficie de las células que expresan TNFa.

Ejemplos 1. Aislamiento y purificación del anticuerpo anti-IL-12 1.1. Estrategia de purificación Durante la conclusión de una operación de cultivo celular de producción diseñada para producir los anticuerpos IL-12, el caldo fue ajustado lentamente y mantenido a pH 3.5 durante un período de 1 hora, después fue ajustado nuevamente a pH 5, seguido por centrifugación (11,000 x g) para eliminar las células e impurezas precipitadas. El sobrenadante de centrifugación fue clarificado adicionalmente por un tren de filtración de dos etapas (filtración profunda Cuno 90ZA, seguida por filtración a 0.45/0.2 µ?t?). Después de la clarificación, el anticuerpo fue capturado y purificado adicionalmente en un procedimiento de cinco etapas.

La cosecha de cultivo celular acidificada aclarada fue titulada a pH 7 con NaOH 3 N en un periodo de 30 minutos y fue filtrada antes de la cromatografía. una columna de 1.0 cm de diámetro x 21.6 cm de largo (17 mi de volumen de lecho) fue utilizada para esta operación a escala de referencia. Una columna de 1.0 cm x 15.1 cm (11.9 mi de volumen de lecho) fue utilizada en la etapa temprana para generar el material para el desarrollo de purificación excelente. Una columna de 20 cm x 21 cm (6.6 I de volumen de lecho) fue utilizada a la escala de 300 I. Las columnas fueron llenadas con resina MabSelect™ (GE Healthcare, cat# 17-5199-04, lote# 302070); la asimetría y altura de una placa teórica equivalente (HETP, por su abreviatura en inglés) fueron medidas para determinar la calidad del relleno.

La columna fue equilibrada previamente con 25 mM de Tris, 100 mM de NaCI, solución amortiguadora a pH 7.2. Después del equilibrio, la columna fue cargada con la cosecha de cultivo celular clarificada (v = 300 cm/hr para la carga inicial de 35 g Ab/I de resina, entonces 150 cm/hr hasta el final de la carga, 40 g/l máximo). La columna entonces fue lavada con 3 volúmenes de columna (CV, por su abreviatura en inglés) de solución amortiguadora de equilibrio (v = 300 cm/hr) seguidos por 3 CVs de 20 mM de ácido cítrico/citrato de Na, 0.5 M NaCI, lavado con solución amortiguadora a pH 6, seguido por 3 CVs adicionales de solución amortiguadora de equilibrio. El producto entonces fue eluído con 0.1 M de ácido acético, 100 mM de NaCI, pH 3.5 (v = 300 cm/hr). El eluato de columna fue recolectado de una desviación inicial A28o de 0.1 AU a una lectura de 0.1 AU en el borde de salida del pico de elución (2 mm de trayectoria de flujo celular) y fue titulado a pH 5 inmediatamente con 1.0 M de Tris, solución amortiguadora de pH 10.

La capacidad de unión dinámica (DBC) de la columna MabSelect™ fue determinada por una estrategia de carga de caudal simple o de carga de caudal doble. La carga de caudal simple fue evaluada a 300 cm/hr a través de toda la carga. La estrategia de carga de caudal doble fue realizada cargando la columna con hasta 35 mg de proteína/ml de resina a una velocidad lineal de 300 cm/hr, y después reduciendo la velocidad lineal a la mitad para permitir un tiempo de residencia más largo para la última porción de la carga. En cada experimento la columna fue sobrecargada para asegurar la saturación de la columna a las condiciones de carga dadas. El material de flujo directo para cada análisis fue fraccionado para determinar la cantidad total de anticuerpo cargada antes de que el 5% fuera detectado en la ruptura. Los títulos de las fracciones de flujo directo fueron obtenidos por el análisis de HPLC Poros A™.

La recuperación fue calculada por espectrofotometría UV a 280 nm (coeficiente de extinción de 1.42 para una solución de 1 mg/ml usando una longitud de trayectoria de 1 cm) para las muestras de elución. Los títulos de carga fueron determinados por el análisis de HPLC Poros A™. SEC-HPLC, ELISA HCP y ELISA de proteína A, fueron realizados para la evaluación de la pureza, eliminación de HCP y niveles de proteína A lavada.

El eluato de MabSelect™ fue titulado a pH 8 ± 0.1 con la solución amortiguadora de 1 M de Tris, pH 10, y después fue diluido a 6.5 ± 0.5 mS/cm con agua. El material diluido fue mezclado durante un período de una hora, seguido por un deslipidizante de Cuno™ y filtraciones de 0.45/0.22 pm.

Una columna de 1.0 cm de diámetro x 29 cm de largo (22.8 mi de volumen de lecho) fue utilizada para la cromatografía de Q Sefarose™ Fast Flow a la escala de referencia. Una columna de 20 cm x 29.5 cm (9.27 I de volumen de lecho) fue utilizada a una escala de 300 I. Las columnas fueron llenadas con la resina Q Sefarose™ FF (GE Healthcare, Piscataway, NJ, cat# 17-0510-04, lote# 296307 para la escala de 300 I, lote# 303189 para la escala de referencia); la asimetría y HETP fueron medidos para determinar la calidad de relleno.

El equilibrio de la resina fue logrado con 25 mM de Tris, 50 mM de NaCI, pH 8. La cromatografía fue operada en el modo de flujo directo donde las impurezas relacionadas al proceso fueron absorbidas en la resina y los anticuerpos fluyeron a través de la columna. La carga de la columna fue realizada a 150 cm/hr, y la recolección de flujo directo (FTW) fue comenzada cuando A2eo se eleve por encima de 0.2 AU. Las muestras del material de FTW fueron recolectadas a intervalos que corresponden a 30, 50, 80, 90 y 100 g de cargas de proteína/l de resina. La columna entonces fue lavada con la solución amortiguadora de equilibrio y la recolección de FTW fue continuada hasta que A28o volvió a una OD de 0.2 AU. FTW Q Sefarose™ fue diluido con un volumen igual de 1.7 M (NH4)2S04, 50 mM de fosfato de Na, pH 7 (SR-343) inmediatamente, para prepararse para la carga a la columna Phenyl Sefarose™ HP. Esta solución fue filtrada a 0.2 pm y fue etiquetada la carga de Sefarose™ HP.

La recuperación fue calculada por espectrofotometría UV a 280 nm (coeficiente de extinción de 1.42 para una solución de 1 mg/ml usando una longitud de trayectoria de 1 cm). SEC-LA HPLC, ELISA HCP y ELISA de proteína A fueron realizados para la evaluación de la pureza, eliminación de HCP y eliminación de la proteína A lavada.

Una columna de 1.0 cm de diámetro x 15.6 cm de largo (12.3 mi de volumen de lecho) fue utilizada para la cromatografía Phenyl Sefarose™ HP a la escala de referencia. Una columna de 20 cm x 15.5 cm (4.87 I de volumen de lecho) fue utilizada a la escala de 300 I. Las columnas fueron llenadas con la resina de Phenyl Sefarose™ HP (GE Healthcare, Piscatway, NJ, cat# 17-1082-04, lote# 298138); la asimetría y HETP fueron medidos para determinar la calidad del relleno.

El equilibrio de la resina fue logrado con 25 mM de fosfato de sodio, 0.85 M de sulfato de amonio, pH 7. La carga máxima de proteína para esta etapa fue de = 40 g de proteína por litro de resina (v = 75 cm/hr). Después de la carga, la columna fue lavada con 3 volúmenes de columna de 20 mM de fosfato de sodio, 1.1 M de (NH )2S04, pH 7 (SR-290). El producto fue eluído realizando un gradiente de etapa usando 15 mM de fosfato de sodio, pH 7, 0.5 M de sulfato de amonio a una velocidad lineal de 37.5 cm/hr. El eluato de columna fue recolectado de una desviación inicial A28o de 1.0 AU a una lectura de 0.2 AU en el borde de salida del pico de elución. Los agregados y otras impurezas permanecen unidos a la resina y fueron separados de la columna de HIC por lavado con agua o 0.5 M de NaOH.

La recuperación fue calculada por espectrofotometría UV a 280 nm (coeficiente de extinción de 1.42 para una solución de 1 mg/ml usando una longitud de trayectoria de 1 cm). SEC-LA HPLC, ELISA HCP y ELISA de proteína A fueron realizados para la evaluación de la pureza, eliminación de HCP y eliminación de proteína A lavada.

La filtración viral con el filtro Ultipor DV20™ no fue evaluada a la escala de referencia o escala de laboratorio debido a la limitación de tamaño en ambas escalas. En lugar de eso, un filtro Ultipor DV50™ fue utilizado a la escala de 300 I para generar el material preclínico. A la escala de referencia, el producto que fue eluído de la cromatografía Phenyl Sefarose™ HP fue utilizado directamente para la operación final de ultrafiltración y de diafiltración.

Un ultrafiltro de celulosa regenerado de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kD de Millipore fue utilizado para esta etapa (UF/DF). Antes de la operación, el sistema UF fue esterilizado con 1 M de NaOH y enjuagado con agua.

El filtrado de DV50™ fue concentrado inicialmente a 30 mg/ml de proteína. Fue realizad la diafiltracion continuo con 2 volúmenes (DV) de 5 mM de histidina, 5 mM de metionina, 0.5% de sucrosa, 2% de manitol (peso/volumen), pH 5.9 (solución amortiguadora de diafiltracion) (SR-265). El material retenido fue concentrado adicionalmente a 40 g/l, después fue diafiltrado con 6 DVs adicionales de solución amortiguadora de diafiltracion. El material retenido fue concentrado adicionalmente a ~75 g/l. El producto del sistema UF después fue drenado y enjuagado con solución amortiguadora de diafiltracion para recuperar el producto mantenido en el sistema. El material concentrado y el lavado fueron combinados para producir el producto de anticuerpo diafiltrado a -65 g/l. Este producto fue filtrado a 0.2 µ?p y estuvo preparado para el embotellamiento final. 1.2. Análisis de la pureza de muestra SEC-HPLC. La pureza del producto de anticuerpo fue determinada por cromatografía de exclusión de tamaño SEC-HPLC.

Análisis HPLC Poros A. Los títulos de anticuerpo de la cosecha, carga de abSelect™ y muestras de flujo directo fueron determinados por un análisis de captura de cuantificación Poros A™.

ELISA HCP. Los niveles de proteína de célula hospedadora fueron evaluados usando ELISA de proteína de célula hospedadora. La HCP fue insertada entre dos anticuerpos específicos en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

La placa fue recubierta con 100 µ?/???? de una mezcla de anticuerpos purificados de afinidad anti-CHO de cabra (6 pg/ml cada uno en 50 mM de bicarbonato de sodio, pH 9.4) durante 1 hora a 37°C con agitación a 80 rpm; el contenido de la placa entonces fue vertido y los sitios no específicos fueron bloqueados con 300 µ?/???? de caseína durante 1 hora a 37°C con agitación a 80 rpm. Después del bloqueo, la placa fue lavada con solución amortiguadora de lavado (1X PBS, 0.1% Tritón X-100, pH 9). Las muestras para la curva estándar fueron preparadas en serie diluyendo 5.2 mg/ml de alícuota de proteínas de célula hospedadora CHO. El diluyente para todos los reactivo fue caseína, calentada a 37°C y sonorizada durante 2 minutos, a menos que fuera indicado lo contrario. Las concentraciones para la curva estándar fueron de 300, 200, 133, 89, 59, 40, 26, y 18 ng/ml. El estándar de anticuerpo fue diluido 5X y utilizado como control de análisis. Para que el análisis sea aceptado, el valor calculado para el control debe estar en el intervalo de 45-76 ng de HCP/ml. Las muestras fueron diluidas a modo que los valores calculados se encontraran dentro del intervalo de la curva estándar. Los estándares, control, y muestras (100 µ?/????) fueron cargados sobre la placa dos veces. La placa fue incubada a 37°C con agitación a 80 rpm durante 1 hora. Después de la incubación de muestra, la placa fue lavada con la solución amortiguadora y cargada con 100 µ?/???? de anticuerpo anti-CHO de cabra biotinilado diluido a 3 pg/ml. La placa fue incubada a 37°C con agitación a 80 rpm durante 1 hora y después lavada. 100 µ?/???? de neutravidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) a 100 pg/ml fueron agregados y la placa fue incubada a 37°C con agitación a 80 rpm durante 1 hora. Un lavado final fue realizado y la placa fue incubada con 100 µ?/???? de sustrato colorimétrico Blue K HRP durante 7 minutos con agitación a la velocidad 3 en una mezcladora de placa de título Lab-Line a temperatura ambiente. La reacción fue detenida con la adición de 100 µ?/???? de 2 M de ácido fosfórico y la placa fue leída a 450 nm. El desarrollo de color es proporcional a la cantidad de HCP presente en la muestra de prueba.

ELISA de proteína A. La depuración de la proteína A fue evaluada usando un kit de análisis de Cygnus Technologies, Inc. (análisis inmunoenimétrico para la medición de la proteína A en las muestras que contienen la inmunoglobulina humana, cat# F050H). Los estándares, reactivo, y la placa fueron proporcionados en el kit. Las muestras fueron diluidas a 1 mg/ml con 1X PBS y desnaturalizadas a 100°C durante 5 minutos con la desnaturalización de solución amortiguadora (50 µ? solución amortiguadora de desnaturalización en 200 µ? de muestra). Las muestras fueron centrifugadas a 6000 x g durante 5 minutos para granular el anticuerpo desnaturalizado. 100 µ? de anticuerpo anti-proteína A biotinilado y 50 µ? de sobrenadante de muestras desnaturalizadas, controles, y estándares fueron agregados a todos los pozos. La placa fue incubada durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 180 rpm. El contenido de los pozos fue aspirado y la placa fue lavada manualmente cuatro veces con 300 µ? de solución de lavado. estreptavidina:fosfatasa alcalina fue agregada a cada pozo (100 µ?) y la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación a 180 rpm. Después de lavar la placa según lo descrito anteriormente, 100 µ? de sustrato colorimétrico de fosfatasa alcalina fue agregado a los pozos y la placa fue incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación a 180 rpm. La placa fue leída a 405 y 492 nm. Si la absorbencia para la muestra de 16 ng/ml fue de = 1.2, la placa fue incubada 30 minutos adicionales y leída nuevamente. El desarrollo de color es proporcional a la cantidad de proteína A presente en la muestra de prueba. 1.3. Resultados de la estrategia de purificación Cromatografía de proteína A. La cromatografía de proteína A de abSelect™ fue utilizada para capturar los anticuerpos anti-IL-12 y reducir el producto y procesar las impurezas relacionadas tal como fragmentos de cadena ligera simples y dobles, proteínas de célula hospedadora (HCP) CHO y ADN, etc. Los datos de la escala de referencia y de la escala de biorreactor de 300 I mostraron buena recuperación de proteína y la separación de HCP (tablas 2 y 3). Un cromatógrama representativo de la escala de biorreactor de 300 I fue proporcionado en la figura 4.

Tabla 2. Síntesis de la recuperación y pureza para el nuevo proceso a escala de referencia •Análisis ELISA HCP a 1 día. SOP PD-122.

**ND - no determinado.

Tabla 3. Síntesis del nuevo proceso a la escala de 300 litros Proteína Pureza HCP Etapa de Recuperación A lavada (% de (ng/mg proceso (%) (ng/mg monómero) Ab*) Ab) Clarificación 91 ND** 141753 ND** MabSelect™ 95 94.44 <2117.6 7.6 *Análisis ELISA HCP a 1 día. SOP PD-122.

**ND = no determinado.

***NA = no aplicable.

Los datos mostrados en la tabla 4 demuestran que la capacidad de unión dinámica de la cromatografía de MabSelect™ fue afectada por el flujo de carga, específicamente por el tiempo de residencia. Cuando se realizó la carga a una velocidad lineal constante de 300 cm/hr (tiempo de residencia de 3.4 minutos), la DBC fue de 44.3 mg de proteína/ml de resina. Cuando la estrategia de carga de caudal doble (300 cm/hr hasta 35 g/l) se intercambió a 150 cm/hr dio lugar a la DBC que aumentó 17% a 51.7 mg de proteína/ml de resina. Este aumento de DBC fue logrado duplicando el tiempo de residencia para la última porción de carga. Teóricamente, en la etapa inicial de la carga de columna, la unión ocurre predominantemente en la superficie de gránulo, los sitios que son fácilmente accesibles. Esto permite el uso de caudales más rápidos con poco impacto sobre la cinética de unión. Una vez que se ocupan todos los sitios fácilmente accesibles, las proteínas necesitan difundirse en los poros para unirse a los sitios menos accesibles. Cinéticamente este es un proceso más lento y por lo tanto, los caudales se deben reducir por consiguiente para maximizar la unión.

Tabla 4. Efecto del caudal sobre la DBC de la columna de MabSelect™ DBC a 5% Velocidad lineal Experimento BT de carga # (mg Ab/ml resina) resina, segunda velocidad lineal de 150 cm/hr hasta la Promedio 51.7 aparición del anticuerpo en el flujo directo de carga La cantidad doble de cadena ligera fue reducida de 0.5% a 0.2% (de acuerdo con HPLC-SEC) implementando una etapa intermedia de lavado. Varias soluciones amortiguadoras de lavado fueron evaluadas incluyendo 0.5 M de NaCI, 25 mM de acetato de sodio, 0.5 M de NaCI, pH 5.0 o pH 5.5 y 20 mM de ácido cítrico/citrato de Na, 0.5 M de NaCI, pH 6. Los datos de HPLC-SEC y SDS-PAGE (figura 5) demostraron una buena depuración de la especie de bajo peso molecular (LMW) de todos los experimentos. Cuando el lavado fue realizado a pH 6, la misma depuración de LMW fue observada en comparación con los lavados de pH más bajo, mientras que la recuperación de proteína del 95% fue comparable a los análisis sin la etapa intermedia de lavado.

Cromatografía Q Sepharose™ Fast Flow. La columna de Q Sefarose™ FF fue utilizada para reducir el proceso carado negativamente y las impurezas relacionadas con el producto tal como ADN y proteínas de célula hospedadora. Esta y las etapas subsecuentes constituyeron las etapas de purificación detallada en todo el proceso.

Antes de la cromatografía, la preparación de muestra de carga comenzó con el ajuste del pH y conductividad del eluato de MabSelect™. El pH del eluato fue ajustado de pH 5 a pH 8 usando 1 M de Tris, pH 10; seguido inmediatamente por una disminución de la conductividad de -15 mS a 7 mS con agua. Una vez que la conductividad del eluato de MabSelect™ se aproximó a 7 mS/cm, la precipitación comenzó a ocurrir y se dejó continuar durante una hora. El material precipitado fue retirado por un filtro deslipidizante Cuno™ o profundo 30ZA, seguido por filtraciones a 0.45/0.2 µ?t). La recuperación de proteína de esta etapa de la preparación de carga fue de 96.3% de acuerdo con la absorbencia UV a 280 nm, indicando que la mayoría del material precipitado no fue anticuerpo. Esto también fue confirmado por el análisis de SDS-PAGE de los precipitados (figura 6).

La columna de Q Sefarose™ FF fue operada en un modo de flujo directo. Un perfil de cromatografía representativo se muestra en la figura 7. No se observó ninguna ruptura evidente de las HCPs cuando se cargaron a 80 g de Ab/I de resina en la escala de biorreactor de 300 I (tabla 5). Una vez que la carga alcanzó 90 g de Ab/I de resina, el nivel de HCP se duplicó en el lavado de flujo directo (FTW), indicando que la resina alcanzó su capacidad de unión. Los niveles de HCP continuaron aumentando a una carga de 100 g de Ab/I de resina (tabla 5). Esto representa una mejora significativa con respecto al proceso de fabricación de anticuerpo actual. La carga máxima es 50 g de Ab/I de resina. Este carga representa un aumento del 60% de la capacidad de unión para la operación de Q Sefarose™. El aumento de la capacidad de carga es debido al uso de una resina de afinidad tal como la proteína A contra un intercambiador catiónico para la etapa de captura, dando así por resultado corrientes mucho de alimentación más limpias para la operación de la unidad de Q Sefarose™ .

La recuperación de proteína es comúnmente alta para esta etapa. Los datos de los análisis a escala de referencia y a escala de biorreactor de 300 I dieron lugar a producción de etapa comparables (96% y 93%) (tablas 2 y 3). La reducción de HCP (97% y 85%) también fue alcanzada a ambas escalas (tabla 2 y 3).

Tabla 5. Efecto de la cantidad de carga sobre la depuración de HCP de la columna QFF Cantidad de HCP (ng/ml)* Ab (mg/ml) HCP (ng/ml) carga de Q Filtración profunda de 436.306 7.54 58 carga de Q Cantidad de HCP (ng/ml)* Ab (mg/ml) HCP (ng/ml) carga de Q Carga del 30% 104.122 8.66 12 de FTW de Q** Carga del 50% 61.642 8.59 7 de FTW de Q** Carga del 80% 61.867 8.80 7 de FTW de Q** Carga del 90% 132.955 8.80 15 de FTW de Q** Carga del 100% de FTW 157.683 8.52 17 de Q** Cantidad de 62.808 8.24 8 FWT de Q *Análisis ELISA HCP a 1 día. SOP PD-122. **100% de carga = carga de 100 g de Ab/I de resina.

Cromatografía de HIC. La cromatografía de HIC fue utilizada para eliminar los agregados y moléculas de anticuerpo fragmentadas de los anticuerpos intactos con base en sus diferencias de hidrofobicidad. En el caso de los anticuerpos anti-IL-12, los agregados son más hidrofóbicos que los monómeros, por lo tanto se unen más fuertemente a la columna de HIC. Cuando la columna se eluye con 0.5 M de sulfato de amonio, Ab monomérico se eluye, mientras que los agregados permanecen unidos a la columna y se separan solamente en el agua. En contraste, las moléculas de anticuerpo fragmentadas o especies de bajo peso molecular (LMW) son menos hidrofóbicas que los anticuerpos intactos y por lo tanto no están unidos tal fuertemente a la resina de cromatografía de HIC. La mayor parte de las LMW se eluyen de la columna antes del pico de elución principal. Puesto que la etapa de lavado ascendente de MabSelect™ pudo eliminar a una mayoría de LMW de la corriente de proceso; el proceso de HIC fue diseñado principalmente para eliminar los anticuerpos agregados, los lixiviados de proteína A, HCPs residuales y otras impurezas relacionadas con el proceso y producto para alcanzar las especificaciones del producto final. Un perfil de elución de cromatografía representativo es proporcionado en la figura 8.

Los datos de la escala de referencia y escala de 300 I mostraron una recuperación del =90%, y una buena eliminación de agregados (>99% de pureza) por cromatografía de HIC (ver las tablas 2 y 3). La proteína A lixiviada en el material FTW de Q fue reducida de 8.21 a 0.65 ng/mg Ab (PPM) por la operación de cromatografía de HIC (ver la tabla 2).

En comparación con el proceso de fabricación actual (por ejemplo, la captura de intercambio catiónico), el proceso basado en la captura de afinidad de proteína A pudo purificar los anticuerpos anti- IL-12 de la cosecha de cultivo celular de CHO con una producción más alta y una mejor eliminación de HCP. 2. Aislamiento y purificación del anticuerpo anti-TNFa 2.1. Estrategia de purificación Clarificación de cosecha de cultivo celular. El caldo de cosecha de fermentación de cultivo celular de 13 días y un material de cosecha de fermentación clarificado de 15 días fueron utilizados como materia prima en este ejemplo. El caldo de cultivo celular fue centrifugado a 3000 rpm durante 30 minutos con la centrifuga Beckman Coulter Allegra™ 6R. El sobrenadante recolectado fue filtrado a través del filtro deslipidizante (CUNO ZeraPlus® BC0030A DELI - cápsula descartable BioCap™ 30) al caudal de 20 ml/min. La cosecha clarificada después se sometió a alícuotas y almacenó a -80°C. La cosecha congelada fue descongelada y filtrada con un filtro de acetato de celulosa de 0.22 µ m Corning® antes de cargarse a la columna. El caldo de cosecha fue centrifugado con una centrifuga de discos y filtrado adicionalmente a través del filtro profundo y filtro deslipidizante. El filtrado fue almacenado a 4°C antes de cargarse a la columna. El proceso de clarificación fue realizado a temperatura ambiente.

Cromatografía de afinidad de proteína A. Una columna de 10 mi (1.6 x 5 cm) y una columna de 40.2 mi (1.6 x 20 cm) fueron llenadas con resina de MabSelect™ (GE Healthcare). Un sistema de cromatografía AKTA Explorer™ fue utilizado para las operaciones. La columna fue llenada usando 0.5 de NaCI. La tabla 6 exhibe las condiciones de cromatografía. Las fracciones de pico de elución fueron combinadas y mantenidas durante 1 hora antes de neutralizarse a pH 8.0 con 3M de trolamina. El proceso fue realizado a temperatura ambiente.

Tabla 6. Condiciones de cromatografía de afinidad de proteína A Velocidad Volumen Etapa Solución lineal* (CV) (cm/h) 50 m de acetato de NA Almacenamiento 3 100 a pH 5, 20% de etanol *La velocidad lineal fue de 100 cm/h para una columna de 5 cm de altura y 400 cm/h para una columna de 20 cm de altura para mantener el mismo tiempo de residencia.

Preparación de material de carga de Q. El eluato neutralizado de dos análisis de proteína A fue combinado y diluido aproximadamente 0.5-1.0 veces con agua Milli Q para alcanzar una conductividad de 4.5~5.5 mS/cm (25°C). La muestra diluida fue filtrada a través de un filtro profundo (CUNO Zeta Plus BioCap® BC0030A30ZA) a un caudal de 20 ml/min seguido con un filtro de acetato de celulosa de 0.45 pm (Corning, Inc.) y entonces filtro de acetato de celulosa de 0.22 µ?t? (Corning, Inc.). La muestra entonces estuvo preparada para cargarse a la columna de Q.

Cromatografía de intercambio amónico de Q Sefarose™ . Una columna de 60.3 mi (1.6 x 30 cm) y una columna de 40.2 mi (1.6 x 20 cm) fueron llenadas con resina Q Sefarose™ Fast Flow (GE Healthcare) y se operaron por el sistema de cromatografía AKTA Explorer™. La tabla 7 exhibe las condiciones de cromatografía. El proceso fue realizado a 12°C. Las muestras de flujo directo de columna fueron recolectadas para la purificación por cromatografía de Phenyl HP.

Tabla 7. Condición de cromatografía de Q Sepharose Cromatografía de Phenyl Sefarose™ HP. Una columna de 30.2 mi (1.6 x 15 cm) fue llenada con resina de Phenyl Sefarose™ HP (GE Healthcare) y operada por el sistema de cromatografía AKTA Explorer™. El flujo directo de Q fue diluido con solución amortiguadora de 2.2 M (NH4)2SO4/40 mM de NaH2P04 a una relación de 1:1 para alcanzar una conductividad de 147 ± 11 mS/cm para la carga en la columna de Phenyl Sefarose™ HP. El pico de elución principal fue recolectado. La tabla 8 exhibe las condiciones de cromatografía. El proceso fue realizado a 12°C.

Tabla 8. Condición de cromatografía de Phenyl HP.

Velocidad Volumen Etapa Solución lineal* (CV) (cm/h) 1.1 M de (NH4)S04, 20 Equilibrio 5 75 mM de Na-P04 Ver la información de 75 Carga Variable muestra 1.1 M de (NH4)S04, 20 75 Lavado 5 mM de Na-P04 0.6 M-0.65 M de AmS04, Elución 3 37.5 11.4 mM de NaPi 25 mM de Na-P04, 20% 37.5 Regeneración 3 de iPrOH Enjuague Agua Milli Q 3 37.5 Esterilización 1 M de NaOH 3 37.5 2.2. Análisis de pureza de muestra pH. Un medidor de pH fue calibrado usando dos soluciones estándar de pH (pH 4 y 7 o pH 7 y 10) inmediatamente antes del uso. Los valores medidos estuvieron dentro de los puntos de calibración. Un medidor de pH Corning Pinnacle 545 fue utilizado.

Conductividad. La conductividad fue medida a 25°C, usando un medidor de conductividad Radiometer Analytical CDM210.

Espectroscopia UV ?2ß?· A2eo UV se midió, usando un espectrofotómetro Agilent UV8453. El coeficiente de extinción usado para adalimumab es 1.39 l/g-cm.

HPLC Poros. La concentración de anticuerpo fue determinada por HPLC Poros A (proteína A). Las diluciones de muestra fueron aplicadas para alcanzar las lecturas dentro del intervalo de calibración. Un sistema de HPLC Shimadzu fue configurado con un cartucho sensor Poros A ImmunoDetection (Applied Biosystems, Foster City, CA). La columna fue mantenida a temperatura ambiente. El sistema fue operado a 2 ml/minutos. La temperatura de bandeja del muestreador automático fue ajustada a 4°C. La absorbancia fue supervisada a 280 nm. La solución amortiguadora A fue 1X PBS. La solución amortiguadora B fue 0.1 M de ácido acético y 150 mM de cloruro de sodio. La muestra fue inyectada y el adalimumab fue eluído usando 100% de solución amortiguadora B.

HPLC WCX-10. El análisis de HPLC WCX-10 (intercambio catiónico débil) fue realizado. Un sistema de HPLC Shimadzu fue configurado con una columna analítica Dionex ProPac WCX-10y una columna protectora (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA). Ambas columnas fueron mantenidas a 30°C. El sistema fue operado a 1 ml/minutos. La temperatura bandeja de muestrador automático fue ajustada a 4°C. La absorbancia fue supervisada a 280 nm. La solución amortiguadora A fue 10 mM de fosfato de sodio dibásico, pH 7.5 y la solución amortiguadora B fue 10 mM de fosfato de sodio dibásico/500 mM de cloruro de sodio, pH 5.5. La muestra fue inyectada y el adalimumab fue eluído usando el método de gradiente según lo indicado.

HPLC-Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). El análisis de SEC fue realizado. Las diluciones de muestra fueron aplicadas para alcanzar lecturas dentro de la curva estándar. Un sistema de HPLC Shimadzu fue configurado con una columna Superóse™ 6 10/300 GL (GE Healthcare). La columna fue mantenida a temperatura ambiente. El sistema fue operado a 0.5 ml/minutos. La temperatura de bandeja de muestreador automático fue ajustada a 4°C. La absorbencia fue supervisada a 214 nm. La solución amortiguadora A fue 20 mM de fosfato de sodio dibásico/150 mM de cloruro de sodio. La muestra fue inyectada y el adalimumab fue implementado de manera isocrática usando 100% de solución amortiguadora A.

ELISA HCP. El ELISA HCP fue realizado según lo descrito anteriormente. Las diluciones de muestra fueron aplicadas para alcanzar las lecturas dentro del intervalo de calibración.

Análisis de ELISA de proteína A. El análisis de concentración de proteína A lixiviable fue realizado según lo descrito anteriormente. Los kits recubiertos previamente para el análisis de inmunoglobulina humana que contienen las muestras del análisis inmunoenzimático para la medición de las muestras de proteína A (catálogo # F050H) que incluyen el diluyente de muestra (catálogo # 1028) fueron comprados de Cygnus Technologies, Inc. El calentador de bloque (tipo 17600 Dry-Bath, Barnstead/Thermolyne) fue utilizado para la desnaturalización de la muestra. La incubadora (max 4000, Barnstead/Lab-Line) fue utilizada para la incubación de la muestra. El lector de placa (Spectramax Plus, Molecular Devices) fue utilizado para la lectura de la absorbancia a 405 nm y 495 nm.

SDS-PAGE. Las muestras fueron diluidas con solución amortiguadora de 1X PBS a una concentración designada, después un volumen igual de solución amortiguadora de carga 2X (solución amortiguadora de muestra (2X) Invitrogen™ Novex® Tris-Glycine SDS, Cat# LC2676) fue agregado a cada muestra diluida. Para reducir SDS-PAGE, un décimo volumen de reductor (agente reductor de muestra (10X) Invitrogen™ NaP AGE®, Cat# NP0004) fue agregado a cada muestra. 20 µ? de cada muestra preparada fueron cargados a cada pozo en gel (gel de 12% de Tris-glicina, Invitrogen™). El gel fue implementado debajo solución amortiguadora de aplicación de 1X Tri-glicina-SDS (diluido de solución amortiguadora de 10X Tris-glicina-SDS de ABC Storage Room) a voltaje constante de 125 V y 35 mA durante 108 minutos. SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen™, Cat# LC6060) fue utilizado para teñir el gel durante 2 horas y se destiñó con agua illi Q hasta que los pliegues fueron visibles. SeeBlue® Plus Prestained Standard (1X) (Invitrogen™ Cat# LC5925) fue utilizado como marcador en este estudio. Cada muestra preparada fue cargada en la base de la cantidad total igual de anticuerpo. 2.3. Resultados de la estrategia de purificación Capacidad de unión dinámica de MabSelect™. La capacidad de unión dinámica de una resina bajo las condiciones dadas se puede calcular por la sobrecarga de la columna y analizando el progreso resultante del producto. Comúnmente, el ajuste para la capacidad de unión máxima es para determinar la carga que corresponde al 10% de umbral y después que reduce este de 10 a 20% como margen de seguridad para asegurar la variabilidad de medición de proceso y el ligando de proteína A lixiviado con el tiempo que será cubierto. El punto de 10% de umbral para la resina de MabSelect™ está a 37.4 g de anticuerpo por I de resina (tabla 10). Esto sugirió una capacidad de unión a resina recomendada máxima de 32 g/l de resina a un caudal de 400 cm/hr bajo las condiciones estudiadas. La cantidad de carga de 32 g/l fue utilizada en este ejemplo.

Producción de recuperación de anticuerpo. Hubo dos análisis realizados para la producción de producto y el estudio de calidad. El caldo de cosecha fue clarificado según lo descrito anteriormente. Los filtrados fueron cargados en la columna MabSelect™ y se analizaron según lo descrito anteriormente. El pH de los eluatos (pH 4.06) fue más alto que el pH de reducción/desactivación viral suficiente (pH 3.5), por lo tanto la cantidad de eluato fue ajustada a pH 3.5 con ácido acético glacial diluido 10X (J.T. Baker 9522-03). En la etapa de cromatografía de Q Sefarose™, 30 g/l fueron cargados en el análisis 1 y 40 g/l en el análisis 2 para desafiar la capacidad de depuración de impureza del proceso.

La tabla 9 enumera las producciones de la etapa de recuperación de anticuerpo de estos 2 análisis y un proceso para la purificación que no utiliza la proteína A ("AY-04").

Tabla 9. Producciones de recuperación en el proceso de proteína A estudiado y en el proceso AY-04 *Datos del reporte tecnológico ABC/TO R348 Las proteínas de célula hospedadora (HCP) son las impurezas principales generadas por las células CHO. Además de las impurezas llevadas en el material de cosecha, la proteína A puede lixiviarse de la matriz de resina de proteína A en la mezcla de producto como una impureza relacionada al proceso. Un buen proceso debe demostrar su capacidad de depurar eliminar HCP y la proteína A lixiviable.

Depuración de HCP. El material de cosecha de lote fue aplicado a una columna de MabSelect™ (2.6 x 20cm). Los niveles de HCP en el eluato fueron medidos según lo descrito anteriormente y fueron comparados con el eluato de Fractogel™ S en un proceso AY-04. Los datos demostraron que la cromatografía de MabSelect™ eliminó el 99.9% de HCP cargados y que la cromatografía de Fractogel™ S de AY04 eliminó 88~93% de HCP cargadas. Según lo esperado, la resina de afinidad de proteína A tuvo mejor capacidad de depuración de HCP que la resina de intercambio catiónico de Fractogel™ S.

Lixiviables de proteína. Para detectar la proteína A lixiviada de la matriz de resina, un kit comercial de ELISA (Cygnus Technologies, Inc) fue utilizado para determinar el contenido de proteína A. La proteína A lixiviada durante la etapa de afinidad fue de aproximadamente 6 ng/mg de anticuerpo en el eluato. Después de la purificación detallada con Q Sefarose™ y Phenyl HP, la proteína lixiviada A fue reducida detectablemente a aproximadamente 0.02 ng/mg.

SDS-PAGE. Un SDS-PAGE de reducción desnaturalizado fue conducido para comparar las diferencias intermedias entre el proceso de proteína A y el proceso AY-04. 2 pg de anticuerpo de cada muestra fueron cargados. No se observa ninguna diferencia obvia en el gel (figura 10).

Estudio de pH de elución de MabSelect™. En el caso de la resina de afinidad de proteína A, el anticuerpo está unido a pH neutral y eluído bajo condición acida. Puesto que la reducción/desactivación viral a pH bajo es muy eficiente y ampliamente utilizada en los procesos de purificación de anticuerpos monoclonales, la etapa de reducción/desactivación viral se puede simplificar manteniendo el eluato ácido de MabSelect™ durante un periodo de tiempo suficiente. Fue estudiados el efecto del pH de elución sobre la producción de recuperación de anticuerpo y sobre la calidad de producto. La elución a aproximadamente pH 3.2 fue seleccionada como el pH de elución de MabSelect™ basado en su producción de recuperación más alta y calidad de producto aceptable en términos de porcentaje de monómero y variantes totales de lisina.

La figura 11 muestra que una producción de por lo menos 90% fue obtenida para un intervalo de pH de elución de 2.5 a 3.8 y una disminución significativa de la producción ocurre a pH 4. Esto sugiere que a un pH de solución amortiguadora de elución más alto que pH 4, no se podría eluir suficientemente el anticuerpo de resina de MabSelect™.

Impacto sobre la agregación de anticuerpo. Todos los niveles de monómero del anticuerpo (Adalimumab) en los eluatos de MabSelect™ fueron más altos de 92% (figura 12). Todos cumplieron los límites de acción en proceso (monómero de HPLC SEC de = 92%) de la cromatografía de Fractogel™ en el proceso AY-04 a un intervalo de pH de solución amortiguadora de elución de 2.5 a 3.8, aunque un pH de elución más alto generará menos agregados. El tiempo de residencia del eluato bajo condición ácida durante 1 a 3 horas no afectó detectablemente la agregación de anticuerpo. 3. Determinación de la concentración de proteína de célula hospedadora en composiciones de anticuerpo anti-IL-12 Este procedimiento describe la metodología de ensayo para la determinación de la concentración de proteína de célula hospedadora residual en las muestras de anticuerpo anti-IL-12. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se utiliza para insertar la proteína de célula hospedadora (antígenos) entre dos capas de anticuerpos específicos. Esto es seguido por el bloqueo de sitios no específicos con caseína. Las proteínas de célula hospedadora entonces se incuban durante cuyo tiempo las moléculas de antígeno son capturadas por el primer anticuerpo (anticuerpo de recubrimiento). Un segundo anticuerpo (anticuerpo anti-proteína de célula hospedadora biotinilado) entonces se agrega el cuál se fija al antígeno (proteínas de célula hospedadora). Se agrega el conjugado de neutravidina-HRP que une al anticuerpo anti-proteína de célula hospedadora biotinilado. Esto es seguido por la adición de sustrato azul de K. El sustrato cromogénico es hidrolizado por el anticuerpo conjugado con enzima unido, que produce un color azul. La reacción se detiene con 2 M de H3P04, que cambia el color a amarillo. La intensidad de color es directamente proporcional a la cantidad de unión a antígeno en el pozo.

Preparación de 50 mM de bicarbonato de sodio (solución amortiguadora de recubrimiento) capa, pH 9.4. A un recipiente de 1 I se agrega: 900 mi de agua Milli-Q; 4.20 g ± 0.01 g de bicarbonato de sodio. Agitar hasta que se haya disuelto completamente. Ajustar el pH a 9.4 con NaOH 1 N. Transferir a un matraz volumétrico de 1 I y llevar a un volumen con agua Milli-Q. Mezclar por inversión hasta que sea homogénea. Filtrar a través de una unidad de filtrado estéril de 0.22 pm. Almacenar a 4°C nominal durante hasta 7 días a partir de la fecha de preparación.

Preparación de 0.104 M de Na2HP04*7H20, 1.37 M de NaCI, 0.027 M de KCI, 0.0176 M de KH2P04, pH = 6.8-6.9 (10X PBS). Agregar aproximadamente 400 mi de agua Milli-Q a un recipiente de cristal. Agregar 13.94 g ± 0.01 g de Na2HP04 x 7H20. Agregar 40.0 g ± 0.1 g de NaCI. Agregar 0.01 g ± 1.00 g de KCI. Agregar 0.01 g ± 1.20 g de KH2P04. Agitar hasta que sea homogéneo. Transferir a un matraz volumétrico de 500 mi. C.s. a un volumen de 500 mi con agua Milli-Q. Mezclar por inversión. Filtrar a través de una unidad de filtrado estéril de 0.2 pm. Almacenar a temperatura ambiente por hasta 7 días.

Preparación de 1X PBS + 0.1% Tritones X-100, pH 7.40: (solución amortiguadora de lavado de placa). En un cilindro graduado de 4 I, mezclar 400 mi de 10X PBS (etapa 5.2) con 3500 mi de agua Milli-Q. Comprobar el pH, y ajustar en caso de ser necesario a 7.40 ± 0.05 con ácido clorhídrico 1 N o NaOH 1 N.

Llevar a un volumen con agua Milli-Q. Colocar firmemente Parafilm en el cilindro y mezclar por inversión hasta que sea homogéneo. Transferir a una botella de 4 I. eliminar 4 mi de 1X PBS y descartar. Agregar 4 mi de Tritón X-100 a 3996 mi de 1X PBS. Colocar en la placa de agitación y agitar hasta disolver completamente. Filtrar la cantidad de solución amortiguadora de lavado de placa necesaria para la preparación de solución amortiguadora de dilución a través de una unidad de filtrado estéril de 0.22 pm. Almacenar a temperatura ambiente por hasta 7 días.

Preparación de la mezcla de anticuerpo de recubrimiento: anti-CHO de cabra 599/626/748 (lote # G11201 a 1.534 mg/ml), la purificado por afinidad: OBSERVACION: Almacenar las soluciones madre a -80°C nominal en frascos. Preparar las alícuotas. Tomar una alícuota por placa al momento de uso. Inmediatamente antes del uso: Diluir la mezcla de anticuerpo para tener una concentración final de 4 pg/ml en 50 mM de bicarbonato de sodio frío como sigue. Por ejemplo: agregar 31 µ? de mezcla de anticuerpo de recubrimiento a 11969 µ? de solución amortiguadora de recubrimiento fría. Mezclar suavemente por inversión.

Preparación de la mezcla de anticuerpo anti-proteína de célula hospedadora de cabra biotin ¡lado, 599/626/748 (lote # G11202 a 0.822 mg/ml): OBSERVACION: Almacenar las soluciones madre a -80°C nominal en frascos. Preparar las alícuotas. Tomar una alícuota por placa al momento de uso.

Inmediatamente antes del uso: Diluir la mezcla de anticuerpo biotinilado para tener una concentración final de 1 pg/ml de caseína a 37°C ± 2°C como sigue. Por ejemplo: agregar 14.6 µ? de mezcla de anticuerpo biotinilado a 11985 µ? de caseína a 37°C ± 20C. Mezclar suavemente por inversión.

Preparación de neutravidina-HRP. Reconstituir nuevos lotes (2 mg/frasco) a 1 mg/ml como sigue: Agregar 400 µ? de agua Milli-Q al frasco, después agregar 1600 µ? de 1X PBS, para un total de 2 mi. Agitar suavemente hasta mezclarse. Almacenar a -20°C nominal. Preparar las alícuotas con un volumen deseado para utilizar 1 alícuota por placa. Preparar en un tubo de polipropileno. Calificar los nuevos lotes para determinar la concentración de trabajo. Asignar un vencimiento de 6 meses a partir de la fecha de preparación. Por ejemplo, si la concentración de trabajo fue determinada como 0.2 pg/ml entonces se preparan como sigue. Inmediatamente antes del uso: Descongelar una alícuota de neutravidina-HRP a temperatura ambiente. Diluir 1 mg/ml de solución de neutravidina a 0.1 mg/ml (100 µg/ml) con caseína a 37°C ± 2°C. Por ejemplo: Diluir X10, agregar 50 µ? de neutravidina a 450 µ? de caseína. Agitar suavemente hasta mezclarse. Diluir adicionalmente 100 Mg/ml de solución a 0.2 pg/ml con caseína a 37°C ± 2°C. Por ejemplo: Diluir X500, agregar 24 µ? de neutravidina (100 Mg/ml) a 11976 µ? de caseína. Agitar suavemente hasta mezclarse.

Preparación de 5.72 M de ácido fosfórico (solución de parada). Preparar una solución de 2 M de ácido fosfórica a partir de ácido fosfórico concentrado como sigue. A partir del % de ácido fosfórico indicado en la etiqueta, densidad (1.685 g/ml) y peso de fórmula (98 g/mole), calcular el volumen de ácido fosfórico concentrado necesario para preparar 500 mi de 2 M de ácido fosfórico. Agregar el volumen de ácido fosfórico concentrado calculado anteriormente al frasco. Llevar a un volumen con agua illi-Q y mezclar por la inversión hasta que sea homogéneo. Almacenar a temperatura ambiente por hasta 6 meses a partir de la fecha de preparación.

Preparación de la solución amortiguadora de dilución (caseína diluida X100 en 1X PBS + 0.1% Tritón X100, pH 7.4). Diluir caseína X100 a 37°C ± 2°C en 0.22 µ?? de 1X PBS filtrado estéril + 0.1% Tritón X100, pH 7.4 (anterior). Por ejemplo: Agregar 1 mi de caseína a 37°C ± 2°C a 99 mi de 0.22 gm de 1X PBS filtrado estéril + 0.1% Tritón X100, pH 7.4. Mezclar bien. Preparar nuevamente para cada uso.

Preparación de estándares. Estándares de proteína de célula hospedadora (estándares de antígeno) (lote # G11203 a 1.218 mg/ml): OBSERVACION: Almacenar las soluciones madre a -80°C nominal en 70 µ? de alícuotas. Descongelar una alícuota a temperatura ambiente. Realizar las diluciones seriales en tubos de polipropileno usando solución amortiguadora de dilución.

Preparación de muestras. En tubos de polipropileno, diluir muestras a granel finales a 24 mg/ml en solución amortiguadora de dilución. Concentración de registro. OBSERVACION: Utilizar las siguientes soluciones para preparar las muestras adicionadas y preparar 12 mg/ml de las soluciones referidas a continuación. En microtubos de polipropileno, diluir adicionalmente 24 mg/ml de soluciones a 12 mg/ml en solución amortiguadora de dilución. Cargar los pozos por triplicado para cada uno de los 12 mg/ml de soluciones en la placa para un total de 6 pozos.

Preparación de aditivo. En un microtubo de polipropileno, preparar 10 ng/ml de aditivo de proteína de célula hospedadora estándar a partir de 20 ng/ml de estándar preparado anteriormente diluyéndolo 2X con la solución amortiguadora de dilución. Cargar tres pozos con 10 ng/ml de solución de aditivo sobre la placa. Utilizar 20 ng/ml de solución estándar de la etapa 6.1 para las muestras adicionadas.

Preparación de las muestras adicionadas. En microtubos de polipropileno, adicionar 300 µ? de cada 24 mg/ml de solución a granel final con 300 µ? de 20 ng/ml de solución de aditivo (6.1). Cargar los pozos por triplicado con cada solución de muestra adicionada para un total de 6 pozos.

Preparación del control. Un intervalo de control se debe ajustar para cada nueva solución madre de control, antes de usarse en la prueba rutinaria. Solución madre de control: Preparar 150 µ? de alícuotas de un lote de concentrado de sustancia de fármaco ABT-874 y almacenar congelado a -80°C nominal por hasta tres años.

Preparación del control de trabajo. Descongelar una alícuota de control a temperatura ambiente. En los tubos de polipropileno, diluir el control a 24 mg/ml con la solución amortiguadora de dilución. En los microtubos de polipropileno, diluir adicionalmente 24 mg/ml de solución de control con la solución amortiguadora de dilución a 12 mg/ml. Preparar una sola dilución y carga el control en 3 pozos de la placa.

Procedimientos de ELISA. Llenar la botella de lavado de placa con solución amortiguadora de lavado de placa (referirse a la etapa 5.3, 1X PBS + 0.1% Tritón X-100). Preparar la lavadora de placas. Comprobar los siguientes parámetros: Los parámetros se deben ajustar a: Tipo de placa: 1 para cada ciclo (un total de 5 ciclos): Volumen: 400 µ?; Tiempo de impregnación: 10 segundos; Tiempo de asp.: 4 segundos.

Procedimiento de análisis. Recubrir las placas con 100 µ?/???? de 4 pg/ml de mezcla de anticuerpo de recubrimiento de cabra en 50 mM de bicarbonato de sodio frío. Golpear ligeramente el lado de la placa hasta que la solución de recubrimiento cubra la parte inferior de los pozos uniformemente, cubrir con cinta de sellado e incubar a 4°C nominal con agitación en la mezcladora de placa (o equivalente) a la velocidad 3 por durante 18 horas ± 1 hora. Después de la incubación durante la noche, retirar la placa del refrigerador y permitir equilibrarse a temperatura ambiente. Agitar el recubrimiento. Absorber la placa con toallas de papel. Bloquear con 300 µ?/???? de caseína a 37°C ± 2°C, cubrir con cinta de sellado e incubar a 37°C ± 2°C con agitación en una mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 1 hora. Preparar el estándar, muestra, control, aditivo, y muestras adicionadas durante la incubación de bloqueo. Lavar la placa 5 veces con solución amortiguadora de lavado. Absorber la placa con toallas de papel. Usar una pipeta de 8 canales, colocar con una pipeta 100 µ?/???? de estándares, muestras, aditivos, muestras adicionadas, y control por triplicado en los pozos de la placa. Colocar con una pipeta 100 µ?/???? de solución amortiguadora de dilución en todos los pozos vacíos de la placa para servir como espacios vacíos. Cubrir con cinta de sellado e incubar a 37°C ± 2°C con agitación en una mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 1 hora. Llenar una plantilla para utilizar como guía al cargar la placa.

Ajuste de lector de placa. Ajustar la plantilla, incorporar las concentraciones para los estándares. No incorporar los factores de dilución para las muestras, control, aditivo, o muestras adicionadas. Asignar los pozos que contienen diluyente como vacíos que se restarán de todos los pozos. Lavar la placa 5 veces con solución amortiguadora de lavado. Absorber la placa con toallas de papel. Agregar 100 µ?/???? de anticuerpo de cabra biotinilado. Cubrir con cinta de sellado e incubar a 37°C ± 2°C con agitación en una mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 1 hora. Lavar la placa 5 veces con solución amortiguadora de lavado. Absorber la placa con toallas de papel. Agregar 100 µ?/???? de solución de conjugado de neutravidina-HRP. Cubrir con cinta de sellado e incubar en 37°C ± 2°C con agitación en una mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 1 hora. Lavar la placa 5 veces con solución amortiguadora de lavado. Absorber la placa con toallas de papel. Agregar 100 µ?/???? de sustrato K-Blue frío, cubrir con cinta de sellado e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos (iniciar cronometro tan pronto como el sustrato se agregue a la primera fila), con agitación a velocidad 3 en la mezcladora de placa de titulación Lab-Line (o equivalente). Detener la reacción agregando 100 µ?/???? 2 de ácido fosfórico (etapa 5.7). Colocar la placa en una mezcladora de placa a velocidad 3 durante 3-5 minutos. Leer la placa a 450 nm.

Análisis y cálculos de datos. OBSERVACION: solamente se aceptan las muestras, aditivos, muestras adicionadas, y control, con las densidades ópticas que se encuentren dentro del límite de cuantificación práctico (2.5 ng/ml de estándar) de la curva estándar y que cumplan con el % de CV o % de criterios de diferencia indicados posteriormente. Si la OD de muestra se encuentra por debajo de 2.5 ng/ml de estándar, el resultado deberá reportarse como menos de 2.5 ng/ml. Este valor se debe entonces dividir por la concentración de muestra diluida (12 mg/ml) para reportar el valor en ng/mg. Si la muestra es alta en concentración de célula hospedadora que hace que la muestra no adicionada y/o adicionada estar por encima de la curva estándar, se debe reportar el valor como >100 ng/ml. Este valor se debe entonces dividir por la concentración de muestra diluida (12 mg/ml) para reportar el valor en ng/mg. Considerar el valor de muestra como cero para los cálculos de recuperación de aditivo cuando la muestra está por debajo de 2.5 ng/ml de estándar.

Curva estándar. Las concentraciones estándar se deben incorporar a la plantilla de protocolo. Se utiliza un ajuste de curva cuadrático. El coeficiente de determinación debe ser = 0.99 y el % de CV entre los pozos triplicados debe ser = 20%. Si este criterio no se cumple: Un estándar (1 nivel, 3 pozos) se puede descartar. Si se descarta 1.25 ng/ml, sólo las muestras y muestras adicionadas con densidades ópticas que se encuentran dentro de 2.5 ng/ml y las densidades ópticas de 100 ng/ml (los puntos de curva estándar restantes) son aceptables. Además, para los triplicados de cada nivel estándar, si un solo pozo se contamina claramente o muestra una unión baja, se puede descartar. Si un pozo se descarta de un nivel estándar, las réplicas restantes deben tener un % de diferencia = 20%. El % de CV para el estándar más bajo, que muestra valores de OD cercanos a los antecedentes (vacíos) de la placa, debe ser = 30%. Si se descarta un pozo, el % de diferencia para las réplicas restantes debe ser = 35%. Si se descarta el estándar más bajo, sólo son aceptables las muestras y muestras adicionadas con densidades ópticas que se encuentran dentro de las densidades ópticas de nivel de curva estándar restante.

Muestras. El % de CV deben ser = 20% entre los pozos triplicados. Reportar el % de CV entre los pozos triplicados. Un pozo de cada dilución de muestra se puede descartar. Las réplicas restantes deben tener un % de diferencia de = 20%. OBSERVACION: Si la OD de muestra no adicionada está debajo de 2.5 ng/ml de OD estándar, el % de criterios de diferencia no se aplica a los resultados de muestra no adicionada. Referirse al cálculo anterior.

Calcular la concentración actual de la célula hospedadora en ng/mg del valor promedio (ng/ml) como sigue: Proteína de célula hospedadora CHO (ng/mg) = "resultado promedio de muestra no adicionada (ng/ml)"_Concentración de muestra diluida (12 mg/ml).

Aditivos. El % de CV debe ser = 20% entre los pozos triplicados. Registrar el % de CV. Un pozo de aditivo se puede descartar. Los puntos restantes deben tener un % de diferencia = 20%. Referirse al cálculo anterior. Reportar la concentración de célula hospedadora en ng/ml. Este resultado será utilizado en los cálculos de recuperación de aditivo. La concentración resultante para el aditivo (ng/ml) debe ser ± 20% de la concentración teórica de aditivo. Registrar el resultado e indicar si se aprobó o falló. Si el resultado de aditivo no está dentro del 20% teórico, el análisis debe ser repetido. La concentración de aditivo promedio (ng/ml) x 100 = debe ser 20% ± 100% de 10 ng/ml.

Muestras adicionadas. El % de CV debe ser = 20% entre los pozos triplicados. Registrar el % de CV entre los pozos triplicados. Un pozo de cada dilución de muestra adicionada se puede descartar. Las réplicas restantes deben tener un % de diferencia de = 20%. Referirse al cálculo anterior. Reportar el "resultado de muestra adicionada" para cada dilución en ng/ml. Registrar el % de diferencia entre las diluciones duplicadas. El % de diferencia entre las diluciones debe ser = 25%. Estos resultados serán utilizados en los cálculos de recuperación de aditivo.

Calcular el % de recuperación de aditivo para cada dilución ajustada usando la siguiente fórmula: % de recuperación de aditivo = valor de muestra adicionada - valor de muestra no adicionada X 100 el valor de aditivo. OBSERVACION: (1) si la OD del valor de muestra no adicionada se encuentra debajo de 2.5 ng/ml de estándar se considera el valor como cero en el % de cálculo de recuperación de aditivo. El % de recuperación de aditivo debe ser 50% ± 100% (50%-150%) para cada dilución para cada muestra. Registrar los resultados y si aprobaron o fallaron.

Control. El % de CV debe ser = 20% entre los pozos triplicados. Registrar el % de CV resultante. Un pozo del control se puede descartar. Las réplicas restantes deben tener un % de diferencia de = 20%. Referirse al cálculo anterior. Reportar la concentración de célula hospedadora en el control en ng/ml.

Calcular la concentración de célula hospedadora en ng/mg como sigue: Proteína de célula hospedadora (ng/mg) = resultado de proteína de célula hospedadora de control en ng/ml. 4. Determinación de la concentración de proteína A en composiciones de anticuerpo anti-IL-12 En este ELISA, las placas son recubiertas con anti-proteína A de pollo e incubadas. Los sitios no específicos se bloquean con caseína en PBS. Las placas se lavan en 1X PBS + 0.1% Tritón X-100 para eliminar el material no unido. Los estándares de muestras y Cys-proteína A se diluyen en 1X PBS + 4.1% Tritón X + 10% caseína. Las soluciones son desnaturalizadas por calentamiento a 95°C ± 2°C, separando la proteína A de ABT-874. Las soluciones después se agregan a la placa y se incuban. El material no unido se lava con 1X PBS + 0.1% Tritón X-100. La anti-proteína A de pollo biotinilada se agrega a la placa de microtítulo y se incuba. La placa se lava para eliminar el material no unido y se agrega el conjugado de neutravidina-peroxidasa.

La neutravidina se unirá a anti-proteína A de pollo biotinilada que se ha unido a los pozos. La placa se lava nuevamente vez para eliminar la neutravidina no unida y el sustrato K-Blue (tetrametilbenzidina (TMB)) se agrega a la placa. El sustrato es hidrolizado por la neutravidina unida produciendo un color azul. La reacción se detiene con ácido fosfórico, cambiando el color a amarillo. La intensidad del color amarillo en los pozos es directamente proporcional a la concentración de la proteína A presente en los pozos.

Preparación de reactivos y soluciones. Las botellas con caseína se deben calentar a 37°C ± 20C; sonorizar durante 2 minutos, y someter a alícuotas. Las alícuotas deben ser almacenadas a 4°C nominal. Cuando el análisis se deba realizar, el número de alícuotas de caseína necesarias, se debe colocarse a 37°C ± 2°C. La solución amortiguadora de recubrimiento y sustrato son usados fríos (tomados a 4°C nominal justo antes de usar). 50 mM de bicarbonato de sodio (solución amortiguadora de recubrimiento), pH 9.4. A un recipiente de 1 I agregar: 900 mi de agua Milli-Q, 4.20 g ± 0.01 g de bicarbonato de sodio. Agitar hasta que se disuelvan completamente. Ajustar el pH a 9.4 con NaOH 1N. Transferir a un matraz volumétrico de 1 I y llevar a un volumen con agua Milli-Q. Mezclar por inversión hasta que sea homogéneo. Filtrar a través de unidades de filtración estéril de 0.22 CA pm. Almacenar a 4°C nominal por hasta 7 días a partir de la fecha de preparación. 104 M de Na2HP04*7H20, 1.37 M de NaCI, 0.027 M de KCI, 0.0176 M de KH2P04, pH = 6.8-6.9. (10X PBS): Agregar aproximadamente 400 mi de agua Milli-Q a un recipiente de cristal. Agregar 13.94 g ± 0.01 g de Na2HP04 x 7H20. Agregar 40.0 g ± 0.1 g de NaCI. Agregar 0.01 g ± 1.00 g de KCI. Agregar 0.01 g ± 1.20 g de KH2P04. Agitar hasta que sea homogéneo. Transferir a un matraz volumétrico de 500 mi. C.s. a un volumen de 500 mi con agua de Milli-Q. Mezclar por inversión. Filtrar a través de una unidad de filtración estéril de 0.2 CA pm. Almacenar a temperatura ambiente por hasta 7 días. 1X PBS + 0.1% Tritón X-100, pH 7.40: (solución amortiguadora de lavado de placa). En un cilindro graduado de 4 I, mezclar 400 mi de 10X PBS (ver anteriormente) con 3500 mi de agua Milli-Q. Comprobar el pH, y ajustar en caso de ser necesario a 7.40 ± 0.05 con ácido clorhídrico 1 N o NaOH 1 N. Llevar a un volumen con agua Milli-Q. Colocar firmemente Parafilm en el cilindro y mezclar por inversión hasta que sea homogéneo. Transferir a una botella de 4 I. eliminar 4 mi de 1 X PBS y descartar. Agregar 4 mi de Tritón X-100 a 3996 mi de 1 X PBS. Colocar en la placa de agitación y agitar para disolver totalmente. Almacenar a temperatura ambiente por hasta 7 días.

Anticuerpo de recubrimiento anti-proteína A de pollo. Tomar una alícuota de anticuerpo por placa al momento de uso. Para calificar nuevas lotes de anti-proteína A de pollo, puede ser necesario utilizar y calificar un conjugado de anti-proteína A de pollo-biotina (preparado del mismo lote de recubrimiento). Inmediatamente antes del uso: diluir la mezcla de anticuerpo en 50 mM de bicarbonato de sodio frío a la concentración determinada durante la calificación de recubrimiento. Por ejemplo: Si durante la calificación la concentración de recubrimiento que se cargará en la placa fue determinada como 6 pg/ml y si la concentración de solución madre es 3000 pg/ml, entonces agregar 24 µ? de anticuerpo de recubrimiento a 11976 µ? de solución amortiguadora de recubrimiento fría. Mezclar suavemente por inversión.

Anti-proteína A de pollo biotinilada. Tomar una alícuota de anticuerpo por placa al momento de uso. Para calificar los nuevos lotes de conjugado de anti-proteína A de pollo-biotina, puede ser necesario utilizarlos y calificarlos con el mismo lote de anti-proteína A de pollo que fue preparado. Inmediatamente antes del uso: Diluir el anticuerpo biotinilado en caseína a 37°C ± 2°C a la concentración determinada durante la calificación del anticuerpo biotinilado. Por ejemplo: Si durante la calificación la concentración del anticuerpo biotinilado que se cargará en la placa fue determinada como 4 pg/ml y si la concentración de la solución madre es 1000 µg/ml, entonces agregar 48 µ? de anticuerpo biotinilado a 11952 µ? de caseína a 37°C ± 2°C. Mezclar suavemente por inversión.

Neutravidina-HRP. Reconstituir los nuevos lotes (2 mg/frasco) a 1 mg/ml como sigue: Agregar 400 µ? de agua Milli-Q al frasco, entonces agregar 1600 µ? de 1X PBS, para un total de 2 mi. Agitar suavemente hasta mezclarse. Almacenar a -80°C nominal. Preparar las alícuotas con el volumen deseado para utilizar 1 alícuota por placa. Prepararse en un tubo de polipropileno. Asignar la fecha de vencimiento de 6 meses a partir de la fecha de preparación. Por ejemplo, si la concentración de trabajo fue determinada como 0.1 pg/ml entonces se preparan como sigue. Inmediatamente antes del uso, descongelar una alícuota de neutravidina-HRP a temperatura ambiente. Diluir 1 mg/ml de solución de neutravidina a 0.01 mg/ml (10 g/ml) con caseína a 37°C ± 2°C. Por ejemplo: Diluir X10, agregar 50 µ? de neutravidina a 450 µ? de caseína. Agitar suavemente hasta mezclarse, X10 nuevamente, agregar 100 µ? de X10 neutravidina a 900 µ? de caseína. Agitar suavemente hasta mezclarse. Diluir adicionalmente 10 µg/ml de solución a 0.1 µ?/ ?? con caseína a 37°C ± 2°C. Por ejemplo: Diluir X100, agregar 120 µ? de neutravidina (10 µg/ml) a 11880 µ? de caseína. Invertir varias veces suavemente hasta mezclarse.

Solución de parada (se utiliza ácido fosfórico 1 N comprado.) Almacenar a temperatura ambiente durante hasta 1 año a partir de la fecha de recepción. Diluir solución amortiguadora (1X PBS + 4.1% Tritón X100 + 10% de caseína, pH 7.4). Agregar 86 mi de 1X PBS + 0.1% Tritón X100, pH 7.4 (etapa 5.3) a un recipiente o matraz, agregar 4 mi de Tritón X-100, y 10 mi de caseína bloqueadora en PBS, y agitar hasta disolver/mezclar. Puede tardar 20 a 30 minutos en disolverse el Tritón. Esto iguala a una solución de 1X PBS + 4.1% Tritón X100 + 10% de caseína a pH 7.4. Filtrar a través de una unidades de filtración estéril de 0.22 CA µ?t?. Preparar nuevamente para cada uso. Esto es suficiente para 1 placa.

Estándares de proteína A (estándares de antígeno). OBSERVACION: Almacenar las soluciones madre a -20°C nominal en 70 µ? de alícuotas. Descongelar una alícuota en hielo. Realizar las diluciones seriales de acuerdo con los ejemplos en la tabla bajo los tubos de polipropileno que usan la solución amortiguadora de dilución (ver anteriormente) usando la concentración indicada por los fabricantes COA: Por ejemplo si COA indica que una concentración de solución madre es 2.1 mg/ml (2100000 ng/ml) entonces: Descongelar las muestras en hielo. En tubos de microcentrífuga de polipropileno, diluir las muestras a granel finales a 20 mg/ml en solución amortiguadora de dilución (anterior). Realizar 2 diluciones separadas. Registrar la concentración. Utilizar las siguientes soluciones para preparar las muestras adicionadas y preparar 10 mg/ml de soluciones. Por ejemplo: Conc. (mg/ml) Vol. µ? de X mg/ml de solución Vol. de dilución serial de diluyente (µ?) de 120 de muestra madre. En tubos de microcentrífuga de polipropileno, diluir adicionalmente 20 mg/ml de soluciones a 10 mg/ml en solución amortiguadora de dilución.

Preparación de aditivo. En un tubo de microcentrífuga de polipropileno, preparar un aditivo de 0.296 ng/ml de proteína A de 0.593 ng/ml de estándares preparados anteriormente en la etapa 6.1 diluyéndolo 2X con la solución amortiguadora de dilución. Realizar una sola dilución. Los pozos triplicados para 0.296 ng/ml de soluciones de aditivo serán cargados en la placa. Utilizar 0.593 ng/ml de soluciones estándar de la etapa 6.1 para adicionar las muestras.

Preparación de muestras adicionadas. En tubos de microcentrífuga de polipropileno, adicionar 500 µ? de cada 20 mg/ml de solución a granel final con 500 µ? de 0.593 ng/ml de soluciones de aditivo. Mantener para la desnaturalización. Los pozos triplicados para cada solución de muestra adicionada serán cargados en la placa para un total de 6 pozos.

Preparación del control. Obtener un lote de sustancia de fármaco ABT-874. Preparar 150 µ? de alícuotas y almacenar congelado a -80°C nominal durante tres años a partir de la fecha de la división en alícuotas.

Control de trabajo. Descongelar una alícuota de control en hielo. En un tubo de microcentrífuga de polipropileno, diluir el control a 10 mg/ml con la solución amortiguadora de dilución para tener un volumen final de 1000 µ?. Preparar una sola dilución. Mantenerse para la desnaturalización. Los pozos triplicados de control serán cargados en la placa.

Desnaturalización. Para los vacíos de placa, agregar 1000 µ? de solución amortiguadora de dilución a los tubos de microcentrífuga iguales al número de vacíos que son utilizados en la placa. Los tapones de los tubos se pueden cubrir con Parafilm para evitar que se abran durante el calentamiento o un segundo estante se puede colocar sobre ellos para mantener los tapones cerrados. Calentar los estándares, muestras no adicionadas, muestras adicionadas, aditivos, vacíos, y control, a 95°C ± 2°C durante 15 minutos. Retirar el Parafilm de los tubos durante el enfriamiento, si se utiliza.

Permitir enfriarse durante 15 minutos, y centrifugar durante 5 minutos a aproximadamente 10000 rpm. Transferir 700 µ? de sobrenadante en microtubos para cargarse en la placa. Tener cuidado de no alterar los gránulos de Triton/proteína.

Instrucciones de lavadora de placa y ajuste de baño de agua. Llenar la botella de lavado de placa con solución amortiguadora de lavado de placa (referirse a la etapa 5.3, 1X PBS + 0.1% Tritón X-100). Preparar la lavadora de placa. Comprobar los siguientes parámetros: Los parámetros se deben fijar a: Tipo de placa: 1 para cada ciclo (un total de 4 ciclos): Velocidad de Asp: 10 mm/s; Volumen: 400 µ Is; Tiempo de impregnación: 5 segundos; Tiempo de Asp.: 6 segundos. Encender el baño de agua y ajustar a 95° C. Permitir que la temperatura del baño de agua se equilibre a 95°C ± 2°C durante por lo menos 30 minutos.

Procedimiento de análisis. Una lista de comprobación se puede utilizar como guía comprobando las etapas mientras son completadas. Adicionalmente, registrar todo el equipo usado durante el análisis. La cantidad de alícuotas de caseína que se utilizarán para cada día del análisis que será implementado se deben colocar a 37°C ± 2°C. La solución amortiguadora de recubrimiento y el sustrato se usan fríos. Preparar el estándar, muestra, control, aditivo, y muestras adicionadas antes y durante la incubación de bloqueo. La incubación de bloqueo pude tomar más de 1 hora en preparar las diluciones, transferir a los tubos de Eppendorf, desnaturalizar durante 15 minutos, enfriar durante 15 minutos, centrifugar durante 5 minutos, y transferir a microtubos. Permitir por lo menos de 40 minutos antes de bloquear las placas. Las muestras, muestras adicionadas, estándares, control, aditivo de análisis, y vacíos, se cargan en la placa horizontalmente de las filas B a G usando una pipeta de 12 canales. Los estándares se cargan de concentración alta a baja. El recubrimiento de placa, adición de biotina, adición de neutravidina, adición de sustrato, y adición de la solución de parada se hacen verticalmente de la columna 2 a 11 Recubrir las placas con 100 µ?/???? de anticuerpo de recubrimiento en 50 m de bicarbonato de sodio frío. Golpear ligeramente el lado de la placa hasta que la solución de recubrimiento cubra uniformemente la parte inferior de los pozos, cubrir con cinta de sellado e incubar a 4°C nominal con agitación en la mezcladora de placa (o equivalente) a la velocidad 3.

Después de la incubación durante la noche, retirar la placa del refrigerador y permitir equilibrar a temperatura ambiente. Agitar el recubrimiento. Absorber la placa con toallas de papel. Bloquear con 300 µ?/???? de caseína a 37°C ± 2°C, cubrir con cinta de sellado e incubar a 37°C ± 2°C con agitación en una mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 10 minutos ± 1 hora.

Preparar el estándar, muestra, control, aditivo, y muestras adicionadas antes y durante la incubación de bloqueo. Lavar la placa 4 veces con solución amortiguadora de lavado. Absorber la placa con toallas de papel. Usar una pipeta de 8 canales, colocar con pipeta 100 µ?/???? de estándares desnaturalizados, muestras, aditivos, muestras adicionadas, vacíos, y control en los pozos triplicados de la placa. Los pozos exteriores de la placa no se utilizan, agregar solución amortiguadora de dilución no tratada a estos pozos. Cubrir con cinta de sellado e incubar a 37°C ± 2°C con agitación en la mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 2 horas. Llenar una plantilla para utilizar como guia al cargar la placa.

Ajuste de lector de placa. Lavar la placa 4 veces con solución amortiguadora de lavado. Absorber la placa con toallas de papel. Agregar 100 µ?/???? de anticuerpo biotinilado. Cubrir con cinta de sellado e incubar a 37°C ± 2°C con agitación en una mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 1 hora.

Lavar la placa 4 veces con la solución amortiguadora de lavado. Absorber la placa con toallas de papel. Agregar 100 µ?/???? de solución de conjugado de neutravidina-HRP. Iniciar el cronometrar tan pronto como la neutravidina se agregue a la última fila. Cubrir con cinta de sellado e incubar a 37°C ± 2°C con agitación en una mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 30 minutos. Lavar la placa 4 veces con la solución amortiguadora de lavado. Absorber la placa con toallas de papel. Agregar 100 µ?/???? de sustrato K-Blue frío, cubrir con cinta de sellado e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos (iniciar el cronometro tan pronto como el sustrato se agregue a la primera fila), con agitación a velocidad 3 en la mezcladora de placa de titulación Lab-Line (o equivalente). Detener la reacción agregando 100 µ?/pozo de ácido fosfórico 1 N. Colocar la placa en una mezcladora de placa a velocidad 3 durante 3 minutos. Leer la placa a 450 nm.

Análisis y cálculos de datos. OBSERVACION: Solamente se aceptan las muestras, aditivos, muestras adicionadas, y control, con densidades ópticas que se ubican dentro del límite de cuantificación práctico de la curva estándar y que cumplen el criterio de % de CV o % de diferencia indicado posteriormente. Si la OD se ubica debajo de la curva estándar, el resultado se deber reportar como menor de 0.18 ng/ml (análisis LOQ). Este valor se debe entonces dividir por la concentración de muestra diluida (10 mg/ml) para reportar el valor en ng/mg. Si la muestra es alta a la concentración de proteína A que hace que la muestra no adicionada y/o adicionada esté por encima de la curva estándar (2 ng/ml), después diluirse adicionalmente para estar dentro de la curva estándar. Este valor se debe entonces dividir por la concentración de muestra diluida para reportar el valor en ng/mg. Para los cálculos de recuperación de aditivo, restar el valor de muestra no adicionada (ng/ml) del valor de muestra adicionada (ng/ml) incluso cuando el valor de muestra no adicionada (ng/ml) está debajo de la curva. Si se obtiene un valor negativo u "oscilatorio" entonces se considera la muestrea no adicionada como cero para los cálculos de recuperación de aditivo.

Curva estándar. Las concentraciones estándar se deben incorporar en la plantilla de protocolo. Se utiliza un ajuste de curva cuadrática. El coeficiente de determinación debe ser = 0.99 y % de CV entre los pozos triplicados debe ser = 20%. Si este criterio no se cumple: Un estándar (1 nivel, 3 pozos) se puede descartar. Si se descartan 0.18 ng/ml, solamente son aceptables las muestras y muestras adicionadas con las densidades ópticas que se ubican dentro de 0.26 ng/ml y densidades ópticas de 2 ng/ml (los puntos de curva estándar restantes). Además, para los triplicados de cada nivel estándar, si un solo pozo se contamina claramente o muestra la unión baja, se puede descarar. Si un pozo se descarta de un nivel estándar, las réplicas restantes deben tener un % de diferencia = 20%. El % de CV para el estándar más bajo, que muestra valores de OD cercanos al antecedente (vacíos) de la placa, debe ser = 30%. Si se descarta un pozo, el % de diferencia para las réplicas restantes debe ser = 35%. Si se descarta el estándar más bajo, sólo se aceptan las muestras y muestras adicionadas con densidades ópticas que se ubican dentro de las densidades ópticas del nivel de curva estándar restante.

Calcular el % de diferencia como sigue: % de diferencia = (Abs. (dilución de resultado 1 - dilución de resultado 2)/valor promedio) X 100%. El análisis debe ser repetido si los estándares no cumplen los criterios anteriores. Reportar los valore del % de CV y/o % de diferencia y los resultados del coeficiente de curva estándar de determinación.

Muestras. El % de CV deben ser = 20% entre los pozos triplicados. Reportar el % de CV entre los pozos triplicados. Un pozo de cada dilución de muestra se puede descartar. Las réplicas restantes deben tener un % de diferencia de = 20%. OBSERVACION: Si la OD de muestra no adicionada está debajo de la OD de estándar más bajo, el criterio del % de diferencia no se aplica a los resultados de muestra no adicionada. Referirse al cálculo anterior.

Reportar el "resultado de muestra no adicionada" para cada dilución en ng/ml. Estos valores serán utilizados en los cálculos de recuperación de aditivo. Calcular el "resultado promedio de muestra no adicionada (ng/ml)" y el % de diferencia entre diluciones. Reportar los resultados. El % de diferencia entre diluciones debe ser = 25%. Calcular la concentración de proteína A actual en ng/mg a partir del valor promedio (ng/ml) como sigue: La proteína A (ng/mg) = "resultado de muestra no adicionada (ng/ml)" promedio -concentración de muestra diluida (10 mg/ml). Registrar el resultado.

Aditivos. El % de CV debe ser = 20% entre los pozos triplicados. Registrar el % de CV. Un pozo del aditivo se puede descartar. Los aditivos restantes deben tener un % de diferencia = 20%. Referirse al cálculo anterior. Reportar la concentración de proteína A en ng/ml. Este resultado será utilizado en los cálculos de recuperación de aditivo. La concentración resultante para el aditivo (ng/ml) debe ser ± 20% de la concentración de aditivo teórica. Registrar el resultado e indicar si se aprueba o rechaza. Si el resultado de aditivo no está dentro del 20% teórico, el análisis debe ser repetido. La concentración de aditivo promedio (ng/ml) x 100 = debe ser 20% ± 100% a 0.296 ng/ml.

Muestras adicionadas. % de CV deben ser = 20% entre los pozos triplicados. Registrar el % de CV entre los pozos triplicados. Un pozo de cada dilución de muestra adicionada se puede descartar. Las réplicas restantes deben tener un % de diferencia de = 20%. Referirse al cálculo anterior. Reportar el "resultado de muestra adicionada" para cada dilución en ng/ml. Registrar el % de diferencia entre las diluciones duplicadas. El % de diferencia entre diluciones debe ser = 25%. Estos resultados serán utilizados en los cálculos de recuperación de aditivo. Calcular el % de recuperación de aditivo para cada dilución determinada usando la siguiente fórmula: % de recuperación de aditivo = valor de m uestra adicionada - valor de muestra no adicionada X 100.

Valor de aditivo. OBSERVACION: Para los cálculos de recuperación de aditivo, restar el valor de muestra no adicionada (ng/ml) del valor de muestra adicionada (ng/ml) incluso cuando el valor de muestra, no adicionada (ng/ml) está debajo de la curva. Si el valor obtenido es negativo u "oscilatorio" entonces se considera la muestrea no adicionada como cero para los cálculos de recuperación de aditivo. El % de recuperación de aditivo debe ser 50% ± 100% (50%-1 50%) para cada dilución para cada muestra. Registrar los resultados y aprobar/rechazar.

Control. El % de CV debe ser = 20% entre los pozos triplicados. Registrar el resultado del % de CV. Un pozo del control se puede descartar. Las réplicas restantes deben tener un % de diferencia de = 20%.

Varias publicaciones se citan en la presente, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una preparación de anticuerpo reducida en proteína de célula hospedadora (HCP) a partir de una mezcla de muestra que incluye un anticuerpo y por lo menos una HCP, que comprende: (a) someter la matriz de muestra a una reducción de pH que forma así una muestra de recuperación primaria, en donde la reducción del pH es de aproximadamente 3 a aproximadamente 4; (b) ajustar la muestra de recuperación primaria a un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8 seguido por el contacto de la muestra de recuperación primaria con una resina de cromatografía de afinidad y recolectar una muestra de cromatografía de afinidad; (c) poner en contacto la muestra de cromatografía de afinidad con una resina de intercambio iónico y recolectar una muestra de intercambio iónico; (d) poner en contacto la muestra de intercambio iónico con una resina de cromatografía interactiva hidrofóbica (HCI) y recolectar una muestra de HIC, en donde la muestra de HIC comprende la preparación de anticuerpo reducida en HCP.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la reducción de pH es lograda mezclando un ácido conveniente con la mezcla de muestra, y en donde el ácido conveniente se selecciona del grupo que consiste de ácido cítrico, ácido acético, ácido caprílico, y similares.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la resina de cromatografía de afinidad es una resina de proteína A.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la resina de proteína A es resina de MabSelect™.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio aniónico o una resina de intercambio catiónico.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la resina de intercambio tónico es una resina de intercambio catiónico.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la resina de intercambio catiónico se selecciona del grupo que consiste de Fractogel, carboximetilo, sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) y sulfonatos.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la resina de intercambio catiónico es Fractogel™ S03.

9. El método de la reivindicación 5, en donde la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio aniónico.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la resina de intercambio aniónico se selecciona del grupo que consiste de Q Sepharose, dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE), y grupos amina cuaternaria (Q).

11. El método de la reivindicación 11, en donde la resina de intercambio aniónico es Q Sepharose.

12. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de intercambio iónico comprende una primera etapa de intercambio iónico y una segunda etapa de intercambio iónico.

13. El método de la reivindicación 1, en donde HIC se realiza usando una columna que comprende uno o más grupos hidrofóbicos.

14. El método de la reivindicación 13, en donde uno o más grupos hidrofóbicos se seleccionan del grupo que consiste de grupos alquilo, arilo, y una combinación de los mismos.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la columna se selecciona del grupo que consiste de sefarosa de fenilo (tal como la columna Phenyl Sefarose™ 6 Fast Flow, columna Phenyl Sepharose™ High Performance), columna Octyl Sepharose™ High Performance, Fractogel™ EMD Propyl, columnas Fractogel™ EMD Phenyl, Macro-Prep™ Methyl, Macro-Prep™ t-Butyl Supports, columna WP Hl-Propyl (C3)™, y columnas de éter, fenilo o butilo Toyopearl™ .

16. El método de la reivindicación 15, en donde la columna comprende sefarosa de fenilo.

17. El método de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende una etapa de filtración, en donde la muestra de HIC se somete a filtración para eliminar las partículas virales y para facilitar el intercambio de solución amortiguadora.

18. El método de la reivindicación 1, en donde la preparación de anticuerpo reducida en HCP comprende un anticuerpo anti-IL-12 o una porción de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-TNFa o porción de unión a antígeno del mismo.

19. El método de la reivindicación 18, en donde la preparación de anticuerpo reducida en HCP es un anticuerpo anti-IL-12 o una porción de unión a antígeno del mismo.

20. El método de la reivindicación 18, en donde la preparación de anticuerpo reducida en HCP es un anticuerpo anti-TNFa o una porción de unión a antígeno del mismo.

21. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo anti-IL-12 o porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, o anticuerpo multivalente.

22. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo anti-TNFa o porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, o anticuerpo multivalente.

23. El método de la reivindicación 21, en donde el anticuerpo anti-IL-12 o porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado.

24. El método de la reivindicación 22, en donde el anticuerpo anti-TNFa o porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado.

25. El método de la reivindicación 1, en donde la preparación está sustancialmente libre de HCP.

26. El método de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende la filtración profunda.

27. Una composición farmacéutica que comprende una preparación de anticuerpo reducida en HCP producida por el método de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

28. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL-12 o porción de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-TNFa o porción de unión a antígeno del mismo.

29. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, en donde la composición está sustancialmente libre de HCP.