JP5065391B2 - ヒトエリスロポエチンの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は，ヒトエリスロポエチンの製造方法に関し，より詳しくは，本発明は，ヒトエリスロポエチン産生哺乳類細胞を所定の培地交換手順に従って反復培養することによるヒトエリスロポエチンの製造方法，及び，これにより培養上清中に得られたヒトエリスロポエチンから，そのまま医薬として使用できる高純度のヒトエリスロポエチンを，有機溶媒を使用せずに且つ高収率で製造するための製造方法に関する。

エリスロポエチン（「ｈＥＰＯ」）は，赤芽球前駆細胞に働いて赤血球へと分化させ赤血球の産生を促進する糖タンパク質である。このため，ヒトエリスロポエチンは，ヒトの貧血特に腎性貧血治療剤として，また手術に備えた自己血の貯蔵のために用いられている。ヒトエリスロポエチンは，これをコードする遺伝子により形質転換した哺乳動物細胞を用いて人工的な産生が行われており，その場合細胞の増殖を高めるために一般に牛胎仔血清を添加した培地で培養がなされる（非特許文献１参照）。しかしながらそこでは，細胞が血清含有培地で培養されるために，当該方法には，そのようにして得られるヒトエリスロポエチンが血清由来のウイルス及びプリオンに汚染されている危険性を回避できない，という問題がある。

また，細胞を先ず血清含有培地で前培養して増殖させた後，血清不含の培地に交換してヒトエリスロポエチンを産生させ，次いで精製工程に付すという方法も報告されている（特許文献１及び２参照）。これらの方法によれば，血清の使用は前培養ステップに止まり，ヒトエリスロポエチンの産生段階では培地は既に無血清培地に切り替えられていることから，ウイルスやプリオンによる汚染の危険性は低下すると考えられる。しかし，それでもなお，エリスロポエチン産生段階で使用される無血清培地に微量の血清成分が混入し得るため，汚染の懸念を完全に払拭するまでには至らない。従って，可能であれば細胞の増殖のための前培養（すなわち，細胞を増殖させるためのステップ）も無血清培地で行うことが好ましいと考えられる。

これに関し，無血清培地を用いてエリスロポエチンを製造する方法を記載した報告がある（特許文献３参照）。しかしながら，血清は，細胞の増殖を著しく活性化する成分を含んでおり，その不使用はヒトエリスロポエチン産生細胞の増殖には実際には極めて不利である。特に医療用にヒトエリスロポエチンの大量製造を試みる場合，そのために必要な培地交換を伴う長期間の反復的細胞培養において，血清の不使用は，それにより細胞の増殖速度の経時的減衰が起こることから，大量製造の設計自体を不可能若しくは非実用的なものにしてしまう。この理由から，血清を使用せずにしかも長期間のヒトエリスロポエチン産生細胞の実用的な長期の反復培養を提供する方法が必要である。

他方，上記のとおり無血清培地を用いたエリスロポエチンの製造方法が報告されているが（特許文献３参照）。しかしながら，そこには無血清培地で産生されたエリスロポエチンの精製方法に関する記載は無い。

ヒトエリスロポエチンを精製する「効率のよい」方法として，逆相クロマトグラフィーを使用する方法が知られている（特許文献１及び２）。後者には，無血清培地に交換して細胞を培養することにより産生させたエリスロポエチンを，ＣＭ−セファロースクロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィーを用いて精製する方法が開示されている。しかしながら，そこでは逆相クロマトグラフィーからの溶出にアセトニトリルが使用されている。この場合におけるエリスロポエチンの収率は，精製前に２００μｇ含まれたエリスロポエチンのうち１５．５μｇが回収されていることから，約７．８％であり。また，精製されたエリスロポエチンの純度は６２％に止まっている。また，特許文献１では，培養上清が逆相クロマトグラフィーに付され，エタノールを用いてエリスロポエチンが精製されている。

特許文献１及び２に記載されているように，エリスロポエチンの精製工程に逆相クロマトグラフィーが適用される限り，有機溶媒を使用するこが避けられない。しかしながら，有機溶媒の使用は，エリスロポエチンの立体構造に変化を与えるおそれがある。また，工業的製造を考慮すると，製造工程での有機溶媒の使用は，排水の処理に特別な設備を有することを必要とする。従って，有機溶媒を使用するのは，経済面からも環境面からも避けることが望ましい。

また，無血清培地で培養した細胞の培養上清から，限外濾過，陽イオン交換クロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーをこの順で行うことによる，エリスロポエチン精製方法が知られている（特許文献４）。この方法において，逆相クロマトグラフィーカラムからのエリスロポエチンの溶出には５０〜８０％のエタノール水溶液が使用されている。エタノールはタンパク質を変性させる得るため，エリスロポエチンの立体構造が当該工程で乱されるおそれがある。また本法により精製されたエリスロポエチンの収率は少なくとも５０％である旨同文献には述べられているものの，純度に関する記載は無い。

無血清培地で培養した細胞の培養上清から，色素アフィニティークロマトグラフィー，疎水性クロマトグラフィー，ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィー，陰イオン交換クロマトグラフィーを連続して行うことによって，エリスロポエチンを精製する方法が開示されている（特許文献５）。この方法により，エリスロポエチンが９９％を超える純度で精製された。しかしながら，精製工程で，イソプロパノール，アセトニトリル等の有機溶媒が使用されたため，エリスロポエチンの立体構造が乱されるおそれがあった。その上，この方法は，工業的規模でのエリスロポエチンの製造のためには，経済面からも環境面からも好ましくない。

エリスロポエチンを，有機溶媒を用いずに精製する方法も知られている（特許文献６）。その方法では，精製エリスロポエチンを得るために，無血清培地での細胞培養物の上清が，フェニルボロネートクロマトグラフィー，陰イオン交換クロマトグラフィー，限外ろ過，及びゲルろ過クロマトグラフィーに，連続して付された（特許文献６）。しかし，本精製方法により回収されたエリスロポエチンは純度が９２％に留まっており，純度が低すぎ，医薬として使用できない。

特公平４−３５１５９公報 特公平１−４４３１７公報 特開平５−２５２９４２公報 特公平６−９８０１９公報 特許第３０６１２００号公報 特表平１１−５０３７２６号公報 Park JH., Biotechnol. Appl. Biochem. 32, 167-172, 2000

従って，本発明の一目的は，実質的に又は全く血清を含まない培地でヒトエリスロポエチンの大量生産を可能にする製造方法を提供することである。
本発明の更なる一目的は，そのようにして製造したヒトエリスロポエチンから出発して，精製工程において有機溶媒を使用することなく，そのまま医薬として使用できる十分に高い純度のヒトエリスロポエチンを高収率で製造するための方法を提供することである。

本発明者等は，ヒトエリスロポエチン産生細胞を培養するのに無血清培地を使用した場合であっても，反復的な培地交換を限られた特定の条件下に行なうことによって，細胞増殖速度を減衰させることなく，長期間にわたってほぼ一定の増殖速度でヒトエリスロポエチン産生細胞を連続的に増殖させることができることを見出した。更に本発明者は，こうして培養上清中に得られるヒトエリスロポエチンから出発して，色素アフィニティークロマトグラフィー，ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー，陽イオン交換クロマトグラフィー，及び，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの組み合わせを含む精製方法により，高度に精製されたヒトエリスロポエチンが得られることを見出した。本発明はこれらの発見に基づき更に検討を加えて完成させたものである。すなわち，本発明は以下を提供する。

（１）ヒトエリスロポエチンの製造方法であって，ヒトエリスロポエチン産生哺乳類細胞を無血清培地中で反復的に培地交換しつつ培養することを含み，該培地交換が，培地中の生細胞密度が２×１０⁶〜４×１０⁶個／ｍＬに達したときに培養物の８０〜９５％を回収してこれと同量の新鮮な培地と培養物の残部とを合わせることにより行なわれるものであり，且つ上記回収された培養物から該細胞を除去することにより，ヒトエリスロポエチンを含有する培養上清を調製することを含むものである，製造方法。
（２）ヒトエリスロポエチンの製造方法であって，ヒトエリスロポエチン産生哺乳類細胞を無血清培地中で反復的に培地交換しつつ培養することを含み，該培地交換が，培養物を部分的に回収してこれと同量の新鮮な培地を培養物の残部と混合することにより行われ，ここに，交換される培地の量が，得られる混合物中の当初の生細胞密度が１．５×１０⁵〜２．５×１０⁵個／ｍＬとなるように調節されるものであり，且つ上記回収された培養物から該細胞を除去することにより，ヒトエリスロポエチンを含有する培養上清を調製することを含むものである，製造方法。
（３）該培地交換が，２〜８日に１回の頻度で行なわれるものである，上記（２）の製造方法。
（４）該培地交換が，培地中の生細胞密度が２×１０⁶〜４×１０⁶個／ｍＬの時期において行なわれるものである，上記（２）又は（３）の製造方法。
（５）培地交換及びこれに続く培養が少なくとも４回繰り返されるものである，上記（１）ないし（４）の何れかの製造方法。
（６）該ヒトエリスロポエチン産生哺乳類細胞が，ヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡを導入して形質転換したＣＨＯ細胞である，上記（１）ないし（５）の何れかの製造方法。
（７）ヒトエリスロポエチンの製造方法であって，
（ａ）上記（１）ないし（６）の何れかの製造方法によって得られた培養上清を色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーに付してヒトエリスロポエチン活性を有する画分を回収するステップと，
（ｂ）回収された該画分をハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに付してヒトエリスロポエチン活性を有する画分を回収するステップと，
（ｃ）上記ステップ（ｂ）で回収された該画分を陽イオンクロマトグラフィーに付してヒトエリスロポエチン活性を有する画分を回収するステップと，そして
（ｄ）上記ステップ（ｄ）で回収された該画分をゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付してヒトエリスロポエチン活性を有する画分を回収するステップと
をこの順で含んでなるものである，製造方法。
（８）該色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーにおける色素がブルートリアジン色素である，上記（７）の製造方法。

本発明の製造方法によれば，血清を使用しない細胞培養でヒトエリスロポエチンの大量製造が可能になる。従って当該方法は，血清の使用に由来し得るものであるウイルスやプリオンによる汚染の危険を実質的に伴わずにヒトエリスロポエチンを安定的に供給することを可能にする。また，本発明の精製方法によるときは，精製工程で有機溶媒が使用されないため，溶媒によるヒトエリスロポエチンの変性のおそれが除かれる。更には，有機溶媒含有廃液に対処するための余分な設備が不要となるため，本発明は経済的に有利であり，環境面においても好ましい。更にはまた，ヒトエリスロポエチン産生のための培地のみならず，細胞増殖のための培地としても無血清培地を用いたときは，血清の使用に由来し得るウイルスやプリオンによる汚染の危険が，確実に払拭される。

図１は，ヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡを組み込むベクターpCI-neoを示す。 図２は，ヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターpCl-neo(hEPO)を示す。 図３は，本培養−１における生細胞密度の経時的変化を示すグラフである。 図４は，本培養−１における培養上清中のｈＥＰＯ濃度の経時的変化を示すグラフである。 図５は，本培養−２における生細胞密度の経時的変化を示すグラフである。 図６は，本培養−２における培養上清中のｈＥＰＯ濃度の経時的変化を示すグラフである。 図７は，本培養−３における生細胞密度の経時的変化を示すグラフ。 図８は，本培養−３における培養上清中のｈＥＰＯ濃度の経時的変化を示すグラフである。

本発明において使用するヒトエリスロポエチン産生細胞は，当業者に周知の方法によりヒトエリスロポエチン遺伝子を組み込んで形質転換した細胞（好ましくは，哺乳類細胞，例えばチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞）を用いて，実施例の部に記載したようにして作成することができる。

本発明において，ヒトエリスロポエチン産生細胞の培養のための無血清培地の一例は，アミノ酸３〜７００ｍｇ／Ｌ，ビタミン類０．００１〜５０ｍｇ／Ｌ，単糖類０．３〜１０ｇ／Ｌ，無機塩０．１〜１００００ｍｇ／Ｌ，微量元素０．００１〜０．１ｍｇ／Ｌ，ヌクレオシド０．１〜５０ｍｇ／Ｌ，脂肪酸０．００１〜１０ｍｇ／Ｌ，ビオチン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，ヒドロコルチゾン０．１〜２０μｇ／Ｌ，インシュリン０．１〜２０ｍｇ／Ｌ，ビタミンＢ₁₂０．１〜１０ｍｇ／Ｌ，プトレッシン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，ピルビン酸ナトリウム・・・１０〜５００ｍｇ／Ｌ，及び水溶性鉄化合物よりなるものである。当該培地に，慣用のｐＨ指示薬および抗生物質を添加してもよい。

無血清培地として，ＤＭＥＭ／F１２培地（ＤＭＥＭとF１２の混合培地）を基本培地として用いてもよく，この培地は当業者に周知である。更にまた無血清培地として，炭酸水素ナトリウム，Ｌ−グルタミン，Ｄ−グルコース，インスリン，ナトリウムセレナイト，ジアミノブタン，ヒドロコルチゾン，硫酸鉄(II)，アスパラギン，アスパラギン酸，セリン及びポリビニルアルコールよりなるものである，ＤＭＥＭ（ＨＧ）ＨＡＭ改良型（Ｒ５）培地を使用してもよい。更には市販の無血清培地，例えば，CHO-S-SFM II（インビトロジェン社），IS CHO-V-GS（アーバイン・サイエンティフィック社），EX-CELL302（JRH社）等を基本培地として使用してもよい。

本発明において，「培地交換」は，好ましくは，培地中の生細胞密度が２×１０⁶〜４×１０⁶個／ｍＬに達しているときに，培養物の好ましくは８０〜９５％，より好ましくは８５〜９５％（例えば約９０％）を回収しこれと同量の新鮮な培地と培養物の残部とを合わせることにより行なわれる。その結果，これに続く培養は，無血清培地中の生細胞密度が培地交換直前の５〜２０％（より好ましくは５〜１５％，例えば，１０％）である状態から開始されるが，これは培地交換を反復して行なう場合に，細胞増殖速度の減衰が早期に起こるのを防止し，長期間の反復培養を可能にする。培養温度は，哺乳類細胞のための通常の培養温度であればよく，例えば約３７℃である。培地交換の時期は，より好ましくは，生細胞密度が２．２×１０⁶〜４×１０⁶個／ｍＬの時期に行なわれ，更に好ましくは，生細胞密度が２．５×１０⁶〜３．８×１０⁶個／ｍＬの時期に行なわれる。

代わりとして，培地交換は，培地交換直後の培養器内の生細胞密度（すなわち，回収されず残された生細胞が新鮮な培地の補充により元の培養体積まで希釈された状態での生細胞密度）が１．５×１０⁵〜２．５×１０⁵個／ｍＬ（例えば，２×１０⁵個／ｍＬ）となるように，新鮮な培地に交換すべき培地の量を定めることによってもよい。この場合，培地交換後の培養（約３７℃）を，好ましくは２〜８日間，より好ましくは２〜６日間，更に好ましくは３〜５日間行なった後に次の培地交換を行うか，又は，培養物中の生細胞密度が好ましくは２×１０⁶〜４×１０⁶個／ｍＬ，より好ましくは２．２×１０⁶〜４×１０⁶個／ｍＬ，更に好ましくは２．５×１０⁶〜３．８×１０⁶個／ｍＬとなるまで培養してから，次の培地交換を行なってよい。

本発明による培地交換を伴った反復培養において培地交換は，好ましくは４回以上行なわれ，より好ましくは，６回以上，更に好ましくは１０回以上，特に好ましくは１５回以上行なわれる。本発明の方法によれば，培地交換を伴って多数回にわたって反復培養を続けても，細胞増殖速度の減退は見られない。

本発明において，ｈＥＰＯ精製のための各クロマトグラフィーは，タンパク質の非特異的吸着を防止するため，非イオン性界面活性剤の存在下で行われる。好ましい非イオン性界面活性剤の例としては，ポリソルベート系界面活性剤が挙げられ，そのうちポリソルベート８０が特に好ましいが，これに限定されない。非イオン性界面活性剤の濃度は，好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．００１％（ｗ／ｖ），より好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）である。

ｈＥＰＯ精製は，室温又は低温で行うことができるが，好ましくは低温で，特に１〜１０℃で行われる。

精製の第一ステップにおける，色素アフィニティークロマトグラフィーは，主にプロテアーゼを含む夾雑物を除去するためのものである。ブルートリアジン色素が好適に利用されるが，その他のトリアジン色素も適当である。固相として特に好ましい材料は，次の概略式に示すBlue Sepharose 6 FF (Fast Flow)であり，色素Cibacron^TM Blue F3GAを共有結合で固定してあるSepharose 6 Fast Flowマトリックスよりなるものである。

中性付近で平衡化してある色素アフィニティークロマトグラフィーカラムにｈＥＰＯを負荷し，吸着させ，塩濃度を増加させて溶出させる。溶出に用いる塩の例としては，特に限定はないが，塩化ナトリウムが挙げられ，その濃度は好ましくは０．２〜１ｍｏｌ／Ｌ，更に好ましくは０．３〜０．４ｍｏｌ／Ｌである。

精製の第二ステップにおいては，中性付近で平衡化してあるハイドロキシアパタイトカラムにｈＥＰＯを吸着させる。カラムを洗浄した後，リン酸緩衝液によりｈＥＰＯを溶出させる。この液のリン酸緩衝剤濃度は好ましくは１０〜１００ｍＭ，更に好ましくは２０ｍＭである。このステップにおいて，ｈＥＰＯは精製の第一ステップで除去されなかった夾雑タンパク質から更に分離され，こうして高度に精製される。

また，精製の第一ステップ及び第二ステップの後に，フェニル−セファロース等の疎水性樹脂を用いて疎水性クロマトグラフィーステップを追加することもできる。その場合，ｈＥＰＯ含有画分は，予めトリス−塩酸緩衝液でｐＨ７．０〜８．０に調整し且つ塩化ナトリウムを１．５ｍｏｌ／Ｌ以上の濃度になるように添加しておくことが好ましい。

精製の第三ステップにおける，陽イオン交換クロマトグラフィーは，主に色素を除去するためのものである。陽イオン交換樹脂の例としては，特に限定はないが，好ましくはイオン交換セルロース，より好ましくはＳＰ−セファロース（SP-Sepharose）が挙げられる。ｈＥＰＯ含有画分は，陽イオン交換クロマトグラフィーに供するより前に，緩衝液でｐＨを好ましくは５以下，より好ましくはｐＨ４．５〜５．０に調整しておく。このとき用いられる緩衝液の例としては，特に限定は無いが，酢酸緩衝液が挙げられる。同じ緩衝液でｐＨを４．５〜５．０に平衡化したカラムにｈＥＰＯを吸着させ，そして塩濃度の上昇により溶出させる。このために用いる塩の例としては，特に限定はないが，好ましくは塩化ナトリウムが挙げられ，その濃度は，好ましくは０．０５〜０．５ｍｏｌ／Ｌ，より好ましくは０．１〜０．４ｍｏｌ／Ｌ，特に好ましくは約０．３ｍｏｌ／Ｌである。

精製方法の第四ステップにおけるゲルろ過カラムクロマトグラフィーは，ｈＥＰＯの多量体又は分解物を除去するためのものであり，これにより，実質的に純粋なｈＥＰＯが得られる。

以下，実施例に基づいて本発明を説明する。しかしながら本発明がそれらの実施例に限定されることは意図しない。

〔ヒトエリスロポエチン用発現ベクターの構築〕
次のプライマーのセットを用いて，ヒト胎児肝臓由来のcＤＮＡライブラリー(Clontech社)からＰＣＲでヒトエリスロポエチンのｃＤＮＡを増幅した。
5’-CCGAATTCATGGGGGTGCACGAATGTCC-3’（配列番号１），及び
5’-TCAAGCTTCTTAGATCTCAG AGTTGCTCTC-3’（配列番号２）。

配列番号１の配列において，ヌクレオチド３〜８はEcoRI部位に対応し，ヌクレオチド９〜２８はコード領域の最初の２０個のヌクレオチドに対応する。

配列番号２の配列において，そのヌクレオチド１２〜１７はBglII部位に対応し，ヌクレオチド１８〜３０はｃＤＮＡのヌクレオチド７７４〜７６２に対応する。

ＰＣＲ反応は，変性ステップを９５℃で１分，アニールステップを６０℃で１分，伸長ステップを７２℃２分を１サイクルとして，３０サイクル行った。増幅したｃＤＮＡをEcoRI及びHindIIIで切断した後，pBluescript（pBS: Stratagene社）ベクターのマルチクローニングサイトのEcoRIからHindIIIサイトの間へサブクローニングした。得られたベクターを制限酵素BglIIで切断した後，修飾酵素Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し，続いて，制限酵素EcoRI消化によりヒトｈＥＰＯ遺伝子断片を切り出した。得られたヒトｈＥＰＯ遺伝子の断片のヌクレオチド配列及びこれがコードするアミノ酸配列を，配列番号３及び配列番号４にそれぞれ示す。配列番号３において，塩基９〜５８７がアミノ酸をコードする領域に対応し，塩基３〜８はEcoRI切断部位，塩基７７５〜７８０はBglII切断部位に対応する。得られたヒトｈＥＰＯ遺伝子の断片を，ベクターpCI-neo（Promega社）（図１）のEcoRI部位とSmaI部位の間へDNA ligation kit ver.2 (TAKARA社)を用いてライゲーションし，図２に示す得られた組換えベクターを，ヒトエリスロポエチン用発現ベクターとして用いたpCl-neo(hEPO)とした（図２）。

〔組換えヒトエリスロポエチン発現用細胞の樹立〕
ＣＨＯ細胞（CHO-K1）を理化学研究所より入手した。１Ｘ１０⁷個のＣＨＯ細胞を，Lipofectamine2000（Invitrogen社）を用い，上記ヒトエリスロポエチン発現ベクター２０μｇにより，慣用の方法で形質転換し，次いで，１０％の牛胎仔血清（FBS）とG418(SIGMA社)を０．８ｍｇ／ｍＬ含むHam-F12培地（Invitrogen社）で選択培養して，ネオマイシンに耐性の安定した形質転換体を得た。次に，細胞を無血清培地に馴化させるために，Ｌ−グルタミンを４ｍＭ，ヒポキサンチンを１０ｍｇ／Ｌ，チミジンを４ｍｇ／Ｌ，G418を１２０ｍｇ／Ｌ添加した市販の血清不含EX-CELL302培地（JRH社)中に細胞を移し，細胞の増殖が安定するまで連続的に培養した。得られた細胞を，１０％のFBSと１０％のDMSOを含むHam-F12培地に懸濁させ，液体窒素中に保存し，種細胞とした。

〔組換えヒトエリスロポエチン発現細胞の前培養〕
前記種細胞を，２×１０⁵個／ｍＬの濃度に希釈してＬ−グルタミンを４ｍＭ，ヒポキサンチンを１０ｍｇ／Ｌ，チミジンを４ｍｇ／Ｌ，及びG418を０．１２ｍｇ／ｍＬ添加したEX-CELL302培地（JRH社）中で，３７℃で５％Ｃ０₂存在下に，２２５ｃｍ²の培養フラスコ中で培養した。細胞を３〜４日毎に連続的して継代培養し，細胞総数が５Ｌスケールの培養を開始するために必要な少なくとも１Ｘ１０⁹個に達するまで，３〜６回継代した。こうして得られた細胞を用いて，以下の３通りの異なったタイプの本培養を行なった。

〔本培養−１：７０％培地交換〕
前記の前培養で得られた細胞を，生細胞濃度が約２Ｘ１０⁵個／ｍＬとなるように５Ｌのジャーファーメンター（Able社）に移し，前培養に用いたのと同じ培地中で，４０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で５％ＣＯ₂存在下に培養した。３〜６日毎に培養物の７０％部分を新鮮な培地に交換しながら継代培養を繰り返した。生細胞密度は経時的にモニターした（図３）。各回の培地交換直後の生細胞密度は，約０．７〜１．２×１０⁶個／ｍＬであった。培養物の少量を経時的にサンプリングして遠心し，得られた培養上清中のｈＥＰＯ濃度を，後述するＥＬＩＳＡ法により測定した（図４）。各培地交換において，回収された培養物を遠心して細胞を分離し，培養上清を得た。培養上清は凍結保存し，全培養スケジュールの終了時に全てを解凍し一つに合わせて，ｈＥＰＯの精製に供した。

培養中，培養上清中のｈＥＰＯの最高の濃度レベル（約３７ｍｇ／Ｌ）には，５回目の継代において到達した。しかしながらそれ以降の継代では，培養物中の生細胞密度に全体として大きな変化がないにも拘わらず，ｈＥＰＯの濃度は図４に見られるとおり急速に低下することが判明した。更に，各継代おけるｈＥＰＯの最高濃度のレベルは，全体を通して極めて不安定であった。５回目以降の継代におけるｈＥＰＯ最高濃度のレベルの急速な低下の原因は明らかでないが，細胞のｈＥＰＯ産生能の低下や，継代時に持ち越された酵素（プロテアーゼ等）ｈＥＰＯの分解によるものかもしれない。

〔本培養−２：９０％培地交換〕
前記の前培養で得られた細胞を，生細胞濃度が約２．５Ｘ１０⁵個／ｍＬとなるように５Ｌのジャーファーメンター（Able社）に移し，前培養に用いたのと同じ培地中で，４０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で５％ＣＯ₂存在下に培養した。３〜６日毎に培養物の９０％部分を新鮮な培地に交換しながら継代培養を繰り返した。生細胞密度は経時的にモニターした（図５）。各回の培地交換直後の生細胞密度は約２．５Ｘ１０⁵個／ｍＬ〜４．５Ｘ１０⁵個／ｍＬであった。また培養物の少量を経時的にサンプリングして遠心し，得られた培養上清中のｈＥＰＯ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した（図６）。各培地交換において，回収された培養物を遠心して細胞を分離し，培養上清を得た。培養上清は凍結保存し，全培養スケジュールの終了時に全て解凍して一つに合わせ，ｈＥＰＯの精製に供した。

図６に見られるように，各継代培養におけるｈＥＰＯの最高濃度のレベルは，継代を２１回繰り返してもほぼ均一で，１１ｍｇ／Ｌ〜１７ｍｇ／Ｌの範囲を保持していた。継代を反復することによるｈＥＰＯの濃度低下等の，細胞のｈＥＰＯの産生能の低下や培地中のｈＥＰＯの分解亢進の兆候は，認められなかった。

〔本培養−３：初期生細胞数固定〕
前記の前培養で得られた細胞を，生細胞濃度が約２．５Ｘ１０⁵個／ｍＬとなるように５Ｌのジャーファーメンター（Able社）に移し，前培養に用いたのと同じ培地中で，４０ｒｐｍで攪拌しながら，３７℃で５％ＣＯ₂存在下に培養した。３〜６日毎に培地交換して継代培養を繰り返した。生細胞密度は経時的にモニターした（図７）。各回の培地交換時に計測された生細胞密度に基づいて，各培地交換直後の培養器内の生細胞密度（すなわち，回収されず残された生細胞が新鮮な培地の補充により元の培養体積まで希釈された状態での生細胞密度）が約２．５Ｘ１０⁵個／ｍＬとなるように，培養培地の交換量を調節した。培養物の少量を経時的にサンプリングして遠心し，得られた培養上清中のｈＥＰＯ濃度を，下記のようにしてＥＬＩＳＡ法により測定した（図８）。各培地交換において，回収された培養培地を遠心して細胞を分離し，培養上清を得た。培養上清は凍結保存し，全培養スケジュールの終了時に全て解凍して一つに合わせ，ｈＥＰＯの精製に供した。

図８に見られるように，各継代培養における培地中のｈＥＰＯの最高濃度のレベルは，継代を１５回繰り返してもほぼ均一で，１５ｍｇ／Ｌないし１９ｍｇ／Ｌの範囲を保持していた。継代を反復することによるｈＥＰＯの濃度低下等の，細胞のｈＥＰＯの産生能の低下や培地中のｈＥＰＯの分解亢進の兆候は認められなかった。

〔ヒトエリスロポエチンの精製方法〕
培養上清のｐＨを約６．８に調整後，ポリソルベート８０を０．００５％（ｗ／ｖ）含む蒸留水を加え，導電率を１３ｍＳ／ｃｍ以下に調整した。ポリソルベート８０を０．００５％（ｗ／ｖ）含む０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化しておいたブルーセファロースＦＦ（Blue-Sepharose FF）(１６ｍｍＸ７５ｍｍ；１５ｍＬ，Amersham社）に，前記培養上清約１６０ｍＬを，流速１２０ｃｍ／時で適用しヒトエリスロポエチンを吸着させた。次に，カラムを７５ｍＬの前記緩衝液により洗浄した後，ポリソルベート８０を０．００５％（ｗ／ｖ），塩化ナトリウムを０．４Ｍ含む０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）でヒトエリスロポエチンを同じ流速で溶出し回収した。

次いで前記Blue-Sepharose FFカラムクロマトグラフィー溶出画分に，塩化カルシウムを，終濃度が２ｍＭとなるように加え，続いて，予めポリソルベート８０を０．００５％（ｗ／ｖ），塩化ナトリウムを１Ｍ，塩化カルシウムを２ｍＭ含む０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化しておいたハイドロキシアパタイトカラム（HA ULTROGEL：２６ｍｍＸ５６ｍｍ；３０ｍＬ，バイオセラプ社）に，流速４５ｍＬ／時で適用して，ヒトエリスロポエチンを樹脂に吸着させた。引き続き同じ流速でカラムを１５０ｍＬの前記緩衝液により洗浄後，ポリソルベート８０を０．００５％（ｗ／ｖ）含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）でヒトエリスロポエチンを溶出し回収した。

次に前記HA ULTROGELカラム溶出画分に，１０分の１量の０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を添加してｐＨを５以下に調整し，更にポリソルベート８０を０．００５％（ｗ／ｖ）含む蒸留水を加え，導電率を９ｍＳ／ｃｍ以下に調整した。この希釈された画分を，ポリソルベート８０を０．００５％（ｗ／ｖ）含む０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化しておいた陽イオン交換樹脂SP-Sepharose FFカラム（１６ｍｍＸ４０ｍｍ；８ｍＬ，Amersham社）に流速４０ｍＬ／時で適用し吸着させた。次いで，カラムを，ポリソルベート８０を０．００５％（ｗ／ｖ），塩化ナトリウムを０．０５Ｍ含む０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）により同じ流速で洗浄した後，ポリソルベート８０を０．００５％（ｗ／ｖ），塩化ナトリウムを０．３Ｍ含む０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）でヒトエリスロポエチンを溶出し回収した。

次に前記SP-Sepharose FFカラムクロマトグラフィー溶出画分を限外ろ過膜濃縮（排除限界分子量8,000）で１ｍｌに濃縮した。この濃縮された画分を，ポリソルベート８０を０．００５％（ｗ／ｖ），塩化ナトリウムを０．２Ｍ含む０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化しておいたSuperdex 200pgXK16/60カラム（１６ｍｍＸ６００ｍｍ；１２０ｍＬ，Amersham社）に適用して，流速３０ｍＬ／時でゲルろ過し，ヒトエリスロポエチンを分離し，回収した。

〔網状赤血球産生促進するｈＥＰＯの生物学的作用に基づくin vivo定量法〕
試験動物として，Ｂ６Ｄ２Ｆ１（ＢＤＦ１）系マウス〔８週齢，雄性（チャールズリバー社）〕を用いた。これらの動物の背部皮下にヒトエリスロポエチン検体を投与した。投与後４日目に，試験動物の下大静脈より血液を２００μＬ採取し，３０分以内に自動網状赤血球測定装置Ｒ−５００（Sysmex社）を用いて赤血球数（RBC，Ｘ１０⁴／μＬ），網状赤血球数（RET，Ｘ１０⁴／μＬ），及び網状赤血球比率（RET％，％）を計測した。ヒトエリスロポエチン標準品（European Pharmacopoeia）との比較で，ヒトエリスロポエチンのインビボ（in vivo）生物活性（Ｕ／ｍＬ）を算出した。

〔ヒトエリスロポエチンのＳＥ−ＨＰＬＣ法による純度試験〕
５ｍＭリン酸二水素カリウム，８．１ｍＭリン酸水素二ナトリウム，０．４Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）を含有する移動相でヒトエリスロポエチン検体を５倍量に希釈した。希釈された検体を，ＨＰＬＣシステムＬＣ−１０Ａ（島津製作所製）を用いて，ＴＳＫ−ｇｅｌＧ３０００ＳＷ（７．５ｍｍＸ６００ｍｍ（東ソー社））に，流速０．５ｍＬ／分，室温で適用してゲルろ過し，２１４ｎｍでの吸光度を測定した。

〔ＥＬＩＳＡ法によるｈＥＰＯの定量方法〕
本発明者により製造されたｈＥＰＯで免疫したウサギの血液から，常法によりウサギ抗ｈＥＰＯ抗体溶液を調製した。ウサギ抗ｈＥＰＯ抗体溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え，４℃で１時間貯蔵して固定させた。液を捨てた後，０．０７５％Tween20を含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ液（Tris：０．００５Ｍ，ＢＳＡ：１％，ＮａＣｌ：０．１３８Ｍ，ＫＣｌ：０．００２７Ｍ，ｐＨ８．０）を各ウェルに１００μＬずつ加え，４℃で１時間貯蔵してブロッキングした。液を捨てた後，各ウェルを０．０７５％Tween20を含むＴＢＳ−Ｔ液で３回洗浄し，適当な濃度に希釈した検体を各ウェルに１００μＬずつ加え，３７℃で１時間貯蔵した。これと並行して，本発明により製造されローリー（Lowry）法により定量された上記ｈＥＰＯを希釈して１〜１６ｎｇ／ｍＬの濃度とすることにより調製した標準溶液を，幾つかのウェルに加えた。液を捨て，プレートを前記と同様にして洗浄し，ＨＲＰ標識したマウス抗ｈＥＰＯモノクロナール抗体（Ｒ＆Ｄ社製）を２次抗体として各ウェルに１００μＬずつ加え，３７℃で１時間貯蔵した。各ウェルを前記と同様にして洗浄後，ＨＲＰ基質（プロメガ社）を加え，３７℃で１５分間貯蔵した後，塩酸を加えて反応を停止させた。マイクロウエルプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定して，標準溶液の吸光度との比較から検体中のｈＥＰＯ濃度を算出した。

〔逆相ＨＰＬＣ法によるヒトエリスロポエチンの純度試験〕
０．０６％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）よりなるＡ液，０．０６％ＴＦＡ／８０％アセトニトリルよりなるＢ液を用意した。ＨＰＬＣシステムＬＣ−１０Ａ（島津製作所製）を用いて，ヒトエリスロポエチン検体をブチルシリル化シリカゲル（Vydac214ATP54^TM，Vydac社）に適用し，Ｂ液を５０〜７５％の割合で用いた濃度勾配で，２５℃にて流速１．０ｍＬ／分で溶出させた。

〔ヒトエリスロポエチンの分析結果〕
In vivo定量法の結果，前記方法により得られたヒトエリスロポエチンは，１．５×１０⁵Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有することが見出され，また培養液中に含まれていたヒトエリスロポエチンの約４５％が回収されたことが判明した。また，上記の本発明の方法により得られた精製ヒトエリスロポエチンは，ゲルろ過ＨＰＬＣ法，逆相ＨＰＬＣ法の何れによる純度試験でも単一のピークを示し，殆ど純度１００％であることが判明した。

本発明は，全く血清を用いない方法によるヒトエリスロポエチンの大規模生産を可能にする。本方法は，従って，ウイルスやプリオンによる汚染の危険が実質的に無いヒトエリスロポエチンを安定的に供給することを可能にする。更に，本発明は，溶媒によるヒトエリスロポエチンの変性の危険を除くことができる。更には，本発明は，経済的な有利性を有しまた環境的視点からも望ましい。尚も更には，ｈＥＰＯ産生及び回収を開始に備えた細胞増殖のための培養における無血清培地の使用と組み合わせたときは，本発明は，ウイルス及びプリオンによる汚染の危険を完全に除去する。

Claims (7)

1. （ａ）ヒトエリスロポエチンの製造方法であって，ヒトエリスロポエチン産生哺乳類細胞を無血清培地中で反復的に培地交換しつつ培養することを含み，該培地交換が，培養物を部分的に回収してこれと同量の新鮮な培地を培養物の残部と混合することにより行われ，ここに，交換される培地の量が，得られる混合物中の当初の生細胞密度が１．５×１０^５〜２．５×１０^５個／ｍＬとなるように調節されるものであり，且つ上記回収された培養物から該細胞を除去することにより，ヒトエリスロポエチンを含有する培養上清を調製するステップと，
   （ｂ）該培養上清を色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーに付してヒトエリスロポエチン活性を有する画分を回収するステップと，
   （ｃ）回収された該画分をハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに付してヒトエリスロポエチン活性を有する画分を回収するステップと，
   （ｄ）上記ステップ（ｃ）で回収された該画分を陽イオンクロマトグラフィーに付してヒトエリスロポエチン活性を有する画分を回収するステップと，そして
   （ｅ）上記ステップ（ｄ）で回収された該画分をゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付してヒトエリスロポエチン活性を有する画分を回収するステップと
   をこの順で含んでなるものである，製造方法。
2. 該培地交換が，２〜８日に１回の頻度で行なわれるものである，請求項１の製造方法。
3. 該培地交換が，培地中の生細胞密度が２×１０^６〜４×１０^６個／ｍＬの時期において行なわれるものである，請求項１又は２の製造方法。
4. 該培地交換及びこれに続く培養が少なくとも４回繰り返されるものである，請求項１ないし３の何れかの製造方法。
5. 該ヒトエリスロポエチン産生哺乳類細胞が，ヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡを導入して形質転換したＣＨＯ細胞である，請求項１ないし４の何れかの製造方法。
6. 該色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーにおける色素がブルートリアジン色素である，請求項１ないし５の何れかの製造方法。
7. 該ステップ（ｂ）〜（ｅ）において有機溶媒が使用されないものである，請求項１ないし６の何れかの製造方法。

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