CN109153985B

CN109153985B - 转化体、以及转铁蛋白的制造方法

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Publication number: CN109153985B
Application number: CN201780006400.5A
Authority: CN
Inventors: 依地热斯·阿里木江; 熊谷博道; 小岛千明
Original assignee: Asahi Glass Co Ltd
Current assignee: AGC Inc
Priority date: 2016-01-12
Filing date: 2017-01-10
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2037-01-10
Also published as: EP3404098B1; US10465199B2; JPWO2017122638A1; JP6801675B2; CN109153985A; US20180312853A1; WO2017122638A1; EP3404098A4; EP3404098A1

Abstract

本发明提供使用粟酒裂殖酵母的转化体、以高生产性分泌产生转铁蛋白的方法、以及适合该方法的转化体。转化体的特征在于，将粟酒裂殖酵母作为宿主，具有转铁蛋白基因，和存在于转铁蛋白基因的上游区域、使与在宿主内起作用的分泌信号肽结合的转铁蛋白表达的分泌信号肽基因，宿主本来具有的gas2基因被删除或失活；并且转铁蛋白的制造方法的特征在于，在液体培养基中培养转化体，从该液体培养基取得转铁蛋白。

Description

转化体、以及转铁蛋白的制造方法

技术领域

本发明涉及将Schizosaccharomyces pombe(以下，称为“粟酒裂殖酵母”。)作为宿主、使用整合了转铁蛋白基因的转化体、制造转铁蛋白的方法。

背景技术

转铁蛋白(以下，也称为“TF”。)是与Fe³⁺离子结合的糖蛋白的1种，与铁的代谢密切相关。尤其，人血清转铁蛋白(以下，也称为“人转铁蛋白”或“hTF”。)属于人体内的铁结合蛋白质家族，参与体内的铁运输·代谢，用作对动物细胞的培养用培养基的添加剂、医药品、DDS的运输载体。TF是具有N臂(N-lobe)和C臂(C-lobe)2个结构域的约80kDa的糖蛋白，通过翻译作为在N末端具有分泌信号肽的未成熟型蛋白质被合成后，作为切断了分泌信号肽的成熟型的糖蛋白向细胞外分泌。

作为TF生产的最通常的方法，已知使用仓鼠肾脏细胞(BHK细胞)等哺乳细胞的培养株生产全长重组蛋白质的方法。此外，已知使用作为裂殖酵母的粟酒裂殖酵母的方法。粟酒裂殖酵母与作为出芽酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不同，细胞分裂以及转录形态与人细胞接近，不含有对人体有不良影响的物质。因此，在粟酒裂殖酵母中生产TF的全长重组蛋白质的方法作为医药品等被人摄取的TF的生产方法是优良的。例如，专利文献1中公开了将粟酒裂殖酵母作为宿主，在含有酪蛋白氨基酸的液体培养基中培养导入了hTF基因的转化体，高效地生产hTF，在液体培养基中使其分泌、回收的方法。

另一方面，已知在使用酵母等真核细胞微生物的异源蛋白质生产体系中，为了提高目标异源蛋白质的生产效率，使用将对于异源蛋白质生产而言不需要或不利的宿主的基因组部分的一部分或全部删除或失活了的改良宿主。例如，专利文献2中记载了通过在粟酒裂殖酵母中使用将选自编码特定的蛋白酶的基因(蛋白酶基因簇)的至少1种的基因删除或失活了的改良宿主，提高异源蛋白质的生产效率。

此外，可通过在hTF蛋白质的N末端上附加了分泌信号(内质网迁移信号)肽的状态下进行生产，来分泌生产hTF蛋白质。例如，如果培养导入了编码融合蛋白质的结构基因的粟酒裂殖酵母的转化体，则生产的该融合蛋白质在高尔基体或内质网中分泌信号肽被切断，hTF蛋白质被分泌至培养基中；该融合蛋白质在hTF蛋白质的N末端融合有像来源于与粟酒裂殖酵母的接合相关的接合信息素(P-因子)的前体的分泌信号的多肽那样、通过粟酒裂殖酵母而被识别的分泌信号肽。例如专利文献3中，记载了通过在目标外源蛋白质的N末端侧上融合有由作为具有分子伴侣功能、集中于内质网的蛋白质的PDI1(蛋白质二硫键异构酶1，Protein disulfide isomerase 1)的分泌信号肽和a结构域和b结构域和x结构域构成的部分蛋白质，或由PDI1的内质网迁移信号肽和a结构域和b结构域和b’结构域和x结构域构成的部分蛋白质的状态下使其表达，使粟酒裂殖酵母中外源蛋白质分泌生产的量增大。另外，PDI1从N末端起依次具有ER迁移信号、a结构域、b结构域、b’结构域、x结构域、a’结构域、以及包含ER定位信号(ADEL)的c结构域。a结构域以及a’结构域中各有1个分子伴侣活性的活性中心(CGHC)，a结构域、b结构域、b’结构域、以及a’结构域4者一起形成硫氧还蛋白折叠。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开2011-125281号公报

专利文献2：国际公开第2007/015470号

专利文献3：国际公开第2013/111754号

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明的目的在于提供使用粟酒裂殖酵母的转化体、以高生产性分泌产生TF的方法、以及适于该方法的转化体。

解决技术问题所采用的技术方案

本发明的转化体的特征在于，将粟酒裂殖酵母作为宿主，具有TF基因，和存在于TF基因的上游区域、使与在宿主内起作用的分泌信号肽结合的TF表达的分泌信号肽基因，宿主本来具有的gas2基因被删除或失活。

作为该转化体，优选TF基因是编码人转铁蛋白的基因。

此外，作为该转化体，TF基因是在编码哺乳动物所具有的天然型TF的基因中导入突变后的突变TF基因，突变TF基因优选编码天然型TF的至少1处作为N连接型糖链修饰部位的天冬酰胺残基缺失、或被其它氨基酸残基取代的突变TF的基因。

此外，作为该转化体，优选宿主本来具有的至少1种蛋白酶基因被删除或失活。作为蛋白酶基因，更优选选自金属蛋白酶基因簇、丝氨酸蛋白酶基因簇、半胱氨酸蛋白酶基因簇以及天冬氨酸蛋白酶基因簇的基因。作为被删除或失活的蛋白酶基因，进一步优选选自psp3基因、isp6基因、ppp53基因、ppp16基因、ppp22基因、sxa2基因、ppp80基因以及ppp20基因的至少1种基因。

此外，作为该转化体，优选TF基因直接或间接地连接在编码包含分泌信号肽的分泌载体蛋白质的基因的下游，更优选编码分泌载体蛋白质的基因是编码宿主的PDI1的分泌信号肽部分的基因、和编码人的PDI1的ab结构域部分的基因、和编码宿主的PDI1的x结构域部分的基因的融合基因。

本发明的TF的制造方法的特征在于，在液体培养基中培养本发明的转化体，从该液体培养基取得转铁蛋白。

作为该TF的制造方法，优选在pH5.5～6.5的液体培养基中培养转化体，还优选在含有腺嘌呤的液体培养基中培养转化体，还优选在将转化体培养至菌体密度(OD₆₆₀)达到100以上后、从该液体培养基取得转铁蛋白。

本发明的转化体的制造方法的特征在于，将粟酒裂殖酵母作为宿主，整合在宿主内起作用的分泌信号肽基因、和位于分泌信号肽基因的下游的TF基因，以及将宿主本来具有的gas2基因删除或失活。

发明的效果

通过培养本发明的转化体，可高效地制造TF。

此外，通过本发明的TF的制造方法，可使用粟酒裂殖酵母，以高生产性分泌产生TF。

附图说明

图1是显示分泌表达载体pSL6PDI1(SP)Hsabx-hTF(N413QN611Q)的结构的图。

图2是A8-hTF(1)株以及A8-gas2Δ-hTF(1)株的培养液的SDS-PAGE的CBB染色图。

图3是显示A8-hTF(1)株以及A8-gas2Δ-hTF(1)株的hTF(N413Q/N611Q)蛋白质的分泌量的经时变化的图。

图4是用DEAE色谱法纯化A8-hTF(1)株以及A8-gas2Δ-hTF(1)株的培养上清中的hTF(N413Q/N611Q)蛋白质的纯化组分的SDS-PAGE的CBB染色图。

具体实施方式

[TF基因、分泌信号肽基因]

本发明中，“TF基因”是指编码成熟型的TF蛋白质的结构基因。此外，以下将成熟型的TF蛋白质称为“TF蛋白质”。

在本来具有TF基因的物种的细胞中，包含分泌信号肽的蛋白质(分泌载体蛋白质)和TF蛋白质连接的融合蛋白质进行表达，该融合蛋白质在内质网或高尔基体中分泌载体蛋白质被切割，TF蛋白质分泌至细胞外。

另一方面，由于本发明中的作为宿主的粟酒裂殖酵母本来不具有TF基因，分泌载体蛋白质和TF蛋白质连接的融合蛋白质即使在宿主内进行表达，其分泌载体蛋白质也不一定能在宿主细胞内被切割。因此，作为本发明中的分泌信号肽或分泌载体蛋白质，优选在宿主中充分起作用的、在TF蛋白质的N末端侧上本来所具有的以外的分泌信号肽或分泌载体蛋白质。本发明中的“在宿主内起作用的”(分泌信号肽)是指具有将在宿主内表达的融合蛋白质作为TF蛋白质分泌至宿主细胞外的功能。

此外，本发明中，TF蛋白质和分泌信号肽或分泌载体蛋白质可以直接连接，也可以通过由1～数十个氨基酸残基的肽构成的接头间接地连接。

[转化体]

本发明的转化体的特征在于，将粟酒裂殖酵母作为宿主，具有TF基因，和存在于TF基因的上游区域、使与在宿主内起作用的分泌信号肽结合的TF蛋白质表达的分泌信号肽基因，宿主本来具有的gas2基因被删除或失活。

本发明的转化体所具有的TF基因所编码的TF蛋白质可以是来源于任意的物种的天然型的TF蛋白质(存在于野生型的生物的染色体中的TF基因所编码的TF蛋白质)，也可以是天然型的TF蛋白质的修饰蛋白质。作为该修饰蛋白质，例如可例举由天然型的TF蛋白质的氨基酸序列的1个或数个的氨基酸被取代、附加、或缺失了的氨基酸序列构成，且具有TF的功能的多肽。可例举由与天然型的TF蛋白质的氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的序列一致性的氨基酸序列构成，且具有TF的功能的多肽。TF的功能是指与Fe³⁺离子结合、且与细胞表面的TF受体结合而被摄入到细胞内的功能。作为本发明的转化体所具有的TF基因所编码的TF蛋白质，优选来源于人、猴、小鼠、大鼠、兔、牛、马、狗、猫等哺乳动物的天然型的TF蛋白质或其修饰蛋白质，特别优选hTF或其修饰蛋白质。

在本发明的转化体所具有的TF基因所编码的TF蛋白质是天然型的TF蛋白质的修饰蛋白质的情况下，作为该修饰，例如优选，翻译后的作为N连接型糖链修饰部位的天冬氨酸残基的至少1个以上缺失、或被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列的点突变。在使具有N连接型糖链修饰部位的蛋白质进行分泌表达的情况下，得到的重组蛋白质被长度不均匀的高甘露糖型糖链修饰，因此有均匀性和品质下降之虞。

在本发明的转化体所具有的TF基因是编码导入了使N连接型糖链修饰部位消失的突变的突变TF蛋白质的突变TF基因的情况下，通过培养该转化体，可分泌生产TF的功能稳定且品质均衡的重组TF蛋白质。例如，作为该突变TF基因，优选编码天然型的hTF蛋白质所具有的2处N连接型糖链修饰部位(第432个以及第630个的天冬氨酸残基)中，至少1处的作为N连接型糖链修饰部位的天冬酰胺残基缺失、或被其它氨基酸取代的突变TF蛋白质的突变TF基因，更优选编码2处N连接型糖链修饰部位均被天冬酰胺残基以外的氨基酸残基取代的突变TF蛋白质的突变TF基因，进一步优选编码2处N连接型糖链修饰部位均被谷氨酰胺残基取代的突变TF蛋白质的突变TF基因(序列编号2)。

本发明的转化体所具有的分泌信号肽基因是编码在该转化体的细胞内起作用的分泌信号肽的结构基因。分泌信号肽基因可以是编码分泌载体蛋白质的结构基因的一部分。即，编码分泌载体蛋白质的结构基因可以在分泌信号肽基因的下游具有分泌信号肽基因部分以外的编码分泌载体蛋白质的结构基因部分。分泌信号肽只要在粟酒裂殖酵母内起作用即可，例如可使用粟酒裂殖酵母本来具有的分泌蛋白质的分泌信号肽、P3分泌信号(34个氨基酸残基)等国际公开第1996/23890号中记载的分泌信号肽，优选粟酒裂殖酵母的PDI1的分泌信号肽。

作为粟酒裂殖酵母内起作用的分泌载体蛋白质，优选包含分泌信号肽的PDI1的全长蛋白质、PDI1的部分蛋白质，或融合了这些的突变蛋白质的蛋白质。尤其，优选包含PDI1的a结构域的蛋白质或包含PDI1的a’结构域的蛋白质，更优选包含PDI1的a结构域或a’结构域的至少一方和b结构域或b’结构域的至少一方的蛋白质，进一步优选包含PDI1的a结构域或a’结构域的至少一方和b结构域或b’结构域的至少一方和x结构域的蛋白质(参照专利文献3。)。融合在分泌信号肽的下游的蛋白质所包含的PDI1的各结构域可以全部来源于同种的物种，也可以是来源于2种以上的物种的结构域的组合。

作为本发明的转化体，为了进一步提高TF的分泌产生能力，作为该分泌载体蛋白质，从上游侧依次，优选粟酒裂殖酵母的PDI1的分泌信号肽基因、和编码人的PDI1的abx结构域部分的基因或编码人的PDI1的abb’x结构域部分的基因直接或间接地连接的融合基因，粟酒裂殖酵母的PDI1的分泌信号肽基因、和编码人的PDI1的ab结构域部分的基因或编码人的PDI1的abb’结构域部分的基因、和编码粟酒裂殖酵母的PDI1的x结构域部分的基因直接或间接地连接的融合基因。

粟酒裂殖酵母本来不具有TF基因。因此，本发明的转化体是用基因工程的方法将来源于粟酒裂殖酵母以外的生物的TF基因导入粟酒裂殖酵母而得的。本发明的转化体所具有的TF基因的碱基序列可以是TF蛋白质所来源的物种的基因序列其本身，也可以将该基因序列改变为粟酒裂殖酵母中使用频率高的密码子。

该转化体所具有的分泌信号肽基因和TF基因直接或间接地连接的基因(以下，称为SP-TF基因。)可以是1个拷贝，也可以是2个拷贝以上。SP-TF基因可以作为质粒而被导入到粟酒裂殖酵母的染色体外，也可以导入到粟酒裂殖酵母的染色体内。通过在染色体中导入外源基因，可得到传代的维持稳定性优良的转化体。

关于将酵母作为宿主使用的基因重组法，开发了用于更稳定高效地表达异源蛋白质的各种表达系统，尤其是表达载体、分泌信号、基因导入表达载体等，在本发明的转化体的制造中，这些可被广泛应用。例如，作为将粟酒裂殖酵母作为宿主的表达系统，已知日本专利2776085号公报、日本专利特开平07-163373号公报、日本专利特开平10-215867号公报、日本专利特开平10-215867号公报、日本专利特开平11-192094号公报、日本专利特开11-192094号公报、日本专利特开2000-262284号公报、国际公开第96/023890号等，可将这些表达系统广泛用于本发明的转化体的制造中。

向作为宿主的粟酒裂殖酵母的SP-TF基因的导入例如可通过将包含SP-TF基因和在粟酒裂殖酵母内起作用的启动子和终止子的表达盒直接导入宿主细胞、或将整合后的载体导入宿主细胞来进行。该表达盒中，可包含5’-非翻译区域、3’-非翻译区域的任意1个以上，也可包含ura4基因等营养缺陷型互补标记。

作为在粟酒裂殖酵母内起作用的启动子，例如可例举乙醇脱氢酶基因启动子、nmt1基因启动子、果糖-1，6-二磷酸酶基因启动子、转化酶基因的启动子(参照国际公开第99/23223号)、热休克蛋白基因启动子(参照国际公开第2007/26617号、国际公开第2014/030644号)等粟酒裂殖酵母本来具有的启动子，hCMV启动子、SV40启动子等来源于动物细胞病毒的启动子。作为在粟酒裂殖酵母内起作用的终止子，例如可例举LPI(人脂皮质素I)终止子等。

作为整合该表达盒的载体，例如可适当使用pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等来源于大肠杆菌的质粒。该质粒优选具有用于选择转化体的标记。作为该标记，例如可例举ura4基因(营养缺陷型互补标记)、异丙基苹果酸脱氢酶基因(leu1基因)。

在将包含SP-TF基因的表达盒通过同源重组法整合到粟酒裂殖酵母的染色体中的情况下，整合该表达盒的靶位点可仅存在于粟酒裂殖酵母的染色体中的1处，也可存在2处以上。在存在2处以上靶位点的情况下，该载体被整合在粟酒裂殖酵母的染色体的2处以上。在1个靶位点上整合表达盒的情况下，例如可使用日本专利特开2000-262284号公报中记载的方法记载的靶位点。使用具有不同整合部位的2种以上载体，分别将载体整合在不同的靶位点上。

作为整合有包含SP-TF基因的表达盒的载体，例如可使用专利文献1、专利文献3等中记载的整合有分泌信号肽基因和hTF基因的载体。

本发明的转化体中，作为宿主的粟酒裂殖酵母本来具有的gas2基因(SPBC29A10.08.1)被删除或失活。如下述实施例所示，在将导入SP-TF基因的粟酒裂殖酵母的转化体培养到菌体密度(以浊度计测定的660nm下的光学密度：OD₆₆₀)达到100以上的高密度的情况下，Gas2(1，3-β-葡聚糖基转移酶)蛋白质与TF的表达量都增大。Gas2蛋白质集中于细胞壁，是参与裂殖酵母的细胞壁的生物合成的糖蛋白，不认为直接参与TF的表达和分泌。尽管如此，在TF表达株(导入了SP-TF基因的转化体)的高密度菌体培养过程中，Gas2蛋白质与TF蛋白质同时被大量分泌到液体培养基中，且TF的产生效率下降。不可思议地，TF表达株的高密度培养时观察到的Gas2蛋白质的表达以及分泌量的增大在OD₆₆₀为20～30的通常的分批培养时没有被明确地观察到。本发明的转化体中，由于gas2基因被删除或失活，因此即使在高密度培养时Gas2蛋白质也不表达，TF的向液体培养基中的分泌量也增大。

另外，粟酒裂殖酵母的染色体的全部碱基序列在Sanger研究所的数据库“GeneDB”中作为“Schizosaccharomyces pombe Gene DB(http://www.genedb.org/genedb/pombe/)”被收录、公开。本说明书记载的粟酒裂殖酵母的基因的序列数据可用基因名或系统名从上述数据库中检索获得。

作为本发明的转化体，优选蛋白酶基因(编码蛋白酶的基因)中的至少1种被删除或失活。转化体内，通过抑制粟酒裂殖酵母本来具有的至少1种的蛋白酶基因的蛋白酶活性，提高TF蛋白质的生产效率，进一步提高TF蛋白质的生产量。作为本发明的转化体，优选选自丝氨酸蛋白酶基因簇(编码丝氨酸蛋白酶的基因的簇)、氨肽酶基因簇(编码氨肽酶的基因的簇)、羧肽酶基因簇(编码羧肽酶的基因的簇)以及二肽酶基因簇(编码二肽酶的基因的簇)的1种以上基因被删除或失活。

作为本发明的转化体，可以仅1种蛋白酶基因被删除等，也可2种以上蛋白酶基因被删除等。其中，优选选自金属蛋白酶基因簇(编码金属蛋白酶的基因的簇)、丝氨酸蛋白酶基因簇、半胱氨酸蛋白酶基因簇(编码半胱氨酸蛋白酶的基因的簇)以及天冬氨酸蛋白酶基因簇(编码天冬氨酸蛋白酶的基因的簇)的至少1种基因被删除等的转化体，还优选选自金属蛋白酶基因簇以及丝氨酸蛋白酶基因簇的至少1种基因和选自半胱氨酸蛋白酶基因簇以及天冬氨酸蛋白酶基因簇的至少1种基因被删除等的转化体。

作为粟酒裂殖酵母的该4种蛋白酶基因簇，例如可例举以下基因簇。

金属蛋白酶基因簇：cdb4(SPAC23H4.09)、mas2(SPBC18E5.12c)、pgp1(SPCC1259.10)、ppp20(SPAC4F10.02)、ppp22(SPBC14C8.03)、ppp51(SPAC22G7.01c)、ppp52(SPBC18A7.01)、ppp53(SPAP14E8.04)。

丝氨酸蛋白酶基因簇：isp6(SPAC4A8.04)、ppp16(SPBC1711.12)、psp3(SPAC1006.01)、sxa2(SPAC1296.03c)。

半胱氨酸蛋白酶基因簇：ppp80(SPAC19B12.08)、pca1(SPCC1840.04)、cut1(SPCC5E4.04)、gpi8(SPCC11E10.02c)。

天冬氨酸蛋白酶基因簇：sxa1(SPAC26A3.01)、yps1(SPCC1795.09)、ppp81(SPAC25B8.17)。

本发明的转化体可通过将在作为宿主的粟酒裂殖酵母中导入了包含SP-TF基因的表达盒的转化体的gas2基因删除或失活来制造，也可通过将包含SP-TF基因的表达盒导入到预先删除或失活了gas2基因的粟酒裂殖酵母中来制造。作为此时使用的宿主，通过使用至少1种蛋白酶基因被删除或失活的粟酒裂殖酵母的突变株，可得到导入了SP-TF基因、gas2基因被删除或失活、且至少1种蛋白酶基因被删除或失活的转化体。作为粟酒裂殖酵母本来具有的至少1种蛋白酶基因被删除或失活的突变株，例如优选使用如专利文献2中记载的A8株那样，psp3基因、isp6基因、ppp53基因、ppp16基因、ppp22基因、sxa2基因、ppp80基因、以及ppp20基因被删除等的粟酒裂殖酵母的突变株。

作为进行gas2基因的删除或失活、或蛋白酶基因的删除或失活的方法，可使用公知的方法。具体而言，可使用Latour法(《核酸研究(Nucreic Acids Research)》杂志，2006年，34卷，e11页，国际公开第2007/063919号中记载)来使基因缺失。也可通过采用诱变剂的突变分离法(酵母分子遗传学实验法，1996年，学会出版中心)、采用PCR的随机突变法(《PCR方法及应用(PCR Methods Application)》杂志)，第2卷，1992年，28-33页)等向基因的一部分中引入突变，藉此使该基因失活。此外，进行特定的基因的删除或失活的部分可以是ORF(开放阅读框)部分，也可以是表达调控序列部分。特别优选的方法是基于将结构基因的ORF部分用标记基因取代的PCR介导的同源重组方法(《酵母(Yeast)》杂志，第14巻，943～951页，1998年)的删除或失活的方法。

转化方法可使用公知的转化方法的任一种。作为该转化方法，例如可例举乙酸锂法、电穿孔法、原生质球法、玻璃珠法等以往公知的方法、或日本专利特开2005-198612号公报记载的方法。此外，也可使用市售的酵母转化用试剂盒。

本发明的转化体可以与天然的裂殖酵母属酵母相同的方式培养。

用于该转化体的培养的液体培养基可使用公知的酵母培养培养基，只要是含有裂殖酵母属酵母可同化的碳源、氮源、无机盐类等，可效率良好地进行裂殖酵母属酵母的培养即可。作为液体培养基，既可以使用天然培养基，也可以使用合成培养基。

作为液体培养基，例如MMA(含琼脂的基本培养基)、SDC(合成葡萄糖完全培养基)、TES(0.5％细菌-酵母提取物，3％葡萄糖，补充尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、腺嘌呤)、YES(0.5％细菌-酵母提取物，3％葡萄糖，补充尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、腺嘌呤)、YPD(1％细菌-酵母提取物，2％细菌用蛋白胨，2％葡萄糖)等。

作为碳源，例如可例举葡萄糖、果糖、蔗糖等糖。作为氮源，可例举例如氨、氯化铵、乙酸铵等无机酸或无机酸的铵盐、胨、酪蛋白氨基酸。作为无机盐类，例如可例举磷酸镁、硫酸镁、氯化钠。具体而言，可使用YPD培养基等营养培养基(M.D.Rose等，“酵母遗传学方法(Methods In Yeast Genetics)”，冷泉港出版社(1990))或MB培养基等基本培养基(K.Okazaki等，《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》，18，6485-6489(1990))等。

作为培养可以采用公知的酵母培养方法，例如可以通过振荡培养、搅拌培养等进行。

此外，培养温度优选23～37℃，进一步优选30～32℃。此外，培养时间可适当决定。

此外，培养既可以是分批培养，也可以是连续培养。

[TF的制造方法]

可将粟酒裂殖酵母作为宿主，在液体培养基中培养具有SP-TF基因的转化体(TF表达株)，取得分泌在培养后的该液体培养基中的TF蛋白质。培养TF表达株的液体培养基和培养方法可与本发明的转化体的培养相同地使用公知的酵母培养培养基，用公知的培养方法进行。

TF蛋白质容易在酸性条件下分解。因此，在TF的制造中，培养TF表达株的液体培养基的pH条件优选pH5.5以上，更优选pH5.5～6.5。由于随着培养时间变长，培养液的pH有下降的倾向，因此在为了TF的制造的培养中，优选适当调整pH，以使培养液的pH维持在5.5～6.5的范围内。

为了进一步提高TF蛋白质的分泌生产量，培养TF表达株的培养时间优选2天以上，更优选3～6天，进一步优选3～5天。

培养TF表达株的液体培养基优选含有腺嘌呤。在TF表达株具有1个拷贝以上的SP-TF基因的情况下，容易溶菌，TF的表达量有下降的倾向。通过在含有腺嘌呤的液体培养基中进行培养，即使是具有1个拷贝以上的SP-TF基因的TF表达株，也可良好地增殖，TF的分泌生产效率变高。液体培养基的腺嘌呤含量例如以表示菌体密度的单位OD₆₆₀计，可以为0.5～200mg/L，优选1～100mg/L。

此外，为了提高TF的生产性，优选对TF表达株进行高密度培养。其中，优选一边控制培养槽的通气速度、搅拌速度、补料分批培养基的添加速度，一边在pH5.5～6.5、优选pH5.5～6.0的条件下进行初始培养基和补料分批培养。由于在将培养基的葡萄糖浓度抑制在一定的低水平的同时、根据增殖速度和营养消耗速度继续添加(分批补料)培养基，可使菌体密度最终比试管或烧瓶等中的分批培养提高数十倍，实现高菌体密度，分泌生产更多量的TF。在TF表达株的高密度培养中，优选进行培养直至OD₆₆₀达到100以上、优选OD₆₆₀达到200～800。

作为TF表达株，优选本发明的转化体。本发明的转化体不表达来源于宿主的Gas2蛋白质，TF的分泌表达的效率高。而且，从高密度培养后的液体培养基中纯化TF蛋白质时，不需要从Gas2蛋白质进行分离纯化，可更简便地进行纯化。

培养后的从液体培养基的TF蛋白质的取得可使用公知的方法。例如，进行通过离心分离从培养结束后的液体培养基中分离去除菌体后、使得到的培养上清吸附在亲和柱等上、清洗后使其洗脱的方法，使用活性炭去除色素等杂质的方法，使用分离膜进行分离的方法等。在对具有gas2基因的TF表达株进行高密度培养的情况下，由于回收的培养上清中含有大量的Gas2蛋白质，因此在对该培养上清进行使用DEAE树脂的阴离子交换色谱法的情况下，包含TF蛋白质的组分也含有Gas2蛋白质。因此，对该包含TF蛋白质的组分，要进一步进行疏水性相互作用色谱法或凝胶过滤色谱法，才能从Gas2蛋白质分离，纯化TF蛋白质。与此相对，对于本发明的转化体的高密度培养后的培养上清，仅进行使用DEAE树脂的阴离子交换色谱法1次，即可纯化TF蛋白质。

实施例

下面示出实施例和比较例，对本发明进行详细说明。但是，本发明并不受到下述记载的限定。此外，在本实施例中没有特别说明的情况下，“％”意味着“质量％”。

[实施例1]

<hTF突变体的基因的制作>

天然型的hTF基因的ORF(序列编号1)编码在19个残基的分泌信号肽的下游融合了hTF蛋白质的全长698个残基的蛋白质。以人cDNA文库为模板，使用引物对(正向引物(Forward primer)#9220(序列编号3)以及反向引物(Reverse primer)#9221(序列编号4))进行PCR，得到在编码hTF蛋白质的基因的5’末端侧附加了限制酶位点AflII和编码人PDI1的abx结构域的C末端部分的4个残基(Leu-Lys-Lys-Arg)的碱基序列、在3’末端侧上附加了限制酶位点XbaI的DNA片段。

通过连接将得到的DNA片段的AflII和XbaI的双酶切产物整合到裂殖酵母的染色体单座整合型分泌表达载体pSL6P3(专利文献3)的AflII和XbaI的双酶切产物中，进行向大肠杆菌DH5α的转化，藉此制备克隆了编码在N末端包含abx结构域的C末端部分的4个残基的天然型的hTF蛋白质的基因的表达载体pSL6P3-hTF的质粒DNA，其中，裂殖酵母的染色体单座整合型分泌表达载体pSL6P3在hCMV启动子下游配置编码P3分泌信号肽的基因，在该基因与LPI终止子之间具备多克隆位点。

另外，用限制酶NotI切割在pSL6P3载体的多克隆位点上整合了目标蛋白质的表达盒的分泌表达载体、通过染色体同源重组将线性化了的载体片段以1个拷贝整合在裂殖酵母染色体上以邻接存在的2个基因座leu1-32和top2之间。此外，pSL6P3载体中，整合了与突变型(leu1^-)基因(亮氨酸合成系基因(leu1)被点突变(leu1-32)失活了的基因)的点突变(leu1-32)部分互补的亮氨酸标记基因片段(leu1⁺)。因此，在将包含突变型(leu1^-)基因的亮氨酸需求型酵母作为宿主株的情况下，在染色体中整合了pSL6P3载体的线性化片段的转化体从亮氨酸需求型恢复，因此可用不含有亮氨酸的基本培养基(MMA板)筛选克隆。

通过PCR法，在pSL6P3-hTF中的hTF基因中导入将天然型的hTF蛋白质的第413和第611(序列编号1的第432和第630)个天冬酰胺残基取代为谷氨酰胺残基的突变，制成pSL6P3-hTF(N413Q/N611Q)。具体而言，导入分别用胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)取代编码各个天冬酰胺残基的密码子的第1个碱基、第3个碱基的4处的点突变。导入了突变的hTF(N413Q/N611Q)的序列示于序列编号2。

<hTF(N413Q/N611Q)的表达载体的制作>

通过连接将用AflII和XbaI双酶切pSL6P3-hTF(N413Q/N611Q)后的包含hTF(N413Q/N611Q)的编码区域的DNA片段整合到裂殖酵母的染色体单座整合型分泌表达载体pSL6PDI1(SP)Hsabx-AflII的AflII和XbaI的双酶切产物中，进行向大肠杆菌DH5α的转化，藉此制成分泌载体蛋白质(PDI1(SP)-Hsabx)和突变型hTF(N413Q/N611Q)蛋白质的融合蛋白质的染色体单座整合型表达载体pSL6PDI1(SP)Hsabx-hTF(N413QN611Q)(8749bp，图1)，其中，裂殖酵母的染色体单座整合型分泌表达载体pSL6PDI1(SP)Hsabx-AflII在hCMV启动子下游配置编码由粟酒裂殖酵母的PDI1的分泌信号肽和人的PDI1的ab结构域和粟酒裂殖酵母的PDI1的x结构域构成的分泌载体蛋白质(PDI1(SP)-Hsabx)的基因，在该基因和LPI终止子之间具备多克隆位点。

<A8株的制作>

对于作为粟酒裂殖酵母的亮氨酸·尿嘧啶需求型(leu1^-ura4^-)株(基因型：h-leu1-32 ura4-D18)的ARC010株，通过Latour法，制成删除了psp3基因、isp6基因、ppp53基因、ppp16基因、ppp22基因、sxa2基因、ppp80基因、以及ppp20基因的8个基因的A8株(基因型：h-leu1-32 psp3-D13 isp6-D14 oma1-D10 ppp16-D20 fma2-D13 sxa2-D15 aap1-D17ppp80-D11)。A8株是亮氨酸需求型株。更详细地，Latour法中，将基因删除片段(Latour片段：由两个末端的同源重组区域、被其夹持的ura4⁺标记基因和OL(重叠序列)区域构成)暂且通过同源重组整合在裂殖酵母基因组上的删除对象区域的上游或下游中，制作潜在株。接着，用包含5’-FOA的培养基培养该潜在株，在整合后的OL间发生同源重组，使包含ura4⁺标记基因的删除靶区域脱落了的基因删除株形成为菌落。通过PCR确认得到的基因删除株被删除了靶基因。该方法中，由于没有残留包含ura4⁺标记基因的外源基因，因此能够在不整合外源基因地仅删除靶基因的基础上，一边循环利用ura4⁺标记基因一边重复进行基因删除。通过PCR制作用于删除各基因的Latour片段时使用的引物的碱基序列示于表1。

[表1]

<A8-gas2Δ株的制作>

对于A8株，通过Latour法，制作删除了gas2基因的A8-gas2Δ株(基因型：h-leu1-32 psp3-D13 isp6-D14 oma1-D10 ppp16-D20 fma2-D13 sxa2-D15 aap1-D17 ppp80-D11gas2-D15)。通过PCR确认得到的基因删除株被删除了靶基因。A8-gas2Δ株是亮氨酸需求型株。通过PCR制作用于删除gas2基因的Latour片段时使用的引物的碱基序列示于表2。

[表2]

对制作的A8株以及A8-gas2Δ株，用试管水平(接种在5mL的YES中，培养条件30℃、68小时)进行成长评价(μmax和增殖曲线的测定)。其结果是，与相同的营养缺陷型(leu1^―)的野生株(ARC001)相比，两株中表示菌体增殖的最初上升的最大比增殖速度(μmax相对值)均微减(下降约8～12％)，但最终达到的菌体密度(OD₆₆₀)反而微增(增加约9～17％)，两株均确认为能够与亮氨酸需求型野生株相同地成长(没有图示。)。尤其，A8株和A8-gas2Δ株在成长以及表型中没有观察到变化。

<hTF(N413Q/N611Q)基因的1拷贝表达株的制作>

用限制酶NotI切割pSL6PDI1(SP)Hsabx-hTF(N413QN611Q)，制备线性化了的载体片段(6993bp)，使用乙酸锂法，以亮氨酸需求型粟酒裂殖酵母A8株或A8-gas2Δ株为宿主，对将该载体片段进行转化。将转化处理后的菌体涂布在MMA板上，获取亮氨酸需求型互补而形成的菌落，作为重组体克隆。之后，将通过PCR确认了靶基因正确导入了的克隆选择为阳性克隆(hTF(N413Q/N611Q)表达株)。将pSL6PDI1(SP)Hsabx-hTF(N413QN611Q)导入到A8株以及A8-gas2Δ株中的转化体分别命名为A8-hTF(1)株以及A8-gas2Δ-hTF(1)株。

<hTF(N413Q/N611Q)的1拷贝表达株的分泌表达>

培养A8-hTF(1)株以及A8-gas2Δ-hTF(1)株，使hTF(N413Q/N611Q)分泌表达。具体而言，使用玻璃试管，在5mL的YES中分别进行约24小时的复苏培养和预培养后，使用玻璃试管，在5mL的YPD+MES培养基(在YPD中含有0.3M的MES缓冲液的液体培养基)(pH6.0)中，进行32℃、3天或5天的振荡培养。培养结束时刻的菌体密度(最终到达OD₆₆₀)为30～36。分别对从培养液回收的培养液上清组分和菌体颗粒进行SDS-PAGE分析，确认hTF(N413Q/N611Q)在菌体内外表达(没有图示。)。此外，在A8-hTF(1)株以及A8-gas2Δ-hTF(1)株中，与3天培养相比，5天培养的菌体颗粒中的hTF(N413Q/N611Q)量均较少，培养上清中的hTF(N413Q/N611Q)量均较多，因此可知可通过延长培养时间，可使hTF(N413Q/N611Q)的分泌量增加，使未分泌的菌体内残留量变少。

<hTF(N413Q/N611Q)的1拷贝表达株的结果>

培养A8-gas2Δ-hTF(1)株，使hTF(N413Q/N611Q)分泌表达。具体而言，使用玻璃试管，在5mL的YES中分别进行约24小时的复苏培养和预培养后，使用24孔板，在5mL的含腺嘌呤YPD+MES培养基(pH6.0)中进行32℃的3天、4天、或5天振荡培养，使用市售的试剂盒(商品名：“人转铁蛋白ELISA定量套装(Human Transferrin ELISA Quantitation Set)”，Bethyl实验室公司(Bethyl Laboratories社)制)进行ELISA，测定培养结束后分泌到培养上清中的hTF(N413Q/N611Q)的蛋白质量。培养时间越长，则hTF(N413Q/N611Q)的分泌量越多。此外，培养5天中的单位培养上清的hTF(N413Q/N611Q)的分泌量中，A8-gas2Δ-hTF(1)株为30～40mg/L。

<hTF(N413Q/N611Q)的1拷贝表达株的高密度培养>

培养A8-hTF(1)株以及A8-gas2Δ-hTF(1)株，对hTF(N413Q/N611Q)进行高密度培养，使其分泌表达。具体而言，在5L的培养规模下，一边控制培养槽的通气速度、搅拌速度、补料分批培养基的添加速度，一边在将培养液的pH调节到5.5～6.0的条件下，进行初始培养基和补料分批培养。作为液体培养基，使用含腺嘌呤的半合成培养基(数％的细菌酵母提取物、葡萄糖、维生素类、矿物质类、无机盐类等各合成成分)。一边将葡萄糖浓度抑制在2％的低水平，一边根据增殖速度和营养消耗速度，继续添加(分批补料)培养基。最终，菌体密度(OD₆₆₀)达到200～800左右。

经时地将培养液采样，进行SDS-PAGE的结果示于图2。各泳道中，各加载5μL培养液。图中，“hTF”表示hTF(N413Q/N611Q)的条带。如图2的CBB染色图所示，确认以48、72以及96小时的培养时间，在A8-gas2Δ-hTF(1)株中gas2的表达均得到了抑制，与A8-hTF(1)株相比，A8-gas2Δ-hTF(1)株的hTF(N413Q/N611Q)的分泌量更多。

此外，使用采样的培养液，以与上述相同的方式进行ELISA，测定分泌到培养上清中的hTF(N413Q/N611Q)的蛋白质量。如图3所示，从培养开始48小时左右两株的分泌量没有差距，但在这以后A8-gas2Δ-hTF(1)株中hTF(N413Q/N611Q)的分泌量明显比A8-hTF(1)株多。两株的最终到达分泌量(A8-hTF(1)株是从培养开始168小时后，A8-gas2Δ-hTF(1)株是从培养开始96小时后的分泌量)示于表3。与A8-hTF(1)株相比，A8-gas2Δ-hTF(1)株的单位培养液的hTF分泌量为4.8倍以上，单位菌体(单位OD₆₆₀)的hTF分泌量为2.1倍以上。

[表3]

通过离心分离处理从高密度培养后的培养液中去除菌体，对回收的培养上清进行DEAE色谱法，纯化hTF。DEAE柱使用填充了DEAE树脂(DEAE琼脂糖凝胶FF(快流))的柱(商品名：“XK26”，GE医疗集团生命科学公司(GEヘルスケアバイオサイエンス社)制)。具体而言，将900mL的培养上清加载到通过平衡化缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.5)平衡化了的DEAE柱(1CV＝60.6mL)上后，在从0％(15CV)到100％(5CV)为止的梯度条件下加载洗脱缓冲液B(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.5)，使其洗脱。将馏分大小设为30.3mL。

汇总回收含有hTF(N413Q/N611Q)蛋白质的部分(第3～第6部分)，将进行SDS-PAGE的结果示于图4。图4中，“gas2删除后”是A8-gas2Δ-hTF(1)株的培养液的纯化组分的CBB染色图，“gas2删除前”是A8-hTF(1)株的培养液的纯化组分的CBB染色图。如图4的CBB染色图所示，A8-gas2Δ-hTF(1)株的培养液的纯化组分中，仅检出hTF(N413Q/N611Q)蛋白质的条带，确认能够仅用1次DEAE色谱法将hTF(N413Q/N611Q)蛋白质从其它蛋白质中分离，进行高纯度纯化。另一方面，在A8-hTF(1)株的培养液的纯化组分中，除了hTF(N413Q/N611Q)蛋白质之外，在更高分子侧检出了多个条带。其中115kDa附近的条带在切出进行N末端序列分析后，确认是Gas2。认为Gas2的分泌在通常的菌体密度下的培养中没有明确地被确认到，因此是高密度培养特有的现象。A8-hTF(1)株中，在hTF(N413Q/N611Q)之外Gas2的分泌生产量也增大，因此暗示了与A8-gas2Δ-hTF(1)株相比，hTF(N413Q/N611Q)的分泌生产量被抑制在低水平。

这里引用2016年1月12日提出申请的日本专利申请2016-003606号的说明书、权利要求书、附图和摘要的全部内容作为本发明的说明书的揭示。

序列表

<110> 旭硝子株式会社

<120> 转化体、以及转铁蛋白的制造方法

<130> P20150210WO01

<160> 22

<210> 1

<211> 2097

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 转铁蛋白

<400> 1

ATG AGG CTC GCC GTG GGA GCC CTG CTG GTC TGC GCC GTC CTG GGG CTG 48

Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu

5 10 15

TGT CTG GCT GTC CCT GAT AAA ACT GTG AGA TGG TGT GCA GTG TCG GAG 96

Cys Leu Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu

20 25 30

CAT GAG GCC ACT AAG TGC CAG AGT TTC CGC GAC CAT ATG AAA AGC GTC 144

His Glu Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val

35 40 45

ATT CCA TCC GAT GGT CCC AGT GTT GCT TGT GTG AAG AAA GCC TCC TAC 192

Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr

50 55 60

CTT GAT TGC ATC AGG GCC ATT GCG GCA AAC GAA GCG GAT GCT GTG ACA 240

Leu Asp Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr

65 70 75 80

CTG GAT GCA GGT TTG GTG TAT GAT GCT TAC CTG GCT CCC AAT AAC CTG 288

Leu Asp Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu

85 90 95

AAG CCT GTG GTG GCA GAG TTC TAT GGG TCA AAA GAG GAT CCA CAG ACT 336

Lys Pro Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr

100 105 110

TTC TAT TAT GCT GTT GCT GTG GTG AAG AAG GAT AGT GGC TTC CAG ATG 384

Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met

115 120 125

AAC CAG CTT CGA GGC AAG AAG TCC TGC CAC ACG GGT CTA GGC AGG TCC 432

Asn Gln Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser

130 135 140

GCT GGG TGG AAC ATC CCC ATA GGC TTA CTT TAC TGT GAC TTA CCT GAG 480

Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu

145 150 155 160

CCA CGT AAA CCT CTT GAG AAA GCA GTG GCC AAT TTC TTC TCG GGC AGC 528

Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser

165 170 175

TGT GCC CCT TGT GCG GAT GGG ACG GAC TTC CCC CAG CTG TGT CAA CTG 576

Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu

180 185 190

TGT CCA GGG TGT GGC TGC TCC ACC CTT AAC CAA TAC TTC GGC TAC TCA 624

Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser

195 200 205

GGA GCC TTC AAG TGT CTG AAG GAT GGT GCT GGG GAT GTG GCC TTT GTC 672

Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val

210 215 220

AAG CAC TCG ACT ATA TTT GAG AAC TTG GCA AAC AAG GCT GAC AGG GAC 720

Lys His Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp

225 230 235 240

CAG TAT GAG CTG CTT TGC CTG GAC AAC ACC CGG AAG CCG GTA GAT GAA 768

Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu

245 250 255

TAC AAG GAC TGC CAC TTG GCC CAG GTC CCT TCT CAT ACC GTC GTG GCC 816

Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala

260 265 270

CGA AGT ATG GGC GGC AAG GAG GAC TTG ATC TGG GAG CTT CTC AAC CAG 864

Arg Ser Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln

275 280 285

GCC CAG GAA CAT TTT GGC AAA GAC AAA TCA AAA GAA TTC CAA CTA TTC 912

Ala Gln Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe

290 295 300

AGC TCT CCT CAT GGG AAG GAC CTG CTG TTT AAG GAC TCT GCC CAC GGG 960

Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly

305 310 315 320

TTT TTA AAA GTC CCC CCC AGG ATG GAT GCC AAG ATG TAC CTG GGC TAT 1008

Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr

325 330 335

GAG TAT GTC ACT GCC ATC CGG AAT CTA CGG GAA GGC ACA TGC CCA GAA 1056

Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu

340 345 350

GCC CCA ACA GAT GAA TGC AAG CCT GTG AAG TGG TGT GCG CTG AGC CAC 1104

Ala Pro Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His

355 360 365

CAC GAG AGG CTC AAG TGT GAT GAG TGG AGT GTT AAC AGT GTA GGG AAA 1152

His Glu Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys

370 375 380

ATA GAG TGT GTA TCA GCA GAG ACC ACC GAA GAC TGC ATC GCC AAG ATC 1200

Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile

385 390 395 400

ATG AAT GGA GAA GCT GAT GCC ATG AGC TTG GAT GGA GGG TTT GTC TAC 1248

Met Asn Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr

405 410 415

ATA GCG GGC AAG TGT GGT CTG GTG CCT GTC TTG GCA GAA AAC TAC AAT 1296

Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn

420 425 430

AAG AGC GAT AAT TGT GAG GAT ACA CCA GAG GCA GGG TAT TTT GCT GTA 1344

Lys Ser Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val

435 440 445

GCA GTG GTG AAG AAA TCA GCT TCT GAC CTC ACC TGG GAC AAT CTG AAA 1392

Ala Val Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys

450 455 460

GGC AAG AAG TCC TGC CAT ACG GCA GTT GGC AGA ACC GCT GGC TGG AAC 1440

Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn

465 470 475 480

ATC CCC ATG GGC CTG CTC TAC AAT AAG ATC AAC CAC TGC AGA TTT GAT 1488

Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp

485 490 495

GAA TTT TTC AGT GAA GGT TGT GCC CCT GGG TCT AAG AAA GAC TCC AGT 1536

Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser

500 505 510

CTC TGT AAG CTG TGT ATG GGC TCA GGC CTA AAC CTG TGT GAA CCC AAC 1584

Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn

515 520 525

AAC AAA GAG GGA TAC TAC GGC TAC ACA GGC GCT TTC AGG TGT CTG GTT 1632

Asn Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val

530 535 540

GAG AAG GGA GAT GTG GCC TTT GTG AAA CAC CAG ACT GTC CCA CAG AAC 1680

Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn

545 550 555 560

ACT GGG GGA AAA AAC CCT GAT CCA TGG GCT AAG AAT CTG AAT GAA AAA 1728

Thr Gly Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys

565 570 575

GAC TAT GAG TTG CTG TGC CTT GAT GGT ACC AGG AAA CCT GTG GAG GAG 1776

Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu

580 585 590

TAT GCG AAC TGC CAC CTG GCC AGA GCC CCG AAT CAC GCT GTG GTC ACA 1824

Tyr Ala Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr

595 600 605

CGG AAA GAT AAG GAA GCT TGC GTC CAC AAG ATA TTA CGT CAA CAG CAG 1872

Arg Lys Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln

610 615 620

CAC CTA TTT GGA AGC AAC GTA ACT GAC TGC TCG GGC AAC TTT TGT TTG 1920

His Leu Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu

625 630 635 640

TTC CGG TCG GAA ACC AAG GAC CTT CTG TTC AGA GAT GAC ACA GTA TGT 1968

Phe Arg Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys

645 650 655

TTG GCC AAA CTT CAT GAC AGA AAC ACA TAT GAA AAA TAC TTA GGA GAA 2016

Leu Ala Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu

660 665 670

GAA TAT GTC AAG GCT GTT GGT AAC CTG AGA AAA TGC TCC ACC TCA TCA 2064

Glu Tyr Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser

675 680 685

CTC CTG GAA GCC TGC ACT TTC CGT AGA CCT TAA 2097

Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro

690 695

<210> 2

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人

<220>

<223> 转铁蛋白的突变型 (N413Q/N611Q)

<400> 2

GTC CCT GAT AAA ACT GTG AGA TGG TGT GCA GTG TCG GAG CAT GAG GCC 48

Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala

5 10 15

ACT AAG TGC CAG AGT TTC CGC GAC CAT ATG AAA AGC GTC ATT CCA TCC 96

Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser

20 25 30

GAT GGT CCC AGT GTT GCT TGT GTG AAG AAA GCC TCC TAC CTT GAT TGC 144

Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys

35 40 45

ATC AGG GCC ATT GCG GCA AAC GAA GCG GAT GCT GTG ACA CTG GAT GCA 192

Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala

50 55 60

GGT TTG GTG TAT GAT GCT TAC CTG GCT CCC AAT AAC CTG AAG CCT GTG 240

Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val

65 70 75 80

GTG GCA GAG TTC TAT GGG TCA AAA GAG GAT CCA CAG ACT TTC TAT TAT 288

Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr

85 90 95

GCT GTT GCT GTG GTG AAG AAG GAT AGT GGC TTC CAG ATG AAC CAG CTT 336

Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu

100 105 110

CGA GGC AAG AAG TCC TGC CAC ACG GGT CTA GGC AGG TCC GCT GGG TGG 384

Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp

115 120 125

AAC ATC CCC ATA GGC TTA CTT TAC TGT GAC TTA CCT GAG CCA CGT AAA 432

Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys

130 135 140

CCT CTT GAG AAA GCA GTG GCC AAT TTC TTC TCG GGC AGC TGT GCC CCT 480

Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro

145 150 155 160

TGT GCG GAT GGG ACG GAC TTC CCC CAG CTG TGT CAA CTG TGT CCA GGG 528

Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly

165 170 175

TGT GGC TGC TCC ACC CTT AAC CAA TAC TTC GGC TAC TCA GGA GCC TTC 576

Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe

180 185 190

AAG TGT CTG AAG GAT GGT GCT GGG GAT GTG GCC TTT GTC AAG CAC TCG 624

Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser

195 200 205

ACT ATA TTT GAG AAC TTG GCA AAC AAG GCT GAC AGG GAC CAG TAT GAG 672

Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu

210 215 220

CTG CTT TGC CTG GAC AAC ACC CGG AAG CCG GTA GAT GAA TAC AAG GAC 720

Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp

225 230 235 240

TGC CAC TTG GCC CAG GTC CCT TCT CAT ACC GTC GTG GCC CGA AGT ATG 768

Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met

245 250 255

GGC GGC AAG GAG GAC TTG ATC TGG GAG CTT CTC AAC CAG GCC CAG GAA 816

Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu

260 265 270

CAT TTT GGC AAA GAC AAA TCA AAA GAA TTC CAA CTA TTC AGC TCT CCT 864

His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro

275 280 285

CAT GGG AAG GAC CTG CTG TTT AAG GAC TCT GCC CAC GGG TTT TTA AAA 912

His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys

290 295 300

GTC CCC CCC AGG ATG GAT GCC AAG ATG TAC CTG GGC TAT GAG TAT GTC 960

Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val

305 310 315 320

ACT GCC ATC CGG AAT CTA CGG GAA GGC ACA TGC CCA GAA GCC CCA ACA 1008

Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr

325 330 335

GAT GAA TGC AAG CCT GTG AAG TGG TGT GCG CTG AGC CAC CAC GAG AGG 1056

Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg

340 345 350

CTC AAG TGT GAT GAG TGG AGT GTT AAC AGT GTA GGG AAA ATA GAG TGT 1104

Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys

355 360 365

GTA TCA GCA GAG ACC ACC GAA GAC TGC ATC GCC AAG ATC ATG AAT GGA 1152

Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly

370 375 380

GAA GCT GAT GCC ATG AGC TTG GAT GGA GGG TTT GTC TAC ATA GCG GGC 1200

Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly

385 390 395 400

AAG TGT GGT CTG GTG CCT GTC TTG GCA GAA AAC TAC CAA AAG AGC GAT 1248

Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Gln Lys Ser Asp

405 410 415

AAT TGT GAG GAT ACA CCA GAG GCA GGG TAT TTT GCT GTA GCA GTG GTG 1296

Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val

420 425 430

AAG AAA TCA GCT TCT GAC CTC ACC TGG GAC AAT CTG AAA GGC AAG AAG 1344

Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys

435 440 445

TCC TGC CAT ACG GCA GTT GGC AGA ACC GCT GGC TGG AAC ATC CCC ATG 1392

Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met

450 455 460

GGC CTG CTC TAC AAT AAG ATC AAC CAC TGC AGA TTT GAT GAA TTT TTC 1440

Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe

465 470 475 480

AGT GAA GGT TGT GCC CCT GGG TCT AAG AAA GAC TCC AGT CTC TGT AAG 1488

Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys

485 490 495

CTG TGT ATG GGC TCA GGC CTA AAC CTG TGT GAA CCC AAC AAC AAA GAG 1536

Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu

500 505 510

GGA TAC TAC GGC TAC ACA GGC GCT TTC AGG TGT CTG GTT GAG AAG GGA 1584

Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly

515 520 525

GAT GTG GCC TTT GTG AAA CAC CAG ACT GTC CCA CAG AAC ACT GGG GGA 1632

Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly

530 535 540

AAA AAC CCT GAT CCA TGG GCT AAG AAT CTG AAT GAA AAA GAC TAT GAG 1680

Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu

545 550 555 560

TTG CTG TGC CTT GAT GGT ACC AGG AAA CCT GTG GAG GAG TAT GCG AAC 1728

Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn

565 570 575

TGC CAC CTG GCC AGA GCC CCG AAT CAC GCT GTG GTC ACA CGG AAA GAT 1776

Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp

580 585 590

AAG GAA GCT TGC GTC CAC AAG ATA TTA CGT CAA CAG CAG CAC CTA TTT 1824

Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe

595 600 605

GGA AGC CAA GTA ACT GAC TGC TCG GGC AAC TTT TGT TTG TTC CGG TCG 1872

Gly Ser Gln Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser

610 615 620

GAA ACC AAG GAC CTT CTG TTC AGA GAT GAC ACA GTA TGT TTG GCC AAA 1920

Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys

625 630 635 640

CTT CAT GAC AGA AAC ACA TAT GAA AAA TAC TTA GGA GAA GAA TAT GTC 1968

Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val

645 650 655

AAG GCT GTT GGT AAC CTG AGA AAA TGC TCC ACC TCA TCA CTC CTG GAA 2016

Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu

660 665 670

GCC TGC ACT TTC CGT AGA CCT TAA 2040

Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro

675

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 正向引物 #9220

<400> 3

gagacttaag aagcgtgtcc ctgataaaac tgtgagatgg 40

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 反向引物 #9221

<400> 4

ctcttctaga ttaaggtcta cggaaagtgc 30

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 正向引物 #6164

<400> 5

gcaagtactg ctcttgatct g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 反向引物 #6167

<400> 6

taaagcatcc actttgagca a 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 正向引物 #6153

<400> 7

tctgttggca acatgtctc 19

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 反向引物 #6156

<400> 8

gtgaaagtag attatccatg aggtc 25

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 正向引物 #7243

<400> 9

tgccttttac ggttctttgg tc 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 反向引物 #7246

<400> 10

tgcacatcag gtagcccgac 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 正向引物 #7255

<400> 11

tcattaagtc gtcgtcaaac gg 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 反向引物 #7258

<400> 12

ctttaggtcg tcaatttcgt gc 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 正向引物 #6917

<400> 13

catactcccc tgatgtttcg c 21

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 反向引物 #6920

<400> 14

cattcatggt ggtaagagtg ttcc 24

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 正向引物 #9515

<400> 15

accaatcttc catatcccct tg 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 反向引物 #9518

<400> 16

gctacgaaag cttcaactgc g 21

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 正向引物 #9883

<400> 17

aaagttcttt gttttcaatt tccatg 26

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 反向引物 #9886

<400> 18

tccttataaa cgagctatcg aattg 25

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 正向引物 #6175

<400> 19

gaatcatact acgatcagtt gc 22

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 反向引物 #6178

<400> 20

gaaatttact cacagggaag aac 23

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 正向引物 #10493

<400> 21

gaatgtccat ataagtcaat gatgagc 27

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 反向引物 #10496

<400> 22

gaggttaacg actatggtct tgttaac 27

Claims

1.一种粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，所述转化体具有转铁蛋白基因，和存在于所述转铁蛋白基因的上游区域的分泌信号肽基因，所述分泌信号肽与所述转铁蛋白结合并使所述转铁蛋白分泌至细胞外，所述转化体本来具有的gas2基因被删除或失活。

2.如权利要求1所述的粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，所述转铁蛋白是哺乳动物的转铁蛋白。

3.如权利要求1或2所述的粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，所述转铁蛋白是人的转铁蛋白。

4.如权利要求1或2所述的粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，所述转铁蛋白基因是在编码哺乳动物所具有的天然型的转铁蛋白的基因中导入突变后的突变转铁蛋白基因，所述突变转铁蛋白基因为编码天然型转铁蛋白的至少1处作为N连接型糖链修饰部位的天冬酰胺残基缺失、或被其它氨基酸残基取代的突变转铁蛋白的基因。

5.如权利要求4所述的粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，所述转铁蛋白基因是在编码人所具有的天然型的转铁蛋白的基因中导入了突变的突变转铁蛋白基因。

6.如权利要求1所述的粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，所述转化体本来具有的至少1种的蛋白酶基因被删除或失活。

7.如权利要求6所述的粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，所述蛋白酶基因为选自金属蛋白酶基因簇、丝氨酸蛋白酶基因簇、半胱氨酸蛋白酶基因簇以及天冬氨酸蛋白酶基因簇的基因。

8.如权利要求6或7所述的粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，所述蛋白酶基因为选自psp3基因、isp6基因、ppp53基因、ppp16基因、ppp22基因、sxa2基因、ppp80基因以及ppp20基因的基因。

9.如权利要求1所述的粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，所述转铁蛋白基因连接在编码包含分泌信号肽的分泌载体蛋白质的基因的3’末端。

10.如权利要求9所述的粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，编码所述分泌载体蛋白质的基因是由编码宿主的PDI1的分泌信号肽部分的核苷酸片段、和编码人的PDI1的ab结构域部分的核苷酸片段、和编码宿主的PDI1的x结构域部分的核苷酸片段组成的融合基因。

11.一种转铁蛋白的制造方法，其特征在于，在液体培养基中培养权利要求1～10中任一项所述的粟酒裂殖酵母转化体，从该液体培养基中取得转铁蛋白。

12.如权利要求11所述的转铁蛋白的制造方法，其特征在于，在pH5.5～6.5的液体培养基中培养所述转化体。

13.如权利要求11或12所述的转铁蛋白的制造方法，其特征在于，在含有腺嘌呤的液体培养基中培养所述转化体。

14.如权利要求11所述的转铁蛋白的制造方法，其特征在于，将所述转化体培养至菌体密度OD₆₆₀达到100以上后，从该液体培养基中取得转铁蛋白。

15.一种粟酒裂殖酵母转化体的制造方法，其特征在于，向宿主粟酒裂殖酵母整合包含转铁蛋白基因和存在于所述转铁蛋白基因的上游区域的分泌信号肽基因的核酸片段，所述分泌信号肽与所述转铁蛋白结合并使所述转铁蛋白分泌至细胞外；以及将所述宿主本来具有的gas2基因删除或失活。