CN108192905A - 一种表达盒、表达载体、宿主菌及制备无标签重组人il37成熟肽的方法 - Google Patents

一种表达盒、表达载体、宿主菌及制备无标签重组人il37成熟肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种表达盒、表达载体、宿主菌及制备无标签重组人IL37成熟肽的方法。本发明所述一种表达盒，包含启动子、伴侣蛋白编码的核酸序列、酶切识别位点编码的核酸序列、编码人白细胞介素37成熟肽的核酸序列和终止转录子。本发明所述制备无标签重组人IL37成熟肽(rIL37)的方法是包含上述的表达盒的表达载体的宿主菌经培养后诱导重组蛋白表达，收集菌体，裂解菌体收集上清，进行亲和层析，然后加入能结合亲和层析介质的蛋白酶在线切除标签蛋白；其中所述蛋白酶可识别所述的表达盒中的酶切识别位点。本发明所述制备方法能够快速切除标签蛋白，简化了制备工艺，同时大大提高rIL37的纯度。

Description

一种表达盒、表达载体、宿主菌及制备无标签重组人IL37成熟 肽的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种表达盒、表达载体、宿主菌及制备无标签重组人IL37成熟肽的方法。
背景技术
白细胞介素即是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名，现仍一直沿用。最初指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子，现指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子。白细胞介素和血细胞生长因子同属细胞因子，两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。目前至少发现了38个白细胞介素，分别命名为IL-1～IL-38，功能复杂，成网络，复杂重叠；在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它们还参与机体的多种生理及病理反应。免疫系统细胞的增殖、分化和功能受到一系列细胞因子的调节。根据细胞因子的结构同源性可将其分为几个蛋白质家族，如IL-1家族、IL-6家族、IL-10家族、肿瘤坏死因子家族和造血因子家族等。
IL-37于2000年首次被发现，是IL-1家族的成员，又名IL-IF7，包括12个β链，与IL-1家族成员尤其是IL-8拥有共同的结构模型。IL-37是目前唯一没有发现鼠同系物的IL-1家族成员。且没有其鼠源同系物。IL37存在5种剪切变异体(IL37a-e)，其中含218AA的IL37b(NM014439)最长。IL37b通过加工为两种成熟肽(21-218AA和46-218AA，分子量分别为21.9kD和19.4kD)，与细胞核内的Smad3和细胞外的IL-18Rα链相互作用，抑制固有免疫系统的炎症反应，在炎症性疾病的治疗领域有着巨大的应用潜力。
众所周知，利用基因工程的方法制备重组蛋白类药物，在生物医药领域有着举足轻重的作用。有研究利用大肠杆菌表达系统重组表达带His标签的IL37b重组蛋白，但是其纯度较低。同时未切除标签的rIL37产品不能真正反映IL37本身的性质，这两个因素大大限制了rIL37产品的临床应用。而传统切除标签蛋白的方法需要将融合蛋白从层析柱上洗脱下来，然后再进行切除标签，就会导致样品中的杂质成分过多，增加了后续的纯化步骤及难度。因此，急需一种快速制备无标签、纯度高、有产业化前景的rIL37的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的旨在克服现有技术的不足，提供一种表达盒、表达载体、宿主菌及快速制备无标签、纯度高的重组人白细胞介素37成熟肽的方法。
为了达到以上目的，本发明的技术方案如下：
一种表达盒，从5’端至3’端依次包括以下元件：(1)启动子；(2)伴侣蛋白编码的核酸序列；(3)酶切识别位点编码的核酸序列；(4)编码人白细胞介素37成熟肽的核酸序列；(5)终止转录子。
作为优选，所述人白细胞介素37成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID No：8～15中一种所示，或在SEQ ID No：8～15所示序列中截短、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸。
作为优选，所述启动子为Tac启动子、T7启动子、GAP启动子或AOX启动子；所述伴侣蛋白为硫氧还蛋白(GST)、类泛素蛋白(SUMO)、TF、麦芽糖结合蛋白(MBP)；所述酶切识别位点编码的核酸序列为HRV3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)、Factor Xa蛋白酶、凝血酶(Thrombin)、SUMO蛋白酶、肠激酶(Enterokinase)的切割识别位点的核苷酸序列。
本发明还提供了包含上述表达盒的表达载体。
作为优选，所述表达载体为pGEX6P1、pGEX6P2、pGEX4T1、pGEX4T2、pMAL-c2x、pMAL-c5x、pPICZαA或pGAPZαA。
本发明还提供了包含上述表达载体的宿主菌。
作为优选，所述宿主菌，其为大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母菌或昆虫细胞。
本发明提供了一种无标签重组人IL37成熟肽的制备方法，包含上述的表达盒的表达载体的宿主菌经培养后诱导重组蛋白表达，收集菌体，裂解菌体收集上清，进行亲和层析，然后加入能结合亲和层析介质的蛋白酶；其中所述蛋白酶可识别所述的表达盒中的酶切识别位点。
作为优选，所述蛋白酶为HRV3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)、Factor Xa蛋白酶、凝血酶(Thrombin)、SUMO蛋白酶、肠激酶(Enterokinase)。
作为优选，所述方法还包括纯化步骤。所述纯化包括但不限于分子筛层析、疏水层析、亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析中至少一种。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种表达盒、表达载体、宿主菌及制备无标签重组人IL37成熟肽(rIL37)的方法。本发明所述表达盒，包含启动子、伴侣蛋白编码的核酸序列、酶切识别位点编码的核酸序列、编码人白细胞介素37成熟肽的核酸序列和终止转录子。本发明所述表达载体是通过将上述表达盒构建至表达载体。本发明所述宿主菌是上述表达载体转化至基因工程菌，并用诱导剂诱导rIL37融合蛋白表达。本发明所述制备无标签rIL37成熟肽的方法是包含上述的表达盒的表达载体的宿主菌经培养后诱导重组蛋白表达，收集菌体，裂解菌体收集上清，进行亲和层析，然后加入能结合亲和层析介质的蛋白酶；其中所述蛋白酶可识别所述的表达盒中的酶切识别位点。本发明所述方法在亲和层析过程中在线切除标签蛋白以快速得到无标签的rIL37成熟肽，进一步纯化可得到高纯度的rIL37。本发明所述制备方法能够快速切除标签蛋白，简化了制备工艺，同时大大提高rIL37的纯度。实验表明经过后期一步纯化，其纯度可达99％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明所述制备方法的流程图；
图2示GST亲和层析及在线切除GST标签的示意图；经优化后的IL37成熟肽基因分别插入至pGEX6P1的BamHI和XhoI酶切位点，构建pGEX6P1-IL37成熟肽的重组表达载体，表达的重组蛋白为GST标签可切除的融合蛋白，然后经GST亲和层析、GST-HRV3C蛋白酶在线切除GST标签，得到无标签的rIL37；
图3示亲和层析过程中直接在线切割、纯化rIL37；图A：Mono S纯化峰型图，呈单一峰；图B：SDS-PAGE电泳分析纯化效果，泳道1为用GST填料亲和层析纯化融合蛋白；泳道2为GST-HRV3C酶在线切割后的填料；泳道3为在线切割后的rIL37；泳道4Mono S纯化的流穿；泳道5-9为NaCl梯度洗脱峰的rIL37蛋白；
图4示亲和层析过程中先洗脱再切割、纯化rIL37；A：GST亲和层析纯化融合蛋白，泳道1-6为GST洗脱融合蛋白；图B：GST-HRV3C蛋白酶切割标签蛋白，泳道1为切割前，泳道2为切割后；图C：Mono S纯化rIL37，泳道1泳道为Mono S纯化的流穿；泳道2-6为NaCl梯度洗脱峰的rIL37，黑色箭头为rIL37。
具体实施方式
本发明公开了一种表达盒、表达载体、宿主菌及制备无标签重组人IL37成熟肽的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明涉及包含一个编码人IL37成熟肽的核酸序列的表达盒，该表达盒以IL37b基因序列(NM014439)为基础，从5’端至3’端依次包括以下元件：(1)启动子；(2)伴侣蛋白编码的核酸序列；(3)酶切识别位点编码的核酸序列；(4)人白细胞介素37成熟肽编码的核酸序列；(5)终止转录子。
其中，所述的人白细胞介素37成熟肽是指野生型IL37成熟肽、单体或其他突变型。所述IL37成熟肽包括但不限于IL37(21-218)(SEQ ID No：8)、IL37(46-218)(SEQ ID No：9)、羧基末端截短、氨基末端截短、缺失或添加一个或几个氨基酸。IL37成熟肽单体包括但不限于IL37(21-218)D73K(SEQID No：10)、IL37(21-218)Y85A(SEQ ID No：11)、IL37(21-218)D73K/Y85A(SEQ ID No：12)、IL37(46-218)D73K(SEQ ID No：13)、IL37(46-218)Y85A(SEQ ID No：14)、IL37(46-218)D73K/Y85A(SEQ ID No：15)。所述其他IL37成熟肽突变型包括但不限于保守氨基酸的取代、羧基末端截短、缺失或添加一个或几个氨基酸。所述的IL37成熟肽、单体或其突变体的共同特征在于其N端都含有一定长度的柔性片段。
其中，作为优选，所述表达盒中所述启动子为Tac启动子、T7启动子、GAP启动子或AOX启动子。更优选地，所述启动子为Tac启动子。
本发明所述表达盒中连接有伴侣蛋白编码的核酸序列，伴侣蛋白融合表达的方式可以提高人白细胞介素37成熟肽的可溶性。
作为优选，所述表达盒中的伴侣蛋白为硫氧还蛋白(GST)，类泛素蛋白(SUMO)、TF蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)。更优选地，所述伴侣蛋白为GST蛋白。
本发明所述表达盒在伴侣蛋白与人IL37成熟肽之间添加了能将IL37成熟肽与伴侣蛋白切割开的蛋白酶切割识别位点编码的核酸序列，所述酶切识别位点编码的核酸序列包括但不限于为HRV3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)、Factor Xa蛋白酶、凝血酶(Thrombin)、SUMO蛋白酶、肠激酶(Enterokinase)的切割识别位点的核苷酸序列。
优选地，所述蛋白酶切割识别位点编码的核酸序列为HRV3C蛋白酶特异性切割的多肽序列LEVLFQGP的编码序列。
本发明还提供了包含上述表达盒的表达载体。所述表达载体是通过将上述表达盒克隆至连接载体中得到的。其中，用于连接的载体包括但不限于pGEX6P1、pGEX6P2、pGEX4T1、pGEX4T2、pMAL-c2x、pMAL-c5x、pPICZαA、pGAPZαA等载体。优选地，用于连接的载体为pGEX6P1。
本发明还提供了包含上述的表达载体的宿主菌。所述宿主菌可选自工业上常用的原核表达系统，如大肠杆菌；或真核表达系统，如哺乳动物细胞、酵母菌或昆虫细胞。优选地，本发明所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)Rosseta基因工程菌。
本发明还涉及提供一种在亲和层析过程中在线切除标签蛋白以快速得到无标签的重组人白细胞介素37成熟肽的方法，包含上述表达盒的表达载体的宿主菌经培养后诱导重组蛋白表达，收集菌体，裂解菌体收集上清，进行亲和层析，然后加入能结合亲和层析介质的蛋白酶在线切除标签蛋白；其中所述蛋白酶可识别所述的表达盒中的酶切识别位点。
传统的方法需要将融合蛋白从亲和层析的介质上脱液下来，然后在含融合蛋白的洗脱液样品中额外加入切除标签的蛋白酶，酶切后的样品中至少存在3种组分：标签蛋白、蛋白酶、目的蛋白，增加了后续纯化的难度。本发明所述方法直接在亲和层析的过程中，加入可结合亲和层析介质的蛋白酶：一方面蛋白酶结合在层析介质上，一方面识别表达盒中的酶切识别位点发挥其蛋白酶切割活性，在亲和层析过程中实现在线切除标签蛋白，酶切后的亲和层析介质上保留蛋白酶和标签蛋白，酶切后的流穿液样品中只有切除标签后的IL37成熟肽(如图2所示)。
本发明所述方法所述蛋白酶可识别表达盒中的酶切识别位点，包括但不限于HRV3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)、Factor Xa蛋白酶、凝血酶(Thrombin)、SUMO蛋白酶、肠激酶(Enterokinase)。
其中，本领域技术人员可以理解，本发明所述方法中与层析介质结合的蛋白酶与表达盒中的酶切识别位点是相关联、匹配的，本发明所述方法中与层析介质结合的蛋白酶必须能够识别表达盒中的酶切识别位点，如表达盒中所述酶切识别位点编码的核酸序列为HRV3C蛋白酶的切割识别位点的核苷酸序列，所述方法中层析介质中结合的蛋白酶则为HRV3C蛋白酶；表达盒中所述酶切识别位点编码的核酸序列为Thrombin蛋白酶的切割识别位点的核苷酸序列，所述方法中层析介质中结合的蛋白酶则为Thrombin蛋白酶。优选地，本发明所述方法中蛋白酶为HRV3C蛋白酶。
本发明所述方法还包括纯化步骤。所述纯化为分子筛层析、疏水层析、亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析中至少一种。
优选地，所述纯化为阳离子交换层析(Mono S)
由上述技术方案可知，本发明提供了一种表达盒、表达载体、宿主菌及制备无标签重组人IL37成熟肽的方法。本发明所述表达盒，包含启动子、伴侣蛋白编码的核酸序列、酶切识别位点编码的核酸序列、编码人白细胞介素37成熟肽的核酸序列和终止转录子。本发明所述表达载体是通过将上述表达盒构建至表达载体。本发明所述宿主菌是上述表达载体转化至基因工程菌，并用诱导剂诱导rIL37融合蛋白表达。本发明所述制备无标签重组人IL37成熟肽的方法是包含上述的表达盒的表达载体的宿主菌经培养后诱导重组蛋白表达，收集菌体，裂解菌体收集上清，进行亲和层析，然后加入能结合亲和层析介质的蛋白酶在线切除标签蛋白；其中所述蛋白酶可识别所述的表达盒中的酶切识别位点。本发明所述方法在亲和层析过程中在线切除标签蛋白以快速得到无标签的重组人白细胞介素37成熟肽，进一步纯化可得到高纯度的rIL37。本发明所述制备方法能够快速切除标签蛋白，简化了制备工艺，同时大大提高rIL37的纯度。实验表明经过后期一步纯化，其纯度可达99％以上。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中构建载体时所涉及PCR扩增IL37成熟肽基因片段的引物序列见SEQ IDNo：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3；定点突变PCR构建IL37成熟肽突变体载体的引物序列见SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7，具体见表1所示。所涉及的克隆方法具体参考《分子克隆》(第三版，科学出版社，2002年8月)。
表1引物序列及蛋白序列
实施例1、pGEX6P1-IL37(46-218)重组表达载体的构建
1.IL37(46-218)克隆片段的制备
人IL37基因(NM014439)由南京金斯瑞生物公司连接至pDonR-223载体中，并命名为pDonR-223-IL37。然后以pDonR-223-hIL37载体为模板0.5μl，分别加入10μM浓度的引物F46(SEQ ID No：2)和R218(SEQ ID No：3)各1μl，PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5μl，5×PrimeSTAR*Buffer(Mg2+plus)5μl，2.5mM浓度的dNTP Mixture 2.5μl，ddH2O14.5μl。PCR反应条件为98℃预变性5min，98℃/10s，58℃/10s，68℃/45s(30个循环)，72℃延伸10min，电泳，切胶回收约530bp的DNA片段，此片段为含有BamHI和XhoI酶切位点的IL37(46-218)基因片段，以30μl无菌去离子水从DNA纯化柱上洗脱。
2.BamHI、XhoI双切PCR片段和pGEX6P1载体的制备
在200μl EP管中各加入14μl PCR得到的IL37(46-218)基因片段，然后加入2μlBamHI，2μl XhoI，2μl 10×H Buffer。在另一个200μl EP管中加入2μlBamHI，2μl XhoI，2μl10×H Buffer，14μl小提的质粒pGEX6P1载体。两个EP管均置于37℃孵育3h，电泳证实酶切完全后，分别切胶回收纯化具有相同粘性末端的IL37(46-218)和pGEX6P1片段。以25μl无菌去离子水从纯化柱上洗脱。
3.连接、转化及阳性克隆的筛选：
将上一步得到的具有相同粘性末端的IL37(46-218)基因片段20.5μl，与1μl线性化的pGEX6P1片段，2.5μl 10×T4连接酶Buffer及1μl T4DNA连接酶混匀，16℃反应过夜。取5μl连接混合物进行转化克隆宿主JM109。取200μl转化混合物均匀涂布于含有100μg/ml氨苄抗生素的2×YT固体培养基上；在37℃恒温培养箱中倒置培养过夜，直至长出清晰可见的单菌落。挑取数个单菌落至4ml含100μg/ml氨苄霉素的2×YT培养基中，37℃，230rpm生长约10h，快速提取质粒，进行BamHI和XhoI双酶切鉴定分析，确定连接位点正确，将构建的载体命名pGEX6P1-IL37(46-218)，并将其保存于-20℃。重组质粒的示意图如图2所示。
实施例2、重组工程菌的构建及高表达克隆的筛选
1.重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta。
首先制备感受态工程菌(以下步骤需在无菌条件下进行)：将保存于-80℃的工程菌BL21(DE3)Rosetta取出，划线活化在LB固体培养基上，37℃恒温培养箱中倒置培养过夜，待长出单菌落；挑取单菌落接种到250ml的锥形瓶中(含50ml LB培养基)，37℃，220rpm培养6-8h，测OD600，待其达到0.6-0.8时停止培养；4℃，2 500rpm离心5-10min，收集菌体，并将上清去净；加入40ml预冷的Inoue转化缓冲液(10mM PIPES，55mM MnCl2，15mMCaCl2，250mMKCl)重悬菌体。整个过程在冰上操作；4℃，2 500rpm离心5-10min，收集菌体，加入10ml转化缓冲液重悬菌体；分装为200μl每支，每支中加入14μl的DMSO，并与菌液混匀，贴好标签，置于液氮中保存，备用。
然后将重组表达载体转化工程菌：将工程菌BL21(DE3)Rosetta感受态细胞从液氮中取出，置于冰上解冻；取1μl重组质粒(这里指的是pGEX6P1-IL37(46-218))加入到100μl工程菌BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，于冰上放置30min；42℃热激45s，热激过程不要有晃动，然后迅速放回冰上，放置1min；然后加入至900μl经37℃预热的LB培养基，37℃，100rpm慢速温和孵育1h；然后将菌液3 500rpm离心5min去除900μl上清，取剩下的100μl均匀涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上；在37℃恒温培养箱中倒置培养过夜，待菌落形成。
2.高表达克隆的筛选：
挑取含pGEX6P1-IL37(46-218)质粒的BL21(DE3)Rosetta单菌落于5ml含100μg/ml的2×YT液体培养基小量培养至OD600约等于0.8时，加入1mMIPTG，继续培养4h诱导蛋白表达，SDS-PAGE分析，在此挑选高表达克隆。并将高表达克隆的工程菌加入20％的甘油保存于-20℃备用。
实施例3、重组蛋白的表达、纯化及纯度估算
1.蛋白的重组表达
将高表达重组蛋白的工程菌在冰上解冻后，划线接种于含有100μg/ml氨苄霉素的2×YT平板，并在37℃恒温培养箱中倒置培养过夜，直至长出清晰可见的单菌落。然后挑取单菌落接种于50ml含有100μg/ml的2×YT培养基中220rpm/37℃过夜增菌，按1％接种量转接至500ml带挡板的摇瓶中至菌体OD600值约为0.8时，加入1mM IPTG继续震荡培养4h，诱导重组蛋白的表达。然后8000rpm离心20min，弃上清，收集菌体并冻存于-20℃备用。
2.诱导表达的工程菌菌体破碎
解冻诱导表达重组蛋白的工程菌体5g，加入50ml裂解缓冲液(25mMTris-HClpH7.0，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)重悬菌体，然后加入蛋白酶抑制剂(1mM PMSF，2μg/ml Pepstatin A，2μg/ml Leupeptin)。将菌体用超声破碎仪裂解菌体(超1s，停3s，共3min，振幅为25％)。裂解后的悬液于高速冷冻台式离心机4℃，35 000g离心30min，并收集上清至50ml离心管中。
3.亲和层析过程中直接在线切割、纯化rIL37
整个步骤如图2所示。10ml裂解缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.0，100mMNaCl，1mMEDTA，1mM DTT)加入至1ml GST填料平衡。然后将上一步菌体破碎后含重组蛋白的上清与平衡后的GST填料在4℃条件下，慢速翻转孵育1小时。将孵育液转移至重力流的层析管中(GEHealthcare company)，弃上清液，加入用10ml裂解缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.0，100mMNaCl，1mM EDTA，1mM DTT)洗去非特异性结合的杂蛋白。将4ml裂解缓冲液(25mM Tris-HClpH7.0，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)加入结合了重组蛋白的GST填料并重悬，转移到50ml离心管中，加入10μl 1mg/ml浓度的GST-HRV3C酶，置于水平摇床100rpm轻摇，4℃酶切过夜。将酶切后的混合物转移至重力流层析管中，收集流穿液即为无标签的rIL37蛋白，并往重力流层析管中加入6ml裂解缓冲液以充分收集。
4.Mono S纯化rIL37及纯度估算
采用GE Healthcare company的AKTA FPLC系统，以5ml低盐缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.0，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)平衡Mono S5/5柱子后。然后将上一步酶切后的10ml rIL37蛋白流穿液用0.22μM滤膜过滤，并将样品上至Mono S 5/5纯化柱，流速为0.8ml/min，然后用2ml低盐缓冲液冲洗Mono S柱上杂蛋白，最后用高盐缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.0，1M NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)经20倍柱体积至100％高盐洗脱液，线性梯度洗脱结合至Mono S柱上的蛋白。根据A280吸收值确定蛋白峰，并收集各个峰，最后通过SDS-PAGE电泳结果及Mono S纯化时目的蛋白峰洗脱位置，确定rIL37蛋白在300mM NaCl浓度时洗脱，其纯度达到99％以上(如图3所示)。
5.对比例：亲和层析过程中先洗脱再切割、纯化rIL37
蛋白重组表达及亲和层析的步骤与上文一样。先用10ml裂解缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.0，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)加入至1ml GST填料平衡。然后将上一步菌体破碎后含重组蛋白的上清与平衡后的GST填料在4℃条件下，慢速翻转孵育1小时。将孵育液转移至重力流的层析管中(GEHealthcare company)，弃上清液，加入用10ml裂解缓冲液(25mM Tris-HClpH7.0，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)洗去非特异性结合的杂蛋白。将10ml含有10mM GSH的缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.0，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)加入结合了重组蛋白的GST填料以洗脱目的蛋白(图4A第1-6泳道)，收集目的蛋白后加入10μl1mg/ml浓度的GST-HRV3C酶，置于水平摇床100rpm轻摇，4℃酶切过夜。将酶切后的混合物进一步采用阳离子交换层析，其具体步骤如上文所示。结果发现其切割体系中成分较复杂(图4B第2泳道)，在后续Mono S纯化的效果不佳，其纯度只能达到大约80％(图4C第2-6泳道)。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 南华大学
<120> 一种表达盒、表达载体、宿主菌及制备无标签重组人IL37成熟肽的方法
<130> MP1730663
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
cgggatccga accccagtgc tgcttaga 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cgggatccgt tcacacaagt ccaaaggt 28
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ccgctcgagt taatcgctga cctcactggg gc 32
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gttccagata aaaacgccat acgcccagag atc 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gatctctggg cgtatggcgt ttttatctgg aac 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
aaagtactgg tcctgaagtc tgggaatctc ata 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
tatgagattc ccagacttca ggaccagtac ttt 33
<210> 8
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Gly Pro Leu Gly Ser Glu Pro Gln Cys Cys Leu Glu Asp Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Leu Glu Pro Gly Pro Ser Leu Pro Thr Met Asn Phe Val His
20 25 30
Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser Ile His
35 40 45
Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu Ile Ala
50 55 60
Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu
85 90 95
Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly
100 105 110
Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu
115 120 125
Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala
130 135 140
Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp
145 150 155 160
Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val Thr Asp
165 170 175
Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys
180 185 190
Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp
195 200
<210> 9
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Gly Pro Leu Gly Ser Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn
1 5 10 15
Pro Lys Lys Phe Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu
20 25 30
Asp Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro
35 40 45
Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu
50 55 60
Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu
65 70 75 80
Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys
85 90 95
Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg
100 105 110
Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu
115 120 125
Ser Ala Ala His Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn
130 135 140
Glu Pro Val Gly Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu
145 150 155 160
Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val
165 170 175
Ser Asp
<210> 10
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Gly Pro Leu Gly Ser Glu Pro Gln Cys Cys Leu Glu Asp Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Leu Glu Pro Gly Pro Ser Leu Pro Thr Met Asn Phe Val His
20 25 30
Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser Ile His
35 40 45
Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Lys Ser Gly Asn Leu Ile Ala
50 55 60
Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu
85 90 95
Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly
100 105 110
Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu
115 120 125
Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala
130 135 140
Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp
145 150 155 160
Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val Thr Asp
165 170 175
Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys
180 185 190
Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp
195 200
<210> 11
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Gly Pro Leu Gly Ser Glu Pro Gln Cys Cys Leu Glu Asp Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Leu Glu Pro Gly Pro Ser Leu Pro Thr Met Asn Phe Val His
20 25 30
Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser Ile His
35 40 45
Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu Ile Ala
50 55 60
Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu
85 90 95
Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly
100 105 110
Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu
115 120 125
Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala
130 135 140
Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp
145 150 155 160
Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val Thr Asp
165 170 175
Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys
180 185 190
Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp
195 200
<210> 12
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
Gly Pro Leu Gly Ser Glu Pro Gln Cys Cys Leu Glu Asp Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Leu Glu Pro Gly Pro Ser Leu Pro Thr Met Asn Phe Val His
20 25 30
Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser Ile His
35 40 45
Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Lys Ser Gly Asn Leu Ile Ala
50 55 60
Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu
85 90 95
Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly
100 105 110
Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu
115 120 125
Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala
130 135 140
Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp
145 150 155 160
Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val Thr Asp
165 170 175
Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys
180 185 190
Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp
195 200
<210> 13
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Gly Pro Leu Gly Ser Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn
1 5 10 15
Pro Lys Lys Phe Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu
20 25 30
Lys Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro
35 40 45
Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu
50 55 60
Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu
65 70 75 80
Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys
85 90 95
Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg
100 105 110
Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu
115 120 125
Ser Ala Ala His Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn
130 135 140
Glu Pro Val Gly Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu
145 150 155 160
Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val
165 170 175
Ser Asp
<210> 14
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
Gly Pro Leu Gly Ser Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn
1 5 10 15
Pro Lys Lys Phe Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu
20 25 30
Asp Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro
35 40 45
Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu
50 55 60
Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu
65 70 75 80
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Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg
100 105 110
Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu
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Ser Ala Ala His Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn
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Glu Pro Val Gly Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu
145 150 155 160
Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val
165 170 175
Ser Asp
<210> 15
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
Gly Pro Leu Gly Ser Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn
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Lys Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro
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Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu
50 55 60
Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu
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Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys
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Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg
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Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu
115 120 125
Ser Ala Ala His Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn
130 135 140
Glu Pro Val Gly Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu
145 150 155 160
Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val
165 170 175
Ser Asp

Claims (10)

1.一种表达盒，从5’端至3’端依次包括以下元件：(1)启动子；(2)伴侣蛋白编码的核酸序列；(3)酶切识别位点编码的核酸序列；(4)编码人白细胞介素37成熟肽的核酸序列；(5)终止转录子。
2.根据权利要求1所述的表达盒，所述人白细胞介素37成熟肽的氨基酸序列如SEQ IDNo：8～15中一种所示，或在SEQ ID No：8～15所示序列中截短、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的表达盒，所述启动子为Tac启动子、T7启动子、GAP启动子或AOX启动子；所述伴侣蛋白为硫氧还蛋白(GST)，类泛素蛋白(SUMO)、TF、麦芽糖结合蛋白(MBP)；所述酶切识别位点编码的核酸序列为HRV3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)、Factor Xa蛋白酶、凝血酶(Thrombin)、SUMO蛋白酶、肠激酶(Enterokinase)的切割识别位点的核苷酸序列。
4.包含权利要求1-3任一所述的表达盒的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，所述表达载体为pGEX6P1、pGEX6P2、pGEX4T1、pGEX4T2、pMAL-c2x、pMAL-c5x、pPICZαA或pGAPZαA。
6.包含权利要求4所述的表达载体的宿主菌。
7.根据权利要求6所述宿主菌，其为大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母菌或昆虫细胞。
8.一种制备无标签重组人IL37成熟肽的方法，包含权利要求1-3任一所述的表达盒的表达载体的宿主菌经培养后诱导重组蛋白表达，收集菌体，裂解菌体收集上清，进行亲和层析，然后加入能结合亲和层析介质的蛋白酶；其中所述蛋白酶可识别所述的表达盒中的酶切识别位点。
9.根据权利要求8所述方法，所述蛋白酶包括但不限于HRV3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)、Factor Xa蛋白酶、凝血酶(Thrombin)、SUMO蛋白酶、肠激酶(Enterokinase)。
10.根据权利要求9所述方法，还包括纯化步骤，所述纯化为分子筛层析、疏水层析、亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析中至少一种。
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