CN110093394B

CN110093394B - 一种蛋白包涵体及重组人β-神经生长因子的制备方法

Info

Publication number: CN110093394B
Application number: CN201910390559.2A
Authority: CN
Inventors: 李树刚; 张伟; 王传胜; 邓永康; 龚会英; 柴新娟; 但国平; 程丹凝; 余英鹏
Original assignee: Chongqing Kerun Biomedical R & D Co ltd
Current assignee: Chongqing Kerun Biomedical R & D Co ltd
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: CN110093394A

Abstract

本发明涉及一种蛋白包涵体及重组人β‑神经生长因子的制备方法，对含肠激酶酶切位点的重组人β‑神经生长因子前体蛋白的包涵体进行色谱复性，得到复性前体蛋白，即蛋白包涵体；对复性前体蛋白进行肠激酶酶切，得到酶解产物；对酶解产物进行分离纯化。本发明将色谱法应用到rhpro‑NGF包涵体复性中，相比于传统的稀释复性方法，显著提高复性率，缩短复性时间，使后续纯化更简单，获得结构正确高纯度产品，能够减少蛋白质互相聚集的机会，打破复性变性反应平衡，使复性反应持续进行，以较高的蛋白复性浓度进行，便于去除变性剂，集成复性与纯化过程，可以实现自动化、规模化，层析介质可以重复使用，降低工艺成本，更利于将来产业化的大规模生产。

Description

一种蛋白包涵体及重组人β-神经生长因子的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，并且更具体地，涉及到一种蛋白包涵体及重组人β-神经生长因子的制备方法。

背景技术

神经生长因子(NGF)是最早被发现的、目前研究最为透彻的一种具有营养神经元胞体并促进神经元轴突生长功能的神经营养因子，动物试验及临床研究表明基于其调控中枢及周围神经元的发育、分化、生长的生理功能，在发生神经损伤后，外源给予NGF可促进损伤神经的修复和再生，因此是一种治疗神经损伤相关疾病的潜在药物。NGF是一个复合蛋白，由α、β、γ三个亚单位组成，其中具有营养和促进神经生长功能的是β亚单位，是两条由118个氨基酸组成的单肽链通过非共价结合形成的二聚体，不同物种间β-神经生长因子(β-NGF)的结构具有高度同源性，生物学功能也没有明显种间差异。

从上世纪90年代开始，国内外多家制药公司和药物研究机构将β-NGF作为一种治疗神经损伤的蛋白药物进行研究开发，但到目前为止，世界上仅有我国的海特、舒泰神、未名医药和丽珠四家公司以及意大利的Dompé公司成功上市了NGF药物。我国上市的四种NGF药物，其活性成分都是鼠β-NGF，从小鼠颌下腺提取，生产上存在鼠源病毒污染的风险且批间质量控制难度大。鼠β-NGF和人β-NGF的同源性为90％，长期应用会产生免疫原性，因此有必要研发人β-NGF药物。从人体组织提取β-NGF很难实现，一方面人体组织中β-NGF分布广、含量低，提取纯化难度大，另一方面组织来源存在伦理问题和安全风险，这些都不利于实现规模化的安全药物生产。因此通过重组表达人β-NGF势在必行。

意大利Dompé公司于2017年上市了世界上第一个重组人β-NGF药物，生产工艺是采用原核表达系统(E.coli)表达重组人β-神经生长因子前体蛋白(rhpro-NGF)包涵体，包涵体经过稀释复性，用胰蛋白酶切掉前导肽后再纯化得到β-NGF蛋白。由于稀释复性率低，且存在因二硫键错配导致构象不正确问题，导致生物学活性比从鼠提取的β-NGF低50倍这样的问题。因此国内外业界更倾向于使用真核系统直接表达人NGF-β来克服这些问题，目前国外使用真核系统大规模表达并纯化人β-NGF已有成熟工艺，如NIBSC提供的重组人β-NGF国际标准品就是用CHO细胞表达的。国内生产鼠β-NGF药物的四家企业，在进行产品升级换代的策略上也是采用CHO细胞表达重组人β-NGF。但是采用CHO细胞生产人β-NGF不能回避的问题是哺乳动物细胞培养成本高，表达量低(50mg/mL)。且由于细胞分泌过程中翻译后修饰或分泌后氨基酸残基侧链发生化学反应或肽链降解而产生了一系列变异体蛋白需要除去，增加了后续纯化的难度和成本。相比之下，使用原核系统生产人β-NGF，成本低，但需要解决包涵体复性上的难点。但目前文献报道的原核表达的rhpro-NGF主要是通过稀释复性。稀释复性的复性率低，复性时间长，运用到生产上时需要很大复性体积，不利于产业化生产，且生产成本较高。

基于此，现有技术仍然有待改进。

发明内容

本发明针对上述问题，目的在于提供一种蛋白包涵体及重组人β-神经生长因子的制备方法，其能显著提高复性率，使后续纯化更简单，获得结构正确高纯度产品，降低工艺成本，更利于将来产业化生产。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明的实施例公开了一种重组人β-神经生长因子的制备方法，其包含以下步骤：

步骤(1)对含肠激酶酶切位点的重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体进行色谱复性，得到复性前体蛋白；

步骤(2)对所述复性前体蛋白进行肠激酶酶切，得到酶解产物；

步骤(3)对所述酶解产物进行分离纯化。

进一步地，所述步骤(1)中，所述色谱复性包括：

步骤(11)色谱柱平衡：用复性缓冲液A平衡SP-Sepharose FF填料；

步骤(12)包涵体溶液上柱：平衡后的填料与rhpro-NGF包涵体溶解液混合，装柱，再用复性缓冲液A平衡；

步骤(13)包涵体柱上线性梯度复性：复性缓冲液A从100％-0，同时复性缓冲液B从0-100％；

步骤(14)复性蛋白洗脱，得到目标组分和非复性组分；

其中，所述复性缓冲液A为25mM Tris-HCl、7-8M尿素、5mM EDTA-Na2、5mM GSH、1mMGSSG pH8.0；所述复性缓冲液B为25mM Tris-HCl、0.5M尿素、5mM EDTA-Na2，5mM GSH、1mMGSSG pH8.0。

进一步地，通过对所述含肠激酶酶切位点的重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体进行菌体裂解处理、rhpro-NGF包涵体的洗涤和溶解，得到rhpro-NGF包涵体溶解液。

进一步地，所述菌体裂解处理包括：用裂解缓冲液按菌液比1:10重悬菌体，采用高压匀浆方式破菌；

所述裂解缓冲液为25mM Tris-HCl、5mM EDTA-Na2pH8.0；

所述高压匀浆方式破菌包括：200Bar均浆一次，800Bar破碎两次；破菌温度15℃。

进一步地，所述步骤(2)中，采用重组牛肠激酶进行肠激酶酶切。

进一步地，所述步骤(3)中，采用组合层析对所述酶解产物进行分离纯化。

进一步地，所述组合层析包括：采用SP-HP和BUTYL-Sepharose FF组合层析对酶解产物进行分离纯化。

进一步地，所述步骤(1)中，所述含肠激酶酶切位点的重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体通过重组大肠杆菌高密度发酵和IPTG诱导表达获得。

进一步地，表达质粒为pET-30a(+)，菌株为BL21(DE3)；

所述高密度发酵和IPTG诱导表达包括：

在菌体OD600达20时，开始补料培养，补料培养基的流加参数为240mL/h/20L；

在菌体OD600达35时，开始补料诱导，补料培养基的流加参数为60mL/h/20L；

IPTG诱导浓度为0.5mM，诱导4小时；

所述补料培养基为40％甘油+20％酵母粉。

另一方面，本发明的实施例公开了一种蛋白包涵体，其通过对含肠激酶酶切位点的重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体进行色谱复性得到。

本发明的有益效果是：

本发明将色谱法应用到rhpro-NGF包涵体复性中，相比于传统的稀释复性方法，显著提高复性率，缩短复性时间，使后续纯化更简单，获得结构正确高纯度产品，能够减少蛋白质互相聚集的机会，打破复性变性反应平衡，使复性反应持续进行，以较高的蛋白复性浓度进行，便于去除变性剂，集成复性与纯化过程，可以实现自动化、规模化，层析介质可以重复使用，降低工艺成本，更利于将来产业化的大规模生产。

附图说明

图1为重组人β-NGF SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1为还原性电泳，泳道2为非还原性电泳；

图2为重组人β-NGF RP-HPLC检测图；

图3为重组人β-NGF质谱分子量检测图；

图4-1至图4-6为重组人β-NGF N端测序图；

图5为重组人β-NGF细胞测活量效曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂和培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。

本发明的一些实施例所公开的重组人β-神经生长因子的制备方法，包含以下步骤：

步骤(3)对所述酶解产物进行分离纯化。

上述实施例将色谱复性技术应用于rhpro-NGF包涵体复性，相比于传统稀释复性方法，实现了在高浓度条件下复性，减小了操作体积，使复性过程和纯化过程在同一操作单元下完成，复性率从原稀释复性10％左右提高到30％左右；再经重组牛肠激酶酶切前体蛋白，经两步层析，可制得纯度大于99％的重组人β-NGF蛋白，得率为每百克菌体获得纯品70-80mg。本发明提供的制备工艺，提高了生产效率、降低了工艺成本且利于产业化生产。

在一些优选的实施例公开的重组人β-神经生长因子的制备方法中，其中，所述步骤(1)中，所述色谱复性包括：

步骤(11)色谱柱平衡：用复性缓冲液A平衡SP-Sepharose FF填料；

步骤(14)复性蛋白洗脱，得到目标组分和非复性组分；

其中，所述复性缓冲液A为25mM Tris-HCl、7-8M尿素、5mM EDTA-Na2、5mM GSH、1mMGSSG pH8.0；

所述复性缓冲液B为25mM Tris-HCl、0.5M尿素、5mM EDTA-Na2，5mM GSH、1mM GSSGpH8.0。

具体地，首先对表达含肠激酶酶切位点的rhpro-NGF重组大肠杆菌进行高密度发酵和IPTG诱导，离心发酵液收集含rhpro-NGF包涵体的菌体；然后破碎菌体，离心分离、洗涤并溶解包涵体；将色谱填料平衡后与包涵体溶解液混合并装柱；采用包涵体柱上梯度复性并洗脱复性的前体蛋白；收集洗脱的前体蛋白并脱盐，用肠激酶酶切；最后采用离子交换和疏水层析纯化酶切混合物，阶段梯度洗脱，分子筛脱盐并超滤浓缩获得重组人β-NGF蛋白。

本发明一些实施例中，重组工程菌表达质粒选用pET-30a(+)，菌株选用BL21(DE3)；高密度发酵条件为：菌体OD达20时开始补料培养，补料培养基的流加参数为240mL/h/20L；菌体OD达35时开始补料诱导，补料培养基的流加参数为60mL/h/20L；IPTG诱导浓度为0.5mM，诱导时间为4小时；补料培养基为40％甘油+20％酵母粉；破碎菌体时，菌体重悬液为25mM Tris-HCl、5mM EDTA-Na2pH8.0，使用量为菌体湿重10倍体积；破碎菌体的条件为15℃、200bar匀浆一次、800bar破菌两次；洗涤包涵体的缓冲液为25mM Tris-HCl、0.2M NaCl、5mM EDTA-Na2(洗涤缓冲液3)、将洗涤缓冲液3的尿素调整至2M尿素即为洗涤缓冲液2、将洗涤缓冲液3的尿素调整为2M尿素和1％Triton X100即为洗涤缓冲液1；溶解包涵体的缓冲液为25mM Tris-HCl、7-8M尿素、5mM EDTA-Na2，5mM GSH pH8.0；色谱填料是SP-SepharoseFF；平衡填料的缓冲液是复性缓冲液A即25mM Tris-HCl、7-8M尿素、5mM EDTA-Na2、5mMGSH、1mM GSSG pH8.0；梯度复性条件为复性缓冲液A从100％-0，同时复性缓冲液B从0-100％，流速10mL/min，梯度时间12小时；复性缓冲液B为25mM Tris-HCl、0.5M尿素、5mMEDTA-Na2，5mM GSH、1mM GSSG pH8.0；前体蛋白洗脱缓冲液为25mM Tris-HCl、0.5M NaClpH8.0；前体蛋白脱盐方式为分子筛脱盐，使用G25填料；肠激酶酶切条件为每毫克前体蛋白加0.4U肠激酶酶量，6-8℃酶解12小时；离子交换层析的填料选用SP-HP，洗脱方式为阶段梯度洗脱，10％(25mM Tris-HCl pH8.0)/90％(25mM Tris-HCl、1M NaCl pH8.0)洗脱杂蛋白；20％(25mM Tris-HCl pH8.0)/80％(25mM Tris-HCl、1M NaCl pH8.0)洗脱目标蛋白；流速120mL/min，室温；疏水层析的填料选用BUTYL-Sepharose FF，洗脱方式为阶段梯度洗脱，80％(20mM PB、1M硫酸铵pH7.4)/20％(20mM PB pH7.4)、60％(20mM PB、1M硫酸铵pH7.4)/40％(20mM PB pH7.4)、50％(20mM PB、1M硫酸铵pH7.4)/50％(20mM PB pH7.4)、40％(20mMPB、1M硫酸铵pH7.4)/60％(20mM PB pH7.4)、100％(20mM PB pH7.4)，收集50％(20mM PB、1M硫酸铵pH7.4)/50％(20mM PB pH7.4)洗脱组分，经分子筛G25脱盐，超滤浓缩后可得纯度大于99％，比活力为1.2×10⁶U/mg的重组人β-神经生长因子。

所用试剂耗材列表

(1)限制性内切酶NdeI：购于Takara公司；

(2)限制性内切酶NotI：购于Takara公司；

(3)大肠杆菌BL21(DE3)：购于Novagen公司；

(4)表达载体pET-30a(+)：购于Novagen公司；

(5)大肠杆菌DH5α：购于Thermo Fisher Scientific公司；

(6)肠激酶：购于上海雅心生物技术有限公司；

(7)SP-Sepharose Fast Flow填料：购于GE生命科学公司；

(8)G25填料：购于GE生命科学公司；

(9)SP-HP填料：购于GE生命科学公司；

(10)BUTYL-Sepharose Fast Flow填料：购于GE生命科学公司；

(11)TF-1细胞：购于ATCC；

(12)RPMI 1640培养液：购于ATCC；

(13)FBS：购于Gibco公司；

(14)MTS：购于Promega公司；

(15)rhNGF国际标准品：购于NIBSC；

(16)乙腈、三氟乙酸：市售，色谱纯；

(17)其余化学试剂：市售，分析纯。

实施例一：表达含肠激酶酶切位点的rhpro-NGF工程菌构建

参照大肠杆菌密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的前提下，优化rhpro-NGF碱基序列，并且在rhpro-NGF蛋白的前导肽和成熟肽碱基序列中间插入肠激酶识别位点DDDDK的碱基序列。优化后的碱基序列5’端加上NdeI酶切位点，3’端加上NotI酶切位点，并在目的蛋白3’端与NotI酶切位点之间加入终止密码子序列TAATAA，得到如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。设计好的序列通过化学合成方式进行全基因合成。用NdeI/NotI双酶切该合成序列，与用相同酶切的表达质粒pET-30a(+)连接，转化大肠杆菌DH5α并涂布含卡那霉素50μg/mL的LB平板，挑选单克隆菌落用LB培养基在37℃振荡培养，抽提质粒并酶切检验，获得含肠激酶酶切位点的rhpro-NGF表达质粒[pET-30a(+)-rhpro-NGF]，将该质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中并涂含卡那霉素50μg/mL的LB平板，挑选单克隆菌落，用LB培养基在37℃振荡培养并加IPTG诱导表达，电泳检测目标蛋白表达水平，优选表达量高的重组工程菌株。

SEQ ID NO:1

CATATGGAACCGCATAGTGAAAGTAATGTGCCGGCCGGTCATACCATTCCGCAGGCACATTGGACCAAACTGCAGCATAGTCTGGATACCGCCCTGCGTCGCGCACGCAGTGCACCTGCTGCAGCAATTGCCGCACGTGTGGCAGGCCAGACCCGTAATATTACCGTTGATCCGCGTCTGTTTAAAAAACGTCGTCTGCGCAGTCCGCGTGTGCTGTTTAGTACCCAGCCGCCGCGTGAAGCAGCAGATACCCAGGATCTGGATTTTGAAGTTGGTGGTGCCGCCCCGTTTAATCGTACCCATCGTAGTAAACGCGATGATGATGATAAAAGCAGCAGCCATCCGATTTTTCATCGTGGCGAATTTTCAGTTTGCGATAGTGTGAGCGTGTGGGTTGGCGATAAAACCACCGCCACCGATATTAAGGGTAAAGAAGTTATGGTTCTGGGCGAAGTTAATATTAATAATAGCGTTTTCAAGCAGTACTTCTTTGAAACCAAATGTCGCGATCCGAATCCGGTGGATAGCGGCTGTCGCGGTATTGATAGTAAACATTGGAATAGTTACTGCACCACCACCCATACCTTTGTGAAAGCCCTGACAATGGATGGCAAACAGGCAGCCTGGCGTTTTATTCGTATTGATACCGCCTGTGTTTGTGTGCTGAGCCGCAAAGCCGTGCGCTAATAAGCGGCCGC

SEQ ID NO:2(DDDDK表示插入的肠激酶位点)

EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRDDDDKSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR

实施例二：rhpro-NGF工程菌高密度培养及目标蛋白的诱导表达

将rhpro-NGF工程菌划线LB平板(kan 100mg/L)，37℃恒温培养箱培养约16-18h，至单菌落长出。挑工程菌单菌落接种20ml LB培养基中(kan 100mg/L)，37□，230rpm培养8h。0.1％转接至250mlLB(kan 100mg/L)，1L锥形瓶，37℃，230rpm培养13h。平行培养4瓶，制备菌液1000ml，5％接种至发酵罐NLF-2220L上罐培养基中，接种前用氨水将pH调至7.0，发酵过程控制温度为36□。培养基的pH值和溶氧通过流加氨水和增加搅拌速度和通气量来控制，溶氧大于30％。约5h后培养基中的碳源耗尽，OD600达到20，之后以240mL/h/20L培养基的速度开始流加补料培养基(40％甘油+20％酵母粉)继续培养，OD600达到35，以60mL/h/20L培养基的速度流加补料培养基开始诱导，诱导剂为IPTG，终浓度0.5mM。并保持此流加速度，维持溶氧在30％以上。诱导4h，下罐。

实施例三：rhpro-NGF包涵体(IB)的色谱复性

(一)、菌体裂解

1、裂解缓冲液：25mM Tris-HCl、5mM EDTA-Na₂pH8.0；

2、菌体混悬比：1:10

3、破菌压力：200Bar均浆一次，800Bar破碎两次；温度15℃

4、IB收集：高速冷冻离心，10000g，离心30min，去上清液，留取沉淀；

5、称沉淀的重量。

(二)、IB的洗涤

1、洗涤缓冲液

1)洗涤缓冲液1：25mM Tris-HCl、2M尿素、1％Triton X100、0.2M NaCl、5mMEDTA-Na2pH8.0；

2)洗涤缓冲液2：25mM Tris-HCl、2M尿素、0.2M NaCl、5mM EDTA-Na2pH8.0；

3)洗涤缓冲液3：25mM Tris-HCl、0.2M NaCl、5mM EDTA-Na2pH8.0；

2、混悬比：1:10，电动搅拌器搅拌，室温(25℃)洗涤30min；

3、分别用洗涤缓冲液1-3洗涤IB；

4、IB离心分离：10000g，离心30min，去上清液，留取沉淀；

5、第三次洗涤后，称取沉淀的数量。

(三)、IB溶解

1、溶解缓冲液：25mM Tris-HCl、7-8M尿素、5mM EDTA-Na2，5mM GSH pH8.0；

2、混悬比：1:10，磁力搅拌器搅拌，室温(25℃)溶解2小时；

3、IB溶液分离：10000g，离心30min，取上清液，去沉淀；

4、BCA法测定蛋白浓度。

(四)、色谱法复性

1、填料：SP-Sepharose Fast Flow

2、层析柱规格：Φ200×H150(mm*mm)，填料体积：4700mL；

3、负载量：每毫升填料负载0.5mg∽2.5mg；

4、复性缓冲液：

1)A：25mM Tris-HCl、7-8M尿素、5mM EDTA-Na2，5mM GSH、1mM GSSG pH8.0；

2)B：25mM Tris-HCl、0.5M尿素、5mM EDTA-Na2，5mM GSH、1mM GSSG pH8.0；

5、复性参数条件

1)填料处理：0.5M NaOH清洗3-5CV，用纯化水清洗至中性，用25mM Tris-HCl、1MNaCl pH8.0缓冲液再生3CV，用复性缓冲液A平衡2CV；

2)样品处理：平衡后的填料与IB溶液混合，装柱；

3)用复性缓冲液A重新平衡2CV；

4)复性：线性梯度：复性缓冲液A由100％降低至0(同时，复性缓冲液B由0增加至100％)，流速10mL/min，梯度时间720min；

5)洗脱：25mM Tris-HCl、0.5M NaCl pH8.0缓冲液，洗脱目标组分；用25mM Tris-HCl、1M NaCl pH8.0缓冲液洗脱非复性组分；

6、分子筛脱盐：用G25脱盐柱脱盐Φ200×H300(mm*mm)；填料体积：9200mL；每次进样1800mL；流速450mL/min，收集无盐组分；Lowry法测定蛋白浓度；用电泳检测蛋白纯度；平衡缓冲液为25mM Tris-HCl pH8.0。

实施例四：重组人β-NGF蛋白的酶切及组合层析分离纯化

酶切：

按每毫克融合蛋白用肠激酶0.4U的酶量，加入肠激酶，在6-8℃酶解12小时；

组合层析：

1、SP-HP纯化：

1)柱规格：Φ100×H150(mm*mm)，填料体积：1100mL；

2)负载量：每毫升填料1mg-3.5mg；流速120mL/min；

3)纯化缓冲液：

纯化缓冲液C：25mM Tris-HCl pH8.0；

纯化缓冲液D：25mM Tris-HCl、1M NaCl pH8.0；

4)阶段梯度洗脱：

10％D(90％C)，洗脱杂质蛋白；20％D(80％C)洗脱目的蛋白；

5)Lowry法测定蛋白浓度；RP-HPLC分析蛋白纯度；

2、BUTYL-Sepharose Fast Flow精纯化：

1)柱规格：Φ70×H250(mm*mm)，填料体积：950mL；

2)缓冲液

缓冲液E：20mM PB含1M硫酸铵pH7.4；

缓冲液F：20mM PB pH7.4；

3)阶段梯度洗脱：

阶段梯度：80％E、60％E、50％E、40％E、100％F，流速90mL/min(室温20℃)；

收集用50％E洗脱组分；

3、分子筛脱盐：

用G25脱盐柱脱盐Φ40×H300(mm*mm)，填料体积：350mL，每次进样80mL，流速20mL/min，收集无盐组分；用20mM PB pH7.4缓冲液平衡脱盐。其中，SDS-PAGE电泳分析见图1，RP-HPLC分析蛋白纯度见图2和表1。

表1

实施例五：重组人β-NGF的纯度、活性和结构确证

一、重组人β-NGF纯度分析

检测仪器为安捷伦科技生产的1260型高效液相色谱仪，Thermo-C18反相分析柱4.6*250mm，粒径5μm，孔径

流动相为乙腈/水+三氟乙酸，0～20min乙腈梯度25％升高至35％。

检测波长为214nm，柱温30℃，流速1.0ml/min。

RP-HPLC分析纯度大于99％，见图2和表1。

二、重组人β-NGF结构确证

质谱分子量为13621Da，与理论分子量一致，由上海中科新生命生物科技有限公司检测完成，见图3。

N端6个氨基酸测序为Ser-Ser-Ser-His-Pro-Ile-，与理论序列一致，由北京百泰派克生物科技有限公司检测完成，见图4-1至图4-6，其中，图4-1为N端第一位测序；图4-2为N端第二位测序；图4-3为N端第三位测序；图4-4为N端第四位测序；图4-5为N端第五位测序；图4-6为N端第六位测序。

三、生物活性测定：TF-1细胞/MTS比色法

人红细胞白血病细胞(TF-1细胞)的生长依赖重组人β-NGF，根据加入不同重组人β-NGF量，TF-1细胞生长情况不同，来检测的重组人β-NGF生物学活性。

1、试剂

1)RPMI 1640培养液，4℃保存。

2)基础培养液：10％FBS+90％RPMI1640，4℃保存。

3)完全培养液：基础培养液添加rhNGF至终浓度为每1ml含9U。

4)MTS溶液：MTS于4℃融化，1.2ml/支分装到EP管中，并避光保存于-20℃。

5)TF-1细胞：TF-1细胞株用完全培养基于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，控制细胞生长密度为每1ml含1.0×105～5.0×105个细胞。

6)标准品溶液的制备：在洁净条件下，取rhNGF国际标准品，用RPMI1640复溶并按标示效价稀释至2000U/mL，分装并冻存于-80℃。检测时，用基础培养液稀释至200U/mL备用。

7)检测样品的制备：在洁净条件下，将检测样品用基础培养液稀释至合适浓度(质量浓度或活性浓度)备用。

2、测定方法

在洁净条件下，取足量TF-1细胞培养物，离心收集TF-1细胞，用RPMI1640洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成每1ml含3.0×105个细胞的细胞悬液，置于37℃、5％二氧化碳条件下备用。将标准品和样品各100μL在96孔板中进行2倍比稀释，14个梯度，每个孔最后留50μL溶液，向加有标准品溶液和检测样品溶液的14个孔中加入细胞悬液50μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养66～72小时。每孔加入MTS溶液20μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养4小时。培养结束后，向每孔加入10％SDS溶液25μL，振荡裂解5-10分钟，放入酶标仪，在波长490nm处测定吸光度，记录测定结果。

试验数据用Graphpad Prism6软件进行四参数回归计算，并按下式计算结果：

样品生物学活性(U/mL)＝(标准品生物学活性x样品预稀释倍数x样品半效量稀释倍数)/(标准品预稀释倍数x标准品半效量稀释倍数)，重组人β-NGF生物活性为1.2×10⁶U/mg，量效曲线图见图5和表2。

表2

	rhNGF standard	Sample-A	Sample-B	Sample-C
					EC50	1.119	0.9665	0.9861	0.9213

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

序列表

<110> 重庆科润生物医药研发有限公司

<120> 一种蛋白包涵体及重组人β-神经生长因子的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 698

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 1

catatggaac cgcatagtga aagtaatgtg ccggccggtc ataccattcc gcaggcacat 60

tggaccaaac tgcagcatag tctggatacc gccctgcgtc gcgcacgcag tgcacctgct 120

gcagcaattg ccgcacgtgt ggcaggccag acccgtaata ttaccgttga tccgcgtctg 180

tttaaaaaac gtcgtctgcg cagtccgcgt gtgctgttta gtacccagcc gccgcgtgaa 240

gcagcagata cccaggatct ggattttgaa gttggtggtg ccgccccgtt taatcgtacc 300

catcgtagta aacgcgatga tgatgataaa agcagcagcc atccgatttt tcatcgtggc 360

gaattttcag tttgcgatag tgtgagcgtg tgggttggcg ataaaaccac cgccaccgat 420

attaagggta aagaagttat ggttctgggc gaagttaata ttaataatag cgttttcaag 480

cagtacttct ttgaaaccaa atgtcgcgat ccgaatccgg tggatagcgg ctgtcgcggt 540

attgatagta aacattggaa tagttactgc accaccaccc atacctttgt gaaagccctg 600

acaatggatg gcaaacaggc agcctggcgt tttattcgta ttgataccgc ctgtgtttgt 660

gtgctgagcc gcaaagccgt gcgctaataa gcggccgc 698

<210> 2

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro Gln

1 5 10 15

Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg

20 25 30

Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln

35 40 45

Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu

50 55 60

Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala

65 70 75 80

Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn

85 90 95

Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Asp Asp Asp Asp Lys Ser Ser Ser His

100 105 110

Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val

115 120 125

Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val

130 135 140

Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr

145 150 155 160

Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys

165 170 175

Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His

180 185 190

Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg

195 200 205

Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala

210 215 220

Val Arg

225

Claims

1.一种重组人β-神经生长因子的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

步骤(1)：对含肠激酶酶切位点的重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体进行色谱复性，得到复性前体蛋白；

所述色谱复性依次包括：

色谱柱平衡：用复性缓冲液A平衡SP-Sepharose FF填料；

包涵体溶液上柱：平衡后的填料与所述重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体溶解液混合，装柱，再用复性缓冲液A平衡；

包涵体柱上线性梯度复性：复性缓冲液A从100％-0，同时复性缓冲液B从0-100％，流速10mL/min，梯度时间12小时；

复性蛋白洗脱，得到目标组分和非复性组分；

其中，所述复性缓冲液A为25mM Tris-HCl、7-8M尿素、5mMEDTA-Na₂、5mM GSH、1mM GSSGpH8.0；所述复性缓冲液B为25mM Tris-HCl、0.5M尿素、5mM EDTA-Na₂，5mM GSH、1mMGSSGpH8.0；

所述含肠激酶酶切位点的重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体通过重组大肠杆菌高密度发酵和IPTG诱导表达获得；表达质粒为pET-30a(+)，菌株为BL21(DE3)；

所述高密度发酵和IPTG诱导表达包括：

在菌体OD600达20时，开始补料培养，补料培养基的流加参数为240mL/h/20L；在菌体OD600达35时，开始补料诱导，补料培养基的流加参数为60mL/h/20L；IPTG诱导浓度为0.5mM，诱导4小时；所述补料培养基为40％甘油+20％酵母粉；

对所述高密度发酵和IPTG诱导表达获得的菌体进行菌体裂解、洗涤和溶解处理得到重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体溶解液，用于色谱复性；

其中，所述菌体裂解处理包括：用裂解缓冲液按菌液比1:10重悬菌体，采用高压匀浆方式破菌，所述裂解缓冲液为25mM Tris-HCl、5mM DTA-Na₂ pH8.0；破碎菌体的条件为15℃、200bar匀浆一次、800bar破菌两次；洗涤包涵体的缓冲液为：洗涤缓冲液1：25mM Tris-HCl、2M尿素、1％Triton X100、0.2M NaCl、5mM EDTA-Na₂，pH8.0；洗涤缓冲液2：25mM Tris-HCl、2M尿素、0.2M NaCl、5mM EDTA-Na₂，pH8.0；洗涤缓冲液3：25mM Tris-HCl、0.2M NaCl、5mMEDTA-Na₂，pH8.0；溶解包涵体的缓冲液为25mM Tris-HCl、7-8M尿素、5mM EDTA-Na₂、5mMGSH，pH8.0；

步骤(2)：对所述复性前体蛋白进行肠激酶酶切，得到酶解产物；

步骤(3)：对所述酶解产物进行分离纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，采用重组牛肠激酶进行肠激酶酶切。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用组合层析对所述酶解产物进行分离纯化。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述组合层析包括：采用SP-HP和BUTYL-Sepharose FF组合层析对酶解产物进行分离纯化。