CN113249288A

CN113249288A - 一种高效表达glp-1类似物的重组菌及其应用

Info

Publication number: CN113249288A
Application number: CN202110786966.2A
Authority: CN
Inventors: 彭志恩; 宋浩; 柳学伟; 杨晓瑜; 巨晓芝; 郭万成; 信铭雁
Original assignee: Aoruite Pharmaceutical Tianjin Co ltd
Current assignee: Aoruite Pharmaceutical (Tianjin) Co., Ltd; YANGZHOU LIANAO BIOMEDICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2021-07-13
Filing date: 2021-07-13
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2041-07-13
Also published as: CN113249288B9; CN113249288B

Abstract

本发明公开了一种高效表达胰高血糖素样肽1（GLP‑1）或其类似物的重组菌。本发明的重组菌包括表达GLP‑1或其类似物的载体以及干扰重组菌中蛋白酶表达的载体。其中干扰重组菌中蛋白酶表达的载体为通过RNA干扰的方法设计的干扰ClpA、ClpP、ClpQ、ClpX、ClpY、Dcp、PepD、HflB蛋白酶表达的表达载体。本发明通过对重组菌中蛋白酶的表达进行抑制干扰，可以有效解决GLP‑1类似物发酵过程中被宿主菌的蛋白酶降解的问题，同时构建时加入亲水性氨基酸可显著增加蛋白可溶性，减少包涵体产生，可溶部分占比80%，从而将GLP‑1类似物的表达量提高到2g/L以上。本发明的重组菌可高效表达GLP‑1类似物融合蛋白，进而高效制备GLP‑1类似物。

Description

一种高效表达GLP-1类似物的重组菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效表达GLP-1类似物的重组菌及其应用。

背景技术

人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）在治疗2型糖尿病中具有药用潜力，其生理作用包括刺激胰岛素表达、抑制胰高血糖素分泌和减少胃排空，有助于葡萄糖水平的正常化。随着2型糖尿病在世界范围内的流行率增加，开发了许多GLP-1衍生物以增强GLP-1的生物活性和药物稳定性。其日益增长的需求要求开发利用重组微生物进行GLP-1及其类似物大规模生产的生物工艺。

由于GLP-1是一种多肽激素，其生物活性不需要真核翻译后修饰，大肠杆菌可以成为适宜的生产宿主菌株。许多具有重要医疗功能和经济价值的蛋白产物都是通过大肠杆菌获得表达。然而，一些低分子量的肽，如GLP-1及其类似物，当在大肠杆菌中未经修饰表达时，容易被细胞内蛋白水解酶快速降解，严重影响目标产物的表达水平。

大肠杆菌细胞中存在多种蛋白酶，它们在细胞代谢中具有重要的生理功能，一方面，可通过对调节蛋白的灭活来发挥调节作用，维持调节蛋白的基本水平，在作用完成以后迅速将其降解清除。另一方面，蛋白酶还作为大肠杆菌自身防御体系的组成部分，参与降解无用的错误合成或折叠的蛋白质。

蛋白质融合技术已被应用于多肽在大肠杆菌中的稳定表达，即将目的蛋白或多肽与另一蛋白质、或短肽的DNA序列融合，在菌体内表达。融合蛋白具有如下优点：（1）利用宿主的表达调控系统，可增加目的蛋白的表达量；（2）降低菌内蛋白酶的作用，减少目的蛋白的降解。

现有的一些研究开发了蛋白酶缺陷菌株来减少多肽或其他蛋白质的降解，但是蛋白酶缺陷菌株往往生长缓慢，难以快速进行高密度发酵，有些蛋白酶同时也是降解变异蛋白或提供营养、前体和能量所需要的。

CN110128552A，CN110498849A，CN107881187A，CN104592381A，CN108191981A，CN107881187A公开了大肠杆菌表达GLP-1类似物的方法，这些方法均为直接在宿主中导入重组表达载体，没有进行其他工程化改造，且均以包涵体形式表达。包涵体需要长时间溶解、变复性并且复性所需体积大，不适合大规模生产。

发明内容

发明人在做表达GLP-1类似物的重组菌设计时设想：抑制蛋白酶基因表达会是一种更有利的选择。sRNA(small regulatory RNA，非编码RNA)长度一般在几十至几百个核苷酸之间，其可以在分子伴侣Hfq的协助下与正在进行翻译的 mRNA 结合，导致 mRNA发生结构重组，核糖体结合位点（RBS）区域进行碱基互补结合形成二级结构阻止了核糖体结合，使得蛋白酶翻译过程得到抑制，从而减少GLP-1类似物的降解。

为了利用重组大肠杆菌系统高效生产完整的GLP-1及其类似物，发明人设计GLP-1类似物融合蛋白由Leading Peptide -EK- GLP-1类似物连续组成，同时导入抑制蛋白酶表达的sRNAs，从而获得了高效表达的重组菌株。

为实现所述的发明，采用如下的技术方案。

本发明公开了一种重组菌，所述重组菌包括表达GLP-1或其类似物的载体以及干扰重组菌中蛋白酶表达的载体。

优选的，所述蛋白酶基因选自ClpA、ClpP、ClpQ、ClpX、ClpY、Dcp、PepD、HflB中的一种或几种。

优选的，所述蛋白酶的序列为SEQ ID NO:3-10。

优选的，所述干扰重组菌中蛋白酶表达的载体为RNA干扰载体。

优选的，所述RNA干扰载体包括干扰蛋白酶表达的基因片段。

优选的，所述干扰片段选自SEQ ID NO:11-18中的一种或几种。

优选的，所述重组菌为酵母或大肠杆菌。

优选的，大肠杆菌优选为MG1655或BL21（DE3）。

优选的，所述表达GLP-1或其类似物的载体为pRSFdute1 -Leading Peptide -EK-Arg³⁴GLP-1_（7-37）或pRSFdute1 -Leading Peptide -EK- Arg³⁴GLP-1_（9-37）。

本发明公开了所述的重组菌在制备GLP-1或其类似物中的应用。

本发明公开了一种表达GLP-1或其类似物的方法，包括发酵所述的重组菌的操作。

优选的，所述发酵包括诱导的步骤，优选诱导表达包括采用温度诱导或诱导剂诱导。

本发明的第一个目的是提供一种高效表达重组GLP-1类似物的基因片段HIS6-Ub-EK- Arg³⁴GLP-1_（7-37）、HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_（9-37），本发明第二个目的是利用sRNAs抑制不同的蛋白酶，减少表达过程中GLP-1类似物的降解，提供一种高效表达重组GLP-1类似物的工程菌株，实现GLP-1类似物的工业化生产。

为了达到上述的第一个目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效表达重组GLP-1类似物的表达基因片段HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_（7-37）、HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_（9-37），该表达基因片段的序列如SEQ ID NO:1、2所示。

本发明还公开了含有上述的表达基因片段的重组表达载体。

该重组表达载体为所述的基因片段克隆进入PRSFDuet1载体中获得重组表达载体PRSFDuet1- HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)、PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)。

本发明还公开了含有上述的表达基因片段的菌株，该菌株采用表达载体PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)、PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，用IPTG诱导重组菌株的表达，离心收集菌体。

上述的菌株可以用于重组GLP-1类似物（Arg³⁴GLP-1_(7-37)、Arg³⁴GLP-1_(9-37)）的高效表达。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

大肠杆菌中的蛋白酶ClpA、ClpP、ClpQ、ClpX、ClpY、Dcp、PepD、HflB（SEQ ID NO:3-10）会降解异源多肽产物，为了减少GLP-1类似物在发酵过程中的降解，利用sRNA抑制蛋白酶的表达。sRNAs的结构包括PCI启动子、20-24bp蛋白酶序列、Hfq结合蛋白序列和终止子，该表达基因片段的序列分别如SEQ ID NO:11-18所示，其通过与核糖体竞争性结合靶标蛋白酶信使RNA，进而达到抑制靶标蛋白酶基因表达的目的；

将基因片段NO:11-18分别克隆到质粒pBAD202质粒上，分别命名为pBAD-sRNA-clpA、pBAD-sRNA-clpP、pBAD-sRNA-clpQ、pBAD-sRNA-clpX、pBAD-sRNA-clpY、pBAD-sRNA-Dcp、pBAD-sRNA-PepD和pBAD-sRNA-hflB；

将质粒PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)、PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)分别和pBAD-sRNA-clpA、pBAD-sRNA-clpP、pBAD-sRNA-clpQ、pBAD-sRNA-clpX、pBAD-sRNA-clpY、pBAD-sRNA-Dcp、pBAD-sRNA-PepD和pBAD-sRNA-hflB转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，用IPTG诱导表达，离心收集菌体，用Tris缓冲液重悬细胞，高压破碎，离心收集上清液；

将得到的HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)、HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)通过镍柱进行纯化，将洗脱的蛋白进行脱盐，平衡液为25 mM Tris , 50 mM NaCl ，2 mM CaCl₂ pH=7.6。肠激酶酶切后进一步分离纯化获得Arg³⁴GLP-1_(7-37)、Arg³⁴GLP-1_(9-37)。

本发明具有以下有益效果：

本发明解决如何通过基因工程的方法高效表达GLP-1类似物Arg³⁴GLP-1_(7-37)、Arg³⁴GLP-1_(9-37)。通过提高基因拷贝数，提高GLP-1类似物产量；通过对蛋白酶的表达进行抑制，可以有效解决GLP-1类似物发酵过程中降解的问题，同时构建时加入亲水性氨基酸可显著增加蛋白可溶性，减少包涵体产生，可溶部分占比80%，从而将GLP-1类似物的表达量提高到2g/L以上。

附图说明

图1为PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)载体图谱。

图2为pBAD-sRNA-clpA载体图谱。

图3为高表达筛选图。根据蛋白电泳胶光密度进行定量，a双质粒表达菌株3（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37) 和pBAD-sRNA-clpP）与对照相比产量提高最多，可达200%；b双质粒表达菌株11（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37) 和pBAD-sRNA-clpP），对照相比产量提高最多，可达185%。

图4为蛋白分离纯化图，其中图a为纯化的蛋白的吸收峰图，纵坐标单位mAu，横坐标单位ml；图b为纯化的蛋白的电泳图（1：HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)；2：HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)）。

图5 为纯化蛋白Arg³⁴GLP-1_(7-37)的质谱图。

图6为纯化蛋白Arg³⁴GLP-1_(9-37)的质谱图。

图7 为融合蛋白电泳图，其中1#是融合蛋白HIS6-Ub-EK-Arg34GLP-1(7-37)，2#是融合蛋白HIS6-Ub-EK-Arg34GLP-1(9-37)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

其中实施例中使用的缓冲液的配方如下：

Buffer A : 25 mM Tris ,150 mM NaCl ,20 mM咪唑 pH=7.5 ；

Buffer B : 25 mM Tris ,150 mM NaCl ,500 mM咪唑 pH=7.5 ；

Buffer C ：25 mM Tris , 50 mM NaCl ，2 mM CaCl₂ pH=7.6 ；

实施例1 GLP-1类似物表达载体和抑制蛋白酶sRNA载体的构建

重组融合基因HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)、HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)通过NcoI和EcoRI双酶切后，分别与PRSFDuet1经NcoI和EcoRI双酶切后回收的载体片段进行连接，筛选得到重组表达质粒PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)、PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)，再将重组融合基因HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)、HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)通过NdeI和XhoI双酶切后，分别与质粒PRSFDuet1- HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)、PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)经NdeI和XhoI双酶切后回收的载体片段进行连接，筛选得到双表达质粒PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)、PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)，PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)结果见图1。

将基因片段NO:11-18通过酶SpeI和PstI双酶切后，与pBAD202经SpeI和PstI双酶切后回收的载体片段连接，筛选得到抑制蛋白酶表达的sRNA重组质粒pBAD-sRNA-clpA、pBAD-sRNA-clpP、pBAD-sRNA-clpQ、pBAD-sRNA-clpX、pBAD-sRNA-clpY、pBAD-sRNA-Dcp、pBAD-sRNA-PepD和pBAD-sRNA-hflB，pBAD-sRNA-clpA结果见图2，其他sRNA重组质粒略。

实施例2 表达GLP-1类似物重组工程菌的构建及高表达筛选

以BL21（DE3）为宿主菌，制备感受态细胞，将重组表达质粒PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)、PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)和质粒pBAD-sRNA-clpA、pBAD-sRNA-clpP、pBAD-sRNA-clpQ、pBAD-sRNA-clpX、pBAD-sRNA-clpY、pBAD-sRNA-Dcp、pBAD-sRNA-PepD和pBAD-sRNA-hflB用氯化钙法转化至其感受态细胞，分别形成BL21（DE3）双质粒表达菌株1（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)和pBAD-sRNA-clpA）、2（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)和pBAD-sRNA-clpQ）、3（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)和pBAD-sRNA-clpP）、4（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)和pBAD-sRNA-clpX）、5（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)和pBAD-sRNA-clpY）、6（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)和pBAD-sRNA-Dcp）、7（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)和pBAD-sRNA-PepD）、8（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)和pBAD-sRNA-hflB），9（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)和pBAD-sRNA-clpA）、10（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)和pBAD-sRNA-clpQ）、11（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)和pBAD-sRNA-clpP）、12（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)和pBAD-sRNA-clpX）、13（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)和pBAD-sRNA-clpY）、14（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)和pBAD-sRNA-Dcp）、15（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)和pBAD-sRNA-PepD）、16（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)和pBAD-sRNA-hflB），转化方法按照《分子克隆实验指南》第四版的氯化钙法进行。将转化液涂布至添加了100μg/ml氨苄青霉素、100μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，37℃倒置培养直到出现单菌落，即获得了重组表达菌株，挑选单克隆菌株测序鉴定正确。将上述菌株同等培养条件下诱导表达，经过高表达筛选，BL21（DE3）双质粒表达菌株3（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(7-37)，和pBAD-sRNA-clpP）、BL21（DE3）双质粒表达菌株11（PRSFDuet1-HIS6-Ub-EK-Arg³⁴GLP-1_(9-37)和pBAD-sRNA-clpP），见图3，a双质粒表达菌株3与对照相比产量提高最多，可达200%，b双质粒表达菌株11与对照相比产量提高最多，可达185%。

实施例3重组GLP-1类似物的表达与纯化

在平板上挑取重组双质粒表达菌株3、双质粒表达菌株11单菌落，在试管培养8h后按照1:1000转入500mL三角瓶中37℃震荡培养，当OD值达到0.6-0.8时，用0.5 mM IPTG进行诱导，25℃诱导20h后离心弃上清液得到菌体沉淀。

对离心得到的菌体用30mL蛋白纯化的Buffer A悬浮，利用高压均质破碎机对悬浮细胞进行破碎，得到蛋白的粗样品液，离心收集上清液，利用亲和Ni进行蛋白的纯化，用不同比例的Buffer B进行梯度洗脱，将含有HIS6的蛋白洗脱下来，对洗脱液进行脱盐处理，置换到溶液Buffer C中。融合蛋白分离纯化见图4。10ug融合蛋白加入1U肠激酶，25℃酶切6h-12h。酶切后通过亲和层析或离子交换分离纯化获得GLP-1类似物。质谱图见图5、6。

用于多肽检测的HPLC：

条件如下：

HPLC柱子: Shim-pack GIST, 4.6×250mm(SHIMADZU)
	材料: 5um C18
运行时间: 30min
	波长: 214nm
流速: 1ml/min
	进样量: 10ul
HPLC溶剂 A: 0.1% TFA in water； B: 0.1% TFA in Acetonitrile
	柱温: 35℃
梯度: 0-5min 35% buffer B
	5-20min 50% buffer B
20-25min 80% buffer B
	25-30min 35% buffer B

实施例4重组工程菌株高密度发酵

接种实施例2所得的重组双质粒表达菌株3、双质粒表达菌株11阳性单克隆于3mL液体LB培养基中，37℃、250rpm震荡过夜培养后，按1%左右的比例接种于400mL液体LB培养基中，培养至OD600达到4时作为种子液，接入2L的发酵培养基中进行高密度发酵。初始温度37℃，搅拌速度300rpm，通气量1.5vvm/L/min，pH为6.8，之后不断提高搅拌转速最大至1000rpm。高密度发酵需氧量大，如氧气缺乏，会产生乙酸，甚至造成菌体裂解释放有害物质，对重组工程菌的表达产生不可逆的影响。因此，后期需补充一定的纯氧。发酵培养分为两个阶段，第一阶段接种后，培养4小时左右，培养基中的碳源消耗完全，按照DO进行反馈补料。补料后温度降为30℃，溶氧保持30%以上，补料8小时后加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导，诱导12小时后放罐。

重组双质粒表达菌株3、菌株11高密度发酵后分别进行分离纯化及酶切，通过BCA蛋白定量试剂盒定量测定，GLP-1类似物表达量分别可达2g/L、2.11g/L；表明采用本发明方法干扰获得的菌株实现了GLP类似物的高密度发酵表达。

通过液相色谱检测，酶切后分离纯化分别可获得800mg-1000mg的GLP-1类似物。通过电泳检测，菌株发酵获得的融合蛋白Arg34GLP-1（7-37）可溶占比83%，融合蛋白Arg34GLP-1（9-37）可溶占比80%，其中，全菌为细胞破碎后样品，上清为细胞破碎后样品离心的上清-即可溶部分，沉淀为细胞破碎后样品离心后的沉淀-即为不可溶部分。检测结果参见图7（其中1#是融合蛋白HIS6-Ub-EK-Arg34GLP-1(7-37)，2#是融合蛋白HIS6-Ub-EK-Arg34GLP-1(9-37)）。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 奥锐特药业（天津）有限公司

<120> 一种高效表达GLP-1类似物的重组菌及其应用

<130> 2021

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcatcacc atcatcacca ccagatcttc gtgaagaccc tgaccggtaa aaccattacc 60

ctggaagtgg aaagcagcga caccatcgat aacgttaaga gcaaaatcca agacaaagag 120

ggtattccgc cggatcagca acgtctgatt tttgcgggta aacagctgga ggacggccgt 180

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ggtggcgacg atgacgataa agaaggtacc ttcaccagcg acgtgagcag ctatctggag 300

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<210> 2

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcatcacc atcatcacca ccagatcttc gtgaagaccc tgaccggtaa aaccattacc 60

ctggaagtgg aaagcagcga caccatcgat aacgttaaga gcaaaatcca agacaaagag 120

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ggtggcgacg atgacgataa agaaggtacc ttcaccagcg acgtgagcag ctatctggag 300

ggccaggcgg cgaaggaatt tattgcgtgg ctggttcgtg gtcgtggcta a 351

<210> 3

<211> 2277

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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caccaggata acagcaccga tgcgatggaa gagatcaaga agatctttac accggaattc 1920

cgtaaccgtc tcgacaacat tatctggttt gatcatctgt caaccgacgt gatccatcag 1980

gtggtggata aattcatcgt cgagttgcag gttcagctgg atcagaaagg tgtttctctg 2040

gaagtgagcc aggaagcgcg taactggctg gccgagaaag gttacgaccg ggcaatgggc 2100

gctcgtccga tggcgcgtgt catccaggac aacctgaaaa aaccgctcgc caacgaactg 2160

ctgtttggtt cgctggtgga cggcggtcag gtcaccgtcg cgctggataa agagaaaaat 2220

gagctgactt acggattcca gagtgcacaa aagcacaagg cggaagcagc gcattaa 2277

<210> 4

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtcataca gcggcgaacg agataacttt gcaccccata tggcgctggt gccgatggtc 60

attgaacaga cctcacgcgg tgagcgctct tttgatatct attctcgtct acttaaggaa 120

cgcgtcattt ttctgactgg ccaggttgaa gaccacatgg ctaacctgat tgtggcgcag 180

atgctgttcc tggaagcgga aaacccagaa aaagatatct atctgtacat taactcccca 240

ggcggggtga tcactgccgg gatgtctatc tatgacacca tgcagtttat caagcctgat 300

gtcagcacca tctgtatggg ccaggcggcc tcgatgggcg ctttcttgct gaccgcaggg 360

gcaaaaggta aacgtttttg cctgccgaat tcgcgcgtga tgattcacca accgttgggc 420

ggctaccagg gccaggcgac cgatatcgaa attcatgccc gtgaaattct gaaagttaaa 480

gggcgcatga atgaacttat ggcgcttcat acgggtcaat cattagaaca gattgaacgt 540

gataccgagc gcgatcgctt cctttccgcc cctgaagcgg tggaatacgg tctggtcgat 600

tcgattctga cccatcgtaa ttga 624

<210> 5

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgacaacta tagtaagcgt acgccgtaac ggccatgtgg tcatcgctgg tgatggtcag 60

gccacgttgg gcaataccgt aatgaaaggc aacgtgaaaa aggtccgccg tctgtacaac 120

gacaaagtca tcgcgggctt tgcgggcggt actgcggatg cttttacgct gttcgaactg 180

tttgaacgta aactggaaat gcatcagggc catctggtca aagccgccgt tgagctggca 240

aaagactggc gtaccgatcg catgctgcgc aaacttgaag cactgctggc agtcgcggat 300

gaaactgcat cgcttatcat caccggtaac ggtgacgtgg tgcagccaga aaacgatctt 360

attgctatcg gctccggcgg cccttacgcc caggctgcgg cgcgcgcgct gttagaaaac 420

actgaactta gcgcccgtga aattgctgaa aaggcgttgg atattgcagg cgacatttgc 480

atctatacca accatttcca caccatcgaa gaattaagct acaaagcgta a 531

<210> 6

<211> 1275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgacagata aacgcaaaga tggctcaggc aaattgctgt attgctcttt ttgcggcaaa 60

agccagcatg aagtgcgcaa gctgattgcc ggtccatccg tgtatatctg cgacgaatgt 120

gttgatttat gtaacgacat cattcgcgaa gagattaaag aagttgcacc gcatcgtgaa 180

cgcagtgcgc taccgacgcc gcatgaaatt cgcaaccacc tggacgatta cgttatcggc 240

caggaacagg cgaaaaaagt gctggcggtc gcggtataca accattacaa acgtctgcgc 300

aacggcgata ccagcaatgg cgtcgagttg ggcaaaagta acattctgct gatcggtccg 360

accggttccg gtaaaacgct gctggctgaa acgctggcgc gcctgctgga tgttccgttc 420

accatggccg acgcgactac actgaccgaa gccggttatg tgggtgaaga cgttgaaaac 480

atcattcaga agctgttgca gaaatgcgac tacgatgtcc agaaagcaca gcgtggtatt 540

gtctacatcg atgaaatcga caagatttct cgtaagtcag acaacccgtc cattacccga 600

gacgtttccg gtgaaggcgt acagcaggca ctgttgaaac tgatcgaagg tacggtagct 660

gctgttccac cgcaaggtgg gcgtaaacat ccgcagcagg aattcttgca ggttgatacc 720

tctaagatcc tgtttatttg tggcggtgcg tttgccggtc tggataaagt gatttcccac 780

cgtgtagaaa ccggctccgg cattggtttt ggcgcgacgg taaaagcgaa gtccgacaaa 840

gcaagcgaag gcgagctgct ggcgcaggtt gaaccggaag atctgatcaa gtttggtctt 900

atccctgagt ttattggtcg tctgccggtt gtcgcaacgt tgaatgaact gagcgaagaa 960

gctctgattc agatcctcaa agagccgaaa aacgccctga ccaagcagta tcaggcgctg 1020

tttaatctgg aaggcgtgga tctggaattc cgtgacgagg cgctggatgc tatcgctaag 1080

aaagcgatgg cgcgtaaaac cggtgcccgt ggcctgcgtt ccatcgtaga agccgcactg 1140

ctcgatacca tgtacgatct gccgtccatg gaagacgtcg aaaaagtggt tatcgacgag 1200

tcggtaattg atggtcaaag caaaccgttg ctgatttatg gcaagccgga agcgcaacag 1260

gcatctggtg aataa 1275

<210> 7

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtctgaaa tgaccccacg cgaaatcgtc agcgaactgg ataagcacat catcggccag 60

gacaacgcca agcgttctgt ggcgattgct ctgcgtaacc gctggcgtcg catgcagctc 120

aacgaagagc tgcgccatga agtgaccccg aaaaatatcc tgatgatcgg cccgaccggt 180

gtcggtaaaa ctgaaatcgc ccgtcgtctg gctaagctgg cgaatgcgcc gttcatcaaa 240

gttgaagcga ccaaattcac cgaagtgggc tacgtcggta aggaagtgga ttctattatt 300

cgcgatctga ccgatgccgc cgtgaaaatg gtacgcgtcc aggctatcga gaaaaaccgt 360

tatcgcgctg aagaactggc agaagaacgt attctcgacg tgctgatccc acctgctaaa 420

aacaactggg gacagaccga acagcagcag gaaccgtccg ctgctcgtca ggcattccgc 480

aaaaaactgc gtgaaggcca gcttgatgac aaagaaatcg agatcgatct tgccgcagca 540

ccgatgggcg ttgaaattat ggctcctccg ggcatggaag agatgaccag ccagctgcag 600

tccatgttcc agaacctggg cggccagaag caaaaagcgc gtaagctgaa aatcaaagac 660

gccatgaagc tgctgattga agaagaagcg gcgaaactgg tgaacccgga agagctgaag 720

caagacgcta tcgacgctgt tgagcagcac gggatcgtgt ttatcgacga aatcgacaaa 780

atctgtaagc gcggcgagtc ttccggtccg gatgtttctc gtgaaggcgt tcagcgtgac 840

ctgctgccgc tggtagaagg ttgcaccgtt tccaccaaac acgggatggt caaaactgac 900

cacattctgt ttatcgcttc tggcgcgttc cagattgcga aaccgtctga cctgatcccg 960

gaactgcaag gtcgtctgcc aatccgcgtt gaactgcagg cgctgaccac cagcgacttc 1020

gagcgtattc tgaccgagcc gaatgcctct atcaccgtgc agtacaaagc actgatggcg 1080

actgaaggcg taaatatcga gtttaccgac tccggtatta aacgcatcgc ggaagcggca 1140

tggcaggtga acgaatctac cgaaaacatc ggtgctcgtc gtttacacac tgttctggag 1200

cgtttaatgg aagagatttc ctacgacgcc agcgatttaa gcggtcaaaa tatcactatt 1260

gacgcagatt atgtgagcaa acatctggat gcgttggtgg cagatgaaga tctgagccgt 1320

tttatcctat aa 1332

<210> 8

<211> 2046

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgacaacaa tgaatccttt ccttgtgcaa agcacactgc cgtatctggc tccccatttt 60

gatcaaattg ccaatcatca ctatcgcccg gcattcgatg agggaatgca gcaaaagcgg 120

gcagaaattg ctgccatcgc gcttaacccg caaatgcctg atttcaacaa tactattctg 180

gcactggaac aaagcggaga attacttacc cgcgttacca gcgtcttttt tgcgatgact 240

gcggcgcata ccaatgatga attacagcgt cttgacgagc agttttccgc tgaactggcg 300

gaactggcta atgatatcta tctgaacggt gaattattcg cgcgggtaga tgctgtctgg 360

cagcgccgtg aatccctggg gcttgatagt gaatccatcc gcctggtgga ggtgattcat 420

caacgttttg tccttgccgg agccaaactt gcgcaagctg ataaagcaaa attaaaagta 480

ctgaatacag aagctgcgac cctgaccagc cagtttaacc agcgattact ggcagcaaat 540

aaatccggcg gtctggttgt gaacgatatc gcgcagctgg caggaatgag tgagcaagag 600

attgcgctgg cggcagaggc ggctcgcgag aaaggtctgg ataacaaatg gctgattccg 660

ctgctgaata ccacccaaca accggcgctt gccgaaatgc gcgatcgtgc gacgcgtgaa 720

aaactgttta ttgcgggctg gacgcgagcg gaaaaaaatg atgccaatga tacccgcgct 780

atcattcaac gtctggtgga gatccgtgca caacaggcaa cactacttgg ttttcctcat 840

tatgccgcat ggaaaatcgc cgatcagatg gcaaaaacac ctgaagcagc acttaacttt 900

atgcgggaaa ttgttccagc ggcgcgtcaa cgtgcgagcg atgaattagc ctccatacag 960

gcggttatcg ataagcagca gggcgggttt agcgcgcagc cgtgggactg ggcattttat 1020

gcggaacagg tacggcggga gaaatttgat cttgatgagg cgcagctcaa gccatatttt 1080

gaattaaaca cggtgttaaa tgaaggtgta ttctggaccg cgaatcagct cttcggtatt 1140

aagtttgtcg aacgttttga tattcctgtc taccatcctg acgttcgtgt gtgggaaatt 1200

tttgatcata atggcgtggg gctggcgtta ttttacggtg atttcttcgc ccgtgattca 1260

aaaagcggcg gtgcatggat gggcaatttt gttgagcaat caacgcttaa taaaacacat 1320

ccggtaattt ataacgtctg caattatcag aaacccgctg ccggtgagcc tgcgttgtta 1380

ctctgggatg atgtcataac cttattccat gaatttggtc atacgctgca cggccttttt 1440

gcccgccagc gttatgccac gctttccggc accaacacgc cgcgtgattt tgtcgaattt 1500

ccgtcgcaaa tcaacgaaca ctgggcaacg catccgcagg tattcgctcg ctacgcccgg 1560

cattatcaga gcggggcagc aatgcctgac gaactgcaac agaaaatgcg taatgccagc 1620

ctgttcaaca aagggtatga gatgagcgaa ctgcttagcg ccgcacttct cgatatgcgc 1680

tggcattgcc tggaagaaaa cgaagcaatg caggatgtcg atgattttga attgcgggcg 1740

ctggtggcgg aaaatatgga tcttcctgct ataccgccac gctatcgcag cagttatttc 1800

gcccatattt ttggtggcgg atatgctgca ggttattacg cttatctgtg gacgcaaatg 1860

ttggccgatg atggttatca gtggtttgtt gagcagggcg gattaacgcg tgaaaatggg 1920

ctgcgttttc gcgaggcgat cctttccaga ggtaacagcg aagatctgga acgcctgtat 1980

cgacaatggc gcggtaaggc acctaagatt atgccgatgc tgcaacatcg tggcttgaac 2040

atataa 2046

<210> 9

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgtctgaac tgtctcaatt atctccacag ccgctgtggg atatttttgc caaaatctgt 60

tctattcctc acccgtccta tcatgaagag caactcgctg aatacattgt tggttgggca 120

aaagagaaag gtttccatgt cgaacgcgat caggtaggta atatcctgat tcgtaaacct 180

gctaccgcag gtatggaaaa tcgtaaaccg gtcgtcttac aggcccacct cgatatggtg 240

ccgcagaaaa ataacgacac cgtgcatgac ttcacgaaag atcctatcca gccttatatt 300

gatggcgaat gggttaaagc gcgcggcacc acgctgggtg cggataacgg cattggtatg 360

gcctctgcgc tggcggttct ggctgacgaa aacgtggttc acggcccgct ggaagtgctg 420

ctgaccatga ccgaagaagc cggtatggac ggtgcgttcg gcttacaggg caactggttg 480

caggctgata ttctgattaa caccgactcc gaagaagaag gtgaaatcta catgggttgt 540

gcggggggta tcgacttcac ctccaacctg catttagatc gtgaagcggt tccagctggt 600

tttgaaacct tcaagttaac cttaaaaggt ctgaaaggcg gtcactccgg cggggaaatc 660

cacgttgggc tgggtaatgc caacaaactg ctggtgcgct tcctggcggg tcatgcggaa 720

gaactggatc tgcgccttat cgatttcaac ggcggcacac tgcgtaacgc catcccgcgt 780

gaagcctttg cgaccattgc tgtcgcagct gataaagtcg acgtcctgaa atctctggtg 840

aatacctatc aggagatcct gaaaaacgag ctggcagaaa aagagaaaaa tctggccttg 900

ttgctggact ctgtagcgaa cgataaagct gccctgattg cgaaatctcg cgataccttt 960

attcgtctgc tgaacgccac cccgaacggt gtgattcgta actccgatgt agccaaaggt 1020

gtggttgaaa cctccctgaa cgtcggtgtg gtgaccatga ctgacaataa cgtagaaatt 1080

cactgcctga tccgttcact gatcgacagc ggtaaagact acgtggtgag catgctggat 1140

tcgctgggta aactggctgg cgcgaaaacc gaagcgaaag gcgcatatcc tggctggcag 1200

ccggacgcta attctccggt gatgcatctg gtacgtgaaa cctatcagcg cctgttcaac 1260

aagacgccga acatccagat tatccacgcg ggcctggaat gtggtctgtt caaaaaaccg 1320

tatccggaaa tggacatggt ttctatcggg ccaactatca ccggtccaca ctctccggat 1380

gagcaagttc acatcgaaag cgtaggtcat tactggacac tgctgactga actgctgaaa 1440

gaaattccgg cgaagtaa 1458

<210> 10

<211> 1935

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggcgaaaa acctaatact ctggctggtc attgccgttg tgctgatgtc agtattccag 60

agctttgggc ccagcgagtc taatggccgt aaggtggatt actctacctt cctacaagag 120

gtcaataacg accaggttcg tgaagcgcgt atcaacggac gtgaaatcaa cgttaccaag 180

aaagatagta accgttatac cacttacatt ccggttcagg atccgaaatt actggataac 240

ctgttgacca agaacgtcaa ggttgtcggt gaaccgcctg aagaaccaag cctgctggct 300

tctatcttca tctcctggtt cccgatgctg ttgctgattg gtgtctggat cttcttcatg 360

cgtcaaatgc agggcggcgg tggcaaaggt gccatgtcgt ttggtaagag caaagcgcgc 420

atgctgacgg aagatcagat caaaacgacc tttgctgacg ttgcgggctg cgacgaagca 480

aaagaagaag ttgctgaact ggttgagtat ctgcgcgagc cgagccgctt ccagaaactc 540

ggcggtaaga tcccgaaagg cgtcttgatg gtcggtcctc cgggtaccgg taaaacgctg 600

ctggcgaaag cgattgcagg cgaagcgaaa gttccgttct ttactatctc cggttctgac 660

ttcgtagaaa tgttcgtcgg tgtgggtgca tcccgtgttc gtgacatgtt cgaacaggcg 720

aagaaagcgg caccgtgcat catctttatc gatgaaatcg acgccgtagg ccgccagcgt 780

ggcgctggtc tgggcggtgg tcacgatgaa cgtgaacaga ctctgaacca gatgctggtt 840

gagatggatg gcttcgaagg taacgaaggt atcatcgtta tcgccgcgac taaccgtccg 900

gacgttctcg acccggccct gctgcgtcct ggccgtttcg accgtcaggt tgtggtcggc 960

ttgccagatg ttcgcggtcg tgagcagatc ctgaaagttc acatgcgtcg cgtaccattg 1020

gcacccgata tcgacgcggc aatcattgcc cgtggtactc ctggtttctc cggtgctgac 1080

ctggcgaacc tggtgaacga agcggcactg ttcgctgctc gtggcaacaa acgcgttgtg 1140

tcgatggttg agttcgagaa agcgaaagac aaaatcatga tgggtgcgga acgtcgctcc 1200

atggtgatga cggaagcgca gaaagaatcg acggcttacc acgaagcggg tcatgcgatt 1260

atcggtcgcc tggtgccgga acacgatccg gtgcacaaag tgacgattat cccacgcggt 1320

cgtgcgctgg gtgtgacttt cttcttgcct gagggcgacg caatcagcgc cagccgtcag 1380

aaactggaaa gccagatttc tacgctgtac ggtggtcgtc tggcagaaga gatcatctac 1440

gggccggaac atgtatctac cggtgcgtcc aacgatatta aagttgcgac caacctggca 1500

cgtaacatgg tgactcagtg gggcttctct gagaaattgg gtccactgct gtacgcggaa 1560

gaagaaggtg aagtgttcct cggccgtagc gtagcgaaag cgaaacatat gtccgatgaa 1620

actgcacgta tcatcgacca ggaagtgaaa gcactgattg agcgtaacta taatcgtgcg 1680

cgtcagcttc tgaccgacaa tatggatatt ctgcatgcga tgaaagatgc tctcatgaaa 1740

tatgagacta tcgacgcacc gcagattgat gacctgatgg cacgtcgcga tgtacgtccg 1800

ccagcgggct gggaagaacc aggcgcttct aacaattctg gcgacaatgg tagtccaaag 1860

gctcctcgtc cggttgatga accgcgtacg ccgaacccgg gtaacaccat gtcagagcag 1920

ttaggcgaca agtaa 1935

<210> 11

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgcg agttccagtt 60

cttgattgag cattttctgt tgggccattg cattgccact gattttccaa catataaaaa 120

gacaagcccg aacagtcgtc cgggcttttt ttctcgagcc aggcatcaaa taaaacgaaa 180

ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgtttt tgtcggtgaa cgctctctac 240

tagagtcaca ctggctcacc ttcgggtggg cctttctgcg tttata 286

<210> 12

<211> 283

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgct cgttcgccgc 60

tgtatgacat tttctgttgg gccattgcat tgccactgat tttccaacat ataaaaagac 120

aagcccgaac agtcgtccgg gctttttttc tcgagccagg catcaaataa aacgaaaggc 180

tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgtttttgt cggtgaacgc tctctactag 240

agtcacactg gctcaccttc gggtgggcct ttctgcgttt ata 283

<210> 13

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgcg cgtacgctta 60

ctatagttgt cactttctgt tgggccattg cattgccact gattttccaa catataaaaa 120

gacaagcccg aacagtcgtc cgggcttttt ttctcgagcc aggcatcaaa taaaacgaaa 180

ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgtttt tgtcggtgaa cgctctctac 240

tagagtcaca ctggctcacc ttcgggtggg cctttctgcg tttata 286

<210> 14

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgcg ccatctttgc 60

gtttatctgt cattttctgt tgggccattg cattgccact gattttccaa catataaaaa 120

gacaagcccg aacagtcgtc cgggcttttt ttctcgagcc aggcatcaaa taaaacgaaa 180

ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgtttt tgtcggtgaa cgctctctac 240

tagagtcaca ctggctcacc ttcgggtggg cctttctgcg tttata 286

<210> 15

<211> 283

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgcg cgtggggtca 60

tttcagacat tttctgttgg gccattgcat tgccactgat tttccaacat ataaaaagac 120

aagcccgaac agtcgtccgg gctttttttc tcgagccagg catcaaataa aacgaaaggc 180

tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgtttttgt cggtgaacgc tctctactag 240

agtcacactg gctcaccttc gggtgggcct ttctgcgttt ata 283

<210> 16

<211> 283

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgcg aaaggattca 60

ttgttgtcat tttctgttgg gccattgcat tgccactgat tttccaacat ataaaaagac 120

aagcccgaac agtcgtccgg gctttttttc tcgagccagg catcaaataa aacgaaaggc 180

tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgtttttgt cggtgaacgc tctctactag 240

agtcacactg gctcaccttc gggtgggcct ttctgcgttt ata 283

<210> 17

<211> 283

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgca attgagacag 60

ttcagacact tttctgttgg gccattgcat tgccactgat tttccaacat ataaaaagac 120

aagcccgaac agtcgtccgg gctttttttc tcgagccagg catcaaataa aacgaaaggc 180

tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgtttttgt cggtgaacgc tctctactag 240

agtcacactg gctcaccttc gggtgggcct ttctgcgttt ata 283

<210> 18

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgcc cagagtatta 60

ggtttttcgc cattttctgt tgggccattg cattgccact gattttccaa catataaaaa 120

gacaagcccg aacagtcgtc cgggcttttt ttctcgagcc aggcatcaaa taaaacgaaa 180

ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgtttt tgtcggtgaa cgctctctac 240

tagagtcaca ctggctcacc ttcgggtggg cctttctgcg tttata 286

Claims

1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括表达GLP-1或其类似物的载体以及干扰重组菌中蛋白酶表达的载体。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述蛋白酶基因选自ClpA、ClpP、ClpQ、ClpX、ClpY、Dcp、PepD、HflB中的一种或几种。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述干扰重组菌中蛋白酶表达的载体为RNA干扰载体。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述RNA干扰载体包括干扰蛋白酶表达的基因片段。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述RNA干扰载体的序列选自SEQ IDNO:11-18中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为酵母或大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的重组菌，所述大肠杆菌为MG1655或BL21（DE3）。

8.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述表达GLP-1或其类似物的载体为pRSFdute1 -Leading Peptide -EK- Arg³⁴GLP-1_（7-37）或pRSFdute1 -Leading Peptide -EK- Arg³⁴GLP-1_（9-37）。

9.权利要求1-8任一权利要求所述的重组菌在制备GLP-1或其类似物中的应用。

10.一种表达GLP-1或其类似物的方法，其特征在于，包括发酵权利要求1-8任一权利要求所述的重组菌的操作。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述发酵包括诱导的步骤，诱导表达包括采用温度诱导或诱导剂诱导。